JP2016010318A - Method and kit for dna typing of hla gene - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、大量並列シークエンサーを用いたHLA遺伝子のDNAタイピングのための方法及びキットに関する。 The present invention relates to a method and kit for DNA typing of HLA genes using a massively parallel sequencer.
ヒトの主要組織適合遺伝子複合体(Major Histocompatibility Complex;MHC)であるヒト白血球抗原(Human Leukocyte Antigen;HLA)は、病原体等の外来タンパク質由来ペプチド、および自己タンパク質由来ペプチドをT細胞に提示することにより免疫応答の誘導に深く関わっているが、主なものとして6種類の抗原が知られている。ほぼすべての細胞で発現しているクラスI分子(HLA−A、HLA−B、HLA−C)と、主として免疫系の細胞で発現しているクラスII分子(HLA−DR、HLA−DQ、HLA−DP)である。 Human leukocyte antigen (HLA), which is a major human histocompatibility complex (MHC), presents peptides derived from foreign proteins such as pathogens and self-protein-derived peptides to T cells. Although deeply involved in the induction of an immune response, six types of antigens are known as main ones. Class I molecules (HLA-A, HLA-B, HLA-C) expressed in almost all cells and class II molecules (HLA-DR, HLA-DQ, HLA) expressed mainly in cells of the immune system -DP).
HLAクラスI抗原は高度な多型性を示すα鎖と多型性がほとんど無いβ2−ミクログロブリンからなり、HLAクラスII抗原は高度な多型が存在するβ鎖と多型性が少ないα鎖から成る。クラスI分子のα鎖はHLA−A、HLA−B、HLA−Cの各遺伝子にコードされ、クラスII抗原のβ鎖はHLA−DRB1、HLA−DQB1、HLA−DPB1、α鎖はHLA−DRA1、HLA−DQA1、HLA−DPA1遺伝子にコードされている。遺伝子レベルでは、HLAクラスI抗原ではα鎖をコードしている遺伝子のエクソン2とエクソン3が高度な多型性を示し、HLAクラスII抗原ではβ鎖をコードしている遺伝子のエクソン2が高度な多型性を示す。 HLA class I antigen is composed of α-chain showing high polymorphism and β2-microglobulin with almost no polymorphism, and HLA class II antigen is β-chain with high polymorphism and α-chain with little polymorphism. Consists of. Α chain of class I molecule is encoded by HLA-A, HLA-B and HLA-C genes, β chain of class II antigen is HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DPB1, and α chain is HLA-DRA1 , HLA-DQA1, and HLA-DPA1 gene. At the gene level, exon 2 and exon 3 of the gene encoding the α chain show high polymorphism in the HLA class I antigen, and exon 2 of the gene encoding the β chain in the HLA class II antigen is advanced. Show polymorphism.
HLAをコードしている遺伝子領域はヒト第6染色体短腕部6p21.3に位置し、テロメア側からセントロメア側に向けて、クラスI領域(HLA−A、HLA−C、HLA−B等)、クラスIII領域、クラスII領域(HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DQA1、HLA−DQB1、HLA−DPA1、HLA−DPB1等)の順に並び、多くの遺伝子が非常に高い密度でコードされており、輸血や移植及び様々な疾患との関連性が報告されてきている。クラスIII領域にはHLA遺伝子は存在せず、補体成分や腫瘍壊死因子(Tumor Necrosis Factor;TNF)等の遺伝子が存在している。 The gene region encoding HLA is located in human chromosome 6 short arm 6p21.3, class I region (HLA-A, HLA-C, HLA-B, etc.) from the telomere side toward the centromere side, Class III region, class II region (HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, etc.) are arranged in this order, and many genes are encoded at very high density. The relationship between blood transfusion and transplantation and various diseases has been reported. There is no HLA gene in the class III region, and genes such as complement components and tumor necrosis factor (TNF) are present.
HLA−DR抗原のβ鎖をコードするHLA−DRB遺伝子領域には5種類の構造多型が確認されている。DR1型やDR10型では、同一染色体上にHLA−DRB1の他にHLA−DRB6やHLA−DRB9などの偽遺伝子が位置する。DR2型では、同一染色体上にHLA−DRB1の他にHLA−DRB5(DR51)遺伝子やHLA−DRB6やHLA−DRB9などの偽遺伝子が位置する。DR3、DR5およびDR6型では、HLA−DRB1の他に同一染色体上にHLA−DRB3(DR52)遺伝子やHLA-DRB2やHLA−DRB9などの偽遺伝子が位置する。DR4、DR7およびDR9型では、HLA−DRB1の他に同一染色体上にHLA−DRB4(DR53)遺伝子やHLA-DRB7、HLA-DRB8やHLA−DRB9などの偽遺伝子が位置する。これらに対して、DR8型では、同一染色体上にHLA−DRB1以外のHLA−DRB遺伝子は位置しない。 Five structural polymorphisms have been confirmed in the HLA-DRB gene region encoding the β chain of the HLA-DR antigen. In DR1 type and DR10 type, pseudogenes such as HLA-DRB6 and HLA-DRB9 are located on the same chromosome in addition to HLA-DRB1. In DR2 type, HLA-DRB5 (DR51) gene and pseudogenes such as HLA-DRB6 and HLA-DRB9 are located on the same chromosome in addition to HLA-DRB1. In DR3, DR5 and DR6 types, in addition to HLA-DRB1, pseudogenes such as HLA-DRB3 (DR52) gene, HLA-DRB2 and HLA-DRB9 are located on the same chromosome. In the DR4, DR7, and DR9 types, in addition to HLA-DRB1, pseudogenes such as HLA-DRB4 (DR53) gene, HLA-DRB7, HLA-DRB8, and HLA-DRB9 are located on the same chromosome. In contrast, in the DR8 type, no HLA-DRB gene other than HLA-DRB1 is located on the same chromosome.
各アリルのエクソンには多型性を示す複数の領域が存在し、ある多型領域の塩基配列(アミノ酸配列)が、複数のアリルに共通であることも多い。すなわち各HLAアリルは複数の多型領域の組み合わせにより規定される。HLAクラスI抗原ではエクソン内の多型領域のみならず、同一の塩基配列をもつエクソン2あるいはエクソン3が、複数のアリルに共通であることもある。 Each allele exon has a plurality of regions exhibiting polymorphisms, and the base sequence (amino acid sequence) of a certain polymorphic region is often common to a plurality of alleles. That is, each HLA allele is defined by a combination of multiple polymorphic regions. In the HLA class I antigen, exon 2 or exon 3 having the same base sequence as well as the polymorphic region in the exon may be common to a plurality of alleles.
HLAには高度な多型が存在するため対立遺伝子(アリル)の種類が極めて多いことも知られ、それらの表記法も決められている。即ち、血清学的HLA型を判別する第1区域(2桁レベル)、同一の血清学的HLA型内でアミノ酸置換を伴うアリルを判別する第2区域(4桁レベル)、アミノ酸変異を伴わない塩基置換が認められるアリルを判別する第3区域(6桁レベル)、及びHLA分子をコードする遺伝子領域外(イントロン)での塩基置換を伴うアリルを判別する第4区域(8桁レベル)である。 It is known that HLA has a high degree of polymorphism, so that there are an extremely large number of alleles (alleles), and their notation is also determined. That is, the first zone for discriminating serological HLA type (2 digit level), the second zone for discriminating alleles with amino acid substitution within the same serological HLA type (4 digit level), and no amino acid mutation The third zone (6 digit level) that discriminates alleles in which base substitution is recognized, and the fourth zone (8 digit level) that discriminates alleles with base substitution outside the gene region encoding the HLA molecule (intron). .
骨髄移植の際には、移植希望者とドナーのHLAタイプが4桁レベルで完全適合すれば移植の成功率が向上し、重度のGVHD頻度が低下すると言われている。逆に、HLA型が4桁レベルで不一致であると拒絶反応が起こる等の不具合を生じる危険性が高くなる。従って、HLAタイピングを正確かつ高精度に実施することが臨床的にも極めて重要である。 In bone marrow transplantation, it is said that the success rate of transplantation will improve and the frequency of severe GVHD will decrease if the HLA type of the transplant candidate and donor perfectly match at the 4-digit level. Conversely, if the HLA type is inconsistent at the 4-digit level, there is a high risk of inconvenience such as rejection. Therefore, it is extremely important clinically to perform HLA typing accurately and with high accuracy.
HLA遺伝子におけるDNAタイピング法として、ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction;PCR)に基づくSBT(Sequence Based Typing)法やSSO(Sequence Specific Oligonucleotide)−Luminex法が主流となっている。
これら従来のDNAタイピング法は、多数のサンプルを迅速にタイピングできるという長所はあるが、多型領域やクラスI遺伝子の場合はエクソンの染色体上のシス・トランスの位置関係を正確に決めることができないこともあるため、フェーズ・アンビギュイティ(phase ambiguity)が生じ、高精度なHLAタイピングが難しい場合があった。
また、従来の方法は、各遺伝子のエクソン領域を中心とするPCRを用いたDNAタイピング法であるため、イントロン領域やプロモーター領域における塩基置換を見逃してしまい、その結果、遺伝子構造は他の発現HLA遺伝子と変わらないが、発現が抑制されるヌル(null)アリルの検出を見逃す可能性があった。
As DNA typing methods in HLA genes, SBT (Sequence Based Typing) method based on polymerase chain reaction (PCR) and SSO (Sequence Specific Oligotide) -Luminex method are mainly used.
These conventional DNA typing methods have the advantage of being able to rapidly type a large number of samples, but in the case of polymorphic regions and class I genes, the positional relationship of cis-trans on the exon chromosome cannot be determined accurately. In some cases, phase ambiguity occurs, and high-precision HLA typing may be difficult.
Moreover, since the conventional method is a DNA typing method using PCR centering on the exon region of each gene, it misses base substitution in the intron region and the promoter region, and as a result, the gene structure has other expression HLA. It was possible to miss the detection of a null allele that is not different from the gene but whose expression is suppressed.
本発明は、フェーズ・アンビギュイティに由来する曖昧さを排除した高精度のDNAタイピング方法及びキットを提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a highly accurate DNA typing method and kit that eliminates ambiguity derived from phase ambiguity.
本発明者らは、クラスIのHLA分子であるHLA−A、HLA−B及びHLA−CならびにクラスIIのHLA分子であるHLA−DRB1、HLA−DQB1及びHLA−DPB1の6座について、それらのHLA遺伝子を特異的に増幅しうるPCRプライマーを新たに設計し、好適なPCR条件を設定して、大量並列シークエンシング技術を駆使するという新しい着想に基づき、上記課題を解決すべく検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。 We have identified the six loci of the class I HLA molecules HLA-A, HLA-B and HLA-C and the class II HLA molecules HLA-DRB1, HLA-DQB1 and HLA-DPB1. Based on the new idea of designing a new PCR primer that can specifically amplify the HLA gene, setting suitable PCR conditions, and making full use of massively parallel sequencing technology, we studied to solve the above problems As a result, the present invention has been completed.
即ち本発明は、以下のステップを含むHLAのDNAタイピング方法を提供する。
(1)ヒトゲノム塩基配列におけるHLA−A、HLA−B,HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DPB1及びHLA−DQB1の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセット(配列番号1〜12)を準備するステップ;
(2)前記プライマーセットを用いて被検試料(DNA)をPCR増幅するステップ;
(3)PCR増幅された産物の塩基配列を決定するステップ;及び
(4)データベースとのホモロジー検索を実施するステップ。
That is, the present invention provides an HLA DNA typing method including the following steps.
(1) Primer sets (sequences) that specifically anneal to the upstream region and the downstream region of each gene of HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, and HLA-DQB1 in the human genome sequence Preparing steps 1-12);
(2) PCR-amplifying a test sample (DNA) using the primer set;
(3) determining the base sequence of the PCR amplified product; and (4) performing a homology search with the database.
本発明の方法は1分子からのHLA遺伝子の6座位のDNAタイピングに必要な全塩基配列が得られるので、シス・トランスの位置関係が不明なフェーズ・アンビギュイティが排除された究極のDNAタイピング法である。これにより、移植の際の移植希望者とドナー候補との間における高精度なHLAの一致が実現される。
HLA遺伝子のプロモーター領域、エクソン領域、イントロン領域など周辺領域を含む遺伝子全塩基配列が決定されるので、全く発現していない、あるいは発現が抑制されているnullアリルや新規アリルの検出が可能となる。
The method of the present invention provides the entire base sequence necessary for DNA typing of the 6-locus of the HLA gene from one molecule, so that the ultimate DNA typing in which phase ambiguity with unknown cis-trans positional relationship is eliminated Is the law. As a result, high-accuracy HLA matching between the transplant candidate and the donor candidate at the time of transplantation is realized.
Since the entire nucleotide sequence of the gene including peripheral regions such as the promoter region, exon region, and intron region of the HLA gene is determined, it becomes possible to detect null alleles or novel alleles that are not expressed at all or whose expression is suppressed. .
以下、本発明のDNAタイピング方法をステップ毎に詳細に説明する。
(1)プライマーセット準備ステップ
本発明のDNAタイピング方法においては、まず、ヒトゲノム塩基配列におけるHLA−A、HLA−B,HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DPB1及びHLA−DQB1の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセット(配列番号1〜12)を準備する。
HLA遺伝子が存在する領域を含むヒト第6染色体(6p21.3)のゲノム塩基配列は既に解明されており、その遺伝子構造及び発現産物(HLA分子)の構造との関連も知られている(図1と図2参照)。
Hereinafter, the DNA typing method of the present invention will be described in detail step by step.
(1) Primer set preparation step In the DNA typing method of the present invention, first, upstream of each gene of HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, and HLA-DQB1 in the human genome base sequence. A primer set (SEQ ID NO: 1 to 12) that specifically anneals to the region and the downstream region is prepared.
The genomic base sequence of human chromosome 6 (6p21.3) including the region where the HLA gene is present has already been elucidated, and the relationship between the gene structure and the structure of the expression product (HLA molecule) is also known (Fig. 1 and FIG. 2).
即ち、古典的HLAクラスI分子と言われるHLA−A、HLA−B及びHLA−Cの遺伝子は7個又は8個のエクソンを含んでおり(図1(a))、エクソン1の外側には2種類のエンハンサーやプロモーター領域があって発現が調節されている(図1(b))。
さらに、エクソン2、3及び4において多型領域が多数存在することも知られているため、従来のDNAタイピング方法では、特にエクソン2及び3に基づいて作成されたプライマーを用いたPCRが行なわれ、それに伴って前述したようにフェーズ・アンビギュイティの問題が生じていた。
また、古典的HLAクラスII分子と言われるHLA−DR、HLA−DQ及びHLA−DPはα鎖とβ鎖から構成され、それぞれの遺伝子は5個又は6個のエクソンを含んでおり(図2(a))、エクソン1の外側にはプロモーター領域があって発現が調節されている(図2(b))。
さらに、エクソン2及び3において多型領域が多数存在することも知られているため、従来のDNAタイピング方法では、特にエクソン2に基づいて作成されたプライマーを用いたPCRが行なわれ、それに伴って前述したようにフェーズ・アンビギュイティの問題が生じていた。
That is, HLA-A, HLA-B and HLA-C genes, which are called classical HLA class I molecules, contain 7 or 8 exons (FIG. 1 (a)), and outside of exon 1 There are two types of enhancers and promoter regions, and expression is regulated (FIG. 1 (b)).
Furthermore, since it is known that there are many polymorphic regions in exons 2, 3 and 4, the conventional DNA typing method particularly performs PCR using primers prepared based on exons 2 and 3. As a result, the phase ambiguity problem has arisen as described above.
HLA-DR, HLA-DQ, and HLA-DP, which are said to be classical HLA class II molecules, are composed of an α chain and a β chain, and each gene contains 5 or 6 exons (FIG. 2). (A)), the promoter region is located outside exon 1, and expression is regulated (FIG. 2 (b)).
Furthermore, since it is also known that there are a large number of polymorphic regions in exons 2 and 3, in the conventional DNA typing method, PCR using a primer prepared based on exon 2 is performed. As mentioned above, there was a phase ambiguity problem.
本発明では、古典的クラスI分子(HLA−A,HLA−B,HLA−C)ならびに古典的クラスII分子のHLA−DRB1、HLA−DPB1及びHLA−DQB1の遺伝子領域の全て(エクソンのみならず、イントロン、5’側と3’側の非翻訳領域、プロモーター領域も含む)をPCR増幅できるプライマーセットを調製し、それを用いてPCR増幅したPCR産物を後述する次世代シークエンシングに供するので、フェーズ・アンビギュイティ等の不確実さを排除でき、nullアリルの有無も正確に検知することができる。 In the present invention, all of the gene regions of classical class I molecules (HLA-A, HLA-B, HLA-C) and classical class II molecules HLA-DRB1, HLA-DPB1, and HLA-DQB1 (not only exons) Intron, 5 'and 3' untranslated regions, including a promoter region), a primer set capable of PCR amplification is prepared, and PCR amplified PCR products are used for next-generation sequencing described below. Uncertainties such as phase ambiguity can be eliminated, and the presence or absence of null allyl can be accurately detected.
具体的には、下記表1に掲げるPCRプライマーセットを調製する。
表1における配列番号1及び2は、MHCクラスIα鎖であるHLA−A遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−A遺伝子の全領域(プロモーター、エクソン及びイントロンを含む)を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。 SEQ ID NOs: 1 and 2 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-A gene, which is an MHC class I α chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-A gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
配列番号1は、ヒトゲノム塩基配列のHLA領域におけるテロメア側から第29,910,189番目から第29,910,212番目に相当する塩基配列を持つフォワード・プライマーである。
配列番号2は、ヒトゲノム塩基配列列のHLA領域におけるテロメア側から第29,913,562番目から第29,913,586番目に相当する塩基に相補的な塩基配列を持つリバース・プライマーである。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約3,398塩基(bp)である。
SEQ ID NO: 1 is a forward primer having a nucleotide sequence corresponding to positions 29,910,189 to 29,910,212 from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence.
SEQ ID NO: 2 is a reverse primer having a base sequence complementary to the bases corresponding to the 29,913,562th position to the 29,913,586th position from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence sequence.
The expected length of PCR products obtained using these primer sets is about 3,398 bases (bp).
表1における配列番号3及び4は、MHCクラスIα鎖であるHLA−B遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−B遺伝子の全領域(プロモーター、エクソン及びイントロンを含む)を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。 Sequence numbers 3 and 4 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-B gene, which is an MHC class I α chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-B gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
配列番号3は、ヒトゲノム塩基配列のHLA領域におけるテロメア側から31,321,366 番目から第31,321,392番目に相当する塩基配列を持つフォワード・プライマーである。
配列番号4は、ヒトゲノム塩基配列列のHLA領域におけるテロメア側から第31,325,632番目から第31,325,661番目に相当する塩基に相補的な塩基配列を持つリバース・プライマーである。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約4,296塩基(bp)である
SEQ ID NO: 3 is a forward primer having a base sequence corresponding to the 31,321,366th position to the 31,321,392th position from the telomere side in the HLA region of the human genome base sequence.
SEQ ID NO: 4 is a reverse primer having a base sequence complementary to the base corresponding to the 31st, 325, 632rd to 31st, 325, 661th from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence sequence.
The expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 4,296 bases (bp)
表1における配列番号5及び6は、MHCクラスIα鎖であるHLA−C遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−C遺伝子の全領域(プロモーター、エクソン及びイントロンを含む)を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。 SEQ ID NOs: 5 and 6 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-C gene that is an MHC class I α chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-C gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
配列番号5は、ヒトゲノム塩基配列のHLA領域におけるテロメア側から第31,235,959番目から第31,235,982番目に相当する塩基配列を持つフォワード・プライマーである。
配列番号6は、ヒトゲノム塩基配列列のHLA領域におけるテロメア側から第31,240,373番目から第31,240,398番目に相当する塩基に相補的な塩基配列を持つリバース・プライマーである。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約4,440塩基(bp)である。
SEQ ID NO: 5 is a forward primer having a nucleotide sequence corresponding to the 31,235,959th position to the 31,235,982nd position from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence.
SEQ ID NO: 6 is a reverse primer having a base sequence complementary to the base corresponding to the 31,240,373rd to 31,240,398th from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence sequence.
The expected length of PCR products obtained using these primer sets is about 4,440 bases (bp).
表1における配列番号7及び8は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DRB1遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DRB1遺伝子の全領域(プロモーター、エクソン及びイントロンを含む)を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。 SEQ ID NOs: 7 and 8 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DRB1 gene, which is an MHC class II β chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-DRB1 gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
配列番号7は、ヒトゲノム塩基配列のHLA領域におけるテロメア側から第32,546,220番目から第32,546,247番目に相当する塩基配列を持つフォワード・プライマーである。
配列番号8は、ヒトゲノム塩基配列列のHLA領域におけるテロメア側から第32,558,090番目から第32,558,118番目に相当する塩基に相補的な塩基配列を持つリバース・プライマーである。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約11,899塩基(bp)である。
SEQ ID NO: 7 is a forward primer having a nucleotide sequence corresponding to the 32,546,220th position to the 32,546,247th position from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence.
SEQ ID NO: 8 is a reverse primer having a base sequence complementary to a base corresponding to the 32,558,090th position to the 32,558,118th position from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence sequence.
The expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 11,899 bases (bp).
表1における配列番号9と10は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DPB1遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DPB1遺伝子の全領域(プロモーター、エクソン及びイントロンを含む)を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。 SEQ ID NOs: 9 and 10 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DPB1 gene, which is an MHC class II β chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-DPB1 gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
配列番号9は、ヒトゲノム塩基配列のHLA領域におけるテロメア側から第33,042,795番目から第33,042,823番目に相当する塩基配列を持つフォワード・プライマーである。
配列番号10は、ヒトゲノム塩基配列列のHLA領域におけるテロメア側から第33,056,373番目から第33,056,399番目に相当する塩基に相補的な塩基配列を持つリバース・プライマーである。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約13,605塩基(bp)である。
SEQ ID NO: 9 is a forward primer having a nucleotide sequence corresponding to the 33,042,795th position to the 33,042,823th position from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence.
SEQ ID NO: 10 is a reverse primer having a base sequence complementary to the base corresponding to the 33,056,373rd to 33,056,399th from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence sequence.
The expected length of the PCR product obtained using these primer sets is approximately 13,605 bases (bp).
表1における配列番号11と12は、はMHCクラスIIβ鎖であるHLA−DQB1遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DQB1遺伝子の全領域(プロモーター、エクソン及びイントロンを含む)を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。 SEQ ID NOs: 11 and 12 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DQB1 gene, which is an MHC class II β chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-DQB1 gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
配列番号11は、ヒトゲノム塩基配列のHLA領域におけるテロメア側から第32,627,718番目から第32,627,743番目に相当する塩基配列を持つフォワード・プライマーである。
配列番号12は、ヒトゲノム塩基配列列のHLA領域におけるテロメア側から第32,634,812番目から第32,634,835番目に相当する塩基に相補的な塩基配列を持つリバース・プライマーである。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約7,118塩基(bp)である。
SEQ ID NO: 11 is a forward primer having a nucleotide sequence corresponding to the 32,627,718th position to the 32,627,743th position from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence.
SEQ ID NO: 12 is a reverse primer having a base sequence complementary to the base corresponding to the 32,634,812th position to the 32,634,835th position from the telomere side in the HLA region of the human genome sequence sequence.
The expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 7,118 bases (bp).
これらのプライマーは、当該分野で通常用いられている手法により調製することができる。また、表1に記載したプライマーセットは最も好ましい例を示したものであり、本発明の方法においては、HLAの各遺伝子全領域を上流側及び下流側から挟み込む位置にアニール可能なフォワード(Forward)プライマーとリバース(Reverse)プライマーとのセットであれば、配列番号1〜12に示した塩基配列に、1から数個の塩基の置換、挿入又は欠損を有するものを同様に使用することができる。 These primers can be prepared by techniques usually used in the art. In addition, the primer set shown in Table 1 shows the most preferable example. In the method of the present invention, forward (Forward) in which the entire region of each gene of HLA can be annealed at a position between the upstream side and the downstream side. In the case of a set of a primer and a reverse primer, those having 1 to several base substitutions, insertions or deletions in the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 can be used in the same manner.
(2)PCR増幅ステップ
本発明の方法では、前記ステップ(1)で準備したプライマーセットを用い、被検試料(DNA)をPCR増幅する。
PCR増幅反応は、通常のプロトコールに従って実施される。具体的には次の通りである。
1.被検試料の形態に応じて、当該試料からDNAを抽出する。
2.抽出したDNAを定量し、適宜プライマー濃度を設定して反応液を調製する。
3.反応条件を設定してPCR反応を実施する。
例:熱変性ステップ(通常は92〜97℃)
アニーリングステップ(通常は55〜72℃)
伸長ステップ(通常は65〜80℃)
4.得られたPCR産物を精製し、次の塩基配列決定ステップに供する。
(2) PCR amplification step In the method of the present invention, the test sample (DNA) is PCR amplified using the primer set prepared in step (1).
The PCR amplification reaction is performed according to a normal protocol. Specifically, it is as follows.
1. DNA is extracted from the sample according to the form of the test sample.
2. The extracted DNA is quantified, and a primer solution is appropriately set to prepare a reaction solution.
3. Set the reaction conditions and perform the PCR reaction.
Example: Thermal denaturation step (usually 92-97 ° C)
Annealing step (usually 55-72 ° C)
Elongation step (usually 65-80 ° C)
4). The obtained PCR product is purified and subjected to the next nucleotide sequencing step.
(3)塩基配列決定ステップ。
次に、前記ステップ(2)で生成されたPCR産物(増幅DNA)の塩基配列を決定する。このステップは、いわゆる次世代シークエンス(あるいは超高速シークエンス)と呼ばれている手法を用いて実施するのが好ましい。次世代シークエンスに関しては、例えば、「実験医学」第27巻、第1号、2009年(羊土社)等を参照されたい。
(3) A base sequence determination step.
Next, the base sequence of the PCR product (amplified DNA) generated in step (2) is determined. This step is preferably performed by using a so-called next-generation sequence (or ultra-high speed sequence). For the next-generation sequence, see, for example, “Experimental Medicine” Vol. 27, No. 1, 2009 (Yodosha).
例えば、イルミナ(illumina)社のNextra(TM)DNAサンプル調製キットでDNAライブラリーを作製し、ゲノムシークエンサーMiSeqシステム(イルミナ社)を用いて配列決定する方法などが挙げられる。
この方法では、トランスポソームを解するDNAの断片化とアダプター結合が同時に行われるので、ライブラリーの調製が約90分以内という短時間で実施できる。得られたサンプルのシークエンシングには、好ましくはペアエンド解析が用いられる。
For example, a method of preparing a DNA library with Illumina's Nextra ™ DNA sample preparation kit and sequencing it using the genome sequencer MiSeq system (Illumina), and the like.
In this method, since DNA fragmentation to transposome and adapter binding are performed simultaneously, the library can be prepared in a short time of about 90 minutes or less. Paired end analysis is preferably used for sequencing the obtained sample.
(4)DNAタイピングステップ
次いで、前記ステップ(3)で得られた塩基配列を、既知のHLA対立遺伝子の塩基配列データベースのデータと比較することにより、被検試料に含まれていたDNAのアリル型(8桁まで)が決定される。
(4) DNA typing step Next, by comparing the base sequence obtained in step (3) with the data of the base sequence database of known HLA alleles, the allele type of the DNA contained in the test sample (Up to 8 digits) is determined.
本発明の方法は、前記表1に記載したプライマーセットを代表例とする。HLAクラスI及びHLAクラスIIの各遺伝子全領域を挟み込む位置にプライマーを設定し、各遺伝子のほぼ全領域に渡って増幅したDNAの配列決定をすることに特徴を有し、それによってフェーズ・アンビギュイティ(不確実さ)を排除し、nullアリルに関する情報を得ることもできる。
すなわち本発明は、配列番号1〜12で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含むHLA遺伝子タイピング用キットも提供する。
In the method of the present invention, the primer set described in Table 1 is used as a representative example. It is characterized in that primers are set at positions sandwiching the entire HLA class I and HLA class II gene regions, and the amplified DNA is sequenced over almost the entire region of each gene. Information on null alleles can also be obtained by eliminating guity (uncertainty).
That is, the present invention also provides an HLA genotyping kit including a primer comprising an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1-12.
以下に具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with specific examples, but the present invention is not limited to these examples.
(実施例1)
[実験方法]
1.既に抽出されているゲノムDNAを鋳型として、各HLA遺伝子特異的プライマーセット(表1参照)を用いてPCR反応を行った。具体的な手順は次の通りである。
(1)PCR増幅はPrime STAR GXLポリメラーゼ(TaKaRa)を用い、以下の組成で実施した。
(2)これを94度で2分間の保温後、続いて98度で10秒間、68度で10分間の2ステップを1工程として、この工程を30回繰り返した。なお、このPCR増幅にはGeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)を用いた。PCR後に、アガロースゲル電気泳動によりPCR産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図4に示した。
(Example 1)
[experimental method]
1. PCR reaction was performed using each HLA gene-specific primer set (see Table 1) using the already extracted genomic DNA as a template. The specific procedure is as follows.
(1) PCR amplification was performed using Prime STAR GXL polymerase (TaKaRa) with the following composition.
(2) After keeping the temperature at 94 ° C. for 2 minutes, this step was repeated 30 times, with two steps of 98 ° C. for 10 seconds and 68 ° C. for 10 minutes as one step. In this PCR amplification, GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) was used. After PCR, the amplification status of the PCR product was confirmed by agarose gel electrophoresis. The electrophoretic image is shown in FIG.
2.PCR産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
得られたPCR増幅産物をNextera DNA Sample Preparation Kit (illumina)を用いてDNAライブラリーを調整、MiSeq(illumina)により150bpペアエンドでシーケンスするという流れである。
Nextera DNA Sample Preparation KitはNextera transposomeを用いることでタグメンテーションと呼ばれるDNA切断とタグ配列の挿入を同時に行うことにより反応時間を含め90分と短時間でDNAライブラリーを調整することが可能である。また、2種類のIndexを用いることで最大96種類(Index1:8種類+Index2:12種類)のサンプルを同時に解析することができるという特徴を持つ。また、他の次世代シーケンサーのDNAライブラリー調整と異なり、開始DNA量必要量がわずか50ngというのも特徴の一つである。
さらに、調整したDNAライブラリーのインサートサイズが200bp〜1kb以上と非常に幅が広いことも、本手法での特徴とメリットとなっている。単一なPCRに由来する良質なシークエンス情報を得た後、データ解析によりHLAタイピングを行うが、このデータ解析が本法の最も独創的な点である。まず得られたシークエンスリードを各PCR増幅領域のリファレンス配列にBWAおよび Samtools によってマッピングし、ディプロタイプとしての解析結果を得て、PicardおよびGenome Analysis TKによりリファレンス配列と異なる塩基を検出する。検出された一塩基置換(SNV)および挿入欠失(Indel)のうち、SNVのみをシークエンスリードのペア情報を元に相を分類し、この相を分けられたハプロタイプのSNVを元に2つのHLA遺伝子配列を作成する。
この相の特定は1つのペアエンドのシークエンスリードによって2つ以上のSNVをつなぐ必要があり、2つ以上のSNV間の距離は様々であるが、HLA遺伝子が非常に多様性に富んでいるという特徴とNextera DNA Sample Preparation Kitで調整したDNAライブラリーのインサートサイズが200bp〜1kb以上と非常に幅が広いことが様々な距離の2つ以上のSNVの相の特定を可能としている。
次いで、この2つのハプロタイプのHLA遺伝子配列にシークエンスリードを再度マッピングすることで相に分けられたSNVの確認とIndelの相を決定する。1度目のマッピング結果で検出されるIndelは偽陽性を含んでいるが2度目のマッピングではSNVのない塩基配列にマッピングするため確実にIndelを決定することが可能である。2度目のマッピングで得られた2つのコンセンサス配列が2つのHLA遺伝子のシークエンスであり、これをIMGT/HLAデータベースに検索することでHLAアレルが新規か既知か、既知であればHLAアレル番号を得ることができる。
2. The base sequence of the PCR product was determined. Specifically, it was performed as follows.
The resulting PCR amplification product is prepared using a Nextera DNA Sample Preparation Kit (illumina) to prepare a DNA library and sequenced at 150 bp paired end using MiSeq (illumina).
Nextera DNA Sample Preparation Kit can adjust DNA library in 90 minutes including reaction time by using Nextera transposome to simultaneously perform DNA cleavage called tagging and insertion of tag sequence. . Further, by using two types of indexes, a maximum of 96 types (Index1: 8 types + Index2: 12 types) of samples can be analyzed simultaneously. Another feature is that, unlike other next-generation sequencer DNA library preparation, the required amount of starting DNA is only 50 ng.
Furthermore, the insert size of the prepared DNA library is as wide as 200 bp to 1 kb or more, which is a feature and merit of this method. After obtaining high-quality sequence information derived from a single PCR, HLA typing is performed by data analysis. This data analysis is the most original point of this method. First, the obtained sequence read is mapped to the reference sequence of each PCR amplification region by BWA and Samtools, an analysis result as a diplotype is obtained, and a base different from the reference sequence is detected by Picard and Genome Analysis TK. Of the detected single nucleotide substitutions (SNV) and insertion deletions (Indel), only SNVs are classified into phases based on sequence read pair information, and these phases are divided into two HLAs based on the haplotype SNVs that are separated. Create gene sequences.
To identify this phase, it is necessary to connect two or more SNVs by one paired end sequence read, and the distance between two or more SNVs varies, but the HLA gene is very diverse. The insert size of the DNA library prepared by using the Nextera DNA Sample Preparation Kit is as wide as 200 bp to 1 kb or more, which makes it possible to specify two or more SNV phases at various distances.
Next, by re-mapping the sequence reads to the HLA gene sequences of these two haplotypes, the confirmation of SNV divided into phases and the phase of Indel are determined. Indel detected in the first mapping result includes false positives, but in the second mapping, it is possible to reliably determine Indel because it maps to a base sequence without SNV. The two consensus sequences obtained in the second mapping are sequences of two HLA genes. By searching this into the IMGT / HLA database, the HLA allele is new or known, and if it is known, the HLA allele number is obtained. be able to.
[結果]
HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DPB1及びHLA-DQB1において、それぞれ特異的に増幅するPCRプライマーを設計し、前記の条件下でのPCRによって得られた産物のアガロースゲル電気泳動から、各HLA遺伝子におけるPCR産物ともに、目的の分子量の位置に単一の増幅産物が得られた(図4)。
[result]
PCR primers that specifically amplify in HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, and HLA-DQB1, respectively, were designed, and the products obtained by PCR under the above conditions From the agarose gel electrophoresis, a single amplification product was obtained at the position of the target molecular weight together with the PCR product in each HLA gene (FIG. 4).
表2に、採用した幾つかのサンプルについて、本願発明の方法で決定したHLAアリル型(実施例)及び従来のSSO法を用いて決定したHLAアリル型を示す。
SSO法では4桁レベルまでしか特定されなかったのに対し、本発明の方法(実施例)では6桁又は8桁レベルまで詳細にアリル型を決定することができた。よって本発明の方法は、フェーズ・アンビギュイティのない8桁レベルのHLAタイピングを可能とするとともに、nullアリルの原因となるプロモーターやイントロン内の塩基置換や挿入・欠失を効率よく検出するための優れたツールであると考えられる。
Table 2 shows the HLA allyl type determined using the method of the present invention and the HLA allyl type determined using the conventional SSO method for some of the samples employed.
While the SSO method could only specify up to the 4-digit level, the method (Example) of the present invention could determine the allyl type in detail up to the 6-digit or 8-digit level. Therefore, the method of the present invention enables 8-digit level HLA typing without phase ambiguity and efficiently detects base substitutions, insertions and deletions in promoters and introns that cause null alleles. Is considered an excellent tool.
Claims (13)
(2)前記プライマーセットを用いて被検試料(DNA)をPCR増幅するステップ;
(3)PCR増幅された産物の塩基配列を決定するステップ;及び
(4)任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップを含むことを特徴とする、HLAのDNAタイピング方法。 (1) SEQ ID NO: 1, which specifically anneals to the upstream region and the downstream region of each gene of HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, and HLA-DQB1 in the human genome base sequence Preparing a primer set consisting of an oligonucleotide having the base sequence shown in -12;
(2) PCR-amplifying a test sample (DNA) using the primer set;
(3) determining the base sequence of the PCR-amplified product; and (4) optionally performing a homology search with a database.
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