JP2016028577A - Antibody against carcinoembryonic antigen and uses thereof - Google Patents

Antibody against carcinoembryonic antigen and uses thereof Download PDF

Info

Publication number
JP2016028577A
JP2016028577A JP2015163791A JP2015163791A JP2016028577A JP 2016028577 A JP2016028577 A JP 2016028577A JP 2015163791 A JP2015163791 A JP 2015163791A JP 2015163791 A JP2015163791 A JP 2015163791A JP 2016028577 A JP2016028577 A JP 2016028577A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
cea
cancer
humanized chimeric
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2015163791A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
ジファ ヤン，
Zhihua Yang
ジファ ヤン，
ユリャン ラン，
Yuliang Ran
ユリャン ラン，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Haikang Pharmaceutical Tech and Deve Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Haikang Pharmaceutical Tech and Deve Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Haikang Pharmaceutical Tech and Deve Co Ltd filed Critical Shanghai Haikang Pharmaceutical Tech and Deve Co Ltd
Publication of JP2016028577A publication Critical patent/JP2016028577A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a humanized chimeric monoclonal antibody against carcinoembryonic antigen (CEA).SOLUTION: The invention also provides: polynucleotides encoding the antibody, the polynucleotides encoding a polypeptide comprising CDR regions that are identical to the CDR regions of the humanized chimeric antibody or a functional variant thereof; expression vectors comprising the polynucleotides; and host cells containing the expression vectors (particularly, Chinese hamster ovary cells). The invention also provides methods for manufacturing medicaments for diagnosis and/or treatment of tumors on the basis of the antibody, polynucleotides, vectors and host cells.SELECTED DRAWING: Figure 15

Description

本発明は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対するヒト化キメラ抗体、該抗体をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む宿主細胞並びに腫瘍を診断及び／若しくは治療するための薬剤又は医薬の調製におけるそれらの使用に関する。   The present invention diagnoses and / or treats humanized chimeric antibodies against carcinoembryonic antigen (CEA), polynucleotides encoding the antibodies, expression vectors containing the polynucleotides, host cells containing the expression vectors, and tumors For their use in the preparation of medicaments or medicaments.

１９６５年に、カナダのＧｏｌｄ及びＦｒｅｄｍａｎは、ヒト結腸がんからの抽出物を用いてウサギを免疫し、得られた血清を用いて様々なヒト組織を調べた。このときに、ヒト内胚葉を起源とする消化管腫瘍の染色が強陽性であることが見出され、２〜６カ月齢の胎児の消化管組織も陽性であることも見出され、よって、消化管腫瘍において発現が陽性であるこのような抗原分子が癌胎児性抗原（ＣＥＡ）と命名された。後に、内胚葉細胞から分化した腫瘍細胞におけるＣＥＡ抗原の発現が、正常細胞のものより１００倍高く、よって、これは様々なヒト悪性腫瘍についての重要な抗原及びマーカーであることが見出された。ＣＥＡは、約１８０〜２００ｋＤの分子量を有する糖鎖及びペプチド鎖で構成される糖タンパク質である。糖鎖の組成及び起源の違いにより、ＣＥＡの生化学的特性及び免疫原性は非常に異質性、多様性及び不均質性を示し、よって巨大分子の比較的大きいファミリーを形成する。ＣＥＡ分子は、多くの異なる抗原エピトープを有し、これらの異なるエピトープは、成体、胎児器官の異なる正常組織及び様々な悪性腫瘍組織において異なって発現され、その特異性も異なる。Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍらは、１９８９年に、ＣＥＡ抗原エピトープを５つの群、すなわちＧｏｌｄ１〜５（Ｇｏｌｄ分類）に分割できることを提案した。Ｇｏｌｄ１〜５群の抗原エピトープがそれぞれＣＥＡ分子のドメインＡ３、Ｂ２、Ｂ３、Ａ１及びＮにあり、Ａ３及びＢ３ドメインは他のＣＥＡ関連分子との相同性が低く、これらは、ＣＥＡ分子の比較的ユニークなドメインであることが研究において示されている。   In 1965, Canada's Gold and Fredman immunized rabbits with extracts from human colon cancer and examined the various human tissues with the resulting sera. At this time, it was found that the staining of gastrointestinal tumors originating in human endoderm was strongly positive, and that the gastrointestinal tissue of 2-6 months old fetuses was also positive, Such antigen molecules that are positively expressed in gastrointestinal tumors have been named carcinoembryonic antigen (CEA). Later, the expression of CEA antigen in tumor cells differentiated from endoderm cells was 100 times higher than that of normal cells, thus it was found to be an important antigen and marker for various human malignancies. . CEA is a glycoprotein composed of a sugar chain and a peptide chain having a molecular weight of about 180 to 200 kD. Due to differences in sugar chain composition and origin, the biochemical properties and immunogenicity of CEA are very heterogeneous, diverse and heterogeneous, thus forming a relatively large family of macromolecules. CEA molecules have many different antigenic epitopes, and these different epitopes are differentially expressed in adults, different normal tissues of fetal organs and various malignant tumor tissues, and also have different specificities. Hammarstrom et al. Proposed in 1989 that CEA antigenic epitopes could be divided into five groups, Gold 1-5 (Gold classification). The antigen epitopes of Gold 1 to 5 group are respectively in domains A3, B2, B3, A1 and N of CEA molecule, and A3 and B3 domains have low homology with other CEA related molecules, Studies have shown that it is a unique domain.

ＣＥＡは、細胞の細胞膜上及び細胞質中で主に発現され、８週齢の胚の様々な胚葉組織においても発現される。３カ月を超える胚の組織では、ＣＥＡは、胃腸上皮組織において主に発現されるが、成体組織におけるＣＥＡの発現は著しく低減又は減じられ、結腸上皮細胞の表面上で痕跡量が発現されるのみである。しかし、ＣＥＡは、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮頚がん、前立腺がん、膀胱がん、胆嚢がん及び食道がんを含む多くの悪性腫瘍において５０〜９０％までの陽性率で高発現される。ＣＥＡは、これらの悪性腫瘍の転移巣においても高発現され、発現レベルは原発巣よりも高い。これらの腫瘍のうち、結腸直腸がんにおけるＣＥＡ発現は、陽性率（９５％より高い）及び強度の両方の点で最も高い。ＣＥＡは、結腸直腸がん組織のほぼ全てで高発現され、肝臓転移巣のような転移巣におけるＣＥＡの発現レベル及び陽性率は、原発巣よりも著しく高い。悪性腫瘍におけるＣＥＡの発現は、腫瘍の量、段階、転移及び予後と密接に関係することも多くの研究において証明されている。よって、ＣＥＡは、悪性腫瘍についての特異的分子マーカーとして広く認識され、このことにより、腫瘍の標的治療及び診断についての最良の標的の１つとなっている。   CEA is mainly expressed on the cell membrane and in the cytoplasm of cells and is also expressed in various germ layer tissues of 8-week-old embryos. In embryonic tissues over 3 months, CEA is predominantly expressed in gastrointestinal epithelial tissue, but CEA expression in adult tissue is significantly reduced or reduced, and only trace amounts are expressed on the surface of colonic epithelial cells. It is. However, CEA has many malignancies including colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, cervical cancer, prostate cancer, bladder cancer, gallbladder cancer and esophageal cancer. Is highly expressed with a positive rate of 50 to 90%. CEA is also highly expressed in the metastatic foci of these malignant tumors, and the expression level is higher than that of the primary foci. Of these tumors, CEA expression in colorectal cancer is highest in both positive rates (greater than 95%) and intensity. CEA is highly expressed in almost all colorectal cancer tissues, and the expression level and positive rate of CEA in metastases such as liver metastases is significantly higher than in primary lesions. Many studies have also shown that CEA expression in malignant tumors is closely related to tumor volume, stage, metastasis and prognosis. Thus, CEA is widely recognized as a specific molecular marker for malignant tumors, which makes it one of the best targets for targeted therapy and diagnosis of tumors.

ＣＥＡ陽性悪性腫瘍は高い罹患率を有し、非常に多数の患者に影響を与え、世界中の人々の健康について最も驚異となる疾患の１つになっている。例えば、ＣＥＡを高発現する結腸がんは、最も一般的に見られる悪性腫瘍の１つである。欧州及びアメリカの先進国における結腸直腸がんの罹患率は、全ての悪性腫瘍のうちで第３位であり、死亡率は第２位である。新しく発生した事例は世界中で毎年１００万件を超え、５２９，０００名を超える患者が結腸直腸がんで死亡する。毎年、中国において４００，０００名近くの結腸直腸がん患者が新しく発生し、結腸直腸がん患者の２００，０００名近くが、治療に不応性であることにより死亡する。現在までに、ＦＤＡは、結腸がんについての４つの一般的に用いられる化学療法医薬：フルオロウラシル、イリノテカン、オキサリプラチン及びカペシタビンのみを承認している。これらの現在利用可能な術後の補助的治療としての化学療法医薬及び化学療法レジメンは、結腸直腸がんの再発率を約１５％にまで低減でき、５年生存率を約１０〜１３％にまで改善及び増加できる。抗体標的医薬は、悪性腫瘍を治療するために最近１０年間の間に開発されている別の型の新しい医薬である。非ホジキンリンパ腫などのいくつかの血液系腫瘍の臨床的治療において、これは著しい治療効果を示し、患者の５年生存率を増加できる。ＣＥＡ抗原を標的として用いる放射活性抗体標的治療剤として、ＣＥＡ抗体医薬は現在のところ臨床的使用について承認されていない。しかし、２つのＣＥＡ抗体放射性免疫治療剤が、第Ｉ相、第ＩＩ相の臨床試験について承認されている。１つは１３１Ｉ−ｈＭＮ−１４抗体医薬、すなわち１３１Ｉとカップリングした組換えヒト化抗ＣＥＡ抗体ｈＭＮ−１４であり、これは、１９９９年に米国のＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．により開発され、現在、進行結腸直腸がんにおける薬物耐性転移を治療するための第ＩＩ相臨床試験がほぼ終了し、第ＩＩＩ相臨床試験に入っている。別の抗ヒトＣＥＡ抗体医薬は、放射活性核種９０ｙとカップリングしたｃＴ８４．６６ヒト／マウスキメラ抗体であり、これは米国のＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ ＣｅｎｔｅｒによりＦＤＡの承認のもとで開発されている。現在、進行悪性腫瘍を治療するための第Ｉ相臨床試験が終了した。しかし、これらの２つのＣＥＡ抗体医薬は、特異性をさらに改良する必要がある、毒性及び副作用をさらに低減する必要がある、抗体の親和性が過剰に高く、このことにより、標的放射性免疫治療中に親和性バリアの発生を引き起こす傾向があり、それにより治療効果に著しく影響するなどのいくつかの問題をまだ有している。従来技術の抗ＣＥＡ抗体の問題を克服するための新しい抗ＣＥＡ抗体に対する必要性が存在する。 CEA positive malignancies have a high morbidity, affect a large number of patients and have become one of the most amazing diseases for the health of people around the world. For example, colon cancer that highly expresses CEA is one of the most commonly seen malignant tumors. Colorectal cancer morbidity in European and American developed countries is third among all malignant tumors and mortality is second. More than 1 million new cases occur annually worldwide, and more than 529,000 patients die from colorectal cancer. Each year, nearly 400,000 new colorectal cancer patients in China occur and nearly 200,000 colorectal cancer patients die from refractory treatment. To date, the FDA has approved only four commonly used chemotherapeutic drugs for colon cancer: fluorouracil, irinotecan, oxaliplatin, and capecitabine. These currently available postoperative adjuvant chemotherapeutic drugs and chemotherapy regimens can reduce the recurrence rate of colorectal cancer to about 15% and a 5-year survival rate of about 10-13%. Can improve and increase up to. Antibody-targeted drugs are another type of new drugs that have been developed over the last decade to treat malignant tumors. In clinical treatment of some hematological tumors such as non-Hodgkin's lymphoma, this has a significant therapeutic effect and can increase the patient's 5-year survival rate. As a radioactive antibody targeted therapeutic using CEA antigen as a target, CEA antibody drugs are currently not approved for clinical use. However, two CEA antibody radioimmunotherapy agents have been approved for Phase I and Phase II clinical trials. One is a 131 I-hMN-14 antibody drug, a recombinant humanized anti-CEA antibody hMN-14 coupled to 131 I, which was published in 1999 in the United States Immunomedics Corp. Is currently completed and is now in Phase III clinical trials to treat drug resistant metastases in advanced colorectal cancer. Another anti-human CEA antibody drug is a cT84.66 human / mouse chimeric antibody coupled to radionuclide 90 y, which was developed with FDA approval by City of Hope National Medical Center in the United States. Yes. Currently, phase I clinical trials for the treatment of advanced malignant tumors have been completed. However, these two CEA antibody drugs need to be further improved in specificity, need to further reduce toxicity and side effects, have an excessively high antibody affinity, which makes it possible during targeted radioimmunotherapy Still have some problems, such as tending to cause the development of an affinity barrier, thereby significantly affecting the therapeutic effect. There is a need for new anti-CEA antibodies to overcome the problems of prior art anti-CEA antibodies.

抗体の結合特異性及び親和性はともに、軽鎖及び重鎖の超可変領域（相補性決定領域、略してＣＤＲともよばれる）のアミノ酸配列により主に決定されることが多くの従来の研究において結論付けられている。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、その教育的原理の中で、同じ相補性決定領域を有する同じ型の全ての抗体は１つの抗体に属すると断言している。よって、臨床的な治療価値を有する１つの抗体のＣＤＲを得た後に、その非ＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、様々な確立された知られている技術により容易に変化させて、同じ又はよりよい生物活性を有する変異体を得ることができる。   It is concluded in many previous studies that both the binding specificity and affinity of an antibody are mainly determined by the amino acid sequences of the light and heavy chain hypervariable regions (complementarity determining regions, also called CDR for short). It is attached. The US Food and Drug Administration (FDA), in its educational principle, asserts that all antibodies of the same type that have the same complementarity determining region belong to one antibody. Thus, after obtaining the CDRs of one antibody with clinical therapeutic value, the amino acid sequence of its non-CDR region can be easily changed by various established and known techniques to produce the same or better organism. Mutants with activity can be obtained.

本発明は、顕著なＣＥＡ結合特異性及び適度な親和性を有する親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体に基づく。   The present invention is based on a parental anti-CEA mouse monoclonal antibody with significant CEA binding specificity and moderate affinity.

該抗体のＣＤＲ領域の配列は、クローニング、同定及び遺伝子構造分析により決定されている。対応するヒト化キメラ抗体及びその真核細胞発現ベクターが構築され、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を発現して分泌する細胞株が得られた。
本発明は、元のマウスモノクローナル抗体のものと同等である適度な親和性に加えて、前記ヒト化キメラ抗体が、優れたＣＥＡ結合特異性及びｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍標的特性も有し、結腸がんの増殖を多くの動物モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで著しく阻害できることをさらに実証する。該抗体はヒト化されているので、抗体の毒性及び副作用は、ヒトに用いた場合に低減できる。本発明は、動物モデル及び放射性免疫イメージングのような実験をさらに採用して、前記ヒト化キメラ抗体が、ＣＥＡ陽性腫瘍についての優れた標的特性を有し、よって、ＣＥＡ陽性腫瘍についてのｉｎ ｖｉｖｏ診断剤を調製するために用いることができることをｉｎ ｖｉｖｏにおいて十分に証明する。さらに、本発明は、放射性免疫治療などの実験も採用して、いくつかの動物モデルの体内において、前記ヒト化キメラ抗体がＣＥＡ陽性腫瘍の増殖を阻害するための優れた能力を有し、よって、ＣＥＡ陽性腫瘍のための治療用医薬の調製において用いることができることを実証する。 The sequence of the CDR region of the antibody has been determined by cloning, identification and gene structure analysis. Corresponding humanized chimeric antibodies and their eukaryotic expression vectors were constructed, resulting in cell lines that express and secrete anti-CEA humanized chimeric antibodies.
In addition to moderate affinity comparable to that of the original mouse monoclonal antibody, the present invention also provides that the humanized chimeric antibody also has excellent CEA binding specificity and in vivo tumor targeting properties, It is further demonstrated that proliferation can be significantly inhibited in vivo in many animal models. Since the antibody is humanized, the toxicity and side effects of the antibody can be reduced when used in humans. The present invention further employs experiments such as animal models and radioimmunoimaging, wherein the humanized chimeric antibody has excellent target properties for CEA positive tumors and thus in vivo diagnosis for CEA positive tumors It is well demonstrated in vivo that it can be used to prepare agents. Furthermore, the present invention also employs experiments such as radioimmunotherapy, and in some animal models, the humanized chimeric antibody has an excellent ability to inhibit the growth of CEA positive tumors, thus Demonstrating that it can be used in the preparation of a therapeutic medicament for CEA positive tumors.

よって、本発明は、以下の態様に主に関する。
第１の態様では、本発明は、モノクローナル抗体の重鎖が、配列番号７〜９に示すＣＤＲ領域を含み、モノクローナル抗体の軽鎖が、配列番号１０〜１２に示すＣＤＲ領域を含む、癌胎児性抗原に対するヒト化キメラモノクローナル抗体又はその機能的変異体に関する。 Therefore, the present invention mainly relates to the following aspects.
In a first aspect, the present invention relates to a carcinoembryo, wherein the heavy chain of the monoclonal antibody comprises the CDR regions shown in SEQ ID NOs: 7-9 and the light chain of the monoclonal antibody comprises the CDR regions shown in SEQ ID NOs: 10-12. The present invention relates to a humanized chimeric monoclonal antibody against a functional antigen or a functional variant thereof.

第２の態様では、本発明は、抗ＣＥＡヒト化キメラモノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号１であり、重鎖のアミノ酸配列が、配列番号２である、抗ＣＥＡヒト化キメラモノクローナル抗体又はその機能的変異体に関する。   In a second aspect, the present invention provides an anti-CEA humanized chimeric monoclonal antibody wherein the light chain amino acid sequence of the anti-CEA humanized chimeric monoclonal antibody is SEQ ID NO: 1 and the heavy chain amino acid sequence is SEQ ID NO: 2. It relates to an antibody or a functional variant thereof.

第３の態様では、本発明は、前記ヒト化キメラ抗体のＣＤＲ領域と同一であるＣＤＲ領域を有するポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、前記ヒト化キメラ抗体の生物活性と同等又はそれより高い生物活性を有する。抗体の結合特異性及び親和性がともに、ＣＤＲ領域により主に決定されることが当技術分野において知られている。様々な確立された知られている従来技術に基づいて、非ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を容易に変化させて、同等又はそれより高い生物活性を有する変異体を得ることができる。   In a third aspect, the present invention relates to a polypeptide having a CDR region that is identical to the CDR region of the humanized chimeric antibody, wherein the polypeptide has an organism equivalent to or higher than the biological activity of the humanized chimeric antibody. Has activity. It is known in the art that both the binding specificity and affinity of an antibody are mainly determined by the CDR regions. Based on various established and known prior art, the amino acid sequence of the non-CDR region can be easily changed to obtain variants with equivalent or higher biological activity.

第４の態様では、本発明は、第１若しくは第２の態様によるモノクローナル抗体又はその変異体をコードするか又は第３の態様によるポリペプチドをコードする核酸に関する。核酸の配列が変化しても、トリプレットコドンの遺伝子ドグマに従って配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体タンパク質に最終的に翻訳できる限りは、それはやはり前記抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体をコードするポリヌクレオチドであることが当技術分野において知られている。前記核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。   In a fourth aspect, the invention relates to a nucleic acid encoding the monoclonal antibody or variant thereof according to the first or second aspect or encoding the polypeptide according to the third aspect. Even if the sequence of the nucleic acid changes, as long as it can be finally translated into an antibody protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 according to the gene dog of the triplet codon, it is still the anti-CEA humanized chimeric antibody Are known in the art. The nucleic acid can be DNA or RNA.

第５の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関し、好ましくは、該発現ベクターは、真核細胞において高発現される。好ましくは、前記真核細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。好ましい実施形態では、前記発現ベクターは、図４に示すｐＳＲＮＣ−Ｃκ−ＣＥＡ又は図５に示すｐＳＲＤＣ−Ｃγ１−ＣＥＡである。   In a fifth aspect, the present invention relates to an expression vector comprising a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, preferably the expression vector is highly expressed in eukaryotic cells. . Preferably, the eukaryotic cell is a Chinese hamster ovary cell. In a preferred embodiment, the expression vector is pSRNC-Cκ-CEA shown in FIG. 4 or pSRDC-Cγ1-CEA shown in FIG.

第６の態様では、本発明は、第５の態様による発現ベクターを含む宿主細胞に関する。好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、特に寄託番号第ＣＧＭＣＣ３８０３号の細胞である。   In a sixth aspect, the present invention relates to a host cell comprising the expression vector according to the fifth aspect. In a preferred embodiment, the host cell of the invention is a Chinese hamster ovary (CHO) cell, particularly a cell with deposit number CGMCC3803.

第７の態様では、本発明は、治療有効量の態様１〜３の１つによる前記抗体若しくはポリペプチド又はその機能的変異体（例えば複合体、融合タンパク質）の、或いは第４の態様による前記核酸の、或いは第５の態様による前記ベクターの、或いは第６の態様による前記宿主細胞の、抗腫瘍医薬の調製における使用に関する。前記腫瘍は、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮頚がん、前立腺がん、膀胱がん、胆嚢がん及び食道がん、好ましくは結腸直腸がんからなる群から選択される。好ましい実施形態では、前記抗腫瘍医薬は、活性成分として放射性物質とカップリングした態様１〜３のいずれか１つによる前記抗体又はポリペプチドを含み、好ましくは、前記放射性物質は、１３１Ｉである。 In a seventh aspect, the present invention provides a therapeutically effective amount of the antibody or polypeptide or functional variant thereof (eg, complex, fusion protein) according to one of aspects 1-3, or according to the fourth aspect. It relates to the use of a nucleic acid or of the vector according to the fifth aspect or of the host cell according to the sixth aspect in the preparation of an antitumor medicament. The tumor is colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, cervical cancer, prostate cancer, bladder cancer, gallbladder cancer and esophageal cancer, preferably colorectal cancer. Selected from the group consisting of In a preferred embodiment, the anti-tumor medicament comprises the antibody or polypeptide according to any one of aspects 1 to 3 coupled as an active ingredient with a radioactive substance, preferably the radioactive substance is 131 I .

第８の態様では、本発明は、態様１〜３の１つによる前記抗体若しくはポリペプチド又はその機能的変異体（例えば複合体、融合タンパク質）の、或いは第４の態様による前記核酸の、或いは第５の態様による前記ベクターの、或いは第６の態様による前記宿主細胞の、腫瘍診断剤の調製における使用に関する。前記腫瘍は、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮頚がん、前立腺がん、膀胱がん、胆嚢がん及び食道がん、好ましくは結腸直腸がんからなる群から選択される。好ましい実施形態では、前記腫瘍診断医薬は、活性成分として放射性免疫イメージング剤とカップリングした態様１〜３のいずれか１つによる前記抗体又はポリペプチドを含み、好ましくは、前記放射性免疫イメージング剤は、１８８Ｒｅである。 In an eighth aspect, the invention relates to the antibody or polypeptide according to one of aspects 1 to 3 or a functional variant thereof (eg complex, fusion protein), or the nucleic acid according to the fourth aspect, or It relates to the use of the vector according to the fifth aspect or the host cell according to the sixth aspect in the preparation of a tumor diagnostic agent. The tumor is colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, cervical cancer, prostate cancer, bladder cancer, gallbladder cancer and esophageal cancer, preferably colorectal cancer. Selected from the group consisting of In a preferred embodiment, the tumor diagnostic medicament comprises the antibody or polypeptide according to any one of aspects 1 to 3 coupled as an active ingredient with a radioimmunoimaging agent, preferably the radioimmunoimaging agent comprises 188 Re.

親のマウスモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞の抽出した全ＲＮＡについてのアガロースゲル電気泳動を用いた分析を示す。レーン１．分子量マーカー、λＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩ。レーン２．親のマウスモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡ。FIG. 5 shows analysis using agarose gel electrophoresis on total RNA extracted from parental mouse monoclonal antibody hybridoma cells. Lane 1. Molecular weight marker, λDNA / HindIII. Lane 2. Total RNA of parental mouse monoclonal antibody hybridoma cells. 親のマウスモノクローナル抗体ＶＬ、ＶＨ遺伝子のＰＣＲ産物についてのアガロースゲル電気泳動を用いた分析を示す。レーン１．分子量マーカー、λＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩ。レーン２．親のマウスモノクローナル抗体ＶＬ遺伝子のＰＣＲ産物。レーン３．親のマウスモノクローナル抗体ＶＨ遺伝子のＰＣＲ産物。The analysis using the agarose gel electrophoresis about the PCR product of a parent mouse monoclonal antibody VL and a VH gene is shown. Lane 1. Molecular weight marker, λDNA / HindIII. Lane 2. PCR product of parental mouse monoclonal antibody VL gene. Lane 3. PCR product of parental mouse monoclonal antibody VH gene. 増幅により得られた親のマウスモノクローナル抗体ＶＬ、ＶＨ遺伝子のヌクレオチド配列及びそのアミノ酸配列並びにＣＤＲ配列を示す。The nucleotide sequence and amino acid sequence and CDR sequence of the parental mouse monoclonal antibody VL and VH genes obtained by amplification are shown. 抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体軽鎖真核発現ベクターｐＳＲＮＣ−Ｃκ−ＣＥＡの構造についての概略図を示す。Ｐｗ、減弱化真核プロモーター；Ｎｅｏ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子；ＰｈＣＭＶ−ＩＥ、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター及びエンハンサー；ＶＬ遺伝子、リーダーペプチド配列及び５’端イントロンスプライシング部位配列を有する軽鎖可変領域の遺伝子断片；Ｃκ遺伝子、ヒト抗体軽鎖のκ鎖定常領域遺伝子断片；ＢＧＨポリＡ、ウシ成長ホルモンポリＡテイル付加部位；Ａｐ、アンピシリン耐性遺伝子。1 shows a schematic diagram of the structure of an anti-CEA humanized chimeric antibody light chain eukaryotic expression vector pSRNC-Cκ-CEA. Pw, attenuated eukaryotic promoter; Neo, aminoglycoside phosphotransferase (neo) gene; PhCMV-IE, human cytomegalovirus immediate early promoter and enhancer; light chain with VL gene, leader peptide sequence and 5'-end intron splicing site sequence Variable region gene fragment; Cκ gene, κ chain constant region gene fragment of human antibody light chain; BGH poly A, bovine growth hormone poly A tail addition site; Ap, ampicillin resistance gene. 抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体重鎖真核発現ベクターｐＳＲＤＣ−Ｃγ１−ＣＥＡの構造についての概略図を示す。Ｐｗ、減弱化真核プロモーター；ｄｈｆｒ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子；ＰｈＣＭＶ−ＩＥ、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター及びエンハンサー；ＶＨ遺伝子、リーダーペプチド配列及び５’端イントロンスプライシング部位配列を有する重鎖可変領域の遺伝子断片；Ｃγ１遺伝子、ヒト抗体重鎖のγ１鎖定常領域遺伝子断片；ＢＧＨポリＡ、ウシ成長ホルモンポリＡテイル付加部位；Ａｐ、アンピシリン耐性遺伝子。The schematic about the structure of an anti- CEA humanized chimeric antibody heavy chain eukaryotic expression vector pSRDC-Cγ1-CEA is shown. Pw, attenuated eukaryotic promoter; dhfr, dihydrofolate reductase (dhfr) gene; PhCMV-IE, human cytomegalovirus immediate early promoter and enhancer; heavy with VH gene, leader peptide sequence and 5'-end intron splicing site sequence Chain variable region gene fragment; Cγ1 gene, γ1 chain constant region gene fragment of human antibody heavy chain; BGH poly A, bovine growth hormone poly A tail addition site; Ap, ampicillin resistance gene. 抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を高レベルで発現及び分泌する細胞株についての構築及びスクリーニングプロセスを示す。Figure 2 shows the construction and screening process for cell lines that express and secrete anti-CEA humanized chimeric antibodies at high levels. ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を発現及び分泌するＣＨＯ細胞株の上清中のキメラ抗体含量を示す。ここで、ＣＨＯ上清（１：１０００）、ＯＤ４９０＝１．５２０は、０．０８μｇ／ｍｌ、上清ストック溶液の濃度：０．０８×１０００＝８０μｇ／ｍｌに相当する。The chimera antibody content in the supernatant of a CHO cell line expressing and secreting an anti-CEA humanized chimeric antibody, measured using an ELISA method, is shown. Here, CHO supernatant (1: 1000), OD490 = 1.520 corresponds to 0.08 μg / ml, concentration of supernatant stock solution: 0.08 × 1000 = 80 μg / ml. ＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の抗原特異性を示す。レーン１．λＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩ。レーン２．３２０ｂｐマーカー。レーン３．抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体ＶＬ遺伝子のＰＣＲ増幅産物。レーン４．抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体ＶＨ遺伝子のＰＣＲ増幅産物。レーン５、６．陰性対照。Figure 4 shows the antigen specificity of anti-CEA humanized chimeric antibody analyzed using RT-PCR. Lane 1. λDNA / HindIII. Lane 2.320 bp marker. Lane 3. PCR amplification product of anti-CEA humanized chimeric antibody VL gene. Lane 4. PCR amplification product of anti-CEA humanized chimeric antibody VH gene. Lanes 5 and 6. Negative control. 免疫蛍光を用いて分析した、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の抗原特異性を示す。Figure 3 shows the antigen specificity of anti-CEA humanized chimeric antibody analyzed using immunofluorescence. 抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体が、いくつかのＣＥＡ発現がん細胞上のＣＥＡ抗原を認識できることを示す。FIG. 5 shows that anti-CEA humanized chimeric antibody can recognize CEA antigen on some CEA expressing cancer cells. ウェスタンブロッティングを用いて分析した、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体のヒト化特性を示す。レーン１．分子量マーカー。レーン２．キメラ抗体、２次抗体として抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＨＲＰ。レーン３．マウスモノクローナル抗体、２次抗体として抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＨＲＰ。レーン４．キメラ抗体、１次抗体として抗ヒトκ鎖。レーン５．マウスモノクローナル抗体、１次抗体として抗ヒトκ鎖。Figure 3 shows the humanization properties of anti-CEA humanized chimeric antibodies analyzed using Western blotting. Lane 1. Molecular weight marker. Lane 2. Chimeric antibody, anti-human IgG Fc-HRP as secondary antibody. Lane 3. Mouse monoclonal antibody, anti-human IgG Fc-HRP as secondary antibody. Lane 4. Chimeric antibody, anti-human kappa chain as primary antibody. Lane 5. Mouse monoclonal antibody, anti-human kappa chain as primary antibody. 抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の組織１グラムあたりのパーセント（ＩＤ％／ｇ）として表した、放射活性線量取り込み分析の結果を示す。The results of radioactive dose uptake analysis expressed as percent per gram of tissue (ID% / g) of anti-CEA humanized chimeric antibody are shown. 腫瘍組織と正常組織との間（Ｔ／ＮＴ）の抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の放射線比率の結果を示す。The radiation ratio results of anti-CEA humanized chimeric antibody between tumor tissue and normal tissue (T / NT) are shown. 抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体によるＣＥＡ陽性結腸がんの腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫イメージングを示す。2 shows in vivo radioimmunoimaging of CEA positive colon cancer tumors with anti-CEA humanized chimeric antibody. 抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体とＩ−１３との複合体の単回投与によるヒト結腸がんを有するヌードマウス移植腫瘍モデルの治療の結果を示す（増殖曲線）。The result of the treatment of a nude mouse transplanted tumor model having human colon cancer by a single administration of a complex of anti-CEA humanized chimeric antibody and I-13 is shown (growth curve). 抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体とＩ−１３との複合体の複数回投与によるヒト結腸がんを有するヌードマウス移植腫瘍モデルの治療の結果を示す（増殖曲線）。The result of the treatment of a nude mouse transplanted tumor model having human colon cancer by multiple administration of a complex of anti-CEA humanized chimeric antibody and I-13 is shown (growth curve).

本発明の抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の抗体可変領域は、抗マウスモノクローナル抗体Ｃ２４由来であり、これは、本発明者らがＣＥＡを用いてマウスを免疫することにより以前に調製及び取得し、２０１０年５月４日に寄託番号第ＣＧＭＣＣ３８０２号の下で寄託されたハイブリドーマ細胞から得ることができる。いくつかの以前の研究（Ｌｕ，Ｂａｏｌａｎ．Ｃｈｅｎｇ，Ｍｉｎｇ．Ｑｉａｎｇ，Ｌａｉｙｉｎｇ．ら「Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ」Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９８６、１５（２）：３７頁）は、このマウスモノクローナル抗体が、特に高い特異性及び適度な親和性を含む、標的治療に適切ないくつかの優れた生物学的特性を有することを示す。該モノクローナル抗体は、ＣＥＡ抗原と高い特異性で結合し、胃がん、肺がん、結腸がん、直腸がん、乳がん、卵巣がん、膀胱がんなどを含むいくつかのヒト腫瘍とｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的に結合できるが、正常ヒト組織細胞と高い特異性ではほとんど結合しない。数千の試料の免疫組織化学的分析は、抗体が、上記のいくつかの腫瘍組織と、６０％〜９０％までの陽性率で結合するが、正常組織との結合についての陽性率は５％〜１０％の間のみであることを実証する。さらに、高い特異性に加えて、標的治療についての別の利点は、モノクローナル抗体が適度な親和性を有することである。抗原−抗体結合力学によると、標的治療に用いる場合、過剰に高い親和性を有する抗体は、標的抗体が腫瘍表面に吸着し、腫瘍の内部にさらに浸透してよりよい治療効果を奏することが妨げられる結果となる。よって、適度な親和性を有する抗体が、腫瘍の標的治療のためにより適切である。本発明の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体は、適度な親和性を有し、親和性定数は約１×１０−９Ｍ−１である。そのヒト化抗体は、腫瘍の臨床治療においてよりよい治療効果及び展望を有すると期待できる。 The antibody variable region of the anti-CEA humanized chimeric antibody of the invention is derived from anti-mouse monoclonal antibody C24, which was previously prepared and obtained by the inventors by immunizing mice with CEA, 2010 It can be obtained from hybridoma cells deposited on May 4, year under deposit number CGMCC3802. Some previous studies (Lu, Baolan. Cheng, Ming. Qiang, Laying. Et al., "The study for the preparation of the biologics and the immunological characteristics of the biotechnology of the two." Show that this mouse monoclonal antibody has several excellent biological properties suitable for targeted therapy, including particularly high specificity and moderate affinity. The monoclonal antibody binds with high specificity to CEA antigen and is specific in vitro with several human tumors including gastric cancer, lung cancer, colon cancer, rectal cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, etc. Can bind to normal human tissue cells with high specificity. Immunohistochemical analysis of thousands of samples shows that antibodies bind to some of the above tumor tissues with a positive rate of 60% to 90%, but a positive rate for binding to normal tissue is 5%. Demonstrate that it is only between -10%. Furthermore, in addition to high specificity, another advantage for targeted therapy is that monoclonal antibodies have moderate affinity. According to antigen-antibody binding mechanics, when used for target therapy, an antibody with an excessively high affinity prevents the target antibody from adsorbing to the tumor surface and further penetrating the interior of the tumor to produce a better therapeutic effect. Result. Thus, antibodies with moderate affinity are more appropriate for tumor targeted therapy. The anti-CEA mouse monoclonal antibody of the present invention has moderate affinity, and the affinity constant is about 1 × 10 −9 M −1 . The humanized antibody can be expected to have a better therapeutic effect and perspective in clinical treatment of tumors.

定義
モノクローナル抗体
本明細書で用いる場合、用語「モノクローナル抗体」は、本質的に相同な抗体の群から得られる抗体のことをいい、すなわち、この群に含まれる抗体のそれぞれが、いくつかの自発的突然変異体が非常に少量で存在し得ることを除いて同一である。モノクローナル抗体は、単独標的部位に対して高度に特異的な抗体である。さらに、従来の（ポリクローナル）抗体調製（これは、異なる決定因子（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含有する）とは対照的に、各モノクローナル抗体は、標的上の１つの単独決定因子に対する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体の利点は、ハイブリドーマ培養により合成でき、他の免疫グロブリンが混入しないことである。修飾語「モノクローナル」は、抗体が、本質的に均質な抗体集団から得られるという特徴のことをいうが、何らかの特別なプロセスにより抗体を生成する必要があることを意味しない。例えば、本発明で用いるモノクローナル抗体は、従来の技術によりファージ抗体ライブラリーから単離できる。本発明に従って用いる親のモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６、４９５頁（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法により生成できるか、又は組換え法により生成できる。 Definition
Monoclonal antibody As used herein, the term “monoclonal antibody” refers to an antibody obtained from a group of essentially homologous antibodies, ie, each of the antibodies contained in this group has several spontaneous Identical except that the mutant may be present in very small amounts. A monoclonal antibody is an antibody that is highly specific for a single target site. Furthermore, in contrast to conventional (polyclonal) antibody preparations, which typically contain different antibodies to different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed to one single determinant on the target. In addition to its specificity, the advantage of monoclonal antibodies is that they can be synthesized by hybridoma culture and are not contaminated with other immunoglobulins. The modifier “monoclonal” refers to the characteristic that antibodies are obtained from an essentially homogeneous antibody population, but does not imply that antibodies need to be produced by any particular process. For example, the monoclonal antibody used in the present invention can be isolated from a phage antibody library by conventional techniques. Parental monoclonal antibodies for use in accordance with the present invention can be produced by the hybridoma method first described by Kohler and Milstein, Nature 256, 495 (1975), or can be produced by recombinant methods.

相補性決定領域（ＣＤＲ）
本明細書で用いる場合、用語「相補性決定領域」は、免疫グロブリンのような結合分子の可変領域中の配列のことをいう。典型的に、相補性決定領域は、抗原上の認識されるエピトープに相補的（形状及び電荷分布の点で）な抗原結合部位を主にもたらす。ＣＤＲ領域は、タンパク質若しくはタンパク質断片の直鎖状エピトープ、不連続エピトープ又は立体構造エピトープに特異的であり得る。これらのエピトープは、それらの天然の立体構造でタンパク質上に存在するか、又は変性形（例えばＳＤＳ中での可溶化により）でタンパク質上に存在する場合もある。エピトープは、翻訳後修飾タンパク質で構成されることもできる。 Complementarity determining region (CDR)
As used herein, the term “complementarity determining region” refers to a sequence in the variable region of a binding molecule such as an immunoglobulin. Typically, the complementarity determining region primarily provides an antigen binding site that is complementary (in terms of shape and charge distribution) to the recognized epitope on the antigen. The CDR regions can be specific for linear epitopes, discontinuous epitopes or conformational epitopes of a protein or protein fragment. These epitopes may be present on the protein in their native conformation or may be present on the protein in a denatured form (eg, by solubilization in SDS). An epitope can also be composed of post-translationally modified proteins.

ポリヌクレオチド
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」は、ストリンジェントな条件下で本質的に同一のヌクレオチド配列とハイブリダイズでき（天然ヌクレオチドと全く同じように）、及び／又は天然ヌクレオチドと全く同じように同一アミノ酸に翻訳できる限り、デオキシリボ−ポリヌクレオチド、リボ−ポリヌクレオチド又は天然のリボヌクレオチドの本質的な特性を有するそれらの類似体を含む。ポリヌクレオチドは、天然若しくは異種構造又は調節遺伝子の全長配列若しくはサブシークエンスであり得る。そうでないと明記しない限り、この用語は、特定の配列及びその相補配列を含む。よって、用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で用いる場合、安定性又は他の理由のために改変された原則的な鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。 Polynucleotide As used herein, a “polynucleotide” is capable of hybridizing under stringent conditions to essentially the same nucleotide sequence (just like natural nucleotides) and / or identical to natural nucleotides. So long as they can be translated into the same amino acid, including deoxyribo-polynucleotides, ribo-polynucleotides or analogs thereof having the essential properties of natural ribonucleotides. A polynucleotide can be a natural or heterologous structure or a full-length sequence or subsequence of a regulatory gene. Unless otherwise stated, the term includes the specific sequence and its complementary sequence. Thus, the term “polynucleotide” as used herein includes principal strand DNA or RNA modified for stability or other reasons.

ポリペプチド
本明細書で用いる場合、用語「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマーのことをいう「ペプチド」及び「タンパク質」と交換可能に用いることができる。この用語は、１若しくは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的類似体であるアミノ酸ポリマーのために用いられ、天然アミノ酸ポリマーのために用いられる。天然アミノ酸のこのような類似体の本質的な特性は、該類似体をタンパク質に組み込んだ場合に、タンパク質が、同一であるが完全に天然のアミノ酸で構成されるタンパク質により刺激される抗体と特異的に反応できることである。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、それらに限定されないがリン酸化、グリコシル化、脂質付加、硫化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化及びＡＤＰ−リボシル化を含む改変も含む。 Polypeptide As used herein, the term “polypeptide” can be used interchangeably with “peptide” and “protein”, which refers to a polymer of amino acid residues. The term is used for an amino acid polymer in which one or more amino acid residues are artificial analogs of the corresponding natural amino acid, and is used for a natural amino acid polymer. The essential properties of such analogs of natural amino acids are that when the analog is incorporated into a protein, the protein is specific to antibodies stimulated by proteins that are identical but composed entirely of natural amino acids. It can react. The terms “polypeptide”, “peptide” and “protein” include, but are not limited to, phosphorylation, glycosylation, lipid addition, sulfurization, γ-carboxylation of glutamic acid residues, hydroxylation and ADP-ribosylation. Including.

特異的結合
本明細書で用いる場合、抗体と抗原のようなその結合パートナーとの間の相互作用に関して言及する用語「特異的結合」は、上記の相互作用が、抗原決定因子又はエピトープの存在のような結合パートナー上の特定の構造の存在に依存することを意味する。言い換えると、上記の結合パートナーが他の分子又は生物の混合物中に存在しても、上記の抗体が、上記の結合パートナーとまだ優先的に結合又は認識する。上記の結合は、共有相互作用若しくは非共有相互作用又は２つの相互作用の両方により媒介できる。つまり、用語「特異的結合」は、抗原又はその断片との免疫特異的結合及び他の抗原との非免疫特異的結合のことをいう。免疫特異的結合の結合分子は、放射性免疫分析（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＢＩＡＣＯＲＥ又は当技術分野において既知のアッセイにより決定されるより低い親和性で他のペプチド又はポリペプチドと結合できる。結合分子又は抗原と免疫特異的に結合するその断片は、関連抗原と交差反応できる。好ましくは、結合分子又は抗原と免疫特異的に結合するその断片は、他の抗原と交差反応しない。 Specific binding As used herein, the term “specific binding”, which refers to the interaction between an antibody and its binding partner, such as an antigen, refers to the interaction described above in the presence of an antigenic determinant or epitope. Is dependent on the presence of a particular structure on such a binding partner. In other words, even if the binding partner is present in a mixture of other molecules or organisms, the antibody still binds or recognizes the binding partner preferentially. Such binding can be mediated by either covalent or non-covalent interactions or by two interactions. That is, the term “specific binding” refers to immunospecific binding to an antigen or fragment thereof and non-immunospecific binding to other antigens. A binding molecule for immunospecific binding may be associated with other peptides or polypeptides with a lower affinity as determined by radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), BIACORE or assays known in the art. Can be combined. A binding molecule or fragment thereof that immunospecifically binds to an antigen can cross-react with related antigens. Preferably, a binding molecule or fragment thereof that immunospecifically binds to an antigen does not cross-react with other antigens.

機能的変異体
本明細書で用いる場合、用語「機能的変異体」は、親の結合分子のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列と比較した場合に１若しくは複数のヌクレオチド及び／又はアミノ酸を改変するヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を含むが、親の結合分子の結合パートナー（例えばＣＥＡ）とまだ競合的に結合できる結合分子のことをいう。言い換えると、親の結合分子のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列における改変が、上記のヌクレオチド配列によりコードされるか又は上記のアミノ酸配列を含む結合分子の結合特異性に著しく影響しないか又はそれを変化させない、すなわち上記の結合分子が、その標的部位をまだ認識し、それと結合できる。上記の機能的変異体は、ヌクレオチド又はアミノ酸の置換、付加及び欠失を含む保存配列改変を有することができる。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発及びランダムＰＣＲ媒介突然変異誘発のような当技術分野において既知の標準的な技術により導入でき、天然及び非天然のヌクレオチド並びにアミノ酸を含むことができる。 Functional variants As used herein, the term “functional variant” refers to nucleotides that modify one or more nucleotides and / or amino acids when compared to the nucleotide and / or amino acid sequence of a parent binding molecule and A binding molecule that includes an amino acid sequence but can still competitively bind to a binding partner (eg, CEA) of a parent binding molecule. In other words, alterations in the nucleotide and / or amino acid sequence of the parent binding molecule do not significantly affect or alter the binding specificity of the binding molecule encoded by or comprising the amino acid sequence. That is, the binding molecule described above can still recognize and bind to its target site. The functional variants described above can have conservative sequence modifications including nucleotide or amino acid substitutions, additions and deletions. These modifications can be introduced by standard techniques known in the art, such as site-directed mutagenesis and random PCR-mediated mutagenesis, and can include natural and non-natural nucleotides and amino acids.

保存アミノ酸置換は、同様の構造又は化学的特異性を有するアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置き換えを含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーが決定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。当業者は、上記以外のアミノ酸残基ファミリー分類も用いることができることを理解している。さらに、変異体は、異なる構造又は化学的特性を有するアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置き換えのような非保存アミノ酸置換も有することができる。同様の小さい変化は、アミノ酸の欠失若しくは挿入又は両方も含み得る。アミノ酸残基を、その免疫学的活性を消去することなく置換、挿入又は欠失できることを決定するための指示は、当技術分野において既知のコンピュータプログラムを用いて見出すことができる。   Conservative amino acid substitutions include the replacement of amino acid residues with amino acid residues having similar structure or chemical specificity. A family of amino acid residues having similar side chains has been determined. These families include basic side chains (eg lysine, arginine, histidine), acidic side chains (eg aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (eg glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, Tryptophan), non-polar side chains (eg alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine), β-branched side chains (eg threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (eg tyrosine, phenylalanine, tryptophan, Amino acids having histidine). Those skilled in the art understand that other amino acid residue family classifications can also be used. Furthermore, the variant can also have non-conservative amino acid substitutions, such as replacement of amino acid residues with amino acid residues having different structural or chemical properties. Similar minor changes may include amino acid deletions or insertions or both. Instructions for determining that an amino acid residue can be substituted, inserted or deleted without erasing its immunological activity can be found using computer programs known in the art.

ヌクレオチド配列中の変異は、トランジション変異若しくはトランスバージョン変異のような遺伝子座において生じる単独変異（部位変異）であり得るか、又は単独の座における複数のヌクレオチドの挿入、欠失若しくは変化であり得る。さらに、１又は複数の変化を、ヌクレオチド配列内の任意の数の座において作製できる。変異は、当技術分野において既知の適当な方法により行うことができる。   Mutations in the nucleotide sequence can be single mutations (site mutations) occurring at the locus, such as transition mutations or transversion mutations, or can be insertions, deletions or changes of multiple nucleotides at a single locus. Furthermore, one or more changes can be made at any number of loci within the nucleotide sequence. Mutations can be made by any suitable method known in the art.

キメラ抗体
キメラ抗体を生成するための方法は、当業者により得ることができる。例えば、軽鎖及び重鎖はそれぞれ、例えば免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖を用いて別々のプラスミドにおいて発現できる。次いで、これらを精製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて完全抗体としてアセンブリする。このようなアセンブリを遂行するための方法は、記載されている。例えばＳｃｈａｒｆｆ，Ｍ．、Ｈａｒｖｅｙ Ｌｅｃｔｕｒｅｓ ６９：１２５頁（１９７４）を参照されたい。Ｏｉら、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（４）：２１４〜２２１頁（１９８６）；及びＳｕｎら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ５（１９８６）Ｓｕｐｐｌ １：５１７〜２０頁も参照されたい。 Chimeric antibodies Methods for producing chimeric antibodies can be obtained by those skilled in the art. For example, the light and heavy chains can be expressed on separate plasmids using, for example, an immunoglobulin light chain and an immunoglobulin heavy chain, respectively. They are then purified and assembled as complete antibodies in vitro. A method for accomplishing such assembly has been described. For example, Scharff, M .; Harvey Lecture 69: 125 (1974). See also Oi et al., Bio Technologies 4 (4): 214-221 (1986); and Sun et al., Hybridoma 5 (1986) Suppl 1: 517-20.

回収した単離軽鎖及び重鎖からＩｇＧ抗体を形成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ反応パラメータも記載されている。例えばＢｅｙｃｈｏｋ，Ｓ．、Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、６９頁、１９７９を参照されたい。軽鎖と重鎖との細胞内会合を遂行するように同じ細胞内で軽鎖と重鎖とを同時発現させ、次いでそれらを連結して完全Ｈ２Ｌ２ＩｇＧ抗体を形成することも可能である。このような同時発現は、同じ宿主細胞内で同じ又は異なるプラスミドを用いて達成できる。 In vitro reaction parameters for forming IgG antibodies from recovered isolated light and heavy chains are also described. For example, Beychok, S .; , Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, New York, p. 69, 1979. It is also possible to co-express the light and heavy chains in the same cell to accomplish intracellular association of the light and heavy chains and then link them to form a complete H 2 L 2 IgG antibody. is there. Such co-expression can be achieved using the same or different plasmids in the same host cell.

ヒト化抗体
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又は非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するその断片（例えば抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２断片又は標的と結合する他の配列）である。一般的に、ヒト化抗体は、全て又は本質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、全て又は本質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域のものである、ほぼ完全な可変領域の少なくとも１つ、及び通常２つである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含有でき、これは、通常、選択されたヒト免疫グロブリン鋳型の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分である。 "Humanized" forms of humanized antibodies non-human (e.g., murine) antibodies are chimeric immunoglobulins, immunoglobulin chains or contain minimal sequence derived from a fragment (e.g., an antibody Fv, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 fragments or other sequences that bind to the target). Generally, a humanized antibody has all or essentially all of the CDR regions corresponding to those of a non-human immunoglobulin, and all or essentially all of the FR regions are of a region of a human immunoglobulin consensus sequence. , At least one of the almost complete variable regions, and usually two. A humanized antibody can also contain at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), which is typically at least a portion of the immunoglobulin constant region of a selected human immunoglobulin template.

ベクター
用語「ベクター」は、別の核酸を宿主細胞に導入して複製し、あるいくつかの場合には発現させるために別の核酸を挿入できる核酸分子のことをいう。言い換えると、ベクターは、連結された核酸分子を移動させることができる。クローニングベクター及び発現ベクターはともに、本発明で用いる用語「ベクター」に包含される。ベクターは、それらに限定されないが、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）並びに植物若しくは動物（ヒトを含む）のファージ又はウイルスに由来するベクターを含む。ベクターは、所定の宿主により認識される複製起点を含有する。発現ベクターの場合、ベクターは、プロモーター及び宿主により認識される他の調節領域も含有する。別の核酸分子を含有するベクターは、形質転換、トランスフェクションにより又はウイルス侵入機構を用いることにより細胞に導入できる。いくつかのベクターは、宿主細胞内で自律複製できる（例えば細菌複製起点を有するベクターは、細菌内で複製できる）。他のベクターは、宿主に導入された場合に宿主のゲノムに組み込まれ、そのことにより宿主のゲノムと一緒に複製できる。 The vector term "vector" refers to a nucleic acid molecule into which another nucleic acid can be introduced and replicated into a host cell and inserted in some cases for expression. In other words, the vector can move the linked nucleic acid molecules. Both cloning vectors and expression vectors are encompassed by the term “vector” as used in the present invention. Vectors include, but are not limited to, vectors derived from plasmids, cosmids, bacterial artificial chromosomes (BAC) and yeast artificial chromosomes (YAC) and plant or animal (including human) phages or viruses. A vector contains an origin of replication that is recognized by a given host. In the case of expression vectors, the vector also contains a promoter and other regulatory regions recognized by the host. A vector containing another nucleic acid molecule can be introduced into the cell by transformation, transfection, or by using a viral entry mechanism. Some vectors are capable of autonomous replication in a host cell (eg, vectors having a bacterial origin of replication can replicate in bacteria). Other vectors are integrated into the host genome when introduced into the host, and thereby can be replicated together with the host genome.

作動可能に連結した
用語「作動可能に連結した」とは、２つ以上の核酸要素が物理的に通常連結され、互いに機能的関係を有することを意味する。例えば、プロモーターが、コード配列の転写若しくは発現を開始又は調節できるならば、プロモーター及び上記のコード配列は、作動可能に連結しており、この場合、コード配列は、プロモーターの「制御」下であると解釈される。 The term “operably linked” operably linked means that two or more nucleic acid elements are usually physically linked and have a functional relationship to each other. For example, if a promoter can initiate or regulate transcription or expression of a coding sequence, the promoter and the coding sequence described above are operably linked, in which case the coding sequence is under “control” of the promoter. Is interpreted.

宿主
本明細書で用いる場合、用語「宿主」は、発現ベクターのようなベクターが導入された生物又は細胞のことをいう。上記の生物又は細胞は、原核若しくは真核の生物又は細胞であり得る。この用語は、ある対象の生物又は細胞のみに言及するのではなく、この生物又は細胞の子孫にも言及すると理解される。変異又は環境の影響により、いくつかの改変が後続の世代に生じ、よって、このような子孫は、親の生物又は細胞と実際上異なるが、これらは、本明細書で用いる場合の用語「宿主」の範囲内にまだ含まれる。 Host As used herein, the term “host” refers to an organism or cell into which a vector such as an expression vector has been introduced. Said organism or cell may be a prokaryotic or eukaryotic organism or cell. It is understood that this term refers not only to an organism or cell of interest, but also to the progeny of this organism or cell. Due to mutations or environmental influences, some modifications occur in subsequent generations, and thus such offspring are effectively different from the parent organism or cell, but as used herein, the term “host ”Still within the scope.

薬学的に許容される賦形剤
「薬学的に許容される賦形剤」は、医薬、活性剤又は結合分子のような活性分子と組み合わせて適度な又は簡便な剤形を調製する任意の不活性な薬剤のことをいう。「薬学的に許容される賦形剤」は、用いられる投与量及び濃度にて宿主にとって非毒性であり、医薬、薬又は結合分子を含有する調製物の他の成分と適合できる賦形剤である。 Pharmaceutically acceptable excipients “Pharmaceutically acceptable excipients” are any inability to prepare a modest or convenient dosage form in combination with an active molecule such as a pharmaceutical, active agent or binding molecule. An active drug. A “pharmaceutically acceptable excipient” is an excipient that is non-toxic to the host at the dosage and concentration used and is compatible with the other ingredients of the preparation containing the medicament, drug or binding molecule. is there.

治療有効量
用語「治療有効量」は、がんを効果的に予防、改善及び／又は治療できる本発明の抗体の量を意味する。 The term “therapeutically effective amount” means the amount of an antibody of the present invention that can effectively prevent, ameliorate and / or treat cancer.

治療
用語「治療」は、疾患を治癒又は疾患を予防若しくは疾患の進行を少なくとも遅らせるために用いる治療的治療或いは予防的措置のことをいう。治療される対象は、がんに罹患している対象及びがんの予防を必要とする対象を含む。がんから部分的又は完全に回復した対象も治療を必要とする。予防は、がんの進行を阻害若しくは遅くすること或いはがんに関連する１若しくは複数の症状の発症、発生又は進行を阻害又は低減することを含む。 The therapeutic term “treatment” refers to a therapeutic treatment or preventive measure used to cure a disease or prevent a disease or at least slow the progression of a disease. Subjects to be treated include subjects suffering from cancer and subjects in need of cancer prevention. Subjects who have partially or fully recovered from cancer also require treatment. Prevention includes inhibiting or slowing the progression of cancer or inhibiting or reducing the onset, occurrence or progression of one or more symptoms associated with cancer.

本記載では、用語「含む」は、言及した要素、整数若しくはステップ又は要素、整数若しくはステップの群を含むが、他の要素、整数若しくはステップ又は要素、整数若しくはステップの群を排除しないことを意味する。   In this description, the term “comprising” means including the stated element, integer or step or element, integer or step, but not excluding another element, integer or step or element, integer or step group. To do.

一態様では、本発明は、モノクローナル抗体の重鎖が、配列番号７〜９に示すＣＤＲ領域を含み、モノクローナル抗体の軽鎖が、配列番号１０〜１２に示すＣＤＲ領域を含む、癌胎児性抗原に対するヒト化キメラモノクローナル抗体又はその機能的変異体を提供する。   In one aspect, the invention provides an oncofetal antigen wherein the heavy chain of the monoclonal antibody comprises the CDR regions shown in SEQ ID NOs: 7-9 and the light chain of the monoclonal antibody comprises the CDR regions shown in SEQ ID NOs: 10-12. A humanized chimeric monoclonal antibody against or a functional variant thereof is provided.

一態様では、本発明は、抗体の軽鎖タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１を含むか又は配列番号１からなり、重鎖タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２を含むか又は配列番号２からなる抗ＣＥＡ抗体又はその機能的変異体を提供する。本発明の好ましい実施形態では、抗ＣＥＡ抗体は、組換え又はモノクローナル抗体である。別の好ましい実施形態では、前記抗体は、キメラ又はヒト化抗体である。   In one aspect, the invention provides that the light chain protein amino acid sequence of the antibody comprises or consists of SEQ ID NO: 1, and the heavy chain protein amino acid sequence comprises SEQ ID NO: 2 or from SEQ ID NO: 2. An anti-CEA antibody or a functional variant thereof is provided. In a preferred embodiment of the invention, the anti-CEA antibody is a recombinant or monoclonal antibody. In another preferred embodiment, the antibody is a chimeric or humanized antibody.

本出願では、用語「本発明の抗体」は、モノクローナル抗体の重鎖が、配列番号７〜９に示すＣＤＲ領域を含み、モノクローナル抗体の軽鎖が、配列番号１０〜１２に示すＣＤＲ領域を含む、本発明による抗ＣＥＡヒト化キメラモノクローナル抗体又はその機能的変異体のことをいう。具体的に、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の軽鎖タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１を含むか又は配列番号１からなり、重鎖タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２を含むか又は配列番号２からなる。   In the present application, the term “antibody of the present invention” means that the heavy chain of a monoclonal antibody contains the CDR regions shown in SEQ ID NOs: 7 to 9, and the light chain of the monoclonal antibody contains the CDR regions shown in SEQ ID NOs: 10-12. Refers to an anti-CEA humanized chimeric monoclonal antibody according to the present invention or a functional variant thereof. Specifically, the amino acid sequence of the light chain protein of the anti-CEA humanized chimeric antibody comprises or consists of SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the heavy chain protein comprises SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 2. Consists of.

本発明は、前記ヒト化キメラ抗体のものと同一であるＣＤＲ配列を有するポリペプチドにも関し、これは、本発明による前記ヒト化キメラ抗体の生物活性と同等又はそれより高い生物活性を有する。用語「本発明のポリペプチド」は、前記ヒト化キメラ抗体のものと同一であるＣＤＲ配列を有するポリペプチドのことをいい、前記ポリペプチドは、本発明による前記ヒト化キメラ抗体の生物活性と同等又はそれより高い生物活性を有する。   The invention also relates to a polypeptide having a CDR sequence that is identical to that of the humanized chimeric antibody, which has a biological activity equal to or higher than that of the humanized chimeric antibody according to the invention. The term “polypeptide of the invention” refers to a polypeptide having a CDR sequence that is identical to that of the humanized chimeric antibody, the polypeptide being equivalent to the biological activity of the humanized chimeric antibody according to the invention. Or higher biological activity.

別の態様では、本発明は、本発明の抗体若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその相補配列を含む本発明の抗体をコードする核酸に関する。前記核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。ヌクレオチド配列が変化しても、トリプレットコドンの遺伝子ドグマに従って配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体タンパク質に最終的に翻訳できる限りは、それはやはり前記抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体をコードするポリヌクレオチドであることが当技術分野において知られている。   In another aspect, the invention relates to a nucleic acid encoding an antibody of the invention comprising a polynucleotide encoding the antibody or polypeptide of the invention or a complementary sequence thereof. The nucleic acid can be DNA or RNA. As long as the nucleotide sequence changes, as long as it can be finally translated into an antibody protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 according to the triplet codon gene dogma, It is known in the art to be a polynucleotide that encodes.

別の態様では、本発明は、前記抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を調製するために用いることができる組換え発現ベクターを提供する、前記ベクターは、本発明の抗体をコードする核酸を含む。ベクターは、Ｆ、Ｒ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴＯＬ、Ｔｉなどのプラスミド；コスミド；λ、ラムドイド、Ｍ１３、Ｍｕ、Ｐ１、Ｐ２２、Ｑ、Ｔ−ｅｖｅｎ、Ｔ−ｏｄｄ、Ｔ２、Ｔ４、Ｔ７などのファージ；植物ウイルス；又は動物ウイルスに由来できる。ベクターは、クローニング及び／又は発現の目的のため及び遺伝子治療の目的のために用いることができる。１若しくは複数の発現調節核酸分子と作動可能に連結した本発明の抗体をコードする１又は複数の核酸分子を含むベクターも、本発明に含まれる。ベクターの選択は、組換え手順及び用いる宿主に依存する。ベクターを宿主細胞に導入することは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥ−グルカン媒介トランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクション又はエレクトロポレーションにより達成できる。ベクターは、自律複製できるか又はベクターが組み込まれた染色体と一緒に複製できる。好ましくは、前記ベクターは、１又は複数の選択マーカーを含有する。前記マーカーの選択は、選択される宿主細胞に依存でき、本発明にとって重要でなく、当業者に知られている。前記マーカーは、それらに限定されないが、カナマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、ヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）、マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）を含む。具体的に、本発明では、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の軽鎖及び重鎖をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ真核プロモーターを有する２つのベクターに組換えによりクローニングされる。得られる発現ベクターを、真核宿主細胞に導入する。抗体を高い収率で発現する真核宿主細胞をスクリーニングにより得て、前記宿主細胞の培養物の上清は、細胞により分泌された抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体タンパク質を多量に含有する。抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体タンパク質は、当技術分野において既知の技術的方法に従って簡便に抽出及び調製できる。好ましい実施形態では、前記発現ベクターは、それぞれｐＳＲＮＣ−Ｃκ−ＣＥＡ及びｐＳＲＤＣ−Ｃγ１−ＣＥＡであり、これらは、前記抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の遺伝子と、メトトレキセートストレス増幅発現選択マーカー遺伝子（ｄｈｆｒ）とを含有し、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現できる。好ましい実施形態では、前記宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯである。   In another aspect, the invention provides a recombinant expression vector that can be used to prepare the anti-CEA humanized chimeric antibody, wherein the vector comprises a nucleic acid encoding an antibody of the invention. Vectors include plasmids such as F, R1, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti; cosmids; λ, lambda, M13, Mu, P1, P22, Q, T-even, T-odd, T2, T4, T7, etc. From phage; plant viruses; or animal viruses. Vectors can be used for cloning and / or expression purposes and for gene therapy purposes. Also included in the invention are vectors comprising one or more nucleic acid molecules encoding an antibody of the invention operably linked to one or more expression-regulating nucleic acid molecules. The choice of vector depends on the recombination procedure and the host used. Introducing the vector into the host cell can be accomplished by calcium phosphate transfection, viral infection, DEAE-glucan mediated transfection, lipofectamine transfection or electroporation. The vector can replicate autonomously or can replicate with the chromosome in which the vector is integrated. Preferably, the vector contains one or more selectable markers. The choice of the marker can depend on the host cell selected and is not critical to the invention and is known to those skilled in the art. Such markers include, but are not limited to, kanamycin, neomycin, puromycin, hygromycin, zeocin, herpes simplex virus thymidine kinase gene (HSV-TK), mouse dihydrofolate reductase gene (dhfr). Specifically, in the present invention, the polynucleotides encoding the light chain and heavy chain of the anti-CEA humanized chimeric antibody are recombinantly cloned into two vectors each having a eukaryotic promoter. The resulting expression vector is introduced into a eukaryotic host cell. Eukaryotic host cells that express the antibody in high yield are obtained by screening, and the culture supernatant of the host cell contains a large amount of anti-CEA humanized chimeric antibody protein secreted by the cells. Anti-CEA humanized chimeric antibody protein can be conveniently extracted and prepared according to technical methods known in the art. In a preferred embodiment, the expression vectors are pSRNC-Cκ-CEA and pSRDC-Cγ1-CEA, respectively, which comprise the anti-CEA humanized chimeric antibody gene, methotrexate stress amplification expression selection marker gene (dhfr), and And can be expressed in Chinese hamster ovary (CHO) cells. In a preferred embodiment, the host cell is a Chinese hamster ovary cell CHO.

本発明は、前記ベクターの１又は複数のコピーを含有する宿主も提供する。好ましくは、前記宿主は、宿主細胞である。宿主細胞は、それらに限定されないが、哺乳動物、植物、昆虫、真菌又は細菌を起源とする細胞を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物細胞を用いる発現系は、本発明において好ましい。好ましい実施形態では、本発明は、ｐＳＲＮＣ−Ｃκ−ＣＥＡ及びｐＳＲＤＣ−Ｃγ１−ＣＥＡを含有するチャイニーズハムスター卵巣細胞である組換え宿主細胞（Ｒｃｃ２４）を提供する。前記組換え宿主細胞は、段階的メトトレキセートストレス増幅発現、発現収率によりスクリーニングした高発現株のサブクローニング及び血清フリー培養における最終的な馴化により得られる。前記宿主細胞は、Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒに、２０１０年５月４日に寄託番号第ＣＧＭＣＣ３８０３号で寄託された。   The invention also provides a host containing one or more copies of the vector. Preferably, the host is a host cell. Host cells include, but are not limited to, cells originating from mammals, plants, insects, fungi or bacteria. Expression systems that use mammalian cells such as Chinese hamster ovary (CHO) cells are preferred in the present invention. In a preferred embodiment, the present invention provides a recombinant host cell (Rcc24) that is a Chinese hamster ovary cell containing pSRNC-Cκ-CEA and pSRDC-Cγ1-CEA. Said recombinant host cells are obtained by stepwise methotrexate stress amplification expression, subcloning of high expression strains screened by expression yield and final acclimation in serum free culture. The host cell was deposited with the China General Microbiological Culture Collection Center on May 4, 2010 under the deposit number CGMCC3803.

本発明の一態様によると、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体タンパク質は、ヒトＣＥＡ陽性腫瘍を診断及び／又は治療するための医薬の調製において用いることができる。追跡分子を本発明の抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体とカップリングさせることにより、ヒトＣＥＡ陽性腫瘍を診断するための医薬を調製できる。前記追跡分子は、放射活性核種（例えば１２５Ｉ、１１１Ｉｎ、９９Ｔｅなど）であり得る。代わりに、ナノ蛍光物質又は遠赤外物質などの臨床的に許容される技術的手段により検出できる他の型の分子を用いることもできる。本発明の好ましい実施形態では、追跡分子は、放射活性核種レニウム−１８８である。追跡分子を抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体とカップリングさせた後に、ＣＥＡ陽性腫瘍は、γカメラ又はイメージャーによる放射性免疫イメージングにより、比較的良好なシグナルノイズ比、標的特性及びイメージング品質で正確に診断できる。 According to one aspect of the invention, the anti-CEA humanized chimeric antibody protein can be used in the preparation of a medicament for diagnosing and / or treating human CEA positive tumors. By coupling the tracking molecule with the anti-CEA humanized chimeric antibody of the present invention, a medicament for diagnosing human CEA positive tumor can be prepared. The tracking molecule may be a radioactive nuclide (eg, 125 I, 111 In, 99 Te, etc.). Alternatively, other types of molecules that can be detected by clinically acceptable technical means such as nanofluorescent materials or far-infrared materials can be used. In a preferred embodiment of the invention, the tracking molecule is the radionuclide rhenium-188. After coupling the tracking molecule with an anti-CEA humanized chimeric antibody, CEA positive tumors can be accurately diagnosed with relatively good signal-to-noise ratio, target characteristics and imaging quality by radioimmunoimaging with a gamma camera or imager .

本発明の抗体は、腫瘍の治療のための医薬組成物の調製において用いることもできる。さらに、放射活性核種などのある治療剤を、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体とカップリングさせて、ヒトＣＥＡ陽性腫瘍の治療のための医薬組成物を調製できる。本明細書で記載する場合、「抗体複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、放射活性核種のような治療用物質を本発明の抗体と、当業者に既知の様々なカップリング法によりカップリングさせることにより得られる複合体のことをいう。前記放射活性核種は、１３１Ｉ及び９０Ｙを含む。本発明の好ましい実施形態では、前記治療用物質は、放射活性核種ヨウ素−１３１である。治療用物質を抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体とカップリングさせた後に、放射性免疫治療をＣＥＡ陽性腫瘍について行うことができ、これは、腫瘍の増殖を著しく阻害でき、優れた治療効果を有し、明らかな毒性及び副作用を本質的に有さない。好ましい実施形態では、抗体又は抗体複合体は、卵巣がん、乳がん、肺がん及び他のＣＥＡ陽性腫瘍を含むＣＥＡを発現する腫瘍の診断又は治療のために用いることができる。好ましい具体的な実施形態では、ＣＥＡを発現する前記腫瘍は、結腸直腸がんである。現存する臨床的診断技術に基づいて、当業者は、患者の血清中のＣＥＡ含量を検出でき、患者の腫瘍がＣＥＡ陽性であるかを決定でき、治療すべき適度な腫瘍の型を容易に選択できる。当業者は、前記医薬組成物が、薬学的に許容される賦形剤も含み得ることも理解している。 The antibodies of the invention can also be used in the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of tumors. In addition, certain therapeutic agents such as radioactive nuclides can be coupled with anti-CEA humanized chimeric antibodies to prepare pharmaceutical compositions for the treatment of human CEA positive tumors. As described herein, an “antibody conjugate” is the coupling of a therapeutic substance, such as a radionuclide, with an antibody of the present invention by various coupling methods known to those skilled in the art. This refers to the complex obtained by The radioactive nuclides include 131 I and 90 Y. In a preferred embodiment of the invention, the therapeutic substance is radioactive nuclide iodine-131. After coupling the therapeutic substance with anti-CEA humanized chimeric antibody, radioimmunotherapy can be performed on CEA positive tumors, which can significantly inhibit the growth of the tumors and has an excellent therapeutic effect, clearly Has essentially no toxicity and side effects. In a preferred embodiment, the antibody or antibody conjugate can be used for the diagnosis or treatment of tumors that express CEA, including ovarian cancer, breast cancer, lung cancer and other CEA positive tumors. In a preferred specific embodiment, said tumor expressing CEA is a colorectal cancer. Based on existing clinical diagnostic techniques, one skilled in the art can detect CEA content in the patient's serum, determine if the patient's tumor is CEA positive, and easily select the appropriate tumor type to be treated it can. One skilled in the art also understands that the pharmaceutical composition may also include a pharmaceutically acceptable excipient.

前記抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体は、それらに限定されないが、非経口投与、例えば経静脈、注入、局部投与などを含む従来の投与経路により、患者に医薬として投与できる。適度な用量は、投与の方法並びに治療される対象及び耐容能レベルを含むいくつかのパラメータに依存する。１３１Ｉ標識抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体が、用量依存的にヒト結腸直腸がんの増殖を著しく阻害できることが明確である。好ましい用量は、１２．５ｍＣｉ／ｋｇであり、治療は、１０日間隔で２回行った。 The anti-CEA humanized chimeric antibody can be administered as a medicament to a patient by conventional administration routes including, but not limited to, parenteral administration, eg, intravenous, infusion, topical administration, and the like. The appropriate dose will depend on a number of parameters including the mode of administration and the subject being treated and tolerability level. It is clear that 131 I-labeled anti-CEA humanized chimeric antibody can significantly inhibit the growth of human colorectal cancer in a dose-dependent manner. A preferred dose was 12.5 mCi / kg and treatment was performed twice at 10 day intervals.

本発明を、以下の実施例によりさらに説明するが、いずれの実施例又はそれらの組み合わせも、本発明の範囲又は実施形態を限定すると解釈されない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義される。当技術分野における常識と組み合わせた本明細書の記載に基づいて、当業者は、特許請求の範囲により定義される範囲を明確に理解できる。   The present invention is further illustrated by the following examples, which are not to be construed as limiting the scope or embodiments of the invention. The scope of the present invention is defined by the appended claims. Based on the description of the present specification combined with common sense in the technical field, those skilled in the art can clearly understand the scope defined by the claims.

生物材料の寄託情報
生物材料の寄託情報
親のマウスモノクローナル抗体を生成するマウスハイブリドーマ細胞株Ｃ２４は、Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＭＣＣ、Ｂｅｉｃｈｅｎｘｉ Ｒｏａｄ １−３ ｉｎ Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ ｏｆ Ｂｅｉｊｉｎｇ、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、２０１０年５月４日に寄託番号第ＣＧＭＣＣ３８０２号で寄託した。 Deposited information on biological materials Deposited information on biological materials The mouse hybridoma cell line C24, which produces the mouse monoclonal antibody of the parent, is a Chinese General Microbiological Collection Center (CGMCC, Beichenxi Rad infusion Dit. Deposited on May 4, 2010 under the deposit number CGMCC3802 at Chinese Academy of Sciences.

ヒト化キメラモノクローナル抗体を生成するＣＨＯ細胞株Ｒｃｃ２４は、Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＭＣＣ、Ｂｅｉｃｈｅｎｘｉ Ｒｏａｄ １−３ ｉｎ Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ ｏｆ Ｂｅｉｊｉｎｇ、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、２０１０年５月４日に寄託番号第ＣＧＭＣＣ３８０３号で寄託した。   The CHO cell line Rcc24 that produces humanized chimeric monoclonal antibodies was established in China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC, Beichenxi Road 1-3 in Chowing Digest of Beijing, Deposit was made with the deposit number CGMCC3803 on the 4th.

実施例１：キメラ抗体についての遺伝子のクローニング及び配列決定
遺伝子クローニング法を用いて、親の抗ＣＥＡマウスのモノクローナル抗体中の軽鎖及び重鎖可変領域についての遺伝子をクローニングし、ヌクレオチド配列分析を行った。 Example 1: Gene Cloning and Sequencing for Chimeric Antibody Using the gene cloning method, the genes for the light and heavy chain variable regions in the monoclonal antibody of the parent anti-CEA mouse were cloned and subjected to nucleotide sequence analysis. It was.

親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体の可変領域についての遺伝子を増幅するための方法：マウスモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞Ｃ２４からの全ＲＮＡの抽出を、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）試薬（Ｇｉｂｃｏ）の使用説明に従って次のようにして行った。１×１０７マウスモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞を回収し、１００００ｒｐｍにて１分間遠心分離した。ピペット操作で上清を捨てた後に、１ｍｌのトリゾールを加えて細胞を十分に溶解させた。室温にて３〜５分間静置した後に、０．２ｍｌのクロロホルムを加えた。転倒させて混和した後に、試料を４℃、１２０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、次いで０．６ｍｌの上清を新しい遠心分離チューブに移し、０．５ｍｌのイソプロパノールを加えた。転倒させて混和した後に、試料を室温にて５〜１０分間静置し、次いで４℃、１２０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。上清を捨てた後に、試料を７５％エタノールで１回洗浄し、風乾し、次いで５０μｌのｄｄＨ２Ｏを加えて沈殿物を溶解した。マウスモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞ｃＤＮＡの第１鎖の合成を、製造業者により提供される使用説明に従ってＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ）を用いて行った。４μｌの５×緩衝液、１０ｍＭのＤＤＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１０μｇの全ＲＮＡ、０．５ｍＭの最終濃度のｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１０μｇ／ｍｌの最終濃度のオリゴｄ（Ｔ）１５（Ｐｒｏｍｅｇａ）、４０ｕのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２００ｕ（Ｕ）のＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ）を２０μｌの系に加え、これらを次いで混和した。試料を３７℃にて１時間、次いで沸騰した水で５分間インキュベートして逆転写酵素を不活性化させた。マウスモノクローナル抗体軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子の増幅を、高正確性ＤＮＡポリメラーゼＴａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）＋Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、１０×緩衝液１０μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ２μｌ、ｃＤＮＡ ２０μｌ、各増幅プライマー５０ｐｍｏｌを含有する１００μｌの反応系において行った。反応系の表面を、混和の後にパラフィン油で覆った。９５℃の水浴中で５分間インキュベートした後に、１〜２ｕのＴａｑ＋Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを、パラフィン油を通して加え、以下のサイクルを開始した：９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で１分間を３０サイクル、並びに最後のサイクルにおいて７２℃で１０分間。ＰＣＲプライマー：軽鎖可変領域の増幅用プライマー：ＰＶＬ５：５’−ＧＡＣＡＴ ＴＣＡＧＣ ＴＧＡＣＣ ＣＡＧＴＣ ＴＣＣＡ−３’（配列番号３）；ＰＶＬ３：５’−ＧＴＴＡＧ ＡＴＣＴＣ ＣＡＧＣＴ ＴＧＧＴＣ ＣＣ−３’（配列番号４）。重鎖可変領域の増幅用プライマー：ＰＶＨ５：５’−ＡＧＧＴＳ ＭＡＲＣＴ ＧＣＡＧＳ ＡＧＴＣＷ ＧＧ−３’（Ｓ＝Ｃ／Ｇ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｗ＝Ａ／Ｔ）（配列番号５）；ＰＶＨ３：５’−ＴＧＡＧＧ ＡＧＡＣＧ ＧＴＧＡＣ ＣＧＴＧＧ ＴＣＣＣＴ ＴＧＧＣＣ ＣＣＡＧ−３’（配列番号６）。 Method for amplifying the gene for the variable region of the parent anti-CEA mouse monoclonal antibody: Extraction of total RNA from mouse monoclonal antibody hybridoma cell C24 is as follows according to instructions for use of Trizol reagent (Gibco) I went. 1 × 10 7 mouse monoclonal antibody hybridoma cells were collected and centrifuged at 10,000 rpm for 1 minute. After discarding the supernatant by pipetting, 1 ml of trizol was added to fully lyse the cells. After standing at room temperature for 3-5 minutes, 0.2 ml of chloroform was added. After inverting and mixing, the sample was centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., then 0.6 ml of the supernatant was transferred to a new centrifuge tube and 0.5 ml of isopropanol was added. After mixing by inversion, the sample was allowed to stand at room temperature for 5 to 10 minutes, and then centrifuged at 4 ° C. and 12000 rpm for 10 minutes. After discarding the supernatant, the sample was washed once with 75% ethanol, air dried, and then 50 μl ddH 2 O was added to dissolve the precipitate. Synthesis of the first strand of mouse monoclonal antibody hybridoma cell cDNA was performed using MMLV reverse transcriptase (Gibco) according to the instructions provided by the manufacturer. 4 μl of 5 × buffer, 10 mM DDT (Promega), 10 μg total RNA, 0.5 mM final concentration of dNTP (Promega), 10 μg / ml final concentration of oligo d (T) 15 (Promega), 40 u RNasin (Promega), 200u (U) of MMLV reverse transcriptase (Gibco) was added to a 20 μl system which was then mixed. Samples were incubated at 37 ° C. for 1 hour and then in boiling water for 5 minutes to inactivate reverse transcriptase. Amplification of mouse monoclonal antibody light chain and heavy chain variable region genes was performed using high-precision DNA polymerase Taq (Promega) + Pfu DNA polymerase (Promega), 10 × buffer 10 μl, 10 mM dNTP 2 μl, cDNA 20 μl, each amplification primer Performed in a 100 μl reaction containing 50 pmol. The surface of the reaction system was covered with paraffin oil after mixing. After incubation for 5 minutes in a 95 ° C. water bath, 1-2 u Taq + Pfu DNA polymerase was added through paraffin oil and the following cycles were started: 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 1 minute. 30 cycles as well as 10 minutes at 72 ° C. in the last cycle. PCR primer: Primer for amplification of light chain variable region: PVL5: 5′-GACAT TCAGC TGACC CAGTC TCCA-3 ′ (SEQ ID NO: 3); PVL3: 5′-GTTAG ATCTC CAGCT TGGTC CC-3 ′ (SEQ ID NO: 4). Primer for amplification of heavy chain variable region: PVH5: 5′-AGGTS MARCT GCAGS AGTCW GG-3 ′ (S = C / G, M = A / C, R = A / G, W = A / T) (SEQ ID NO: 5); PVH3: 5′-TGAGG AGACG GTGAC CGTGG TCCCT TGGCC CCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 6).

０．７％非変性アガロースゲル電気泳動を行って、全ＲＮＡを分析した。１８Ｓ ＲＮＡ及び２８Ｓ ＲＮＡのサイズは正しく、明度比率は約１：２であり、バンドは明確であり、これらのことは、抽出した全ＲＮＡが比較的完全であったことを示した（図１）。オリゴｄ（Ｔ）１５をプライマーとして用いて、ｃＤＮＡの第１鎖を合成し、このｃＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行った。軽鎖プライマーＰＶＬ５及びＰＶＬ３を用いることにより、約３２０ｂｐの軽鎖可変領域の遺伝子断片を増幅し、重鎖プライマーＰＶＨ５及びＰＶＨ３を用いることにより、約３６０ｂｐの重鎖可変領域の遺伝子断片を増幅した。鋳型を含まないブランク対照は、増幅バンドを示さなかった（図２）。増幅された可変領域遺伝子断片のサイズは、通常の抗体の可変領域遺伝子のサイズと一致した。   Total RNA was analyzed by 0.7% non-denaturing agarose gel electrophoresis. The size of 18S RNA and 28S RNA was correct, the lightness ratio was about 1: 2, and the bands were clear, indicating that the total RNA extracted was relatively complete (Figure 1). . The first strand of cDNA was synthesized using oligo d (T) 15 as a primer, and PCR was performed using this cDNA as a template. The light chain primer PVL5 and PVL3 were used to amplify the gene fragment of the light chain variable region of about 320 bp, and the heavy chain primer PVH5 and PVH3 were used to amplify the gene fragment of the heavy chain variable region of about 360 bp. The blank control without template showed no amplification band (Figure 2). The size of the amplified variable region gene fragment was consistent with the size of the variable region gene of a normal antibody.

親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体軽鎖、重鎖可変領域の遺伝子のクローニング、配列決定及び遺伝子構造分析：親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体軽鎖可変領域の遺伝子断片を、大量に増幅した。グラスミルク吸着法を用いて単離及び回収した後に、断片を、ＰｖｕＩＩ及びＢｇｌＩＩ二重消化に供し、次いで、クローニングベクターｐＲＧＷＬの対応する部位にクローニングした。１５３個全ての形質転換クローンのうち、２４個のクローンをスクリーニングのためにランダムに採取し、６個の組換えクローンを得た。３個のＶＬ遺伝子組換えクローンをヌクレオチド配列分析のために選択した。ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を図３に示した。３個のクローンの配列は同一であり、クローニングされた抗体軽鎖可変領域遺伝子が、実際に親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体軽鎖可変領域遺伝子であったことを示した。１個のクローンを３個のクローンからランダムに採取し、ｐＲＧＷＬ−Ｃ５０２と命名した。Ｋａｂａｔのデータとの比較から、親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体のＶＬ（配列番号２）がマウスκ軽鎖ＶＩサブグループに属することがわかる。軽鎖ＣＤＲ１〜３配列（配列番号１０〜１２）を図３に示した。親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体重鎖可変領域の遺伝子断片を、大量に増幅した。グラスミルク吸着法を用いて単離及び回収した後に、断片を、ＰｓｔＩ及びＢｓｔＥＩＩ二重消化に供し、次いで、クローニングベクターｐＲＧＷＨの対応する部位にクローニングした。３６４個全ての形質転換クローンのうち、２４個のクローンをスクリーニングのためにランダムに採取し、１８個の組換えクローンを得た。３個のＶＨ遺伝子組換えクローンをヌクレオチド配列分析のために選択した。ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を図３に示した。３個のクローンの配列は同一であり、クローニングされた抗体重鎖可変領域遺伝子が、実際に親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体重鎖可変領域遺伝子であったことを示した。１個のクローンを３個のクローンからランダムに採取し、ｐＲＧＷＨ−Ｃ５０４と命名した。Ｋａｂａｔのデータとの比較から、親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体のＶＨ（配列番号１）が、マウス重鎖ＩＩ（Ｂ）サブグループに属することがわかる。重鎖ＣＤＲ１〜３配列（配列番号７〜９）を図３に示した。具体的に、配列番号７〜１２の配列は、次のとおりである：
配列番号７−Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｈｉｓ
配列番号８−Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｇｌｙ
配列番号９−Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ
配列番号１０−Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｈｉｓ
配列番号１１−Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ
配列番号１２−Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Cloning, sequencing and gene structure analysis of parent anti-CEA mouse monoclonal antibody light chain and heavy chain variable region genes: Gene fragments of parent anti-CEA mouse monoclonal antibody light chain variable regions were amplified in large quantities. After isolation and recovery using the glass milk adsorption method, the fragments were subjected to PvuII and BglII double digestion and then cloned into the corresponding sites of the cloning vector pRGWL. Of all 153 transformed clones, 24 clones were randomly picked for screening to obtain 6 recombinant clones. Three VL transgenic clones were selected for nucleotide sequence analysis. The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence are shown in FIG. The sequences of the three clones were identical, indicating that the cloned antibody light chain variable region gene was actually the parent anti-CEA mouse monoclonal antibody light chain variable region gene. One clone was randomly picked from 3 clones and named pRGWL-C502. Comparison with Kabat data shows that the parental anti-CEA mouse monoclonal antibody VL (SEQ ID NO: 2) belongs to the mouse kappa light chain VI subgroup. The light chain CDR1-3 sequences (SEQ ID NOs: 10-12) are shown in FIG. The gene fragment of the heavy chain variable region of the parent anti-CEA mouse monoclonal antibody was amplified in large quantities. After isolation and recovery using the glass milk adsorption method, the fragments were subjected to PstI and BstEII double digestion and then cloned into the corresponding sites of the cloning vector pRGWH. Of all 364 transformed clones, 24 clones were randomly picked for screening to obtain 18 recombinant clones. Three VH recombinant clones were selected for nucleotide sequence analysis. The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence are shown in FIG. The sequences of the three clones were identical, indicating that the cloned antibody heavy chain variable region gene was actually the parent anti-CEA mouse monoclonal antibody heavy chain variable region gene. One clone was randomly picked from 3 clones and named pRGWH-C504. Comparison with Kabat data shows that the parent anti-CEA mouse monoclonal antibody VH (SEQ ID NO: 1) belongs to the mouse heavy chain II (B) subgroup. The heavy chain CDR 1-3 sequences (SEQ ID NOs: 7-9) are shown in FIG. Specifically, the sequences of SEQ ID NOs: 7-12 are as follows:
SEQ ID NO: 7-His Tyr Tyr Met His
SEQ ID NO: 8-Trp Ile Asn Pro Glu Asn Val Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln Gly
SEQ ID NO: 9-Tyr Arg Tyr Ala Gly Gly Gly Ala Leu Asp Tyr
SEQ ID NO: 10—Ser Ala Ser Ser Ser Val Tyr Ile His
Sequence number 11-Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
Sequence number 12-Gln Gln Trp Asn Asn Asn Pro Tyr Ser

実施例２：抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体についての遺伝子及び発現ベクターの構築
遺伝子クローニング及びＤＮＡ組換え法を用いて、親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体の可変領域遺伝子を、調節配列及びヒト抗体定常領域遺伝子を含有するベクターに組み換えて、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の遺伝子及び前記遺伝子を含有する真核発現ベクターを構築した。 Example 2: Construction of gene and expression vector for anti-CEA humanized chimeric antibody Using gene cloning and DNA recombination methods, the variable region gene of the parent anti-CEA mouse monoclonal antibody, the regulatory sequence and the human antibody constant region gene The gene of anti-CEA humanized chimeric antibody and a eukaryotic expression vector containing the gene were constructed.

調節配列を有する可変遺伝子断片のＰＣＲ増幅：ＰＣＲ増幅を、高正確性ＤＮＡポリメラーゼ、すなわちＴａｑ＋Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを、１０×緩衝液１０μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ２μｌ、プラスミド１μｇ、５０ｐｍｏｌの各増幅プライマーを含有する１００μｌ反応系において行った。混和の後に、反応系の表面をパラフィン油で覆った。９５℃の水浴中で５分間インキュベートした後に、１〜２ｕのＴａｑ＋Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを、パラフィン油を通して加え、以下のサイクルを開始した：９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で１分間を２０サイクル、並びに最後のサイクルにおいて７２℃で１０分間。   PCR amplification of variable gene fragments with regulatory sequences: PCR amplification is performed with a high accuracy DNA polymerase, ie Taq + Pfu DNA polymerase, 10 μl buffer 10 μl, 10 mM dNTP 2 μl, plasmid 1 μg, 50 μmol each amplification primer containing 50 μmol Performed in the system. After mixing, the surface of the reaction system was covered with paraffin oil. After incubation for 5 minutes in a 95 ° C. water bath, 1-2 u Taq + Pfu DNA polymerase was added through paraffin oil and the following cycles were started: 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 1 minute. 20 cycles as well as 10 minutes at 72 ° C. in the last cycle.

抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の真核発現ベクターの構築及び同定：実施例１において取得及び同定した組換えクローニングプラスミドｐＲＧＷＬ−Ｃ５０２及びｐＲＧＷＨ−Ｃ５０４を鋳型として用いて、クローニングの目的のためにＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限部位を有するプライマーＰＶＬＳ及びＰＶＮＰ（軽鎖について）並びにＰＶＨＳ及びＰＶＮＰ（重鎖について）をＰＣＲ増幅のために用いて、リーダーペプチド配列と５’端スプライシング部位とを有する親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体のＶＬ及びＶＨ配列を増幅した。ＰＣＲ増幅により、リーダーペプチド配列と５’端スプライシング部位とを有する親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体のＶＬ断片を、軽鎖についての組換えプラスミドから増幅し、ＶＬ断片のサイズは約５００ｂｐであった。リーダーペプチド配列と５’端スプライシング部位とを有する親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体のＶＨ断片を、重鎖についての組換えプラスミドから増幅し、サイズは約７００ｂｐであった。ＰＣＲ産物を、グラスミルク法を用いて単離及び回収し、次いで、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩを用いて消化した。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」に記載される従来のＤＮＡ組換え手順に従って、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体遺伝子の完全真核発現ベクターを得るように、ＶＬ断片をｐＳＲＮＣ−Ｃκの対応する部位にクローニングし、ＶＨ断片をｐＳＲＤＣ−Ｃγ１の対応する部位にクローニングした。ＶＬ及びＶＨ断片をそれぞれ発現ベクターｐＳＲＮＣ−Ｃκ及びｐＳＲＤＣ−Ｃγ１に連結した後に、１２個のクローンをそれぞれスクリーニングのために採取した。酵素消化により、９個の軽鎖及び７個の重鎖組換えクローンを得た。ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩによる酵素消化の後に、対応するＶＬ及びＶＨ断片を同定し、このことにより、完全抗癌胎児性抗原モノクローナル抗体遺伝子及びその真核発現ベクターの構築が成功したことが実証された。２回のヌクレオチド配列決定により、抗癌胎児性抗原モノクローナル抗体真核発現ベクターｐＳＲＮＣ−Ｃκ−ＣＥＡ及びｐＳＲＤＣ−Ｃγ１−ＣＥＡ中の可変領域遺伝子配列が、それぞれｐＲＧＷＬ−Ｃ５０２及びｐＲＧＷＨ−Ｃ５０４中に含まれる可変領域遺伝子配列と完全に同一であることが証明された。   Construction and identification of eukaryotic expression vectors of anti-CEA humanized chimeric antibody: BamHI and NotI for cloning purposes using the recombinant cloning plasmids pRGWL-C502 and pRGWH-C504 obtained and identified in Example 1 as templates Parental anti-CEA mouse monoclonal antibody with leader peptide sequence and 5'-end splicing site using primers PVLS and PVNP (for light chain) and PVHS and PVNP (for heavy chain) with restriction sites for PCR amplification The VL and VH sequences were amplified. By PCR amplification, a VL fragment of a parent anti-CEA mouse monoclonal antibody having a leader peptide sequence and a 5'-end splicing site was amplified from the recombinant plasmid for the light chain, and the size of the VL fragment was approximately 500 bp. A VH fragment of a parent anti-CEA mouse monoclonal antibody having a leader peptide sequence and a 5'-end splicing site was amplified from the recombinant plasmid for the heavy chain and was approximately 700 bp in size. The PCR product was isolated and recovered using the glass milk method and then digested with BamHI and NotI. According to the conventional DNA recombination procedure described in “Molecular Cloning”, the VL fragment was cloned into the corresponding site of pSRNC-Cκ to obtain a complete eukaryotic expression vector of the anti-CEA humanized chimeric antibody gene. Was cloned into the corresponding site of pSRDC-Cγ1. After linking the VL and VH fragments to the expression vectors pSRNC-Cκ and pSRDC-Cγ1, respectively, 12 clones were picked for screening, respectively. Nine light chain and seven heavy chain recombinant clones were obtained by enzymatic digestion. After enzymatic digestion with BamHI and NotI, the corresponding VL and VH fragments were identified, demonstrating the successful construction of the complete anti-carcinoembryonic antigen monoclonal antibody gene and its eukaryotic expression vector. The variable region gene sequences in the anti-carcinoembryonic antigen monoclonal antibody eukaryotic expression vectors pSRNC-Cκ-CEA and pSRDC-Cγ1-CEA are included in pRGWL-C502 and pRGWH-C504, respectively, by two nucleotide sequencing. It was proved to be completely identical to the variable region gene sequence.

抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体真核発現ベクターの構造：抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体真核発現ベクター系は、２つの別々の発現ベクター、すなわち軽鎖真核発現ベクターｐＳＲＮＣ−Ｃκ−ＣＥＡと重鎖真核発現ベクターｐＳＲＤＣ−Ｃγ１−ＣＥＡとを含有するが、これらの構造の概略図を図４及び５に示した。   Structure of anti-CEA humanized chimeric antibody eukaryotic expression vector: The anti-CEA humanized chimeric antibody eukaryotic expression vector system consists of two separate expression vectors: light chain eukaryotic expression vector pSRNC-Cκ-CEA and heavy chain eukaryotic Although it contains the expression vector pSRDC-Cγ1-CEA, schematic diagrams of these structures are shown in FIGS.

実施例３：抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の発現ベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞による発現
ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞（本発明者らの実験室にて保管）を、１０％ＦＢＳ、０．０３ｍｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン（Ｈ）、０．００３ｍｍｏｌ／Ｌチミジンデオキシヌクレオシド（Ｔ）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌプロリン（Ｐｒｏ）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌグリシン（Ｇｌｙ）、１００ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍｍｏｌ／Ｌグルタミンを含むＤＭＥＭ完全成長培地中で、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。継代を、１：１０の比率で３〜４日毎に常法通り行った。上記の細胞培養試薬は、Ｇｉｂｃｏ社から購入した。遺伝子トランスフェクション法を用いて、リポフェクタミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）試薬（Ｇｉｂｃｏ）をトランスフェクションのために用いた。細胞に抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の発現ベクターをトランスフェクトし、次いで、Ｈ、Ｔ、Ｇｌｙを含まない培地で培養することによりスクリーニングした。クローンが形成された後に、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を含有する選択培地を培養のために用いて、スクリーニングを行った。その結果、４μｇの軽鎖及び重鎖キメラ抗体遺伝子発現ベクターのそれぞれを用いて、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞をトランスフェクトした。クローンの形成は、約１０日後に観察され、全て一緒に約３５０個のクローンが計数された。プールした耐性クローンの培養物の上清は、間接ＥＬＩＳＡ法を用いることによりＯＤ４９０＝１．６２２として測定され（陰性対照ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−上清のＯＤ４９０は０．０６３のみであった）、このことは、トランスフェクトした細胞の上清中に抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体発現が存在したことを示した。 Example 3: Anti-CEA expressing an expression vector of the humanized chimeric antibody according to CHO cells transfected CHO-dhfr - the (stored at the present inventors' laboratory) cells, 10% FBS, 0.03mmol / L hypoxanthine Contains xanthine (H), 0.003 mmol / L thymidine deoxynucleoside (T), 0.1 mmol / L proline (Pro), 0.1 mmol / L glycine (Gly), 100 u / ml penicillin / streptomycin, 2 mmol / L glutamine The cells were cultured in DMEM complete growth medium under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. Passaging was performed routinely every 3-4 days in a 1:10 ratio. The above cell culture reagents were purchased from Gibco. Using the gene transfection method, LipofectAMINE reagent (Gibco) was used for transfection. Cells were screened by transfection with an anti-CEA humanized chimeric antibody expression vector and then culturing in medium without H, T, Gly. After the clones were formed, screening was performed using selective media containing 200 μg / ml G418 (Gibco) for culture. As a result, CHO-dhfr − cells were transfected with 4 μg each of the light chain and heavy chain chimeric antibody gene expression vectors. The formation of clones was observed after about 10 days and all about 350 clones were counted together. Culture supernatants pooled resistant clones were measured as OD 490 = 1.622 by using an indirect ELISA method (negative control CHO-dhfr - OD 490 of the supernatant was only 0.063), This indicated that anti-CEA humanized chimeric antibody expression was present in the supernatant of the transfected cells.

実施例４：ストレス下での発現増幅により抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を高発現できる株のスクリーニング
形質転換ＣＨＯ細胞を、１０％ＦＢＳ、１００ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍｍｏｌ／Ｌグルタミンを含むＤＭＥＭ完全成長培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。継代を、１：１０の比率で３〜４日毎に常法通り行った。メトトレキセート（ＭＴＸ）のストレス下での発現増幅のスクリーニング法を用いて、高発現株をスクリーニングした。上清中の抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を発現する細胞クローンを、ストレス下で発現を増幅するために、３×１０−８Ｍ及び１０−７Ｍのメトトレキセート（ＭＴＸ）（Ｓｉｇｍａ）をそれぞれ含有する完全培地中で逐次的に培養した。各回の増幅発現の後に、サブクローニングを限界希釈により行って、最高の収率を有するクローンを選択した（図６）。 Example 4: Screening for strains capable of high expression of anti-CEA humanized chimeric antibody by expression amplification under stress Transformed CHO cells were grown to complete DMEM containing 10% FBS, 100 u / ml penicillin / streptomycin, 2 mmol / L glutamine The cells were cultured in a medium (Gibco) under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. Passaging was performed routinely every 3-4 days in a 1:10 ratio. High expression strains were screened using a screening method for expression amplification under stress of methotrexate (MTX). Cell clones expressing anti-CEA humanized chimeric antibody in the supernatant contain 3 × 10 −8 M and 10 −7 M methotrexate (MTX) (Sigma), respectively, to amplify expression under stress Sequentially cultured in complete medium. After each round of amplified expression, subcloning was performed by limiting dilution to select the clone with the highest yield (FIG. 6).

抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体発現ベクターをＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクトした後の１回目のスクリーニングで得られ、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を高効率で発現できるクローン１Ｃ５（０．４１μｇ／ｍｌまでのキメラ抗体の収率）を、３×１０−８Ｍのメトトレキセート（ＭＴＸ）（Ｓｉｇｍａ）を含有する培地中で培養した。約３０日間の連続した培養の後に、細胞モダリティ及び成長速度は通常に回復したことが観察され、細胞は、３×１０−８ＭのＭＴＸに適応した。キメラ抗体の発現収率は、１０．４μｇ／ｍｌであった。サブクローニングの後に、最高のキメラ抗体収率を有するクローン２Ｂ２を選択し、キメラ抗体の収率は、１６μｇ／ｍｌであった。１：５の比率での継代の後に、クローン２Ｂ２を、１０−７ＭのＭＴＸを含有する完全培地中で次いで培養した。細胞が適応した後に、キメラ抗体の収率は、３２μｇ／ｍｌであった。サブクローニングの後に、最高のキメラ抗体収率を有するクローン３Ｂ２を選択し、予備的検出により、キメラ抗体収率は、８０μｇ／ｍｌほどの高さであった（図７）。 Clone 1C5 (up to 0.41 μg / ml) obtained in the first screening after transfection of CHO-dhfr − cells with an anti-CEA humanized chimeric antibody expression vector and capable of expressing anti-CEA humanized chimeric antibody with high efficiency The yield of the chimeric antibody) was cultured in a medium containing 3 × 10 −8 M methotrexate (MTX) (Sigma). After about 30 days of continuous culture, it was observed that cell modalities and growth rates had returned to normal, and the cells were adapted to 3 × 10 −8 M MTX. The expression yield of the chimeric antibody was 10.4 μg / ml. After subcloning, clone 2B2 with the highest chimeric antibody yield was selected and the yield of chimeric antibody was 16 μg / ml. After passage at a ratio of 1: 5, clone 2B2 was then cultured in complete medium containing 10 −7 M MTX. After cell adaptation, the chimeric antibody yield was 32 μg / ml. After subcloning, clone 3B2 with the highest chimeric antibody yield was selected and by preliminary detection, the chimeric antibody yield was as high as 80 μg / ml (FIG. 7).

実施例５：血清フリー懸濁培養に適応し、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を生成できる細胞株の馴化及び調製
血清を減少させる方法を用いて細胞株（血清フリー懸濁培養に適応されている）を馴化して、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を高レベルで発現及び分泌できる細胞株（血清フリー懸濁培養に適応されている）を得た。 Example 5: Adaptation and preparation of cell lines adapted to serum-free suspension culture and capable of producing anti-CEA humanized chimeric antibodies Cell lines using methods to reduce serum (adapted to serum-free suspension culture) To obtain a cell line (adapted to serum-free suspension culture) capable of expressing and secreting anti-CEA humanized chimeric antibody at high levels.

血清を含有する培地で培養した場合に接着して成長し、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を高効率で発現及び分泌するｒＣＨＯ ＲＣＣ−２４細胞（すなわちクローン３Ｂ２）を、まず、５％血清を含有するＤＭＥＭ完全成長培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養フラスコにおいて培養した。細胞が適応し、安定な成長を示した後に、培地を、２％、１％、０．５％、０．２５％の血清をそれぞれ同じように含有する完全成長培地に逐次的に置き換えた。細胞が適応し、安定な成長を示した後に、培地を、血清フリー培地、すなわちＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ成長培地（Ｇｉｂｃｏ）に最終的に置き換えた。このときに、細胞のほとんどは接着成長の特性を喪失し、培養物は本質的に半懸濁になった。細胞が適応し、安定な成長を示した後に、細胞を、次いで、８０〜１００ｒｐｍにて振とうフラスコ中で培養し、細胞を強制的に懸濁で成長させた。細胞が適応し、安定な成長を示した後に、血清フリー懸濁培養で成長でき、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を効果的に発現及び分泌する、得られた新しい細胞を、ｒＣＨＯ ＲＣＣ−２４（ＳＦ）細胞株と命名した。   RCHO RCC-24 cells (ie, clone 3B2) that grow adherently when cultured in medium containing serum and express and secrete anti-CEA humanized chimeric antibody with high efficiency (ie clone 3B2), initially contain 5% serum Cultured in culture flasks in DMEM complete growth medium (Gibco). After the cells had adapted and showed stable growth, the medium was sequentially replaced with complete growth medium containing 2%, 1%, 0.5%, 0.25% serum, respectively. After the cells had adapted and showed stable growth, the medium was finally replaced with serum-free medium, ie CHO-S-SFM II growth medium (Gibco). At this time, most of the cells lost the properties of adherent growth and the culture was essentially semi-suspended. After the cells had adapted and showed stable growth, the cells were then cultured in shake flasks at 80-100 rpm to force the cells to grow in suspension. After the cells have adapted and show stable growth, the resulting new cells that can be grown in serum-free suspension culture and that effectively express and secrete anti-CEA humanized chimeric antibodies are identified as rCHO RCC-24 (SF ) Named cell line.

実施例６：抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の特異性、ヒト化特性及びｉｎ ｖｉｖｏ標的特性の同定
１．抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の特異性の同定：
ＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ここでは、トリゾール試薬の使用説明に従って、具体的には実施例１に記載したようにして細胞の全ＲＮＡの抽出を行った。ｃＤＮＡの第１鎖の合成を、製造業者の使用説明に従って、具体的には実施例１に記載するようにしてＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。ＰＣＲ増幅実験において、細胞のｃＤＮＡからの可変領域遺伝子を増幅する方法は、実施例に記載したとおりであった。結果は、配列決定の後に、ｒＣＨＯ ＲＣＣ−２４（ＳＦ）細胞株から増幅された軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子（図８）が、元の親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子と同一であり、よって、抗癌胎児性抗原モノクローナル抗体が、親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体の特異性を維持し、ＣＥＡと特異的に結合できることを示した。 Example 6: Identification of anti-CEA humanized chimeric antibody specificity, humanization properties and in vivo target properties Identification of the specificity of the anti-CEA humanized chimeric antibody:
The RT-PCR method was performed, and here, the total RNA of the cells was extracted as described in Example 1 according to the instructions for using the Trizol reagent. The synthesis of the first strand of cDNA was performed using MMLV reverse transcriptase (Promega) as described in Example 1 according to the manufacturer's instructions. In PCR amplification experiments, the method for amplifying variable region genes from cellular cDNA was as described in the Examples. The results show that after sequencing, the light chain and heavy chain variable region genes amplified from the rCHO RCC-24 (SF) cell line (FIG. 8) show that the light chain and heavy chain of the original parent anti-CEA mouse monoclonal antibody. It was identical to the variable region gene, thus indicating that the anti-carcinoembryonic antigen monoclonal antibody retains the specificity of the parent anti-CEA mouse monoclonal antibody and can specifically bind to CEA.

ＥＬＩＳＡ法を行い、ここでは、１μｇ／ｍｌのＣＥＡを用いてＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。試料を反応のために加えた後に、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片−ＨＲＰＥＬＩＳＡ抗体（Ｓｉｇｍａ）（マウスＩｇと交差反応しない）又はヤギ−抗マウスＩｇＧ Ｆｃ断片−ＨＲＰ ＥＬＩＳＡ抗体（Ｓｉｇｍａ）（ヒトＩｇと交差反応しない）を加えた。インキュベーション及び発色の後に、ＯＤ４９０値を測定した。その後、ヒトＣＥＡ抗原を用いてＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、次いで、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片−ＨＲＰを２次抗体として用いて直接ＥＬＩＳＡを行った。形質転換細胞の上清中の抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体及びプロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラムにより精製された抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体はともに、コーティングのために用いたＣＥＡ抗原と結合でき、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片ポリクローナル抗体により認識でき、強い陽性反応を示した。非形質転換ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞培養上清及び親のマウスモノクローナル抗体は、陰性の反応を示した。ヤギ−抗マウスＩｇＧ Ｆｃ断片−ＨＲＰを２次抗体として用いた場合、非形質転換ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞培養上清及び精製抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体はともに陰性の反応を示したが、親のマウスモノクローナル抗体は陽性の反応を示した。無関係の抗体ヒトＩｇＧ１は、両方の場合について陰性であった。発現された抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体がＣＥＡ抗原と特異的に結合でき、親のマウスモノクローナル抗体と同じ抗原結合特異性を有したことが実証された。 An ELISA method was performed, in which the ELISA plate was coated with 1 μg / ml CEA. After adding the sample for reaction, goat-anti-human IgG Fc fragment-HRP ELISA antibody (Sigma) (does not cross-react with mouse Ig) or goat-anti-mouse IgG Fc fragment-HRP ELISA antibody (Sigma) (human Ig and Added). OD490 values were measured after incubation and color development. Subsequently, ELISA plates were coated with human CEA antigen, followed by direct ELISA using goat-anti-human IgG Fc fragment-HRP as a secondary antibody. Both the anti-CEA humanized chimeric antibody in the supernatant of the transformed cells and the anti-CEA humanized chimeric antibody purified by the protein A affinity chromatography column can bind to the CEA antigen used for coating, It was recognized by a human IgG Fc fragment polyclonal antibody and showed a strong positive reaction. Non-transformed CHO-dhfr - cell culture supernatant and parental mouse monoclonal antibody showed a negative reaction. When goat-anti-mouse IgG Fc fragment-HRP was used as the secondary antibody, both non-transformed CHO-dhfr - cell culture supernatant and purified anti-CEA humanized chimeric antibody showed a negative reaction, but the parental mouse The monoclonal antibody showed a positive reaction. The irrelevant antibody human IgG1 was negative in both cases. It was demonstrated that the expressed anti-CEA humanized chimeric antibody could specifically bind to the CEA antigen and had the same antigen binding specificity as the parental mouse monoclonal antibody.

競合阻害実験を行い、ここでは、１μｇ／ｍｌのＣＥＡ抗原を用いてＥＬＩＳＡプレート（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）をコーティングした。２．５ｎｇ／ウェルの無関係のマウスモノクローナル抗体（本発明者らで調製した）又は２．５ｎｇ／ウェルの親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体Ｃ５０（本発明者らで調製した）及び異なる濃度の抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を加えた。３７℃でのインキュベーションの後に、次いで、ヤギ−抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ ＥＬＩＳＡ抗体（Ｓｉｇｍａ）を加えた。ＯＤ４９０値を反応の後に測定し、その競合阻害率を計算した。競合阻害率は、以下の式に従って計算し、無関係の抗体ヒトＩｇＧ１対照も用いた。
A competitive inhibition experiment was performed in which 1 μg / ml CEA antigen was used to coat an ELISA plate (Biodesign). 2.5 ng / well irrelevant mouse monoclonal antibody (prepared by the inventors) or 2.5 ng / well parental anti-CEA mouse monoclonal antibody C50 (prepared by the inventors) and different concentrations of anti-CEA Humanized chimeric antibody was added. After incubation at 37 ° C., goat-anti-mouse IgG-HRP ELISA antibody (Sigma) was then added. The OD490 value was measured after the reaction and its competitive inhibition rate was calculated. The competitive inhibition rate was calculated according to the following formula, and an irrelevant antibody human IgG1 control was also used.

競合阻害実験の結果を以下の表に示し、陰性対照である無関係の抗体ヒトＩｇＧ１及び親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体の反応は、競合阻害効果を示さなかった（競合阻害率は−１２．８０％であった）。抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体と親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体との間の比率が２：１である場合、親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体と抗原との間の結合について著しい競合阻害が起こり得る。キメラ抗体の濃度が増加すると、親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体と抗原との間の結合産物の量が減少し、そのＯＤ４９０が徐々に減少し、競合阻害率が増加した。比率が３２：１の場合、競合阻害率は４０．８５％まで到達できる。このことは、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体及び親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体がともに、ＣＥＡ抗原の同じエピトープと結合できることを示し、このことにより、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体及び親の抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体が同じ抗原結合特異性を有することが証明された。   The results of the competitive inhibition experiment are shown in the following table. The reaction of the irrelevant antibody human IgG1 as a negative control and the parent anti-CEA mouse monoclonal antibody did not show a competitive inhibitory effect (competitive inhibition rate was -12.80%). Met). If the ratio between the anti-CEA humanized chimeric antibody and the parent anti-CEA mouse monoclonal antibody is 2: 1, significant competitive inhibition can occur for binding between the parent anti-CEA mouse monoclonal antibody and the antigen. As the concentration of the chimeric antibody increased, the amount of binding product between the parent anti-CEA mouse monoclonal antibody and the antigen decreased, its OD490 gradually decreased, and the competitive inhibition rate increased. When the ratio is 32: 1, the competitive inhibition rate can reach 40.85%. This indicates that both the anti-CEA humanized chimeric antibody and the parental anti-CEA mouse monoclonal antibody can bind to the same epitope of the CEA antigen, thereby producing an anti-CEA humanized chimeric antibody and a parent anti-CEA mouse monoclonal antibody. Were proved to have the same antigen binding specificity.

免疫蛍光試験を行い、ここでは、ＣＥＡを高レベルで発現できる結腸がん細胞ＬＳ１８０（ＡＴＣＣから購入）を標的細胞として用い、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を加えた。３７℃でのインキュベーションの後に、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ蛍光２次抗体（Ｓｉｇｍａ）を次いで加え、蛍光顕微鏡を用いて、反応後の観察を行い、無関係の抗体対照を対照として用いた。図９における結果は、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体が、ＣＥＡを高レベルで発現できる結腸がん細胞ＬＳ１８０上のＣＥＡ抗原を認識できることを示した。
免疫蛍光試験を行い、ここでは、いくつかのＣＥＡ発現がん細胞ＳＷ１１１６、ＬＯＶＯ（ＡＴＣＣから購入）を標的細胞として用い、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を加えた。３７℃でのインキュベーションの後に、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ５蛍光２次抗体（Ｓｉｇｍａ）を次いで加えた。蛍光顕微鏡を用いて反応後の観察を行い、無関係の抗体対照を対照として用いた。結果（図１０）は、癌胎児性抗原に対するモノクローナル抗体が、ＣＥＡ発現がん細胞上のＣＥＡ抗原を認識できることを示した。 An immunofluorescence test was performed, where colon cancer cells LS180 (purchased from ATCC) capable of expressing CEA at high levels were used as target cells, and anti-CEA humanized chimeric antibody was added. After incubation at 37 ° C., goat-anti-human IgG-FITC fluorescent secondary antibody (Sigma) was then added, post-reaction observations were made using a fluorescence microscope, and an irrelevant antibody control was used as a control. The results in FIG. 9 showed that the anti-CEA humanized chimeric antibody can recognize CEA antigen on colon cancer cells LS180 that can express CEA at high levels.
An immunofluorescence test was performed, where several CEA-expressing cancer cells SW1116, LOVO (purchased from ATCC) were used as target cells, and anti-CEA humanized chimeric antibody was added. After incubation at 37 ° C, goat-anti-human IgG-Cy5 fluorescent secondary antibody (Sigma) was then added. Post-reaction observations were made using a fluorescence microscope and an irrelevant antibody control was used as a control. The results (FIG. 10) showed that the monoclonal antibody against carcinoembryonic antigen can recognize CEA antigen on CEA expressing cancer cells.

２．抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体のヒト化特性の同定：
ＥＬＩＳＡ実験において、ＣＥＡ、ヤギ−抗ヒトκ鎖（Ｓｉｇｍａ）又はヤギ−抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いてＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）をＥＬＩＳＡ抗体として用いた。ＥＬＩＳＡの結果（表４）は、精製抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体が強い陽性反応を示したが、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体モノクローナル抗体の親のマウスモノクローナル抗体は陰性の反応を示したことを示した。このことは、精製抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体が、ヒトＩｇＧの軽鎖及び重鎖定常領域を含有することを実証した。 2. Identification of humanization properties of anti-CEA humanized chimeric antibodies:
In an ELISA experiment, the ELISA plate was coated with CEA, goat-anti-human kappa chain (Sigma) or goat-anti-human IgG polyclonal antibody (Sigma), and goat-anti-human IgG Fc fragment-HRP (Sigma) was applied to the ELISA antibody. Used as. The results of the ELISA (Table 4) showed that the purified anti-CEA humanized chimeric antibody showed a strong positive reaction, whereas the anti-CEA humanized chimeric antibody monoclonal antibody parental mouse monoclonal antibody showed a negative reaction. . This demonstrated that the purified anti-CEA humanized chimeric antibody contained human IgG light and heavy chain constant regions.

ウェスタンブロッティング実験を行い、ここでは、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体についての還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。抗体をメンブレンに移した後に、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片−ＨＲＰ又はヤギ−抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体をそれぞれ用いてウェスタンブロッティングを行った。結果（図１１）は、５５ｋＤでのタンパク質バンドが、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片−ＨＲＰにより認識され、染色された単独の特異的バンドを形成し、バンドが示すサイズが、抗体の重鎖に相当したことを示した。対照マウスモノクローナル抗体は、その位置にバンドを示さず、このことは、発現された抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体重鎖がヒト定常領域を含有することを実証した。２５ｋＤでのタンパク質バンドがヤギ−抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体により認識され、染色された単独の特異的バンドを表し、このバンドが示すサイズは、抗体の軽鎖に相当した。対照マウスモノクローナル抗体はここでは陰性の反応を示し、このことは、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体がヒトκ鎖定常領域を含むことを示した。   Western blotting experiments were performed where reduced SDS-PAGE was performed on anti-CEA humanized chimeric antibodies. After transferring the antibody to the membrane, Western blotting was performed using goat-anti-human IgG Fc fragment-HRP or goat-anti-human κ chain polyclonal antibody, respectively. The result (FIG. 11) shows that the protein band at 55 kD is recognized by goat-anti-human IgG Fc fragment-HRP and forms a single specific band that is stained and the size indicated by the band is in the heavy chain of the antibody. I showed that it was equivalent. The control mouse monoclonal antibody showed no band at that position, demonstrating that the expressed anti-CEA humanized chimeric antibody heavy chain contained a human constant region. A protein band at 25 kD represents a single specific band that was recognized and stained by a goat-anti-human kappa chain polyclonal antibody, and the size represented by this band corresponded to the light chain of the antibody. The control mouse monoclonal antibody showed a negative response here, indicating that the anti-CEA humanized chimeric antibody contains a human kappa chain constant region.

ヤギ−抗ヒトＩｇＧ、ヤギ−抗ヒトＩｇＭ及びヤギ−抗ヒトＩｇＡを用いて血清を免疫し、二重免疫拡散試験を、検査のために行った。結果は、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体が、ヒトＩｇＧ型の免疫グロブリンに属することを示した。マウス−抗ヒトＩｇＧ１、マウス−抗ヒトＩｇＧ２、マウス−抗ヒトＩｇＧ３及びマウス−抗ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡ試験を行い、結果は、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体がヒトＩｇＧ１であったことを示した。   Serum was immunized with goat-anti-human IgG, goat-anti-human IgM and goat-anti-human IgA, and a double immunodiffusion test was performed for testing. The results showed that the anti-CEA humanized chimeric antibody belongs to human IgG type immunoglobulin. An ELISA test was performed using mouse-anti-human IgG1, mouse-anti-human IgG2, mouse-anti-human IgG3 and mouse-anti-human IgG4 monoclonal antibodies, and the results show that the anti-CEA humanized chimeric antibody was human IgG1. Indicated.

３．抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体のｉｎ ｖｉｖｏ標的特性の同定：
ｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫取り込み実験、ｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫生体分布実験を含むいくつかのｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫実験を行って、腫瘍をｉｎ ｖｉｖｏで特異的に標的にする特性について抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を調べた（ＣＥＡ陽性腫瘍結腸がん細胞ＬＳ１７４Ｔの腫瘍を有するマウスをモデルとして用いた）。結果は、核種１２５Ｉ標識抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の注射の後に、腫瘍が、全ての組織のうちで最も多く標識抗体を取り込み、他の正常組織よりもかなり高く、これは、最大で３３％まで達し、２６％が７ｄ後まで残ることができることを示した。標識抗体は、腫瘍によく蓄積し、長期間残ることができる。正常組織における取り込み量は低く、これらは残らず、全て時間経過とともに迅速に減少した（図１２）。Ｔ／Ｎ比率研究の結果は、標識抗体が、注射の２４時間後に腫瘍に主に分布し、血液プールにはそれらのわずかが分布したことを示した。しかし、９６時間後に、標識抗体は、腫瘍にのみ優勢的に分布し、このことは、核種標識抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体が腫瘍に特異的に分布できるが、正常組織には分布しないことを示した（図１３）。上記の結果は、抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体が、優れたｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍標的特性を有し、動物においてＣＥＡ陽性腫瘍細胞と特異的に結合でき、腫瘍中に特異的に蓄積されて残るが、血液プール以外の正常組織には分布せず残らなかったことを示した。 3. Identification of in vivo target properties of anti-CEA humanized chimeric antibodies:
Several in vivo radioimmunity experiments were conducted, including in vivo radioimmunouptake experiments, in vivo radioimmunobiodistribution experiments, and anti-CEA humanized chimeric antibodies were investigated for their ability to specifically target tumors in vivo (Mice with tumors of CEA positive tumor colon cancer cells LS174T were used as a model). The results show that after injection of a nuclide 125 I-labeled anti-CEA humanized chimeric antibody, the tumor takes up the most labeled antibody of all tissues and is significantly higher than other normal tissues, which is up to 33% And showed that 26% can remain until after 7d. The labeled antibody accumulates well in the tumor and can remain for a long time. The amount of uptake in normal tissues was low, none of them remained, and all decreased rapidly over time (FIG. 12). The results of the T / N ratio study showed that the labeled antibodies were predominantly distributed in the tumor 24 hours after injection and only a few of them were distributed in the blood pool. However, after 96 hours, the labeled antibody is predominantly distributed only in the tumor, indicating that the nuclide-labeled anti-CEA humanized chimeric antibody can be specifically distributed in the tumor but not in normal tissues. (FIG. 13). The above results indicate that the anti-CEA humanized chimeric antibody has excellent in vivo tumor targeting properties and can specifically bind to CEA positive tumor cells in animals and remains specifically accumulated in the tumor, It was not distributed and remained in normal tissues other than the pool.

実施例７：抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を用いるｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫イメージング診断のための診断用医薬の調製
Ｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫イメージング実験を採用して、ｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫イメージング診断についての診断用医薬（本発明の抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を用いて調製した）の効力を評価した。図１４に示す結果は、本発明の核種１８８Ｒｅ標識抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体の注射の２４時間後に、腫瘍を明確に画像化できることを示した。腫瘍は、５〜７日後にさらにより明確になり、画像化できる最小の腫瘍のサイズは、０．５ｃｍであった。結果は、ｉｎ ｖｉｖｏ診断への非常に良好な応用の可能性を示す。 Example 7: Preparation of diagnostic drug for in vivo radioimmunoimaging diagnosis using anti-CEA humanized chimeric antibody Diagnostic drug for in vivo radioimmunoimaging diagnosis by adopting in vivo radioimmunoimaging experiment (this The efficacy of the anti-CEA humanized chimeric antibody of the invention was prepared). The results shown in FIG. 14 showed that tumors can be clearly imaged 24 hours after injection of the nuclide 188 Re labeled anti-CEA humanized chimeric antibody of the present invention. Tumors became even clearer after 5-7 days and the smallest tumor size that could be imaged was 0.5 cm. The results show the potential for very good application to in vivo diagnosis.

実施例８：抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を用いるＣＥＡ陽性腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫治療のための治療用医薬の調製
核種Ｉ−１３１を用いて抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体を標識した（ｒｃｈ２４と略す、約２０ｍＣｉ／ｍｇタンパク質）。結腸がん腫瘍を死滅させるｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫治療の有効性を、ヒトＣＥＡ陽性結腸がん細胞ＬＳ１８０（ＡＴＣＣ、ＵＳＡから購入）の移植腫瘍を有するマウスにおいて研究し、ここでは、１００万個のＬＳ１８０を前記マウスの右側の背中にｓ．ｃ．注射し、腫瘍のサイズが適度になった後に治療を行った。結果は、形成された腫瘍について（腫瘍のサイズが０．５ｃｍ３を超えた後に治療を行った）、２５０μＣｉ／用量の高い免疫活性及び特異的放射活性を有する標識抗体を用いる単回治療が、形成された腫瘍について８１．１％の腫瘍阻害率を示した（表５、図１５）が、１２５μＣｉ／マウスを１ｗ間隔で３回投与した治療群について（腫瘍のサイズが約０．１ｃｍ３になったときに治療を行った）、腫瘍阻害率は９３％であり（表６、図１６）、腫瘍の増殖はほぼ停止したことを示した。両方の場合において、ヒト結腸がんの増殖は、著しく阻害できる。末梢血液像分析及び体重変動についての予備的毒性研究は、１３１Ｉ標識抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体をヒト結腸がんのｉｎ ｖｉｖｏ放射性免疫治療のために用いる場合、末梢血液像及びマウスの体重の各成分は、治療群と対照群との間で著しく異ならず、このことは、明らかな毒性がないことを示した。 Example 8: Preparation of a therapeutic medicament for in vivo radioimmunotherapy of CEA positive tumors using anti-CEA humanized chimeric antibody Anti-CEA humanized chimeric antibody was labeled with nuclide I-131 (abbreviated rch24, About 20 mCi / mg protein). The effectiveness of in vivo radioimmunotherapy to kill colon cancer tumors was studied in mice with transplanted tumors of human CEA positive colon cancer cells LS180 (purchased from ATCC, USA), where 1 million LS180 On the right back of the mouse. c. Treatment was performed after injection and tumor size was moderate. The results show that for the formed tumors (treatment was performed after the tumor size exceeded 0.5 cm 3 ), a single treatment with a labeled antibody with high immunoactivity and specific radioactivity of 250 μCi / dose, The formed tumor showed a tumor inhibition rate of 81.1% (Table 5, FIG. 15), but for the treatment group administered 125 μCi / mouse three times at 1 w intervals (tumor size was about 0.1 cm 3) . The tumor inhibition rate was 93% (Table 6, FIG. 16), indicating that tumor growth was almost stopped. In both cases, human colon cancer growth can be significantly inhibited. Preliminary toxicity studies on peripheral blood image analysis and body weight variability are as follows: when 131 I-labeled anti-CEA humanized chimeric antibody is used for in vivo radioimmunotherapy of human colon cancer, peripheral blood image and mouse body weight The ingredients were not significantly different between the treatment group and the control group, indicating that there was no apparent toxicity.

ヒト大腸がんを有するヌードマウスモデルにおいて、試験試料（すなわち１３１Ｉ標識抗ＣＥＡキメラ抗体ｒｃｈ２４）のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を観察した。方法：ヒト大腸がん細胞ＬＳ１８０、ＬＳ１７４Ｔ及びＳＷ１１１６をそれぞれＢＡＢＬ／ｃ ｎｕ／ｎｕヌードマウスにｓ．ｃ．接種した８〜１０日後に、異なる群にそれぞれ投与した。腫瘍のサイズによる均衡の原則に基づいて、群を、対照群；「ヌード」抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体ｒｃｈ２４群（１５６．２μｇ／ｋｇ群及び６２５．０μｇ／ｋｇ群）；同一の特異的放射活性で標識した無関係のヒトＩｇＧ群（３．１ｍＣｉ／ｋｇ群及び１２．５ｍＣｉ／ｋｇ群）；１３１Ｉ標識抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体ｒｃｈ２４群（３．１ｍＣｉ／ｋｇ群、６．２５ｍＣｉ／ｋｇ群及び１２．５ｍＣｉ／ｋｇ群）；並びに陽性化学療法医薬対照群に分割した。試験試料及び適切な対照試料を尾静脈中の注射により１０日毎に１回、合計で２回投与した。規則的に、動物の全身の状態を観察し、体重を測定し、腫瘍のサイズを測定し、血清ＣＥＡレベル及び末梢血指標を測定し、腫瘍組織及び非腫瘍組織中の同位体の分布を決定した。腫瘍を有するヌードマウスを実験の最後に屠殺し、腫瘍の重量を測定した。結果：高用量の試験試料群（１３１Ｉ標識抗ＣＥＡキメラ抗体ｒｃｈ２４）の１匹のヌードマウスが死亡し、同一の特異的放射活性で標識した無関係のヒトＩｇＧの高用量群の１匹のヌードマウスが死亡した。投与後に、試験試料の全ての群において、腫瘍のサイズは対照群のものよりも小さく、相対的腫瘍増殖率は、対照群のものよりも低かった。３つの腫瘍株ＬＳ１８０、ＬＳ１７４、ＳＷ１１１６についての腫瘍阻害率は、低用量群において４７．８〜７１．４％であり、中程度用量群において５２．２〜７５．０％であり、高用量群において６５．２〜８６．２％であった。試験試料の全ての群においてヌードマウスの血清ＣＥＡレベルは、対照群のものよりも明確に低かった。「ヌード」抗ＣＥＡヒト化キメラ抗体及び１３１Ｉ標識無関係ヒトＩｇＧの異なる用量群を比較した場合に、腫瘍阻害効果は、試験試料の対応する群より著しかった。３つの腫瘍株についての腫瘍阻害効果について、試験試料１３１Ｉ標識抗ＣＥＡキメラ抗体ｒｃｈ２４は、ＬＳ１８０腫瘍の増殖の阻害について最も効力があった。１回目の投与の４８時間及び９６時間後に、腫瘍組織中の同位体の分布は、非腫瘍組織におけるものよりも明確に高かった。投与の３０日後に、投与群のヌードマウスにおける末梢血白血球総数などの指標は、対照群のものと著しくは異ならなかった。結論：試験試料１３１Ｉ標識抗ＣＥＡキメラ抗体ｒｃｈ２４は、マウスが有するヒト大腸がんの増殖を投与量依存的に著しく阻害でき、腫瘍を有するヌードマウスにおける血清ＣＥＡレベルを同時に減少でき、腫瘍組織におけるその標的分布は著しかった。投与は１０日間隔で２回行い、投与群における腫瘍を有するヌードマウスの造血機能は明確には変化しなかった。   In a nude mouse model having human colon cancer, the in vivo antitumor activity of the test sample (ie, 131I-labeled anti-CEA chimeric antibody rch24) was observed. Method: Human colon cancer cells LS180, LS174T and SW1116 were s.c. in BABL / c nu / nu nude mice, respectively. c. 8-10 days after inoculation, each was administered to a different group. Based on the principle of balance by tumor size, the group was divided into control group; “nude” anti-CEA humanized chimeric antibody rch24 group (156.2 μg / kg group and 625.0 μg / kg group); identical specific radioactivity Unrelated human IgG groups labeled with (3.1 mCi / kg group and 12.5 mCi / kg group); 131I-labeled anti-CEA humanized chimeric antibody rch24 group (3.1 mCi / kg group, 6.25 mCi / kg group and 12 .5 mCi / kg group); as well as positive chemotherapy drug control group. Test samples and appropriate control samples were administered once every 10 days by injection in the tail vein, for a total of 2 doses. Regularly observe the general condition of animals, measure body weight, measure tumor size, measure serum CEA levels and peripheral blood indicators, and determine isotope distribution in tumor and non-tumor tissues did. Nude mice with tumors were sacrificed at the end of the experiment and tumor weights were measured. Results: One nude mouse from the high dose test sample group (131I labeled anti-CEA chimeric antibody rch24) died and one nude mouse from the high dose group of irrelevant human IgG labeled with the same specific radioactivity Died. After administration, in all groups of test samples, the tumor size was smaller than that of the control group and the relative tumor growth rate was lower than that of the control group. The tumor inhibition rates for the three tumor lines LS180, LS174, SW1116 are 47.8-71.4% in the low dose group, 52.2-75.0% in the medium dose group, and the high dose group 65.2 to 86.2%. Serum CEA levels in nude mice were clearly lower in all groups of test samples than those in the control group. When comparing different dose groups of “nude” anti-CEA humanized chimeric antibody and 131I-labeled irrelevant human IgG, the tumor inhibitory effect was more pronounced than the corresponding group of test samples. For tumor inhibitory effects for the three tumor lines, test sample 131I-labeled anti-CEA chimeric antibody rch24 was most potent at inhibiting the growth of LS180 tumors. At 48 and 96 hours after the first dose, the distribution of isotopes in the tumor tissue was clearly higher than in non-tumor tissue. At 30 days after administration, indicators such as peripheral blood leukocyte counts in nude mice in the administration group were not significantly different from those in the control group. Conclusion: Test sample 131I-labeled anti-CEA chimeric antibody rch24 can significantly inhibit the growth of human colon cancer in mice in a dose-dependent manner, and can simultaneously reduce serum CEA levels in tumor-bearing nude mice, The target distribution was remarkable. Administration was performed twice at 10-day intervals, and the hematopoietic function of nude mice with tumors in the administration group did not change clearly.

Claims (14)

配列番号７〜９に示すＣＤＲ領域を含む重鎖と、配列番号１０〜１２に示すＣＤＲ領域を含む軽鎖とを含む、ヒト化キメラモノクローナル抗体又はその機能的変異体。   A humanized chimeric monoclonal antibody or a functional variant thereof, comprising a heavy chain comprising the CDR regions shown in SEQ ID NOs: 7 to 9 and a light chain containing the CDR regions shown in SEQ ID NOs: 10-12. 配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、請求項１に記載の抗体又はその機能的変異体。   The antibody or functional variant thereof according to claim 1, comprising a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 請求項１若しくは２に記載のヒト化キメラ抗体又はその機能的変異体のＣＤＲ領域と同一であるＣＤＲ領域を含み、請求項１に記載の前記ヒト化キメラ抗体の生物活性と同等又はそれより高い生物活性を有するポリペプチド。   A CDR region that is the same as the CDR region of the humanized chimeric antibody or functional variant thereof according to claim 1 or 2, and is equivalent to or higher than the biological activity of the humanized chimeric antibody according to claim 1. A polypeptide having biological activity. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒト化キメラ抗体若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその相補配列を含む核酸。   A nucleic acid comprising a polynucleotide encoding the humanized chimeric antibody or polypeptide according to any one of claims 1 to 3, or a complementary sequence thereof. ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項４に記載の核酸。   The nucleic acid according to claim 4, which is DNA or RNA. 好ましくは、真核細胞において、特にチャイニーズハムスター卵巣細胞において高発現される、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。   Preferably, an expression vector comprising a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, which is highly expressed in eukaryotic cells, particularly Chinese hamster ovary cells. 図４に示すｐＳＲＮＣ−Ｃκ−ＣＥＡ又は図５に示すｐＳＲＤＣ−Ｃγ１−ＣＥＡである、請求項６に記載のベクター。   The vector according to claim 6, which is pSRNC-Cκ-CEA shown in FIG. 4 or pSRDC-Cγ1-CEA shown in FIG. 請求項４若しくは５に記載の核酸を含む、又は請求項６若しくは７に記載のベクターを含む、宿主細胞。   A host cell comprising the nucleic acid according to claim 4 or 5, or comprising the vector according to claim 6 or 7. チャイニーズハムスター卵巣細胞、特に寄託番号第ＣＧＭＣＣ３８０３号を有する細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。   9. A host cell according to claim 8, which is a Chinese hamster ovary cell, in particular a cell having the deposit number CGMCC3803. 治療有効量の請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体若しくはポリペプチドの、又は請求項４若しくは５に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補配列の、又は請求項６若しくは７に記載のベクターの、又は請求項８若しくは９に記載の宿主細胞の、抗腫瘍医薬の調製における使用。   A therapeutically effective amount of the antibody or polypeptide according to any one of claims 1 to 3, or the polynucleotide or complementary sequence according to claim 4 or 5, or the vector according to claim 6 or 7. Or a host cell according to claim 8 or 9 in the preparation of an antitumor medicament. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はポリペプチドの、腫瘍診断剤の調製における使用。   Use of the antibody or polypeptide according to any one of claims 1 to 3 in the preparation of a tumor diagnostic agent. 前記腫瘍が、結腸直腸がん、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮頚がん、前立腺がん、膀胱がん、胆嚢がん及び食道がんからなる群から選択され、好ましくは結腸直腸である、請求項１０又は１１に記載の使用。   The tumor consists of colorectal cancer, colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, cervical cancer, prostate cancer, bladder cancer, gallbladder cancer and esophageal cancer 12. Use according to claim 10 or 11, selected from the group, preferably colorectal. 前記抗腫瘍医薬が、活性成分として放射性免疫治療剤とカップリングした請求項１〜３のいずれか一項に記載の前記抗体又はポリペプチドを含み、好ましくは、前記放射性免疫治療剤が１３１Ｉである、請求項１０に記載の使用。 The antitumor medicament comprises the antibody or polypeptide according to any one of claims 1 to 3 coupled as an active ingredient with a radioimmunotherapy agent, preferably the radioimmunotherapy agent is 131 I. Use according to claim 10, wherein: 前記腫瘍診断剤が、活性成分として放射性免疫イメージング剤とカップリングした請求項１〜３のいずれか一項に記載の前記抗体又はポリペプチドを含み、好ましくは、前記放射性免疫イメージング剤が１８８Ｒｅである、請求項１１に記載の使用。
The said tumor diagnostic agent contains the said antibody or polypeptide as described in any one of Claims 1-3 couple | bonded with the radioimmunoimaging agent as an active ingredient, Preferably, the said radioimmunoimaging agent is 188 Re. The use according to claim 11, wherein:
JP2015163791A 2010-05-05 2015-08-21 Antibody against carcinoembryonic antigen and uses thereof Pending JP2016028577A (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201010163052.2 2010-05-05
CN2010101630522A CN101928347B (en) 2010-05-05 2010-05-05 Anti-carcinoembryonic-antigen (CEA) antibody and application thereof

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013508358A Division JP5987822B2 (en) 2010-05-05 2011-03-16 Antibodies against carcinoembryonic antigen and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2016028577A true JP2016028577A (en) 2016-03-03

Family

ID=43367813

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013508358A Active JP5987822B2 (en) 2010-05-05 2011-03-16 Antibodies against carcinoembryonic antigen and uses thereof
JP2015163791A Pending JP2016028577A (en) 2010-05-05 2015-08-21 Antibody against carcinoembryonic antigen and uses thereof

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013508358A Active JP5987822B2 (en) 2010-05-05 2011-03-16 Antibodies against carcinoembryonic antigen and uses thereof

Country Status (9)

Country Link
US (1) US9056911B2 (en)
EP (1) EP2567982B1 (en)
JP (2) JP5987822B2 (en)
CN (1) CN101928347B (en)
CA (1) CA2798285C (en)
ES (1) ES2655998T3 (en)
HK (1) HK1149937A1 (en)
PL (1) PL2567982T3 (en)
WO (1) WO2011137687A1 (en)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101928347B (en) * 2010-05-05 2013-03-27 上海海抗中医药科技发展有限公司 Anti-carcinoembryonic-antigen (CEA) antibody and application thereof
DK3252076T3 (en) 2011-01-14 2019-12-02 Univ California DIAGNOSTIC USE OF ANTIBODIES AGAINST ROR-1 PROTEIN
RU2493166C1 (en) * 2012-04-09 2013-09-20 Общество с ограниченной ответственностью "Технофарма" Nanoantibody specifically binding cea protein, method of its usage for detection of this protein
US10656156B2 (en) * 2012-07-05 2020-05-19 Mepur Ravindranath Diagnostic and therapeutic potential of HLA-E monospecific monoclonal IgG antibodies directed against tumor cell surface and soluble HLA-E
CN104628859A (en) * 2015-01-26 2015-05-20 佳德资本投资管理（Bvi）有限公司 Anti-human carcino-embryonic antigen antibody as well as coding gene and application thereof
UA126388C2 (en) 2016-11-18 2022-09-28 Астеллас Фарма Інк. NOVEL ANTI-HUMAN MUC1 ANTIBODY Fab FRAGMENT
CN106749667B (en) * 2016-12-04 2020-07-14 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 Nanometer antibody for resisting carcinoembryonic antigen and application thereof
CA3054738A1 (en) * 2017-02-27 2018-08-30 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multispecific binding proteins targeting cea
TWI795415B (en) * 2017-07-07 2023-03-11 日商安斯泰來製藥股份有限公司 A novel anti-human CEACAM5 antibody Fab fragment
TW201922796A (en) * 2017-10-30 2019-06-16 國立研究開發法人國立癌症研究中心 Antibody beneficial for treatment of solid tumors, antibody-drug conjugate, and cancer drug including same
CN110297093B (en) * 2019-03-18 2022-04-22 山西瑞豪生物科技有限公司 Method and kit for detecting human immunoglobulin G4
CN114409789B (en) * 2022-03-30 2022-06-07 北京科跃中楷生物技术有限公司 Colloidal gold particle marking method and detection kit
CN114560944B (en) * 2022-03-30 2022-08-09 北京科跃中楷生物技术有限公司 Antibody labeled by colloidal gold particles and application thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10508466A (en) * 1994-10-05 1998-08-25 イムノメディクス，インコーポレイテッド Type III anti-CEA humanized mouse monoclonal antibody grafted with CDR

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1216321A (en) * 1997-10-31 1999-05-12 ***广州总医院医务部科训科 Cloning method, sequence and application of carcinoembryonic antigen promoter DNA
CN1077801C (en) * 1997-11-19 2002-01-16 中国科学院微生物研究所 Carcinoembryonic antigen gene engineering antiboy CL-3-scFv
US20040096826A1 (en) 2002-01-30 2004-05-20 Evans Glen A. Methods for creating recombination products between nucleotide sequences
US7232888B2 (en) 2002-07-01 2007-06-19 Massachusetts Institute Of Technology Antibodies against tumor surface antigens
CN1532281A (en) * 2003-03-21 2004-09-29 吉林大学第一医院 RFecombination of carcino-emhyyonic antigen gene fragment and gene vaccine
JP4908440B2 (en) * 2008-03-06 2012-04-04 株式会社東芝 Image processing apparatus and method
CN101928347B (en) * 2010-05-05 2013-03-27 上海海抗中医药科技发展有限公司 Anti-carcinoembryonic-antigen (CEA) antibody and application thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10508466A (en) * 1994-10-05 1998-08-25 イムノメディクス，インコーポレイテッド Type III anti-CEA humanized mouse monoclonal antibody grafted with CDR

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6014005356; Ｒａｎ　Ｙ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．: 'Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　ａ　ａｎｔｉ-ＣＥＡ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ-ｍｏｕｓｅ　ｃｈ' Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１６，　Ｎｏ．２, 2001, ８２-８５ページ *
JPN6014005357; Ｚｈａｎｇ　Ｍ．Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．: 'Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｕｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｔｉ-ＣＥＡ　ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｇｅｎｅ' Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｖｏ．２３，　Ｎｏ．５, 1996, ４７０-４７４ページ *
JPN6014005358; Ｑ．　Ｌｕ　ｅｔ　ａｌ．: 'Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ　ｏｆ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｏｆ　ｃｏｌｏｎ　ｗｉｔｈ　１３１Ｉ-ｌａｂｅｌｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅ' Ａｃｔａ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ Ｖｏｌ．６，　Ｎｏ．１０, 200510, １２５９-１２６４ *
JPN6014005359; Ｚ．　Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．: 'Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｏｆ　Ａｎｔｉ-ＣＥＡ　ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ＲＣＨ２４　ｗｉｔｈ　１３１Ｉ' Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ａｎｄ　Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｖｏｌ．４８，, 200506, Ｓ１３０ページ *
JPN6014048658; Ｌｕ　Ｂａｏｌａｎ　ｅｔ　ａｌ．: 生物工程学報 ２，１, 1986, ｐ．３７-４２ *
JPN6014048661; ＷＡＮＧ　Ｊｉａｎ　ｅｔ　ａｌ．: Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １０，　６, 2004, ｐ．４０１-４０３ *

Also Published As

Publication number Publication date
PL2567982T3 (en) 2018-04-30
JP5987822B2 (en) 2016-09-07
JP2013534406A (en) 2013-09-05
EP2567982A4 (en) 2013-09-18
HK1149937A1 (en) 2011-10-21
US9056911B2 (en) 2015-06-16
EP2567982A1 (en) 2013-03-13
EP2567982B1 (en) 2017-11-01
US20130123471A1 (en) 2013-05-16
CA2798285A1 (en) 2011-11-10
WO2011137687A1 (en) 2011-11-10
CA2798285C (en) 2017-06-06
CN101928347A (en) 2010-12-29
ES2655998T3 (en) 2018-02-22
CN101928347B (en) 2013-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5987822B2 (en) Antibodies against carcinoembryonic antigen and uses thereof
JP5463036B2 (en) Pharmaceutical antibody composition having resistance to soluble CEA
JP2021531826A (en) Specific antibody against trophoblast cell surface antigen 2 (TROP2)
CA2425809A1 (en) Humanized anti-lt-.beta.-r antibodies
JP2000511403A (en) Humanization of anti-carcinoembryonic antigen anti-idiotype antibodies and their use as tumor vaccines and for targeting applications
WO2022095926A1 (en) Antibody targeting interleukin 36r, preparation method therefor, and application thereof
CN112955548B (en) Folic acid receptor alpha-specific antibodies
JP2022523710A (en) CD44-specific antibody
BR112020021061A2 (en) antibodies, isolated polynucleotide, vector, kit or composition, host cell and method of producing an antibody
JP2022539344A (en) Anti-CEA antibody and its application
CN113423736A (en) Antibodies specific to MUC18
EP4257605A1 (en) Anti-tslp nanobody and use thereof
US20240067747A1 (en) Cd73-binding protein and use thereof
WO2022122004A1 (en) Cd73 antigen-binding protein and application thereof
WO2022179039A1 (en) Anti-human cd73 antibody and use thereof
JP2022514786A (en) MUC18-specific antibody
TWI793714B (en) Antibody binding to human CD38, its preparation method and use
CN113248611A (en) anti-BCMA antibody, pharmaceutical composition and application thereof
WO2001023431A1 (en) Derivatives of antibody against ganglioside gm2
CN113164601B (en) Isolated antigen binding proteins and uses thereof
CN117586390A (en) anti-CGRP antibodies and uses
CN117866093A (en) Anti-human B7-H4 antibodies or antigen binding fragments thereof and uses thereof
JP2022512892A (en) Methods and Compositions for Imaging Amyloid Deposits

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20160712

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20170418