JP2022512892A - Methods and Compositions for Imaging Amyloid Deposits - Google Patents
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Abstract
本発明は、検出可能な標識に連結したキメラ（例えば、マウス－ヒト）抗体またはその抗原結合断片を使用してアミロイド沈着物を検出するための方法および診断用組成物に関する。【選択図】なしThe present invention relates to methods and diagnostic compositions for detecting amyloid deposits using a chimeric (eg, mouse-human) antibody linked to a detectable label or an antigen-binding fragment thereof. [Selection diagram] None
Description
［ＥＦＳ－ＷＥＢを介して提出された配列表の参照］
ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して本願と共に電子的に提出した「８４４１－００１８－１－ＳＴ２５」と題する配列表のＡＳＣＩＩファイルの内容は、２０１９年１月２２日に作成され、その大きさは１６．９ｋｂであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
[Refer to the sequence listing submitted via EFS-WEB]
The contents of the ASCII file of the sequence listing entitled "8441-0018-1-ST25" submitted electronically with the present application via EFS-Web was created on January 22, 2019, and its size is 16.9 kb. And the entire contents are incorporated herein by reference.
［優先権の主張］
本願は、２０１８年１０月３１日に出願された米国特許仮出願第６２／７５３，４１０号の優先権を主張するものであり、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
[Priority claim]
This application claims the priority of U.S. Patent Application No. 62 / 753,410 filed October 31, 2018, the entire contents of which are incorporated herein by reference.
本発明は、検出可能な分子が連結または結合したヒト化およびキメラ（例えば、マウス－ヒト）抗体およびその抗原結合断片、ならびにアミロイド沈着物を検出および撮像するためにそれらを使用する方法に関する。 The present invention relates to humanized and chimeric (eg, mouse-human) antibodies to which detectable molecules are linked or bound and antigen-binding fragments thereof, as well as methods of using them to detect and image amyloid deposits.
以下の説明は、本発明について単に読者の理解を助けるために提供されるものであり、先行技術を説明または構成することを認めるものではない。 The following description is provided solely to aid the reader's understanding of the invention and does not endorse the description or composition of the prior art.
天然抗体は、通常、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つのジスルフィド結合によって重鎖に連結している。重鎖間の追加のジスルフィド結合の数は、様々な抗体アイソタイプごとに異なる。最も単純なアイソタイプはＩｇＧであり、これは２つの軽鎖および２つの重鎖のみを含み、２つの重鎖が２つのジスルフィド結合によって連結している。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの隣接する定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他端に定常ドメインを有する。抗体の軽鎖および重鎖の各可変ドメインは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントを含む。軽鎖の各ＣＤＲは、隣接する重鎖の対応するＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位を形成する。軽鎖には、その定常領域に応じて、κとλの２つの主要なタイプがある。κとλの両方の軽鎖は、様々な重鎖タイプのいずれかと結合し得る。 Native antibodies are usually about 150,000 daltons of heterotetrameric glycoproteins composed of two identical light chains and two identical heavy chains. Each light chain is linked to a heavy chain by a single disulfide bond. The number of additional disulfide bonds between heavy chains varies for different antibody isotypes. The simplest isotype is IgG, which contains only two light chains and two heavy chains, with the two heavy chains linked by two disulfide bonds. Each heavy chain has a variable domain ( VH ) at one end and several adjacent constant domains. Each light chain has a variable domain ( VL ) at one end and a stationary domain at the other end. Each variable domain of the light and heavy chains of an antibody contains three segments called complementarity determining regions (“CDRs”) or hypervariable regions. Each CDR of the light chain, together with the corresponding CDR of the adjacent heavy chain, forms an antigen binding site for the antibody. There are two main types of light chains, κ and λ, depending on their constant region. Both κ and λ light chains can bind to any of a variety of heavy chain types.
原発性アミロイドーシスとも呼ばれるアミロイド軽鎖アミロイドーシス（ＡＬアミロイドーシス、ＡＬまたはＡＬＡ）は、米国で最も一般的な形態の全身性アミロイドーシスである。「アミロイドーシス」という用語は、共通の特徴、すなわち臓器および組織における病的不溶性原線維タンパク質の細胞外沈着を共有する疾患のクラスターを指す（Ｒｏｄｎｅｙら、ＮＥＪＭ、２５：８９８）。アミロイドーシスは、人の抗体産生細胞の機能不全によって引き起こされ、異常なタンパク質線維の産生を引き起こし、これが凝集して臓器および組織に不溶性アミロイド沈着物を形成する。アミロイドーシスの種類は、原線維沈着物を形成する前駆体タンパク質の性質によって決定される。原発性アミロイドーシスでは、原線維が免疫グロブリン軽鎖の断片を含み、続発性アミロイドーシスでは、原線維がアミロイドＡタンパク質を含む。アミロイドーシスの現代の分類は、原線維沈着物を形成する前駆体血漿タンパク質の性質に基づいている。 Amyloid light chain amyloidosis (AL amyloidosis, AL or ALA), also called primary amyloidosis, is the most common form of systemic amyloidosis in the United States. The term "amyloidosis" refers to a cluster of diseases that share a common feature: extracellular deposition of pathologically insoluble fibrillar proteins in organs and tissues (Rodney et al., NEJM, 25: 898). Amyloidosis is caused by the dysfunction of human antibody-producing cells, causing the production of abnormal protein fibers that aggregate to form insoluble amyloid deposits in organs and tissues. The type of amyloidosis is determined by the nature of the precursor protein that forms the fibril deposits. In primary amyloidosis, the fibrils contain a fragment of the immunoglobulin light chain, and in secondary amyloidosis, the fibrils contain the amyloid A protein. The modern classification of amyloidosis is based on the properties of precursor plasma proteins that form fibril deposits.
前駆体血漿タンパク質は多様であり、互いに無関係である。それにもかかわらず、すべての前駆体沈着物は、原線維沈着物の典型的な染色特性を担う共通の典型的なβプリーツシート構造を共有するアミロイド沈着物を生成する。アミロイドーシスの発症の最終段階では、患者の臓器にアミロイド原線維が沈着する。アミロイドーシスの死亡率は高く、現在の５年生存率は約２８％である。 Precursor plasma proteins are diverse and unrelated to each other. Nonetheless, all precursor deposits produce amyloid deposits that share a common, typical β-pleated sheet structure that is responsible for the typical staining properties of fibril deposits. At the final stage of the onset of amyloidosis, amyloid fibrils deposit in the patient's organs. The mortality rate of amyloidosis is high, and the current 5-year survival rate is about 28%.
これまでＡＬの治療は、従来のまたは高用量の細胞傷害性化学療法を通して機能不全細胞を攻撃することにより、アミロイド形成性の前駆体軽鎖の合成を減らすことに向けられてきた。しかしながら、問題となる血漿細胞クローンを除去することで予後が改善されたにもかかわらず、不溶性アミロイド原線維が持続的に沈着することによる多臓器不全のため、死亡率は依然として高い。この治療法には２つの欠点がある。第一に、原線維沈着物は、かなりの沈着が起こるまで無症状であることが多い。したがって、かなりの沈着物が生じてしまう前に治療が行われる可能性が低い。第二に、この治療はせいぜい前駆体異常タンパク質の産生を停止するのに最も有効なだけで、既存の沈着物を除去するのに有効ではなく、病的沈着物が持続（または進行）するためにＡＬ患者の予後は非常に悪いままである（Ｓｏｌｏｍｏｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２：２６９）。 Historically, treatment of AL has been directed to reduce the synthesis of amyloid-forming precursor light chains by attacking dysfunctional cells through conventional or high-dose cytotoxic chemotherapy. However, despite improved prognosis by removing the plasma cell clones in question, mortality remains high due to multiple organ failure due to persistent deposition of insoluble amyloid fibrils. This treatment has two drawbacks. First, fibril deposits are often asymptomatic until significant deposits occur. Therefore, it is unlikely that treatment will be given before significant deposits have formed. Second, this treatment is at best most effective in stopping the production of prognostic aberrant proteins, not in removing existing deposits, because the pathological deposits persist (or progress). The prognosis of AL patients remains very poor (Solomon et al., Int. J. Exp. Clin. Invest., 2: 269).
そのため、アミロイド沈着物の治療的標的化および除去は、医学的にも非常に注目されている領域である。これに付随して、アミロイド沈着物の存在および位置を検出し、上述した標的化および除去の補助として、アミロイド沈着物の除去を監視することも非常に注目されている。本明細書に記載の組成物および方法は、そのような存在および位置を検出するためのこの要求を満たすものである。 Therefore, therapeutic targeting and removal of amyloid deposits is a region of great medical attention. Along with this, much attention has also been paid to detecting the presence and location of amyloid deposits and monitoring the removal of amyloid deposits as an aid to the above-mentioned targeting and removal. The compositions and methods described herein meet this requirement for detecting such presence and location.
本明細書では、原発性（ＡＬ）アミロイドーシスに起因するものも含むアミロイド沈着物の存在、位置および量を検出するための組成物および方法が記載されている。本明細書に記載の組成物は、アミロイド沈着物（例えば、アミロイド軽鎖原繊維）に特異的に結合し且つ検出可能な分子が連結するヒト化またはキメラ抗体またはその断片（「抗原結合断片」）を含む。本明細書に記載の方法は、上述した組成物を、アミロイド沈着物を有する疑いのある対象に投与するステップと、画像診断による検出可能な分子の検出によって、アミロイド沈着物の存在、量および／または位置を検出するステップと、を含む。 As used herein, compositions and methods for detecting the presence, location and amount of amyloid deposits, including those due to primary (AL) amyloidosis, are described. The compositions described herein are humanized or chimeric antibodies or fragments thereof (“antigen-binding fragments” that specifically bind to amyloid deposits (eg, amyloid light chain fibrils) and to which detectable molecules are linked. )including. The methods described herein are the presence, amount and / of amyloid deposits by the step of administering the composition described above to a subject suspected of having amyloid deposits and the detection of detectable molecules by diagnostic imaging. Or including a step to detect the position.
また、本方法は、アミロイド沈着物に対する診断用組成物の親和性に基づいて、本明細書に記載のヒト化またはキメラ抗体による治療のために患者を分類（ｓｔｒａｔｉｆｙｉｎｇ）する方法を含む。また、本方法は、アミロイド沈着物に対する診断用組成物の親和性に基づいて、本明細書に記載の治療のためのヒト化またはキメラ抗体の適切な投与量を決定するステップを含む。すなわち、標識抗体または抗体断片の検出された親和性（取り込み）に基づいて、患者の適切な投与量を決定することができる。標識抗体または抗原結合抗体断片に対して強い親和性を示す患者は、標識抗体または抗原結合抗体断片に対して弱い親和性を示す患者よりも少ない量の治療用抗体または抗原結合抗体断片を必要とする場合がある。したがって、本発明は、本明細書に記載の標識抗体または抗体断片を患者に投与するステップと、アミロイド沈着物に対する標識抗体または抗体断片の親和性を決定するステップと、親和性の力に基づいて、キメラまたはヒト化抗体または抗体断片の投与量または一連の投与量を投与するステップと、を含む、本明細書に記載の治療のためのヒト化またはキメラ抗体の適切な投与量を決定する方法を提供する。 The method also includes a method of stratifying patients for treatment with the humanized or chimeric antibodies described herein based on the affinity of the diagnostic composition for amyloid deposits. The method also comprises determining the appropriate dose of humanized or chimeric antibody for the treatment described herein based on the affinity of the diagnostic composition for amyloid deposits. That is, an appropriate dose for a patient can be determined based on the detected affinity (uptake) of the labeled antibody or antibody fragment. Patients with a strong affinity for a labeled antibody or antigen-binding antibody fragment require a smaller amount of therapeutic antibody or antigen-binding antibody fragment than a patient with a weaker affinity for a labeled antibody or antigen-binding antibody fragment. May be done. Accordingly, the invention is based on the power of affinity, the step of administering to a patient the labeled antibody or antibody fragment described herein, the step of determining the affinity of the labeled antibody or antibody fragment for an amyloid deposit. , A step of administering a dose of a chimeric or humanized antibody or antibody fragment or a series of doses, and a method of determining an appropriate dose of a humanized or chimeric antibody for the treatment described herein. I will provide a.
一部の実施形態において、診断用組成物に含まれる本明細書に記載の抗体は、配列番号４７を含むＶＫ領域と、配列番号４８を含むＶＨ領域と、を有する。一部の実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ１に由来する定常領域を有する。一部の実施形態において、抗体は、マウス同等物よりも高い親和性でアミロイド原繊維に結合する。一部の実施形態において、抗体は、配列番号３６のＶＫ領域と配列番号３５のＶＨ領域とを有するマウス抗体よりも高い親和性でアミロイド原繊維のβプリーツシート構造によって発現されるエピトープに結合する。また、一部の実施形態において、抗体は、κ（ｋａｐｐａ）およびλ（ｌａｍｂｄａ）アミロイド原繊維にインビボで結合する。 In some embodiments, the antibodies described herein contained in a diagnostic composition have a VK region comprising SEQ ID NO: 47 and a VH region comprising SEQ ID NO: 48. In some embodiments, the antibody has a constant region derived from human IgG1. In some embodiments, the antibody binds to amyloid fibrils with a higher affinity than the mouse equivalent. In some embodiments, the antibody is on an epitope expressed by the β-pleated sheet structure of amyloid fibrils with higher affinity than mouse antibodies having the VK region of SEQ ID NO: 36 and the VH region of SEQ ID NO: 35. Join. Also, in some embodiments, the antibody binds to κ (kappa) and λ (lambda) amyloid fibrils in vivo.
別の態様において、本発明は、検出可能な標識または分子に連結した本明細書に記載のヒト化またはキメラ抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む組成物を提供する。 In another aspect, the invention provides a composition comprising a humanized or chimeric antibody described herein linked to a detectable label or molecule, and a pharmaceutically acceptable carrier.
本方法および本組成物において有用なキメラ抗体は、ベクター構築物１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１－Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００の哺乳動物細胞におけるコトランスフェクション、またはスーパーベクター構築物ｐＧ１ＫＤ２００－１１－１Ｆ４の哺乳動物細胞におけるトランスフェクションによって産生されてもよい。一部の実施形態において、ベクター構築物１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１－Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００のコトランスフェクションまたはスーパーベクター構築物ｐＧ１ＫＤ２００－１１－１Ｆ４のトランスフェクションは、ＣＯＳ細胞で生じる。このようにして産生された抗体を、「キメラ１１－１Ｆ４抗体」と呼ぶ。また、本明細書の他の箇所に記載するように、キメラ１１－１Ｆ４抗体の断片も、本方法および本組成物に有用である。 Chimeric antibodies useful in this method and in this composition are vector constructs 11-1F4VK. pKN100 and 11-F4VH. It may be produced by co-transfection of pG1D200 in mammalian cells or by transfection of the supervector construct pG1KD200-11-1F4 in mammalian cells. In some embodiments, the vector construct 11-1F4VK. pKN100 and 11-F4VH. Cotransfection of pG1D200 or transfection of the supervector construct pG1KD200-11-1F4 occurs in COS cells. The antibody thus produced is referred to as a "chimeric 11-1F4 antibody". Fragments of the chimeric 11-1F4 antibody are also useful in the method and in the composition, as described elsewhere herein.
一部の実施形態において、検出されたアミロイド沈着物は、原発性アミロイドーシスに起因する。一部の実施形態において、原発性アミロイドーシスは、心臓、腎臓、肝臓、肺、消化管、神経系、筋肉骨格系、軟部組織および皮膚からなる群から選択される少なくとも１つの臓器または組織の関与を含み、沈着物は、それらの臓器のうちの１つまたは複数で検出される。 In some embodiments, the detected amyloid deposits result from primary amyloidosis. In some embodiments, primary amyloidosis involves the involvement of at least one organ or tissue selected from the group consisting of heart, kidney, liver, lung, gastrointestinal tract, nervous system, musculoskeletal system, soft tissue and skin. Containing and deposits are detected in one or more of those organs.
一態様において、本発明は、検出可能な標識またはマーカーが連結したヒト化またはキメラ抗体またはその抗原結合断片の診断上有効な量を、アミロイド沈着疾患と診断されたまたはその疑いのある患者に投与するステップと、画像診断によって、患者の体内におけるアミロイド沈着物に結合した検出可能な標識の存在、位置および／または量を検出するステップと、を含む、アミロイド沈着物を検出または撮像する方法を提供する。本態様において、抗体または抗原結合断片は、配列番号５２を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５３を含むＣＤＲＨ２、および配列番号５４を含むＣＤＲＨ３を有する可変重鎖（ＶＨ）と、配列番号４９を含むＣＤＲＬ１、配列番号５０を含むＣＤＲＬ２、および配列番号５１を含むＣＤＲＬ３を有する可変軽鎖（ＶＫ）と、を有してもよい。別の態様において、本発明は、検出可能な分子に連結した上述した抗体または抗体断片と、薬学的に許容される担体と、を含む組成物を提供する。
In one aspect, the invention administers a diagnostically effective amount of a humanized or chimeric antibody or antigen-binding fragment thereof ligated with a detectable label or marker to a patient diagnosed with or suspected of having an amyloid deposit disease. Provided is a method for detecting or imaging amyloid deposits, which comprises a step of detecting the presence, location and / or amount of a detectable label bound to the amyloid deposit in the patient's body by diagnostic imaging. do. In this embodiment, the antibody or antigen binding fragment comprises a complementarity determining region (CDR) H1 comprising SEQ ID NO: 52, CDRH2 comprising SEQ ID NO: 53, and a variable heavy chain ( VH ) having CDRH3 comprising SEQ ID NO: 54. It may have a
上述した態様の一部の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化抗体であってもよく、他の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、キメラ抗体であってもよい。 In some embodiments of the embodiments described above, the antibody or antigen-binding fragment thereof may be a humanized antibody, and in other embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof may be a chimeric antibody.
上述した態様の一部の実施形態において、抗体または抗原結合断片のＶＫ領域は、配列番号４７を含んでもよく、ＶＨ領域は、配列番号４８を含んでもよい。 In some embodiments of the embodiments described above, the VK region of the antibody or antigen binding fragment may comprise SEQ ID NO: 47 and the VH region may comprise SEQ ID NO: 48.
上述した態様の一部の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１に由来する定常領域を有してもよい。一部の実施形態において、抗体は、キメラ１１－１Ｆ４抗体であってもよい。 In some embodiments of the embodiments described above, the antibody or antigen binding fragment may have constant regions derived from human IgG1. In some embodiments, the antibody may be a chimeric 11-1F4 antibody.
別の態様において、本発明は、標識抗体またはその抗原結合断片を投与し、画像診断による患者における標識の存在を検出することによって、アミロイド沈着疾患を有する疑いのある患者のアミロイド沈着疾患を検出する方法を提供する。 In another embodiment, the invention detects amyloid-deposited disease in a patient suspected of having amyloid-deposited disease by administering a labeled antibody or antigen-binding fragment thereof and detecting the presence of the label in the patient by diagnostic imaging. Provide a method.
本態様の一部の実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体は、ヒトＩｇＧ１に由来する定常領域を有する。 In some embodiments of this embodiment, the humanized or chimeric 11-1F4 antibody has a constant region derived from human IgG1.
別の態様において、本発明は、アミロイド沈着物を有する疑いのある患者におけるアミロイド沈着物の存在、位置および／または量をインビボで検出する方法を提供する。該方法は、検出可能な分子が連結した抗体または抗原結合断片を患者に投与するステップを含む。ここで、抗体または抗原結合断片は、配列番号５３を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５３を含むＣＤＲＨ２、および配列番号５４を含むＣＤＲＨ３を有する可変重鎖（ＶＨ）と、配列番号４９を含むＣＤＲＬ１、配列番号５０を含むＣＤＲＬ２、および配列番号５１を含むＣＤＲＬ３を有する可変軽鎖（ＶＫ）と、を有する。また、該方法は、画像診断によるアミロイド沈着物に結合した検出可能な標識の検出によって、アミロイド沈着物の存在、位置および／または量を検出するステップを含む。 In another aspect, the invention provides a method of detecting the presence, location and / or amount of amyloid deposits in vivo in a patient suspected of having amyloid deposits. The method comprises administering to the patient an antibody or antigen binding fragment ligated with a detectable molecule. Here, the antibody or antigen binding fragment is sequenced with a variable heavy chain ( VH ) having a complementarity determining region (CDR) H1 comprising SEQ ID NO: 53, CDRH2 comprising SEQ ID NO: 53, and CDRH3 comprising SEQ ID NO: 54. It has a CDRL1 comprising number 49, a CDRL2 comprising SEQ ID NO: 50, and a variable light chain (VK) having CDRL3 comprising SEQ ID NO: 51. The method also comprises the step of detecting the presence, location and / or amount of amyloid deposits by detecting a detectable label bound to the amyloid deposits by diagnostic imaging.
別の実施形態において、本発明は、アミロイド沈着物を有する疑いのある患者におけるアミロイド沈着物の存在、位置および／または量をインビボで検出する方法を提供する。該方法は、検出可能な分子が連結した抗体または抗原結合断片を患者に投与するステップを含む。ここで、抗体または抗原結合断片は、配列番号４７を含むＶＫ領域と、配列番号４８を含むＶＨ領域と、を有する。また、該方法は、画像診断による検出可能な標識の検出によって、アミロイド沈着物に結合したアミロイド沈着物の存在、位置および／または量を検出するステップを含む。 In another embodiment, the invention provides a method for detecting the presence, location and / or amount of amyloid deposits in vivo in a patient suspected of having amyloid deposits. The method comprises administering to the patient an antibody or antigen binding fragment ligated with a detectable molecule. Here, the antibody or antigen-binding fragment has a VK region containing SEQ ID NO: 47 and a VH region containing SEQ ID NO: 48. The method also comprises the step of detecting the presence, location and / or amount of amyloid deposits bound to the amyloid deposits by detecting a detectable label by diagnostic imaging.
上述したいずれかの方法の一態様において、本発明は、検出の方法が陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）である上述した方法を提供する。検出の方法がＰＥＴである態様において、検出可能な標識は、１２４Ｉであってもよく、８９Ｚｒであってもよい。上述した方法の別の態様において、抗体は、キメラまたはヒト化１１－１Ｆ４、その抗原結合断片および抗体ＣＡＥＬ－１０１から選択される。上述した方法のさらに別の態様において、アミロイド沈着物は、心臓で生じている。 In one aspect of any of the methods described above, the present invention provides the method described above, wherein the method of detection is positron emission tomography (PET). In embodiments where the method of detection is PET, the detectable label may be 124 I or 89 Zr. In another embodiment of the method described above, the antibody is selected from chimeric or humanized 11-1F4, antigen binding fragments thereof and antibody CAEL-101. In yet another embodiment of the method described above, amyloid deposits occur in the heart.
別の態様において、本発明は、検出可能な分子が連結した抗体または抗原結合断片を含む、対象におけるアミロイド沈着物の存在を検出するための組成物を提供する。ここで、抗体または抗原結合断片は、配列番号５３を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５３を含むＣＤＲＨ２、および配列番号５４を含むＣＤＲＨ３を有する可変重鎖（ＶＨ）と、配列番号４９を含むＣＤＲＬ１、配列番号５０を含むＣＤＲＬ２、および配列番号５１を含むＣＤＲＬ３を有する可変軽鎖（ＶＫ）と、を有する。 In another aspect, the invention provides a composition for detecting the presence of amyloid deposits in a subject, comprising an antibody or antigen binding fragment to which a detectable molecule is linked. Here, the antibody or antigen binding fragment is sequenced with a variable heavy chain ( VH ) having a complementarity determining region (CDR) H1 comprising SEQ ID NO: 53, CDRH2 comprising SEQ ID NO: 53, and CDRH3 comprising SEQ ID NO: 54. It has a CDRL1 comprising number 49, a CDRL2 comprising SEQ ID NO: 50, and a variable light chain (VK) having CDRL3 comprising SEQ ID NO: 51.
別の態様において、本発明は、検出可能な分子が連結した抗体または抗原結合断片を含む、対象におけるアミロイド沈着物の存在を検出するための組成物を提供する。ここで、抗体または抗原結合断片は、配列番号４７を含むＶＫ領域と、配列番号４８を含むＶＨ領域と、を有する。 In another aspect, the invention provides a composition for detecting the presence of amyloid deposits in a subject, comprising an antibody or antigen binding fragment to which a detectable molecule is linked. Here, the antibody or antigen-binding fragment has a VK region containing SEQ ID NO: 47 and a VH region containing SEQ ID NO: 48.
上述した組成物の一態様において、検出可能な分子は、１２４Ｉおよび８９Ｚｒから選択される。上述した組成物の別の態様において、抗体は、キメラまたはヒト化１１－１Ｆ４またはその抗原結合断片および抗体ＣＡＥＬ－１０１から選択される。上述した組成物のさらに別の態様において、アミロイド沈着物は、心臓で生じている。 In one embodiment of the composition described above, the detectable molecule is selected from 124 I and 89 Zr. In another embodiment of the composition described above, the antibody is selected from chimeric or humanized 11-1F4 or antigen binding fragments thereof and antibody CAEL-101. In yet another embodiment of the composition described above, the amyloid deposits occur in the heart.
別の態様において、本発明は、アミロイド沈着疾患と診断され且つアミロイド沈着物を有する患者における疾患の進行を監視する方法を提供する。該方法は、（ａ）上述した組成物を患者に投与し、画像診断を患者に実施して、アミロイド沈着物に結合した検出可能な分子の量を検出するステップと、（ｂ）アミロイド沈着物を除去するように意図された治療法で患者を治療するステップと、（ｃ）上述した組成物を患者に投与するステップと、（ｄ）画像診断を患者に実施して、アミロイド沈着物に結合した検出可能な分子の量を検出するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）で検出された検出可能な分子の量と、ステップ（ａ）で検出された検出可能な分子の量とを比較するステップと、を含む。 In another aspect, the invention provides a method of monitoring disease progression in a patient diagnosed with amyloid deposits and having amyloid deposits. The method comprises (a) administering to the patient the composition described above and performing diagnostic imaging on the patient to detect the amount of detectable molecule bound to the amyloid deposit, and (b) the amyloid deposit. A step of treating the patient with a treatment intended to remove the The step of detecting the amount of the detectable molecule obtained, (e) the amount of the detectable molecule detected in step (d), and the amount of the detectable molecule detected in step (a) are compared. Including steps.
上述した方法のステップ（ｂ）において、患者は、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体またはその抗原結合断片および抗体ＣＡＥＬ－１０１から選択される抗体で治療されてもよい。上述した方法において、組成物は、上述した組成物のいずれかであってもよい。別の態様において、検出の方法は、ＰＥＴであってもよい。別の態様において、検出方法がＰＥＴである場合、検出可能な標識は、１２４Ｉおよび８９Ｚｒから選択される。上述した方法の別の態様において、抗体は、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４またはその抗原結合断片およびＣＡＥＬ－１０１から選択される。上述した方法の別の態様において、アミロイド沈着物は、心臓で生じている。 In step (b) of the method described above, the patient may be treated with a humanized or chimeric 11-1F4 antibody or antigen-binding fragment thereof and an antibody selected from the antibody CAEL-101. In the method described above, the composition may be any of the compositions described above. In another embodiment, the method of detection may be PET. In another embodiment, if the detection method is PET, the detectable label is selected from 124 I and 89 Zr. In another embodiment of the method described above, the antibody is selected from humanized or chimeric 11-1F4 or antigen-binding fragments thereof and CAEL-101. In another aspect of the method described above, amyloid deposits occur in the heart.
別の実施形態において、本発明は、患者におけるアミロイド沈着物を除去する治療の効果を決定する方法を提供する。該方法は、（ａ）ヒト化またはキメラ１１－Ｆ４抗体またはその抗体断片の治療上有効な投与量で患者を治療するステップと、（ｂ）上述した組成物の１つの診断上有効な量を患者に投与するステップと、（ｃ）画像診断によって、患者のリンパ節における診断用組成物から検出可能な分子の量を測定するステップと、を含む。ここで、リンパ節で検出された検出可能な分子の量が多いほど、治療の効果が高いといえる。本実施形態の一態様において、アミロイド沈着物は、心臓で生じている。 In another embodiment, the invention provides a method of determining the effect of treatment on removing amyloid deposits in a patient. The method comprises (a) treating a patient with a therapeutically effective dose of a humanized or chimeric 11-F4 antibody or antibody fragment thereof, and (b) a diagnostically effective amount of one of the compositions described above. It comprises the steps of administering to the patient and (c) measuring the amount of molecules detectable from the diagnostic composition in the patient's lymph nodes by diagnostic imaging. Here, it can be said that the larger the amount of detectable molecule detected in the lymph node, the higher the therapeutic effect. In one aspect of this embodiment, the amyloid deposits occur in the heart.
本発明の一部の実施形態において、キメラ１１－１Ｆ４抗体は、ＣＡＥＬ－１０１であり、抗体は、ＡＣＣ番号ＰＴＡ－１２５１４６としてＡＴＣＣに寄託されたＣＨＯ細胞によって産生される。 In some embodiments of the invention, the chimeric 11-1F4 antibody is CAEL-101, which is produced by CHO cells deposited with ATCC as ACC No. PTA-1251446.
一部の実施形態において、原発性アミロイドーシスは、λ軽鎖原線維凝集体沈着物からなり、他の実施形態において、原発性アミロイドーシスは、κ軽鎖原線維凝集体沈着物からなり、さらに別の実施形態において、原発性アミロイドーシスは、κおよびλ軽鎖原線維凝集体沈着物からなる。 In some embodiments, the primary amyloidosis consists of a λ light chain fibril aggregate deposit, and in other embodiments, the primary amyloidosis consists of a κ light chain fibril aggregate deposit, yet another. In embodiments, the primary amyloidosis consists of κ and λ light chain fibril aggregate deposits.
上述した全体的な説明および以下の詳細な説明は、例示的および説明的であり、本発明のさらなる説明を提供するように意図されている。 The overall description described above and the detailed description below are exemplary and explanatory and are intended to provide further description of the invention.
本発明によれば、検出可能な分子がそれぞれ連結したヒト化抗体、キメラ抗体（例えば、マウス－ヒト抗体）またはその抗原結合断片を含む組成物が提供され、これは、アミロイド沈着物の存在、位置および量をインビボで検出するのに有用である。これらの組成物は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応をほとんどまたは全く生じさせることなく、アミロイド沈着物の検出、位置特定（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）および／または定量化を可能にする。本発明は、検出可能なマーカーに連結した抗体または抗体断片の少なくとも１つと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物を提供し、また、アミロイド沈着物が存在する場合のアミロイド沈着物の検出に効果的な、マーカーが連結した抗体または抗体断片の有効な量を患者に投与し、画像診断によるアミロイド沈着物に結合した検出可能なマーカーの存在、量および／または位置を検出することで、アミロイド沈着物の位置および量を検出する方法を提供する。 According to the present invention, there is provided a composition comprising a humanized antibody, a chimeric antibody (eg, a mouse-human antibody) or an antigen-binding fragment thereof, each of which is ligated with a detectable molecule, which is the presence of an amyloid deposit. Useful for detecting location and quantity in vivo. These compositions allow detection, localization and / or quantification of amyloid deposits with little or no human anti-mouse antibody (HAMA) reaction. The present invention provides a composition comprising at least one of an antibody or antibody fragment linked to a detectable marker, a pharmaceutically acceptable carrier, and an amyloid deposit in the presence of an amyloid deposit. Administering a patient an effective amount of a marker-linked antibody or antibody fragment effective in detecting amyloid deposits to detect the presence, amount and / or location of detectable marker bound to amyloid deposits by diagnostic imaging. Provides a method for detecting the location and amount of amyloid deposits.
さらに本発明によれば、該方法は、アミロイド沈着疾患の治療における効果を監視または決定するために提供される。アミロイド沈着疾患と診断され且つアミロイド沈着物を有する患者における疾患の進行を監視する方法は、
（ａ）検出可能な分子が連結したヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体またはその抗原結合断片の診断上有効な量を患者に投与し、アミロイド沈着物に結合した検出可能な分子の量を検出するステップと、
（ｂ）ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体またはその抗原結合断片などの、アミロイド沈着物を除去するように意図された治療法で患者を治療するステップと、
（ｃ）検出可能な分子が連結したヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体またはその抗原結合断片の診断上有効な量を患者に投与し、アミロイド沈着物に結合した検出可能な分子の量を検出するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で検出された検出可能な分子の量と、ステップ（ａ）で検出された検出可能な分子の量とを比較するステップと、
を含む。
Further according to the present invention, the method is provided to monitor or determine the effect in the treatment of amyloid deposits. Methods for monitoring disease progression in patients diagnosed with amyloid deposits and having amyloid deposits are:
(A) A diagnostically effective amount of a humanized or chimeric 11-1F4 antibody or antigen-binding fragment thereof linked with a detectable molecule is administered to the patient, and the amount of the detectable molecule bound to the amyloid deposit is detected. Steps and
(B) A step of treating a patient with a treatment intended to remove amyloid deposits, such as a humanized or chimeric 11-1F4 antibody or antigen-binding fragment thereof.
(C) A diagnostically effective amount of a humanized or chimeric 11-1F4 antibody or antigen-binding fragment thereof linked with a detectable molecule is administered to the patient, and the amount of the detectable molecule bound to the amyloid deposit is detected. Steps and
(D) A step of comparing the amount of the detectable molecule detected in step (c) with the amount of the detectable molecule detected in step (a).
including.
本実施形態において、本発明は、アミロイド沈着物を除去するように意図された治療の前と後の両方で、本明細書に記載のマーカーが連結した抗体または抗体断片を患者に投与し、治療後に検出されたアミロイド沈着物の大きさおよび範囲と、治療前に測定された大きさおよび範囲との差を測定することによって、患者におけるアミロイド沈着物（存在する場合）の量の変化の程度を測定することを目的としている。 In the present embodiment, the invention administers to a patient an antibody or antibody fragment ligated with the markers described herein for treatment, both before and after treatment intended to remove amyloid deposits. By measuring the difference between the size and range of amyloid deposits detected later and the size and range measured prior to treatment, the extent of change in the amount of amyloid deposits (if any) in the patient. The purpose is to measure.
さらに、対象におけるアミロイド沈着物をインビボで検出する方法が提供される。該方法は、（ａ）検出可能な分子に連結した本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片を１つまたは複数含む組成物を対象に投与するステップと、（ｂ）画像診断によって、アミロイド沈着物に結合した抗体またはその抗原結合断片に連結した検出可能な薬剤を検出するステップと、を含む。 Further provided are methods for detecting amyloid deposits in a subject in vivo. The method comprises (a) administering to the subject a composition comprising one or more of the antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein linked to a detectable molecule, and (b) amyloid by diagnostic imaging. Includes the step of detecting an antibody bound to a deposit or a detectable agent linked to an antigen-binding fragment thereof.
上述した方法において、検出のステップ（ステップ（ｂ））は、ＰＥＴ（陽電子放出断層撮影法）、ＳＰＥＣＴ（単一光子放射断層撮影法）、ＭＲＩ、蛍光撮像またはその他の適切な画像診断方法を用いて実施されてもよい。ＰＥＴは、好ましい撮像方法である。検出可能な分子を用いた腫瘍やその他の沈着物を撮像するためのＰＥＴの使用がよく知られている。この画像診断用薬剤の調製とＰＥＴでの使用については、例えばＢａｉｌｌｙら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１７，１８，５７）、Ｂｏｅｒｍａｎら（Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ，２０１１；５２：１１７１－１１７２）、およびＭａｙｅｒら（Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ，２０１７；５８：５３８－５４６）による説明に記載されており、その全内容が参照により本明細書に組み込まれている。これらの参考文献は、主に癌性腫瘍の検出を目的としているが、それらに記載されている材料および方法は、アミロイド沈着物を検出するために同様に有用である。 In the method described above, the detection step (step (b)) uses PET (positron emission tomography), SPECT (single photon emission tomography), MRI, fluorescence imaging or other suitable diagnostic imaging method. May be carried out. PET is the preferred imaging method. The use of PET for imaging tumors and other deposits with detectable molecules is well known. For the preparation of this diagnostic imaging agent and its use in PET, see, for example, Bailly et al. (Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 57), Boerman et al. (J Nucl Med, 2011; 52: 1171-1172), et al. And Mayer et al. (J Nucl Med, 2017; 58: 538-546), the entire contents of which are incorporated herein by reference. Although these references are primarily aimed at detecting cancerous tumors, the materials and methods described therein are equally useful for detecting amyloid deposits.
上述した方法におけるインビボでの撮像ステップは、診断を目的とした全身の撮像、または治療レジメンに対する疾患の進行や患者の反応を評価するように、心臓、腎臓、脾臓、神経系または消化器系などの特定部位を定量的且つ局所的に撮像するものであってもよい。上述した方法における検出ステップは、検出可能な薬剤が１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ、８９Ｚｒまたは６８Ｇａなどのアイソトープである陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、特定の用途に応じて検出可能な薬剤が９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、２０１Ｔｌまたは１３３Ｘｅなどの放射性追跡子である単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、ならびに検出可能な薬剤が例えばガドリニウム、酸化鉄ナノ粒子および炭素被覆した鉄－コバルトナノ粒子などである磁気共鳴撮像法（ＭＲＩ）を含むがこれらに限定されない任意の画像診断技術であってもよい。本明細書に記載する実施例において、抗体は、１２４Ｉまたは８９Ｚｒで標識される。 In vivo imaging steps in the methods described above include whole body imaging for diagnostic purposes, or the heart, kidney, spleen, nervous system or digestive system, etc. to assess disease progression and patient response to a therapeutic regimen. It may be the one that quantitatively and locally images the specific part of. In the detection step in the method described above, the detectable agent is an isotope such as 11 C, 13 N, 15 O, 18 F, 64 Cu, 62 Cu, 124 I, 76 Br, 82 Rb, 89 Zr or 68 Ga. Positron emission tomography (PET), single photon emission tomography (SPECT) where the drug detectable for a particular application is a radiotracer such as 99 m Tc, 111 In, 123 I, 201 Tl or 133 Xe. ), And any diagnostic imaging technique including, but not limited to, magnetic resonance imaging (MRI) in which the detectable agent is, for example, gadrinium, iron oxide nanoparticles and carbon-coated iron-cobalt nanoparticles. good. In the examples described herein, the antibody is labeled with 124 I or 89 Zr.
本明細書に記載の検出可能な分子（本明細書において「標識」、「マーカー」または「薬剤」と呼ぶ場合がある）は、当該技術分野では周知の任意の適切な方法を介して、抗体またはその断片に連結（本明細書において「結合」と呼ぶ場合がある）してもよい。例えば、以下は限定するものではないが、検出可能な薬剤は、共有結合またはイオン相互作用を介して抗体または抗体断片に連結してもよい。結合は、化学的な架橋反応を介して実現されてもよく、バクテリア、酵母または哺乳動物細胞に基づくシステムなどの任意のペプチド発現システムと組み合わされた組換えＤＮＡ方法論を用いた融合を介して実現されてもよい。抗体またはその断片を検出可能な薬剤に連結するための方法は、上述した参考文献に示されているように、当業者には周知である。 The detectable molecule described herein (sometimes referred to herein as a "label", "marker" or "drug") is an antibody via any suitable method well known in the art. Alternatively, it may be linked to the fragment (sometimes referred to as "bonding" herein). For example, the detectable agent may be linked to the antibody or antibody fragment via covalent bonds or ionic interactions, including, but not limited to: Binding may be achieved via a chemical cross-linking reaction or via fusion using a recombinant DNA methodology combined with any peptide expression system, such as a system based on bacterial, yeast or mammalian cells. May be done. Methods for linking an antibody or fragment thereof to a detectable agent are well known to those of skill in the art, as shown in the references described above.
さらに本明細書において、患者のアミロイド沈着物による診断用組成物の取り込みによって決定される、アミロイド沈着物に対する診断用組成物の親和性に基づいて、治療のための本明細書に記載のヒト化またはキメラ抗体の適切な投与量を決定する方法が提供される。すなわち、標識抗体または抗体断片の検出された取り込みに基づいて、患者の投与量を決定することができる。標識抗体または抗体断片の高い取り込みを示す患者は、標識抗体または抗体断片の低い取り込みを示す患者よりも少ない量の治療用抗体または抗体断片を必要とする場合がある。したがって、本発明は、治療のための本明細書に記載のヒト化またはキメラ抗体の適切な投与量を決定する方法を提供する。該方法は、本明細書に記載の標識抗体または抗体断片を患者に投与するステップと、アミロイド沈着物による標識抗体または抗体断片の取り込みを決定するステップと、検出された取り込み量に基づいて、キメラまたはヒト化抗体または抗体断片の投与量または一連の投与量を投与するステップと、を含む。 Further herein, humanization as described herein for treatment based on the affinity of the diagnostic composition for the amyloid deposit, as determined by the uptake of the diagnostic composition by the patient's amyloid deposit. Alternatively, a method of determining an appropriate dose of chimeric antibody is provided. That is, the patient's dose can be determined based on the detected uptake of the labeled antibody or antibody fragment. Patients with high uptake of labeled antibody or antibody fragment may require less therapeutic antibody or antibody fragment than patients with low uptake of labeled antibody or antibody fragment. Accordingly, the present invention provides a method of determining an appropriate dose of a humanized or chimeric antibody described herein for treatment. The method is chimeric based on the steps of administering to a patient the labeled antibody or antibody fragment described herein, determining the uptake of the labeled antibody or antibody fragment by an amyloid deposit, and the amount of uptake detected. Alternatively, it comprises the step of administering a dose of a humanized antibody or antibody fragment or a series of doses.
さらに本明細書において、本明細書に記載のキメラまたはヒト化抗体または抗体断片を用いてアミロイド沈着物を除去する治療の効果を決定する方法が提供される。該方法は、（ａ）本明細書に記載のキメラまたはヒト化抗体または抗体断片などの、アミロイド沈着物を除去するように意図された治療法の治療上有効な投与量で患者を治療するステップと、（ｂ）本明細書に記載の診断用組成物の診断上有効な量を患者に投与するステップと、（ｃ）患者のリンパ節における診断用組成物から検出可能な分子の量を測定するステップと、を含む。ここで、リンパ節で検出された検出可能な分子の量が多いほど、治療の効果が高いといえる。 Further provided herein are methods of determining the efficacy of treatment to remove amyloid deposits using the chimeric or humanized antibodies or antibody fragments described herein. The method (a) treats the patient with a therapeutically effective dose of a treatment method intended to remove amyloid deposits, such as the chimeric or humanized antibody or antibody fragment described herein. And (b) the step of administering to the patient a diagnostically effective amount of the diagnostic composition described herein, and (c) measuring the amount of molecules detectable from the diagnostic composition in the patient's lymph node. Including steps to do. Here, it can be said that the larger the amount of detectable molecule detected in the lymph node, the higher the therapeutic effect.
［定義］
本方法は、本明細書に記載する特定の実施形態に限定されず、変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するために使用されるものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。本技術の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
[Definition]
It should be understood that the method is not limited to the particular embodiments described herein and can vary. It should also be understood that the terms used herein are used to describe only certain embodiments and are not intended to be limiting. The scope of the art is limited only by the appended claims.
本明細書において使用される特定の用語は、以下の定義された意味を有し得る。本明細書および特許請求の範囲において使用される単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈が明確にそうでないと示さない限り、単数参照および複数参照を含む。例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」という用語は、単一の細胞だけでなく、その混合物を含む複数の細胞を含む。 Certain terms used herein may have the following defined meanings. As used herein and in the claims, the singular forms "a," "an," and "the" include singular and plural references unless the context explicitly indicates otherwise. For example, the term "a cell" includes not only a single cell, but also multiple cells containing a mixture thereof.
本明細書において使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、組成物および方法が列挙された要素を含むが、他の要素を排除することを意図していない。「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、組成物または方法にとって本質的に重要な他の要素を排除することを意味する。「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、特許請求の範囲に定義する組成物および実質的な方法ステップにおいて、他の成分の微量元素を超えるものを排除することを意味する。これらの移行用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲に含まれる。したがって、本方法および本組成物は、追加のステップおよび成分を含むことができ（含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ））、あるいは重要でないステップおよび組成物を含むことができ（～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ））、あるいは本明細書に記載の方法ステップまたは組成物のみからなる（～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ））ことができることを意図している。 As used herein, the term "comprising" includes elements in which compositions and methods are listed, but is not intended to exclude other elements. "Consisting essentially of", when used to define a composition and method, means eliminating other elements that are essentially important to the composition or method. By "consisting of" is meant to exclude trace elements of other components in the composition and substantial method steps as defined in the claims. The embodiments defined by each of these transitional terms are within the scope of the invention. Thus, the method and the composition can include (comprising) additional steps and ingredients, or can include (consisting essently of) non-essential steps and compositions. )), Or it is intended to be able to consist of (consisting of) only the method steps or compositions described herein.
本明細書において使用される「約（ａｂｏｕｔ）」は、その値からプラスまたはマイナス１０％を意味する。 As used herein, "about" means plus or minus 10% from that value.
本明細書において使用される「任意（ｏｐｔｉｏｎａｌ、ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、以下に記載する事象または状況が発生してもしなくてもよく、記載が、その事象または状況が発生する場合と発生しない場合とを含むことを意味する。 As used herein, "optional, optionally" may or may not have the events or situations described below, with or without the events or situations described below. Means to include.
本明細書において使用される「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」、「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」または「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」という用語は、個々の生物、脊椎動物、哺乳動物（例えば、ウシ、イヌ、ネコまたはウマ）、またはヒトであり得る。好ましい実施形態において、個体、患者または対象は、ヒトである。 As used herein, the terms "individual," "patient," or "subject" refer to individual organisms, vertebrates, mammals (eg, cows, dogs, cats, or horses). ), Or can be human. In a preferred embodiment, the individual, patient or subject is a human.
本明細書において使用される「単離抗体（ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すように意図されている（例えば、アミロイド原線維に特異的に結合する単離抗体は、アミロイド原線維に結合しない抗体を実質的に含まない）。ただし、アミロイド軽鎖原線維（例えば、κおよび／またはλ原線維）のエピトープに特異的に結合する単離抗体は、アミロイドＡ原線維などの他のタンパク質に対して交差反応性を有する場合がある。しかしながら、抗体は、好ましくは常にヒトアミロイド軽鎖原線維に結合する。また、単離抗体は、典型的には他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない。 As used herein, the term "isolated antibody" is intended to refer to an antibody that is substantially free of other antibodies with different antigen specificities (eg, amyloid fibrils). An isolated antibody that specifically binds to amyloid fibrils is substantially free of antibodies that do not bind to amyloid fibrils). However, isolated antibodies that specifically bind to epitopes on amyloid light chain fibrils (eg, κ and / or λ fibrils) may be cross-reactive with other proteins such as amyloid A fibrils. be. However, the antibody preferably always binds to human amyloid light chain fibrils. Also, isolated antibodies are typically substantially free of other cellular and / or chemicals.
本明細書において使用される「診断上有効な量」という用語は、患者または対象に投与したときに、アミロイド沈着物が存在する場合に患者または対象におけるその沈着物を画像診断によってインビボで検出、位置特定および／または定量化することができる、検出可能なマーカーが連結した抗体または抗体断片の量を意味する。当業者によってたとえその量が診断上有効な量であるとみなされたとしても、診断上有効な量は、アミロイド沈着物の検出に必ずしも有効ではないことが強調される。診断上有効な量は、投与経路および剤形、対象の年齢および体重、および／または診断開始時のアミロイドーシスの種類や病期などの対象の状態、ならびに他の要因に基づいて、変化する場合がある。 As used herein, the term "diagnostically effective amount" means that when administered to a patient or subject, the deposits in the patient or subject, if present, are detected in vivo by diagnostic imaging. Means the amount of antibody or antibody fragment linked to a detectable marker that can be located and / or quantified. It is emphasized that a diagnostically effective amount is not necessarily effective in detecting amyloid deposits, even if one of ordinary skill in the art considers the amount to be a diagnostically effective amount. Diagnostically effective amounts may vary based on the route of administration and dosage form, the subject's age and weight, and / or the subject's condition, such as the type and stage of amyloidosis at the start of diagnosis, and other factors. be.
本明細書において使用される「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、ヒト以外の哺乳動物に由来する抗体のＣＤＲ、ならびにヒト化抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域を有する抗体を指す。ヒト化抗体は、人体におけるヒト化抗体の抗原性が低下するため、本発明による診断用組成物における要素として有用である。 As used herein, the term "humanized antibody" refers to the CDRs of antibodies derived from non-human mammals, as well as antibodies having a framework region (FR) and constant region of humanized antibodies. Point to. Since the humanized antibody reduces the antigenicity of the humanized antibody in the human body, it is useful as an element in the diagnostic composition according to the present invention.
本明細書において使用される「抗体断片」という用語は、抗体のＣＤＲを含みながら、無傷の抗体の構造体の一部を削除するように設計された抗体の一部を意味する。抗体断片の設計は、当該技術分野では周知であり、（例えば）Ｈｏｌｌｉｇｅｒらにより、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：２３（９），１１２６－１１３５（２００５）に記載されており、その全内容が参照により本明細書に組み込まれている。本明細書において使用される「抗原結合断片」は、アミロイド沈着物に結合する抗体断片を意味する。 As used herein, the term "antibody fragment" means a portion of an antibody designed to remove a portion of the intact antibody structure while containing the CDR of the antibody. The design of antibody fragments is well known in the art and is described by (eg) Holliger et al. In Nature Biotechnology: 23 (9), 1126-1135 (2005), the entire contents of which are described herein by reference. It is built into. As used herein, "antigen binding fragment" means an antibody fragment that binds to an amyloid deposit.
本明細書において使用される「薬学的に許容される担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ－ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」という用語は、例えば「Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」第１０版（２０１４）に記載されているような、患者に投与するための医薬化合物または診療用化合物（例えば、検出可能な分子に連結したキメラ抗体）と混和するための材料を意味する。 The term "pharmaceutically-acceptable carrier" as used herein is described, for example, in "Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Delivery Systems" 10th Edition (2014). It means a material for mixing with a pharmaceutical compound or a medical compound for administration to a patient (for example, a chimeric antibody linked to a detectable molecule).
本明細書において使用される「検出可能な分子」、「検出可能なマーカー」、「検出可能な薬剤」および「検出可能な標識」という同義語は、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴおよびＭＲＩなどを含む（ただしこれらに限定されない）画像診断技術によってインビボで検出される可能性がある物質を意味する。 As used herein, synonyms for "detectable molecule," "detectable marker," "detectable agent," and "detectable label" include PET, SPECT, MRI, and the like (but these). Means substances that may be detected in vivo by diagnostic imaging techniques (but not limited to).
本明細書において使用される「画像診断」または「撮像」という用語は、検出される組織または物質に結合する抗体または抗体断片に連結することで、位置が特定された検出可能な分子を有する患者または対象における組織または物質（アミロイド沈着物など）の存在、位置および／または量を決定するように、患者または対象における検出可能な分子をインビボで撮像する方法を意味する。 As used herein, the term "imaging" or "imaging" refers to a patient having a detectable molecule that is located by linking to an antibody or antibody fragment that binds to the tissue or substance being detected. Alternatively, it means a method of in vivo imaging of a detectable molecule in a patient or subject so as to determine the presence, location and / or amount of tissue or substance (such as amyloid deposits) in the subject.
［抗ＡＬ抗体］
［［マウス抗原線維抗体］］
近年の動物研究では、マウス１１－１Ｆ４抗体と、ＡＬ原線維に存在するβプリーツシート構造に共通するエピトープに対する他のマウス抗ヒト軽鎖特異的抗体とを投与すると、ヒトＡＬκおよびＡＬλアミロイド沈着物が完全に分解されることが示されている。これらのマウス抗体の一部は、米国特許第８，１０５，５９４号（以下「５９４号特許」）明細書に記載されており、その全内容が参照により本明細書に組み込まれている。
[Anti-AL antibody]
[[Mouse antigen fiber antibody]]
In recent animal studies, administration of mouse 11-1F4 antibody with other mouse anti-human light chain-specific antibodies against epitopes common to β-pleated sheet structures present in AL fibrils resulted in human ALκ and ALλ amyloid deposits. Has been shown to be completely decomposed. Some of these mouse antibodies are described in US Pat. No. 8,105,594 (“594”), the entire contents of which are incorporated herein by reference.
受容種がマウス抗体を抗原として認識し、それに対する抗体を産生するため、マウス抗体は、他の動物種（ヒトなど）への投与には一般的に適さない。ある種からの抗体が別の種に注入された場合の抗原性は、通常、定常ドメインの一部によって引き起こされる。このような抗原性反応は、マウス抗体の所望の治療効果を阻害または防止する。ヒトの場合、この抗原性反応は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）と呼ばれる。５９４号特許に記載されている抗体は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を介して、ヒトにおいて高い免疫原性を示す可能性がある。ＨＡＭＡ反応は、通常、ヒトのレシピエントからのマウス抗体の急速な除去をもたらすので、ＨＡＭＡは、マウス抗体がヒトの治療や診断にもたらす利点を大きく制限する。そのため、これらのマウス抗体は、患者におけるアミロイド原線維の沈着物を検出するために患者に投与するのには適していない。したがって、本発明は、投与後の患者において免疫原性ＨＡＭＡ反応を生じる可能性が低い、アミロイド沈着疾患を検出および／または監視するための組成物を提供する。 Mouse antibodies are generally unsuitable for administration to other animal species (such as humans) because the recipient recognizes the mouse antibody as an antigen and produces an antibody against it. Antigenicity when an antibody from one species is injected into another is usually caused by part of the constant domain. Such an antigenic reaction inhibits or prevents the desired therapeutic effect of the mouse antibody. In humans, this antigenic response is called a human antimouse antibody (HAMA). The antibodies described in patent 594 may exhibit high immunogenicity in humans via a human anti-mouse antibody (HAMA) response. Since the HAMA reaction usually results in the rapid removal of mouse antibodies from human recipients, HAMA severely limits the benefits that mouse antibodies bring to human treatment and diagnosis. Therefore, these mouse antibodies are not suitable for administration to patients to detect deposits of amyloid fibrils in patients. Accordingly, the present invention provides compositions for detecting and / or monitoring amyloid deposits that are unlikely to cause an immunogenic HAMA reaction in a patient after administration.
［［ヒト化およびキメラ抗原線維抗体］］
本発明は、検出可能な分子が連結したヒト化およびキメラ抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を提供する。本明細書に記載の組成物は、対象におけるアミロイド沈着物の位置および量を撮像するために有用である。典型的には、抗体は、重（Ｈ）鎖ポリペプチドの２つの同一コピーと、軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの２つのコピーと、を含む４つのポリペプチドからなる。典型的には、各重鎖は、２つのＮ末端可変（ＶＨ）領域と、３つのＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）領域と、を有し、各軽鎖は、１つのＮ末端可変（ＶＬまたはＶＫ）領域と、１つのＣ末端定常（ＣＬ）領域と、を有する。また、抗体における軽鎖および重鎖の各可変ドメインは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントを含む。軽鎖における各ＣＤＲは、隣接する重鎖における対応するＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位を形成する。軽鎖および重鎖の各対の可変領域が抗体の抗原結合部位を形成する一方で、定常領域は、構造的支持を提供し、抗原結合によって開始される免疫反応を調節する。
[[Humanized and chimeric antigen fiber antibody]]
The present invention provides compositions comprising humanized and chimeric antibodies or antigen-binding fragments thereof linked with detectable molecules. The compositions described herein are useful for imaging the location and amount of amyloid deposits in a subject. Typically, the antibody consists of four polypeptides, including two identical copies of the heavy (H) chain polypeptide and two copies of the light (L) chain polypeptide. Typically, each heavy chain has two N-terminal variable ( VH ) regions and three C-terminal stationary (CH1, CH2 and CH3) regions, where each light chain has one N-terminal. It has a variable ( VL or V K ) region and one C-terminal stationary (CL) region. Also, the light and heavy chain variable domains in an antibody contain three segments called complementarity determining regions (“CDRs”) or hypervariable regions. Each CDR in the light chain, along with the corresponding CDR in the adjacent heavy chain, forms an antigen binding site for the antibody. The variable regions of each pair of light and heavy chains form the antigen binding site of the antibody, while the constant regions provide structural support and regulate the immune response initiated by the antigen binding.
キメラ抗体は、非ヒト化抗体の可変領域をヒト化抗体の定常領域に組み込んでいる。例えば、キメラ１１－１Ｆ４抗体は、ヒトＩｇＧ１などのヒト化抗体のＦｃ領域でマウス可変領域を発現させることで産生されてもよい。 The chimeric antibody incorporates the variable region of the non-humanized antibody into the constant region of the humanized antibody. For example, the chimeric 11-1F4 antibody may be produced by expressing a mouse variable region in the Fc region of a humanized antibody such as human IgG1.
非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む、ヒト化型の非ヒト（例えばマウス）抗体を得ることができる。一般に、ヒト化抗体は、１つまたは２つ以上の可変ドメインを有してもよい。可変領域は、非ヒト免疫グロブリンに由来し、フレームワーク領域（ＦＲ）は、ヒト免疫グロブリン配列に対応する。したがって、一部の実施形態において、ヒト化抗ＡＬ抗体は、ヒト化抗体フレームワーク領域を有する。このような抗体は、既知の技術によって調製することができる。 Humanized non-human (eg, mouse) antibodies can be obtained that contain the smallest sequences derived from non-human immunoglobulins. In general, humanized antibodies may have one or more variable domains. The variable region is derived from non-human immunoglobulin and the framework region (FR) corresponds to the human immunoglobulin sequence. Therefore, in some embodiments, the humanized anti-AL antibody has a humanized antibody framework region. Such antibodies can be prepared by known techniques.
マウス１１－１Ｆ４モノクローナル抗体は、アラン・ソロモン医学博士（米国テネシー州ノックスビル市のテネシー大学医療科学センター）に寄託されたＳＰ２／０ハイブリドーマ細胞によって産生される抗ＡＬ抗体である。ハイブリドーマ細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ－１０５）から入手可能である。以下の表１には、１１－１Ｆ４抗体のＶＫ領域（配列番号３６）およびＶＨ領域（配列番号３５）が示されている。表２には、重鎖および軽鎖のＣＤＲ配列が示されている。 The mouse 11-1F4 monoclonal antibody is an anti-AL antibody produced by SP2 / 0 hybridoma cells deposited by Dr. Alan Solomon (University of Tennessee Medical Science Center, Knoxville, Tennessee, USA). Hybridoma cell lines are available from the American Cultured Cell Lineage Conservation Agency (ATCC Deposited PTA-105). Table 1 below shows the VK region (SEQ ID NO: 36) and VH region (SEQ ID NO: 35) of the 11-1F4 antibody. Table 2 shows the CDR sequences of the heavy and light chains.
既知のヒト抗体配列を使用して、上述したＶＨおよびＶＫ領域の遺伝子をクローニングして、キメラ１１－１Ｆ４抗体を作製することができる。キメラ１１－１Ｆ４抗体は、それに相当するマウス抗体と同様に、アミロイドのβプリーツシート構造によって発現されるエピトープに結合する。驚くべきことに、以下の実施例６が示すように、このキメラ抗体は、それが由来する１１－１Ｆ４マウス抗体よりも高い親和性でＡＬアミロイド原線維に結合する。 The known human antibody sequences can be used to clone the genes in the VH and VK regions described above to generate chimeric 11-1F4 antibodies. The chimeric 11-1F4 antibody, like its corresponding mouse antibody, binds to an epitope expressed by the β-pleated sheet structure of amyloid. Surprisingly, as shown in Example 6 below, this chimeric antibody binds to AL amyloid fibrils with higher affinity than the 11-1F4 mouse antibody from which it is derived.
既知のヒト抗体配列を使用して、ＣＤＲ領域の遺伝子をクローニングして、ヒト化型の抗体を作製することもできる。キメラ型の１１－１Ｆ４抗体と同様に、ヒト化型も、それに相当するマウス抗体よりも高いアミロイド原線維に対する結合親和性を有し得る。 Known human antibody sequences can also be used to clone genes in the CDR regions to produce humanized antibodies. Like the chimeric 11-1F4 antibody, the humanized version may have a higher binding affinity for amyloid fibrils than the corresponding mouse antibody.
当業者であれば、本明細書に記載のヒト化およびキメラ抗体は、あらゆる種類のヒト定常領域および／またはフレームワーク領域を利用することができることを理解するであろう。例えば、本明細書に記載のヒト化およびキメラ抗体は、ヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＨ、またはＩｇＭの定常領域および／またはフレームワーク領域を有してもよい。好ましい実施形態において、本明細書に記載のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体は、ヒトＩｇＧ１定常領域を有する。 Those skilled in the art will appreciate that the humanized and chimeric antibodies described herein can utilize any type of human constant region and / or framework region. For example, the humanized and chimeric antibodies described herein have a constant and / or framework region of human IgG (including IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4), IgA, IgE, IgH, or IgM. May be good. In a preferred embodiment, the humanized or chimeric 11-1F4 antibodies described herein have a human IgG1 constant region.
一部の実施形態において、本明細書に記載の抗体は、抗体がアミロイド原線維（例えば、κおよび／またはλ軽鎖原線維）に結合する能力を維持する限り、１つまたは複数の置換、挿入または欠失を含んでもよい。例えば、一部の実施形態において、本発明のキメラ１１－１Ｆ４抗体は、抗体がアミロイド原線維に結合する能力を維持する限り、本明細書に記載の対応する重鎖および軽鎖配列と比較して、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性を有する重鎖および軽鎖を有してもよい。一部の実施形態において、本発明のヒト化１１－１Ｆ４抗体は、抗体がアミロイド原線維に結合する能力を維持する限り、本明細書に記載の対応するＣＤＲ配列と比較して、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性を有するＣＤＲを有してもよい。 In some embodiments, the antibodies described herein are one or more substitutions, as long as the antibody maintains its ability to bind to amyloid fibrils (eg, κ and / or λ light chain fibrils). It may include insertions or deletions. For example, in some embodiments, the chimeric 11-1F4 antibody of the invention is compared to the corresponding heavy and light chain sequences described herein as long as the antibody maintains its ability to bind to amyloid fibrils. About 85%, about 86%, about 87%, about 88%, about 89%, about 90%, about 91%, about 92%, about 93%, about 94%, about 95%, about 96%, It may have heavy and light chains having about 97%, about 98%, about 99%, or about 100% identity. In some embodiments, the humanized 11-1F4 antibody of the invention is approximately 85% compared to the corresponding CDR sequences described herein, as long as the antibody maintains its ability to bind to amyloid fibrils. , About 86%, about 87%, about 88%, about 89%, about 90%, about 91%, about 92%, about 93%, about 94%, about 95%, about 96%, about 97%, about You may have a CDR with 98%, about 99%, or about 100% identity.
［略語］
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、コピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、分（ｍｉｎ）、秒（ｓｅｃ）、トリス－ホウ酸緩衝液（ＴＢＥ）。
[Abbreviation]
Dalveco modified Eagle's medium (DMEM), bovine fetal serum (FBS), ribonucleic acid (RNA), messenger RNA (mRNA), deoxyribonucleic acid (DNA), copy DNA (DNA), polymerase chain reaction (PCR), minutes (min) , Seconds (sec), Tris-boric acid buffer (TBE).
アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ略語によって次の通り表される：アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、バリン（Ｖａｌ）。ヌクレオチドについても、同様に次の通り表される：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、アデニンまたはグアニン（Ｒ）、シトシンまたはチミン（Ｙ）、グアニンまたはシトシン（Ｓ）、アデニンまたはチミン（Ｗ）、グアニンまたはチミン（Ｋ）、アデニンまたはシトシン（Ｍ）、シトシンまたはグアニンまたはチミン（Ｂ）、アデニンまたはグアニンまたはチミン（Ｄ）、アデニンまたはシトシンまたはチミン（Ｈ）、アデニンまたはシトシンまたはグアニン（Ｖ）、および任意の塩基（Ｎ）。 Amino acids are represented by the IUPAC abbreviations as follows: alanine (Ala), arginine (Arg), aspartin (Asn), aspartic acid (Asp), cysteine (Cys), glutamine (Gln), glutamine (Glu), glycine. (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), methionine (Met), phenylalanine (Phe), proline (Pro), serine (Ser), threonin (Thr), tryptophan (Trp), tyrosine (Tyr), valine (Val). Nucleotides are similarly expressed as follows: adenine (A), cytosine (C), guanine (G), thymine (T), uracil (U), adenine or guanine (R), cytosine or thymine (Y). ), Guanine or thymine (S), adenine or thymine (W), guanine or thymine (K), adenine or thymine (M), cytosine or guanine or thymine (B), adenine or guanine or thymine (D), adenine or Cytocin or thymine (H), adenine or cytosine or guanine (V), and any base (N).
［ヒト化またはキメラ抗体］
本発明のキメラ抗体を産生するために、米国特許第８，１０５，５９４号明細書に記載されているマウス１１－１Ｆ４モノクローナル抗体重鎖およびκ軽鎖可変領域遺伝子をＰＣＲ改変して、哺乳動物細胞におけるキメラ１１－１Ｆ４抗体の発現を促進した。改変された可変領域遺伝子の詳細な配列分析を実施した。改変された可変領域遺伝子を適切な哺乳動物発現ベクターにクローニングし、構築物１１－１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００および１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００を作製した。ＥｃｏＲＩ制限酵素消化およびライゲーションによって、１１－１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００および１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００構築物から、単一スーパーベクター構築物ｐＧ１ＫＤ２００－１１－１Ｆ４を作製した。最後に、コトランスフェクションと単一スーパーベクタートランスフェクションの両方によって、キメラ１１－１Ｆ４抗体をＣＯＳ細胞で一過的に発現させた。便宜上、コトランスフェクションまたはトランスフェクションのためにＣＯＳ細胞を選択したが、当業者であれば他の哺乳動物細胞株を使用できることを認識するであろう。アミロイド原線維に対するキメラ１１－１Ｆ４抗体の結合能力の特性を、直接結合ＥＬＩＳＡによって決定した。予想外且つ有益なことに、キメラ１１－１Ｆ４抗体は、マウス１１－１Ｆ４抗体よりも高い親和性でアミロイド原線維に結合した。
[Humanized or chimeric antibody]
In order to produce the chimeric antibody of the present invention, the mouse 11-1F4 monoclonal antibody heavy chain and κ light chain variable region genes described in US Pat. No. 8,105,594 are PCR-modified to mammals. It promoted the expression of the chimeric 11-1F4 antibody in cells. Detailed sequence analysis of the modified variable region gene was performed. The modified variable region gene was cloned into a suitable mammalian expression vector and constructed with 11-1F4VHpG1D200 and 11-1F4VK. pKN100 was prepared. By EcoRI restriction enzyme digestion and ligation, 11-1F4VHpG1D200 and 11-1F4VK. A single supervector construct pG1KD200-11-1F4 was made from the pKN100 construct. Finally, the chimeric 11-1F4 antibody was transiently expressed in COS cells by both cotransfection and single supervector transfection. For convenience, COS cells have been selected for cotransfection or transfection, but one of skill in the art will recognize that other mammalian cell lines can be used. The binding ability of the chimeric 11-1F4 antibody to amyloid fibrils was characterized by direct binding ELISA. Unexpectedly and beneficially, the chimeric 11-1F4 antibody bound to amyloid fibrils with a higher affinity than the mouse 11-1F4 antibody.
典型的には、抗体は、重（Ｈ）鎖ポリペプチドの２つの同一コピーと、軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの２つのコピーと、を含む４つのポリペプチドからなる。典型的には、各重鎖は、１つのＮ末端可変（ＶＨ）領域と、３つのＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）領域と、を有し、各軽鎖は、１つのＮ末端可変（ＶＬまたはＶＫ）領域と、１つのＣ末端定常（ＣＬ）領域と、を有する。軽鎖および重鎖の各対の可変領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。 Typically, the antibody consists of four polypeptides, including two identical copies of the heavy (H) chain polypeptide and two copies of the light (L) chain polypeptide. Typically, each heavy chain has one N-terminal variable ( VH ) region and three C-terminal stationary (CH1, CH2 and CH3) regions, where each light chain has one N-terminal. It has a variable ( VL or V K ) region and one C-terminal stationary (CL) region. The variable regions of each pair of light and heavy chains form the antigen-binding site of the antibody.
本発明の組成物および方法で有用な抗体は、配列番号４７のＶＫ領域と配列番号４８のＶＨ領域とを有するキメラマウス－ヒトモノクローナル抗体、または配列番号４９～５４のＣＤＲ配列を含むヒト化モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、アミロイド原線維のβプリーツシート構造によって発現されるエピトープに結合する。さらに、驚くべきことに、これらの抗体は、配列番号３６のＶＫ領域と配列番号３５のＶＨ領域とを有する、それらが由来する１１－１Ｆ４マウス抗体よりも高い親和性でこのエピトープに結合する。本発明は、ヒト患者におけるアミロイド沈着物を検出する方法を含む。該方法は、薬学的に許容される担体において検出可能な分子に連結する１つの上述した抗体の診断上有効な投与量を患者に投与するステップを含む。抗体組成物は、任意の従来の投与経路によって投与されてもよいが、非経口投与（静脈内など）が好ましい。薬学的に許容される担体は、当該技術分野では周知であり、適切なものが医学分野の当業者によって選択され得る。 Antibodies useful in the compositions and methods of the invention are chimeric mouse-human monoclonal antibodies having the VK region of SEQ ID NO: 47 and the VH region of SEQ ID NO: 48, or humans comprising the CDR sequences of SEQ ID NOs: 49-54. It may be a modified monoclonal antibody. These antibodies bind to epitopes expressed by the β-pleated sheet structure of amyloid fibrils. Furthermore, surprisingly, these antibodies bind to this epitope with higher affinity than the 11-1F4 mouse antibody from which they have the VK region of SEQ ID NO: 36 and the VH region of SEQ ID NO: 35. do. The present invention includes methods for detecting amyloid deposits in human patients. The method comprises administering to the patient a diagnostically effective dose of one of the aforementioned antibodies linked to a detectable molecule on a pharmaceutically acceptable carrier. The antibody composition may be administered by any conventional route of administration, but parenteral administration (intravenous or the like) is preferred. Pharmaceutically acceptable carriers are well known in the art and suitable may be selected by one of ordinary skill in the medical art.
本明細書に記載され且つ特許請求される組成物および方法に有用なキメラ抗体およびその抗原結合断片（ならびにキメラ抗体を作製する方法）は、２０１８年６月２８日付で提出され、共同所有の特許協力条約出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／３９９８０５（２０１７年６月２９日付で出願された米国特許出願第６２／５２６，８３５号に基づく優先権を有する整理番号８４４１－０００４ＷＯ）、および２０１８年７月２４日付で提出され、共同所有の特許協力条約出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４３３７４（整理番号８４４１－０００９ＷＯ）に記載されており、その全内容が参照により本明細書に組み込まれている。本抗体を作製するのに有用な材料には、図５および図６にそれぞれ示す１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１－Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００からなる群から選択されるベクター構築物、ならびに上述した２つのベクター構築物から作製された超構築物（ｓｕｐｅｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）ｐＧ．１ＫＤ２００１１－１Ｆ４が含まれる。他の有用な材料は、改変マウス１１－１Ｆ４抗体ＶＫ領域遺伝子（配列番号４２）と、改変１１－１Ｆ４抗体ＶＨ領域遺伝子（配列番号４５）と、それぞれのプライマーである配列番号４１、４３、４４および４６と、を含む。本抗体は、ベクター構築物１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１－Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００または超構築物ｐＧ．１ＫＤ２００１１－１Ｆ４のＣＯＳ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞などの適切な哺乳動物宿主細胞へのコトランスフェクションによって作製されてもよい。 Chimera antibodies and antigen-binding fragments thereof (as well as methods for making chimeric antibodies) described herein and useful for the claimed compositions and methods were filed on June 28, 2018 and are co-owned patents. In the Cooperation Treaty application PCT / US18 / 399805 (reference number 8441-0004WO with priority under US Patent Application No. 62 / 526,835 filed June 29, 2017), and July 24, 2018. It has been submitted and is described in the jointly owned Patent Cooperation Treaty application PCT / US2018 / 043374 (reference number 8441-0009WO), the entire contents of which are incorporated herein by reference. Materials useful for producing this antibody include 11-1F4VK. pKN100 and 11-F4VH. A vector construct selected from the group consisting of pG1D200, as well as a superconstruct pG made from the two vector constructs described above. 1KD20011-1F4 is included. Other useful materials include the modified mouse 11-1F4 antibody VK region gene (SEQ ID NO: 42), the modified 11-1F4 antibody VH region gene (SEQ ID NO: 45), and primers, SEQ ID NOs: 41 and 43, respectively. , 44 and 46, and the like. This antibody is obtained from the vector construct 11-1F4VK. pKN100 and 11-F4VH. pG1D200 or super construct pG. It may be made by co-transfection into a suitable mammalian host cell such as 1KD2001-1F4 COS (Chinese hamster ovary) cells.
ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体を作製、試験および使用する方法を、以下の実施例の節でさらに詳細に説明する。
［診断用製法］
本明細書に記載の方法に適した診断用組成物は、検出可能なマーカーにそれぞれ連結した本明細書に記載のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体、ヒト化抗体または抗原結合抗体断片と、薬学的に許容される担体または希釈剤と、を含むことができる。
Methods for producing, testing and using humanized or chimeric 11-1F4 antibodies are described in more detail in the Examples section below.
[Diagnosis method]
Diagnostic compositions suitable for the methods described herein are the humanized or chimeric 11-1F4 antibody, humanized antibody or antigen-binding antibody fragment described herein, respectively linked to a detectable marker, and the pharmaceutical. Can include a carrier or diluent that is acceptable to the patient.
組成物は、静脈内、皮下、腹腔内または筋肉内投与のために配合されてもよいが、静脈内投与が好ましい。 The composition may be formulated for intravenous, subcutaneous, intraperitoneal or intramuscular administration, with intravenous administration being preferred.
様々な剤形のための薬理学的に許容される担体が当技術分野で知られている。例えば、液体製剤用の溶媒、可溶化剤、懸濁化剤、等張剤、緩衝剤および無痛化剤が知られている。一部の実施形態において、医薬組成物は、１つまたは複数の保存剤、酸化防止剤、安定化剤などの追加の成分を含む。 Pharmacologically acceptable carriers for various dosage forms are known in the art. For example, solvents for liquid formulations, solubilizers, suspending agents, isotonic agents, buffering agents and soothing agents are known. In some embodiments, the pharmaceutical composition comprises additional ingredients such as one or more preservatives, antioxidants, stabilizers and the like.
滅菌注射液は、マーカーが連結した抗体または抗体断片の必要な量を、必要に応じて上述した成分の１つまたは複数の組み合わせと共に適切な溶媒に組み込み、次いで滅菌精密濾過法によって調製することができる。一般に、分散液は、診断用組成物を、基本的な分散媒および上述した他の成分のうちの必要な成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。
［診断および監視の方法］
一般に、アミロイドーシスは、アミロイドと呼ばれる異常なタンパク質の蓄積によって引き起こされる。アミロイドは、骨髄で産生され、いずれの組織または臓器にも沈着し得る。この具体的な原因は、アミロイドーシスの種類に依存する。
Sterilized injections can be prepared by incorporating the required amount of the antibody or antibody fragment to which the marker is ligated into a suitable solvent, optionally with one or more combinations of the components described above, and then by sterile microfiltration. can. Generally, dispersions are prepared by incorporating the diagnostic composition into a sterile vehicle containing the basic dispersion medium and the required components of the other components described above.
[Diagnosis and monitoring method]
Generally, amyloidosis is caused by the accumulation of an abnormal protein called amyloid. Amyloid is produced in the bone marrow and can be deposited in any tissue or organ. The specific cause of this depends on the type of amyloidosis.
アミロイドーシスまたはアミロイド疾患には、ＡＬアミロイドーシス、ＡＡアミロイドーシスおよび遺伝性アミロイドーシスを含むいくつかのタイプがある。 There are several types of amyloidosis or amyloidosis, including AL amyloidosis, AA amyloidosis and hereditary amyloidosis.
ＡＬアミロイドーシス（免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシス）は、最も一般的なタイプで、心臓、腎臓、皮膚、神経および肝臓に発症する。以前は原発性アミロイドーシスとして知られていたＡＬアミロイドーシスは、分解できない異常な抗体を骨髄が産生することで発生する。抗体は、アミロイド斑として様々な組織に沈着し、組織または臓器の正常な機能を阻害する。 AL amyloidosis (immunoglobulin light chain amyloidosis) is the most common type and affects the heart, kidneys, skin, nerves and liver. AL amyloidosis, formerly known as primary amyloidosis, occurs when the bone marrow produces abnormal antibodies that cannot be degraded. Antibodies deposit in various tissues as amyloid plaques and interfere with the normal functioning of tissues or organs.
以前は続発性アミロイドーシスとして知られていたＡＡアミロイドーシスは、一般に腎臓に発症するが、消化管、肝臓または心臓に発症する場合もある。これは、関節リウマチまたは炎症性腸疾患などの慢性感染性疾患または炎症性疾患に伴って発症することが多い。 AA amyloidosis, formerly known as secondary amyloidosis, generally affects the kidneys, but can also affect the gastrointestinal tract, liver, or heart. It often develops with chronic infectious or inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis or inflammatory bowel disease.
遺伝性アミロイドーシス（家族性アミロイドーシス）は、通常、肝臓、神経、心臓および／または腎臓に発症することが多い遺伝性障害である。出生時に存在する多くの異なるタイプの遺伝子異常が、アミロイド疾患または遺伝性アミロイドーシスのリスクの増加と関連している。アミロイド遺伝子異常のタイプおよび位置は、特定の合併症のリスク、症状が最初に現れる年齢および疾患の経時的進行に影響を及ぼす。 Hereditary amyloidosis (familial amyloidosis) is a hereditary disorder that usually affects the liver, nerves, heart and / or kidneys. Many different types of genetic abnormalities present at birth are associated with an increased risk of amyloid disease or hereditary amyloidosis. The type and location of amyloid gene abnormalities influences the risk of certain complications, the age at which symptoms first appear, and the progression of the disease over time.
アミロイド疾患が心臓に発症すると、多数のタイプの合併症を引き起こし得る。アミロイド沈着物または斑は、心臓が心拍の間に血液で満たされる能力を低下させる。拍動ごとに送られる血液量が少なくなり、息切れの原因となる。また、心臓内または心臓周囲のアミロイド沈着物や斑は、不整脈およびうっ血性心不全などの臓器障害の原因にもなる。 When amyloid disease develops in the heart, it can cause many types of complications. Amyloid deposits or plaques reduce the ability of the heart to fill with blood during the heartbeat. The amount of blood sent with each beat decreases, causing shortness of breath. Amyloid deposits and plaques in or around the heart can also cause organ damage such as arrhythmias and congestive heart failure.
アミロイド疾患が腎臓に発症すると、腎臓の濾過能力が損なわれ、タンパク質が血液から尿に漏出することが多くなる（すなわち、タンパク尿）。さらに、体から老廃物を除去する腎臓の能力が低下し、最終的に腎不全につながり得る。 When amyloid disease develops in the kidneys, the ability of the kidneys to filter is impaired and proteins often leak from the blood into the urine (ie, proteinuria). In addition, the kidneys' ability to remove waste products from the body is reduced, which can ultimately lead to renal failure.
本明細書において、原発性（ＡＬ）アミロイドーシスなどのアミロイド沈着疾患に罹患しているまたは罹患していると疑われる患者におけるアミロイド沈着物を検出、位置特定および／または定量化する方法を提供する。該方法では、アミロイド沈着物が存在する場合にそれを検出、位置特定および／または定量化するのに効果的な量で、検出可能なマーカーに連結したヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体またはその抗原結合断片と薬学的に許容される担体とを患者（例えば、ヒト患者）に投与し、次いで、画像診断によって、患者におけるアミロイド沈着物に結合した検出可能な分子を検出して、アミロイド沈着物が存在する場合にその範囲、位置および／または量を決定することができる。 Provided herein are methods of detecting, locating and / or quantifying amyloid deposits in patients with or suspected of having or suspected of having amyloid deposits such as primary (AL) amyloidosis. In the method, a humanized or chimeric 11-1F4 antibody or antigen thereof linked to a detectable marker in an amount effective for detecting, locating and / or quantifying the presence of amyloid deposits. A binding fragment and a pharmaceutically acceptable carrier are administered to the patient (eg, a human patient), and then diagnostic imaging is performed to detect the detectable molecule bound to the amyloid deposit in the patient, resulting in the amyloid deposit. Its range, position and / or quantity, if present, can be determined.
また、本明細書において、アミロイド沈着疾患と診断され且つアミロイド沈着物を有する患者における疾患の進行を監視する方法が提供される。該方法は、
（ａ）検出可能な分子が連結したヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体またはその抗原結合断片の診断上有効な量を患者に投与し、画像診断を患者に実施して、アミロイド沈着物に結合した検出可能な分子の量を検出するステップと、
（ｂ）ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体またはその抗原結合断片などの、アミロイド沈着物を除去するように意図された治療法で患者を治療するステップと、
（ｃ）検出可能な分子が連結したヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体またはその抗原結合断片の診断上有効な量を患者に投与し、画像診断を患者に実施して、アミロイド沈着物に結合した検出可能な分子の量を検出するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で検出された検出可能な分子の量と、ステップ（ａ）で検出された検出可能な分子の量とを比較するステップと、を含む。
Also provided herein are methods of monitoring disease progression in patients diagnosed with amyloid deposits and having amyloid deposits. The method is
(A) A diagnostically effective amount of a humanized or chimeric 11-1F4 antibody or antigen-binding fragment thereof ligated with a detectable molecule was administered to the patient, and diagnostic imaging was performed on the patient to bind to amyloid deposits. Steps to detect the amount of detectable molecule, and
(B) A step of treating a patient with a treatment intended to remove amyloid deposits, such as a humanized or chimeric 11-1F4 antibody or antigen-binding fragment thereof.
(C) A diagnostically effective amount of a humanized or chimeric 11-1F4 antibody or antigen-binding fragment thereof ligated with a detectable molecule was administered to the patient, and diagnostic imaging was performed on the patient to bind to amyloid deposits. Steps to detect the amount of detectable molecule, and
(D) Includes a step of comparing the amount of detectable molecule detected in step (c) with the amount of detectable molecule detected in step (a).
上述した監視方法は、あらゆる治療を開始する前から実施することができ、または、治療レジメンの最中に使用することができる。すなわち、上述したステップ（ａ）は、患者におけるあらゆる治療の前にアミロイド沈着物の基準量を決定することができ、または、上述したステップ（ａ）は、１つまたは複数の治療コースの後に実施して、次の治療コースの効果を決定することができる。 The monitoring methods described above can be performed prior to the start of any treatment or can be used during a treatment regimen. That is, step (a) described above can determine a reference amount of amyloid deposits prior to any treatment in the patient, or step (a) described above can be performed after one or more treatment courses. The effect of the next course of treatment can then be determined.
一部の実施形態において、アミロイド沈着疾患（例えば、原発性アミロイドーシス）は、心臓、腎臓、肝臓、肺、消化管、神経系、筋肉骨格系、軟部組織および皮膚からなる群から選択される少なくとも１つの臓器または組織の関与を含む。 In some embodiments, the amyloid deposit disease (eg, primary amyloidosis) is at least one selected from the group consisting of heart, kidney, liver, lung, gastrointestinal tract, nervous system, musculoskeletal system, soft tissue and skin. Includes the involvement of two organs or tissues.
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法は、再発性または難治性ＡＬＡを患っている患者を治療することを含む。一部の実施形態において、患者は、κＡＬＡを有し得る。いくつかの実施形態において、患者は、λＡＬＡを有し得る。 In some embodiments, the methods described herein include treating a patient suffering from relapsed or refractory ALA. In some embodiments, the patient may have κALA. In some embodiments, the patient may have λALA.
例示的な診断用の量は、治療される個体の大きさや健康状態に応じて変化し得る。一部の実施形態において、ＰＥＴについて放射性標識されたヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体の診断上有効な量は、約１～１０ｍＣｉである。しかしながら、いくつかの状況や他の画像診断モダリティでは、投与量はより高くてもよく、低くてもよい。画像診断技術の当業者であれば、（例えば）上述した参考文献に記載されているように、適切な量の標識抗体または抗体断片を選択する方法を知っているであろう。 The exemplary diagnostic amount may vary depending on the size and health of the individual being treated. In some embodiments, a diagnostically effective amount of a radiolabeled humanized or chimeric 11-1F4 antibody for PET is about 1-10 mCi. However, in some situations and other diagnostic imaging modalities, the dose may be higher or lower. One of skill in the art of diagnostic imaging will know how to select the appropriate amount of labeled antibody or antibody fragment, as described in the references mentioned above (eg).
以下の実施例は、本発明を説明するために提供される。しかしながら、本発明は、これらの実施例に記載される特定の条件または詳細に限定されるものではないことに留意されたい。本明細書で参照されるすべての出版物は、参照により本明細書に組み込まれている。 The following examples are provided to illustrate the invention. However, it should be noted that the invention is not limited to the particular conditions or details described in these examples. All publications referenced herein are incorporated herein by reference.
［マウス１１－１Ｆ４抗体のＰＣＲクローニングおよびＤＮＡ配列決定］
マウス１１－１Ｆ４モノクローナル抗体重鎖および軽鎖可変領域遺伝子をＰＣＲクローニングし、単離されたすべての可変領域遺伝子（疑似的なものおよび機能性なもの）の詳細な配列分析を実施した。マウス１１－１Ｆ４抗体重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の詳細なＤＮＡおよびアミノ酸配列を得た。
[PCR cloning and DNA sequencing of mouse 11-1F4 antibody]
Mouse 11-1F4 monoclonal antibody heavy and light chain variable region genes were PCR cloned and detailed sequence analysis of all isolated variable region genes (pseudo and functional) was performed. Detailed DNA and amino acid sequences of mouse 11-1F4 antibody heavy and light chain variable region genes were obtained.
［材料］
培地成分および他のすべての組織培養材料は、ライフテクノロジーズ社（英国）から入手した。ＲＮＡ溶液キットはストラタジーン社（米国）から入手し、第１鎖ｃＤＮＡ合成キットはファルマシア社（英国）から購入した。ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを含むＲＣＲ反応のためのすべての構成成分および機器は、パーキンエルマー社（米国）から購入した。ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キットは、インビトロジェン社（米国）から入手した。アガロース（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商標））は、ライフテクノロジーズ社（英国）から入手した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｂｉｇ Ｄｙｅ（商標）ターミネーターサイクルシーケンシング準備反応キットのプレミックスサイクルシーケンシングキットおよびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０シーケンシングマシンは、共にＰＥアプライド・バイオシステムズ社（米国）から購入した。他のすべての分子生物学的製品は、ニュー・イングランド・バイオラボ社（米国）およびプロメガ社（米国）から入手した。
[material]
Medium components and all other tissue culture materials were obtained from Life Technologies, Inc. (UK). The RNA solution kit was obtained from Stratagene (USA) and the first strand cDNA synthesis kit was purchased from Pharmacia (UK). All components and equipment for RCR reactions, including AmpliTaq® DNA polymerase, were purchased from PerkinElmer, USA. The TOPO TA Cloning® kit was obtained from Invitrogen, Inc. (USA). Agarose (UltraPure ™) was obtained from Life Technologies, Inc. (UK). ABI PRISM® Big Dye ™ Terminator Cycle Sequencing Preparation Reaction Kit Premix Cycle Sequencing Kit and
［方法］
図１は、マウスモノクローナル抗体１１－１Ｆ４を産生するハイブリドーマ細胞株からマウスＶＨおよびＶＫ遺伝子をＰＣＲクローニングするために使用される戦略を概説する図である。
[Method]
FIG. 1 outlines a strategy used for PCR cloning of mouse VH and VK genes from a hybridoma cell line that produces the mouse monoclonal antibody 11-1F4 .
α－ヒト軽鎖モノクローナル抗体１１－１Ｆ４を産生するＳＰ２／０ハイブリドーマ細胞株の２つのクローン（Ｂ２Ｃ４およびＢ２Ｄ６）は、親切にもアラン・ソロモン医学博士（米国テネシー州ノックスビル市のテネシー大学医療科学センター）によって提供された。ハイブリドーマ細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ－１０５）から入手可能である。細胞株を、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＬ－グルタミンで補充されたＤＭＥＭ培地を使用して培養した。１０８個の細胞の総生細胞計数に達するまで細胞を培養した。 Two clones of the SP2 / 0 hybridoma cell line (B2C4 and B2D6) that produce the α-human light chain monoclonal antibody 11-1F4 were kindly provided by Dr. Alan Solomon (University of Tennessee Medical Sciences, Knoxville, Tennessee, USA). Provided by the Center). Hybridoma cell lines are available from the American Culture Cell Lineage Conservation Agency (ATCC Deposited PTA-105). Cell lines were cultured using DMEM medium supplemented with 20% (v / v) FBS, penicillin / streptomycin and L-glutamine. Cells were cultured until a total viable cell count of 108 cells was reached.
細胞を各クローンから別々に次の通り収穫した。マウスハイブリドーマ細胞株を、適切な培養培地での懸濁で、約１０８個の細胞の総生細胞計数を提供するのに十分な量まで増殖させた。培養上清を収穫し、ハイブリドーマ細胞をベンチトップ遠心分離機（２５０ｇ、５分）でペレット化した。細胞を２０ｍｌのＰＢＳに穏やかに再懸濁し、生細胞計数のために１００μｌのアリコートを採取した。アリコートの細胞を再度ペレット化し、２００μｌのＰＢＳおよび２００μｌのトリパンブルーを１００μｌの細胞に添加し、穏やかに混合した。１０μｌのこの混合物を使い捨て細胞計数スライドにピペットで入れ、９つの小さな正方形中の白血球の数を顕微鏡下で数えた。青色細胞（すなわち、死細胞）は数えなかった。計数工程を繰り返し、結果を平均し、平均結果に９×１０５を掛けて、２０ｍｌのＰＢＳ中の細胞の生細胞計数を得た。十分な細胞を収穫して、これらをＲＮＡ単離のために１０ｍｌの溶液Ｄに再懸濁した（ストラタジーン社のＲＮＡ単離キットを使用、下記参照）。 Cells were harvested separately from each clone as follows: Mouse hybridoma cell lines, suspended in appropriate culture medium, were grown to an amount sufficient to provide a total viable cell count of approximately 108 cells. Culture supernatants were harvested and hybridoma cells were pelleted on a benchtop centrifuge (250 g, 5 minutes). The cells were gently resuspended in 20 ml PBS and 100 μl aliquots were taken for viable cell counting. Aliquot cells were pelleted again, 200 μl PBS and 200 μl trypan blue were added to 100 μl cells and mixed gently. 10 μl of this mixture was pipetted into a disposable cell counting slide and the number of leukocytes in 9 small squares was counted under a microscope. Blue cells (ie, dead cells) were not counted. The counting process was repeated, the results were averaged and the average result was multiplied by 9 × 105 to obtain a viable cell count of cells in 20 ml PBS. Sufficient cells were harvested and resuspended in 10 ml solution D for RNA isolation (using Stratagene's RNA isolation kit, see below).
次いで、製造業者の指示書に従って、ストラタジーン社のＲＮＡ単離キットを使用して、各クローンの細胞から個別に総ＲＮＡを単離した。１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を試料に添加し、管を繰り返し反転させて、管の内容物を完全に混合した。管に１０．０ｍｌのフェノール（ｐＨ５．３～５．７）を添加し、反転させて内容物を再び完全に混合した。混合物に２．０ｍｌのクロロホルム－イソアミルアルコール混合物を添加し、管に蓋をして１０秒間激しく振盪し、管を氷中で１５分間インキュベートした。試料を、氷上で予冷した５０ｍｌの厚肉丸底遠心管に移し、管を１００００×ｇの遠心分離機で４℃で２０分間回転させた。遠心分離後に、管に２つの相が見えた。上部水相はＲＮＡを含有し、下部フェノール相および中間相はＤＮＡおよびタンパク質を含有していた。ＲＮＡを含有する上部水相を新しい遠心管に移し、下部フェノール相を廃棄した。等量のイソプロパノールを水相に添加し、内容物を反転させて混合し、次いで、管を－２０℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを沈殿させた。管を１００００×ｇの遠心分離機で４℃で２０分間回転させた。遠心分離後に、ＲＮＡを含有する管の底のペレットを取り出し、上清を廃棄した。ペレットを３．０ｍｌの溶液Ｄに溶解し、３．０ｍｌのイソプロパノールを管に添加し、内容物をよく混合した。管を－２０℃で１時間インキュベートした後に、１００００×ｇの遠心分離機で４℃で１０分間再度回転させ、管から上清を除去して廃棄した。（注：この時点まで、ＲＮＡはイソチオシアン酸グアニジンの存在によってリボヌクレアーゼから保護されていたが、ここでもはや保護されなくなった。）ペレットを７５％（ｖ／ｖ）エタノール（ＤＥＰＣ処理水（２５％））で洗浄し、ペレットを真空下で２～３分間乾燥させた。ＲＮＡペレットを０．５～２ｍｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。 Total RNA was then isolated individually from the cells of each clone using the Stratagene RNA Isolation Kit, according to the manufacturer's instructions. 1 ml of 2M sodium acetate (pH 4.0) was added to the sample and the tubes were repeatedly inverted to completely mix the contents of the tubes. 10.0 ml of phenol (pH 5.3-5.7) was added to the tube and inverted to completely mix the contents again. A 2.0 ml chloroform-isoamyl alcohol mixture was added to the mixture, the tube was covered and shaken vigorously for 10 seconds, and the tube was incubated in ice for 15 minutes. The sample was transferred to a 50 ml thick round bottom centrifuge precooled on ice and the tube was rotated in a 10000 xg centrifuge at 4 ° C. for 20 minutes. After centrifugation, two phases were visible in the tube. The upper aqueous phase contained RNA, and the lower phenol and intermediate phases contained DNA and protein. The upper aqueous phase containing RNA was transferred to a new centrifuge tube and the lower phenol phase was discarded. An equal amount of isopropanol was added to the aqueous phase, the contents were inverted and mixed, then the tubes were incubated at −20 ° C. for 1 hour to precipitate RNA. The tube was spun in a 10000 xg centrifuge at 4 ° C. for 20 minutes. After centrifugation, the pellet at the bottom of the tube containing RNA was removed and the supernatant was discarded. The pellet was dissolved in 3.0 ml of solution D, 3.0 ml of isopropanol was added to the tube and the contents were mixed well. After incubating the tube at −20 ° C. for 1 hour, the tube was rotated again at 4 ° C. for 10 minutes in a 10000 × g centrifuge to remove the supernatant from the tube and discard. (Note: Up to this point, RNA was protected from ribonuclease by the presence of guanidine isothiocyanate, but is no longer protected here.) Pellet 75% (v / v) ethanol (DEPC treated water (25%)) ), And the pellet was dried under vacuum for 2-3 minutes. RNA pellets were resuspended in 0.5-2 ml of DEPC-treated water.
アマシャム・ファルマシア・バイオテク社の第１鎖ｃＤＮＡ合成キットに付属のＮｏｔ Ｉ－ｄ（Ｔ）１８プライマーを使用して、製造業者の指示書に従って、１１－１Ｆ４ハイブリドーマｍＲＮＡの１本鎖ＤＮＡコピーを産生した。後述するように、単離された２つのＲＮＡ試料の各々に１つの反応を実施した。使用した成分は、バルク第１鎖ｃＤＮＡ反応混合物、クローニングＦＰＬＣｐｕｒｅ（商標）マウス逆転写酵素、ＲＮＡｇｕａｒｄ（商標）、ＢＳＡ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２００ｍＭ ＤＩＴ水溶液、Ｎｏｔ Ｉ－ｄ（Ｔ）１８プライマー：５’－ｄ［ＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡ１８］－３’、およびＤＥＰＣ処理水であった。 A single-stranded DNA copy of 11-1F4 hybridoma mRNA was produced using the Not Id (T) 18 primer included with the Amersham Pharmacia Biotech 1-strand cDNA synthesis kit, according to the manufacturer's instructions. did. One reaction was performed on each of the two isolated RNA samples, as described below. The components used were bulk first-strand cDNA reaction mixture, cloning FPLCple ™ mouse reverse transcriptase, RNAguard ™, BSA, dATP, dCTP, dGTP and dTTP, 200 mM DIT aqueous solution, Not Id (T) 18 . Primers: 5'-d [AACTGGAAGAATTCGCGCCGCAGGAA 18 ] -3', and DEPC-treated water.
２０μｌのＤＥＰＣ水中の全ＲＮＡのうちの約５μｇを６５℃で１０分間加熱し、次いで、氷上で冷却した。バルク第１鎖ｃＤＮＡ反応混合物を穏やかにピペットで入れて均一な懸濁液を得て、０．５ｍｌのマイクロ遠心管に反応を次の通り設定した：総量３３μｌについて、２０μｌの変性ＲＮＡ溶液、１１μｌのバルク第１鎖ｃＤＮＡ反応混合物、１μｌのＮｏｔ Ｉ－ｄ（Ｔ）１８プライマーおよび１μｌのＤＴＴ溶液。反応物質をピペットで入れて穏やかに混合し、３７℃で１時間インキュベートした。 Approximately 5 μg of total RNA in 20 μl DEPC water was heated at 65 ° C. for 10 minutes and then cooled on ice. The bulk first-strand cDNA reaction mixture was gently pipetted to obtain a homogeneous suspension and the reaction was set up in a 0.5 ml microcentrifuge tube as follows: for a total volume of 33 μl, 20 μl of denatured RNA solution, 11 μl. Bulk First Chain cDNA Reaction Mixture, 1 μl Not Id (T) 18 Primer and 1 μl DTT Solution. The reactants were pipetted, mixed gently and incubated at 37 ° C. for 1 hour.
次いで、マウス重鎖およびκ軽鎖可変領域遺伝子（それぞれＶＨ遺伝子およびＶＫ遺伝子）を、ＪｏｎｅｓおよびＢｅｎｄｉｇによって記載された方法（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：８８）を使用して、ｓｓＤＮＡ鋳型からＰＣＲ増幅した。 The mouse heavy chain and kappa light chain variable region genes ( VH gene and VK gene, respectively) are then PCR from the ssDNA template using the method described by Jones and Bendig (Bio / Technology, 9:88). Amplified.
適切な定常領域プライマー（ＶＨについてＭＨＣ１～ＭＨＣ３およびＶＫについてＭＫＣの等モル混合物）を使用して、変性リーダー配列に特異的なプライマー（ＶＨについてＭＨＶ１－ＭＨＶ１２およびＶＫについてＭＫＶ１～ＭＫＶ１１）の各々に対して別々のＰＣＲ反応を準備した。表１および表２は、それぞれＶＨおよびＶＫ領域遺伝子を増幅するために使用したプライマーを詳述している。合計で、１２の重鎖反応および１１のκ軽鎖反応を実施した。後述するようにすべての場合において、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用して鋳型ｃＤＮＡを増幅した。 Primers specific for denaturing leader sequences (MHV1- MHV12 for VH and MKV1-MKV11 for VK) using appropriate constant region primers (MHV1- MHV3 for VH and equimolar mixtures of MKC for VK). Separate PCR reactions were prepared for each of the above. Tables 1 and 2 detail the primers used to amplify the VH and VK region genes, respectively. In total, 12 heavy chain reactions and 11 kappa light chain reactions were performed. In all cases, the template cDNA was amplified using the AmpliTaq® DNA polymerase as described below.
完成したｃＤＮＡの第１鎖合成反応物を９０℃で５分間加熱して、ＲＮＡ－ｃＤＮＡ二本鎖を変性させ且つ逆転写酵素を不活性化し、氷上で冷却した。１１のＧｅｎｅＡｍｐ（商標）ＰＣＲ反応管をＭＫＶ１－１１で標識した。各管について、各反応混合物が６９．３μｌの滅菌水、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、６μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、それぞれ２μｌのｄＮＴＰの１０ｍＭストック溶液、２．５μｌの１０ｍＭ ＭＫＣプライマー、２．５μｌの１０ｍＭ ＭＫＶプライマーのうちの１つ、および１μｌのＲＮＡ－ｃＤＮＡ鋳型混合物を含有する１００μｌの反応混合物を調製した。次いで、管の各々に０．７μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを添加し、完成した反応混合物に５０μｌの鉱油を重ねた。
The first-strand synthetic reaction of the completed cDNA was heated at 90 ° C. for 5 minutes to denature the RNA- cDNA double strand and inactivate the reverse transcriptase and cool on ice. Eleven GeneAmp ™ PCR reaction tubes were labeled with MKV1-11. For each tube, each reaction mixture is 69.3 μl sterile water, 10
同様の一連の反応混合物を上述したように調製して、マウス重鎖可変領域遺伝子をＰＣＲクローニングした。ただし、今回は１２の反応管を標識し、１２のＭＨＶプライマーのうちの１つと適切なＭＨＣプライマーとをそれぞれに添加した。すなわち、例えば、マウスγ１重鎖の可変ドメイン遺伝子をＰＣＲ増幅するために、ＭＨＣ Ｇ１プライマーを使用した。 A similar series of reaction mixtures was prepared as described above and the mouse heavy chain variable region gene was PCR cloned. However, this time, 12 reaction tubes were labeled and one of the 12 MHV primers and an appropriate MHC primer were added to each. That is, for example, an MHC G1 primer was used to PCR amplify the variable domain gene of the mouse γ1 heavy chain.
反応管をＤＮＡサーマルサイクラーに装填し、（９４℃で１．５分間の初期溶融後）９４℃で１分間、５０℃で１分間および７２℃で１分間のサイクルを２５回繰り返した。最後のサイクルに続いて、７２℃で１０分間の最終伸長ステップを行った後に、４℃に冷却した。２．５分の延長したランプ時間を使用したアニーリング（５０℃）ステップと伸長（７２℃）ステップとの間を除いて、サイクルの各ステップの間で３０秒間のランプ時間を設けた。各ＰＣＲ反応からの１０μｌのアリコートを、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１％（ｗ／ｖ）アガロース／１×ＴＢＥ緩衝液ゲルで泳動して、どのリーダープライマーがＰＣＲ産物を産生するかを決定した。陽性ＰＣＲクローンの大きさは、約４２０ｂｐ～５００ｂｐであった。 The reaction tube was loaded into a DNA thermal cycler and the cycle of 94 ° C. for 1 minute, 50 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 1 minute was repeated 25 times (after initial melting at 94 ° C. for 1.5 minutes). Following the last cycle, a 10 minute final extension step was performed at 72 ° C. followed by cooling to 4 ° C. A ramp time of 30 seconds was provided between each step of the cycle, except between the annealing (50 ° C.) step and the extension (72 ° C.) step using an extended ramp time of 2.5 minutes. 10 μl aliquots from each PCR reaction were run on a 1% (w / v) agarose / 1 × TBE buffer gel containing 0.5 μg / ml ethidium bromide, which leader primer produced the PCR product. I decided to do it. The size of the positive PCR clone was about 420 bp to 500 bp.
上述したＰＣＲ増幅工程をさらに２回繰り返し、完全長可変ドメイン遺伝子を増幅すると思われるＰＣＲ反応を選択した。各潜在的ＰＣＲ産物の６μｌのアリコートを、製造業者の指示書に記載されるように、ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キットによって提供されるｐＣＲ（商標）ＩＩベクターに直接クローニングした。形質転換大腸菌細胞の１０．０％（ｖ／ｖ）、１．０％（ｖ／ｖ）および０．１％（ｖ／ｖ）のアリコートを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する個々の直径９０ｍｍのＬＢ寒天プレートにピペットで入れ、２５μｌのＸ－Ｇａｌストック溶液および４０μｌのＩＰＴＧストック溶液を重ね、３７℃で一晩インキュベートした。陽性コロニーをＰＣＲスクリーニングによって同定した。 The PCR amplification step described above was repeated two more times to select a PCR reaction that would amplify the full-length variable domain gene. 6 μl aliquots of each potential PCR product were cloned directly into the pCR® II vector provided by the TA Cloning® kit as described in the manufacturer's instructions. 10.0% (v / v), 1.0% (v / v) and 0.1% (v / v) aliquots of transformed E. coli cells, each 90 mm in diameter containing 50 μg / ml ampiterin. LB agar plate was pipette, 25 μl of X-Gal stock solution and 40 μl of IPTG stock solution were overlaid and incubated overnight at 37 ° C. Positive colonies were identified by PCR screening.
各ＰＣＲ反応からの５μｌのアリコートを１％アガロース／ＴＢＥ（ｐＨ８．８）ゲルに泳動して、正しい大きさ（約４５０ｂｐ）のＰＣＲ産物を産生したものを決定した。このように同定されたこれらの推定上の陽性ＰＣＲ産物を、ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キットによって提供されるｐＣＲ２．１ベクターに直接クローニングし、製造業者のプロトコルに記載されるようにＴＯＰ１０コンピテント細胞に形質転換した。正しい大きさのインサートを有するプラスミドを含有するコロニーを、ＧｕｓｓｏｗおよびＣｌａｃｋｓｏｎの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７：４０００）に従って、１２１２および１２３３オリゴヌクレオチドプライマー（表３）を使用してコロニーをＰＣＲスクリーニングすることによって同定した。このように同定されたこれらの推定上の陽性クローンを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒおよびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ（商標）ターミネーターを使用し、二本鎖プラスミドＤＮＡの配列を決定した。Ｂ２Ｃ４ハイブリドーマ細胞株クローンからのＶＨおよびＶＫ遺伝子のそれぞれ３つの陽性クローンを配列決定し、Ｂ２Ｄ６ハイブリドーマ細胞株クローンからのＶＫ遺伝子の４つの陽性クローンおよびＶＨ遺伝子の６つも同様に配列決定した。
5 μl aliquots from each PCR reaction were run on a 1% agarose / TBE (pH 8.8) gel to determine what produced the correct size (about 450 bp) PCR product. These putative positive PCR products thus identified were cloned directly into the pCR2.1 vector provided by the TA Cloning® kit and TOP10 competent cells as described in the manufacturer's protocol. Transformed into. Colonies containing plasmids with correctly sized inserts are PCR screened using 1212 and 1233 oligonucleotide primers (Table 3) according to the Gussow and Crackson methods (Nucleic Acids Res., 17: 4000). Identified by. These putative positive clones thus identified were sequenced for double-stranded plasmid DNA using the
マウス１１－１Ｆ４抗体重鎖可変領域遺伝子を増幅するために各ハイブリドーマクローン（Ｂ２Ｃ４およびＢＣＤ６）に対して実施した１２のＰＣＲ反応の結果を表４（ａ）に示す。 Table 4 (a) shows the results of 12 PCR reactions performed on each hybridoma clone (B2C4 and BCD6) to amplify the mouse 11-1F4 antibody heavy chain variable region gene.
変性リーダー配列プライマーＭＨＶ７は、ＭＨＣＧＩ－３定常領域プライマーの混合物（表１）と組み合わせると、Ｂ２Ｃ４ハイブリドーマ細胞株とＢ２Ｄ６ハイブリドーマ細胞株の両方に由来する鋳型ｃＤＮＡから約６００ｂｐのＰＣＲ産物を産生した。このバンドは、平均ＶＨ遺伝子についての予想サイズ（４５０ｂｐ）よりも大きかったので、これ以上の調査は行わなかった。その一方で、変性リーダー配列プライマーＭＨＶ６は、ＭＨＣＧＩ－３定常領域プライマーの混合物（表１）と組み合わせると、Ｂ２Ｃ４ハイブリドーマ細胞株とＢ２Ｄ６ハイブリドーマ細胞株の両方に由来する鋳型ｃＤＮＡからＶＨ遺伝子について予想サイズ（４５０ｂｐ）のＰＣＲ産物を産生した。 The denatured leader sequence primer MHV7, when combined with a mixture of MHCGI-3 constant region primers (Table 1), produced approximately 600 bp of PCR product from template cDNAs from both B2C4 hybridoma cell lines and B2D6 hybridoma cell lines. This band was larger than the expected size (450 bp) for the mean VH gene and was not investigated further. On the other hand, the denatured leader sequence primer MHV6, when combined with a mixture of MHCGI-3 constant region primers (Table 1), is expected size for the VH gene from template cDNAs derived from both B2C4 hybridoma cell lines and B2D6 hybridoma cell lines. (450 bp) PCR product was produced.
表４は、ＳＰ２／０ハイブリドーマ細胞株Ｂ２Ｃ４およびＢ２Ｄ６からマウス１１－１Ｆ４モノクローナル抗体重鎖可変領域遺伝子（ａ）および軽鎖可変領域遺伝子（ｂ）をクローニングするために実施したＰＣＲ増幅の結果を示す。３列目には、実際のＰＣＲ結果が記録されている。プライマーの特定の組み合わせでバンドが観察された場合、塩基対の大きさ（ｂｐ）が適切なスペースに記録された。 Table 4 shows the results of PCR amplification performed to clone the mouse 11-1F4 monoclonal antibody heavy chain variable region gene (a) and light chain variable region gene (b) from SP2 / 0 hybridoma cell lines B2C4 and B2D6. .. The actual PCR results are recorded in the third column. When bands were observed with a particular combination of primers, base pair size (bp) was recorded in the appropriate space.
Ｂ２Ｃ４由来のＰＣＲ産物からの３つのクローンおよびＢ２Ｄ６由来のＰＣＲ産物からの５つのクローンの配列分析によって、単一重鎖可変領域配列が明らかになった（図２）。 Sequence analysis of three clones from the B2C4-derived PCR product and five clones from the B2D6-derived PCR product revealed a single heavy chain variable region sequence (FIG. 2).
使用したクローニング戦略（この領域に隣接するプライマー、すなわちリーダー配列および定常領域配列に特異的なプライマーを使用することによる可変領域遺伝子全体の増幅）によって、完全なＦＲ１配列を同定することができた。配列決定された８つのクローンはすべて、この領域で同一の配列を有していた（図２）。 The cloning strategy used (amplification of the entire variable region gene by using primers flanking this region, ie, primers specific for the leader and constant region sequences) allowed the identification of the complete FR1 sequence. All eight sequenced clones had the same sequence in this region (Fig. 2).
マウス１１－１Ｆ４抗体κ軽鎖可変領域遺伝子を増幅するために各ハイブリドーマクローン（Ｂ２Ｃ４およびＢＣＤ６）に対して実施した１１のＰＣＲ反応の結果を表４（ｂ）に示す。 Table 4 (b) shows the results of 11 PCR reactions performed on each hybridoma clone (B2C4 and BCD6) to amplify the mouse 11-1F4 antibody κ light chain variable region gene.
変性リーダー配列プライマーＭＫＶ６は、ＭＫＣ定常領域プライマー（表２）と組み合わせると、Ｂ２Ｃ４ハイブリドーマ細胞株のみに由来する鋳型ｃＤＮＡから約２００ｂｐのＰＣＲ産物を産生した。このバンドは、ＶＫ遺伝子についての予想サイズ（４５０ｂｐ）よりもはるかに小さかったので、これ以上の調査は行わなかった。 The denatured leader sequence primer MKV6, when combined with the MKC constant region primer (Table 2), produced approximately 200 bp of PCR product from template cDNA derived exclusively from the B2C4 hybridoma cell line. This band was much smaller than the expected size ( 450bp ) for the VK gene, so no further investigation was done.
変性リーダー配列プライマーＭＫＶ２は、ＭＫＣ定常領域プライマー（表２）と組み合わせると、Ｂ２Ｃ４ハイブリドーマ細胞株とＢ２Ｄ６ハイブリドーマ細胞株の両方に由来する鋳型ｃＤＮＡから、バンドの予想サイズ４５０ｂｐよりも小さいＰＣＲ産物を産生した（アガロースゲル上で見た場合）。さらに、以前のＶＫクローニングでは、ＭＫＶ２プライマーが周知のκ軽鎖偽遺伝子を増幅することが分かった。したがって、この産物がマウス１１－１Ｆ４抗体ＶＫ遺伝子ではなく偽遺伝子であることを確認するために、各ＰＣＲ産物の１つのクローンの配列分析を実施した。この配列分析によって、当該ＰＣＲクローンが実際に偽遺伝子であることが明らかになった。 The denatured leader sequence primer MKV2, when combined with the MKC constant region primer (Table 2), produced PCR products smaller than the expected band size of 450 bp from template cDNAs from both B2C4 hybridoma cell lines and B2D6 hybridoma cell lines. (When viewed on an agarose gel). Furthermore, in previous VK cloning, the MKV2 primer was found to amplify the well-known κ light chain pseudogene. Therefore, sequence analysis of one clone of each PCR product was performed to confirm that this product was a pseudogene rather than the mouse 11-1F4 antibody VK gene. This sequence analysis revealed that the PCR clone was actually a pseudogene.
最後に、変性リーダー配列プライマーＭＫＶ１は、ＭＫＣ定常領域プライマー（表１）と組み合わせると、Ｂ２Ｃ４ハイブリドーマ細胞株とＢ２Ｄ６ハイブリドーマ細胞株の両方に由来する鋳型ｃＤＮＡから、ＶＫ遺伝子についてほぼ予想サイズ（４５０ｂｐ）のＰＣＲ産物を産生した。 Finally, the denatured leader sequence primer MKV1, when combined with the MKC constant region primer (Table 1), is approximately the expected size (450 bp) for the VK gene from the template cDNA from both the B2C4 hybridoma cell line and the B2D6 hybridoma cell line. Produced the PCR product of.
Ｂ２Ｃ４由来のＰＣＲ産物の３つのクローンおよびＢ２Ｄ６由来のＰＣＲ産物の４つのクローンの配列分析によって、偽遺伝子として同定できなかった単一κ軽鎖可変領域の配列が明らかになった。 Sequence analysis of three clones of the B2C4-derived PCR product and four clones of the B2D6-derived PCR product revealed the sequence of a single kappa light chain variable region that could not be identified as a pseudogene.
ここで、ハイブリドーマｍＲＮＡから（定常領域特異的およびリーダー配列に特異的なプライマーを使用して）１１－１Ｆ４抗体重鎖可変領域遺伝子をクローニングし、配列決定した。 Here, the 11-1F4 antibody heavy chain variable region gene was cloned and sequenced from hybridoma mRNA (using constant region-specific and leader sequence-specific primers).
この配列を翻訳すると、ＴＶＳＳペプチド配列が得られた。Ｋａｂａｔデータベース（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）に記録された１２２の再配列されたヒトＶＨ遺伝子の分析によって、これらの配列の８４％がＴＶＳＳペプチド配列を有することが明らかになった。したがって、単離されたＶＨ遺伝子が正しい１１－１Ｆ４抗体遺伝子配列であると結論付けられた。 Translation of this sequence gave the TVSS peptide sequence. Analysis of 122 rearranged human VH genes recorded in the Kabat database (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest) revealed that 84% of these sequences had TVSS peptide sequences. Therefore, it was concluded that the isolated VH gene is the correct 11-1F4 antibody gene sequence.
マウス１１－１Ｆ４抗体の可変領域κ軽鎖遺伝子も、機能しないＶＫ偽遺伝子と同様に、クローニングおよび配列決定に成功した。この偽遺伝子は、Ｃａｒｒｏｌｌら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８８）２５：９９１）によって初めて同定された。この配列は、元のＭＯＰＣ－２１腫瘍（ＳＰ２／０を含む）に由来するすべての標準的な融合パートナーに存在する異常なｍＲＮＡ転写産物から生じる。異常なｍＲＮＡの結果として、２３位の不変システインがチロシン残基によって置き換えられ、ＶＪジョイントがフレーム外になり、１０５位に停止コドンが生じる。 The variable region κ light chain gene of the mouse 11-1F4 antibody was also successfully cloned and sequenced, as was the non-functional VK pseudogene. This pseudogene was first identified by Carroll et al. (Molecular Immunology (1988) 25: 991). This sequence results from an aberrant mRNA transcript present in all standard fusion partners from the original MOPC-21 tumor (including SP2 / 0). As a result of the aberrant mRNA, the invariant cysteine at position 23 is replaced by a tyrosine residue, the VJ joint is out of frame, and a stop codon is produced at position 105.
リンパ系細胞やハイブリドーマ細胞では、２つ以上の再配列された軽免疫グロブリンｍＲＮＡを合成することが一般的である。これらのｍＲＮＡは通常、機能的なＶＫ遺伝子では通常見られない終止コドンまたはフレームシフトの存在のために非生産的である。これらの偽メッセンジャーは、機能的なポリペプチドをコードしていないという事実にもかかわらず、Ｖ領域ＰＣＲの基質として非常に優れているため、ハイブリドーマから免疫グロブリン遺伝子をクローニングする際にしばしば大きな問題を引き起こす。 In lymphoid cells and hybridoma cells, it is common to synthesize two or more rearranged light immunoglobulin mRNAs. These mRNAs are usually unproductive due to the presence of stop codons or frameshifts not normally found in functional VK genes. Despite the fact that these pseudomessengers do not encode functional polypeptides, they are very good substrates for V-region PCR, which often poses a major problem when cloning immunoglobulin genes from hybridomas. cause.
１１－１Ｆ４抗体ＶＫ遺伝子配列は、２つの異なるＰＣＲ産物から単離された７つ別個のＰＣＲクローンの詳細な配列分析後に同定され、配列番号３６が得られた。すべての配列が同一であったので、これが正しい１１－１Ｆ４抗体κ軽鎖可変領域配列として認められた。 The 11-1F4 antibody VK gene sequence was identified after detailed sequence analysis of 7 distinct PCR clones isolated from 2 different PCR products, resulting in SEQ ID NO: 36. Since all sequences were identical, this was recognized as the correct 11-1F4 antibody κ light chain variable region sequence.
クローニングされたＶＨおよびＶＫ領域遺伝子を使用して、キメラマウス－ヒト１１－１Ｆ４モノクローナル抗体を作製し、次いで、これを分析してＡＬ原線維への特異的な結合を確認した。 The cloned VH and VK region genes were used to generate chimeric mouse-human 11-1F4 monoclonal antibodies, which were then analyzed to confirm specific binding to AL fibrils.
［キメラマウス－ヒト１１－１Ｆ４（ｃ１１－１Ｆ４）抗体の構築］
キメラマウス－ヒト抗体の一部として哺乳動物細胞で上述した１１－１Ｆ４のＶＨおよびＶＫ可変領域遺伝子の一過的発現を可能にするためには、特異的に設計されたＰＣＲプライマーを使用して５’末端および３’末端を改変することが必要であった（表５）。オリゴヌクレオチドプライマーＦ３９８３６およびＦ３９８３７を使用して１１－１Ｆ４ＶＫ遺伝子をＰＣＲ改変し、プライマーＦ３９８３５およびＦ５８９３３を使用して１１－１Ｆ４ＶＨ遺伝子をＰＣＲ改変した。逆方向（ＢＡＫ）プライマーＦ３９８３６およびＦ３９８３５は、それぞれＶＫおよびＶＨ遺伝子の５’末端に、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、コザック翻訳開始部位および免疫グロブリンリーダー配列を導入した。順方向（ＦＯＲ）オリゴヌクレオチドプライマーＦ３９８３７は、ＶＫ遺伝子の３’末端に、スプライスドナー部位およびＢａｍＨＩ制限部位を導入した。順方向（ＦＯＲ）オリゴヌクレオチドプライマーＦ５８９３３は、ＶＨ遺伝子の３’末端に、ＡｐａＩ制限部位を含むγ－１ＣＨ１遺伝子の最初の２２塩基対を付加した。
[Chimera mouse-construction of human 11-1F4 (c11-1F4) antibody]
To allow transient expression of the VH and VK variable region genes of 11-1F4 described above in mammalian cells as part of a chimeric mouse-human antibody, specifically designed PCR primers are used. It was necessary to modify the 5'end and 3'end (Table 5). The oligonucleotide primers F39836 and F39837 were used to PCR modify the 11-1F4V K gene, and the primers F39835 and F58933 were used to PCR modify the 11-1F4V H gene. Reverse (BAK) primers F39836 and F39835 introduced the HindIII restriction site, Kozak translation initiation site and immunoglobulin leader sequence at the 5'end of the VK and VH genes, respectively. Forward (FOR) oligonucleotide primer F39837 introduced a splice donor site and a BamHI restriction site at the 3'end of the VK gene. The forward (FOR) oligonucleotide primer F58933 added the first 22 base pairs of the γ-1CH 1 gene containing the ApaI restriction site to the 3'end of the VH gene.
コザックコンセンサス配列は、可変領域配列の効率的な翻訳に不可欠である（Ｋｏｚａｋ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏ、１９６：９４７）。これは、リボソームが翻訳を開始する正しいＡＵＧコドンを定義し、最も重要な塩基は、ＡＵＧ開始の上流－３位のアデニン（またはわずかに好ましくはグアニン）である。
Kozak consensus sequences are essential for efficient translation of variable region sequences (Kozak, J Mol Bio, 196: 947). It defines the correct AUG codon at which the ribosome initiates translation, and the most important base is adenine (or slightly preferably guanine) at
免疫グロブリンリーダー配列は、発現した抗体が培地に分泌されることを保証するように、容易に収穫および精製することができる。この例で使用したリーダー配列は、ＶＨおよびＶＫクローニングの工程中にハイブリドーマｃＤＮＡからクローニングされたマウス１１－１Ｆ４のＶＫおよびＶＨリーダー配列であった。 The immunoglobulin leader sequence can be readily harvested and purified to ensure that the expressed antibody is secreted into the medium. The leader sequence used in this example was the VK and VH leader sequences of mouse 11-1F4 cloned from the hybridoma cDNA during the VH and VK cloning steps.
スプライスドナー配列は、軽鎖可変領域を適切な定常領域に正しくインフレームで付着させ、１３０ｂｐのＶＫ：ＣＫイントロンをスプライシングで切り出すために重要である。重鎖可変領域を、Ａｐａｌ部位を介してその適切な定常領域遺伝子に直接付着させたので、スプライスドナー部位の必要性が排除された。 The splice donor sequence is important for the correct inframe attachment of the light chain variable region to the appropriate constant region and for splicing out the 130 bp V KK : CK intron. The heavy chain variable region was attached directly to the appropriate constant region gene via the Appal site, eliminating the need for a splice donor site.
サブクローニング制限部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ、ならびにＨｉｎｄＩｌｌおよびＡｐａｌは、それぞれ改変ＶＫおよびＶＨ可変領域遺伝子を括るものであり、様々な独自の制限部位を使用することで、適切な哺乳動物発現ベクターへの方向性のあるサブクローニングを保証している。 The subcloning restriction sites HindIII and BamHI, as well as HindIll and Appal, enclose the modified VK and VH variable region genes, respectively, and by using various unique restriction sites, directing to a suitable mammalian expression vector. Guarantees sexual subcloning.
まず、１１－１Ｆ４軽鎖可変領域遺伝子を慎重に分析して、望ましくないスプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位およびコザック配列を同定した（表６参照）。重鎖可変領域遺伝子と軽鎖可変領域遺伝子の両方について、後に機能的な全抗体のサブクローニングおよび／または発現を妨げることになる余分なサブクローニング制限部位の存在について分析した。何も見つからなかった。 First, the 11-1F4 light chain variable region gene was carefully analyzed to identify unwanted splice donor sites, splice acceptor sites and Kozak sequences (see Table 6). Both heavy and light chain variable region genes were analyzed for the presence of extra subcloning restriction sites that would later interfere with the subcloning and / or expression of all functional antibodies. I couldn't find anything.
可変領域遺伝子ごとに、別個のＰＣＲ反応を次の通り準備した。上述したプラスミド１１－１Ｆ４ＶＨ．ｐＣＲ２．１および１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＣＲ２．１を鋳型として使用した。１００μｌの反応混合物を各ＰＣＲ管で調製した。各混合物は、最大４１μｌの滅菌水、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝剤Ｉ、８μｌのｄＮＴＰの１０ｍＭストック溶液、１μｌの１０ｍＭ ５’順方向プライマー、１μｌの１０ｍＭ ３’逆方向プライマーおよび１μｌの１／１０希釈の鋳型ＤＮＡを含有していた。最後に、０．５μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（２．５ユニット）を添加した後に、完成した反応混合物に５０μｌの鉱油を重ねた。反応管をＤＮＡサーマルサイクラーに装填し、（９４℃で１分間の初期融解後）９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間および７２℃で５０秒間のサイクルを２５回繰り返した。最後のサイクルに続いて、７２℃で７分間の最終伸長ステップを行って、４℃に冷却した。各ＰＣＲ反応管からの１０μｌのアリコートを、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１．２％（ｗ／ｖ）アガロース／１×ＴＢＥ緩衝剤ゲルで泳動して、ＰＣＲ産物の大きさおよび存在を決定した。陽性ＰＣＲクローンの大きさは、約４２０ｂｐであった。このように同定された推定上の陽性ＰＣＲ産物を、Ｔｏｐｏ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キットによって提供されるｐＣＲ２．１ベクターに直接クローニングし、製造業者のプロトコルに記載されるようにＴＯＰ１０コンピテント細胞に形質転換した。ＧｕｓｓｏｗおよびＣｌａｃｋｓｏｎの方法に従って、１２１２および１２３３オリゴヌクレオチドプライマー（表３）を使用してコロニーをＰＣＲスクリーニングして、正しい大きさのインサートを有するプラスミドを含有するコロニーを同定した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒおよびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ（商標）ターミネーターを使用して、上述した推定上の陽性クローンを二本鎖プラスミドＤＮＡ配列決定した。Ｔｏｐｏ ＴＡにクローニングされたＶＨおよびＶＫ遺伝子の２つの陽性クローンを配列決定した。
Separate PCR reactions were prepared for each variable region gene as follows. The above-mentioned plasmid 11-1F4V H. pCR2.1 and 11-1F4V K. pCR2.1 was used as a template. 100 μl of the reaction mixture was prepared in each PCR tube. Each mixture contains up to 41 μl of sterile water, 10 μl of 10 × PCR buffer I, 8 μl of dNTP in 10 mM stock solution, 1 μl of 10 mM 5'forward primer, 1 μl of 10 mM 3'reverse primer and 1 μl of 1/10. It contained diluted template DNA. Finally, 0.5 μl of AmpliTaq® DNA polymerase (2.5 units) was added, followed by overlaying 50 μl of mineral oil on the finished reaction mixture. The reaction tube was loaded into a DNA thermal cycler and the cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 50 seconds was repeated 25 times (after initial melting at 94 ° C. for 1 minute). Following the last cycle, a final extension step of 7 minutes at 72 ° C. was performed and cooled to 4 ° C. 10 μl aliquots from each PCR reaction tube were run on a 1.2% (w / v) agarose / 1 × TBE buffer gel containing 0.5 μg / ml ethidium bromide to size the PCR product. And determined the existence. The size of the positive PCR clone was about 420 bp. The putative positive PCR product thus identified was cloned directly into the pCR2.1 vector provided by the Topo TA Cloning® kit and into TOP10 competent cells as described in the manufacturer's protocol. Transformed. Colonies were PCR screened using the 1212 and 1233 oligonucleotide primers (Table 3) according to the methods of Gusow and Crackson to identify colonies containing plasmids with the correct size inserts. The above-mentioned putative positive clones were sequenced into the double-stranded plasmid DNA using the
正しく改変された１１－１Ｆ４ＶＨおよび１１－１Ｆ４ＶＫ遺伝子を含むクローンを同定し、これらのクローンからの改変Ｖ遺伝子をそれぞれの発現ベクターにサブクローニングして、哺乳動物細胞におけるキメラ重鎖およびκ軽鎖の発現を促進した。改変された１１－１Ｆ４ＶＫ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ－ＢａｍＨＩ断片として発現ベクターｐＫＮ１００にサブクローニングした（図４）。このベクターは、ヒトκ定常領域遺伝子（アロタイプＫｍ（３ Ａｌａ１５３、Ｓｅｒ１９１））を含んでいる。また、改変された１１－１Ｆ４ＶＨ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ－ＡｐａＩ断片として発現ベクターｐＧ１Ｄ２００（図５）にサブクローニングした。このベクターは、ヒトγ１定常領域遺伝子（アロタイプ：Ｇ１ｍ（－１ Ｇｌｕ３７７、Ｍｅｔ３８Ｉ、－２ Ａｌａ４６２、３ Ａｒｇ２２２、Ｓｅｒ２２９））を含んでいる。使用したκ定常領域アロタイプとγ１定常領域アロタイプは、いずれも白人集団で一般的に見られる。次いで、ライゲーションした発現構築物である１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１－１Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００を使用してＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換し、元のＰＣＲ改変プライマーを使用して上述したＰＣＲスクリーニング法により陽性クローンを同定した（表４）。発現ベクターは、容易に入手可能である。 Clone containing the correctly modified 11-1F4V H and 11-1F4V K genes was identified and the modified V genes from these clones were subcloned into their respective expression vectors to generate chimeric heavy and κ light chains in mammalian cells. Was promoted. The modified 11-1F4VK gene was subcloned into the expression vector pKN100 as a HindIII-BamHI fragment (FIG. 4). This vector contains the human kappa constant region gene (allotype Km (3 Ala153, Ser191)). In addition, the modified 11-1F4VH gene was subcloned into the expression vector pG1D200 (FIG. 5) as a HindIII-ApaI fragment. This vector contains a human γ1 constant region gene (allotype: G1m (-1 Glu377, Met38I, -2 Ala462, 3 Arg222, Ser229)). Both the κ constant region allotype and the γ1 constant region allotype used are commonly found in the Caucasian population. Next, the ligated expression construct 11-1F4VK. pKN100 and 11-1F4VH. DH5α competent cells were transformed with pG1D200 and positive clones were identified by the PCR screening method described above using the original PCR modified primers (Table 4). Expression vectors are readily available.
［ＣＯＳ細胞におけるキメラ１１－１Ｆ４の一過的発現のための単一スーパーベクターの構築］
キメラ１１－１Ｆ４抗体の両方の免疫グロブリン鎖を発現する単一スーパーベクターを次の通り構築した。１１－１Ｆ４κ軽鎖発現カセット（ＨＣＭＶｉプロモーター、１１－１Ｆ４κ軽鎖可変領域遺伝子およびκ軽鎖定常領域遺伝子を含む）を、１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００構築物から制限酵素消化（１位および２４９０位のＥｃｏＲＩ）し（図４）、次いで、固有のＥｃｏＲＩ（４２９７位、図５）を介して、１１－１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００構築物にライゲーションした。このライゲーションによって、１１－１Ｆ４キメラ抗体の重鎖とκ軽鎖の両方を含むスーパーベクター構築物ｐＧ１ＫＤ２００－１１－１Ｆ４が構築された。
[Construction of a single supervector for transient expression of chimera 11-1F4 in COS cells]
A single supervector expressing both immunoglobulin chains of the chimeric 11-1F4 antibody was constructed as follows. The 11-1F4κ light chain expression cassette (containing the HCMVi promoter, 11-1F4κ light chain variable region gene and κ light chain constant region gene) was presented in 11-1F4VK. Restriction enzyme digestion (EcoRI at
［ＣＯＳ細胞におけるキメラγ１／κ．１１－１Ｆ４全抗体の一過的発現］
キメラ１１－１Ｆ４抗体を、次の２つの方法で欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）のＣＯＳ細胞で一過的に発現させた：
（ｉ）それぞれ１０μｇのベクター構築物１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１－１Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００のコトランスフェクションによるもの。コトランスフェクションは二重に行った。
（ｉｉ）１３μｇの単一スーパーベクター構築物ｐＧ１ＫＤ２００－１１－１Ｆ４のトランスフェクションによるもの。スーパーベクターのトランスフェクションは５回行った。
[Chimera γ1 / κ. In COS cells. Transient expression of all 11-1F4 antibodies]
Chimeric 11-1F4 antibody was transiently expressed in COS cells of the European Cell Culture Collection (ECACC) by two methods:
(I) 10 μg of each vector construct 11-1F4VK. pKN100 and 11-1F4VH. By cotransfection of pG1D200. Cotransfection was performed twice.
(Ii) by transfection of 13 μg single supervector construct pG1KD200-11-1F4. Supervector transfection was performed 5 times.
次の通りトランスフェクション法を使用した。１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、５８０μｇ／ｍｌのＬ－グルタミン、および５０ユニット／ｍｌのペニシリン／５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（以下、「培地」）を用いて、ＣＯＳ細胞株を１５０ｃｍ２のフラスコでコンフルエントになるまで増殖した。細胞をトリプシン処理し、ベンチトップ遠心分離機で遠心沈殿させ（２５０ｇ、５分間）、次いで、６ｍｌの培地に再懸濁した後に、これを２５ｍｌの新鮮な予熱培地をそれぞれ含む３つの１５０ｃｍ２のフラスコに均等に分けた。細胞を５％ＣＯ２中３７℃で一晩インキュベートし、翌日、指数関数的に増殖している間に収穫した。各フラスコは、約１×１０７個の細胞を含んでいた。細胞を再度トリプシン処理し、前と同様にペレット化し、２０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、次いで、細胞濃度が１×１０７細胞／ｍｌになるように十分なＰＢＳに再懸濁した。洗浄した７００μｌのＣＯＳ細胞をＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）キュベットにピペットで入れ、次いで、そこに１μｌの重鎖発現ベクターＤＮＡとκ軽鎖発現ベクターＤＮＡ（それぞれ１０μｇ）の両方または１３μｇのスーパーベクター構築物を添加した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）装置を使用して、１９００Ｖ、２５μＦの静電容量パルスを混合物に供給した。各実験トランスフェクションおよび（ＣＯＳ細胞をＤＮＡの非存在下で電気穿孔した）「ＤＮＡなし」対照についてパルスを繰り返した。ＣＯＳ細胞の効率を試験するために、以前に発現した抗体の陽性制御も実施した。
The transfection method was used as follows.
ＣＯＳ細胞を室温で１０分間回復させ、次いで、１０％（ｖ／ｖ）γ－グロブリンを含まないＦＢＳ、５８０μｇ／ｍｌのＬグルタミンおよび５０ユニット／ｍｌのペニシリン／５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した予熱した８ｍｌのＤＭＥＭを含む直径１０ｃｍの組織培養皿に穏やかにピペットで移し、５％ＣＯ２、３７℃で７２時間インキュベートした後に、分析のためにＣＯＳ細胞上清を収穫した。７２時間のインキュベーション後に、培地を回収し、回転させて細胞片を除去し、キメラ抗体の産生およびｃ１１－１Ｆ４抗体の抗原結合についてＥＬＩＳＡによって分析した。 Preheating COS cells were allowed to recover at room temperature for 10 minutes and then supplemented with 10% (v / v) γ-globulin-free FBS, 580 μg / ml L glutamine and 50 units / ml penicillin / 50 μg / ml streptomycin. Gently pipette into a 10 cm diameter tissue culture dish containing 8 ml of DMEM, and after incubating at 5% CO 2 , 37 ° C. for 72 hours, the COS cell supernatant was harvested for analysis. After 72 hours of incubation, medium was harvested and spun to remove cell debris and analyzed by ELISA for chimeric antibody production and antigen binding of c11-1F4 antibody.
［捕捉ＥＬＩＳＡを介したキメラγ１／κ１１－１Ｆ４抗体の定量化］
発現後に、ＣＯＳ細胞の上清に存在するＩｇＧ分子全体を、捕捉ＥＬＩＳＡアッセイを使用して定量化した。ＩｇＧ分子を、固定化ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的抗体を介してＮｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｂ（商標）プレート上に捕捉し、抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を介して検出した。以下と同じ方法で、同じプレート上の既知の濃度の標準ＩｇＧ抗体を捕捉および検出して、標準曲線を作成した。９６ウェル（穴）イムノプレートの各ウェルを、ＰＢＳで希釈した０．４μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体の１００μｌのアリコートでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。過剰なコーティング溶液を除去し、プレートを２００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液（１ｘＰＢＳ、０．１％ＴＷＥＥＮ）で３回洗浄した。第２列のＢ行～Ｇ行のウェルを除くすべてのウェルに、１００μｌのＳＥＣ緩衝液を分注した。ヒトＩｇＧ１／κ抗体のＳＥＣ緩衝液中１μｇ／ｍｌ溶液を標準として調製し、２００μｌ／ウェルを第２列のＢ行およびＣ行のウェルにピペットで入れた。トランスフェクトしたｃｏｓ細胞の培地を遠心分離し（２５０ｇ、５分）、上清を保存した。（ＣＯＳ細胞をＤＮＡの非存在下でトランスフェクトした）「ＤＮＡなし」対照からの上清２００μｌのアリコートを、第２列のＤ行のウェルにピペットで入れ、実験上清の２００μｌ／ウェルのアリコートを第２列のＥ行、Ｆ行およびＧ行のウェルにピペットで入れた。第２列のＢ行～Ｇ行のウェルの２００μｌのアリコートを混合し、次いで、１００μｌを各ウェルから第３列の隣接ウェルに移した。このプロセスを、標準試料、対照試料および実験試料の一連の２倍希釈液で第１１列まで続け、次いで、すべてを３７℃で１時間インキュベートし、すべてのウェルを洗浄緩衝液の２００μｌのアリコートで６回すすいだ。ヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲートをＳＥＣ緩衝液で５０００倍希釈し、１００μｌの希釈コンジュゲートを各ウェルに添加し、インキュベーションとすすぎステップを繰り返した。各ウェルに１５０μｌのＫ－ＢＬＵＥ基質を添加し、暗所中２５℃で１０分間インキュベートした。５０μｌのＲＥＤ ＳＴＯＰ溶液を各ウェルに添加して反応を停止し、６５５ｎｍで光学濃度を読み取った。
[Quantification of chimeric γ1 / κ11-1F4 antibody via capture ELISA]
After expression, the entire IgG molecule present in the supernatant of COS cells was quantified using a capture ELISA assay. IgG molecules were captured on Nunc-Immuno MaxiSorb ™ plates via immobilized goat anti-human IgG, Fcγ fragment-specific antibodies and detected via anti-human κ light chain peroxidase-conjugated antibodies. A standard curve was created by capturing and detecting a known concentration of standard IgG antibody on the same plate in the same manner as below. Each well of the 96-well (hole) immunoplate was coated with an aliquot of 100 μl of 0.4 μg / ml goat anti-human IgG antibody diluted with PBS and incubated overnight at 4 ° C. Excess coating solution was removed and the plates were washed 3 times with 200 μl / well wash buffer (1 x PBS, 0.1% TWEEN). 100 μl of SEC buffer was dispensed into all wells except the wells in rows B to G in the second column. A 1 μg / ml solution of human IgG1 / κ antibody in SEC buffer was prepared as standard and 200 μl / well was pipette into the wells of rows B and C in row 2. The medium of the transfected cos cells was centrifuged (250 g, 5 minutes) and the supernatant was stored. An aliquot of 200 μl of supernatant from a “no DNA” control (COS cells transfected in the absence of DNA) was pipetted into the wells of row D in row 2 and an aliquot of 200 μl / well of experimental supernatant. Was pipette into the wells of rows E, F and G in the second column. A 200 μl aliquot of the wells in rows B to G in the second column was mixed, and then 100 μl was transferred from each well to the adjacent well in the third column. This process was continued up to row 11 with a series of 2-fold dilutions of standard, control and experimental samples, then all were incubated at 37 ° C. for 1 hour and all wells were aliquoted with 200 μl of wash buffer. Rinse 6 times. The goat anti-human kappa light chain peroxidase conjugate was diluted 5000-fold with SEC buffer, 100 μl of the diluted conjugate was added to each well, and the incubation and rinsing steps were repeated. 150 μl of K-BLUE substrate was added to each well and incubated in the dark at 25 ° C. for 10 minutes. 50 μl of RED STOP solution was added to each well to stop the reaction and the optical concentration was read at 655 nm.
［キメラ１１－１Ｆ４抗体の結合分析］
キメラ１１－１Ｆ４抗体を、直接結合ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、アミロイド原線維への結合について試験した。合成原線維を免疫グロブリン軽鎖タンパク質から形成し、「低結合」ポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ、番号３４７４）を使用した固相ＥＬＩＳＡベースアッセイにおける抗体の反応性を監視するために使用した。プレートをコーティングする直前に、２５０μｇの原線維の塊をコーティング緩衝剤（ｐＨ７．５のリン酸緩衝生理食塩水中の０．１％ウシ血清アルブミン）で１ｍｌに希釈した。次いで、出力を最大値の４０％に設定したＴｅｋｍａｒ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒの超音波プローブを使用して、試料を２０秒間超音波処理して、それぞれ最大２～５個のプロトフィラメントで構成される短い原線維の溶液を得た。次いで、この溶液を５ｍｌに希釈し、ボルテックスで十分に混合し、プレートのウェルに等分した。この工程により、各ウェルで５０μｇ／ｍｌの濃度の原線維溶液５０μｌが得られた。次いで、プレートを３７℃のインキュベーターに蓋をせずに入れて、一晩乾燥させた。
[Chimera 11-1F4 antibody binding analysis]
Chimeric 11-1F4 antibodies were tested for binding to amyloid fibrils using a direct binding ELISA assay. Synthetic fibrils were formed from immunoglobulin light chain proteins and used to monitor antibody reactivity in a solid phase ELISA-based assay using a "low bound" polystyrene plate (Costar, number 3474). Immediately prior to coating the plate, 250 μg of fibril mass was diluted to 1 ml with a coating buffer (0.1% bovine serum albumin in phosphate buffered saline at pH 7.5). The sample was then sonicated for 20 seconds using a Tekmar Sonic Disruptor sonic probe with the output set to 40% of the maximum value, and short fibrils each consisting of up to 2-5 protofilaments. Solution was obtained. The solution was then diluted to 5 ml, mixed well with vortex and evenly divided into wells of the plate. This step gave 50 μl of a fibril solution at a concentration of 50 μg / ml in each well. The plate was then placed in an uncovered 37 ° C. incubator and dried overnight.
次いで、プレートを調製してから４８時間以内にＥＬＩＳＡアッセイを次の通り実施した。ＰＢＳに１００μｌの１％ＢＳＡを添加してウェルをブロッキングし、シェーカーを使用して室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）で３回洗浄した。プレートの各ウェルに、５０μｌのｃ１１－１Ｆ４の溶液（０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の３μｇ／ｍｌ抗体）を添加し、シェーカーを使用してプレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを（前回同様に）３回洗浄し、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ番号Ｂ－８７７４、抗重鎖および軽鎖）を使用して、結合抗体の検出を行った。 Then, within 48 hours of preparing the plate, an ELISA assay was performed as follows. Wells were blocked by adding 100 μl of 1% BSA to PBS and incubated for 1 hour at room temperature using a shaker. Plates were washed 3 times with PBS, 0.05% Tween 20 (v / v). To each well of the plate, 50 μl of a solution of c11-1F4 (3 μg / ml antibody in 0.1% BSA / PBS) was added and the plate was incubated for 1 hour at room temperature using a shaker. Plates were washed 3 times (as before) and biotinylated goat anti-mouse IgG antibodies (Sigma number B-8774, anti-heavy and light chains) were used to detect bound antibodies.
改変に成功したＶＨおよびＶＫ遺伝子の配列分析によって、正しい配列が存在することが明らかになった。改変された１１－１Ｆ４ＶＫおよびＶＨ遺伝子の詳細なＤＮＡおよびアミノ酸配列を図３および図４に示す。改変されたＶＫおよびＶＨ遺伝子をそれぞれ哺乳動物発現ベクターｐＧ１Ｄ２００およびｐＫＮ１００にクローニングすることに成功し、得られた１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１－１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００構築物を、哺乳動物細胞のコトランスフェクションに使用した。 Sequence analysis of the successfully modified VH and VK genes revealed the existence of the correct sequence. The detailed DNA and amino acid sequences of the modified 11-1F4VK and VH genes are shown in FIGS. 3 and 4. The modified V K and V H genes were successfully cloned into the mammalian expression vectors pG1D200 and pKN100, respectively, and the obtained 11-1F4VK. The pKN100 and 11-1F4VHpG1D200 constructs were used for cotransfection of mammalian cells.
次いで、１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１－１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００構築物を使用して、哺乳動物細胞でキメラ１１－１Ｆ４抗体を発現する単一スーパーベクター（ｐＧ１ＫＤ２００－１１－１Ｆ４）も構築した。ＥＣＡＣＣのＣＯＳ細胞のコトランスフェクションおよびスーパーベクタートランスフェクションによるキメラ１１－１Ｆ４抗体の発現レベルを分析した。ｐＧ１ＫＤ２００－１１－１Ｆ４スーパーベクターのトランスフェクションから観察された発現レベル（１０３２６ｎｇ／ｍｌ）は、１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１－１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００構築物の対応するコトランスフェクションから観察されたレベル（２８２０ｎｇ／ｍｌ）よりも３．７倍高かった。 Then, 11-1F4VK. Using the pKN100 and 11-1F4VHpG1D200 constructs, a single supervector (pG1KD200-11-1F4) expressing the chimeric 11-1F4 antibody in mammalian cells was also constructed. Expression levels of chimeric 11-1F4 antibody by co-transfection and supervector transfection of ECACC COS cells were analyzed. The expression level (10326 ng / ml) observed from transfection of the pG1KD200-11-1F4 supervector was 11-1F4VK. It was 3.7-fold higher than the level (2820 ng / ml) observed from the corresponding cotransfections of the pKN100 and 11-1F4VHpG1D200 constructs.
発現および定量化の後に、キメラ１１－１Ｆ４抗体を、直接結合ＥＬＩＳＡによって、標的抗原（親切にもＮＣＩによって提供されたアミロイド原線維）への結合について試験した。結合ＥＬＩＳＡの結果を図８に示す。２つの最良の個々のｐＧ１ＫＤ２００－１１－１Ｆ４スーパーベクタートランスフェクションからの上清を、対応するコトランスフェクションからの１つの上清と並行して分析した。 After expression and quantification, the chimeric 11-1F4 antibody was tested for binding to the target antigen (kindly provided by NCI, amyloid fibrils) by direct binding ELISA. The result of the bound ELISA is shown in FIG. Supernatants from the two best individual pG1KD200-11-1F4 supervector transfections were analyzed in parallel with one supernatant from the corresponding cotransfections.
結果は、キメラ１１－１Ｆ４抗体がそのマウスの抗体よりも高い親和性でアミロイド原線維に結合することを示した。通常、キメラ抗体は、元のマウス抗体に匹敵する結合親和性を有すると予想されるため、この結果は驚くべきものであり、予想外であった。特定の機構によって拘束されることを意図するものではないが、本発明者らは、１１－１Ｆ４マウスＶ領域と、キメラ１１－１Ｆ４抗体の作製に使用されるヒトγ１／κＣ領域とを組み合わせることで得られた正味の効果によって、より高い親和性を有する抗体が得られた可能性があると考えている。 The results showed that the chimeric 11-1F4 antibody binds to amyloid fibrils with higher affinity than the mouse antibody. This result was surprising and unexpected, as chimeric antibodies are usually expected to have a binding affinity comparable to that of the original mouse antibody. Although not intended to be constrained by any particular mechanism, we combine the 11-1F4 mouse V region with the human γ1 / κC region used to make chimeric 11-1F4 antibodies. It is believed that the net effect obtained in 1 may have yielded an antibody with higher affinity.
本明細書で使用したキメラ１１－１Ｆ４モノクローナル抗体の一実施形態（本実施形態ではＣＡＥＬ－１０１または抗体ＣＡＥＬ－１０１と呼ぶ場合がある）を分泌するＣＨＯ細胞（ＣＡＥＬ－１０１として同定）の試料は、ブダペスト条約に準拠して２０１８年６月２７日にアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ－１２５１４６）により寄託された。 A sample of CHO cells (identified as CAEL-101) secreting an embodiment of the chimeric 11-1F4 monoclonal antibody used herein (sometimes referred to as CAEL-101 or antibody CAEL-101 in this embodiment) is , Deposited by the American Cell Lineage Conservation Agency (ATCC Deposit No .: PTA-125146) on June 27, 2018 in accordance with the Budapest Treaty.
［マウスにおけるヒトアミロイド沈着物の撮像］
心臓（κ１）、肝臓（κ１）、脾臓（λ１）および腎臓（λ６）からのヒトアミロイド抽出物は、親切にもタフツ大学によって提供された。凍結乾燥されたヒトアミロイド抽出物を２５ｍｌの滅菌ＰＢＳに懸濁し、３分間ホモジナイズした後に、１２，０００ｇで３０分間遠心分離した。得られたペレット１００ｍｇを滅菌生理食塩水に再懸濁した。アミロイド抽出物をＢａｌｂ／ｃマウスに皮下注射した。
[Imaging of human amyloid deposits in mice]
Human amyloid extracts from the heart (κ1), liver (κ1), spleen (λ1) and kidney (λ6) were kindly provided by Tufts University. The lyophilized human amyloid extract was suspended in 25 ml sterile PBS, homogenized for 3 minutes, and then centrifuged at 12,000 g for 30 minutes. 100 mg of the obtained pellet was resuspended in sterile saline. Amyloid extract was subcutaneously injected into Balb / c mice.
［１２４Ｉ］ＣＡＥＬ－１０１：
ｃＧＭＰグレードのＣＡＥＬ－１０１を、標準的なヨードゲン反応を用いて、ＰＥＴ撮像に使用される陽電子放出核種である１２４Ｉで放射性標識した（Ｆｒａｋｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ８０（４）：８４９－５７、およびＭａｒｋｗｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ １７：４８０７－１７）。ヒトアミロイド抽出物を移植して皮下にアミロイドーマを形成してから約５日後に、５０～２００μＣｉの［１２４Ｉ］ＣＡＥＬ－１０１をマウスに注射し、Ｉｎｖｅｏｎ ｍｉｃｒｏＰＥＴスキャナを使用して注射後１日目、４日目および７日目に撮像を実施した。ＰＭＯＤソフトウェアパッケージで対象領域を描き、追跡子注入後１日目および４日目に腫瘍とバックグラウンド（アミロイド沈着物とバックグラウンド）の比（Ｔ：Ｂ）を計算して、アミロイドーマおよび対側のバックグラウンドのＳＵＶｍａｘを得た。
[ 124 I] CAEL-101:
cGMP grade CAEL-101 was radioactively labeled with 124 I, a positron emitting nuclide used for PET imaging, using standard iodine reactions (Fracer et al., Biochem Biophyss Res Commun 80 (4): 849-57). , And Markwell et al., Biochem 17: 4807-17). Approximately 5 days after transplantation of human amyloid extract to form amyloidoma subcutaneously, 50-200 μCi [ 124 I] CAEL-101 was injected into mice, and the first day after injection using an Inveon microPET scanner. Imaging was performed on the 4th and 7th days. The area of interest is drawn with the PMOD software package and the tumor to background (amyloid deposits to background) ratio (T: B) is calculated on
［１２４Ｉ］ＣＡＥＬ－１０１は、ヒトアミロイド抽出物（心臓、肝臓、脾臓および腎臓に由来するκ１、λ１およびλ６サブタイプ）を保有するマウスの１００％を撮像することに成功した。また、先行文献（Ｗａｌｌら、Ｂｌｏｏｄ．２０１０ １１６：２２４１）では機能しないと報告されていた心臓に由来するアミロイドーシスの撮像を初めて実証した（図９）。ヒトアミロイドーマは、追跡子注入後１日目および４日目の両方で可視化され、４日目にはＴ：Ｂ比が著しく増加した。４日目のＴ：Ｂ比は、２．１～４．２の範囲であった。様々なアミロイドーマの間では、取り込みに不均一性が見られた。例えば、κサブタイプを移植したマウスは、インビボでのＴ：Ｂ比（４．１±０．２０）は、λサブタイプ（２．８±０．４６）と比較して著しく良好であった。ただし、すべてのアミロイドーマでＴ：Ｂの取り込みが２．１を超えており、これは臨床的に優位であると考えられる。
[ 124 I] CAEL-101 succeeded in imaging 100% of mice carrying human amyloid extracts (κ1, λ1 and λ6 subtypes derived from heart, liver, spleen and kidney). We also demonstrated for the first time imaging of heart-derived amyloidosis, which was reported to be non-functional in previous literature (Wall et al., Blood. 2010 116: 2241) (FIG. 9). Human amyloidoma was visualized both on
このように、様々なアミロイドーマの間で取り込みが不均一であるという結果は、リアルタイムのＰＥＴ撮像を使用して、本明細書に記載のキメラまたはヒト化抗体による治療のための患者を分類すること、および抗体治療の適切な投与量を決定することに役立つ。すなわち、標識抗体または抗体断片の検出された取り込みに基づいて、患者の投与量を決定することができる。標識抗体または抗体断片に対して強い取り込み（親和性）を示す患者は、標識抗体または抗体断片に対して弱い取り込み（親和性）を示す患者よりも少ない量の治療用抗体または抗体断片を必要とする場合がある。したがって、本発明は、治療のための本明細書に記載のヒト化またはキメラ抗体の適切な投与量を決定する方法を提供する。該方法は、本明細書に記載の標識抗体または抗体断片を患者に投与するステップと、患者におけるアミロイド沈着物による標識抗体または抗体断片の取り込みを決定するステップと、標識抗体または抗体断片の決定された量に基づいてキメラまたはヒト化抗体または抗体断片の投与量または一連の投与量を患者に投与するステップと、を含む。 Thus, the result of heterogeneous uptake among the various amyloidomas is to classify patients for treatment with the chimeric or humanized antibodies described herein using real-time PET imaging. , And help determine the appropriate dose of antibody treatment. That is, the patient's dose can be determined based on the detected uptake of the labeled antibody or antibody fragment. Patients with strong uptake (affinity) to labeled antibody or antibody fragment require less therapeutic antibody or antibody fragment than patients with weak uptake (affinity) to labeled antibody or antibody fragment. May be done. Accordingly, the present invention provides a method of determining an appropriate dose of a humanized or chimeric antibody described herein for treatment. The method is determined by administering the labeled antibody or antibody fragment described herein to a patient, determining the uptake of the labeled antibody or antibody fragment by an amyloid deposit in the patient, and determining the labeled antibody or antibody fragment. Includes a step of administering to a patient a dose or series of doses of a chimeric or humanized antibody or antibody fragment based on the amount of antibody.
［８９Ｚｒ］ＣＡＥＬ－１０１：
［１２４Ｉ］ＣＡＥＬ－１０１は、アミロイドーマとの有意な結合を示したが、１２４Ｉ放射性標識が脱ハロゲン化するため、検出された活性の多くが甲状腺にあるか、標的にならない（甲状腺がブロックされている場合）。そこで、本出願人らは、より安定した放射性核種で放射性標識し、結合しなかった放射性標識を血液から除去した後（７日～１０日後）に撮像することができる方法を模索した。２つの異なる戦略を用いて、ＣＡＥＬ－１０１を８９－ジルコニウム（８９Ｚｒ）で放射性標識し、［８９Ｚｒ］－ＣＡＥＬ－１０１を産生した。戦略の１つは、抗体における無作為のリジンに結合する標準的なＮＣＳリンカーを採用したものである（Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ．２０１０ Ｆｅｂ．３７（２）：２５０－５９、およびＣｕｒｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０１１ Ａｐｒ．１；４（２）：１３１－１３９）。この方法は、多くの臨床用途で使用されているが、理論的にはバッチ間で結合や生体内分布を変化させることができる複数の放射性異性体が生じることが示されている。そのため、本出願人は、二官能性デフェロキサミン－マレイミド架橋剤を使用してシステインを標的とした部位特異的アプローチでＣＡＥＬ－１０１を放射性標識した（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３７（２０１０）２８９－２９７）。ヒト心臓アミロイド抽出物を皮下に移植してアミロイドーマを形成した約５日後に、５０～２００μＣｉの［８９Ｚｒ］ＣＡＥＬ－１０１を動物に注射し、Ｉｎｖｅｏｎ ｍｉｃｒｏＰＥＴスキャナを使用して注射後１日目、４日目、７日目、１１日目および１４日目に撮像を実施した。
[ 89 Zr] CAEL-101:
[ 124 I] CAEL-101 showed significant binding to amyloidoma, but due to the dehalogenation of the 124 I radiolabel, much of the detected activity is in or untargeted to the thyroid gland (thyroid gland is blocked). If it is). Therefore, the applicants sought a method capable of radiolabeling with a more stable radionuclide and imaging after removing the unbound radiolabel from the blood (7 to 10 days later). Using two different strategies, CAEL-101 was radioactively labeled with 89-zirconium ( 89 Zr) to produce [ 89 Zr] -CAEL-101. One of the strategies employs a standard NCS linker that binds to a random lysine in the antibody (Eur J Nucl Mol Imaging. 2010 Feb. 37 (2): 250-59, and Curr Radiopharm. 2011). Apr. 1; 4 (2): 131-139). Although this method has been used in many clinical applications, it has been shown that theoretically it yields multiple radioactive isomers capable of varying binding and biodistribution between batches. Therefore, Applicants have radioactively labeled CAEL-101 with a site-specific approach targeting cysteine using a bifunctional deferoxamine-maleimide crosslinker (Nuclear Medicine and Biologic, 37 (2010) 289-297). .. Approximately 5 days after subcutaneous transplantation of human cardiac amyloid extract to form amyloidoma, 50-200 μCi [ 89 Zr] CAEL-101 was injected into the animal and 1 day after injection using an Inveon microPET scanner. Imaging was performed on the 4th, 7th, 11th and 14th days.
［８９Ｚｒ］ＣＡＥＬ－１０１の変異体の両方は、心臓アミロイド抽出物を保有するマウスを撮像することに成功した。ヒトアミロイドーマは、実験期間中（追跡子注射後１４日間）、非常に良好に可視化され、放射性追跡子の著しい分解は見られなかった。これは、４日目および７日目で著しい分解が見られた［１２４Ｉ］ＣＡＥＬ－１０１とは対照的である。このようにアミロイド沈着物を長時間撮像することで、結合しなかった標識抗体を血液からかなり除去した後に、この標識抗体を使用して撮像を実施することができる。これにより、腫瘍とバックグラウンド（アミロイド沈着物とバックグラウンド）の比率が改善される。これは、心臓のアミロイド沈着物などの隣接する血液区画が多い臓器における疾患を撮像するのに重要な役割を果たす。追跡子注射後１４日目でもアミロイドーマが観察されたことから、抗体結合成分がインビボで長期的に安定していることがわかった。先行文献では機能しないと報告されていた心臓に由来するアミロイドーシスの撮像を再び実証することができた。また、リンパ組織における同側取り込みを初めて観察した。これは、免疫不全のマウスにアミロイドーマを移植したことにより、食作用を受けた免疫細胞におけるアミロイドが排液節に移動したことが原因と考えられる。このモデルでは、ヒトアミロイドが存在するため、自発的なアミロイドの除去が生じる。この新しい観察結果は、ＰＥＴ追跡子のリンパ節への取り込みを調べることで、治療に対する反応を撮像する方法の基礎を提供できる可能性がある。 Both variants of [ 89 Zr] CAEL-101 were successful in imaging mice carrying cardiac amyloid extract. Human amyloidoma was very well visualized during the experimental period (14 days after follower injection) and no significant degradation of the radioactive tracker was observed. This is in contrast to [ 124 I] CAEL-101, which showed significant degradation on days 4 and 7. By imaging the amyloid deposits for a long period of time in this way, it is possible to perform imaging using the labeled antibody after the unbound labeled antibody is considerably removed from the blood. This improves the ratio of tumor to background (amyloid deposits to background). It plays an important role in imaging diseases in adjacent blood compartment-rich organs, such as cardiac amyloid deposits. Amyloidoma was also observed 14 days after the follower injection, indicating that the antibody-binding component was stable in vivo for a long period of time. Imaging of heart-derived amyloidosis, which was reported to be non-functional in previous literature, could be demonstrated again. We also observed ipsilateral uptake in lymphoid tissue for the first time. This is thought to be due to the migration of amyloid in phagocytosed immune cells to the drainage node by transplanting amyloidoma into immunodeficient mice. In this model, the presence of human amyloid results in spontaneous amyloid removal. This new observation may provide the basis for a method of imaging the response to treatment by examining the uptake of PET followers into the lymph nodes.
本明細書の説明および特許請求の範囲において使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語および当該単語の変形は、特に明示されていない限り、他の特徴、添加剤、成分、整数またはステップを排除することを意図していない。これらの単語の範囲は、排他的な意味ではなく、包括的な意味を有するように広く解釈されるものである。 As used herein and in the claims, the word "comprise, competes, composing" and variations of that word are other features, additives, ingredients, integers, unless otherwise stated. Or it is not intended to eliminate the step. The range of these words is broadly interpreted to have a comprehensive meaning rather than an exclusive meaning.
以上、本明細書において本発明の組成物および方法を、実施例を参照して説明した。しかしながら、本発明はこれらに限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の教示から逸脱することなく、当業者に知られているように種々の変形が可能であることが理解されるであろう。 In the present specification, the composition and method of the present invention have been described with reference to Examples. However, the present invention is not limited thereto, and various modifications can be made as known to those skilled in the art without departing from the teachings of the present invention as defined by the appended claims. Will be understood.
Claims (31)
配列番号５３を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５３を含むＣＤＲＨ２、および配列番号５４を含むＣＤＲＨ３を有する可変重鎖（ＶＨ）と、
配列番号４９を含むＣＤＲＬ１、配列番号５０を含むＣＤＲＬ２、および配列番号５１を含むＣＤＲＬ３を有する可変軽鎖（ＶＫ）と、
を有し、
画像診断による前記アミロイド沈着物に結合した検出可能な標識の検出によって、前記アミロイド沈着物の存在、位置および／または量を検出するステップを含む、
方法。 A method of in vivo detection of the presence, location and / or amount of said amyloid deposits in a patient suspected of having amyloid deposits, wherein an antibody or antigen binding fragment ligated with a detectable molecule is administered to the patient. The antibody or the antigen-binding fragment comprises a step.
Complementarity determining regions (CDRs) H1 comprising SEQ ID NO: 53, CDRH2 comprising SEQ ID NO: 53, and variable heavy chains ( VH ) having CDRH3 comprising SEQ ID NO: 54.
A variable light chain (VK) having CDRL1 comprising SEQ ID NO: 49, CDRL2 comprising SEQ ID NO: 50, and CDRL3 comprising SEQ ID NO: 51.
Have,
Includes the step of detecting the presence, location and / or amount of the amyloid deposit by detecting a detectable label bound to the amyloid deposit by diagnostic imaging.
Method.
前記抗体は、キメラ１１－１Ｆ４である、請求項５に記載の方法。 The method of claim 4, wherein the antibody is a chimera 11-1F4.
The method of claim 5, wherein the antibody is a chimera 11-1F4.
配列番号５３を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５３を含むＣＤＲＨ２、および配列番号５４を含むＣＤＲＨ３を有する可変重鎖（ＶＨ）と、
配列番号４９を含むＣＤＲＬ１、配列番号５０を含むＣＤＲＬ２、および配列番号５１を含むＣＤＲＬ３を有する可変軽鎖（ＶＫ）と、
を有する、
組成物。 A composition for detecting the presence, location and / or amount of amyloid deposits in a subject, comprising an antibody or antigen binding fragment to which a detectable molecule is linked, said antibody or antigen binding fragment.
Complementarity determining regions (CDRs) H1 comprising SEQ ID NO: 53, CDRH2 comprising SEQ ID NO: 53, and variable heavy chains ( VH ) having CDRH3 comprising SEQ ID NO: 54.
A variable light chain (VK) having CDRL1 comprising SEQ ID NO: 49, CDRL2 comprising SEQ ID NO: 50, and CDRL3 comprising SEQ ID NO: 51.
Have,
Composition.
請求項１０に記載の組成物。 The antibody or antigen-binding fragment comprises a chimeric mouse-human antibody having a VK region comprising SEQ ID NO: 47 and a VH region comprising SEQ ID NO: 48.
The composition according to claim 10.
（ａ）請求項１０に記載の組成物を前記患者に投与し、画像診断を前記患者に実施して、前記アミロイド沈着物に結合した検出可能な分子の量を検出するステップと、
（ｂ）前記アミロイド沈着物を除去するように意図された治療法で前記患者を治療するステップと、
（ｃ）請求項１０に記載の組成物を前記患者に投与するステップと、
（ｄ）前記画像診断を前記患者に実施して、前記アミロイド沈着物に結合した前記検出可能な分子の量を検出するステップと、
（ｅ）前記ステップ（ｄ）で検出された前記検出可能な分子の量と、前記ステップ（ａ）で検出された前記検出可能な分子の量とを比較するステップと、
を含む、
方法。 A method of monitoring the progression of the disease in a patient diagnosed with an amyloid deposit and having an amyloid deposit.
(A) A step of administering the composition according to claim 10 to the patient, performing diagnostic imaging on the patient, and detecting the amount of detectable molecule bound to the amyloid deposit.
(B) A step of treating the patient with a treatment method intended to remove the amyloid deposits.
(C) The step of administering the composition according to claim 10 to the patient, and
(D) A step of performing the diagnostic imaging on the patient to detect the amount of the detectable molecule bound to the amyloid deposit.
(E) A step of comparing the amount of the detectable molecule detected in the step (d) with the amount of the detectable molecule detected in the step (a).
including,
Method.
方法。 A method of determining the effect of a treatment for removing amyloid deposits in a patient, the step of treating the patient with a therapeutically effective dose of (a) a chimeric 11-F4 antibody or an antigen-binding fragment thereof, and (b). ) The step of administering to the patient a diagnostically effective amount of the diagnostic composition according to claim 10, and (c) a molecule detectable from the diagnostic composition in the patient's lymph node by diagnostic imaging. The higher the amount of the detectable molecule detected in the lymph node, the more effective the treatment, including the step of measuring the amount.
Method.
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| WO2019006062A1 (en) * | 2017-06-29 | 2019-01-03 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Chimeric antibodies for treatment of amyloid deposition diseases |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BLOOD, 2010, VOL.116, NO.13, PP.2241-2244, JPN6022030422, ISSN: 0004971617 * |
| BLOOD, 2015, VOL.126, NO.23, P.188, JPN6023002416, ISSN: 0004971618 * |
| BLOOD, 2017, VOL.130, NO.SUPPL_1, P.509, JPN6023002417, ISSN: 0004971619 * |
| CLINICAL CANCER RESEARCH, 2003, VOL.9, NO.10, PP.3831S-3838S, JPN6022030421, ISSN: 0004971616 * |
| PNAS, 2018.10.30, VOL.115, NO.46, PP.E10839-E10848, JPN6023002418, ISSN: 0004971620 * |
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