JP2015533220A - 側方溶出型分子分画装置 - Google Patents
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Abstract
Description
タンパク質試料は45μLのマウス脳溶解液(SDS−PAGE負荷緩衝液、Rockland社カタログ番号W10−000−T004中に1μg/μlのタンパク質)を含んだ。そのタンパク質試料を5μLの負荷溶液(負荷溶液は7.5(重量/体積)%のフィコール400、0.5%のSDS、12mMのDTT、0.45×KBB緩衝液(1×KBB緩衝液は102mMのトリスベース、57.6mMのTAPS酸、0.96mMのEDTA酸、pH8.7である)である)と混合し、負荷前に5分間で85℃まで加熱した。電気泳動追跡染料であるブロモフェノールブルーを供給業者により提供された溶解液調剤に含めた。
図9に示されているデザインのゲルカセットを次の例外と共に実施例1において説明されたように準備した。ゲルマトリックス組成物は2%の低融点アガロース(SeaPlaqueアガロース、Lonza社)を含み、ゲルマトリックス組成物、第一緩衝液容器と第二緩衝液容器及び負の溶出容器と正の溶出容器は2μg/mlの臭化エチジウムと共に0.5×KBBを含有する緩衝液組成物を含んだ。ゲルマトリックス組成物にも緩衝液組成物にもSDSを使用しなかった。投入DNA試料は制限酵素消化大腸菌ゲノムDNA(HinfI及びMspIで完全に消化された5μgのDNA、New England Biolabs社)を含んだ。分離電気泳動を87VのDCで90分間実施した。分離電気泳動後に図12に示されているようにUV光下でそのカセットを写真撮影した。図12は、分離相電気泳動時にゲノムDNA試料が分離チャネル内で中央に寄せられたままでいることを示している。写真撮影後に分離電極をそのカセットから取り外し、2つの12ピンプラチナ溶出電極アレイを負の溶出容器と正の溶出容器の内部に配置した。具体的には12ピン陰極アレイを負の溶出容器に挿入し、12ピン陽極アレイを正の溶出容器に挿入した。溶出電気泳動を87VのDVで7分間実施した。標準的な手動ピペッターを使用して溶出モジュールストリップの各溶出モジュールから溶出されたDNAを取り出した。投入制限消化画分のアリコットと溶出画分をキャピラリー電気泳動(Agilent Bioanalyzer 2100)により分析した。キャピラリー電気泳動の結果が図13及び14に示されている。産出物のサイズは50塩基対(bp)(溶出モジュール番号12)から約600bp(溶出モジュール番号1)の範囲であった(図13)。収率は図14の電気泳動図からほとんどの画分について25〜40%の範囲であると推定された。
本発明をこれまでその具体的な記載に即して説明してきたが、上述の説明はあくまでも例示を意図したものであり、本開示の範囲を制限することを意図したものではない。他の側面、利点、及び改変も、本開示の範囲内に存する。
Claims (99)
- 天板(top plate)及び底板(bottom plate)を含む電気泳動カセットであって、
前記天板が、少なくとも1つのマクロ流体分離チャネル(macrofluidic separation channel)と、正の溶出チャネルの部分に対応する開口(opening)、空腔(cavity)、又は陥凹(recess)のうち少なくとも1つと、負の溶出チャネルの部分に対応する開口、空腔、又は陥凹のうち少なくとも1つと、少なくとも1つの溶出モジュールとを含み、
前記天板と前記底板とが互いに接触又は接着されてなる、カセット。 - 前記底板が、前記正の溶出チャネルの部分に対応する開口、空腔、又は陥凹のうち少なくとも1つと、前記負の溶出チャネルの部分に対応する開口、空腔、又は陥凹のうち少なくとも1つと、前記溶出モジュールに対応する開口、空腔、又は陥凹のうち少なくとも1つとを含む、請求項1に記載のカセット。
- 前記天板と前記底板との接触又は接着により、少なくとも1つの正の溶出チャネル及び少なくとも1つの負の溶出チャネルが形成されてなる、請求項2に記載のカセット。
- 前記溶出モジュールが、
固相底面(solid bottom surface)と、溶出ポートを含む上面(top surface)と、各々少なくとも1つの正の溶出チャネル又は少なくとも1つの負の溶出チャネルに対応する開口、空腔、又は陥凹のうち少なくとも1つを有する二つの側面(side surfaces)とを有する四面構造(four-sided structure)、並びに、
前記構造の少なくとも1つの面に接触する被分析物非透過性膜(analyte-impermeable membrane)
を含む、請求項1、2、又は3に記載のカセット。 - 前記2つの側面が、上面近傍のより広い形状から底面近傍のより狭い形状へと先細りしてなる、請求項4に記載のカセット。
- 前記被分析物非透過性膜が、少なくとも1つの正の溶出チャネルに隣接する前記構造の側面に接触又は接着されてなる、請求項4に記載のカセット。
- 前記溶出モジュールが、被分析物透過性膜(analyte-permeable membrane)を更に含む、請求項4に記載のカセット。
- 前記被分析物透過性膜が、少なくとも1つの負の溶出チャネルに隣接する前記構造の側面に接触又は接着されてなる、請求項7に記載のカセット。
- 前記溶出モジュールが、前記天板に可逆的に(in a reversible manner)接触又は接着されてなる、請求項1、2、又は3に記載のカセット。
- 前記底板が、前記少なくとも1つの溶出モジュールに対応する少なくとも1つの切欠き(notch)を更に含む、請求項1、2、又は3に記載のカセット。
- 前記切欠きが、1つの底面と2つの側面とを有する三面構造(three-sided structure) を含む、請求項10に記載のカセット。
- 2つの側面が、前記溶出モジュールチャネルの開口、空腔、又は陥凹の何れも被覆しない、請求項11に記載のカセット。
- 前記天板と前記底板との接触又は接着により、前記天板の少なくとも1つの溶出モジュールが、前記底板の少なくとも1つの対応する切欠きに挿入されてなる、請求項10に記載のカセット。
- 前記底板が、前記溶出モジュールチャネルの開口、空腔、又は陥凹の少なくとも1つに対応する、一連の窓部(a series of windows)を含む少なくとも1つの隔壁(divider)を更に含み、ここで各窓部が、負の溶出チャネルの少なくとも1つ及び正の溶出チャネルの少なくとも1つに沿って配置される、請求項1、2、又は3に記載のカセット。
- 前記溶出モジュールが、少なくとも1つの溶出チャンバー及び少なくとも1つの溶出ポートを含む、請求項1、2、又は3に記載のカセット。
- 前記天板が、少なくとも1つの正の溶出電極チャネル及び少なくとも1つの負の溶出電極チャネルを更に含む、請求項1、2、又は3に記載のカセット。
- 前記少なくとも1つの正の溶出電極チャネルが、少なくとも1つの正の溶出チャネルの体積を占め(occupies a volume of)、前記少なくとも1つの負の溶出電極チャネルが、少なくとも1つの負の溶出チャネルの体積を占める、請求項16に記載のカセット。
- 前記少なくとも1つの正の溶出電極チャネル及び前記少なくとも1つの負の溶出電極チャネルが各々、第一の緩衝剤容器(buffer reservoir)の体積及び第二の緩衝剤容器の体積を占める、請求項17に記載のカセット。
- 前記少なくとも1つの正の溶出電極チャネル及び前記少なくとも1つの負の溶出電極チャネルが各々、第一の追加緩衝剤容器(extra buffer reservoir)の体積及び/又は第二の追加緩衝剤容器の体積を占める、請求項18に記載のカセット。
- 前記底板が、前記天板を内側に嵌め込まれる枠(frame)を更に含む、請求項1、2、又は3に記載のカセット。
- 前記天板が、第一の緩衝剤容器の部分に対応する開口、空腔、又は陥凹のうち少なくとも1つ、並びに、第二の緩衝剤容器の部分に対応する開口、空腔、又は陥凹のうち少なくとも1つを更に含む、請求項1、2、又は3に記載のカセット。
- 前記底板が、第一の緩衝剤容器の部分に対応する開口、空腔、又は陥凹のうち少なくとも1つ、並びに、第二の緩衝剤容器の部分に対応する開口、空腔、又は陥凹のうち少なくとも1つを更に含む、請求項21に記載のカセット。
- 前記天板と前記底板との接触又は接着により、第一の緩衝剤容器及び第二の緩衝剤容器が形成されてなる、請求項22に記載のカセット。
- 前記第一の緩衝剤容器が、前記マクロ流体分離チャネルの第一の端部に設けられ、前記第二の緩衝剤容器が、前記マクロ流体分離チャネルの第二の端部に設けられる、請求項23に記載のカセット。
- 前記天板が、第一の追加緩衝剤容器の部分に対応する開口、空腔、又は陥凹のうち少なくとも1つを更に含む、請求項1、2、又は3に記載のカセット。
- 前記底板が、第一の追加緩衝剤容器の部分に対応する開口、空腔、又は陥凹のうち少なくとも1つを更に含む、請求項25に記載のカセット。
- 前記天板と前記底板との接触又は接着により、第一の追加緩衝剤容器が形成されてなる、請求項26に記載のカセット。
- 前記天板が、第二の追加緩衝剤容器の部分に対応する開口、空腔、又は陥凹のうち少なくとも1つを更に含む、請求項1、2、3、又は25に記載のカセット。
- 前記底板が、第二の追加緩衝剤容器の部分に対応する開口、空腔、又は陥凹のうち少なくとも1つを更に含む、請求項28に記載のカセット。
- 前記天板と前記底板との接触又は接着により、第二の追加緩衝剤容器が形成されてなる、請求項29に記載のカセット。
- 前記分離チャネルが試料ウェル空腔を含む、請求項1、2、又は3に記載のカセット。
- 前記天板の外表面が、少なくとも1つの分離電極ポート、1つの溶出電極チャネル、及び1つの試料ポートに対応する、開口、突起(protrusion)及び陥凹のうち少なくとも1つを含む、請求項1、2、又は3に記載のカセット。
- 前記天板の外表面が、少なくとも1つの溶出モジュールポートに対応する開口、突起、及び陥凹を更に含む、請求項32に記載のカセット。
- 前記底板の外表面が、少なくとも1つのポートに対応する開口、突起、及び陥凹のうち少なくとも1つを含む、請求項1、2、又は3に記載のカセット。
- 前記ポートにより、少なくとも1つの分離チャネルに対するゲルマトリックス組成物の導入が容易化される、請求項34に記載のカセット。
- 前記カセットがディスポーザブルである、請求項1、2、又は3に記載のカセット。
- ゲルマトリックス組成物、液体緩衝剤組成物、固体緩衝剤組成物の少なくとも1つを更に含む、請求項1、2、又は3に記載のカセット。
- 前記マクロ流体分離チャネルが、ゲルマトリックス組成物、液体緩衝剤組成物、固体緩衝剤組成物の少なくとも1つを含む、請求項1、2、又は3に記載のカセット。
- ゲルマトリックス組成物、液体緩衝剤組成物、固体緩衝剤組成物の少なくとも1つが、フルオロフォア(fluorophore)又はクロモフォア(chromophore)の少なくとも1つを含む、請求項38に記載のカセット。
- 少なくとも1つのマクロ流体分離チャネルが、ゲルマトリックス組成物を更に含む、請求項39に記載のカセット。
- 前記ゲルマトリックス組成物が、前記マクロ流体分離チャネルの体積を占める、請求項40に記載のカセット。
- 前記ゲルマトリックス組成物が、少なくとも1つの試料ウェル空腔内で、少なくとも1つの試料ウェルを画定する、請求項41に記載のカセット。
- 緩衝剤組成物を更に含む、請求項1、2、又は3に記載のカセット。
- 前記緩衝剤組成物が、少なくとも1つの緩衝剤容器、少なくとも1つの試料ウェル、少なくとも1つの溶出チャネル、及び少なくとも1つの溶出モジュールの体積を占める、請求項43に記載のカセット。
- 前記溶出モジュールが、溶出緩衝剤組成物を含む、請求項43又は44に記載のカセット。
- 前記溶出緩衝剤組成物が、少なくとも1つの溶出チャンバーの体積を占める、請求項45に記載のカセット。
- 前記緩衝剤組成物が、少なくとも1つの追加緩衝剤容器の体積を占める、請求項44に記載のカセット。
- 前記カセットが、除去可能な封止材を更に含む、請求項1〜47の何れか一項に記載のカセット。
- 前記封止材が、前記天板の外表面又は前記底板の外表面の開口、突起、及び陥凹の少なくとも1つを包囲する、請求項48に記載のカセット。
- 少なくとも1つのマクロ流体分離チャネルが光学的に透明である、請求項1、2、又は3に記載のカセット。
- 前記分離チャネルの少なくとも1つの面が光学的に透明である、請求項50に記載のカセット。
- 前記分離チャネルの1つの面のみが光学的に透明である、請求項50に記載のカセット。
- 前記被分析物透過性障壁が、親水性の膜又はフィルターを含む、請求項7に記載のカセット。
- 前記被分析物透過性障壁が、孔径範囲0.4μm〜50μmの少なくとも1つの孔を含む、請求項53に記載のカセット。
- 前記被分析物透過性障壁が、孔径範囲0.4μm〜1μmの少なくとも1つの孔を含む、請求項53に記載のカセット。
- 前記被分析物非透過性障壁が、膜、フィルター、フィルム、又はこれらの組み合わせである、請求項4に記載のカセット。
- 前記被分析物非透過性障壁が、限外濾過膜又は導電性フィルムである、請求項56に記載のカセット。
- 前記限外濾過膜が、孔径範囲0.001μm〜0.1μmの少なくとも1つの孔を含む、請求項57に記載のカセット。
- 前記限外濾過膜の分子量カットオフが1,000〜30,000ダルトンの範囲である、請求項57に記載のカセット。
- 前記限外濾過膜の分子量カットオフが3,000〜10,000ダルトンの範囲である、請求項57に記載のカセット。
- 前記被分析物非透過性障壁が、前記被分析物と同じ電荷を有する導電性フィルムを含む、請求項57に記載のカセット。
- 前記被分析物非透過性障壁が、負に帯電した硫酸基と接触された導電性フィルムを含む、請求項57に記載のカセット。
- 請求項1、2、又は3に記載のカセットと、電極アレイと、負の溶出電極及び正の溶出電極のうち少なくとも1つと、プロセッサーと、電源モジュールを含む電気泳動システムであって、
前記電極アレイが、負の分離電極及び正の分離電極の少なくとも1つを含み、
前記負の分離電極が、前記分離チャネルの第一の端部の第一の緩衝剤容器に対応する前記天板の外表面のポートと並置され(aligned with)、
前記正の分離電極が、前記分離チャネルの第二の端部の第二の緩衝剤容器に対応する前記天板の外表面のポートと並置され、
前記分離チャネルの第一の端部が、少なくとも1つの試料ウェルの近位に配置され、
前記負の溶出電極が、少なくとも1つの負の溶出チャネルの体積を占める前記天板の外表面の溶出電極チャネルと並置され、
前記正の溶出電極が、少なくとも1つの正の溶出チャネルの体積を占める前記天板の外表面の溶出電極チャネルと並置され、
前記プロセッサーが、分離電気泳動時には少なくとも1対の正及び負の分離電極に対する通電を許可する一方、溶出電気泳動時には少なくとも1対の正及び負の分離電極に対する通電を遮断すると共に、少なくとも1対の正及び負の溶出電極に対する通電を許可するように構成され、
前記電源モジュールが、前記プロセッサーと前記の少なくとも1対の正及び負の分離電極又は少なくとも1対の正及び負の溶出電極とのうち少なくとも1つに電力を供給する電源及び中継器の少なくとも1つを含む、システム。 - 少なくとも1つの蓋を更に含む、請求項63に記載のシステム。
- 前記電極アレイが前記蓋に接触又は接着されてなる、請求項64に記載のシステム。
- 少なくとも1つのネストプラットフォーム(nest platform)に接触又は接着されてなる少なくとも1つのカセットネスト(cassette nest)を更に含む、請求項63又は64に記載のシステム。
- 前記カセットネストが、請求項1、2、又は3に記載の前記カセットに接触又は接着されてなる、請求項66に記載のシステム。
- 前記ネストプラットフォームが前記蓋に向かって進行することにより、前記カセットが前記電極アレイと並置される、請求項67に記載のシステム。
- 前記カセットが前記電極アレイと並置されることにより、前記アレイの少なくとも1つの電極が、前記天板の開口、空腔、又は陥凹のうち少なくとも1つを通じて侵入することが容易となる、請求項68に記載のシステム。
- 前記天板の開口、空腔、又は陥凹のうち少なくとも1つが、容器又はチャネルに対応する、請求項69に記載のシステム。
- 前記容器又はチャネルに緩衝剤組成物が充填される、請求項70に記載のシステム。
- 少なくとも1対の正及び負の溶出電極が前記蓋から離れて延在するよりも更に、少なくとも1対の正及び負の分離電極が前記蓋から離れて延在する、請求項64に記載のシステム。
- 前記カセットが分離電気泳動時に、前記少なくとも1対の正及び負の分離電極のみを接触させる第一の位置に存在する、請求項72に記載のシステム。
- 前記カセットが溶出電気泳動時に、前記の少なくとも1対の正及び負の分離電極並びに少なくとも1対の正及び負の溶出電極を接触させる第二の位置に存在する、請求項73に記載のシステム。
- 溶出電気泳動時に、少なくとも1対の正及び負の分離電極が遮断される、請求項74に記載のシステム。
- 試料中の被分析物を分画する方法であって、
請求項1、2、又は3に記載のカセットを供し、ここで前記カセットは、少なくとも1つの緩衝剤容器の体積を占める緩衝剤容器インサートと、試料ポートのうち少なくとも1つと並置された分離チャネルの体積を占める試料ウェルインサートと、前記底板の外表面の開口を含む注入ポートとのうち少なくとも1つを更に含み、
前記注入ポートを通じてゲルマトリックス組成物を挿入し、
前記ゲルマトリックス組成物を凝固させ、ここで前記ゲルマトリックス組成物は液体から固体に転換し得るものであり、
前記の緩衝剤容器インサート及び試料ウェルインサートを除去し、これにより試料ウェルが形成され、
少なくとも1つの緩衝剤容器及び少なくとも1対の正及び負の溶出チャネルに緩衝剤組成物を充填し、
前記電気泳動カセットを請求項63に記載のシステムに挿入し、
分離電気泳動時に前記の少なくとも1対の正及び負の分離電極に対する導通を選択的に許容するよう前記システムのプロセッサーをプログラムし、
溶出電気泳動時に前記の少なくとも1対の正及び負の分離電極に対する導通を選択的に遮断すると共に、少なくとも1対の正及び負の溶出電極に対する導通を選択的に許容するよう前記システムのプロセッサーをプログラムし、
前記試料を前記試料ウェルに導入し、
分離電気泳動時に前記電気泳動カセットに対して電圧を印加し、
溶出電気泳動時に前記電気泳動カセットに対して電圧を印加し、
前記少なくとも1つの溶出モジュールにおいて、所望の電気泳動移動度を有する試料の被分析物を収集することにより、試料中の非分析物を分画することを含む、方法。 - 前記試料が検出可能な化合物を含む、請求項76に記載の方法。
- 前記試料が被分析物と蛍光化合物との複合体を少なくとも1つ含む、請求項77に記載の方法。
- 前記蛍光化合物がフルオロフォアである、請求項78に記載の方法。
- 前記試料が被分析物と光吸収性化合物との複合体を少なくとも1つ含む、請求項77に記載の方法。
- 前記光吸収性化合物がクロモフォアである、請求項80に記載の方法。
- ゲルマトリックス組成物、緩衝剤組成物、又は溶出緩衝剤組成物のうち少なくとも1つが、少なくとも1つの被分析物と複合してなる少なくとも1つのフルオロフォアを含む、請求項76に記載の方法。
- ゲルマトリックス組成物、緩衝剤組成物、又は溶出緩衝剤組成物のうち少なくとも1つが、少なくとも1つの被分析物と複合してなる少なくとも1つのクロモフォアを含む、請求項76に記載の方法。
- 前記試料が分子量マーカーを含む、請求項76に記載の方法。
- 前記被分析物がポリ核酸又はポリペプチドである、請求項76に記載の方法。
- 前記ポリ核酸がデオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)を含む、請求項85に記載の方法。
- 前記ポリ核酸が二重鎖又は一重鎖である、請求項85に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが天然体又は変性体である、請求項85に記載の方法。
- 少なくとも1つのマクロ流体分離チャネルと、少なくとも1つの正の溶出チャネルと、少なくとも1つの負の溶出チャネルと、溶出モジュールに対応する開口、空腔、又は陥凹のうち少なくとも1つとを含むプレート、及び、
少なくとも1つの溶出モジュール
を含む電気泳動カセット。 - 前記溶出モジュールが、
固相底面と、溶出ポートを含む上面と、少なくとも1つの正の溶出チャネル又は少なくとも1つの負の溶出チャネルに対応する開口、空腔、又は陥凹のうち少なくとも1つを各々有する2つの側面とを有する四面構造、及び、
前記構造の少なくとも1つの面と接触する被分析物非透過性膜
を含む、請求項89に記載のカセット。 - 前記被分析物非透過性膜が、少なくとも1つの正の溶出チャネルに隣接する前記構造の側面に接触又は接着されてなる、請求項90に記載のカセット。
- 前記溶出モジュールが被分析物透過性膜を更に含む、請求項90又は91に記載のカセット。
- 前記被分析物透過性膜が、少なくとも1つの負の溶出チャネルに隣接する前記構造の側面に接触又は接着されてなる、請求項92に記載のカセット。
- 前記溶出モジュールが、前記プレートに可逆的に(in a reversible manner)接触又は接着されてなる、請求項89に記載のカセット。
- 前記溶出モジュールが、溶出モジュールに対応する前記開口、空腔、又は陥凹のうち少なくとも1つに可逆的に(in a reversible manner)接触又は接着されてなる、請求項89に記載のカセット。
- 第一の緩衝剤容器を更に含む、請求項89に記載のカセット。
- 第二の緩衝剤容器を更に含む、請求項89又は96に記載のカセット。
- 前記第一の緩衝剤容器が、前記分離チャネルの第一の端部に位置する、請求項96に記載のカセット。
- 前記第二の緩衝剤容器が、前記分離チャネルの第二の端部に位置する、請求項97に記載のカセット。
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