JP2016023148A - 脂質粒子の製造法および脂質粒子を有する核酸送達キャリア - Google Patents
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Abstract
【課題】高い内包率で核酸などを保持することが可能な脂質粒子の製造法、および脂質粒子を有する核酸送達キャリアを提供すること。
【解決手段】下記(1)〜(4)の工程:
(1)リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を加熱する工程;
(2)核酸を含む水相と、工程(1)で調製した油相を混合する工程;
(3)工程(2)で得た油相および水相を含む混合液を冷却し、脂質粒子を晶出する工程;および
(4)工程(3)で得た油相および水相を含む混合液からアルコールおよびエステルを除去する工程、
を含む、核酸を内包した脂質粒子の製造法。
【選択図】なし
【解決手段】下記(1)〜(4)の工程:
(1)リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を加熱する工程;
(2)核酸を含む水相と、工程(1)で調製した油相を混合する工程;
(3)工程(2)で得た油相および水相を含む混合液を冷却し、脂質粒子を晶出する工程;および
(4)工程(3)で得た油相および水相を含む混合液からアルコールおよびエステルを除去する工程、
を含む、核酸を内包した脂質粒子の製造法。
【選択図】なし
Description
本発明は、脂質粒子の製造法および脂質粒子の用途に関し、好適には核酸を細胞内に送達するのに有用な脂質粒子の製造法および脂質粒子の用途に関する。
核酸医薬は、疾患に対する作用機序が明確で、副作用も少なく、次世代の医薬品として記載されている。例えば、RNA干渉(RNAi)を用いた核酸医薬は、細胞に存在する標的遺伝子のmRNAの分解を惹起し、標的遺伝子の発現を阻害することができる。その結果、特定の遺伝子または遺伝子群の異常な発現原因となって生じる疾患症状を軽減または治療することができる。このようなRNA干渉を利用した核酸医薬において、例えば、siRNAなどの核酸が利用されるが、これらの核酸に機能を発現させるためには、核酸を細胞内に送達することが必要である。
核酸を細胞内に効果的に送達する方法として一般にキャリア(ベクター)が用いられる。核酸がアニオン性であることから、キャリア(ベクター)としてカチオン脂質を用いたカチオン性のリポソーム(非特許文献1)、カチオン性とアニオン性の両方を併せもつ両性リポソーム(特許文献1、2)などの検討がなされている。
最も一般的なリポソームの製造法として、Bangham(バンガム)法が知られている。バンガム法とは、容器内でリン脂質をクロロホルムなどの有機溶媒に溶解させ、次いで有機溶媒を蒸発させて容器内面上に脂質薄膜を作成した後、薄膜に水を加えて薄膜を膨潤させ、さらに容器を振盪することによりリポソームを得る方法である。
その他にも、有機溶媒抽出法、界面活性剤除去法、凍結融解法などの方法が知られている。
その他にも、有機溶媒抽出法、界面活性剤除去法、凍結融解法などの方法が知られている。
Gene Therapy, Vol.6, p271, 1999
キャリア(ベクター)の評価のための重要な指標として、内包率がある。内包率とは、キャリア(ベクター)の製造時に内水相に保持させるために添加した親水性物質中の何%が内水相中に保持されているかを示す指標である。
従来のキャリア(ベクター)の製造法では、例えば、核酸を高い内包率で保持することのできるキャリア(ベクター)を得るには十分ではなかった。
従来のキャリア(ベクター)の製造法では、例えば、核酸を高い内包率で保持することのできるキャリア(ベクター)を得るには十分ではなかった。
本発明は、高い内包率で核酸などを保持することが可能な脂質粒子の製造法、および脂質粒子を有する核酸送達キャリアを提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、(1)リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を加熱する工程と、(2)核酸を含む水相と、工程(1)で調製した油相を混合する工程と、(3)工程(2)で得た油相および水相を含む混合液を冷却し、脂質粒子を晶出する工程と、(4)工程(3)で得た油相および水相を含む混合液からアルコールおよびエステルを除去する工程と、を含む製造法が、上記課題を解決した脂質粒子の製造法として提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、課題を解決するための手段は以下の通りである。
[1] 下記(1)〜(4)の工程:
(1)リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を加熱する工程;(2)核酸を含む水相と、工程(1)で調製した油相を混合する工程;(3)工程(2)で得た油相および水相を含む混合液を冷却し、脂質粒子を晶出する工程;および(4)工程(3)で得た油相および水相を含む混合液からアルコールおよびエステルを除去する工程、を含む、核酸を内包した脂質粒子の製造法。
[2] アルコールが炭素数1〜6のアルコールである、[1]に記載の脂質粒子の製造法。
[3] エステルが酢酸エステルである、[1]または[2]に記載の脂質粒子の製造法。
[4] 工程(1)において、油相が、少なくとも1つのアミノ基と少なくとも1つのイミダゾイル基を有する化合物をさらに含む、[1]〜[3]のいずれか1つに記載の脂質粒子の製造法。
[5] 少なくzとも1つのアミノ基と少なくとも1つのイミダゾイル基を有する化合物が一般式(1):
(式中、R1およびR2は、同一または異なって、炭素数10〜22のアルキル基、炭素数10〜22のアルキルオキシアルキレン基、炭素数10〜22のアルカノイルオキシアルキレン基および炭素数10〜22のアルキルオキシカルボニルアルキレン基から選択される置換基である)で表される化合物である、[4]に記載の脂質粒子の製造法。
[6] 工程(1)において、リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を40〜70℃で加熱する、[1]〜[5]のいずれか1つに記載の脂質粒子の製造法。
[7] 工程(3)において、油相および水相を含む混合液を10〜30℃で冷却する、[1]〜[6]のいずれか1つに記載の脂質粒子の製造法。
[8] [1]〜[7]のいずれか1つに記載の製造法によって得られる脂質粒子を有する核酸送達キャリア。
[1] 下記(1)〜(4)の工程:
(1)リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を加熱する工程;(2)核酸を含む水相と、工程(1)で調製した油相を混合する工程;(3)工程(2)で得た油相および水相を含む混合液を冷却し、脂質粒子を晶出する工程;および(4)工程(3)で得た油相および水相を含む混合液からアルコールおよびエステルを除去する工程、を含む、核酸を内包した脂質粒子の製造法。
[2] アルコールが炭素数1〜6のアルコールである、[1]に記載の脂質粒子の製造法。
[3] エステルが酢酸エステルである、[1]または[2]に記載の脂質粒子の製造法。
[4] 工程(1)において、油相が、少なくとも1つのアミノ基と少なくとも1つのイミダゾイル基を有する化合物をさらに含む、[1]〜[3]のいずれか1つに記載の脂質粒子の製造法。
[5] 少なくzとも1つのアミノ基と少なくとも1つのイミダゾイル基を有する化合物が一般式(1):
[6] 工程(1)において、リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を40〜70℃で加熱する、[1]〜[5]のいずれか1つに記載の脂質粒子の製造法。
[7] 工程(3)において、油相および水相を含む混合液を10〜30℃で冷却する、[1]〜[6]のいずれか1つに記載の脂質粒子の製造法。
[8] [1]〜[7]のいずれか1つに記載の製造法によって得られる脂質粒子を有する核酸送達キャリア。
本発明の脂質粒子の製造法によれば、高い内包率で核酸などを保持することが可能な脂質粒子の製造法、および脂質粒子を有する核酸送達キャリアを提供することができる。
以下、本発明について詳細に説明する。
本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
(1)脂質粒子の製造法
本発明の脂質粒子の製造は、下記(1)〜(4)の工程:
(1)リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を加熱する工程;
(2)核酸を含む水相と、工程(1)で調製した油相を混合する工程;
(3)工程(2)で得た油相および水相を含む混合液(以下、油相−水相混合液と称することがある)を冷却し、脂質粒子を晶出する工程;および
(4)工程(3)で得られた油相および水相を含む混合液からアルコールおよびエステルを除去する工程、を含む、核酸を内包した脂質粒子の製造法(以下、本発明の製造法と称することがある)である。
本発明の脂質粒子の製造は、下記(1)〜(4)の工程:
(1)リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を加熱する工程;
(2)核酸を含む水相と、工程(1)で調製した油相を混合する工程;
(3)工程(2)で得た油相および水相を含む混合液(以下、油相−水相混合液と称することがある)を冷却し、脂質粒子を晶出する工程;および
(4)工程(3)で得られた油相および水相を含む混合液からアルコールおよびエステルを除去する工程、を含む、核酸を内包した脂質粒子の製造法(以下、本発明の製造法と称することがある)である。
本発明の製造法は、コアセルベーションを利用した粒子の形成方法である。コアセルベーションとは、親水コロイドに他の物質を添加したり、貧溶媒で希釈したり、pHを変化させたりするとき、コロイドに富む液相とコロイドに乏しい液相とのふたつの相に分離する現象のことである。
本発明の製造法において、リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を加熱し、核酸を含む水相と、得られた油相を混合した後に、時間をかけて冷却することによって一種のコアセルベーション現象が起こり、リン脂質が核酸を内包するように自己組織化することで、高い内包率で核酸を保持したリポソームを得ることができる。
本発明の製造法において、リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を加熱し、核酸を含む水相と、得られた油相を混合した後に、時間をかけて冷却することによって一種のコアセルベーション現象が起こり、リン脂質が核酸を内包するように自己組織化することで、高い内包率で核酸を保持したリポソームを得ることができる。
[工程(1)]
本発明の製造法は、工程(1)リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相(油相とは、リン脂質、アルコールおよびエステルを混合して得られる組成物中に含まれる油性成分を意味する)を加熱する工程を含む。
本発明の製造法は、工程(1)リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相(油相とは、リン脂質、アルコールおよびエステルを混合して得られる組成物中に含まれる油性成分を意味する)を加熱する工程を含む。
本発明で用いられるリン脂質としては、特に限定されないが、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチンなどの天然リン脂質、天然由来のリン脂質の不飽和炭素鎖を水素により飽和とした水素添加リン脂質、天然由来のリン脂質に合成により修飾を加えた合成リン脂質などが挙げられ、これらを1種または2種以上組み合わせて用いてもよい。
本発明におけるリン脂質の総量は、核酸に対して、モル比で10:1〜5000:1であることが好ましく、100:1〜1000:1であることがより好ましい。
本発明で使用されるアルコールとしては、特に限定されないが、炭素数1〜6のアルコールを用いることが好ましい。具体的には、メタノール、エタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、2−ブタノール、3−メチル−1−ブタノールなどが挙げられる。本発明で使用されるアルコールとしては、極性の観点から、エタノールを用いることがより好ましい。
本発明で使用されるエステルとしては、特に限定されないが、酢酸エステルを用いることが好ましい。具体的には、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチルなどが挙げられる。本発明で使用されるエステルとしては、極性又は親油性の観点から、酢酸エチルを用いることがより好ましい。
本発明におけるエステルとアルコールの比率は、容量比率で90:10〜10:90であることが好ましく、80:20〜30:70であることがより好ましく、70:30〜40:60であることがさらに好ましい。
本発明の製造法では、工程(1)において、少なくとも1つのアミノ基と少なくとも1つのイミダゾイル基を有する化合物を(好ましくは脂質として)さらに含むことが好ましい。
本発明において、少なくとも1つのアミノ基と少なくとも1つのイミダゾイル基を有する化合物を使用する際の配合量は、脂質全量に対して、10mol%〜70mol%であることが好ましく、15mol%〜60mol%であることがより好ましく、20mol%〜50mok%であることがさらに好ましい。
本発明で用いられる、少なくとも1つのアミノ基と少なくとも1つのイミダゾイル基を有する化合物としては、特に限定されないが、例えば、一般式(1)で表される化合物を用いることが好ましい。
式中、R1およびR2は、同一または異なって、炭素数10〜22のアルキル基、炭素数10〜22のアルキルオキシアルキレン基、炭素数10〜22のアルカノイルオキシアルキレン基および炭素数10〜22のアルキルオキシカルボニルアルキレン基から選択される置換基である。
R1およびR2は、同一または異なって、炭素数10〜22のアルキル基であることがより好ましく、炭素数14〜20のアルキル基であることがさらに好ましい。また、アルキル基中に二重結合を有していてもよい。
本発明の製造法において用いられる、一般式(1)で表される、少なくとも1つのアミノ基と少なくとも1つのイミダゾイル基を有する化合物は、特に限定されないが、例えば、下記の方法により合成することができる。
式中、PGは保護基を表し、Xは活性エステルを構成する脱離基を表す。R1およびR2は、上記と同様である。
すなわち、適切な保護基により保護されたヒスチジンの活性エステル(A)と、アミン誘導体(B)を塩基存在下で反応させ、化合物(C)を得た後、適切な脱保護方法によって、一般式(1)で表される化合物を合成することができる。
ここで、ヒスチジンの活性エステル(A)において使用できる保護基としては、例えば、W.グリーン(W.Greene)ら、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス(Protective Groups in Organic Synthesis)第4版、第255〜265頁、2007年、ジョン・ウィリイ・アンド・サンズ社(John Wiley & Sons,INC.)に記載の保護基などが挙げられる。具体的には、Boc基(tert-ブトキシカルボニル基)、Z基(ベンジルオキシカルボニル基)などが好ましい例として挙げられる。
使用できる活性エステルの例として、フェニルエステル、トリフルオロフェニルエステル、ペンタフェニルエステル、ヒドロキシスクシンイミドエステルなどを挙げることができ、原料入手性または安定性の観点から、ヒドロキシスクシンイミドエステルが好ましい。
使用できる塩基としては、無機塩基、有機塩基を挙げることができる。無機塩基の例としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムなどを挙げることができ、有機塩基の例としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミンなどを挙げることができる。使用する塩基は、反応に用いるヒスチジンの活性エステル(A)の保護基によって、適切な塩基を用いることが好ましい。
使用できる溶媒としては、特に限定されないが、一般的な有機溶媒を用いることができる。具体的には、エーテル系溶剤、エステル系溶剤、アミド系溶剤、ハロゲン系溶剤を用いることができ、テトラヒドロフランなどのエーテル系溶剤、ジクロロメタン、クロロホルムなどのハロゲン系溶剤が好ましい例として挙げられる。
使用できる脱保護反応としては、例えば、W.グリーン(W.Greene)ら、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス(Protective Groups in Organic Synthesis)第4版、第255〜265頁、2007年、ジョン・ウィリイ・アンド・サンズ社(John Wiley & Sons,INC.)に記載の方法などが挙げられる。
本発明の製造法で用いられる、少なくとも1つのアミノ基と少なくとも1つのイミダゾイル基を有する化合物として、式(2)で表される化合物(2−アミノ−N,N−ジヘキサデシル−3−(1H−イミダゾール−5−イル)プロパンアミド)[本明細書中において化合物Aとも称する]を使用することが好ましい。
本発明の製造法において、式(2)で表される化合物を使用することで、高い内包率で核酸を保持することができ、且つ、標的細胞における核酸の放出性に優れた脂質粒子を得ることができる。
本発明の工程(1)において、リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を加熱する際の温度は、40〜70℃であることが好ましく、45〜65℃であることがより好ましく、50〜60℃であることがさらに好ましい。
また、加熱時間は、液全体の温度が均一に所望の温度になっていることが確認できればよく、特に限定されない。
また、加熱時間は、液全体の温度が均一に所望の温度になっていることが確認できればよく、特に限定されない。
[他の成分]
本発明の油相には、リン脂質、アルコールおよびエステル以外に、本発明の効果を損なわない範囲において、必要に応じて、他の成分を含むことができる。
本発明の油相には、リン脂質、アルコールおよびエステル以外に、本発明の効果を損なわない範囲において、必要に応じて、他の成分を含むことができる。
(ステロール)
本発明の製造法は、油相にステロールを含んでもよい。本発明において、油相にステロールを含むことで、膜流動性を低下させ、脂質粒子の安定化効果を得ることができる。
ステロールとしては、特に限定されないが、コレステロール、フィトステロール(シトステロール、スチグマステロール、フコステロール、スピナステロール、ブラシカステロールなど)、エルゴステロール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル−2’−ヒドロキシエチルエーテル。コレステリル−4’−ヒドロキシブチルエーテルなどを上げることができる。これらの中でも、コレステロールが好ましい。
本発明において、ステロールの配合量は、全脂質量に対して10mol%〜60mol%であることが好ましく、20mol%〜55mol%であることがより好ましく、25mol%〜50mol%であることがさらに好ましい。
本発明の製造法は、油相にステロールを含んでもよい。本発明において、油相にステロールを含むことで、膜流動性を低下させ、脂質粒子の安定化効果を得ることができる。
ステロールとしては、特に限定されないが、コレステロール、フィトステロール(シトステロール、スチグマステロール、フコステロール、スピナステロール、ブラシカステロールなど)、エルゴステロール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル−2’−ヒドロキシエチルエーテル。コレステリル−4’−ヒドロキシブチルエーテルなどを上げることができる。これらの中でも、コレステロールが好ましい。
本発明において、ステロールの配合量は、全脂質量に対して10mol%〜60mol%であることが好ましく、20mol%〜55mol%であることがより好ましく、25mol%〜50mol%であることがさらに好ましい。
(ポリエチレングリコール鎖を有する脂質)
本発明の製造法は、油相にポリエチレングリコール鎖(以下、「PEG鎖」と称する。)を有する脂質を含んでもよい。本発明において、油相にPEG鎖を有する脂質を含むことで、脂質粒子の分散安定化効果を得ることができる。
PEG鎖を有する脂質としては、特に限定されないが、PEG修飾ホスホエタノールアミン、ジアシルグリセロールPEG誘導体、ジアルキルグリセロールPEG誘導体、コレステロールPEG誘導体、セラミドPEG誘導体などが挙げられる。これらの中でも、PEG修飾ホスホエタノールアミンが好ましい。
PEG鎖の重量平均分子量は、500〜5000が好ましく、750〜2000がより好ましい。
PEG鎖は分岐していてもよく、ヒドロキシメチル基のような置換基を有していてもよい。
本発明の製造法は、油相にポリエチレングリコール鎖(以下、「PEG鎖」と称する。)を有する脂質を含んでもよい。本発明において、油相にPEG鎖を有する脂質を含むことで、脂質粒子の分散安定化効果を得ることができる。
PEG鎖を有する脂質としては、特に限定されないが、PEG修飾ホスホエタノールアミン、ジアシルグリセロールPEG誘導体、ジアルキルグリセロールPEG誘導体、コレステロールPEG誘導体、セラミドPEG誘導体などが挙げられる。これらの中でも、PEG修飾ホスホエタノールアミンが好ましい。
PEG鎖の重量平均分子量は、500〜5000が好ましく、750〜2000がより好ましい。
PEG鎖は分岐していてもよく、ヒドロキシメチル基のような置換基を有していてもよい。
本発明おいて、PEG鎖を有する脂質の配合量は、全脂質量に対して0.5mol%〜12mol%であることが好ましく、2mol%〜10mol%であることがより好ましく、4mol%〜8mol%であることがさらに好ましい。
[工程(2)]
本発明の製造法は、工程(2):核酸を含む水相と、工程(1)で調製した油相を混合する工程を含む。
本発明の製造法は、工程(2):核酸を含む水相と、工程(1)で調製した油相を混合する工程を含む。
[核酸]
本発明に用いられる核酸としては、公知の任意の形態の核酸が含まれる。核酸の具体例としては、一般的なRNA、DNA、およびそれらの誘導体を挙げることができ、一本鎖DNAもしくはRNAであってもよく、二本鎖DNAもしくはRNAであってもよく、DNA−RNAハイブリッドであってもよい。本発明に用いることのできる核酸としては、具体的には、アンチセンスDNA、アンチセンスRNA、DNAエンザイム、リボザイム、siRNA、shRNA、miRNA、aiRNA、piRNA、デコイ核酸、アプタマーなどを挙げることができる。本発明に用いられる核酸としては、siRNA、miRNA、aiRNA、アンチセンスDNA、アンチセンスRNAを使用することが好ましい。
本発明に用いられる核酸としては、公知の任意の形態の核酸が含まれる。核酸の具体例としては、一般的なRNA、DNA、およびそれらの誘導体を挙げることができ、一本鎖DNAもしくはRNAであってもよく、二本鎖DNAもしくはRNAであってもよく、DNA−RNAハイブリッドであってもよい。本発明に用いることのできる核酸としては、具体的には、アンチセンスDNA、アンチセンスRNA、DNAエンザイム、リボザイム、siRNA、shRNA、miRNA、aiRNA、piRNA、デコイ核酸、アプタマーなどを挙げることができる。本発明に用いられる核酸としては、siRNA、miRNA、aiRNA、アンチセンスDNA、アンチセンスRNAを使用することが好ましい。
本発明で用いられる核酸は、天然型に限定されるものではなく、ヌクレアーゼ耐性など、生体内における安定性を高めるために、そのヌクレオチドを構成している糖またはリン酸バックボーンなどの少なくとも一部が修飾されているような非天然型であってもよい。
糖部が修飾されている非天然型核酸としては、2’−O−メチルRNA、2’−O−(2−メトキシ)エチルRNA、2’−デオキシ−2’−フルオロアラビノ核酸、架橋型核酸(LNA/BNA)などが挙げられる。また、糖部をペプチドに置き換えたペプチド核酸(PNA)、モルフォリノに置き換えたモルフォリノ核酸なども、非天然型核酸の一例として挙げることができる。
リン酸バックボーンが修飾されている非天然型核酸としては、ホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体などが挙げられる。
糖部が修飾されている非天然型核酸としては、2’−O−メチルRNA、2’−O−(2−メトキシ)エチルRNA、2’−デオキシ−2’−フルオロアラビノ核酸、架橋型核酸(LNA/BNA)などが挙げられる。また、糖部をペプチドに置き換えたペプチド核酸(PNA)、モルフォリノに置き換えたモルフォリノ核酸なども、非天然型核酸の一例として挙げることができる。
リン酸バックボーンが修飾されている非天然型核酸としては、ホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体などが挙げられる。
本発明の製造法における水相(水相とは、水性成分を意味する)は、例えば、核酸を水などの水性成分に溶解させることで得られる。
本発明の工程(2)では、水相と、工程(1)で得られる油相とを混合する。水相と油相とを混合する比率(質量比)は、3.0:1.0〜1.0:1.0が好ましく、1.6:1.0〜1.1:1.0がより好ましい。
水相と油相とを混合する際の温度は、40〜70℃であることが好ましく、45〜65℃であることがより好ましく、50〜60℃であることがさらに好ましい。
また、混合する時間は、液全体が均一になっていることが確認できればよく、特に限定されない。また、加熱時間は、液全体の温度が均一に所望の温度になっていることが確認できればよく、特に限定されない。
また、混合する時間は、液全体が均一になっていることが確認できればよく、特に限定されない。また、加熱時間は、液全体の温度が均一に所望の温度になっていることが確認できればよく、特に限定されない。
[工程(3)]
本発明の製造法は、工程(3):工程(2)で得た油相−水相混合液を冷却し、脂質粒子を晶出する工程を含む。
本発明の製造法は、工程(3):工程(2)で得た油相−水相混合液を冷却し、脂質粒子を晶出する工程を含む。
本発明の工程(3)において、油相−水相混合液の冷却条件は10〜30℃が好ましく、15〜25℃がより好ましい。
また、冷却時間は、特に限定されないが、冷却速度は−3℃/分以下であることが好ましい。
また、冷却時間は、特に限定されないが、冷却速度は−3℃/分以下であることが好ましい。
[工程(4)]
本発明の製造法は、工程(4):工程(3)で得た油相−水相混合液からアルコールおよびエステルを除去する工程を含む
本発明の製造法は、工程(4):工程(3)で得た油相−水相混合液からアルコールおよびエステルを除去する工程を含む
本発明の工程(4)において、油相−水相混合液からアルコールおよびエステルを除去する方法としては、特に限定されず、一般的な手法により除去することができる。
[その他の工程]
本発明の製造法によって得られる脂質粒子は、必要に応じてサイジングを施すことができる。サイジングには、槽内超音波処理またはプローブ超音波処理のいずれかにより脂質粒子を含む液(懸濁液)を超音波処理することにより、粒子径を小さくすることができる。
また、本発明の製造法によって得られる脂質粒子は、必要に応じて濃縮することができる。濃縮には種々の既知の方法を採用することができ、例えば、限外ろ過膜を用いた濃縮方法を挙げることができる。
本発明の製造法によって得られる脂質粒子は、必要に応じてサイジングを施すことができる。サイジングには、槽内超音波処理またはプローブ超音波処理のいずれかにより脂質粒子を含む液(懸濁液)を超音波処理することにより、粒子径を小さくすることができる。
また、本発明の製造法によって得られる脂質粒子は、必要に応じて濃縮することができる。濃縮には種々の既知の方法を採用することができ、例えば、限外ろ過膜を用いた濃縮方法を挙げることができる。
(2)脂質粒子について
本発明において、脂質粒子とは、脂質から構成される粒子を意味し、特に限定されない。本発明の脂質粒子には、脂質二分子膜より構成される閉鎖小胞体であるラメラ構造を持つリポソームが含まれる。リポソームとしては、多重リポソーム(MLV)、小さな一枚膜リポソーム(SUV)、巨大一枚膜リポソームなどの構造が知られているが、特に限定されるものではない。本発明の脂質粒子には、前述のリポソームのような脂質二分子膜構造(ラメラ構造)を持たない、粒子内部も構成成分が詰まった構造を持つ粒子も含まれる。
本発明において、脂質粒子とは、脂質から構成される粒子を意味し、特に限定されない。本発明の脂質粒子には、脂質二分子膜より構成される閉鎖小胞体であるラメラ構造を持つリポソームが含まれる。リポソームとしては、多重リポソーム(MLV)、小さな一枚膜リポソーム(SUV)、巨大一枚膜リポソームなどの構造が知られているが、特に限定されるものではない。本発明の脂質粒子には、前述のリポソームのような脂質二分子膜構造(ラメラ構造)を持たない、粒子内部も構成成分が詰まった構造を持つ粒子も含まれる。
脂質形成の形態は、電子顕微鏡観察またはエックス線を用いた構造解析などにより確認できる。例えば、Cryo透過型電子顕微鏡観察(CryoTEM法)を用いた方法により、リポソームのように脂質粒子が脂質二分子膜構造(ラメラ構造)、内水層を持つ構造、またはリポソームのように脂質粒子が脂質二分子膜構造(ラメラ構造)および内水層を持たず、粒子内部に電子密度が高いコアを持っていることから、脂質をはじめとする構成成分が詰まった構造を有していることなどが確認できる。エックス線小角散乱(SAXS)測定によっても、脂質粒子が脂質二分子膜構造(ラメラ構造)の有無を確認できる。
本発明の脂質粒子の粒子径は特に限定されないが、好ましくは10〜1000nmであり、より好ましくは50〜500nmであり、さらに好ましくは75〜350nmである。脂質粒子の粒子径は、一般的な方法(例えば、動的光散乱法、レーザー回折法など)により測定することができる。
(3)脂質粒子の利用
本発明の製造法によって得られる脂質粒子の一例としては、脂質粒子をin vitroで細胞に導入することによって、細胞に核酸など(例えば、遺伝子など)を導入することができる。また、本発明の製造法によって得られる脂質粒子に、医薬用途を有する核酸を含む場合、脂質粒子は核酸医薬として生体に投与することができる。
本発明の製造法によって得られる脂質粒子の一例としては、脂質粒子をin vitroで細胞に導入することによって、細胞に核酸など(例えば、遺伝子など)を導入することができる。また、本発明の製造法によって得られる脂質粒子に、医薬用途を有する核酸を含む場合、脂質粒子は核酸医薬として生体に投与することができる。
本発明の製造法によって得られる脂質粒子を核酸医薬として使用する場合には、本発明の脂質粒子は単独でまたは薬学的に許容される投与媒体(例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝液)と混合して、生体に投与することができる。
薬学的に許容される担体との混合物中における脂質粒子の濃度は、特に限定されず、一般的には0.05質量%から90質量%とすることができる。また、本発明の脂質粒子を含む核酸医薬は、薬学的に許容される他の添加物質、例えば、pH調整緩衝剤、浸透圧調整剤などを添加してもよい。
薬学的に許容される担体との混合物中における脂質粒子の濃度は、特に限定されず、一般的には0.05質量%から90質量%とすることができる。また、本発明の脂質粒子を含む核酸医薬は、薬学的に許容される他の添加物質、例えば、pH調整緩衝剤、浸透圧調整剤などを添加してもよい。
本発明の脂質粒子を含む核酸医薬をin vivoで投与する際の投与経路は、特に限定されず、任意の方法で投与することができる。投与方法としては、経口投与、非経口投与(関節内投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉投与など)が挙げられる。本発明の脂質粒子を含む核酸医薬は、疾患部位に直接注射することにより投与することもできる。
本発明の脂質粒子の剤形は、特に限定されないが、経口投与を行う場合には、本発明の脂質粒子は、適当な賦形剤と組み合わせて、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、丸剤、懸濁剤、シロップ剤などの形態で使用することができる。また、非経口投与に適した製剤には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬、および等張滅菌注射剤、懸濁化剤、溶解補助剤、粘稠化剤、安定化剤または保存料などの添加剤を適宜含めることができる。
(4)核酸送達キャリア
本発明の製造法によって得られる脂質粒子は、高い内包率で核酸を保持することが可能であるため、核酸送達キャリアとして非常に有用である。本発明の核酸送達キャリアは、例えば、得られた脂質粒子を核酸などと混合して、細胞にin vitroでトランスフェクションをすることにより、細胞に核酸などを導入することができる。また、本発明の核酸送達キャリアは、核酸医薬における核酸送達キャリアとしても有用である。
本発明の製造法によって得られる脂質粒子は、高い内包率で核酸を保持することが可能であるため、核酸送達キャリアとして非常に有用である。本発明の核酸送達キャリアは、例えば、得られた脂質粒子を核酸などと混合して、細胞にin vitroでトランスフェクションをすることにより、細胞に核酸などを導入することができる。また、本発明の核酸送達キャリアは、核酸医薬における核酸送達キャリアとしても有用である。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
また、本発明において、コレステロールは、ディッシュマン社製コレステロールHPを、DPPC(ジパルミトイルホスファチジルコリン)は、日油社製COATSOME MC6060を、DSPE−PEG(ポリエチレングリコール修飾ホスホエタノールアミン、PEG鎖分子量:2000)は、日油社製SUNBRIGHT DSPE−020CNを、レシチンは、日油社製COATSOME NC−50を、使用した。
また、本発明において、コレステロールは、ディッシュマン社製コレステロールHPを、DPPC(ジパルミトイルホスファチジルコリン)は、日油社製COATSOME MC6060を、DSPE−PEG(ポリエチレングリコール修飾ホスホエタノールアミン、PEG鎖分子量:2000)は、日油社製SUNBRIGHT DSPE−020CNを、レシチンは、日油社製COATSOME NC−50を、使用した。
[合成例:式(2)で表される化合物(以下、化合物A)の合成]
第一工程
テトラヒドロフラン230mLに、ジヘキサデシルアミン23gおよびトリエチルアミン5.52gを加え、攪拌しながらBoc-His(1-Boc)-OSU 24.6gを添加し、室温で1時間攪拌し、50℃で5時間攪拌した。その後、テトラヒドロフランを減圧留去し、反応物にクロロホルム450mLおよび水200mLを加えた。有機層を分取し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、10%クエン酸水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=5/1〜3/1)で精製し、油状物の保護体24gを得た。
第一工程
テトラヒドロフラン230mLに、ジヘキサデシルアミン23gおよびトリエチルアミン5.52gを加え、攪拌しながらBoc-His(1-Boc)-OSU 24.6gを添加し、室温で1時間攪拌し、50℃で5時間攪拌した。その後、テトラヒドロフランを減圧留去し、反応物にクロロホルム450mLおよび水200mLを加えた。有機層を分取し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、10%クエン酸水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=5/1〜3/1)で精製し、油状物の保護体24gを得た。
第二工程
トリフルオロ酢酸35mLに、第一工程で得られた保護体21.7gを少しずつ加え、室温で24時間攪拌した。その後、飽和炭酸水素ナトリウム40gを含む水溶液600mLに徐々に添加し、1時間攪拌した。得られた反応液にクロロホルム500mLを加え、有機層を分取し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=10/1)で精製し、無色固体の化合物Aを11.6g得た。化合物の同定は、NMRおよびMSにより行った。
トリフルオロ酢酸35mLに、第一工程で得られた保護体21.7gを少しずつ加え、室温で24時間攪拌した。その後、飽和炭酸水素ナトリウム40gを含む水溶液600mLに徐々に添加し、1時間攪拌した。得られた反応液にクロロホルム500mLを加え、有機層を分取し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=10/1)で精製し、無色固体の化合物Aを11.6g得た。化合物の同定は、NMRおよびMSにより行った。
[実施例1]
(コアセルベーション法)
油相の調製
L−α―ジパルミトイルホスファチジルコリン、レシチン、コレステロール、N−(カルボニル−メトキシポリエチレングリコール2000)−1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンナトリウム塩(以下、DSPE−PEG)を、61/15/20/4のモル比となるように、それぞれ80mg、20mg、14mg、20mg量り取り、エタノールを0.3mL、酢酸エチルを0.7mL加えて溶解させ、油相を得た。
核酸保持脂質粒子の調製
上述の工程で得た油相に、後述のsiRNA5mgを滅菌水0.263mLで溶解した核酸水溶液0.25mL、さらに滅菌水を1.0mL添加し、55℃で10分間加熱した。その後攪拌しながら室温で放冷した。つづいて100mMヒスチジン溶液を用いて室温で透析し、エタノール/酢酸エチル混合溶液を除去した。得られた溶液をエクストルーダー(Avanti Polar Lipids社製Mini Extruder)を用い、0.4μmフィルターを通過させることで整粒し、核酸を保持する脂質粒子を得た。
(コアセルベーション法)
油相の調製
L−α―ジパルミトイルホスファチジルコリン、レシチン、コレステロール、N−(カルボニル−メトキシポリエチレングリコール2000)−1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンナトリウム塩(以下、DSPE−PEG)を、61/15/20/4のモル比となるように、それぞれ80mg、20mg、14mg、20mg量り取り、エタノールを0.3mL、酢酸エチルを0.7mL加えて溶解させ、油相を得た。
核酸保持脂質粒子の調製
上述の工程で得た油相に、後述のsiRNA5mgを滅菌水0.263mLで溶解した核酸水溶液0.25mL、さらに滅菌水を1.0mL添加し、55℃で10分間加熱した。その後攪拌しながら室温で放冷した。つづいて100mMヒスチジン溶液を用いて室温で透析し、エタノール/酢酸エチル混合溶液を除去した。得られた溶液をエクストルーダー(Avanti Polar Lipids社製Mini Extruder)を用い、0.4μmフィルターを通過させることで整粒し、核酸を保持する脂質粒子を得た。
[実施例2]
(コアセルベーション法)
200mMヒスチジン溶液の調製
L−ヒスチジン15.5gを量り取り、500mLの滅菌水で溶解した。pH7となるように200mM HClを添加し、200mMヒスチジン溶液を得た。
油相の調製
L−α―ジパルミトイルホスファチジルコリン、化合物A、コレステロール、DSPE−PEGを、26/26/44/4のモル比となるように、それぞれ37mg、30mg、33mg、20mg量り取り、エタノールを0.3mL、酢酸エチルを0.7mL加えて溶解させ、油相を得た。
核酸保持脂質粒子の調製
上述の工程で得た油相に、後述のsiRNA5mgを滅菌水0.263mLで溶解した核酸水溶液0.25mL、200mMヒスチジン溶液0.625mL、さらに滅菌水を0.375mL添加し、55℃で10分間加熱した。つづいて100mMヒスチジン溶液を用いて室温で透析し、エタノール/酢酸エチル混合溶液を除去した。得られた溶液をエクストルーダー(Avanti Polar Lipids社製Mini Extruder)用い、0.4μmフィルターを通過させることで整粒し、核酸を保持する脂質粒子を得た。
(コアセルベーション法)
200mMヒスチジン溶液の調製
L−ヒスチジン15.5gを量り取り、500mLの滅菌水で溶解した。pH7となるように200mM HClを添加し、200mMヒスチジン溶液を得た。
油相の調製
L−α―ジパルミトイルホスファチジルコリン、化合物A、コレステロール、DSPE−PEGを、26/26/44/4のモル比となるように、それぞれ37mg、30mg、33mg、20mg量り取り、エタノールを0.3mL、酢酸エチルを0.7mL加えて溶解させ、油相を得た。
核酸保持脂質粒子の調製
上述の工程で得た油相に、後述のsiRNA5mgを滅菌水0.263mLで溶解した核酸水溶液0.25mL、200mMヒスチジン溶液0.625mL、さらに滅菌水を0.375mL添加し、55℃で10分間加熱した。つづいて100mMヒスチジン溶液を用いて室温で透析し、エタノール/酢酸エチル混合溶液を除去した。得られた溶液をエクストルーダー(Avanti Polar Lipids社製Mini Extruder)用い、0.4μmフィルターを通過させることで整粒し、核酸を保持する脂質粒子を得た。
[実施例3]
(コアセルベーション法)
油相の調製において、L−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン、化合物A、コレステロール、DSPE−PEGを、26/22/44/8のモル比となるように、それぞれ31mg、31mg、33mg、44mg量り取った以外は、実施例2と同様に調製し、核酸を保持する脂質粒子を得た。
(コアセルベーション法)
油相の調製において、L−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン、化合物A、コレステロール、DSPE−PEGを、26/22/44/8のモル比となるように、それぞれ31mg、31mg、33mg、44mg量り取った以外は、実施例2と同様に調製し、核酸を保持する脂質粒子を得た。
比較例1
(バンガム法)
油相の調製
L−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン、化合物A、コレステロール、DSPE−PEGを、26/26/44/4のモル比となるように、それぞれ37mg、30mg、33mg、20mg量り取り、エタノール0.3mL、酢酸エチル0.7mLを加えて溶解させ、油相を得た。
脂質膜の形成
上述の工程で得た油相をナスフラスコに入れ、エバポレーターでエタノールと酢酸エチルを留去することで脂質膜を得た。
核酸保持脂質粒子の調製
上述のナスフラスコに、後述のsiRNA5mgを滅菌水0.263mLで溶解した核酸水溶液0.25mL、200mMヒスチジン溶液0.625mL、さらに滅菌水0.375mLを添加し、ボルテックスミキサーを用いて55℃で攪拌しながら水和した。得られた液をエクストルーダー(Avanti Polar Lipids社製Mini Extruder)を用い、0.4μmフィルターを通過させることで整粒し、核酸を保持する脂質粒子を得た。
(バンガム法)
油相の調製
L−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン、化合物A、コレステロール、DSPE−PEGを、26/26/44/4のモル比となるように、それぞれ37mg、30mg、33mg、20mg量り取り、エタノール0.3mL、酢酸エチル0.7mLを加えて溶解させ、油相を得た。
脂質膜の形成
上述の工程で得た油相をナスフラスコに入れ、エバポレーターでエタノールと酢酸エチルを留去することで脂質膜を得た。
核酸保持脂質粒子の調製
上述のナスフラスコに、後述のsiRNA5mgを滅菌水0.263mLで溶解した核酸水溶液0.25mL、200mMヒスチジン溶液0.625mL、さらに滅菌水0.375mLを添加し、ボルテックスミキサーを用いて55℃で攪拌しながら水和した。得られた液をエクストルーダー(Avanti Polar Lipids社製Mini Extruder)を用い、0.4μmフィルターを通過させることで整粒し、核酸を保持する脂質粒子を得た。
[比較例2]
(コアセルベーション法)
油相の調製において、エタノール0.3mLおよび酢酸エチル0.7mLの混合液を、エタノール1mLに替えて溶解した以外は、実施例2と同様に調製し、核酸を保持する脂質粒子を得た。
(コアセルベーション法)
油相の調製において、エタノール0.3mLおよび酢酸エチル0.7mLの混合液を、エタノール1mLに替えて溶解した以外は、実施例2と同様に調製し、核酸を保持する脂質粒子を得た。
[比較例3]
(バンガム法)
油相の調製
L−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン、化合物A、コレステロール、DSPE−PEGを、61/15/20/4のモル比となるように、それぞれ80mg、20mg、14mg、20mg量り取り、クロロホルム1.0mLを加えて溶解させ、油相を得た。
脂質膜の形成
上述の工程で得た油相をナスフラスコに入れ、エバポレーターでエタノールと酢酸エチルを留去することで脂質膜を得た。
核酸保持脂質粒子の調製
上述のナスフラスコに、後述のsiRNA5mgを滅菌水0.263mLで溶解した核酸水溶液0.25mL、さらに滅菌水1.0mLを添加し、ボルテックスミキサーを用いて55℃で攪拌しながら水和した。得られた液をエクストルーダー(Avanti Polar Lipids社製Mini Extruder)を用い、0.4μmフィルターを通過させることで整粒し、核酸を保持する脂質粒子を得た。
(バンガム法)
油相の調製
L−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン、化合物A、コレステロール、DSPE−PEGを、61/15/20/4のモル比となるように、それぞれ80mg、20mg、14mg、20mg量り取り、クロロホルム1.0mLを加えて溶解させ、油相を得た。
脂質膜の形成
上述の工程で得た油相をナスフラスコに入れ、エバポレーターでエタノールと酢酸エチルを留去することで脂質膜を得た。
核酸保持脂質粒子の調製
上述のナスフラスコに、後述のsiRNA5mgを滅菌水0.263mLで溶解した核酸水溶液0.25mL、さらに滅菌水1.0mLを添加し、ボルテックスミキサーを用いて55℃で攪拌しながら水和した。得られた液をエクストルーダー(Avanti Polar Lipids社製Mini Extruder)を用い、0.4μmフィルターを通過させることで整粒し、核酸を保持する脂質粒子を得た。
siRNAは以下の配列のものを使用した。
5’−GUUCAGACCACUUCAGCUU−3’(sense鎖)(配列番号1)
3’−CAAGUCUGGUGAAGUCGAA−5’(antisense鎖)(配列番号2)
5’−GUUCAGACCACUUCAGCUU−3’(sense鎖)(配列番号1)
3’−CAAGUCUGGUGAAGUCGAA−5’(antisense鎖)(配列番号2)
脂質粒子の粒径測定
脂質粒子の粒径は、脂質粒子分散液を、大塚電子(株)製のゼータ電位・粒径測定システムELS−Z2を用いて、原液のまま測定した。
脂質粒子の粒径は、脂質粒子分散液を、大塚電子(株)製のゼータ電位・粒径測定システムELS−Z2を用いて、原液のまま測定した。
siRNAの内包率の評価
(総核酸濃度定量)
核酸を保持する脂質粒子0.02mLに、3M酢酸アンモニウム水溶液0.01mLとグリコーゲン0.003mLを添加し、つづいてエタノール0.5mLを添加することで、脂質を溶解し、核酸のみを沈殿させた。−20℃で2時間静置後、14000×g、4℃の条件で15分間遠心し、上清を除去した。15分以上風乾させた後、水を加えて再溶解させ、ナノドロップNF1000(Thermo Fisher Scientific社)を用いて濃度測定することで、総核酸濃度を定量した。
(総核酸濃度定量)
核酸を保持する脂質粒子0.02mLに、3M酢酸アンモニウム水溶液0.01mLとグリコーゲン0.003mLを添加し、つづいてエタノール0.5mLを添加することで、脂質を溶解し、核酸のみを沈殿させた。−20℃で2時間静置後、14000×g、4℃の条件で15分間遠心し、上清を除去した。15分以上風乾させた後、水を加えて再溶解させ、ナノドロップNF1000(Thermo Fisher Scientific社)を用いて濃度測定することで、総核酸濃度を定量した。
(外水相における核酸濃度の定量)
Quant−iT RiboGreen RNA Assay Kit(Invitrogen)を用い、マニュアル&プロトコルに記載のlow−range assayに従って定量した。まず、上述のキットに含まれる20×TEバッファーを水で希釈し、1×TEバッファーとした。外水相の核酸のみを定量するため、核酸を保持する脂質粒子0.005mLに1×TEバッファーを0.095mL添加し、20倍希釈液を調整した。つづいて、20倍希釈液0.1mLに1×TEバッファーを1.99mL添加することで、核酸を保持する脂質粒子を破壊せず、TEバッファーで4000倍に希釈したサンプルを得た。
RiboGreen試薬原液0.009mLに、1×TEバッファー1.791mLを添加し、200倍希釈液を調整し、つづいて200倍希釈液0.22mLに1×TEバッファー1.98mLを添加することで、2000倍に希釈したRiboGreen試薬を得た。
4000倍に希釈したサンプル0.1mLを、96ウェルプレートに入れ、つづいて2000倍に希釈したRiboGreen試薬0.1mLをサンプルに加え、プレートリーダーInfinit EF200(TECAN)を用いて蛍光(励起波長 485nm、蛍光波長 535nm)を測定することで、外水相における核酸濃度を定量した。
Quant−iT RiboGreen RNA Assay Kit(Invitrogen)を用い、マニュアル&プロトコルに記載のlow−range assayに従って定量した。まず、上述のキットに含まれる20×TEバッファーを水で希釈し、1×TEバッファーとした。外水相の核酸のみを定量するため、核酸を保持する脂質粒子0.005mLに1×TEバッファーを0.095mL添加し、20倍希釈液を調整した。つづいて、20倍希釈液0.1mLに1×TEバッファーを1.99mL添加することで、核酸を保持する脂質粒子を破壊せず、TEバッファーで4000倍に希釈したサンプルを得た。
RiboGreen試薬原液0.009mLに、1×TEバッファー1.791mLを添加し、200倍希釈液を調整し、つづいて200倍希釈液0.22mLに1×TEバッファー1.98mLを添加することで、2000倍に希釈したRiboGreen試薬を得た。
4000倍に希釈したサンプル0.1mLを、96ウェルプレートに入れ、つづいて2000倍に希釈したRiboGreen試薬0.1mLをサンプルに加え、プレートリーダーInfinit EF200(TECAN)を用いて蛍光(励起波長 485nm、蛍光波長 535nm)を測定することで、外水相における核酸濃度を定量した。
(内包率の算出)
上述の工程で得られた総核酸濃度および外水相での濃度の定量結果を用いて、下記式に従って、実施例1〜3、比較例1〜3の核酸を保持する脂質粒子の内包率を算出した。
内包率(%)=(総核酸濃度−外水相における核酸濃度)÷総核酸濃度×100
上述の工程で得られた総核酸濃度および外水相での濃度の定量結果を用いて、下記式に従って、実施例1〜3、比較例1〜3の核酸を保持する脂質粒子の内包率を算出した。
内包率(%)=(総核酸濃度−外水相における核酸濃度)÷総核酸濃度×100
結果を表1に表す。
表1に示すように、コアセルベーション法により調整した脂質粒子は、少なくとも1つのアミノ基と少なくとも1つのイミダゾイル基を有する化合物を使用しなくても、従来の調整法であるバンガム法に比べて、予想外に内包率が向上することが判明した。また、実施例2および3のように、少なくとも1つのアミノ基と少なくとも1つのイミダゾイル基を有する化合物を用いて、コアセルベーション法により得られた核酸を保持する脂質粒子は、非常に高い内包率を有することが分かった。
Claims (8)
- 下記(1)〜(4)の工程:
(1)リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を加熱する工程;
(2)核酸を含む水相と、工程(1)で調製した油相を混合する工程;
(3)工程(2)で得た油相および水相を含む混合液を冷却し、脂質粒子を晶出する工程;および
(4)工程(3)で得た油相および水相を含む混合液からアルコールおよびエステルを除去する工程、
を含む、核酸を内包した脂質粒子の製造法。 - アルコールが炭素数1〜6のアルコールである、請求項1に記載の脂質粒子の製造法。
- エステルが酢酸エステルである、請求項1または2に記載の脂質粒子の製造法。
- 工程(1)において、油相が、少なくとも1つのアミノ基と少なくとも1つのイミダゾイル基を有する化合物をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の脂質粒子の製造法。
- 工程(1)において、リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を40〜70℃で加熱する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の脂質粒子の製造法。
- 工程(3)において、油相および水相を含む混合液を10〜30℃で冷却する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の脂質粒子の製造法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の製造法によって得られる脂質粒子を有する核酸送達キャリア。
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