JP2015532643A - デジタル生物学的コンバータ - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2012年8月16日に出願された米国仮出願第61/684,076号の利益を主張し、これは、全ての表、図および請求項を含むその全体が参照により本明細書に援用される。
本発明は、関心対象の生物学的配列などの生物情報の最終生物学的実体への自動化された変換に属する。また、本発明は、たとえば、生物学的脅威への迅速な応答のために提供することに属する。
添付の配列表における要素は、参照により本明細書によって本出願に援用される。添付の配列表テキストファイル、名称SGI1600_1WO_PCT_Sequence Listing_ST25は、2013年8月16日に作成され、15KBである。ファイルは、Windows OSを使用するコンピュータ上でMicrosoft Wordを使用して評価することができる。
本発明の背景の以下の記述は、本発明を理解する際の支援を提供するが、本発明に対する従来技術であるとは、またはそれを記述するものとは認められない。
本発明は、大きな距離を越えてデジタル形式で生物情報を伝達するためのシステムと、その情報のその後の迅速な最終生物学的実体への変換を提供する。生物学的配列情報は、DNA分子、RNA分子、タンパク質またはペプチド、ウイルスおよび/またはファージ粒子、ワクチン、合成細胞または任意の生物学的実体の合成のために必要なその情報であることができる。生物学的実体は、生物学的実体を構築または合成しようとする特定の場所に位置する本発明のシステムによって合成することができる。
受信ユニットは、生物学的配列情報をコードするシグナルを受け取る。一つの態様において、受信ユニットは、送信ユニットからデジタルコード化された生物学的配列情報を受け取るコンピュータである。したがって、受信ユニットは、インターネットに接続することができ、および/またはそうでなければ、コンピュータネットワークに接続することができ、ネットワークに接続するコンピュータ間で情報を交換することを可能にする。また、インターネットは、本明細書に使用される用語として、コンピュータネットワークである。一つの態様において、送信ユニットは、受信ユニットから離れた位置、たとえば別の都市または別の国または国家に位置する。受信ユニットは、地球から離れた場所または地球の大気外、たとえば軌道に乗って回っている宇宙ステーションまたは月の上でさえ、または地球以外の惑星上などに位置することさえできる。いくつかの態様において、送信ユニットは、受信ユニットから少なくとも10マイルまたは少なくとも25マイルまたは少なくとも50マイルまたは少なくとも100マイルまたは少なくとも250マイルまたは少なくとも1000マイル離れた位置に位置する。いくつかの態様において、受信ユニットは、生物学的配列情報を受け取り、アセンブリーユニットが生物学的配列の構築のためのプログラミング命令に変換することができる形態でアセンブリーユニットにそれを提供する。したがって、一つの態様において、受信ユニットは、コンピュータネットワークを介して送信ユニットに接続する。また、受信ユニットは、アセンブリーユニットに接続する。種々の態様において、また、受信ユニットは、コンピュータまたは回路基板またはアセンブリーユニットまたはアセンブリーユニットのサブユニットに組み込まれたコンピュータの一部であることができる。受信ユニットと送信ユニット間の接続は、間接的であることができる、すなわち、1つまたは複数のさらなるコンピュータ、ルータまたはこれらの間に挿入されたその他の電子装置を介する。また、接続は、無線またはサテライト接続を介することができる。また、接続は、コンピュータネットワークを介した送信ユニットと受信ユニットと間の直接接続のように、直接であることができる。どのようにしろ、受信ユニットは、送信ユニットによって伝達されたシグナルを受け取るだろう。一つの態様において、受信ユニットは、電磁波の形態で生物学的配列を受け取り、生物学的実体または生物学的産物の構築のために、アセンブリーユニットに配列を提供する。
送信ユニットは、システムの受信ユニットに生物学的配列情報を伝達する。デジタルシグナルは、一連のビットの形態で情報を表すことができる。当業者は、実質的に生物学的配列情報を含む任意の種類の情報をデジタルシグナルとして容易に伝達することができることを理解する。これらの種類の情報は、コンピュータネットワークを介して容易に伝達され、これは地球にまたがることができる。本発明の一つの態様において、送信ユニットは、情報を1つのコンピュータから別のコンピュータまで伝達すること、またはネットワーク(たとえば、インターネット)に接続されたコンピュータ間で交換することを可能にするコンピュータネットワークに接続するコンピュータである。したがって、一つの態様において、送信ユニットおよび受信ユニットは、コンピュータネットワークの一部であるコンピュータであり、送信ユニットは、デジタル形式に配列情報を取得または変換する、およびたとえば、コンピュータネットワークを介して配列情報を受信ユニットに伝達するためのハードウェアおよび/またはソフトウェアを有する。その他の態様において、送信ユニットは、電話またはキーボードであり、オペレータは、生物学的配列情報を手動で入力することができる。また、送信ユニットは、任意の形式(たとえば、HTML)で受信ユニットにメッセージを送る電子装置であることができる。データのコード化および伝達の形式は、受信ユニットによって生物学的配列の合成のための命令へ変換することができる任意の便利な形式であることができる。送信ユニットは、情報を入力する人から情報を得ることができ、または配列を決定する機器から自動化された様式でそれを得ることができる。生物学的配列情報の供与源は、ウイルスまたはその他の生物学的実体の試料であることができる。
アセンブリーユニットは、送信ユニットから受信ユニットが受け取った情報に従って、生物学的配列を合成する。本発明のシステムにおいて配備されるアセンブリーユニットは、受信ユニットに接続することができる。その他のシステム構成要素と同様に、接続は、ユニット間の直接接続または1つまたは複数のさらなるコンピュータ、ルータまたはユニット間に挿入されたその他の電子装置を介する間接的な接続のいずれかであることができる。アセンブリーユニットは受信ユニットと通信することができ、その結果、受信ユニットが送信ユニットから生物学的配列情報を含むシグナルを受け取るとき、情報をアセンブリーユニットに提供し、即時に自動化された方法において配列を合成し始めることができる。アセンブリーユニットは、1つまたは複数の核酸分子の合成、核酸分子の増幅および転写ならびに/またはペプチドもしくはタンパク質への核酸分子の翻訳を含む種々の機能を有することができるが、限定されない。
生物学的実体は、ポリヌクレオチドもしくはDNA分子またはポリリボヌクレオチドもしくはRNA分子またはペプチドもしくはポリペプチドもしくはタンパク質である。いくつかの態様において、生物学的実体は、核酸またはDNA分子である。生物学的実体がDNAまたはRNA分子であるとき、それは生物学的産物に転換可能であることができる。DNAまたはRNAは、一本鎖DNAもしくはRNAまたは二本鎖DNAもしくはRNAであることができる。生物学的実体がDNA分子であるとき、それは機能的DNA分子であることができ、つまり、これを機能的タンパク質またはペプチドに翻訳させることができるRNAに転写することができ、またはDNA分子として(たとえば、DNAワクチンとして)直接有用であることを意味する。機能的RNA分子は、機能的タンパク質またはペプチドに翻訳することができる。機能的タンパク質またはペプチドは、疾患または障害の治療において臨床的用途を有するものであり、またはいくつかの生物学的状況において直接有用である(たとえば、構造タンパク質としてまたは酵素として有用である)。種々の態様において、機能的タンパク質またはペプチドは、タンパク質のドメイン、結合サブユニット、酵素または酵素活性を有する酵素サブユニット、ワクチンの生成において有用である抗原性活性を有するタンパク質またはペプチド、ウイルスタンパク質またはそのサブユニット、ウイルスコートタンパク質(たとえば、HAまたはNAタンパク質)、またはインビトロで組み合わされるとき、もしくは宿主細胞においてインビトロで組み合わされるときにウイルス粒子を形成する複数のタンパク質またはペプチドであることができる。したがって、臨床的用途は、抗原性応答の発生またはタンパク質またはペプチドの特異的結合分子または受容体に対する結合であることができ、しかし、一つの態様において、抗原性応答は、疾患または障害の治療(たとえば、インフルエンザに対するワクチンの産生)を進めるものであり、またはエピトープの存在を同定するアッセイにおける使用を見いだす。また、機能的タンパク質またはペプチドは、望ましい特性、たとえば望ましい味、感触、臭いまたは別の特性などを提供することができる。一つの態様において、機能的タンパク質またはペプチドは、免疫または抗原性応答の発生以外の機能を有する。
生物学的産物は、生物学的実体によって提供される配列情報を使用して合成され、または構築される生体分子である。したがって、異なる態様において、生物学的実体はDNA分子またはRNA分子であり、生物学的産物は、たとえばウイルスゲノムまたはその一部、ウイルス粒子またはウイルスコートまたはいずれかの一部、バクテリオファージまたはその一部、ウイルス粒子またはウイルスのコートの抗原性一部、細菌ゲノムまたはその一部、遺伝子、核酸配列、一本鎖DNA分子(ssDNA)、二本鎖DNA分子(dsDNA)、RNA分子、アンチセンスRNA部分、siRNA部分、RNAi部分、二本鎖RNA部分、タンパク質分子またはタンパク質部分、タンパク質抗原またはその一部、酵素、構造タンパク質、調節タンパク質、栄養タンパク質、結合タンパク質、輸送タンパク質、ペプチド分子、遺伝子または真菌のゲノムまたはその一部または合成細胞などのそこから作製される任意の生物学的産物であることができる。また、生物学的産物は、修飾を受けたタンパク質、ペプチドまたはポリペプチド、たとえば糖タンパク質を産生する一定のアミノ酸残基のグリコシル化または2つ以上の生物学的ビルディングブロックで形成されたもう一つの分子などであることができる。その他の態様において、生物学的産物は合成細菌またはその一部のゲノムである。特定の態様において、生物学的産物はインフルエンザウイルスであり、配列情報は、生物学的脅威に対するワクチンを調製するために使用される情報である。生物学的産物がウイルスまたはウイルス粒子であるとき、それは、弱毒ウイルスまたは不活化ウイルスまたは無害なウイルスであることができる。いくつかの態様において、生物学的実体はまた、それ自体が生物学的産物であることができる。生物学的実体が生物学的産物であるときの例はDNAワクチンであり、DNA分子それ自体がワクチンとして有用である。DNAワクチンは、病原体タンパク質をコードするDNAの小片からなる。体への注射後、宿主細胞は、病原体タンパク質を合成し、免疫応答を刺激する。一つの態様において、生物学的実体は、二本鎖DNA(dsDNA)に構築することができる複数の一本鎖DNA(ssDNA)またはオリゴヌクレオチドである。分子、ウイルスまたはその他の生物学的実体の「一部」は、天然の分子または生物学的実体の少なくとも10%または少なくとも20%または少なくとも30%または少なくとも40%または少なくとも50%または少なくとも60%または少なくとも70%または少なくとも80%または少なくとも90%であることができる。
本発明は、機能的生物学的実体を合成する方法を提供する。本発明において、デジタルDNA配列またはコード化配列は、受け取ったDNA配列のための合成パラダイムを自動的にデザインするソフトウェアプログラムに入れることができる(たとえば、ARCHETYPE(登録商標), Synthetic Genomics, San Diego, CA)。たとえば、ソフトウェアは、配列を約50〜80塩基または約40〜90塩基または約30〜100塩基または約30〜60塩基または約30〜80塩基または20〜100塩基または20〜80塩基または10〜100塩基または10〜90塩基または10〜80塩基のデザインされた重複したオリゴヌクレオチドに分けることができ、これらのサイズのいずれも、本発明のオリゴヌクレオチドとして使用することができる。次いで、オリゴヌクレオチド配列を構築のためにシステムのサブユニットに伝達する。特定の態様において、ソフトウェアは、約60bpの隣接するオリゴヌクレオチド(ssDNA)間に約30bp(±5%または±10%)の重複を含むようにオリゴヌクレオチドをデザインすることができる。また、オリゴヌクレオチドは、PCR増幅後にプライマー結合ドメインを放出するために、PCR増幅のためのユニバーサルプライマー結合ドメインおよび制限部位を有するようにデザインすることができる。また、本発明において使用されるソフトウェアは、方法において使用される特定の宿主生物に目的を合わせたコドン最適化配列内に受け取られる、または望まれる配列を修飾するための能力を有することができる。ソフトウェアは、システムの任意のユニットまたはサブユニットにおいて存在することができる。
さらに、本発明は、本発明のシステムおよび方法における使用のためのキットを提供する。キットは、生物学的ビルディングブロック、ビルディングブロック重合体、緩衝液または本発明のシステムで本発明の方法を実施するためのその他の試薬の任意の組み合わせなどの生物学的産物を構築するために必要な試薬および成分を含むことができる。単独でまたは上の試薬および成分の任意の組み合わせでのどちらでも、キットはまた、本発明の方法を行うための反応容器を含むことができる。試薬または反応成分または反応容器の任意の組み合わせを、キットの部材を有する容器に提供することができる。また、試薬および試薬成分は、本発明のシステムのインターフェース上に適合する試薬の容器において提供することができる。
本発明のシステムは、自動化された方法を実施することによって生物学的実体を産生することができる。生物学的実体は、任意の所望の配列であることができる。一つの態様において、本発明のシステムは、生物学的実体の一部として所望の配列または構築物を含むようにあらかじめプログラムすることができる。たとえば、本発明のシステムは、オペレータが、合成された配列のさらなる使用に望ましいプラスミドまたはその他のベクターに合成される特定の配列を追加することができるようにあらかじめプログラムすることができる。その他の態様において、システムは、要請された配列を合成すること、および制御配列またはプロモーター配列またはトランス作用性因子のための結合エレメントまたは生物学的実体の一部として要請された配列へのシグナル配列を追加することができる。したがって、配列が特定の宿主生物における後の使用のために合成されるだろうということをオペレータが知っているとき、システムは、制御配列または宿主生物に特有のその他の望ましい配列と共に要請された配列を合成することができ、したがって、さらに生物学的実体または生物学的産物の調製を単純化し、速度が上がる。本発明のシステムおよび方法によって合成されることに加えて、また、制御配列、プロモーター配列、シグナル配列およびトランス作用性因子のための結合エレメントを、所望通り使用のためのあらかじめ作られた配列として本発明の試薬の容器および/または反応容器にあらかじめ装填することができる。また、これらのあらかじめ作られた配列を本発明の任意のキットに含めることができる。
本実施例は、ウイルス粒子を産生する宿主細胞への、オリゴヌクレオチドプールからのHAおよびNA遺伝子のDNA構築物の自動化された構築およびこれらのトランスフェクションを例証する。インフルエンザウイルスは、中心コアをくるんだ糖タンパク質を含むウイルスエンベロープで作製される。中心コアは、ウイルスRNAゲノムおよび、RNAをパックおよび保護するその他のウイルスタンパク質を含む。インフルエンザゲノムは、典型的にはそれぞれ1つまたは2つのウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む8つの小片のRNAを含む。インフルエンザA型の場合において、ゲノムは、8つの小片のRNA上に11の遺伝子を含み、赤血球凝集素(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)を含む11のタンパク質をコードする。その他のタンパク質は、核タンパク質(NP)、M1、M2、NS1、NS2、PA、PB1、PB1−F2およびPB2を含む。
HAおよびNA遺伝子のDNA構築物の配列を表す96のオリゴヌクレオチドのプールを本発明のアセンブリーユニットに提供した。HAおよびNA構築物は、長さがおよそ3kbであり、方法において96のオリゴヌクレオチドから構築した。最初および最後のオリゴヌクレオチドは、PCR増幅のためのプライマー結合ドメイン、および増幅後にプライマー結合ドメインを放出するためにNotI制限部位を含み、また、より大きな断片を構築するために必要である場合、DNA構築のために重複する領域を曝露する。
1.それぞれの構築された産物PCRについて、反応を自動化された様式で行った:
25μl 2×PHUSION(登録商標)Hot−Start Master Mix (Thermo Fisher Scientific Oy, Oy, Fl)
2μl 1% PEG 8000
0.25μl 末端プライマー1(100μM)
0.25μl 末端プライマー2(100μM)
20μl MBG水
上のオリゴプール2.5μlを、PCRマスターミックス(またはその後に組み合わせ)を含む反応容器の反応区画に鋳型として50nM移した。
2.熱サイクルは、以下のパラメーターを使用して行った:
98℃ 1分間
30×(98℃ 30秒間、65℃ 6分間および15秒/サイクルによって伸長する
72℃ 5分間
10℃ 際限なく
エラー修正
以下のパラメーターを使用する熱サイクルによる変性/アニーリング:
98℃ 2分間
85℃まで2℃/秒
85℃ 2分間
25℃まで0.1℃/秒
25℃ 2分間
10℃ 際限なく
2.7μlを取り除き、5.3μl水/2μl SURVEYOR(商標)ヌクレアーゼ(Transgenomic, Inc., Omaha, NE)/1μl 1:4000希釈したExo IIIを含む8.3μlのエラー修正ミックスに添加した。
1時間42℃にて熱サイクルし、10℃で際限なく
Master Mixレシピについては、上を参照されたい。
エラー修正試料2.5μlを合計反応容積50μlにおいて使用した。
サーマルサイクラー条件については、上を参照されたい。
PCR精製
PCR産物は、AMPURE(登録商標)XP technology(Agencourt, Bioscience Corp. Beverly, MA)を使用して精製した。
およそ3kbの核酸構築物を産生した。電気泳動的ゲルを図2に示す。これらの遺伝子は、すでに哺乳動物細胞にトランスフェクション後の発現のためのプロモーター領域(pol Iおよびpol II)を含む。
遺伝子をベクターと共にGIBSON ASSEMBLY(登録商標)ミックスを使用してpUC19にクローン化した。
以下を合わせた:
5μlのミックス
5μlのDNA増幅産物
ミックスをサーモサイクラー50℃において1時間、次いで10℃で際限なく反応容器中でインキュベートした。
次の工程は、完全なウイルスゲノムを提供するために一定のインフルエンザ遺伝子と遺伝子を組み合わせることである。次いで、遺伝子をMDCK細胞にトランスフェクトして救出されたウイルスを産生する。次いで、細胞は、回収の準備ができているウイルス産物を産生する。
追実験において、配列をインフルエンザA型/Shanghai/2/2013HA遺伝子について実施例1に記載されたような様式で合成した。合成HA配列を、先に述べた自動増幅するRNAワクチン技術に従って、RNA依存性RNAポリメラーゼ遺伝子、遺伝子調節因子およびT7ポリメラーゼプロモーターを含むDNA鋳型にクローン化した(Geall et al., Nonviral delivery of self−amplifying RNA vaccines, PNAS, Vol. 109, No. 36, pp. 14604−09 (2012))。RNAのインビトロでの転写構築物の確認後、RNAのキャッピングおよびBHK細胞のRNAでのトランスフェクションを実施した。転写されたRNAの完全性をアガロースゲル電気泳動によって証明した(図示せず)。細胞は、ゲル電気泳動およびH7特異的抗体でのウェスタンブロットによって示されるとおり、H7 HAを発現した。RNAを脂質ナノ粒子(LNP)送達系においてカプセル化し、ワクチンを使用してマウスを免疫した(Geall et al., and Hekele et al., Emerging Microbes and Infections (2013) 2, e52)。最初の注射の2週後に、7匹のH7/LNP免疫マウスのうちの6匹は、1:20〜1:80の範囲のH7特異的血球凝集素阻害力価で血清変換した(データ示さず)。
本発明は、ファージの産生に適用することができ、これはファージ療法において有用であり得る。一つの態様において、ファージは、バクテリオファージである。ファージ療法は、ヒト、動物および植物において病原性細菌感染の治療のために有用である。特に、ファージ療法は、対照の慣例方法に細菌が応答しない応用において有用であり得る。
生物学的配列情報は、この態様において、送信ユニットと同じコンピュータネットワークに接続するコンピュータである本発明の受信ユニットによって受け取られる。また、受信ユニットは、この態様において、1つのサブユニットとしてBIOAUTOMATION(商標)192Eオリゴヌクレオチド合成機(BioAutomation Corp., Plano, TX)を有するアセンブリーユニットに接続する。アセンブリーユニットの全てのサブユニットを、生物学的配列情報を受け取る前にセットアップする。セットアップは、限定されないが、必要な化学物質、試薬および生物学的ビルディングブロックで全ての容器を装填すること、並びに生物学的配列情報を受け取る前に全てのソフトウェアプログラミングを準備することを含み、その結果、配列情報を受け取ると即時に生物学的実体合成の活性化を開始することができる。方法のそれぞれの工程は、反応容器の異なる反応区画において行われる。
また、以下の工程をアセンブリーユニットによって自動化された様式で行い、これは必要な、および便利である程度に多くのサブユニットを有することができる。アセンブリーユニットのそれぞれのサブユニットには、必要に応じて試薬をあらかじめ装填して全ての工程を行う。オリゴヌクレオチド構築の後、ロボットアームを使用してオリゴ合成機から熱サイクル能力を伴う液体のハンドラへ反応容器を移す。完全に自動化された様式で、上の4つのオリゴヌクレオチドプールのそれぞれの10μlに、10μlのPCR構築試薬を添加する。ここで、約10μMの希釈を利用することができる。PCR試薬の便利な形態は、2×HF PHUSION(登録商標)Mix(Thermo Fisher Scientific Oy, Oy, Fl)である。プロトコルは以下に記載する。
1.それぞれの構築された産物についてPCR反応を自動化された様式で行う:
25.00μl 2×HF PHUSION(登録商標)Mix (Thermo Fisher Scientific Oy, Oy, Fl)
0.25μl 末端プライマー1(100μM)
0.25μl 末端プライマー2(100μM)
22μl 水
2.5μl 鋳型(上からの反応産物のGIBSON ASSEMBLY(登録商標)(Synthetic Genomics, Inc., San Diego, CA))
2.熱サイクルは、以下のパラメーターを使用して行う:
98℃ 1分間
サイクル 25×{98℃ 10秒間、60℃ 30秒間、72℃ 1.5分間)
72℃ 5分間
98℃ 2分間
85℃まで2℃/秒で上昇
85℃ 2分間
25℃まで0.1℃/秒で低下
25℃ 2分間
その後、10℃にて保つ
3.S/Eエラー修正ミックス6.25μlをそれぞれの試料に添加(下のプロトコル)
4.エラー修正反応を1時間42℃にて、次いで、その後反応は、温度を変え、10℃にて保つ。
1.また、以下の4つのPCR反応をアセンブリーユニットの熱サイクルサブユニットによって自動化された様式で行う:
25.00μl 反応あたり 2×HOTSTART−IT(登録商標)Taqマスターミックス(Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA)または代替物(PHUSION(登録商標)(Thermo Fisher Scientific Oy, Oy, Fl)
0.25μl プライマー1(100μM)
0.25μl プライマー2(100μM)
22.00μl MBG 水
2.50μl 上からのエラー修正された鋳型
以下の手順を自動化された様式で行う:
1.それぞれの4つの増幅産物2.5μlを上の第2のPCRから取り除き、96ウェルプレートのもう一つの座標にプールする。
2.Notl制限酵素2μlを添加し、1時間37℃にて、次いでNotl酵素を不活性化するために20分間65℃でインキュベートする。
3.2×GIBSON ASSEMBLYTM(Synthetic Genomics, Inc., San Diego, CA)マスターミックス12μlを添加し、1時間50℃にてインキュベートする。
この工程において、活性ウイルス粒子を産生する。また、これらの工程を自動化された様式で行う。上記のとおりにDNA合成および構築後、構築されたΦX174ゲノムを化学的にコンピテントな大腸菌(E. coli)株Cまたはもう一つのΦX174感受性(senstive)大腸菌(E. coli)株(たとえば、DH10)と合わせる。42℃にて熱ショック後、細胞をSOC培地中に回収する。
1.上の構築反応5μlを容器中で化学的にコンピテントなDH10大腸菌(E. coli)細胞50μlと合わせる。
2.熱サイクルを以下の条件に従って行う:
4℃ 2分間
42℃ 30秒間
4℃ 2分間
3.SOC培地150μlを添加し、細胞を数時間37℃にてインキュベートする。
試薬成分
GIBSON ASSEMBLY(登録商標)(Synthetic Genomics, Inc., San Diego, CA)のための成分
1.5×等温(ISO)反応緩衝液(25% PEG−8000、500mM Tris−HCl pH 8.0、50mM MgCl2、50mM DTT、1mMそれぞれの4つのdNTPおよび5mM NAD)。これを下記のように調製する。
2.T5エキソヌクレアーゼ
3.PHUSION(登録商標)High Fidelity DNAポリメラーゼ(Thermo Fisher Scientific Oy, Oy, Fl)
4.Taq DNAリガーゼ
1.5×ISO緩衝液を調製する。この緩衝液6mlは、以下を組み合わせることによって調製することができる:
3mlの1M Tris−HCl pH 8.0
300μlの1M MgCl2
600μlの10mM dNTP
300μlの1M DTT(10mlまでdH20中に1.54g溶解)
1.5g PEG−8000
300μlの100mM NAD(10mlまでdH20中に0.66g溶解;加熱によって50℃にて再懸濁、続いて連続的にボルテックスする)
水を6miまで添加する。1mlを分注し、−20℃にて保存する。
2.80回の反応のために十分な構築マスター混合物800μlを調製する。これは、以下を組み合わせることによって調製することができる:
320μl 5×ISO緩衝液
6.4μlの1U/μl T5エキソ(1×T5エキソ緩衝液中の酵素ストックから、1:10に希釈)
20μlの2U/μl PHUSION(登録商標)High Fidelity DNAポリメラーゼ(Thermo Fisher Scientific Oy, Oy, Fl)
80μlの40U/μl Taqリガーゼ
374μl dH20
混合物を十分に混合し、−20℃にて、または即時に使用する場合、氷上で貯蔵する。
3.構築混合物は、少なくとも1年間−20℃にて貯蔵することができる。酵素は、少なくとも10回の凍結融解サイクル後、活性なままである。
混合物は、20〜150bp重複をもつDNA分子の構築に理想的である。
エラー修正ミックス成分− SURVEYORヌクレアーゼ+エキソヌクレアーゼIII (S/E)
250μlのSURVEYOR(商標)ヌクレアーゼ(Transgenomic Inc., Omaha, NE)+0.03125μl エキソヌクレアーゼIII
機能的緑色蛍光タンパク質(GFP)および発現のための適切な制御配列をコードする核酸配列を、ARCHETYPE(登録商標)(Synthetic Genomics, Inc., San Diego, CA)または配列を約30bp重複をもつ約60bpオリゴヌクレオチドに分ける別のソフトウェアに入力する。最初および最後のオリゴヌクレオチドは、PCR増幅のためのプライマー結合ドメインおよび増幅後にプライマー結合ドメインを放出するためのNotI制限部位を含み、より大きな断片を構築するために必要である場合、DNA構築のために重複した領域を曝露する。
上に記述したものに類似の合成計画後、生物学的配列情報は実施例に記載したように、発明の受信ユニットによって受け取られる。この態様において、受信ユニットは、送信ユニットと同じコンピュータネットワークに接続されたコンピュータである。受信ユニットは、アセンブリーユニットに接続され、この態様では、1つのサブユニットとしてBIOAUTOMATION(商標)192Eオリゴヌクレオチド合成機(BioAutomation Corp., Plano, TX)を有する。アセンブリーユニットのさらなるサブユニットは、生物学的配列情報を受け取る前に、インビトロでの翻訳のためのサブユニットを含み、必要な化学物質、試薬および生物学的ビルディングブロックで全ての容器を装填すること、並びに生物学的配列情報を受け取る前に全てのソフトウェアプログラミングを調製することによって全てセットアップされ、その結果、配列情報を受け取ると即時に生物学的実体合成の活性化を開始することができる。
HER−2(ヒト上皮成長因子受容体2)は、増幅または過剰発現が一定の乳癌の進行において役割を果たすタンパク質である。タンパク質は、ERBB2遺伝子によってコードされる。数々の抗体療法が利用でき、HER−2を標的とする。ワクチンは、HER−2抗原を含んで作製することができ、これは、患者に投与することができ、次いでワクチンに対する抗原性応答を形成してHER−2に対する抗体を産生するだろう。ワクチンは、癌治療において、およびHER−2抗体の産生が有用な用途であることがわかる任意の療法において有用であり得る。
また、本発明は、DNAワクチンの産生における使用を見いだす。1つまたは複数のHIVタンパク質をコードするDNA配列を、発現のための適切な制御配列をもつ適切なプラスミド(たとえば、pGA2/JS2)のDNA配列を含む適切な長さの重複したオリゴヌクレオチド断片にDNA配列を分離するソフトウェアプログラムに入力する。
サブユニットワクチンは、ウイルス粒子全部を導入する必要なく、免疫系に抗原を示す機会を提供する。1つの例は、インフルエンザウイルスに対する免疫を提供するためのOPTAFLU(登録商標)(Novartis Vaccines and Diagnostics, GmbH, Marburg, Germany)ワクチンである。本発明をサブユニットワクチンの迅速な産生において適用することができる。
非感染性ウイルス様粒子(VLP)は、構築されたウイルス粒子を示す必要なく、免疫系を活性化する能力をもつワクチンを製造するために使用することができる。ヒトパピローマウイルス(HPV)に対するワクチンは、L1および/またはL2主要キャプシドタンパク質を使用して製造することができ、これが抗原として有効であるウイルス様粒子に自己組織化する。これらのVLPは、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞または細菌において構築することができる。この種のワクチンの例は、GARDASIL(登録商標)(Merck Sharp & Dohme Corp., Whitehouse Station, NJ)である。複数のHPV L1ウイルス様粒子を免疫の最も幅広いスペクトルについて単一のワクチンに含むことができる。
もう一つの実施形態において、ウイルスワクチン全体を、逆遺伝学技術を使用して細胞培養において合成することができる。インフルエンザA型ゲノムは、8つのウイルスの遺伝子セグメントで構成され、HAおよびNAセグメントを含み、ウイルスへの免疫応答において重要である。一つの態様において、アセンブリーユニットは、ウイルス産生のために、たとえばMDCK細胞、293T細胞またはVero細胞を維持するサブユニットを有する(また、これらの成分は、反応容器の1つまたは複数のさらなる区画において維持することができる)。複数の転写カセットを含むプラスミドを8つのウイルスの遺伝子および必要な制御配列を含んで構築することができる。8つの遺伝子は、必要に応じて複数のプラスミドまたは単一のプラスミド上に存在することができる。HAおよびNAセグメントは、局所的脅威を示すウイルスに由来する配列に基づく。したがって、一つの態様において、6つの非変異遺伝子を事前に調製し、HAおよびNA遺伝子のみをシステムによって合成する。次いで、6つの非変異遺伝子は、方法において試薬として扱うことができる。しかし、もう一つの態様において、アセンブリーユニットのサブユニットは、受信ユニットから受け取った情報に基づいたプラスミドを合成する。いずれの態様においても、合成後、プラスミドを高トランスフェクション効率のための条件下でアセンブリーユニットのもう一つのサブユニットにおいて維持されている細胞培養にトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞は、生きている弱毒ワクチンとして、または要望に応じて、殺された、またはさらに不活性化されたワクチンとして製剤化することができるウイルス粒子全体を産生する。
Claims (35)
- 生物学的配列情報を受け取り、機能的生物学的実体の合成を活性化するためのシステムであって:
受信ユニットから離れた位置に存在する送信ユニットから伝達された、生物学的配列情報をコードするシグナルを受け取るための受信ユニット;
生物学的配列情報に従って生物学的実体を構築するための、受信ユニットに接続されたアセンブリーユニットであって、生物学的ビルディングブロック分子を含有する容器を含むか、またはそれに接続され、かつ、システム中の試薬を輸送するための、および機能的生物学的実体を合成するために自動化された方法における工程を実行するための構成要素を含有する、アセンブリーユニット;
を含み、受信ユニットが、生物学的配列情報を受け取り、アセンブリーユニットにそれを提供する、システム。 - 送信ユニットおよび受信ユニットが、コンピュータネットワークの一部であるコンピュータである、請求項1記載のシステム。
- 生物学的ビルディングブロックが、dNTPまたはヌクレオシドホスホラミダイトである、請求項1記載のシステム。
- 生物学的配列情報に従ってdNTPまたはヌクレオシドホスホラミダイトをオリゴヌクレオチドのセットに構築するためのプログラミング命令をさらに含む、請求項3記載のシステム。
- オリゴヌクレオチドのセットをDNA分子に構築するためのプログラミング命令をさらに含む、請求項3記載のシステム。
- 機能的生物学的実体がDNA分子である、請求項3記載のシステム。
- 生物学的産物への機能的DNA分子の転写および/または翻訳のための試薬を含有する1つまたは複数の容器をさらに含む、請求項5記載のシステム。
- 生物学的配列情報が、ウイルス粒子またはバクテリオファージの少なくとも一部をコードする核酸をコードする、請求項3記載のシステム。
- アセンブリーユニットが、生物学的実体を生物学的産物にさらに変換する、請求項6記載のシステム。
- 生物学的産物が、ウイルス粒子またはウイルス粒子の一部である、請求項9記載のシステム。
- ウイルス粒子またはウイルス粒子の一部がタンパク質抗原を含む、請求項10記載のシステム。
- アセンブリーユニットがさらに、宿主細胞を含む容器を含むか、またはそれに接続されている、請求項9記載のシステム。
- 反応容器の異なる区画において自動化された方法の工程を行うためのプログラミング命令をさらに含む、請求項1記載のシステム。
- 以下の段階を含む、機能的生物学的実体を合成する方法:
機能的生物学的実体を合成するためのシステムにおいて送信ユニットから生物学的配列情報を受け取る段階であって、システムが、
送信ユニットから伝達された生物学的配列情報をコードするシグナルを受け取るための、送信ユニットから離れた位置に存在する受信ユニット;
生物学的配列情報に従って機能的生物学的実体を構築するための、受信ユニットに接続されたアセンブリーユニットであって、生物学的ビルディングブロック分子、および、生物学的ビルディングブロック分子から機能的生物学的実体を合成する反応を行うための試薬を含有する容器を含むか、またはそれに接続された、アセンブリーユニット;
を含み、アセンブリーユニットが、生物学的配列情報に従って生物学的実体を構築するように構成されている、段階;ならびに、
自動化された方法において機能的生物学的実体を合成する段階。 - 送信ユニットおよび受信ユニットが、コンピュータネットワークの一部であるコンピュータである、請求項14記載の方法。
- アセンブリーユニットが、生物学的配列情報を受け取る前に、機能的生物学的実体の構築のために調製されている、請求項14記載の方法。
- 生物学的ビルディングブロックが、dNTPまたはヌクレオシドホスホラミダイトである、請求項14記載の方法。
- システムが、生物学的配列情報に従ってdNTPまたはヌクレオシドホスホラミダイトをオリゴヌクレオチドのセットに構築するためのプログラミング命令をさらに含む、請求項17記載の方法。
- システムが、オリゴヌクレオチドのセットをDNA分子に構築するためのプログラミング命令をさらに含む、請求項18記載の方法。
- 機能的生物学的実体がDNA分子である、請求項14記載の方法。
- システムが、RNA分子へのDNA分子の転写のための1つまたは複数の容器および試薬を含む、請求項19記載の方法。
- システムが、機能的なタンパク質またはペプチドへのRNA分子のインビトロ翻訳のための1つまたは複数の容器および試薬をさらに含む、請求項21記載の方法。
- 生物学的配列情報が、ウイルス粒子の少なくとも一部をコードする核酸分子をコードする、請求項14記載の方法。
- 機能的なタンパク質またはペプチドがウイルスのタンパク質またはペプチドである、請求項22記載の方法。
- DNA分子が5kbより大きい、請求項20記載の方法。
- ビルディングブロック分子が、ビルディングブロック重合体を形成するようにインビトロ反応で連結される、請求項14記載の方法。
- ビルディングブロック分子がヌクレオチドまたはヌクレオシドホスホラミダイトであり、ビルディングブロック重合体がオリゴヌクレオチドである、請求項26記載の方法。
- 反応容器の第1の区画から反応容器の第2の区画までオリゴヌクレオチドを輸送することをさらに含む、請求項27記載の方法。
- 反応容器の第1の区画において方法の1つの工程を、および反応容器の第2の区画において方法の第2の工程を行うことをさらに含む、請求項27記載の方法。
- 生物学的実体を合成する段階がDNA構築工程を含む、請求項27記載の方法。
- 方法の工程が、複数のレベルの生物学的構築を含む、請求項30記載の方法。
- DNA構築工程およびRNA転写工程を含む、請求項31記載の方法。
- DNA構築工程が反応容器の第1の反応区画において行われ、かつRNA転写工程が反応容器の第2の反応区画において行われる、請求項32記載の方法。
- 反応容器の第3の反応区画におけるインビボでのウイルス粒子の産生を含む工程をさらに含む、請求項32記載の方法。
- 以下を含む、提供された生物学的配列情報に従った機能的生物学的実体の合成のための自動化されたシステム:
提供された生物学的配列情報に従って生物学的実体を構築するためのアセンブリーユニットであって、生物学的ビルディングブロック分子を含有する容器を含むか、またはそれに接続され、かつ、システム中の試薬を輸送するための、および機能的生物学的実体を合成するために自動化された方法における工程を実行するための構成要素を含有する、アセンブリーユニット。
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JP2020530979A (ja) * | 2017-06-30 | 2020-11-05 | インスクリプタ, インコーポレイテッド | 自動細胞処理方法、モジュール、機器及びシステム |
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