JP2015525222A - キメラ性凝固因子 - Google Patents

キメラ性凝固因子 Download PDF

Info

Publication number
JP2015525222A
JP2015525222A JP2015516265A JP2015516265A JP2015525222A JP 2015525222 A JP2015525222 A JP 2015525222A JP 2015516265 A JP2015516265 A JP 2015516265A JP 2015516265 A JP2015516265 A JP 2015516265A JP 2015525222 A JP2015525222 A JP 2015525222A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
chimeric protein
moiety
polypeptide
factor
linker
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2015516265A
Other languages
English (en)
Inventor
ジョー サラス，
ジョー サラス，
エレナ キスタノーバ，
エレナ キスタノーバ，
ブ フォン ホン，
ブ フォン ホン，
アダム アール． メゾ，
アダム アール． メゾ，
ロバート ピーターズ，
ロバート ピーターズ，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biogen MA Inc
Original Assignee
Biogen MA Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen MA Inc filed Critical Biogen MA Inc
Publication of JP2015525222A publication Critical patent/JP2015525222A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6432—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21006—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、活性化可能な凝固因子および増強部分を含有するキメラ凝固因子を提示する。活性化可能な凝固因子により、キメラ凝固因子は凝固部位で活性化される。増強部分により、キメラ凝固因子の凝固促進活性がさらに改善されてもよい。キメラ凝固因子は、キメラ凝固因子の薬物動態特性を改善する半減期延長物質への融合によってさらに改善されてもよい。本発明はまた、これらのキメラ凝固因子の作成方法および使用方法を含有する。

Description

外因性凝固系の始まりは、組織因子（血管壁への外傷により露出される）と第ＶＩＩａ因子の複合体形成により調節されている。次いで、この複合体は第ＩＸ因子とＸ因子を、活性形態（第ＩＸａ因子と第Ｘａ因子）へと変換する。第Ｘａ因子は、組織因子を産生する細胞のわずかな量のプロトロンビンをトロンビンへと変換する。得られたトロンビンは、次いで、組織因子を産生する細胞から拡散し、血小板ならびに、第Ｖａ因子およびＶＩＩＩａ因子を作る第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子を活性化する。凝固の伝搬フェーズの間、第ＩＸａ因子（第ＶＩＩＩａ因子との複合体）により第Ｘａ因子が活性化血小板の表面上で創出される。第Ｖａ補因子との複合体である第Ｘａ因子は、プロトロンビンをトロンビンへと活性化し、トロンビンバーストを引き起こす。このカスケードは最終的に、トロンビンによる、フィブリノーゲンのフィブリンへの転換に終わり、フィブリン塊の形成がもたらされる。第ＶＩＩ因子および組織因子は、血液凝固開始の重要なプレイヤーである。
第ＶＩＩ因子は、単鎖チモーゲンとして血中を循環する血漿糖タンパク質であり、触媒的に不活性である。単鎖第ＶＩＩ因子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで様々な因子により二鎖の第ＶＩＩａ因子に転換されうるが、第Ｘａ因子は第ＶＩＩ因子の重要な生理学的活性化物質である。第ＶＩＩ因子チモーゲンの活性化二鎖分子への転換は、アミノ酸第１５２位のアルギニン残基とアミノ酸第１５３位のイソロイシン残基をつなぐペプチド結合の開裂により発生する。組織因子、リン脂質およびカルシウムイオンの存在下で、二鎖第ＶＩＩａ因子は第Ｘ因子または第ＩＸ因子を活性化する。第ＶＩＩａ因子は、凝固カスケードの生理学的なイニシエーターであると考えられており、ＴＦ産生細胞の表面で作用し、初期量のトロンビンを生成し、次いで、当該初期量のトロンビンは血小板へと拡散し、トロンビン生成の拡大相に向かって、血小板を活性化およびプライムする。治療的には、組換えＦＶＩＩａは、活性化血小板の表面上で第Ｘ因子を活性化することにより作用し、凝固の拡大相の間のトロンビンバーストをもたらすためのＦＩＸａまたはＦＶＩＩＩａを必要としない。ＦＶＩＩａの血小板へのアフィニティは比較的低いため、組換えＦＶＩＩａは生理学的レベルを超えたレベルで投薬される。このプロセスは組織因子非依存性であると考えられている。
第Ｘ因子も単鎖ポリペプチド（Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇトリペプチドにより連結された軽鎖および重鎖を含有する）として合成される。次いで、当該単鎖分子は、２つ（またはそれ以上）の内部ペプチド結合の開裂により、軽鎖と重鎖に転換される。血漿中においては、これら２つの鎖は、ジスルフィド結合により共に結合され、第Ｘ因子を形成する。活性化第Ｘ因子である第Ｘａ因子は最終共通経路に参入し、それによりプロトロンビンがトロンビンに転換され、次いで、フィブリノーゲンがフィブリンに転換される。
凝固因子は、しばらくの間、止血を改善するために患者に投与されてきた。組換えＤＮＡ技術の到来により、凝固障害を有する患者の治療が著しく改善され、それにより安全で一定したタンパク質治療の開発が可能となった。たとえば、組換え活性化第ＶＩＩ因子は、たとえば血友病Ａ患者もしくは血友病Ｂ患者、第ＸＩ凝固因子欠損症患者もしくは凝固第ＶＩＩ因子欠損症患者、不完全な血小板機能を有する患者、血小板減少症の患者、またはｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ症の患者に発生する大量出血の治療に広く用いられるようになった。
そのような組み換え分子は有効的ではあるが、治療剤を凝固部位に局在させて薬物動態特性を改善し、クリアランス率を低下させ、製造可能性が改善され、血栓形成が減少し、または活性が増強され、またはこれら特性の１以上を有する、改良版が必要とされている。
本発明により、（ｉ）活性化可能な凝固因子（Ａｃ）、（ｉｉ）増強部分（Ｅｍ）、および、（ｉｉｉ）任意選択的に、活性化可能な凝固因子と増強部分の間のリンカー部分（ＬまたはＬ１）、を含有するキメラタンパク質が提示される。活性化可能な凝固因子および増強部分は、互いに連結されているか、または関連づけられているが、化学的に架橋されていなくてもよい。キメラタンパク質は、化学式Ａｃ−Ｌ−Ｅｍ、またはＥｍ−Ｌ−Ａｃで表されてもよく、ここで、Ａｃは、活性化可能な凝固因子を含有し；ここで、Ｌは、任意選択的なリンカー部分を含有し；および、ここで、Ｅｍは増強部分を含有する。
１つの実施態様において、活性化可能な凝固因子は、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）ならびに当該ＨＣおよび当該ＬＣの間に挿入されたプロテアーゼ開裂部位を含有する凝固因子チモーゲンを含有する。凝固因子チモーゲンは、ＦＶＩＩタンパク質（たとえば、ＦＶＩＩ、その機能性断片、誘導体または変異体）、またはＦＸタンパク質（ＦＸ、その機能性断片、誘導体または変異体）であってもよい。本発明の実施態様には、当該プロテアーゼ開裂部位および当該ＨＣの間に挿入される、自己犠牲部分（たとえば、ＰＡＢＣ）をさらに含有するキメラタンパク質が含まれる。当該ＨＣおよび当該ＬＣの間に挿入されたプロテアーゼ開裂部位は、トロンビン（第ＩＩａ因子）、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるプロテアーゼにより開裂されてもよく、ここで、当該プロテアーゼ開裂部位は、当該凝固因子チモーゲンに自然発生するものではない。
他の実施態様において、増強部分は、凝固補因子、凝固促進ペプチド、または抗原結合部分を含有する。凝固補因子の例としては、限定されないが、組織因子、その断片（たとえば、可溶性組織因子）、変異体もしくは誘導体、または、ＦＶａ、その断片、変異体もしくは誘導体が挙げられる。抗原結合部分の非限定的な例としては、抗体、またはその抗原結合断片（ＦＶＩＩタンパク質またはＦＸタンパク質に結合することができ、および、それぞれ、ＦＶＩＩまたはＦＸの活性を増強する）が挙げられる。
一部の実施態様において、キメラタンパク質には、活性化凝固因子、リンカー部分、または増強部分に連結された、異種部分（Ｈｅｔ）（たとえば、半減期延長物質）がさらに含有される。半減期延長物質の非限定的な例としては、イムノグロブリン定常領域もしくはその一部（たとえば、Ｆｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナー）、アルブミン、トランスフェリン、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＸＴＥＮ配列、ＨＥＳ配列、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）のβサブユニット、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合小分子、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。イムノグロブリン定常領域またはその一部は、Ｆｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナーを含有しても良い。
他の実施態様において、キメラタンパク質は、第一の異種部分（Ｈｅｔ１）および第二の異種部分（Ｈｅｔ２）を含有する。Ｈｅｔ１およびＨｅｔ２のそれぞれ、または両方は、半減期延長物質（たとえば、イムノグロブリン定常領域もしくはその一部（たとえば、Ｆｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナー）、アルブミン、トランスフェリン、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＸＴＥＮ配列、ＨＥＳ配列、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）のβサブユニット、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合小分子、またはそれらの任意の組み合わせ）を含有しても良い。任意選択的に、ある実施態様において、第一の異種部分は、第一のリンカー（Ｌ１）を介して活性化可能な凝固因子に連結され、および、第二の異種部分は、第二のリンカー（Ｌ２）を介して増強部分に連結される。キメラタンパク質は、１つのリンカー（Ｌ１またはＬ２）のみを含有しても良く、または両方のリンカーを含有しても良い。
さらに他の実施態様において、キメラタンパク質は、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、第一のポリペプチド鎖は活性化可能な凝固因子（Ａｃ）を含有し、第二のポリペプチド鎖は増強部分（Ｅｍ）を含有し、ここで、当該第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖は、互いに関連付けられている。たとえば、第一のポリペプチド鎖が、活性化可能な凝固因子（Ａｃ）、第一の異種部分（Ｈｅｔ１）、および第一の任意選択的なリンカー部分（Ｌ１）を含有してもよく、ならびに、第二のポリペプチド鎖が、増強部分（Ｅｍ）、第二の異種部分（Ｈｅｔ２）、および第二の任意選択的なリンカー部分（Ｌ２）を含有してもよく、ここで、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖は、互いに関連付けられている。
さらに他の実施態様において、キメラタンパク質は、
（ａ）リンカー部分を介してＨｅｔ１に連結されたＡｃ、およびＨｅｔ２に連結されたＥｍ、
（ｂ）第一のリンカー部分を介してＨｅｔ１に連結されたＡｃ、および第二のリンカー部分を介してＨｅｔ２に連結されたＥｍ、
（ｃ）Ｈｅｔ１に連結されたＡｃ、およびリンカー部分を介してＨｅｔ２に連結されたＥｍ、
（ｄ）Ｈｅｔ１に連結されたＡｃ、およびＨｅｔ２に連結されたＥｍ、
（ｅ）リンカー部分を介してＨｅｔ１に連結されたＥｍ、およびＨｅｔ２に連結されたＡｃ、
（ｆ）第一のリンカー部分を介してＨｅｔ１に連結されたＥｍ、および第二のリンカー部分を介してＨｅｔ２に連結されたＡｃ、
（ｇ）Ｈｅｔ１に連結されたＥｍ、およびＡｃはリンカー部分を介してＨｅｔ２に連結されている、または、
（ｈ）Ｈｅｔ１に連結されたＥｍ、およびＨｅｔ２に連結されたＡｃ、
から選択される構造を有する。
さらに他の実施態様において、２つのポリペプチド鎖を含有するキメラタンパク質は、
（ａ）第一のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、第二のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、
（ｂ）第一のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、第二のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、
（ｃ）第一のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、第二のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、
（ｄ）第一のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、第二のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｌ１−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、
（ｅ）第一のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、第二のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、
（ｆ）第一のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｌ１−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、第二のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、
（ｇ）第一のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、第二のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、ならびに、
（ｈ）第一のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、第二のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、そして、
ここで、２つのポリペプチド鎖のＨｅｔ１およびＨｅｔ２は、ジスルフィド結合を形成する、
から構成されてもよい。
一部の実施態様において、キメラタンパク質は単一ポリペプチド鎖である。たとえば、キメラタンパク質は、増強部分に連結されたｓｃＦｃ（Ｘ）、および、活性化可能な凝固因子に連結された第一の異種部分、または活性化可能な凝固因子、および、増強部分に連結された第二の異種部分をさらに含有しても良い。単一鎖キメラタンパク質の例は、以下から選択される化学式を含んでも良い：
（１）Ａｃ−Ｈｅｔ１−Ｘ−Ｅｍ−Ｈｅｔ２；
（２）Ａｃ−Ｈｅｔ１−Ｘ−Ｅｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ２；
（３）Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ１−Ｘ−Ｅｍ−Ｈｅｔ２；
（４）Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ１−Ｘ−Ｅｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ２；
（５）Ｈｅｔ２−Ｅｍ−Ｘ−Ｈｅｔ１−Ａｃ；
（６）Ｈｅｔ２−Ｌ２−Ｅｍ−Ｘ−Ｈｅｔ１−Ａｃ；
（７）Ｈｅｔ２−Ｅｍ−Ｘ−Ｈｅｔ１−Ｌ１−Ａｃ；または、
（８）Ｈｅｔ２−Ｌ２−Ｅｍ−Ｘ−Ｈｅｔ１−Ｌ１−Ａｃ、
ここで、（ａ）Ａｃは、活性化可能な凝固因子であり、（ｂ）Ｌ１は、第一の任意選択的なリンカー部分であり、（ｃ）Ｈｅｔ１は、第一の異種部分であり、（ｄ）Ｘは、ｓｃＦｃリンカーであり、（ｅ）Ｅｍは、増強部分であり、（ｆ）Ｌ２は、任意選択的な第二のリンカー部分であり、（ｇ）Ｈｅｔ２は、第二の異種部分であり、および、（ｈ）（−）は、ペプチド結合または１以上のアミノ酸である。１つの実施態様において、ｓｃＦｃリンカーは、プロセッシング可能なリンカー（ｃｓｃＦｃ）であり、少なくとも１つの細胞内プロセッシング部位を有する。プロセッシング可能なリンカーは、酵母Ｋｅｘ２、ＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ２、ＰＣＳＫ３、ＰＣＳＫ４、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、ＰＣＳＫ７、またはそれらの任意の組み合わせから選択される１以上の細胞内プロセッシング酵素により２以上のポリペプチド鎖へとプロセッシングされても良い。１つの実施態様において、細胞内プロセッシング部位は、ＰＣＳＫ５によりプロセッシングされる。
一部の実施態様において、キメラタンパク質はポリシアル化され、ペグ化され、グリコシル化され、ヘシル化され（ｈｅｓｙｌａｔｅｄ）、γ−カルボキシル化され、またはそれらの任意の組み合わせである。
また、キメラタンパク質もしくはその相補物をコードする核酸分子が含まれ、第一のヌクレオチド配列（ＮＡ１）および第二のヌクレオチド配列（ＮＡ２）を含有する核酸分子のセット（ＮＡ１は二鎖のキメラタンパク質またはその相補物の第一のポリペプチドをコードし、ＮＡ２は二鎖キメラタンパク質またはその相補物の第二のポリペプチドをコードする）が含まれ、当該核酸分子もしくは当該核酸分子のセットを含有するベクターが含まれ、または、当該ベクターもしくはベクターのセットを含有する宿主細胞が含まれる。
本発明はまた、当該キメラタンパク質、核酸分子、ベクター、および宿主細胞を含有する医薬組成物を目的とするものであり、および、当該キメラタンパク質、核酸分子もしくは核酸分子のセット、ベクターもしくはベクターのセット、宿主細胞、または医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、それを必要としている対象における出血性疾患または障害を治療、改善または予防するための方法を目的とする。当該組成物により治療可能または予防可能な出血性疾患または障害は、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、および腸腰筋鞘の出血から選択される。本発明の組成物はまた、当該キメラタンパク質、核酸分子もしくは核酸分子のセット、ベクターもしくはベクターのセット、宿主細胞または医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、哺乳類の対象における凝固因子欠損症を治療、改善、または予防するために用いられても良く、ここで、当該凝固因子は、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸまたはＦＸＩから選択される。
特定の実施態様において、キメラタンパク質または組成物は、バイパス治療において出血性疾患または障害を治療、改善または予防するために用いられる。バイパス治療において、対象は、第ＶＩＩＩ因子に対する阻害物質を発現している、または発現する傾向があっても良い。
本発明はまた、単一鎖キメラタンパク質（ｓｃＦｃリンカーを含み、当該ｓｃＦｃリンカーは、細胞内プロセッシング酵素により細胞内で開裂される）をコードするヌクレオチド配列を発現することを含む、キメラタンパク質の製造方法を含む。当該ヌクレオチド配列により産生されるキメラタンパク質は、細胞内プロセッシング部位のプロセッシングに起因する、２つのポリペプチド鎖を含有する。
トロンビン活性化可能な凝固因子またはＦＸＩａ活性化可能な凝固因子、および増強部分（一部においては、「活性増強部分」と呼称される）を含有する、例示的なキメラタンパク質（たとえば、キメラ凝固因子）の概略を図示する。図１Ａは、凝固カスケードプロテアーゼ開裂部位（たとえば、トロンビン開裂部位またはＦＸＩａ開裂部位）に連結されたＦＸに対する任意的な活性化ペプチドを有するＦＶＩＩまたはＦＸ軽鎖（それらはさらにＦＶＩＩまたはＦＸ重鎖に連結される）を示す。次いで、ＦＶＩＩまたはＦＸ重鎖は、リンカーを介して増強部分に連結される。図１Ａの構築物がチモーゲン(非活性形態)として投与される場合、当該構築物は、投与時（活性化の前）、プロテアーゼ阻害物質に対して抵抗性である。凝固因子が図１Ｂに示される外傷部位で活性化される場合、当該凝固因子は、増強部分により刺激された高い活性を示しうる。 トロンビン活性化可能な分子および増強部分を含有するキメラＦＶＩＩタンパク質の略図を図示する。図２Ａは、トロンビン開裂部位に連結されたＦＶＩＩ軽鎖（ＦＶＩＩ重鎖にさらに連結される）を示す。次いで、ＦＶＩＩ重鎖はリンカーを介して増強部分に連結され、非活性なチモーゲンの形態となる。動物に投与される場合、このチモーゲンは循環中のプロテアーゼ阻害物質に対して抵抗性であり、外傷部位で活性化形態（図２Ｂ）へと転換されることが可能である。凝固因子の活性は、増強部分により刺激されうる。増強部分の例としては、可溶性組織因子（ｓＴＦ）、凝固促進ペプチドおよび抗体断片が挙げられる。 トロンビン活性化可能なＦＶＩＩ分子、増強部分としてのｓＴＦ分子、および異種部分（Ｈｅｔ）を含有する分子の概略を図示する（半減期延長のためのＦｃ部分として示される）。図３Ａの構築物には、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖が含まれ、ここで第一のポリペプチド鎖には、Ｎ末端からＣ末端への順で、ＦＶＩＩ軽鎖、トロンビン開裂部位、ＦＶＩＩ重鎖、第一のリンカーおよび第一のＦｃ部分（Ｈｅｔ１）が含まれ、第二のポリペプチド鎖には、Ｎ末端からＣ末端への方向で、ｓＴＦ、第二のリンカー、および第二のＦｃ部分（Ｈｅｔ２）が含まれる。第一のリンカーおよび第二のリンカーは、同一または異なっていても良い。第一のＦｃ部分および第二のＦｃ部分は、同一または異なっていても良い。図３Ａの構築物（すなわち、チモーゲン（非活性形態））が投与される場合、当該構築物は、投与時（活性化の前）、プロテアーゼ阻害物質に対して抵抗性である。凝固因子が図３Ｂに示されるように外傷部位でトロンビンにより活性化される場合、当該凝固因子は増強部分により刺激された高い活性を示しうる。 図４Ｂの構築物の作製の概略を示す（図３Ａと類似）。図４Ａ（左の構築物）は、Ｎ末端からＣ末端への順で、ＦＶＩＩ軽鎖、トロンビン開裂部位（ＡＬＲＰＲ（配列番号１））、ＦＶＩＩ重鎖、第一のリンカー、第一のＦｃ部分（Ｈｅｔ１）、第一の細胞内プロセッシング部位（ＲＲＲＲ（配列番号２））、第二のリンカー、第二の細胞内プロセッシング部位（たとえば、ＲＫＲＲＫＲ（配列番号３））、ｓＴＦ、第三のリンカー、および第二のＦｃ部分（Ｈｅｔ２）をコードする単一のポリペプチド配列を示す。当該単一のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（ＦＶＩＩＩ−１３３）は、宿主細胞中で発現されてもよく、および、当該単一のポリペプチド配列は、第一の細胞内プロセッシング部位および第二の細胞内プロセッシング部位が、プロペプチドエンドペプチダーゼ（たとえば、ＰＣＳＫ５）により開裂されるように、細胞内プロセッシングを受ける。ゆえに、第一の細胞内プロセッシング部位および第二の細胞内プロセッシング部位の間に挿入された第二のリンカーは、ＰＣＳＫ５により取り除かれることができる。図４Ｂは、当該リンカーがプロセッシングにより除去された後の最終構築物（開裂の後も残る細胞内プロセッシング部位の部分を含有しても良い）を示す。この残ったリンカー部分部分は、約１〜約１０、１〜約４の一連のアミノ酸を含有しても良い。図４Ｃは、示されるように、非還元条件または還元条件のいずれかの下での、トロンビン活性化可能なＦＶＩＩ−Ｆｃ／ｓＴＦ−Ｆｃキメラタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 還元条件下での、トロンビン活性化可能なＦＶＩＩ−Ｆｃ／ｓＴＦ−Ｆｃ二量体（ＦＶＩＩ−１３３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。２レーン（すなわち、溶出液）は、精製されたトロンビン活性化可能なＦＶＩＩ−Ｆｃ／ｓＴＦ−Ｆｃ二量体を示す。 ＦＶＩＩ−１３３およびＦＶＩＩａＦｃの活性を検証するために、トロンビン生成アッセイにより作製されたデータを示す。組織因子（ＴＦ）の非存在下、または存在下でのＦＶＩＩ−１３３の活性は、それぞれ、円（●）および四角（■）で示される。ＴＦの非存在下、または存在下でのＦＶＩＩａＦｃの活性は、それぞれ、三角（▲）またはひし形（◆）で示される。ｙ軸は、トロンビンのナノモル（ｎＭ）を示し、ｘ軸は時間を示す。ＦＶＩＩａＦｃ構築物は、２つのポリペプチド鎖、つまり、第一のＦｃ領域に連結された活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）からなる第一の鎖、およびＦｃ領域からなる第二の鎖からなる。 ＦＶＩＩ−１３３およびＦＶＩＩａＦｃの活性を検証するために、マウス血友病Ｂ血液でＲＯＴＥＭアッセイにより作製されたデータを示す。図７Ａおよび７Ｂは、ＦＶＩＩ−１３３に対する凝固時間およびα角を示す。図７Ｃおよび７Ｄは、それぞれ、ＦＶＩＩａＦｃおよびビヒクルの凝固時間およびα角を示す。 ８Ａ〜Ｃは、ヒト血友病Ａ血液における、ＲＯＴＥＭアッセイにより測定されたＦＶＩＩ活性を示す。ＦＶＩＩ−１３３、ＦＶＩＩ−１８４およびＦＶＩＩａを、血友病Ａドナー由来のクエン酸化ヒト血液へと混入させた。ＦＶＩＩ−１３３の構造は図４に示されている。ＦＶＩＩ−１８４は、ＦＶＩＩ−１３３の変異形態であり、Ａｒｇ残基（トロンビン開裂にとって必須である）のＡｌａへの変異により、トロンビン活性化に対し非感受性である。ＦＶＩＩＩ−１８４は、その他の点ではＦＶＩＩ−１３３と同一である。ＦＶＩＩ−１３３（三角）、ＦＶＩＩ−１８４（四角）およびＦＶＩＩａ（円）に対する凝固時間（ＣＴ）、凝固形成時間（ＣＦＴ）、およびα角を測定した。血友病Ａドナーにおける基準凝固時間は、ひし形（◇）で示されている。図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃはそれぞれ、凝固時間、凝固形成時間およびα角の結果のグラフを示す。ＦＶＩＩａは、ＦＶＩＩａ活性に対する対照として用いられた。 ｅｘ ｖｉｖｏＲＯＴＥＭアッセイによる、ｈｅｍＢマウスにおけるＦＶＩＩ−１３３のｅｘ ｖｉｖｏ有効性を示す。凝固時間（ＣＴ）は、それぞれ、ビヒクル、ＦＶＩＩａ、およびＦＶＩＩ−１３３が尾静脈注射を介して投与されたマウスから採取された血液に対して測定された。 Ａ〜Ｂは、タンパク質投与後の時間関数として、ＦＶＩＩおよびＦＶＩＩ／ＡＴＩＩＩ複合体血漿レベルを示す。ＨｅｍＢマウスに、ＦＶＩＩ−１３３、ｒＦＶＩＩａＦｃ、またはｒＦＶＩＩａをｉ．ｖ．投与した。様々な時点での血漿試料を採取し、ＦＶＩＩ抗原レベル（図１０Ａ）、ＦＶＩＩ−１３３／ＡＴＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＦｃ−ＡＴＩＩＩ複合体(図１０Ｂ）を、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＦＶＩＩ−１３３（点線、円）、およびＦＶＩＩａＦｃ（実線、三角）のＰＫ特性（平均滞留時間（ＭＲＴ）を含む）は、Ｐｈｏｅｎｉｘ６プログラムを用いた２コンパートメント解析により作製された。 Ａ〜Ｂは、タンパク質投与後の時間関数として、ＦＶＩＩおよびＦＶＩＩ／ＡＴＩＩＩ複合体血漿レベルを示す。ＨｅｍＢマウスに、ＦＶＩＩ−１３３、ｒＦＶＩＩａＦｃ、またはｒＦＶＩＩａをｉ．ｖ．投与した。様々な時点での血漿試料を採取し、ＦＶＩＩ抗原レベル（図１０Ａ）、ＦＶＩＩ−１３３／ＡＴＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＦｃ−ＡＴＩＩＩ複合体(図１０Ｂ）を、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＦＶＩＩ−１３３（点線、円）、およびＦＶＩＩａＦｃ（実線、三角）のＰＫ特性（平均滞留時間（ＭＲＴ）を含む）は、Ｐｈｏｅｎｉｘ６プログラムを用いた２コンパートメント解析により作製された。 ＲＯＴＥＭアッセイにより計測された、ヒトＨｅｍＡ血液におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ凝固時間を示す。ＦＶＩＩ−２１２（ＦＶＩＩ−１３３と同一の構造を有する）の凝固活性を測定した。当該タンパク質をクエン酸化ヒトＨｅｍＡ血液へと混入させた。凝固はカルシウムにより開始され、凝固時間はＮＡＴＥＭプログラムでＲＯＴＥＭ機器に記録された。ｘ軸はｒＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩ−２１２のいずれかの濃度（ｎＭ）を示し、ｙ軸は凝固時間を示す。 マウスＨｅｍＡの血液（大静脈（Ｖｅｎａ ｃａｖａ）の出血により採取された）における、ＲＯＴＥＭアッセイにより計測されたｉｎ ｖｉｔｒｏ凝固時間を示す。当該タンパク質はクエン酸化マウスＨｅｍＡ血液へと混入された。凝固はカルシウムにより開始され、凝固時間はＮＡＴＥＭプログラムでＲＯＴＥＭ機器に記録された。ｘ軸は混入されたｒＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩ−２１２の濃度（ｎＭ）を示し、ｙ軸は凝固時間を示す。 ＨｅｍＡマウスにおけるｅｘ ｖｉｖｏの有効性を示す。ＦＶＩＩ−２１２（三角）を、１０ｎｍｏｌ／ｋｇでＨｅｍＡマウスに投与した。投与後の様々な時点で、大静脈を介して血液を採取し（抗凝固剤としてクエン酸およびコーントリプシン阻害物質（ＣＴＩ）を使用）、凝固活性をＮＡＴＥＭプログラムで、ＲＯＴＥＭアナライザーにより測定した。ｒＦＶＩＩａ（円）は、対照として用いた。ｘ軸はタンパク質投与後の時間（時）を示し、ｙ軸は凝固時間を示す。 ＨｅｍＡマウスにおける、ｒＦＶＩＩａ(円)、ＦＶＩＩ−２１２（四角）およびｒＦＶＩＩ／ＡＴＩＩＩ（三角）の薬物動態を示す。タンパク質の濃度（ｙ軸）を、時間（ｘ軸）に対してプロットした。 クロモザイム（ｃｈｒｏｍｏｚｙｍｅ）ｔ−ＰＡ基質を用いた、トロンビン活性化前後に測定されたＦＶＩＩ−２１２のアミド溶解活性を示す。トロンビン後のＦＶＩＩ−２１２は、逆三角形として表されている（上から下に向かう最初の線）。ｒＦＶＩＩａは、円として表されている（上から下へと向かう二番目の線）。ＦＶＩＩ−２１２およびトロンビンは、３番目および４番目の線（一番下の線）として示されている。 １６Ａは、本発明のプロテアーゼ活性化可能な凝固促進化合物の一般的な構成を示す。Ｈｅｔ２、Ｐｅｐ２、Ｈｅｔ１およびＬは、独立した、任意選択的な構成要素である。Ｐｅｐ１およびＰｅｐ２はポリペプチドであり、それらの内の少なくとも１つは、凝固因子または凝固促進ペプチドである。Ｈｅｔ１およびＨｅｔは異種部分である。Ｌはリンカーである。追加のリンカーが異なる部分を連結させても良い。たとえば、Ｐｅｐ２とＨｅｔ１の間にリンカーを位置付けても良い（図に示す）。追加のプロテアーゼ開裂可能な基質および自己犠牲的スペーサー群を、他の部分（たとえば、ポリペプチドまたは異種部分）のＮ末端に挿入しても良い。図は、Ｐｅｐ２のＮ末端でのそのような群の任意選択的な挿入を示す。１６Ｂは、プロテアーゼ開裂可能な基質（Ａａ１Ａａ２Ａａ３Ａａ４）、自己犠牲的スペーサーおよび対象のタンパク質（ＰＯＩ；たとえば、凝固因子または凝固促進ペプチド）を含有する本発明の凝固促進化合物の例示的な代表図であり、当該化合物の断片化、開裂可能な基質のタンパク質分解性の開裂後の、対象のペプチドまたはタンパク質の放出および１，６自発的断片化を図示する。 エキソサイト結合ペプチド（Ｍ）を含有する本発明のプロテアーゼ活性化可能な凝固促進化合物の、別の例示的な代表図である。この図は、開裂可能な基質（Ａａ１Ａａ２Ａａ３Ａａ４）のタンパク質分解性の開裂後の、対象のペプチドまたはタンパク質（ＰＯＩ；たとえば、凝固因子または凝固促進ペプチド）およびエキソサイト結合ペプチドの放出、および１，６自発的断片化を図示する。 １４ｎＭのトロンビン処置後の、異なる凝固促進化合物（化合物１、２および３）からの、ＩＶＧＧＱＥペプチド（第ＦＸａ凝固因子の重鎖の６つのＮ末端アミノ酸残基に相当する）の放出動態を示す。 １．４ｎＭのトロンビン処置後の、異なる凝固促進化合物（化合物１、４、５および６）からの、ＩＶＧＧＱＥペプチド（第ＦＸａ凝固因子の重鎖の６つのＮ末端アミノ酸残基に相当する）の放出動態を示す。 活性化因子（ＦＶＩＩａ）を産生する、第ＶＩＩ因子の天然型プロセッシングを示す。 第ＦＶＩＩａ凝固因子を含有する、本発明の例示的な凝固促進化合物の代表図である。 Ａ〜Ｂは、前駆タンパク質転換酵素（たとえばＰＡＣＥ）によってプロセッシング後の開裂可能なポリペプチド（図２２Ｂ）へとプロセッシングされることができる、開裂可能なポリペプチドであるＦＶＩＩ−１８６（図２２Ａ）のフロー図を示す。図２２Ａは、ＦＶＩＩＬＣ（ＦＶＩＩ軽鎖）−前駆タンパク質転換酵素による前駆タンパク質転換酵素プロセッシング部位（たとえばＰＡＣＥプロセッシング部位。たとえば、２Ｘ（ＲＫＲ）（配列番号３））−リンカー１−ＳＵＭＯ−断片化ＦＶＩＩＨＣ（Ｎ末端のＩＶＧＧＫＶ（配列番号６０）が無いＦＶＩＩ重鎖）−リンカー２−Ｆｃ領域２−リンカー３−Ｆｃ領域２を含有する、開裂可能なポリペプチドを示す。図２２Ｂは、ＰＡＣＥによりプロセッシングされる、開裂可能なポリペプチドの概略図を示す。プロセッシングされた開裂可能なポリペプチドは、２つのポリペプチド鎖（前駆タンパク質転換酵素プロセッシング部位に連結されたＦＶＩＩＬＣを含有する第一の鎖、および、リンカー１−ＳＵＭＯ−断片化ＦＶＩＩＨＣ（Ｎ末端のＩＶＧＧＫＶ（配列番号６０）の無いＦＶＩＩ重鎖）−リンカー２−Ｆｃ領域１−リンカー３−Ｆｃ領域２を含有する第二の鎖）を含有する。図２２Ｃは、上述の構築物および鎖を示す、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レーン１）または還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レーン２）を図示する。（−）はペプチド結合を示す。 Ａ〜Ｃは、（ｉ）ＳＵＭＯプロテアーゼによるＦＶＩＩ−１８６の開裂（図２３Ｂ）および、（ｉｉ）そのチオエステルペプチドへの融合物（図２３Ｃ）のフロー図を示す。図２３Ａは、図２２Ｂにおける構築物と同一である。図２３Ｂは、ＦＶＩＩ−１８６がＳＵＭＯプロテアーゼにより開裂された後、得られた開裂ポリペプチド構築物は、２つの鎖（ＦＶＩＩＬＣおよび前駆タンパク質転換酵素部位を含有する第一の鎖、および、断片化ＦＶＩＩＨＣ（Ｎ末端のＩＶＧＧＫＶ（配列番号６０）の無いＦＶＩＩ重鎖）−リンカー２−Ｆｃ領域１−リンカー３−Ｆｃ領域２を含有する第二の鎖）を含有することを示す。第一の鎖および第二の鎖は、ジスルフィド結合により結合されている。図２３Ｃは、開裂されたポリペプチド構築物（図２３Ｂ）がチオエステルペプチドとライゲートした後（Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ＰＡＢＣ−ＩＶＧＧＫＶ−ＣＯＳＢｎ）、得られた構築物が、２つのポリペプチド鎖（ＦＶＩＩＬＣおよび前駆タンパク質転換酵素部位を含有する第一の鎖、および、トロンビン開裂部位−ＦＶＩＩＨＣ（ＦＶＩＩ重鎖）−リンカー２−Ｆｃ領域１−リンカー３−Ｆｃ領域２（ＴＡ−ＦＶＩＩ−１８６）を含む第二の鎖）を含有することを示す。図２３Ｄは、構築物および鎖を示す、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す：レーン１はマーカーを示す；レーン２はＦＶＩＩ−１８６を示す；レーン３はＦＶＩＩ−１８６（ＳＵＭＯプロテアーゼ反応後）を示す；レーン３はＦＶＩＩ−１８６（ＳＵＭＯプロテアーゼ反応、および陽性対照ペプチドとの結合後）を示す；レーン５はＦＶＩＩ−１８６（ＳＵＭＯプロテアーゼ反応、およびＰＡＢＣペプチドとの結合後）を示す。（−）はペプチド結合を示す。 ＴＡ−ＦＶＩＩ−１８６のトロンビン活性化後の、ＦＶＩＩａ色素生成アッセイを示す。ｘ軸は時間（分）を示し、ｙ軸はＦＶＩＩａ活性に対する吸光度（Ａ４０５）測定を示す。（ｘ）は、トロンビンおよびヒルジンの混合物のＦＶＩＩａ活性を示す。（□）はＦＶＩＩ−１８６、トロンビンおよびヒルジンの混合物のＦＶＩＩａ活性を示す。（○）は、ＴＡ−ＦＶＩＩ−１８６、トロンビンおよびヒルジンの混合物のＦＶＩＩａ活性を示す。
本発明は、活性化可能な凝固因子および増強部分を含有するキメラタンパク質に関する。本発明は、少なくとも一部は、凝固因子の有効性、薬物動態特性、および／または、製造可能性を増強するための新たな方法の開発に基づいている。活性化可能な凝固因子は、凝固部位で活性化可能である形態である。バイパス療法における使用に関しては、活性化形態で投与された外因性の凝固因子のみが唯一、有効である。しかしながら、そのような活性化凝固因子は内因性経路（たとえば、アンチトロンビンＩＩＩ、ＴＦＰＩ）により即座に不活化、および急速に***されてしまい、短い有効半減期でしか循環中に存在しない。そして高用量で投与すると血栓形成がもたらされてしまうため、この問題はいまだ解決されていない。ゆえに、本発明は、１つの実施態様において、増強部分に融合された、または関連づけられた活性化可能な凝固因子を含有する、活性増強されたキメラタンパク質構築物に関する。「活性化可能な」凝固因子は、凝固因子チモーゲンの重鎖および軽鎖、ならびに、当該重鎖と軽鎖の間に挿入された異種プロテアーゼ開裂部位（すなわち、凝固因子チモーゲン中、天然には見出されない）を含有する。これらの分子は、増強されたチモーゲン融合タンパク質として循環し、不活化が起こらないため、それらの活性化同等物よりも長い半減期を有するが、凝固部位で活性化される、または凝固部位に局在化するプロテアーゼによる、重鎖および軽鎖の開裂によって、凝固部位で容易に活性化されることができる。増強部分を組み込むことによって、凝固促進活性を改善することもできる。
本発明の例示的な構築物を添付の図面および配列表に示す。１つの実施態様において、本発明は、図面に概説される構造を有するポリペプチドに関する。他の実施態様において、本発明は、添付の配列表に概説される配列を有するポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子に関する。１つの実施態様において、本発明は、添付の配列表に概説される配列を有するポリペプチドの成熟型に関する。それらをコードする、これらの構築物および核酸分子を用いて、対象における止血を改善することができることを理解されたい。
本明細書および請求項の明確な理解のために、以下に、次なる定義を提示する。
Ｉ．定義
本明細書において、「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、天然型アミノ酸、または非天然型アミノ酸の２以上のポリマーを指す。
「アミノ酸」という用語には、アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）：ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）； リシン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；プロリン（ＰｒｏまたはＰ）；セリン（ＳｅｒまたはＳ）；スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；およびバリン（ＶａｌまたはＶ）が含まれる。非従来型のアミノ酸もまた本発明の範囲内にあり、ノルロイシン、オミチン（ｏｍｉｔｈｉｎｅ）、ノルバリン、ホモセリン、および、たとえば、Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)に記載されている他のアミノ酸残基アナログが含まれる。そのような非天然型のアミノ酸残基を作製するためには、Noren et al. Science 244:182 (1989)および上記の Ellman et al.の手順を用いることができる。簡潔に述べると、これらの手順には、非天然型アミノ酸残基を含むサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化すること、次いで、ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳が含まれる。非従来型のアミノ酸の導入は、当分野公知のペプチド化学技術を用いて行うこともできる。本明細書において、「極性アミノ酸」という用語には、正味荷電がゼロであるアミノ酸が含まれるが、それらの側鎖（たとえば、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｃ）の異なる部分において、部分的にゼロではない荷電を有するアミノ酸も含まれる。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用および静電相互作用に関与しうる。本明細書において、「荷電アミノ酸」という用語には、その側鎖（たとえば、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｄ）に正味荷電がゼロでありうるアミノ酸が含まれる。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用および静電相互作用に関与しうる。
「アミノ酸置換」とは、前もって決定されたアミノ酸配列（開始ポリペプチドのアミノ酸配列）に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基と、第二の、異なる「置換」アミノ酸残基との置換を指す。「アミノ酸挿入」とは、少なくとも１つの追加のアミノ酸を、前もって決定されたアミノ酸配列へと組み込むことを指す。通常、挿入が１つまたは２つのアミノ酸残基の挿入から構成される一方で、本発明のより大きな「ペプチド挿入」は、たとえば、約３〜約５、またはさらに約１０、１５、もしくは２０までのアミノ酸残基の挿入から構成されうる。挿入された残基（複数含む）は、上述の天然型または非天然型のものであっても良い。「アミノ酸欠損」とは、前もって決定されたアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を指す。
ポリペプチドは単量体または多量体のいずれであっても良い。たとえば、１つの実施態様において、本発明のタンパク質は二量体である。本発明の二量体ポリペプチドは、２つのポリペプチド鎖を含んでも良く、または、１つのポリペプチド鎖（たとえば、ｓｃＦｃ分子の場合において）からなってもよい。１つの実施態様において、本発明の二量体は、ホモ二量体（２つの同一な単量体のサブユニットまたはポリペプチドを含有する）である（たとえば、２つの同一なＦｃ部分または２つの同一な生物学的活性部分）。他の実施態様において、本発明の二量体は、ヘテロ二量体（２つの同一ではない単量体のサブユニットまたはポリペプチドを含有する）である（たとえば、２つの異なる凝固因子またはその一部または１つの凝固因子のみを含有する）。たとえば、米国特許第７，４０４，９５６号を参照のこと（参照により本明細書に援用される）。
本明細書において、「ペプチドリンカー（複数含む）」、「リンカー（複数含む）」、または「リンカー部分」という用語は、ポリペプチド鎖の直線的なアミノ酸配列中の２つのドメインを連結するペプチドまたはポリペプチド配列（たとえば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）を指す。１つの実施態様において、本発明のポリペプチドは、構築物を構成する２つのＦｃ部分を直接的に、または間接的のいずれかで連結するペプチドリンカーをコードする核酸分子によりコードされる。これらのリンカーは本明細書において「ｓｃＦｃリンカー」と呼称され、および、当該ｓｃＦｃリンカーは、それを含有するポリペプチドの２つのＦｃ部分の間に入る。もしｓｃＦｃリンカーが、直線的なポリペプチド配列中の２つのＦｃ部分を隣接して連結する場合、それは、「直接的な」連結である。対照的に、当該ｓｃＦｃリンカーが、第一のＦｃ部分を結合部分（同様に、それは第二のＦｃ部分へと連結される）へと連結させる場合には、間接的な連結が形成される。これらのｓｃＦｃリンカーにより、単一鎖の遺伝的構築物が形成される。１つの実施態様において、ポリペプチドはまた、プロセッシングされる、および１つの実施態様においては実質的に削除される（たとえば、細胞によるプロセッシングの間に）、ｓｃＦｃリンカー（ｃｓｃＦｃリンカー）をもたらす細胞内プロセッシング部位を含有する。ゆえに、得られたプロセッシングされたポリペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸鎖を含有し、外来性のリンカーアミノ酸配列を実質的に含まない二量体分子である。一部の実施態様において、すべて、または実質的にすべてのリンカーは切除され、一方で、一部の実施態様においては、開裂部位の部分は残留する（たとえば、ＲＲＲＲ開裂部位の４つのアルギニン）。他の実施態様において、リンカーまたはペプチドリンカーは、多くの場合、開裂されても良い。しかしながら、ある実施態様においては、そのような開裂は望ましいものではない。当該リンカーの例示的な位置を、添付の図面に示す。リンカーは、活性化可能な凝固因子、増強部分、および／または、異種部分の間（たとえば、これらの部分のＮ末端またはＣ末端の）に位置づけられても良い。１つの実施態様において、これらのリンカーは、プロセッシングの間に除去されない。
活性化可能な凝固因子中に存在しうる第三のタイプのリンカーは、本明細書において「開裂可能なリンカー」と呼称し、それは、当該凝固因子中には天然で存在しない、異種プロテアーゼ開裂部位（たとえば、第ＸＩａ因子またはトロンビン開裂部位）を含有し、および、当該開裂部位のＮ末端またはＣ末端または両側のいずれか上でさらに追加のリンカーを含んでも良い。そのような部位の例示的な位置を添付の図面に示し、および、凝固因子チモーゲンの重鎖と凝固因子チモーゲンの軽鎖の間の位置が含まれる。他の実施態様においては、そのようなリンカーはさらに自己犠牲的な部分を含有する。たとえば、１つの実施態様において、開裂可能なリンカーに連結された自己犠牲的部分は、凝固因子の重鎖のＮ末端に融合されても良い。そのような場合において、開裂可能なリンカーは、開裂部位のＮ末端で追加のリンカーを含んでも良いが、当該開裂部位のＣ末端で、凝固因子の重鎖のアミノ末端への直接的な融合が必要となる。
本明細書において、「ｇｌｙ−ｓｅｒペプチドリンカー」という用語は、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドを指す。例示的なｇｌｙ／ｓｅｒぺプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号４）を含有する。他の例示的なｇｌｙ／ｓｅｒぺプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号５）を含有し、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４６、５０、５５、６０、７０、８０、９０または、１００と同じか、それ以上の整数である。
１つの実施態様において、ｎ＝１である。１つの実施態様において、ｎ＝２である。他の実施態様において、ｎ＝３である。他の実施態様において、ｎ＝４である。他の実施態様において、ｎ＝５である。さらに他の実施態様において、ｎ＝６である。他の実施態様において、ｎ＝７である。さらに他の実施態様において、ｎ＝８である。他の実施態様において、ｎ＝９である。さらに他の実施態様において、ｎ＝１０である。他の例示的なｇｌｙ／ｓｅｒペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号５）を含有する。１つの実施態様において、ｎ＝１である。１つの実施態様において、ｎ＝２である。好ましい実施態様において、ｎ＝３である。他の実施態様において、ｎ＝４である。他の実施態様において、ｎ＝５である。さらに他の実施態様において、ｎ＝６である。
本発明のポリペプチドまたはタンパク質の「誘導体」は、天然型のポリペプチドまたはタンパク質においては見られない、追加の特性を示すように改変されたポリペプチドまたはタンパク質である。また、「誘導体」には、２０の標準的なアミノ酸の、天然型アミノ酸誘導体の１つ以上を含有するペプチドが含まれる。指定されたポリペプチドまたはタンパク質「から誘導された」ポリペプチドまたはアミノ酸配列とは、当該ポリペプチドの起源（ｏｒｉｇｉｎ）を指す。１つの実施態様において、特定の配列から誘導されたポリペプチドまたはアミノ酸配列は、その配列または一部と本質的に同一であるアミノ酸配列を有し、ここで、当該部分は、少なくとも約１０〜約２０のアミノ酸、少なくとも約２０〜約３０のアミノ酸、または少なくとも約３０〜約５０のアミノ酸からなり、または、配列中にその起源を有していると当業者に識別可能である。
他のペプチドの「変異体」であるポリペプチドは、開始ポリペプチドと比較して１以上の変異を有しても良く、たとえば、他のアミノ酸残基と置換された１以上のアミノ酸残基、または、１以上のアミノ酸残基の挿入もしくは欠損を有しても良い。１つの実施態様において、ポリペプチドは、非天然型のアミノ酸配列を含有する。そのような変異体は、開始ポリペプチドと、１００％未満の配列同一性または類似性を有することになる。他の実施態様において、変異体は、開始ポリペプチドのアミノ酸配列と、約７５％〜１００％未満（たとえば、当該変異体分子の全長にわたり、約８０％〜１００％未満、約８５％〜１００％未満、約９０％〜１００％未満（たとえば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）、および約９５％〜１００％未満）のアミノ酸配列同一性または類似性のアミノ酸配列を有する。１つの実施態様において、開始ポリペプチド配列およびそれから誘導された配列の間には、１アミノ酸の差異が存在する。この配列に対する同一性または類似性は、本明細書において、必要に応じて、最大配列同一パーセントを得るための配列と導入ギャップの位置合わせ後の、開始アミノ酸残基と同一である（すなわち、同じ残基）候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。
本発明のポリペプチドおよびタンパク質に関し、「断片」という用語は、基準となるポリペプチドまたはタンパク質の特性の少なくとも一部を保持している任意のポリペプチドまたはタンパク質を含む。ポリペプチドの断片には、タンパク分解性の断片、ならびに欠失断片が含まれる。
１つの実施態様において、本発明のポリペプチドは、ヒトタンパク質配列から誘導されたアミノ酸配列（たとえば、少なくとも１つの凝固因子またはＦｃ部分またはドメイン）を含有する。しかしながら、ポリペプチドは、他の哺乳類種由来の１以上のアミノ酸を含有しても良い。たとえば、凝固因子、Ｆｃドメイン、または増強部分は、非ヒト種由来であってもよく、対象のポリペプチドに含まれても良い。あるいは、１以上のアミノ酸が、非ヒト種由来であるポリペプチドに存在しても良い。特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは免疫原性でない。
また、本発明のポリペプチドは、由来する天然型（自然発生する）ポリペプチド由来のアミノ酸配列とは異なるように変化しても良いが、天然型ポリペプチドの所望される活性は維持されることが当業者には理解されるであろう。たとえば、「必要不可欠ではない」アミノ酸残基での保存的置換または変化をもたらすヌクレオチド置換またはアミノ酸置換が行われても良い。イムノグロブリン（たとえば、Ｆｃドメイン、部分、または抗原結合部位）由来のポリペプチドの非天然変異型をコードする単離核酸分子は、１以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされるタンパク質に導入されるように、１以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を、当該ヌクレオチド配列へと導入することにより作製される。変異は、標準的な技法（たとえば、特定部位の突然変異誘導およびＰＣＲ介在突然変異誘導）により導入しても良い。
本発明のポリペプチドは、１以上のアミノ酸残基（たとえば、必要不可欠な、または必要不可欠ではないアミノ酸残基）で保存的アミノ酸置換を含有しても良い。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されることである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野に定義されており、塩基性側鎖（たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分子側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。ゆえに、ポリペプチド中の必要不可欠ではないアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基と置換されても良い。他の実施態様において、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーのメンバーの順番および／または組成が異なる、構造的に類似のストリングと置換されても良い。あるいは、他の実施態様において、変異は、たとえば飽和突然変異誘導等により、コード配列のすべてまたは一部の間にランダムに導入されても良く、得られた変異物は本発明のポリペプチドへと組み込まれ、所望の標的への結合能力に対してスクリーニングされても良い。
ポリペプチドに関し、「直線的配列」または「配列」は、配列中で互いに隣接する残基が、当該ポリペプチドの一次構造中で連続している、アミノ末端からカルボキシ末端方向への、ポリペプチドにおけるアミノ酸の順番である。
本明細書において、「連結された」、「融合された」または「融合」という用語は、ペプチド結合（たとえば、遺伝的融合）、化学的結合または他の手段を介した結合を指す。たとえば、分子または部分を結合することができる１つの方法では、ペプチド結合を介して分子または部分を結合するペプチドリンカーを使用する。「遺伝的に融合された」、「遺伝的に連結された」または「遺伝的融合」という用語は、相互交換可能に使用され、それらタンパク質、ポリペプチドまたは断片をコードする単一ポリヌクレオチド分子の遺伝的発現による、個々のペプチド主鎖を介した２以上のタンパク質、ポリペプチドまたはその断片の同一線上の、共有結合的連結または付着を指す。そのような遺伝的融合により、単一で連続的な遺伝子配列の発現がもたらされる。好ましい遺伝的融合は、イン・フレーム、すなわち、２以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が融合され、元のＯＲＦの正確なリーディングフレームを維持する様式で、連続的で長いＯＲＦが形成されるように融合されるものである。ゆえに、得られた組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによりコードされたポリペプチドに相当する２以上のタンパク質セグメントを含有する単一ポリペプチドである（自然界では、通常はそのようにセグメントが連結されていない）。この場合において、当該単一ポリペプチドは、プロセッシングの間に開裂され、２つのポリペプチド鎖を含有する二量体分子を産生する。
本明細書において、「関連する」という用語は、第一のアミノ酸鎖と第二のアミノ酸鎖の間に形成された共有結合または非共有結合を指す。１つの実施態様において、「関連した」という用語は、共有結合的な非ペプチド結合、または非共有結合を意味する。他の実施態様において、「関連した」という用語は、共有結合的な非ペプチド結合または、化学的に架橋されていない非共有結合を指す。一部の実施態様において、この関連性は、コロン（：）により表される。他の実施態様において、ペプチド結合を除く共有結合を意味する。たとえば、アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成することが出来るチオール基、または第二のシステイン残基上のチオール基と架橋することができるチオール基を含有する。ほとんどの天然型ＩｇＧ分子において、ＣＨ１およびＣＬ領域は、ジスルフィド結合により関連づけられ、２つの重鎖は２３９および２４２に相当する位置（Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用（ＥＵナンバリングシステムにおける２２６または２２９位））の２つのジスルフィド結合により関連づけられる。共有結合の例としては、限定されないが、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、シグマ結合、π結合、デルタ結合、グリコシド結合、アグノスティック結合（ａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｏｎｄ）、屈曲結合、双極性結合（ｄｉｐｏｌａｒ ｂｏｎｄ）、π背面結合（ｂａｃｋｂｏｎｄ）、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結合、共役（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、超共役、芳香族性、ハプト数または反結合が挙げられる。非共有結合の非限定的な例としては、イオン結合（たとえば、カチオン−π結合または塩結合）、金属結合、水素結合（たとえば、二水素結合、二水素複合体、低障壁水素結合、または対称性水素結合）、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、機械的結合、ハロゲン結合、金親和性、インターカレーション、スタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）、エントロピー力、または化学的極性が挙げられる。
本明細書において、「化学的に架橋された」という用語は、アミノ酸の酸性側鎖の間の、直接的またはリンカー（たとえばペプチドリンカー）を介した共有結合による結合を指す。化学的な架橋には、二量体Ｆｃ領域のＦｃ部分の間の分子内ジスルフィド結合もしくは分子間ジスルフィド結合、または、活性化可能な凝固因子および増強部分のアミノ酸の間の、操作されていないジスルフィド結合は含まれない。化学的な架橋は通常、架橋剤（たとえば、ヘテロ二機能性の架橋剤）の添加により発生する。化学的架橋の例としては、ｐｈｏｔｏ−Ｉｌｅ、ｐｈｏｔｏ−Ｍｅｔ、およびｐｈｏｔｏ−Ｌｅｕの化学的連結による、１以上の光反応性結合が挙げられる。たとえば、Suchanek et al., (2005) Nature methods, 2: 261-267を参照のこと。
本明細書において、「Ｆｃ領域」という用語は、天然型イムノグロブリンのＦｃ領域に相当するポリペプチド部分、すなわち、その２つの重鎖の各Ｆｃドメインの二量体性の関連付けによる形成と定義づけられる。天然型Ｆｃ領域はホモ二量体であり、２つのポリペプチド鎖を含有する。対照的に、「遺伝的に融合されたＦｃ領域」または「単鎖Ｆｃ領域」（ｓｃＦｃ領域）という用語は、本明細書において、単一ポリペプチド鎖（すなわち、単一の連続的な遺伝子配列にコードされたもの）内で遺伝的に結合されたＦｃドメインから構成される合成二量体Ｆｃ領域を指す。
本明細書において、「Ｆｃドメイン」という用語は、パパイン開裂部位のちょうど上流にあるヒンジ領域（すなわち、１１４である重鎖定常領域の最初の残基を取り、ＩｇＧ中の残基２１６）から始まり、抗体のＣ末端で終わる、単一イムノグロブリン重鎖部分を指す。従って、完全なＦｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含有する。
本明細書において、「Ｆｃドメイン部分」または「Ｆｃ部分」という用語は、ＦｃドメインまたはＦｃドメイン由来のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、Ｆｃ部分は、ヒンジ（たとえば、上部、中部および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはその変異体、部分もしくは断片の内の少なくとも１つを含有する。他の実施態様において、Ｆｃ部分は、完全なＦｃドメイン（すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン）を含有する。１つの実施態様において、Ｆｃ部分は、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合されたヒンジドメイン（またはその一部）を含有する。他の実施態様において、Ｆｃ部分は、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合されたＣＨ２ドメイン（またはその一部）を含有する。他の実施態様において、Ｆｃ部分は、ＣＨ３ドメインまたはその一部からなる。他の実施態様において、Ｆｃ部分は、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメイン（またはその一部）からなる。他の実施態様において、Ｆｃ部分はＣＨ２ドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメインからなる。他の実施態様において、Ｆｃ部分は、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ２ドメイン（またはその一部）からなる。１つの実施態様において、Ｆｃ部分は、ＣＨ２ドメイン（たとえば、ＣＨ２ドメインのすべてまたは一部）の少なくとも一部分を欠損する。
本明細書において、「半減期」という用語は、特定のポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏの生物学的な半減期を指す。半減期は、対象に投与された量の半分が、当該動物の循環系および／または他の組織から排出されるために必要とされる時間によって表されても良い。所与のポリペプチドのクリアランス曲線が時間関数として描かれる場合、その曲線は通常、急峻なα相と、より長いβ相の二相性となる。α相は多くの場合、投与されたキメラポリペプチドの、血管内腔と血管外腔の間の平衡を表し、ポリペプチドのサイズによりある程度は決定される。β相は多くの場合、血管内腔におけるポリペプチドの異化を表す。それゆえ、特定の実施態様において、本明細書に用いられる半減期という用語は、β相におけるポリペプチドの半減期を指す。ヒトにおける、ヒト抗体の典型的なβ相半減期は２１日である。
本明細書において、「半減期延長物質」という用語は、タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させる異種部分を指す。本発明のキメラ凝固因子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、当業者公知の任意の方法により測定することができる（たとえば、ＦＶＩＩ活性レベルアッセイ）。ある実施態様において、半減期延長物質は、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、または、これら要素の任意の誘導体、変異体もしくは組み合わせ等の、非ポリペプチド性の部分に対する付着部を含有しても良い。
本明細書において、「部分」という用語は、キメラポリペプチドの構成部分または構成要素を指す。
本明細書において、「増強部分」という用語は、凝固因子の凝固促進活性を増強することができるポリペプチドの分子、断片、誘導体または、その変異体もしくは成分を指す。１つの実施態様において、本発明のキメラ凝固因子は、ポリペプチドの活性を増強する「増強部分」を含有する（たとえば、補因子として作用することによる）。そのような部分は、たとえば、凝固補因子（たとえば、可溶性組織因子（ｓＴＦ））または第Ｖａ因子タンパク質であっても良いが、標的化部分（たとえば、血小板標的化部分）を含まない。他の実施態様において、増強部分は、活性化可能な凝固因子と相互作用し、それによって、凝固因子の凝固促進活性を増加させる。増強部分は、構築物に遺伝的に融合されていても良く、構築物に化学的に結合されていても良く、またはリンカーを介して構築物に連結されていても良い。たとえば、増強部分は、増強部分と、構築物の活性化可能な凝固因子の間の結合を形成することにより、本発明の構築物に付着されていても良い（増強部分は、第一の官能基を含有し、活性化可能な凝固因子は第二の官能基を含有し、第一および第二の官能基は互いに反応して化学結合を形成することができる）。例示的な増強部分を以下に詳細に記述する。
本明細書において、「自己犠牲的部分」という用語は、その機能を増強させるために、開裂可能なリンカー中に含まれうる分子を指す。１つの実施態様において、自己犠牲的部分は、凝固因子チモーゲンの重鎖とプロテアーゼ開裂部位の間に挿入される。そのような自己犠牲的部分は、プロテアーゼ開裂部位の開裂性が、第一の部分の末端アミノ酸残基による負の影響を受けないという利点を有する。例示的な自己犠牲的部分は、たとえば、米国特許第７，３７５，０７８号および米国特許第７，７５４，６８１号に開示されている（それらは参照により本明細書にその全体が援用される）。
本明細書において、「異種部分」という用語は、キメラタンパク質の構成要素（活性化可能な凝固因子、リンカー部分、または増強部分）に、自然には発生しない部分、および／または、キメラタンパク質の構成要素に結合される、または関連する部分を指す。１つの実施態様において、異種部分は、活性化可能な凝固因子の半減期を延長させることができる。他の実施態様において、異種部分は、活性化可能な凝固因子または活性化された凝固因子の流体力学半径を増加させる。他の実施態様において、異種部分は、凝固因子の１つ以上の薬物動態学的特性を、その生物学的活性または機能（たとえば、凝固促進活性）に明らかな影響を与えることなく、改善する。さらに他の実施態様において、異種部分は、非ポリペプチド性の部分である（たとえば、ペプチドまたはポリペプチドおよび非ポリペプチド性部分の化学的改変または組み合わせ）。さらに他の実施態様において、異種部分はポリペプチドである。一部の実施態様において、キメラ凝固因子は、リンカーにより異種部分に結合または連結されている。異種ポリペプチド部分の非限定的な例としては、イムノグロブリン定常領域もしくはその一部、アルブミンもしくはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンもしくはその断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）のβサブユニット、アルブミン結合小分子、ＸＴＥＮ配列、またはそれらの２以上の組み合わせが含まれる。異種非ポリペプチド性部分の非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、その誘導体またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例示的な異種部分としては、たとえば、ＦｃＲｎ結合部分（たとえば、完全Ｆｃ領域またはＦｃＲｎに結合するそれらの一部）、単鎖Ｆｃ領域（ＳｃＦｃ領域、たとえば、米国特許出願２００８／０２６７３８、ＷＯ２００８／０１２５４３または、ＷＯ２００８／１４３９５４５に記述される）、プロセッシング可能なｓｃＦｃ領域（本明細書に記述されるｃｓｃＦｃ領域を含有する）が挙げられる。
１つの実施態様において、本発明の構築物における使用のための増強部分は、抗体変異体を含有する。「抗体変異体」または「改変抗体」という用語は、自然には発生せず、本明細書に記述される、少なくとも１つのアミノ酸またはアミノ酸改変により天然型由来抗体とは異なる、アミノ酸配列またはアミノ酸側鎖化学を有する、抗体が含まれる。本明細書において、「抗体変異体」という用語には、天然型ではなくなるように改変された抗体の合成形態、たとえば、少なくとも２つの重鎖部分を含有するが、２つの完全重鎖は含まない抗体（たとえば、ドメイン欠損抗体またはミニボディ）；２以上の異なる抗原に結合するように改変された、または単一の抗原上の異なるエピトープに結合するように改変された、多特異性形態の抗体（たとえば、二重特異性、三重特異性等）；ｓｃＦｖ分子に結合された重鎖分子；単鎖抗体；二重特異性抗体；三重特異性抗体；および改変エフェクター機能等を有する抗体が含まれる。
本明細書において、「Ｇｌａドメイン」という用語は、ビタミンＫ依存性タンパク質（たとえば、プロトロンビン、凝固第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘ因子、タンパク質Ｃ、Ｓ、およびＺ）に存在する、保存的膜結合モチーフを指す。これらのタンパク質は、ｇ−カルボキシグルタミン酸（これらタンパク質のＮ末端Ｇｌａドメインにクラスター化されているアミノ酸）の翻訳後合成のために、ビタミンＫを必要とする。当該ドメイン中に存在する全てのグルタミン残基は、潜在的なカルボキシル化部位であり、それゆえ、それらの多くは、カルボキシル化により改変される。カルシウムイオンの存在下で、Ｇｌａドメインは、ホスファチジルセリンを含有するリン脂質膜と相互作用する。Ｇｌａドメインはまた、第ＦＶＩＩａ補因子、組織因子（ＴＦ）への結合における機能を有する。ＴＦと複合体化されると、ＦＶＩＩａのＧｌａドメインは、７つのＣａ２＋イオンと共にロードされ、細胞表面上のリン脂質との相互作用のために、細胞膜の方向に、３つの疎水性の側鎖を突出させ、ＴＦのＣ末端ドメインとしっかりと接触する。
本明細書において、「ｓｃＦｖ分子」という用語には、１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）またはその一部、および１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）またはその一部からなる結合分子が含まれ、ここで、各可変ドメイン（またはその一部）は、同じ抗体または異なる抗体由来である。ｓｃＦｖ分子は、好ましくは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの間に挿入されたｓｃＦｖリンカーを含有する。ｓｃＦｖ分子は当分野に公知であり、たとえば、米国特許第５，８９２，０１９号、Ho et al. 1989. Gene 77:51; Bird et al. 1988 Science 242:423；Pantoliano et al. 1991. Biochemistry 30:10117; Milenic et al. 1991. Cancer Research 51:6363；Takkinen et al. 1991. Protein Engineering 4:837に記述されている。
本明細書において、「ｓｃＦｖリンカー」は、ｓｃＦｖのＶＬおよびＶＨドメインの間に挿入された部分を指す。ｓｃＦｖリンカーは、好ましくは、ｓｃＦｖ分子の抗原結合構造を維持している。１つの実施態様において、ｓｃＦｖリンカーは、ｓｃＦｖリンカーペプチドを含有、または、ｓｃＦｖリンカーペプチドからなる。ある実施態様において、ｓｃＦｖリンカーペプチドは、ｇｌｙ−ｓｅｒペプチドリンカーを含有、または、ｇｌｙ−ｓｅｒペプチドリンカーからなる。他の実施態様において、ｓｃＦｖリンカーはジスルフィド結合を含む。
「グリコシル化」という用語は、１以上の炭水化物の、ポリペプチドへの共有結合を指す。典型的には、グリコシル化は、細胞内環境、または細胞抽出環境内で発生しうる翻訳後事象である。グリコシル化という用語には、たとえば、Ｎ−結合型グリコシル化（１以上の糖がアスパラギン残基に結合する）および／またはＯ−結合型グリコシル化（１以上の糖がヒドロキシル基を有するアミノ酸残基（たとえば、セリンまたはスレオニン）に結合する）が含まれる。１つの実施態様において、本発明の分子はグリコシル化されている。他の実施態様において、本発明の分子は、グリコシル化されていない。さらに他の実施態様において、本発明の分子は、野生型Ｆｃ領域と比較して、グリコシル化が減少している。
本明細書において、「ジスルフィド結合」という用語には、２つの硫黄原子の間に形成される共有結合が含まれる。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成することができるチオール基、または第二のチオール基との架橋を形成することができるチオール基を含有する。ほとんどの天然型ＩｇＧ分子において、ＣＨ１およびＣＬ領域は、天然型ジスルフィド結合により結合されており、２つの重鎖は２３９位および２４２位に相当する位置（Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用（ＥＵナンバリングシステムでは２２６位または２２９位））で２つの天然型ジスルフィド結合により結合されている。
本明細書において、「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、細胞中に所望のポリヌクレオチドを導入し、発現させるためのビヒクルとして、本発明に従い用いられるベクターを意味するために用いられる。当業者に公知であるように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスまたはレトロウイルスから容易に選択されうる。概して、本発明と適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを容易にするための適切な制限酵素部位、および原核細胞または真核細胞に侵入する能力および／または原核細胞または真核細胞で複製する能力を有している。
多くの発現ベクターシステムを、本発明のキメラ凝固因子を製造するために用いうる。たとえば、ある種のベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルス等の動物ウイルス由来であるＤＮＡ要素を使用する。さらに、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能とする１以上のマーカーを導入することにより、染色体へＤＮＡが組み込まれた細胞を選択しても良い。マーカーは、栄養要求性の宿主に対して原栄養を提供し、殺生物抵抗性（たとえば抗生物質）を提供し、またはたとえば銅等の重金属に対する抵抗性を提供してもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接的に結合されていてもよく、または共形質転換により同じ細胞内に導入されても良い。１つの実施態様において、誘導可能な発現システムを用いることができる。また、ｍＲＮＡ合成の最適化のためにさらなる構成要素を必要としても良い。これらの構成要素としては、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターシグナルが挙げられる。１つの実施態様において、分泌シグナル（たとえば、いくつかの良く特徴解析された細菌リーダーペプチド（たとえば、ｐｅｌＢ、ｐｈｏＡまたはｏｍｐＡ）の内の任意の１つ）をｉｎ−ｆｒａｍｅで本発明のポリペプチドのＮ末端へと融合させ、当該ポリペプチドを最適に分泌させてもよい（Lei et al. (1988), Nature, 331:543; Better et al. (1988) Science, 240:1041; Mullinax et al., (1990). PNAS, 87:8095）。
「宿主細胞」という用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターと形質転換された細胞を指す。組換え宿主からのタンパク質の単離プロセスに関する記述において、「細胞」および「細胞培養物」という用語は、相互交換可能に用いられ、他で明確に特定されていない限り、タンパク質源を意味する。他の言葉で置き換えると、「細胞」からのタンパク質の回収は、スピンダウンされた全細胞からのタンパク質の回収、または、培地および懸濁細胞の両方を含有する細胞培養物からのタンパク質の回収、のいずれかを意味し得る。タンパク質発現のために用いられる宿主細胞株は、最も好ましいのは哺乳類起源のものであり、当業者には、発現される所望の遺伝子産物にとって最も適している特定の宿主細胞株を優先的に決定することができる能力を有していると考えられる。例示的な宿主細胞株は、限定されないが、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０ Ｔ抗原を有するＣＶＩの派生物）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＰｅｒＣ６細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウスミエローマ）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウスミエローマ）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）が挙げられる。宿主細胞株は、通常、市販、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または公表文献から入手可能である。本発明のポリペプチドはまた、非哺乳類細胞（たとえば細菌または酵母または植物細胞）で発現されても良い。この点において、様々な単細胞性の非哺乳類微生物（たとえば細菌）もまた形質転換されうる（すなわち、培養または発酵において増殖することができる）ことが認識される。形質転換に感受性のある細菌としては、腸内細菌科のメンバー（たとえば、大腸菌系統またはサルモネラ）；バチルス科（たとえば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；肺炎球菌属；連鎖球菌；およびインフルエンザ菌）が挙げられる。細菌で発現された場合、ポリペプチドは通常、封入体の一部となることが良く知られている。ポリペプチドは単離され、精製され、次いで、機能性分子へとアセンブリされなければならない。
原核細胞に加え、真核微生物を用いても良い。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または普遍的なパン酵母は、真核性微生物の中で最も良く使用されているが、他の多くの系統（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを含む）も通常、利用可能である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現に対しては、たとえばプラスミドＹＲｐ７（Stinchcomb et al., (1979), Nature, 282:39; Kingsman et al., (1979), Gene, 7:141; Tschemper et al., (1980), Gene, 10:157）が良く用いられている。このプラスミドにはすでにＴＲＰ１遺伝子（トリプトファン中で増殖する能力を欠損している酵母の変異株に対する選択マーカーを提供する）を含有している（たとえば、ＡＴＣＣ番号第４４０７６号、またはＰＥＰ４−１(Jones, (1977), Genetics, 85:12)）。酵母宿主細胞ゲノムの特徴として、ｔｒｐｌ損傷の存在により、トリプトファンの無い中での増殖によって、形質転換の検出を効果的に行うことができる。
本明細書において、「内因性の」という用語は、細胞に天然に存在する分子（たとえば、核酸および／またはタンパク質分子）を指す。対照的に、「外因性の」または「異種の」という用語は、所与の文脈において（たとえば、細胞またはポリペプチドにおいて）、通常は見出されないような分子を指す。たとえば、外因性分子または異種分子は、細胞に導入されてもよく、細胞操作（たとえば、トランスフェクションまたは他の遺伝的操作の形態）の後でのみ存在する、または、異種アミノ酸配列は、天然には見出されないタンパク質中に存在しても良い。
本明細書において、「開裂部位」または「プロテアーゼ開裂部位」という用語は、プロテアーゼにより認識される部位を指す。１つの実施態様において、ポリペプチドは、凝固カスケードの間に活性化されるプロテアーゼにより開裂される、プロテアーゼ開裂部位を有しており、凝固形成の場所で、そのような部位の開裂が発生する。そのような部位の例としては、たとえば、トロンビン、第ＸＩａ因子または第Ｘａ因子に認識されるものが挙げられる。例示的なＦＸＩａ開裂部位としては、たとえば、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号６）およびＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号７）が挙げられる。トロンビン開裂部位の例としては、たとえば、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号８）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号９）、ＬＶＰＲＧ（配列番号１０）およびＡＬＲＰＲ（配列番号１）が挙げられる。他のプロテアーゼ開裂部位は、以下に詳述する。
本明細書において、「プロセッシング部位」または「細胞内プロセッシング部位」という用語は、ポリペプチドの翻訳後に機能する酵素の標的である、ポリペプチド中の酵素的開裂部位のタイプを指す。１つの実施態様において、そのような酵素は、ゴルジ内腔からトランス−ゴルジ部分への輸送の間に機能する。細胞内プロセッシング酵素は、細胞からタンパク質が分泌される前に、ポリペプチドを開裂する。そのようなプロセッシング部位の例としては、たとえば、エンドぺプチダーゼファミリーのＰＡＣＥ／ｆｕｒｉｎ（ＰＡＣＥは、Ｐａｉｒｅｄ ｂａｓｉｃ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｃｌｅａｖｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ（塩基性アミノ酸開裂酵素対）の頭字語である）により標的とされるものが挙げられる。これらの酵素はゴルジ膜に位置し、Ａｒｇ−［任意の残基］−（ＬｙｓまたはＡｒｇ）−Ａｒｇ配列モチーフのカルボキシ末端側上でタンパク質を開裂する。本明細書において、酵素の「ｆｕｒｉｎ」ファミリーとしては、ｆｕｒｉｎ、酵母Ｋｅｘ２、ＰＣＳＫ１（ＰＣ１／Ｐｃ３としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ２（ＰＣ２としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ３（ｆｕｒｉｎまたはＰＡＣＥとしてもまた知られる）、ＰＣＳＫ４（ＰＣ４としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ５（ＰＣ５またはＰＣ６としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ６（ＰＡＣＥ４としてもまた知られる）、または、ＰＣＳＫ７（ＰＣ７／ＬＰＣ、ＰＣ８、またはＳＰＣ７としてもまた知られる）が挙げられる。他のプロセッシング部位も当分野に公知である。
２以上のプロセッシング部位または開裂部位を含む構築物においては、そのような部位は同じまたは異なっていても良いことが理解される。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏの製造により、本発明の所望の改変ポリペプチドの大量生産のためのスケールアップが可能となる。組織培養条件下での、哺乳類細胞の培養技法は当分野に公知であり、たとえば、エアリフトリアクター中での、または継続的な攪拌リアクター中での同種懸濁培養、または、たとえば中空糸、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ、もしくはセラミックカートリッジでの固定細胞培養もしくは封入細胞培養が含まれる。もし必要および／または所望であれば、ポリペプチドの溶液を、慣例のクロマトグラフィ法（たとえばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ、ＤＥＡＥセルロースでのクロマトグラフィまたはアフィニティクロマトグラフィ）により精製することができる。
本明細書において、「ポリペプチドの投与により利益を受ける対象」または「その必要がある対象」というフレーズには、たとえば本発明のポリペプチドの投与により利益を受ける（たとえば、止血が改善される）哺乳類対象等の対象が含まれる。１つの実施態様において、対象には、限定されないが、ＦＶＩＩＩ阻害物質を発現し、ゆえに、バイパス療法の必要性がある個人が含まれる。他の実施態様においては、対象として、ＦＶＩＩＩ阻害物質をまだ発現していないが、ＦＶＩＩＩ阻害物質を発現する傾向がある個人も含まれる。対象は成人または未成人（たとえば、１２歳以下）であっても良い。
本明細書において、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」とは、第二の源に由来する第二のアミノ酸配列に共有結合され、または非共有結合された、第一の源に由来する第一のアミノ酸配列から構成される任意のタンパク質を指し、ここで、第一の源および第二の源は同一ではない。同一ではない第一の源および第二の源は、２つの異なる生物学的実体、または同じ生物学的実体由来の２つの異なるタンパク質、または生物学的実体および非生物学的実体を含んでも良い。キメラタンパク質はたとえば、少なくとも２つの異なる生物学的源に由来するタンパク質を含んでも良い。生物学的源は、非合成的に製造された任意の核酸配列またはアミノ酸配列（たとえば、本明細書に詳述される、上述の任意のもののゲノム配列またはｃＤＮＡ配列、プラスミドまたはウイルスベクター、天然型ビリオンまたは変異体またはアナログ）を含んでも良い。合成的な源は、化学的に製造され、生物学的システム（たとえば、アミノ酸配列の固相合成）によるものではないタンパク質または核酸配列を含んでも良い。キメラタンパク質はまた、少なくとも２つの異なる合成的な源に由来するタンパク質、または、少なくとも１つの生物学的な源および少なくとも１つの合成的な源に由来するタンパク質を含んでも良い。キメラタンパク質はまた、任意の源に由来する小有機分子もしくは小無機分子、または、任意の源に由来する核酸に共有結合された、または非共有結合された第一の源に由来する第一のアミノ酸配列を含有しても良い。キメラタンパク質は、第一および第二のアミノ酸配列の間のリンカー分子、または、第一のアミノ酸配列および核酸の間のリンカー分子、または第一のアミノ酸配列および小有機分子もしくは小無機分子の間のリンカー分子を含有しても良い。
本明細書において、「凝固因子」という用語は、対象における出血症状を止める、もしくは出血症状の持続期間を減少させる、天然型の、または遺伝子組み換え製造された、分子またはそのアナログを指す。他の言葉で置き換えると、凝固促進活性を有する分子を意味し、すなわち、フィブリノーゲンを不溶性のフィブリンメッシュへと転換させ、血液を凝固または固まらせる原因となる分子を意味する。「活性化可能な凝固因子」は、活性化形態へと転換することが可能な、不活化形態（たとえば、そのチモーゲン形態）にある凝固因子である。
本明細書において、凝固活性とは、生化学的反応のカスケードに関与し、最終的にはフィブリン塊を形成させ、および／または、大量出血もしくは出血症状の重篤度、持続期間または頻度を減少させる能力を意味する。
本明細書において、止血とは、出血または大量出血を止める、または減速させることを意味し、または、血管もしくは身体からの血液の流出を止める、または減速させることを意味する。
本明細書において、止血障害とは、フィブリン塊形成の能力が無い、または能力が損なわれたことによる、自然発生的な、または外傷の結果としての、大量出血の傾向により特徴付けられる遺伝性の状態または後天的な状態を意味する。
そのような障害の例としては、血友病が挙げられる。血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損）、血友病Ｂ（第ＩＸ欠損または「クリスマス病」）および血友病Ｃ（第ＸＩ欠損、軽度な出血傾向）が３つの主な形態であり、Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ症、第Ｘｉ因子欠損（ＰＴＡ欠損）、第ＸＩＩ因子欠損、フィブリノーゲン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子の欠損または構造異常、Ｂｅｒｎａｒｄ−Ｓｏｕｌｉｅｒ症候群はＧＰＩｂの異常または欠損である。ＧＰＩｂはｖＷＦの受容体であり、不完全で、一次血栓形成（一時止血）の欠落をもたらし、出血傾向を増加させ、Ｇｌａｎｚｍａｎ ａｎｄ Ｎａｅｇｅｌｉの血小板無力症（Ｇｌａｎｚｍａｎｎ血小板無力症）をもたらす。肝不全（急性および慢性状態）においては、肝臓による凝固因子の産生が不十分であり、これにより出血リスクが高まりうる。
本発明のキメラ分子は予防的に用いることができる。本明細書において、「予防的処置」という用語は、出血症状の前の分子投与を指す。１つの実施態様において、全般的な止血剤の必要性がある対象は、外科手術を受けている、または外科手術を受けようとしているものである。本発明のキメラタンパク質は、予防剤として、外科手術の前、または後に投与されても良い。本発明のキメラタンパク質は、急性の出血症状を制御するために、外科手術の間、または外科手術の後に投与されても良い。外科手術には、限定されないが、肝臓移植、肝切除、または幹細胞移植が挙げられる。
要求に応じた処置としては、出血症状、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、および腸腰筋鞘の出血に対する処置が挙げられる。対象は、外科的予防、周術期管理、または外科手術の処置が必要であっても良い。そのような外科手術としては、たとえば、小手術、大手術、抜歯、扁桃切除、鼡径ヘルニア術、滑膜切除術、全膝置換、開頭、骨接合、外傷手術、脳内手術、腹膜内手術、胸腔内手術、または関節置換手術が挙げられる。
本明細書において、「急性出血」という用語は、背景事情に関わらず、出血症状を指す。たとえば、対象は、外傷、***、遺伝性出血性疾患（たとえば、第ＶＩＩ因子欠損）、血小板疾患、または凝固因子に対する抗体の発現による抵抗性を有していても良い。
本明細書において、処置する、処置、処置することとは、たとえば、疾患または状態の重篤度を下げること；疾患経過の持続期間を短くすること；疾患または状態に関連した１以上の症状を改善すること；疾患または状態を有するが、当該疾患または状態を治療する必要がない対象に対して、疾患または状態に関連した１以上の症状の予防法である、有益な効果を提供することを指す。
本明細書において、「固相ペプチド合成」とは、固体表面に固定されたポリペプチド分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成を指す。ＳＰＰＳの一般的原理は、カップリング−洗浄−脱保護−洗浄の繰り返しサイクルの内の１つである。固相付着ペプチドの遊離Ｎ末端アミンを、単一Ｎ保護アミノ酸ユニットに連結させる。次いで、このユニットを脱保護し、さらなるアミノ酸が付着される新規のＮ末端アミンを露出させる。固相ペプチド合成は、当初、Merrifield et al., "Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide". J. Am. Chem. Soc. 85 (14): 2149−2154 (1963)に記述されていた。たとえば、本発明の化合物は、"Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis - A Practical Approach" W. C. Chan, P. D. White編集, Oxford University Press, New York 2000およびその中の参照文献に記述される固相ペプチドを用いて合成することができる。固相ペプチド合成には、天然型アミノ酸、非天然型アミノ酸（Ｄ−アミノ酸を含む）、ペプチド／タンパク質主鎖改変、ならびに、ペプチド性部分および非ペプチド性部分の結合を含有するポリペプチド合成が含まれる。
ＩＩ．キメラタンパク質
本発明は、活性化可能な凝固因子および増強部分を含有するキメラタンパク質を目的とするものである。キメラタンパク質中の活性化可能な凝固因子は、不活性形態（すなわち、チモーゲン）で投与され、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後に、たとえば損傷部位でプロテアーゼにより活性化される。活性化可能な凝固因子が活性化されると、当該活性化した凝固因子と関連した、または連結した増強部分は、凝固経路におけるパートナーとして作用することにより凝固因子の活性を増強することができる。それゆえ、本発明のキメラタンパク質はまた、増強された、もしくは改善されたチモーゲン、または増強された、もしくは改善されたチモーゲン融合タンパク質（たとえば、ＦＶＩＩ増強チモーゲン融合タンパク質またはＦＸ増強チモーゲン融合タンパク質）として記述することができる。キメラタンパク質に有用な活性化可能な凝固因子の例としては、限定されないが、第ＶＩＩ因子または第Ｘ因子（以下の（Ａ）の項に記述）が挙げられる。
活性化可能な凝固因子は、増強部分（たとえば、凝固補因子、たとえば組織因子）を、当該活性化可能な凝固因子により近接させて架橋することによりさらに改善される。ゆえに、凝固因子がヘテロ二量体に開裂される場合、増強部分は、当該凝固因子ヘテロ二量体と相互作用することができ、構造変化を誘導して、凝固活性を増強することができる。本発明に有用な増強部分の例としては、限定されないが、凝固補因子、凝固促進ペプチド、または以下の（Ｂ）の項に記述される抗原結合部分が挙げられる。一部の実施態様において、増強部分は、凝固因子をヘテロ二量体に開裂させる必要なく、当該凝固因子と相互作用する。
凝固因子の重鎖から軽鎖を開裂することによって、凝固因子を二鎖活性化形態が出来る一方、重鎖のＮ末端が完全に開裂されていない場合、当該凝固因子はチモーゲン様タンパク質としてまだ存在しうる。本発明の１つの実施態様には、軽鎖および重鎖を含有するヘテロ二量体チモーゲン様タンパク質を含むキメラタンパク質が含まれ、ここで、重鎖のＮ末端は、プロテアーゼ開裂部位に連結されている。損傷部位での当該プロテアーゼ開裂部位の開裂は、ｉｎ ｖｉｖｏで凝固因子を活性化することができる。
１つの実施態様において、キメラタンパク質中の活性化可能な凝固因子は、たとえば共有結合（たとえばペプチド結合）、ジスルフィド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、シグマ結合、π結合、デルタ結合、グリコシド結合、アグノスティック結合、屈曲結合、双極性結合、π背面、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結合、共役、超共役、芳香族性、ハプト数または反結合により増強部分へと連結される。他の実施態様において、活性化可能な凝固因子と増強部分の間の連結は非共有性の相互作用である（たとえば、イオン相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または水素結合等）。一部の実施態様において、活性化可能な凝固因子と増強部分の間の連結は、共有結合または非共有結合であるが、化学的架橋（たとえば、光反応性結合）ではない。特定の実施態様において、活性化可能な凝固因子と増強部分の間の連結はジスルフィド結合である。
１つの態様において、活性化可能な凝固因子および増強部分を含有するキメラタンパク質はさらに、１以上のリンカー部分を含有する。たとえば、キメラタンパク質は化学式Ａｃ−Ｌ−ＥｍまたはＥｍ−Ｌ−Ａｃを含有することができ、ここで、Ａｃは活性化可能な凝固因子、Ｌはリンカー部分およびＥｍは増強部分である。１つの実施態様において、リンカー部分はペプチドリンカーであっても良い。ペプチドリンカーの非限定的な例は、以下の（Ｄ）の項に記述される。他の実施態様において、リンカー部分は低複合性ポリペプチド（たとえばＸＴＥＮ配列）である。キメラタンパク質に有用なリンカー部分は、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも１０００アミノ酸、または少なくとも２０００アミノ酸を含有する。
他の態様において、本発明のキメラタンパク質には、活性化可能な凝固因子、増強部分、および１以上の異種部分（本明細書において、Ｈｅｔ、Ｈｅｔ１またはＨｅｔ２と示される場合もある）を含有する。異種部分は、異種ポリペプチド部分、非ポリペプチド部分、またはその両方を含有しても良い。異種ポリペプチド部分は、イムノグロブリン定常領域もしくはその一部、アルブミンまたはその断片、誘導体もしくは変異体、アルブミン結合部分、アルブミン結合小分子、ＰＡＳ配列、ＸＴＥＮ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、誘導体もしくは変異体、またはそれらの任意の組み合わせから選択されても良い。他の実施態様において、異種部分はイムノグロブリン定常領域またはその一部（たとえば、Ｆｃ部分）である。さらに他の実施態様において、非ポリペプチド部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、その誘導体またはそれらの任意の組み合わせから選択される。異種部分は、活性化可能な凝固因子のＮ末端またはＣ末端に連結されていても良く（軽鎖、重鎖、またはその両方のいずれか）、または活性化可能な凝固因子内の２つのアミノ酸の間に挿入されていても良く（軽鎖、重鎖、またはその両方のいずれか）、または、増強部分のＮ末端もしくはＣ末端、または増強部分内の２つのアミノ酸の間に挿入されてもよい。異種部分の例は以下の（Ｃ）の項に記述される。
一部の実施態様において、キメラタンパク質は２以上の異種部分を含有する。２以上の異種部分を含有するキメラタンパク質は、１つのポリペプチド鎖、２つのポリペプチド鎖、３つのポリペプチド鎖、またはそれ以上を有していても良い。たとえば、キメラタンパク質は、化学式Ａｃ−Ｈｅｔ１−Ｅｍ−Ｈｅｔ２、Ｈｅｔ２−Ｅｍ−Ｈｅｔ１−Ａｃ、Ａｃ−Ｅｍ−Ｈｅｔ１−Ｈｅｔ２、Ｈｅｔ２−Ｈｅｔ１−Ｅｍ−Ａｃ、Ｈｅｔ１−Ｈｅｔ２−Ａｃ−Ｅｍ、Ｅｍ−Ａｃ−Ｈｅｔ２−Ｈｅｔ１、Ｈｅｔ１−Ｅｍ−Ｈｅｔ２−Ａｃ、Ａｃ−Ｈｅｔ１−Ｅｍ−Ｈｅｔ２、Ｅｍ−Ｈｅｔ２−Ａｃ−Ｈｅｔ１、Ｈｅｔ１−Ａｃ−Ｈｅｔ２−Ｅｍ、Ｈｅｔ２−Ａｃ−Ｈｅｔ１−Ｅｍ、および、Ｅｍ−Ｈｅｔ１−Ａｃ−Ｈｅｔ２により表される単鎖を含有しても良く、ここで、Ａｃは活性化可能な凝固因子、Ｈｅｔ１は第一の異種部分、Ｅｍは増強部分、Ｈｅｔ２は第二の異種部分、および（−）はペプチド結合または１以上のアミノ酸である。
２つのポリペプチド鎖を含有するキメラタンパク質は、化学式Ａｃ−Ｈｅｔ１：Ｅｍ−Ｈｅｔ２、Ｈｅｔ１−Ａｃ：Ｈｅｔ２−Ｅｍ、Ａｃ−Ｈｅｔ１：Ｈｅｔ２−Ｅｍまたは、Ｈｅｔ１−Ａｃ：Ｅｍ−Ｈｅｔ２により表されても良く、ここで、Ａｃは活性化可能な凝固因子、Ｅｍは増強部分、Ｈｅｔ１は第一の異種部分（たとえば、第一のＦｃ部分）、Ｈｅｔ２は第二の異種部分（たとえば、第二のＦｃ部分）、および（−）はペプチド結合または１以上のアミノ酸であり、ならびに、（：）は２つのポリペプチド鎖（たとえば、Ａｃ−Ｈｅｔ１およびＥｍ−Ｈｅｔ２）の間の関連性である。本明細書に表記される関連性（：）は、共有結合または非共有結合（たとえば、少なくとも１つの非ペプチド結合）を表す。１つの実施態様において、関連性、すなわち（：）は、共有結合である。他の実施態様において、関連性、すなわち（：）は、非共有結合的相互作用（たとえば、イオン相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合）である。他の実施態様において、（：）は、非ペプチド共有結合である。さらに他の実施態様において、（：）はペプチド結合である。さらに他の実施態様において、本明細書に表記される化学式中の（：）は、２つの配列の間の物理的関連性または化学的関連性を表すが、化学的架橋ではなく、ここで、第一の配列および第二の配列のいずれか、または両方の活性化で、第一の配列および第二の配列が互いに相互作用するように、第一の配列の一部は、第二の配列に近接している。
本明細書に表記される化学式は、本発明の構築物の単に非限定的な例示に過ぎない。ポリペプチド化学式の方向性は、Ｎ末端（左）からＣ末端（右）で示されている。たとえば、化学式Ａｃ−Ｈｅｔ１は、化学式ＮＨ２−Ａｃ−Ｈｅｔ１−ＣＯＯＨを意味する。さらに、（：）は、他で明記されない限り、第一の鎖の任意の部分と第二の鎖の任意の部分の間の共有結合、または非共有結合による、２つのポリペプチド鎖の間の関連性または相互作用であっても良い。たとえば、化学式Ａｃ−Ｈｅｔ１：Ｅｍ−Ｈｅｔ２は、２つのポリペプチド鎖（第一の鎖はＡｃ−Ｈｅｔ１、第二の鎖はＥｍ−Ｈｅｔ２）を有し、ここで、第一の鎖のＡｃは、第二の鎖のＥｍと相互作用または関連し、および／または、第一の鎖のＨｅｔ１は、第二の鎖のＨｅｔ２と相互作用または関連する。一部の実施態様において、（：）は、共有結合的な非ペプチド結合または非共有結合を意味する。
さらなる態様において、本発明のキメラタンパク質は活性化可能な凝固因子、増強部分、１以上のリンカー部分、および１以上の異種部分を含有する。１つの実施態様において、キメラタンパク質は活性化可能な凝固因子（Ａｃ）、増強部分（Ｅｍ）、１つのリンカー部分（Ｌ）、および１つの異種部分（Ｈｅｔ）を含有し、ここで、構成要素は互いに連結または関連している。キメラタンパク質は、化学式Ａｃ−Ｌ−Ｈｅｔ：Ｅｍ、Ｈｅｔ−Ｌ−Ａｃ：Ｅｍ、Ｅｍ−Ｌ−Ｈｅｔ：Ａｃ、Ｈｅｔ−Ｌ−Ｅｍ：Ａｃ、Ａｃ−Ｌ−Ｈｅｔ−Ｅｍ、または、Ｅｍ−Ｈｅｔ−Ｌ−Ａｃで表されても良い。他の実施態様において、キメラタンパク質は活性化可能な凝固因子（Ａｃ）、増強部分（Ｅｍ）、２つのリンカー部分（Ｌ１およびＬ２）、および１つの異種部分（Ｈｅｔ）を含有する。キメラタンパク質は、化学式Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ−Ｌ２−ＥｍおよびＥｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ−Ｌ１−Ａｃで表されても良い。他の実施態様において、キメラタンパク質は活性化可能な凝固因子（Ａｃ）、増強部分（Ｅｍ）、２つのリンカー部分（Ｌ１およびＬ２）、および２つの異種部分（Ｈｅｔ１およびＨｅｔ２）を含有し、ここで、構成要素は互いに連結または関連している。キメラタンパク質は、化学式Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ１：Ｅｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ２、Ｈｅｔ１−Ｌ２−Ａｃ：Ｅｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ２、またはＨｅｔ１−Ｌ２−Ａｃ：Ｈｅｔ２−Ｌ２−Ｅｍで表されても良く、ここで、Ａｃは、活性化可能な凝固因子を含有し、活性化可能な凝固因子から本質的になり、または、活性化可能な凝固因子からなり、Ｌ１は、第一の任意選択的なリンカー部分（たとえば、第一のリンカー）を含有し、第一の任意選択的なリンカー部分から本質的になり、または、第一の任意選択的なリンカー部分からなり、Ｈｅｔ１は、第一の異種部分（たとえば、第一のＦｃ部分）を含有し、第一の異種部分から本質的になり、または、第一の異種部分からなり、Ｅｍは、増強部分を含有し、増強部分から本質的になり、または、増強部分からなり、Ｌ２は、第二の任意選択的なリンカー部分（たとえば、第二のリンカー）を含有し、第二の任意選択的なリンカー部分から本質的になり、または、第二の任意選択的なリンカー部分からなり、Ｈｅｔ２は、第二の任意選択的な異種部分（たとえば、第二のＦｃ部分）を含有し、第二の任意選択的な異種部分から本質的になり、または、第二の任意選択的な異種部分からなり、（−）は、ペプチド結合もしくは１以上のアミノ酸を含有し、ペプチド結合もしくは１以上のアミノ酸から本質的になり、または、ペプチド結合もしくは１以上のアミノ酸からなり、ならびに、（：）は、Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ１とＥｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ２の間の関連である。本明細書に表記される関連（：）は、共有結合または非共有結合（たとえば、少なくとも１つの非ペプチド結合）を表す。１つの実施態様において、関連、すなわち（：）は、共有結合である。特定の実施態様において、関連（：）は、Ｈｅｔ１とＨｅｔ２の間のジスルフィド結合である。他の実施態様において、関連、すなわち（：）は、非共有結合的相互作用（たとえば、イオン相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合）である。他の実施態様において、（：）は、非ペプチド共有結合である。さらに他の実施態様において、（：）は、ペプチド結合である。さらに他の実施態様において、本明細書に表記される化学式中の（：）は、２つの配列間の物理的関連または化学的関連を表すが、化学的架橋ではなく、ここで、第一の配列および第二の配列のいずれかまたは両方の活性化で、第一の配列および第二の配列が互いに相互作用するように、第一の配列の一部は、第二の配列に近接している。
ある態様において、本発明のキメラタンパク質は、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、第一のポリペプチド鎖は、活性化可能な凝固因子を含有し、第二のポリペプチド鎖は増強部分を含有し、ここで、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖は、互いに連結または関連している。キメラタンパク質はさらに、第一の異種部分、Ｈｅｔ１（たとえば、第一のＦｃ部分、たとえばＦ１）および第二の異種部分、Ｈｅｔ２（たとえば、第二のＦｃ部分、たとえばＦ２）を含有する二量体異種部分領域を含有し、ここで、第一の異種部分は、第一のポリペプチド鎖中にあり、第二の異種部分は第二のポリペプチド鎖中にある。たとえば、キメラタンパク質は、以下から選択される構造を含有しても良い：
（ａ）リンカー部分を介してＨｅｔ１に連結されたＡｃ、およびＨｅｔ２に連結されたＥｍ、
（ｂ）第一のリンカー部分を介してＨｅｔ１に連結されたＡｃ、および第二のリンカー部分を介してＨｅｔ２に連結されたＥｍ、
（ｃ）Ｈｅｔ１に連結されたＡｃ、およびＥｍはリンカー部分を介してＨｅｔ２に連結されている、
（ｄ）Ｈｅｔ１に連結されたＡｃ、およびＨｅｔ２に連結されたＥｍ、
（ｅ）リンカー部分を介してＨｅｔ１に連結されたＥｍ、およびＨｅｔ２に連結されたＡｃ、
（ｆ）第一のリンカー部分を介してＨｅｔ１に連結されたＥｍ、および第二のリンカー部分を介してＨｅｔ２に連結されたＡｃ、
（ｇ）Ｈｅｔ１に連結されたＥｍ、およびＡｃはリンカー部分を介してＨｅｔ２に連結されている、
（ｈ）Ｈｅｔ１に連結されたＥｍ、およびＨｅｔ２に連結されたＡｃ、ここでＨｅｔ１およびＨｅｔ２はジスルフィド結合を形成する。
２つのポリペプチド鎖を含有するキメラタンパク質はまた、以下に記述されるように表されても良い：
（ａ）第一のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、第二のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、
（ｂ）第一のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、第二のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、
（ｃ）第一のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、第二のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、
（ｄ）第一のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、第二のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｌ１−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、
（ｅ）第一のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、第二のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、
（ｆ）第一のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｌ１−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、第二のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、
（ｇ）第一のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、第二のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、ならびに、
（ｈ）第一のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、第二のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、そして、
ここで、２つのポリペプチド鎖のＨｅｔ１およびＨｅｔ２は、ジスルフィド結合を形成する。
さらに他の態様において、キメラタンパク質は活性化可能な凝固因子（Ａｃ）、増強部分（Ｅｍ）、３つのリンカー部分（Ｌ１、Ｌ２およびＸ）および２つの異種部分（Ｈｅｔ１およびＨｅｔ２）を含有し、ここで、構成要素は互いに連結している。キメラタンパク質は、Ａｃ−Ｈｅｔ１−Ｘ−Ｅｍ−Ｈｅｔ２または、Ｈｅｔ２−Ｅｍ−Ｘ−Ｈｅｔ１−Ａｃから選択される化学式のものを含有し、ここで、Ａｃは活性化可能な凝固因子であり、Ｈｅｔ１は第一の異種部分であり、ＸはｓｃＦｃリンカーであり、Ｅｍは増強部分であり、および、Ｈｅｔ２は第二の異種部分である。キメラタンパク質はまた、１以上のリンカー部分を含有してもよい。たとえば、キメラタンパク質は、Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ１−Ｘ−Ｅｍ−Ｈｅｔ２、Ａｃ−Ｈｅｔ１−Ｘ−Ｅｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ２、Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ１−Ｘ−Ｅｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ２、Ｈｅｔ２−Ｅｍ−Ｘ−Ｈｅｔ１−Ｌ１−Ａｃ、Ｈｅｔ２−Ｌ２−Ｅｍ−Ｘ−Ｈｅｔ１−Ａｃ、または、Ｈｅｔ２−Ｌ２−Ｅｍ−Ｘ−Ｈｅｔ１−Ｌ１−Ａｃから選択される化学式のものを含有してもよく、ここで、Ａｃは活性化可能な凝固因子であり、Ｌ１は第一の任意選択的なリンカー部分であり、Ｈｅｔ１は第一の異種部分であり、ＸはｓｃＦｃリンカーであり、Ｅｍは増強部分であり、Ｌ２は第二の任意選択的なリンカー部分であり、および、Ｈｅｔ２は第二の異種部分である。
１つの実施態様において、異種部分（Ｈｅｔ１およびＨｅｔ２）の両方またはいずれかは、同一または異なる異種ポリペプチド部分である。他の実施態様において、Ｈｅｔ１およびＨｅｔ２の両方またはいずれかは、非ポリペプチド部分である。他の実施態様において、異種部分（Ｈｅｔ１およびＨｅｔ２）の両方またはいずれかは、半減期延長物質であっても良い。半減期延長物質の例としては、限定されないが、イムノグロブリン定常領域もしくはその一部、アルブミン、トランスフェリン、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ配列、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）のβサブユニット、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＸＴＥＮ配列、ヒドロキシエチレンデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合小分子、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子またはその断片、誘導体もしくは変異体、またはそれらいずれかの組み合わせが挙げられる。異種部分の例は、以下の（Ｃ）の項に示す。
他の実施態様において、第一および第二の異種部分（Ｈｅｔ１およびＨｅｔ２）は、ペプチド結合またはリンカー（たとえば、ｓｃＦｃリンカー（「Ｘ」と示される場合もある））により互いに連結され、または、共有結合もしくは非共有結合（たとえばジスルフィド結合）により関連づけられる。たとえば、ｓｃＦｃリンカーは、第一のＦｃ部分と第二のＦｃ部分を連結することができ、それによって二量体Ｆｃ領域を形成することができる。ｓｃＦｃリンカーはさらに、細胞内プロセッシング部位（宿主細胞内で発現された場合、キメラタンパク質のプロセッシングを可能とする）を含有しても良い。ｓｃＦｃリンカーの例を、以下の（Ｃ．３）の項に示す。
キメラタンパク質の各構成要素を以下に記述する。
Ａ．活性化可能な凝固因子
１．凝固因子
特に、本発明は第ＶＩＩ因子および第Ｘ因子の改善型に関する。これらの因子はすべて、軽鎖の各アミノ末端が、付加的な部分の組み込みを受け入れないという点で構造的に似ている。同様に、これら３つの凝固因子の凝固因子の重鎖のアミノ末端は、付加的な部分の組み込みを受け入れられない（開裂可能な部分（すなわち、開裂部位からなる開裂部位または部分を介して連結された部分）を除く）。本発明のキメラ凝固因子構築物は、これら共有された特性に基づき設計されており、本発明の例示的な実施態様を図示するために第ＶＩＩ因子がしばしば示されているが、対象の構築物は、第ＶＩＩ因子または第Ｘ因子を用いて作製されても良いことを理解されたい。たとえば、当業者は、本発明の構築物の第ＦＶＩＩ部分を、ＦＸ部分と置換し、これら凝固因子のうちの１つの増強型を作製しても良いことを理解するであろう。
外来性凝固因子は多くの場合、有効となるための十分な反応速度では活性化されないため、バイパス療法に供される凝固因子は、活性型で投与される場合には有効である。しかしながら、それらは内因性経路（たとえば、アンチトロンビンＩＩＩまたはＴＦＰＩ）により急速に不活化され、それにより、活性化形態がクリアランスされ、有効半減期は短い。内因性酵素による急速な不活化およびクリアランスを防ぐために、本発明のキメラ凝固因子は、「活性化可能な」形態として構築されている。そのような活性化可能な構築物は、長い半減期を有する増強チモーゲンとして循環し、しかし、必要とされる際には凝固部位で急速に開裂されることができる。
本発明の例示的なキメラ凝固因子構築物は、添付の図面に記述される。本発明に有用なキメラ凝固因子は、不活性形態で発現され、次いで、不活性形態として投与され、次いで、ｉｎ ｖｉｖｏ投与で活性化される。第ＶＩＩ因子および第Ｘ因子の不活性形態は、単鎖チモーゲンである。第ＶＩＩ因子および第Ｘ因子の活性形態は、重鎖および軽鎖が共有結合（たとえばジスルフィド結合）により連結されている二量体分子から構成される。
活性化可能な凝固因子は、プロテアーゼ開裂部位に連結された凝固因子チモーゲンの軽鎖を含有し、それはさらに当該凝固因子チモーゲンの重鎖に連結される。凝固因子チモーゲンの軽鎖および重鎖は、それぞれ、凝固因子チモーゲンの軽鎖または重鎖の機能を維持する、その断片、変異体、誘導体またはアナログを含有しても良い。
１つの実施態様において、本発明の凝固因子は、第ＶＩＩ因子またはその変異体の成熟形態である。第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ、Ｆ７；第７因子、凝固因子ＶＩＩ、血清因子ＶＩＩ、血清プロトロンビン転換促進因子、ＳＰＣＡ、プロコンベルチンおよびエプタコグ（ｅｐｔａｃｏｇ）アルファとも呼称される）は、凝固カスケードの一部であるセリンプロテアーゼである。ＦＶＩＩはＧｌａドメイン、２つのＥＧＦドメイン（ＥＧＦ−１およびＥＧＦ−２）、およびセリンプロテアーゼ（たとえば、キモトリプシン等）のペプチダーゼＳ１ファミリーのすべてのメンバーの間で高度に保存されているセリンプロテアーゼドメイン（またはペプチダーゼＳ１ドメイン）を含有する。ＦＶＩＩは、単鎖チモーゲン（すなわち活性化可能なＦＶＩＩ）および完全活性化二鎖形態として存在する。
本明細書において、「ＦＶＩＩタンパク質」という用語は、野生型第ＦＶＩＩ、成熟型ＦＶＩＩ、全長ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩの機能性断片、その変異体または誘導体を含む。例示的な第ＦＶＩＩ因子変異体には、特定の活性が増加したものが含まれる（たとえば、その酵素活性（ＫｃａｔまたはＫｍ）を増加させることによりＦＶＩＩの活性を増加させた変異体）。そのような変異体は、当分野に公知であり、たとえば、Persson et al. 2001. PNAS 98:13583；Petrovan and Ruf. 2001. J. Biol. Chem. 276:6616；Persson et al. 2001 J. Biol. Chem. 276:29195；Soejima et al. 2001. J. Biol. Chem. 276:17229；Soejima et al. 2002. J. Biol. Chem. 247:49027に記述される分子の変異形態が挙げられる。１つの実施態様において、ＦＶＩＩの変異形態は、変異を有している。例示的な変異としては、Ｖ１５８Ｄ−Ｅ２９６Ｖ−Ｍ２９８Ｑが挙げられる。他の実施態様において、第ＦＶＩＩ因子の変異形態は、トリプシンの１７０ループからのアミノ酸ＥＡＳＹＰＧＫと、第ＦＶＩＩ因子成熟形態配列からのアミノ酸６０８〜６１９（ＬＱＱＳＲＫＶＧＤＳＰＮ、１７０ループに相当）の置換を含む。ＦＩＸの高度特異的活性変異体は、当分野に公知である。たとえば、Simioni et al. (2009 N.E. Journal of Medicine 361:1671)において、Ｒ３３８Ｌ変異が記述されている。Chang et al. (1988 JBC 273:12089)および、Pierri et al. (2009 Human Gene Therapy 20:479)にはＲ３３８Ａ変異が記述されている。他の変異も当分野に公知であり、たとえばZogg and Brandstetter. 2009 Structure 17:1669；Sichler et al. 2003. J. Biol. Chem. 278:4121；および、Sturzebecher et al. 1997. FEBS Lett 412:295に記述されているものが挙げられる。これらの文献の内容は、参照により本明細書に援用される。例示的なＦＶＩＩのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、配列番号４４および４５の一部としてそれぞれ配列表に開示されている。
第ＶＩＩ因子または第Ｘ因子の活性化は、ＦＶＩＩチモーゲンまたはＦＸチモーゲンの重鎖のすぐ上流が開裂された際に発生する。たとえば、第ＦＶＩＩ因子は、第ＦＶＩＩ因子重鎖の第一残基のすぐ上流、すなわち、Ｉｌｅ−１５３が開裂された際に、活性化される。
１つの実施態様において、本発明の凝固因子は、第Ｘ因子の成熟形態である。第Ｘ因子は、分子量５８．５ｋＤａのビタミンＫ依存性糖タンパク質であり、チモーゲンとして肝臓から血漿へ分泌される。当初、第Ｘ因子はトータルで４８８アミノ酸で構成されるシグナルペプチドを有するプレプロペプチドとして産生される。シグナルペプチドは、小胞体への輸送の間にシグナルペプチダーゼにより切り離され、プロペプチド配列は、成熟Ｎ末端鎖のＮ末端で、第１１位グルタミン酸残基で、ガンマカルボキシル化が発生した後に、開裂される。さらなるプロセッシング工程は、Ａｒｇ１８２とＳｅｒ１８３の間の開裂により発生する。このプロセッシング工程により、トリペプチドＡｒｇ１８０−Ｌｙｓ１８１−Ａｒｇ１８２の同時欠損ももたらされる。得られた分泌型第Ｘ因子チモーゲンは、１３９アミノ酸のＮ末端軽鎖（Ｍ、１６，２００）および３０６アミノ酸のＣ末端重鎖（Ｍ、４２，０００）からなり、それらはＣｙｓ１７２とＣｙｓ３４２の間のジスルフィド架橋により共有結合している。さらなる翻訳後プロセッシング工程としては、Ａｓｐ１０３のベータ−ヒドロキシル化、ならびにＮ型グリコシル化およびＯ型グリコシル化が挙げられる。
表１
これら凝固因子の野生型（ＷＴ）またはその生物学的活性部分に加え、本発明は、活性を有するそれらの前駆体断片化形態、対立遺伝子多型および種変異体、当該凝固因子の成熟型と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し、血栓形成を促進する活性を維持しているポリペプチドを含む、スプライスバリアント、および他のバリアントによりコードされる変異体を用いてもよい。たとえば、ＦＶＩＩの少なくとも１つの活性（たとえば、ＦＶＩＩのＴＦ結合、第Ｘ因子結合、リン脂質結合、および／または、凝固活性）を維持している改変ＶＩＩポリペプチドおよびその変異体を用いても良い。活性を維持することに関して、検出可能な効果を得るのに維持された活性レベルが十分である限りは、野生型凝固因子と比較して、活性が変化（たとえば、増加または減少）していても良い。本発明の構築物中で使用することができる凝固因子の例示的な配列は、添付の配列表に開示する。
例示的な改変ポリペプチドとしては、限定されないが、組織特異的アイソフォームおよびその対立遺伝子多型、核酸の翻訳により調製された合成分子、化学合成により作製されたタンパク質（たとえば、遺伝子組み換え法を介した短いポリペプチドのライゲーションを含む合成）、ヒトおよび非ヒト組織ならびに細胞、キメラポリペプチドならびにその改変体から単離されたタンパク質が挙げられる。本発明の凝固因子はまた、全長成熟型ポリペプチドの少なくとも１つの活性を（必要に応じて活性化で）維持するための適切な領域を含む、または、十分な長さである、ＷＴ分子の断片または部分からなっていてもよい。例示的な凝固因子変異体は、当分野で公知である。
１つの実施態様において、活性化可能な凝固因子を改変して、Ｇｌａドメインを欠損させる。第ＶＩＩ因子の場合においては、Ｇｌａドメインは軽鎖のアミノ末端に存在し、アミノ酸１〜３５からなる。ＧＬＡドメインによって、カルシウムイオンの高いアフィニティで結合する。それはタンパク質成熟型のＮ末端の先端から始まり、保存芳香族残基に終わる。保存Ｇｌａ−ｘ（３）−Ｇｌａ−ｘ−Ｃｙｓモチーフは、カルボキシラーゼによる基質認識に重要であると考えられているドメインの中間において見いだされる。
表面プラズモン共鳴分析と組み合わせて、ストップフロー蛍光動力学的測定を用いたところ、Ｇｌａドメインが、ＦＶＩＩａのプロテアーゼドメインがｓＴＦとの接触を開始する一連の事象において重要であることが判明した（Biochemical and Biophysical Research Communications. 2005. 337:1276）。さらに、凝固因子のクリアランスは、Ｇｌａ相互作用（たとえば、肝細胞およびクリアランス受容体（たとえばＥＰＣＲ））を介してかなり調節されている可能性がある。
それゆえ、Ｇｌａドメインによって、複数の経路を介した凝固因子のクリアランス（たとえば、肝細胞、クリアランス受容体（たとえばＥＰＣＲ等）への結合）が調節される。ゆえに、Ｇｌａドメインを排除することにより、凝固因子の半減期に有益な効果がもたらされる。第ＶＩＩ因子のＧｌａドメインは、珍しいアミノ酸＿−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）を含有し、それは、陰性荷電したリン脂質表面への凝固因子の結合に必須な働きをする。
例示的な凝固因子は、哺乳類のもの（たとえば、ヒト由来）である。例示的な凝固因子の配列は、添付の配列表に提示されている（たとえば、単独、または、キメラ凝固因子構築物との関連で）。
２．プロテアーゼ開裂部位
凝固因子チモーゲンの軽鎖と凝固因子チモーゲンの重鎖を連結するプロテアーゼ開裂部位は、当分野公知のプロテアーゼ開裂部位から選択されても良い。１つの実施態様において、プロテアーゼ開裂部位は、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるプロテアーゼにより開裂される。プロテアーゼ開裂部位により、凝固因子の重鎖と軽鎖が開裂され、損傷部位で互いに解離する。例示的なＦＸＩａ開裂部位としては、たとえば、ＫＬＴＲ（配列番号１３）、ＤＦＴＲ（配列番号１４）、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号６）および、ＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号７）が挙げられる。例示的なトロンビン開裂部位としては、たとえば、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号８）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号９）、ＬＶＰＲＧ（配列番号１０）および、ＡＬＲＰＲ（配列番号１）が挙げられる。
一部の実施態様において、プロテアーゼ開裂部位は、効率的な開裂および活性化のために、細胞内プロセッシング部位と組み合わせても良い。たとえば、キメラタンパク質中の活性化可能な凝固因子は、ヘテロ二量体（共有結合により凝固因子の重鎖と関連づけられた、凝固因子の軽鎖を含有する）を含有しても良く、ここで、凝固因子の重鎖のＮ末端はプロテアーゼ開裂部位に連結されている。プロテアーゼ開裂部位は、凝固部位で開裂され、凝固因子を活性化してもよい。そのような構築物は、凝固因子チモーゲンの軽鎖とプロテアーゼ開裂部位（凝固因子チモーゲンの重鎖に連結されている）の間に細胞内プロセッシング部位を挿入することにより設計されてもよい。その中に挿入された細胞内プロセッシング部位は、宿主細胞で発現されると、細胞内プロセッシング酵素によりプロセッシング（開裂）され、それにより、チモーゲン様ヘテロ二量体が形成される。細胞内プロセッシング酵素の例としては、フリン（ｆｕｒｉｎ）、酵母Ｋｅｘ２、ＰＣＳＫ１（ＰＣ１／Ｐｃ３としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ２（ＰＣ２としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ３（フリンまたはＰＡＣＥとしてもまた知られる）、ＰＣＳＫ４（ＰＣ４としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ５（ＰＣ５またはＰＣ６としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ６（ＰＡＣＥ４としてもまた知られる）、または、ＰＣＳＫ７（ＰＣ７／ＬＰＣ、ＰＣ８、またはＳＰＣ７としてもまた知られる）が挙げられる。他のプロセッシング部位も当分野に公知である。
３．自己犠牲的部分
ある実施態様において、プロテアーゼ開裂部位は、自己犠牲的部分を介して凝固因子チモーゲンの重鎖に連結されている。本明細書において用いられる「自己犠牲的部位」という用語は、２つの離れた部分（たとえば、凝固因子の重鎖とタンパク質開裂部位）を、通常は安定的三重分子へと共に共有結合させることができる二機能性化学部分を指す。自己犠牲的部分は、もし第一の部分（たとえばタンパク質開裂部位）に結合され、開裂された場合は、第二の部分（たとえば、凝固因子の重鎖）から自発的に分離する。
一部の態様において、自己犠牲的部分は、アミノベンジルカルバマート基、アミノベンジルエーテル基、または炭酸アミノベンジル基を含有する。１つの態様において、自己犠牲的部分は、ｐ−アミノベンジルカルバマート（ＰＡＢＣ）である。
Ｐ−アミノベンジルカルバマート（ＰＡＢＣ）は、最も効果的であり、最も広く使用されている自己犠牲的部位特異性プロドラッグ活性のための結合物質である（たとえば、Carl et al. J. Med. Chem. 24:479-480 (1981)；国際特許公開ＷＯ１９８１／００１１４５；Rautio et la, Nature Reviews Drug Discovery 7:255-270 (2008) ；Simplicio et al., Molecules 13:519-547 (2008)を参照のこと）。ＰＡＢＣにより、任意のアミン薬物、ペプチドおよびタンパク質が、プロテアーゼによる開裂および１，６自発的断片化で放出される。
アミノベンジル基の芳香環は、任意選択的に当該芳香環上の１以上（たとえば、Ｒ１および／またはＲ２）の置換基と置換されても良く、環を形成する４つの非置換炭素のうちの１つに付着している水素を置換する。本明細書において、「Ｒｘ」という記号（たとえば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４）は、本明細書に記述される置換基を表す一般的な略語である。
置換基は、ｐ−アミノベンジル基の自己犠牲的能力を改善することができる（Hay et al., J. Chem Soc., Perkin Trans. 1:2759-2770 (1999)；また、Sykes et al. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1:1601-1608 (2000)を参照のこと）。
以下の化学式は、ｐ−アミノベンジル自己犠牲的リンカーおよび、例示的なプロテアーゼ開裂部位の相対位置（Ａａ１Ａａ２Ａａ３Ａａ４）および凝固因子の重鎖（ＰＯＩ）の全体的なトポロジーを示す。化学式は、Ｒ置換基（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）の可能性のある位置を示す。
置換基（単一原子であっても良い（たとえば、ハロゲン）。または複数の原子群であっても良い（たとえば、メチル））は、アミノベンジルまたはその分解産物の安定性に影響を与えるように選択される。環から引き出された電子を用いて、アミノベンジル基のアミノ基と隣接するペプチド結合の間の結合の開裂後の、薬物からのアミノベンジル基の自発的な分解を促進しても良い。例示的な芳香族基Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３置換基としては、たとえば、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、ＯＨ、メチル、メトキシ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＯ３＋、ＮＨＣＯＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＣＦ３、アルキル、ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ８ハロゲン化アルキル、カルボン酸塩、硫酸塩、スルファミン酸塩、スルホン酸塩等が挙げられる（たとえば、米国特許第７，０９１，１８６号および第７，６５９，２４１号を参照のこと）。ｐ−アミノベンジルリンカーは、対象のタンパク質のペプチド、またはタンパク質のアミノ末端に結合されたヘテロ原子Ｚを含有しても良い。本明細書において使用されるヘテロ原子という用語には、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、ケイ素（Ｓｉ）、ボロン（Ｂ）、およびリン（Ｐ）が含まれる。１つの実施態様において、Ｚのヘテロ原子は、Ｏ、ＳまたはＮである。
一部の実施態様において、ｐ−アミノベンジル環の４つの非置換炭素のうちのたった１つのみが置換される。他の一部の実施態様において、ｐ−アミノベンジル環の４つの非置換炭素のうちの２つが置換される。他の実施態様において、ｐ−アミノベンジル環の４つの非置換炭素のうちの３つが置換される。一部の実施態様において、ｐ−アミノベンジル環の４つの非置換炭素が置換される。
自己犠牲的除去は、たとえば、１，４除去、１，６除去（たとえば、ＰＡＢＣ）、１，８除去（たとえば、ｐ−アミノ−シンナミルアルコール）、環化除去（たとえば、４−アミノブタノールエステルおよびエチレンジアミン）等を介して発生させることができる。一部の態様において、自己犠牲的部分は、たとえば、シンナミル、ナフチルまたはビフェニル基を含有してもよい（たとえば、Blencowe et al. Polym. Chem. 2:773-790 (2011)を参照のこと）。一部の態様において、自己犠牲的部分は、複素環を含有する（たとえば、米国特許第７，３７５，０７８号；第７，７５４，６８１号を参照のこと）。多くのホモ芳香族（たとえば、Carl et al. J. Med. Chem. 24:479 (1981); Senter et al. J. Org. Chem. 55:2975 (1990); Taylor et al. J. Org. Chem. 43:1197 (1978); Andrianomenjanahary et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2:1903 (1992)を参照のこと）、およびクマリン（たとえば、Weinstein et al. Chem. Commun. 46:553 (2010)を参照のこと）、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、イソキサゾール、ピロール、ピラゾール（たとえば、Hay et al. J. Med. Chem. 46:5533 (2003)を参照のこと）、ピリジン（たとえば、Perry-Feigenbaum et al. Org. Biomol. Chem. 7:4825 (2009)を参照のこと）、イミダゾン（たとえば、Nailor et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. Z:1267 (1999); Hay and Denny, Tetrahedron Lett. 38:8425 (1997)を参照のこと）、およびトリアゾール（たとえば、Bertrand and Gesson, J. Org. Chem. 72:3596 (2007)を参照のこと）をもとにしたヘテロ芳香族基（水性条件および生理学的条件の両方の下で自己犠牲的である）が当分野に公知である。また、米国特許第７，６９１，９６２号；第７，０９１，１８６号；米国特許出願公開ＵＳ２００６／０２６９４８０；ＵＳ２０１０／００９２４９６；ＵＳ２０１０／０１４５０３６；ＵＳ２００３／０１３０１８９；ＵＳ２００５／０２５６０３０を参照のこと。
自己犠牲的リンカーの置換基が、その慣例的な化学式（左から右に記載される）により明記される場合、右から左に記載される構造に由来する、化学的に同一である置換基を等しく包含する。たとえば、「−ＣＨ２Ｏ−」は、また「−ＯＣＨ２−」を列挙することが意図される。自己犠牲的物質中の置換基、たとえば、上述のｐ−アミノベンジル自己犠牲的リンカーのＲ１および／またはＲ２置換基は、たとえば、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールアルキル、アリールオキシ、ヘテロアリール等を含有しても良い。本発明の化合物が２以上の置換基を含む場合、各置換基は独立して選択される。
Ｂ．増強部分（Ｅｍ）
本発明は、活性化可能な凝固因子が「増強部分」に融合されることにより、当該増強部分に融合されていない活性化可能な凝固因子と比較して、本発明の活性化可能な凝固因子の特性が改善された、改善または増強された活性化可能な凝固因子を提示する。改善された特性には、凝固因子の凝固促進活性が含まれる。凝固促進活性の増加は、遊離している、または融合されていない活性化可能な凝固因子に対する相対的なものである。増強部分は、凝固因子の凝固促進活性を増強する能力を有する任意の分子であっても良い。本発明に有用な増強部分は、活性化可能な凝固因子と物理的に相互作用してもよく、当該物理的な相互作用により、凝固促進活性の増加が誘導されてもよい。
本発明のキメラタンパク質は、１以上の増強部分を含んでも良い。さらに、２以上の増強部分が、順番に（たとえばリンカーを介して）互いに連結されてもよく、および、本発明の構築物に操作可能に連結されたタンデムアレイに連結されても良い。２以上の増強部分が本発明のキメラ凝固因子に存在する場合、当該部分は同一または異なっていても良い。
１つの実施態様において、増強部分は第ＶＩＩ因子または第Ｘ因子の重鎖のＣ末端上に位置している。他の実施態様において、増強部分は第ＶＩＩ因子または第Ｘ因子の軽鎖のＮ末端上に位置している。他の実施態様において、増強部分は、第ＶＩＩ因子または第Ｘ因子の軽鎖のＣ末端上に位置している。Ｆｃドメインまたはその一部が用いられる実施態様においては、増強部分は、第二のＦｃ部分のＮもしくはＣ末端、または、Ｆｃ部分のいずれかまたは両方のＣ末端に位置づけられても良い。
１つの実施態様において、増強部分は、構築物に遺伝的に直接融合されるのではなく、むしろ、リンカーを介して、または化学結合を介して構築物に連結されている。例えば、増強部分は、増強部分と構築物のＦｃ部分の間に結合を形成することにより、本発明の構築物に付着されても良く、増強部分は、第一の官能基を含有し、Ｆｃ部分は第二の官能基を含有し、ならびに、第一および第二の官能基は、互いに反応して化学結合を形成することができる（米国特許第７３８１４０８号を参照のこと）。
ある実施態様において、本発明の増強部分は、血液凝固経路タンパク質（たとえば、補因子）、凝固促進ペプチド、または抗原結合分子であっても良い。増強部分の例は、本明細書の実施例および図面に見出される。増強部分として有用な他の分子は、本明細書の教示に基づき、当業者に容易に選択されることができる。
１．凝固補因子
キメラタンパク質に有用な増強因子は、凝固補因子（ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｃｏｆａｃｔｏｒ）であっても良い。本明細書に置いて用いられる「凝固補因子」とは、他の凝固因子（たとえば、第ＶＩＩ因子または第Ｘ因子）と複合体を形成し、凝固促進活性を有する活性化複合体となる凝固因子を意味する。たとえば、ＦＶＩＩに対する凝固補因子は組織因子であり、ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体を形成する。ＦＸに対する凝固補因子はＦＶａであり、プロトロンビナーゼ複合体を形成し、それにより、プロトロンビンをトロンビンへと活性化する。
１つの実施態様において、凝固因子チモーゲンはＦＶＩＩタンパク質であり、凝固補因子は組織因子（ＴＦ）ポリペプチドである。組織因子は、循環第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子と複合体を形成することにより血液凝固を開始させる。［ＴＦ：ＶＩＩａ］複合体は、第ＩＸ因子または第Ｘ因子を、特定の制限タンパク質分解により活性化する。ＴＦは、細胞表面アセンブリおよび凝固プロテアーゼカスケードの伝播を開始させることにより、正常な止血において役割を果たす。ＴＦはまた、凝固因子ＩＩＩ、トロンボプラスチン、ＣＤ１４２およびＦ３としても知られる。全長組織因子ポリペプチドは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーにおいて、アクセッション番号Ｐ１３７２６−１であり、シグナルペプチド（アミノ酸１〜３２）、細胞外ドメイン（アミノ酸３３〜２５１）、膜貫通ドメイン（アミノ酸２５２〜２７４）、および細胞質ドメイン（アミノ酸２７５〜２９５）で、総アミノ酸２９５からなる。組織因子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、本明細書において、それぞれ、配列番号１６および配列番号１５として表されている。アクセッション番号Ｐ１３７２６−１ （Ｐ１３７２６−２）のアイソフォームは、アミノ酸１９９−２３８の置換：ＴＡＫＴＮＴＮＥＦＬ…ＴＶＮＲＫＳＴＤＳＰ→ＹＳＴＳＬＥＬＷＹＬ…ＷＧＲＡＧＲＲＴＰＨ、および、アミノ酸２３９〜２９５の欠損を含有している。ヒト組織因子の変異体としては、限定されないが、以下の変異を有するポリペプチドが含まれる：Ｔ３６Ａ、Ｉ１４５Ｖ、Ｒ１６３Ｗ、またはＧ２８１Ｅ。また、異なる種（たとえば、マウス、ラット、サル、イヌ、ショウジョウバエ、ブタ）由来のＰＣＳＫ１も含まれる。本明細書において、組織因子ポリペプチドとは、組織因子の可溶性外部ドメイン（ｓＴＦ）（およそアミノ酸３３〜２５１）を含有するポリペプチド、またはその機能性変異体、断片、アナログもしくは誘導体を指す。ｓＴＦは、膜貫通ドメイン、および、細胞質ドメインを欠く。成熟型ヒト組織因子の全長配列は、Spicer et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 84, 5148-5152 (1987)に開示されている。
表２ 組織因子配列
本発明に用いられる組織因子ポリペプチドは、配列番号１５（ｓＴＦ）のアミノ酸３３〜２５１に対し、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含有し、ここで、当該アミノ酸配列は、ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａと複合体を形成することができる。本明細書において用いられる「ＴＦタンパク質」という用語は、全長ＴＦ，その機能性断片（たとえば、細胞外ドメイン）、変異体、アナログまたは誘導体を含む。本明細書に置いて用いられる「可溶性ＴＦ」という用語は、ＴＦの完全細胞外ドメインの１以上の活性を維持している、その任意の機能性断片、変異体、アナログまたは誘導体を含む。１つの実施態様において、可溶性ＴＦ（およびその機能性断片、変異体、アナログまたは誘導体）は、ＦＶＩＩに結合することができる。他の実施態様において、可溶性ＴＦは、ＦＶＩＩに対する凝固補因子として作用することができる。
他の実施態様において、凝固因子チモーゲンはＦＸタンパク質であり、凝固補因子はＦＶａタンパク質である。ＦＶａタンパク質は、プロトロンビンをトロンビンへと活性化させる第Ｘａ因子のプロトロンビナーゼ活性に重要な補因子として機能する。第Ｖ因子の活性化形態である第Ｖａ因子は、重鎖および軽鎖、非共有結合から構成される。２つの鎖の間の相互作用はカルシウム依存性である。第Ｖ因子はまた、凝固因子Ｖ、活性化タンパク質Ｃ補因子、プロアクセレリン、および不安定因子としても知られており、重鎖および軽鎖の２鎖へと開裂されることができる。全長第Ｖ因子ポリペプチドは、ＵｎｉｔＰｒｏｔＫＢエントリーにおいて、アクセッション番号Ｐ１２２５９であり、シグナルペプチド（アミノ酸１〜２８）、重鎖（アミノ酸２９〜７３７）、活性化ペプチド（連結領域とも呼ばれている、アミノ酸７３４〜１５７３）、および軽鎖（アミノ酸１５７４〜２２２４）からなる。ＦＶのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１８および配列番号１７として本明細書に表されている。ヒト第Ｖ因子の変異体としては、限定されないが、以下の変異を有するポリペプチドが含まれる：Ｇ１５Ｓ、Ｄ１０７Ｈ、Ｒ３３４Ｇ、Ｒ３３４Ｔ、Ｉ３８７Ｔ、Ｍ４１３Ｔ、Ｒ５１３Ｋ、Ｒ５３４Ｑ、Ｃ６１３Ｒ、Ｓ７７５Ａ、Ｓ７８１Ｒ、Ｐ８０９Ｓ、Ｎ８１７Ｔ、Ｋ８５８Ｒ、Ｈ８６５Ｒ、Ｔ９１５Ｓ、Ｋ９２５Ｅ、Ｎ９６９Ｓ、Ｒ９８０Ｌ、Ｈ１１４６Ｑ、Ｌ１２８５Ｉ、Ｈ１３２７Ｒ、Ｌ１３９７Ｆ、Ｐ１４０４Ｓ、Ｅ１５３０Ａ、Ｔ１６８５Ｓ、Ｙ１７３０Ｃ、Ｌ１７４９Ｖ、Ｍ１７６４Ｖ、Ｍ１８２０Ｉ、Ｒ２１０２Ｃ、Ｒ２１０２Ｈ、Ｍ２１４８Ｔ、Ｋ２１８５Ｒまたは、Ｄ２２２２Ｇ。異なる種（たとえば、マウス、ラット、サル、イヌ、ショウジョウバエ、またはブタ）由来の第Ｖ因子タンパク質もまた含まれる。
表３ 第Ｖ因子配列
本発明に用いられるＦＶａタンパク質は、重鎖および軽鎖を含有するヘテロ二量体を含有し、ここで、当該重鎖は、配列番号１７のアミノ酸２９〜７３７に対して少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、第一のアミノ酸配列を含有し、当該軽鎖は、配列番号１８のアミノ酸１５７４〜２２２４に対して、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、第二のアミノ酸配列を含有し、ここで、ヘテロ二量体を形成した際の第一のアミノ酸配列および第二のアミノ酸配列は、ＦＸまたはＦＸａと複合体を形成することができる。本明細書において用いられるＦＶａタンパク質は、全長ＦＶａ、成熟型ＦＶａ、その機能性断片、変異体、アナログまたは誘導体を含有する。
２．凝固促進ペプチド
他の実施態様において、増強部分は凝固促進ペプチドである。「凝固促進ペプチド」は、出血性素因（たとえば、血友病Ａ等の血液凝固障害／凝固障害）の治療に用いることができる、またはＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩおよびｖＷＦの内の少なくとも１つにおける欠損の治療に用いることができる、凝固促進活性を有する低分子量化合物（たとえばペプチドまたはペプチド誘導体）である。一部の実施態様において、凝固促進ペプチドが増強部分として用いられる場合、凝固促進ペプチドは、それが融合される凝固因子の触媒活性を増加させることができるものである。
１つの実施態様において、凝固促進ペプチドは、以下の化合物を含有する：
（ａ）化学式ＩＩを含むアミノ酸配列
Ｃ１ＬＡＳＹＣ２ （化学式ＩＩ）
または、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列のレトロ−、インベルソ−、またはレトロ−インベルソ変異体。本開示において、上述の化合物の薬学的に受容可能な塩をさらに提示する。
化学式ＩＩにおいて、Ｃ１およびＣ２は、側鎖を有するアミノ酸であり、ここで、Ｃ１およびＣ２の側鎖は、ループを形成するように結合される。１つの例において、Ｃ１およびＣ２の側鎖は、共有結合されている（たとえば、ジスルフィド結合またはアミド結合を介して）。
化学式ＩＩにおいて、１、２、または３の付加的なアミノ酸を、Ｃ１およびＣ２の間の任意の場所に挿入することができる。上述の任意の実施態様に従う１つの例において、１または２の追加のアミノ酸が、Ｃ１およびＣ２の間の化学式（Ｉ）の任意の場所へと任意選択的に挿入される。他の例において、１つのアミノ酸が、Ｃ１およびＣ２の間の化学式ＩＩの任意の場所へと任意選択的に挿入される。他の例において、Ｃ１およびＣ２の間にはアミノ酸は挿入されない。
化学式ＩＩにおいて、ＬはＬ−ロイシンであり、ＡはＬ−アラニンであり、ＳはＬ−セリンであり、および、ＹはＬ−チロシンである。化学式ＩＩにおいて、Ｌ、Ａ、ＳおよびＹのうちの１、２、または３つは、任意選択的に、独立して選択された置換アミノ酸と置換される。１つの例において、Ｌ、Ａ、ＳおよびＹの内の１または２つは、独立して選択された置換アミノ酸と任意選択的に置換される。他の例において、Ｌ、Ａ、ＳおよびＹの内のまさに１つが、独立して選択された置換アミノ酸と任意選択的に置換される。
他の実施態様において、キメラタンパク質の増強部分は、化学式ＩＩＩのペプチドを含有する化合物を含有する：
化学式ＩＩＩ
またはそのレトロ−、インベルソ−、もしくはレトロ−インベルソ変異体。
化学式ＩＩＩにおいて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、アミノ酸側鎖から独立して選択されたメンバーである。化学式ＩＩＩにおいて、Ｌ１およびＬ２は、直鎖アルキレンまたは分子アルキレン、および直鎖ヘテロアルキレンまたは分子ヘテロアルキレンから独立して選択されたリンカー群である。
化学式ＩＩＩにおいて、Ｚは結合部分である。１つの例において、Ｚは、アミノ基、アミド基、ジスルフィド基、ジセレニド基、−Ｓ−Ｓｅ−基、アルキレン（たとえば、（Ｃ２−Ｃ４）アルキレン）、アルケニル（たとえば、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル）、アルキニル（たとえば、（Ｃ２−Ｃ４）アルキニル）、シクロアルキル（たとえば、１〜４の二重結合を含有する（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル）、ヘテロシクロアルキル（たとえば、Ｏ、ＳおよびＮから選択される１〜６のヘテロ原子を含有する３〜８員複素環）、アリール（たとえば、（Ｃ３−Ｃ７）アリール）、およびヘテロアリール（たとえば、Ｏ、ＳおよびＮから選択される１〜６のヘテロ原子を含有する３〜８員のヘテロアリール）から選択される。
例示的な合成凝固促進ペプチドとしては、たとえば、以下が挙げられる：
ＫＬＴＣＬＡＳＹＣＷＬＦ （配列番号１９）、
ＲＲＡＰＧＫＬＴＣＬＡＳＹＣＷＬＦＷＴＧＩＡ （配列番号２０）、
ＲＲＡＰＧＫＬＱＣＬＡＳＹＣＷＬＦＷＴＧＩＡ （配列番号２１）、
ＰＲＩＲＴＶＧＰＧＳＲＳＡＳＧＫＬＴＣＬＡＳＹＣＷＬＦＷＴＧＩＡ
（配列番号２２）、
ＳＫＱＧＲＰＩＳＰＤＲＲＡＡＧＫＬＴＣＬＡＳＹＣＷＬＦＷＴＧＩＡ
（配列番号２３）、
ＰＲＩＲＴＶＧＰＧＳＲＳＡＳＧＫＳＴＣＬＡＳＹＣＷＬＦＷＴＧＩＡ
（配列番号２４）、
ＳＲＩＲＴＶＳＰＧＳＲＳＡＳＧＫＳＴＣＬＡＳＹＣＷＬＦＷＴＧＩＡ
（配列番号２５）、または、
ＰＲＳＲＴＶＧＰＧＳＲＳＡＳＧＫＳＴＣＬＡＳＹＣＷＬＦＷＴＧＩＡ
（配列番号２６）
例示的な凝固促進ペプチドは、さらに、米国特許出願６１／４９５，８１８、Ｕ．Ｓ．６１／６００，２３７、Ｕ．Ｓ．６１／６０５，５４０、Ｕ．Ｓ．６１／４９６，５４０、Ｕ．Ｓ．６１／４９６，５４３、Ｕ．Ｓ．６１／４９６，５４４、Ｕ．Ｓ．６１／４９６，５４１、および、Ｕ．Ｓ．６１／４９６，５４２に開示されている（各々は、参照によりその全体で本明細書に援用される）。
３．抗体または抗原結合部位
他の実施態様において、増強部分は、少なくとも１つの抗原結合部位（たとえば、抗体、抗体変異体、抗体断片の抗原結合部位）、リガンドの受容体結合部分、または受容体のリガンド結合部分を含有する。増強部分として用いることができる例示的な抗原結合分子は、Andersen LM et al., J Biol Chem. 287: 8994-9001 (Jan. 2012)に開示されており（参照により本明細書にその全体で援用される）、その中に、ＦＶＩＩａの凝固促進活性を増加させ、たとえば血友病Ａおよび出血性素因等の血液凝固障害を治療するために用いられるＦＶＩＩ活性化抗体および抗体誘導体が開示されている。
「抗原結合部分」という用語は、イムノグロブリンのポリペプチド断片、抗体のポリペプチド断片、または、抗原に結合する抗体変異体もしくは抗原結合（すなわち、特異的結合）に関し、損なわれていない抗体と匹敵する抗体変異体（すなわち、それらが由来した、損なわれていない抗体）のポリペプチド断片を指す。抗原結合部分は、当分野公知の遺伝子組み換え法または生化学的方法により製造することができる。例示的な抗原結合部分としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、および（Ｆａｂ’）２、ならびにｓｃＦｖ分子が挙げられる。
他の実施態様において、本発明のキメラ凝固因子は、単鎖結合分子（たとえば、単鎖可変領域またはｓｃＦｖ）由来の結合部位を含有する増強部分を含有しても良い。単鎖抗体の製造に関し記述される技術（米国特許第４，６９４，７７８号;Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)；および、Ward et al., Nature 334:544-554 (1989)）を適合させて、単鎖結合分子を作製することができる。アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片の連結を形成し、単鎖抗体を得る。大腸菌での機能性Ｆｖ断片のアセンブリに関する技術を用いても良い（Skerra et al., Science 242:1038-1041 (1988)）。
ある実施態様において、本発明のキメラ凝固因子は、１以上の結合部位、または、単鎖可変領域配列（ｓｃＦｖ）を含有する、もしくはからなる領域を含有する増強部分を含有してもよい。単鎖可変領域配列は、１以上の抗原結合部位を有する単鎖ポリペプチドを含有する（たとえば、ＶＨドメインへの可塑性リンカーにより連結されるＶＬドメイン）。ｓｃＦｖ分子は、ＶＨ−リンカー−ＶＬの方向で構築されても良く、または、ＶＬ−リンカー−ＶＨの方向で構築されても良い。抗原結合部位を作り出すＶＬとＶＨドメインを連結する可塑性リンカーは、好ましくは、約１０〜約５０のアミノ酸残基を含有する。１つの実施態様において、ペプチドリンカーは、ｇｌｙ−ｓｅｒペプチドリンカーである。例示的なｇｌｙ−ｓｅｒペプチドリンカーは、化学式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎであり、ここで、ｎは、正の整数（たとえば、１、２、３、４、５または６）である。他のペプチドリンカーも当分野に公知である。単鎖可変領域配列を有する抗体（たとえば、単鎖Ｆｖ抗体）および前記単鎖抗体を作製すｒ方法は、当分野に公知である（たとえば、Ho et al. 1989. Gene 77:51; Bird et al. 1988 Science 242:423; Pantoliano et al. 1991. Biochemistry 30:10117; Milenic et al. 1991. Cancer Research 51:6363; Takkinen et al. 1991. Protein Engineering 4:837を参照のこと）
ある実施態様において、本発明のキメラ凝固因子に用いられるｓｃＦｖ分子は、安定化ｓｃＦｖ分子である。１つの実施態様において、安定化ｃＦｖ分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に挿入されたｓｃＦｖリンカーを含有し、ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、ＶＨのアミノ酸とＶＬドメインのアミノ酸の間のジスルフィド結合により連結されている。他の実施態様において、安定化ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さまたは組成を有するｓｃＦｖリンカーを含有してもよい。さらに他の実施態様において、安定化ｓｃＦｖ分子は、少なくとも１つの安定化アミノ酸置換（複数含む）を有するＶＨドメインまたはＶＬドメインを含有しても良い。さらに他の実施態様において、安定化ｓｃＦｖ分子は、上述の安定化特性のうちの少なくとも２つを有しても良い。
安定化ｓｃＦｖ分子は、タンパク質安定性が改善されており、または、操作可能に連結されているポリペプチドのタンパク質安定性を改善する。本発明の好ましいｓｃＦｖリンカーは、本発明のキメラ凝固因子の熱安定性を、従来的なポリペプチドと比較して、少なくとも約２℃または３℃まで改善する。比較は、たとえば、本発明のｓｃＦｖ分子の間で行われても良い。ある実施態様において、安定化ｓｃＦｖ分子は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ｓｃＦｖリンカーおよび、ＶＨアミノ酸４４とＶＬアミノ酸１００を連結するジスルフィド結合を含有する。本発明のキメラ凝固因子に用いられうる他の例示的な安定化ｓｃＦｖ分子は、米国仮特許出願６０／８７３，９９６（２００６年１２月８日出願）または米国特許出願１１／７２５，９７０（２００７年３月１９日出願）に記述されている（各々は参照によりその全体で本明細書に援用される）。
本発明のキメラ凝固因子は、当分野公知のプロトコールを用いて、抗体から誘導された可変領域またはその一部（たとえば、ＶＬおよび／またはＶＨドメイン）を含有してもよい。たとえば、可変ドメインは、非ヒト哺乳類（たとえば、ネズミ、モルモット、霊長類、ウサギまたはラット等）において、抗原またはその断片で当該哺乳類を免疫することにより産生された抗体から誘導されても良い。上述のHarlow & Laneを参照のこと（全ての目的に対し、参照により援用される）。イムノグロブリンは、関連抗原（たとえば、精製腫瘍関連抗原または、そのような抗原を含有する細胞もしくは細胞抽出物）およびアジュバントを複数回、皮下注射または腹腔内注射をすることにより作製されてもよい。通常、この免疫化により活性化脾臓細胞またはリンパ球から、抗原反応性抗体の産生を含む、免疫応答が誘導される。
可変領域は、免疫化された哺乳類の血清から採取されたポリクローナル抗体由来であっても良いが、多くの場合、所望の可変領域が誘導されているモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）の同種調製物を得るために、脾臓、リンパ節または末梢血由来の個々のリンパ球を単離することが望ましい。通常、ウサギまたはモルモットを、ポリクローナル抗体の作製に用いる。マウスは通常、モノクローナル抗体の作製に用いる。マウスに抗原断片を注射し、「ハイブリドーマ」を調製し、そして当該抗原に特異的に結合する抗体に対してハイブリドーマをスクリーニングすることにより、断片に対するモノクローナル抗体が調製されても良い。この良く知られた方法（Kohler et al., (1975), Nature, 256:495）においては、抗原を注射されたマウス由来の、比較的生存期間の短い、または死ぬ運命にあるリンパ球を、不死の腫瘍細胞株（たとえば、ミエローマ細胞株）と融合させ、ハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」（それら両方とも不死であり、Ｂ細胞により遺伝的にコードされる抗体を産生することができる）を得る。得られたハイブリッドを、選別、希釈および、単一抗体形成のための特定遺伝子を含有する各個の株で再増殖させることにより、単一遺伝子株へと分離する。それらは、所望の抗原に対し同質である抗体を産生し、その遺伝的割合の純度に関し、「モノクローナル」と呼称される。
そのように調製されたハイブリドーマ細胞を、適切な培養培地（好ましくは、融合されていない、親のミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１以上の基質を含有する）中に播種および増殖させる。当業者であれば、ハイブリドーマの形成、選択、および増殖のための試薬、細胞株ならびに培地が、多くの供給源から市販されており、標準的なプロトコールが確立されていることを認識するであろう。一般的に、ハイブリドーマが増殖する培養培地は、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関し分析される。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の特異的結合が、免疫沈降またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（たとえば、放射免疫測定（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ））により測定される。ハイブリドーマ細胞が、所望の特異性、アフィニティおよび／または活性の抗体を産生することが特定された後、当該クローンを、限界希釈法によりサブクローニングし、標準法により増殖させてもよい（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp 59-103 (Academic Press, 1986)）。サブクローンから分泌されたモノクローナル抗体は、培養培地、腹水、または血清から、標準的な精製方法（たとえば、アフィニティクロマトグラフィ（たとえば、プロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＬアフィニティクロマトグラフィ）、ヒロドキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、または透析）分離されても良いことが、さらに認識されたい。
所望のモノクローナル抗体またはその結合部位をコードするＤＮＡは、定常領域ドメイン配列の単離に対する、上述の普遍的な任意の手順を用いて、容易に単離および配列解析されうる（たとえば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）。単離およびサブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい源として役立つ。より具体的には、単離されたＤＮＡ（本明細書に記述されるように合成されてもよい）を用いて、本発明のキメラ凝固因子に組み込むための、所望の可変領域配列をクローニングしても良い。
他の実施態様において、結合部位は、完全ヒト抗体から誘導される。ヒトまたは実質的にヒトの抗体は、内因性のイムノグロブリン産生を行うことができないトランスジェニック動物（たとえば、マウス）において作製されてもよい（たとえば、米国特許第６，０７５，１８１号、第５，９３９，５９８号、第５，５９１，６６９号および、第５，５８９，３６９号を参照のこと。それらは参照により本明細書に援用される）。たとえば、キメラの生殖系統に変異のあるマウスにおいて、抗体重鎖接続領域をホモ接合性に欠損させることにより、内因性の抗体産生を完全に阻害することができることが記述されている。そのような生殖系統変異マウスに、ヒトイムノグロブリン遺伝子アレイを移転することにより、抗原チャレンジによりヒト抗体を産生させることができる。ＳＣＩＤマウスを使用した、他の好ましいヒト抗体産生方法は、米国特許第５，８１１，５２４号に記述されている（参照により本明細書に援用される）。これらヒト抗体に関連した遺伝的材料は、本明細書に記述されるように単離および操作されても良いことを認識されたい。
他の態様において、本発明のポリペプチドは、抗体の改変形態から誘導された抗原結合部位またはその一部を含有しても良い。そのような形態の例示としては、たとえば、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ラクダ抗体（カメリド、ｃａｍｅｌｉｄｓ）、ダブ（Ｄａｂｓ）、四価抗体、イントラダイアボディ（ｉｎｔｒａｄｉａｂｏｄｙ）（たとえば、Jendreyko et al. 2003. J. Biol. Chem. 278:47813）、融合タンパク質（たとえば、抗体サイトカイン融合タンパク質、Ｆｃ受容体の少なくとも一部に融合したタンパク質）および二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が挙げられる。他の改変抗体は、たとえば、米国特許第４，７４５，０５５号、欧州特許第２５６，６５４号、Faulkner et al., Nature 298:286 (1982); 欧州特許第１２０，６９４号；欧州特許第１２５，０２３号; Morrison, J. Immun. 123:793 (1979); Kohler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980); Raso et al., Cancer Res. 41:2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2:239 (1984); Morrison, Science 229:1202 (1985); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984); 欧州特許第２５５，６９４号；欧州特許第２６６，６６３号；および、国際特許公開８８／０３５５９に記述されている。再集合イムノグロブリン鎖もまた公知である。たとえば、米国特許第４，４４４，８７８号、国際特許公開ＷＯ８８／０３５６５、および欧州特許第６８，７６３号、およびそれらに引用された参照文献を参照のこと。
他の実施態様において、本発明のキメラ凝固因子は、それらから誘導された二重特異性抗体または抗原結合部位である、抗原結合部位または領域を含有する。二重特異性抗体は、二量体であり、ｓｃＦｖ分子に類似したポリペプチドを各々が有する四価の分子であるが、同一ポリペプチド鎖上のＶＬおよびＶＨドメインが相互作用できないように、通常、短い（たとえば、１０未満であり、好ましくは１〜５）のアミノ酸残基リンカーが両方の可変ドメインを連結している。その代り、第一のポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨドメインは、第二のポリペプチド鎖上のＶＨおよびＶＬドメイン（それぞれ）と相互作用する（たとえば、国際特許公開ＷＯ０２／０２７８１を参照のこと）。１つの実施態様において、本発明のキメラ凝固因子は、遺伝子的に融合されたＦｃ領域（すなわち、ｓｃＦｃ領域）の少なくとも１つのＮ末端および／またはＣ末端に操作可能に連結されている二重特異性抗体を含有する。
ある実施態様において、本発明のキメラ凝固因子は、増強部分として、単一ドメイン結合分子（たとえば、単一ドメイン抗体）を含有する。例示的な単一ドメイン分子としては、抗体の単離重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（すなわち、軽鎖可変ドメインの無い重鎖可変ドメイン）、抗体のおよび単離軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（すなわち、重鎖可変ドメインの無い軽鎖可変ドメイン）が挙げられる。本発明の結合分子に用いられる例示的な単一ドメイン抗体は、たとえば、カメリド重鎖可変ドメイン（約１１８〜１３６アミノ酸残基）（Hamers-Casterman, et al., Nature 363:446-448 (1993)、および、Dumoulin, et al., Protein Science 11:500-515 (2002)に記載）が挙げられる。他の単一ドメイン抗体の例としては、単一ＶＨまたはＶＬドメイン（Ｄａｂｓ（登録商標）（Ｄｏｍａｎｔｉｓ Ｌｔｄ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）としてもまた知られる）が挙げられる。さらに他の単一ドメイン抗体としては、サメ抗体（たとえば、サメＩｇ−ＮＡＲｓ）が挙げられる。サメＩｇ−ＮＡＲｓは、１つの可変ドメインのホモ二量体（Ｖ−ＮＡＲ）および５つのＣ様定常ドメイン（Ｃ−ＮＡＲ）を含有し、ここで、多様性は５〜２３残基に長さが変化する伸長ＣＤＲ３領域に集中している。ラクダ科（たとえば、リャマ等）において、重鎖可変領域（ＶＨＨと呼称される）が、全体的な抗原結合ドメインを形成する。カメリドＶＨＨ可変領域と、不偏的な抗体（ＶＨ）由来のそれとの主な違いは、（ａ）ＶＨの軽鎖接触面において、ＶＨＨの対応する領域と比較し、よりアミノ酸が疎水性である、（ｂ）ＶＨＨにおいて、ＣＤＲ３がより長い、および、（ｃ）ＶＨＨにおける、ＣＤＲ１とＣＤＲ３の間のジスルフィド結合の発生頻度、が挙げられる。単一ドメイン結合分子の作製方法は、米国特許第６，００５，０７９号、および第６，７６５，０８７号に記述されている（それら両方が、参照により本明細書に援用される）。ＶＨＨドメインを含有する単一ドメイン抗体の例としては、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（Ａｂｌｙｎｘ ＮＶ，Ｇｈｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）が挙げられる。
Ｃ．異種部分（たとえば、Ｈｅｔ１、Ｈｅｔ２…、Ｈｅｔｎ）
本発明の一部の実施態様には、１以上の異種部分が含まれる（本明細書において、「Ｈｅｔ１」または「Ｈｅｔ２」と示される）。他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は２つの異種部分（「Ｈｅｔ１」および「Ｈｅｔ２」）を含んでも良い。さらに他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、３つ以上の異種部分（たとえば、３、４、５または６以上の異種部分）を含んでも良い。一部の実施態様において、全ての異種部分は同一である。一部の実施態様において、少なくとも１つの異種部分は他の異種部分と異なっている。一部の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、２、３または４以上の異種部分をタンデムに含有しても良い。他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、２、３以上の異種部分を含有しても良く、ここで、少なくとも１つの追加的な部分（たとえば、活性化可能な凝固因子、リンカー部分、プロテアーゼ開裂部位、自己犠牲的部分、増強部分、またはそれらの組み合わせ）は、２つの異種部分の間に挿入されている。
異種部分は、異種ポリペプチド部分、または異種非ポリペプチド部分、またはその両方を含有してもよい。１つの特定の実施態様において、Ｈｅｔ１は、第一の異種部分（たとえば、当分野に公知の半減期延長分子）である。一部の実施態様において、Ｈｅｔ２は、当分野公知の半減期延長分子であってもよい第二の異種部分である。一部の態様において、異種部分は異種ポリペプチドおよび非ポリペプチド部分の組み合わせを含有する。
ある実施態様において、第一の異種部分（たとえば、第一のＦｃ部分）および第二の異種部分（たとえば、第二のＦｃ部分）は互いに関連して二量体を形成する。１つの実施態様において、第二の異種部分は第二のＦｃ部分であり、ここで、第二のＦｃ部分は、第一の異種部分（たとえば、第一のＦｃ部分）に連結され、または関連付けられている。たとえば、第二の異種部分（たとえば、第二のＦｃ部分）は、リンカーにより、または、共有もしくは非共有結合によって第一の異種部分に関連づけられることにより、第一の異種部分（たとえば、第一のＦｃ部分）に連結されても良い。
一部の実施態様において、Ｈｅｔ１およびＨｅｔ２異種部分は、本発明のキメラタンパク質に組み込まれた際、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期の延長と関連付けられている非構造化特性、または構造化特性のいずれかを有する、ペプチドおよびポリペプチドである。非限定的な例としては、アルブミン、アルブミン断片、イムノグロブリンのＦｃ断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）のβサブユニット、ＨＡＰ配列、ＸＴＥＮ配列、トランスフェリンもしくはその断片、ＰＡＳポリペプチド、ポリグリシンリンカー、ポリセリンリンカー、アルブミン結合部分、またはこれらのポリペプチドの任意の断片、誘導体、変異体または組み合わせが挙げられる。他の関連する態様において、異種部分は、非ポリペプチド部分（たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、またはこれら構成要素の任意の誘導体、変異体もしくは組み合わせ）に対する付着部位（たとえば、システインアミノ酸）を含有しても良い。一部の態様において、非ポリペプチド部分（たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、またはこれらの構成要素の任意の誘導体、変異体、もしくは組み合わせ）に対する付着部位として機能するシステインアミノ酸からなる異種部分である。
一部の実施態様において、異種部分は、少なくとも約１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、または、４０００アミノ酸を含有する、または、少なくとも約１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、または、４０００アミノ酸から本質的になり、または、少なくとも約１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、または、４０００アミノ酸からなる、ポリペプチドである。他の実施態様において、異種部分は、約１００〜約２００アミノ酸、約２００〜約３００アミノ酸、約３００〜約４００アミノ酸、約４００〜約５００アミノ酸、約５００〜約６００アミノ酸、約６００〜約７００アミノ酸、約７００〜約８００アミノ酸、約８００〜約９００アミノ酸、または、約９００〜約１０００アミノ酸を含有する、または、約１００〜約２００アミノ酸、約２００〜約３００アミノ酸、約３００〜約４００アミノ酸、約４００〜約５００アミノ酸、約５００〜約６００アミノ酸、約６００〜約７００アミノ酸、約７００〜約８００アミノ酸、約８００〜約９００アミノ酸、または、約９００〜約１０００アミノ酸から本質的になる、または、約１００〜約２００アミノ酸、約２００〜約３００アミノ酸、約３００〜約４００アミノ酸、約４００〜約５００アミノ酸、約５００〜約６００アミノ酸、約６００〜約７００アミノ酸、約７００〜約８００アミノ酸、約８００〜約９００アミノ酸、または、約９００〜約１０００アミノ酸からなる、ポリペプチドである。
ある実施態様において、異種部分は、活性化可能な凝固因子および／もしくは増強部分の生物学的活性または機能に明らかな影響を与えることなく、キメラタンパク質の薬物動態学的特性の１つ以上を改善する（たとえば、凝固因子もしくその断片の凝固促進活性、または、増強部分の増強特性の活性）。
ある実施態様において、異種部分は、本発明の凝固因子のｉｎ ｖｉｖｏ、および／または、ｉｎ ｖｉｔｒｏ半減期を増加させる。他の実施態様において、異種部分は、本発明の凝固因子もしくはその断片（たとえば、活性化可能な凝固因子のタンパク質分解性の開裂後の異種部分を含有する断片）の可視化、または局在化を促進する。本発明のキメラタンパク質もしくはその断片の可視化および／または局在化は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたは、それらの組み合わせであっても良い。
他の実施態様において、異種部分は、本発明のキメラタンパク質またはその断片（たとえば、活性化可能な凝固因子のタンパク質分解性の開裂後の異種部分を含有する断片）の安定性を増加させる。本明細書において、「安定性」という用語は、環境状態（たとえば、温度の上昇または低下等）に応じて、活性化可能な凝固因子の１つ以上の物理的特性の維持に関する、当業者公知の測定単位を指す。ある態様において、物理的特性は、キメラタンパク質の共有結合性の構造の維持であっても良い（たとえば、タンパク質分解性開裂、望ましくない酸化、または脱アミドが無いこと）。他の態様において、物理的特性はまた、適切なフォールディング状態にある、キメラタンパク質の存在であっても良い（たとえば、可溶性もしくは不溶性の凝集物または沈殿物が無いこと）。１つの態様において、キメラタンパク質の安定性は、キメラタンパク質の生物物理学的特性（たとえば、温度安定性）、ｐＨ変性プロファイル、グリコシル化の安定した除去、可溶性、生化学的機能（たとえば、タンパク質、受容体またはリガンドへの結合機能）等、および／または、それらの組み合わせを分析することにより測定されてもよい。他の態様において、生化学的機能は、相互作用の結合アフィニティにより示される。１つの態様において、タンパク質安定性の測定単位は、温度安定性（すなわち、温度変化に対する抵抗性）である。安定性は、当分野公知の方法（たとえば、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィ）、ＤＬＳ（動的光散乱法）等）を用いて測定されてもよい。温度安定性の測定方法としては、限定されないが、示差走査熱量計（ＤＳＣ）、示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）、円偏光二色性（ＣＤ）および温度変化アッセイが挙げられる。
ある態様において、本発明のキメラタンパク質は少なくとも１つの半減期延長物質（すなわち、そのような部分を欠く、対応するキメラタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期と比較して、キメラタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させる異種部分）を含有する。キメラタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、当業者公知の任意の方法により測定されても良い（たとえば、活性分析（発色分析またはワンステージ凝固ａＰＴＴ分析）、ＥＬＩＳＡ等）。
一部の実施態様において、１以上の半減期延長物質があることにより、キメラタンパク質の半減期は、そのような１以上の半減期延長物質が無い対応するタンパク質の半減期と比較して、増加する。半減期延長物質を含有するキメラタンパク質の半減期は、そのような半減期延長物質の無い対応するキメラタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期よりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍以上長い。
１つの実施態様において、半減期延長物質を含有するキメラタンパク質の半減期は、そのような半減期延長物質の無い対応するタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期よりも、約１．５倍〜約２０倍、約１．５倍〜約１５倍、または約１．５倍〜約１０倍長い。他の実施態様において、半減期延長物質を含有するキメラタンパク質の半減期は、そのような半減期延長物質の無い対応するタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期と比較して、約２倍〜約１０倍、約２倍〜約９倍、約２倍〜約８倍、約２倍〜約７倍、約２倍〜約６倍、約２倍〜約５倍、約２倍〜約４倍、約２倍〜約３倍、約２．５倍〜約１０倍、約２．５倍〜約９倍、約２．５倍〜約８倍、約２．５倍〜約７倍、約２．５倍〜約６倍、約２．５倍〜約５倍、約２．５倍〜約４倍、約２．５倍〜約３倍、約３倍〜約１０倍、約３倍〜約９倍、約３倍〜約８倍、約３倍〜約７倍、約３倍〜約６倍、約３倍〜約５倍、約３倍〜約４倍、約４倍〜約６倍、約５〜約７倍、または約６倍〜約８倍、伸長されている。
他の実施態様において、半減期延長物質を含有するキメラタンパク質の半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。
さらに他の実施態様において、半減期延長物質を含有するキメラタンパク質の半減期は、約１５時間〜約２週間、約１６時間〜約１週間、約１７時間〜約１週間、約１８時間〜約１週間、約１９時間〜約１週間、約２０時間〜約１週間、約２１時間〜約１週間、約２２時間〜約１週間、約２３時間〜約１週間、約２４時間〜約１週間、約３６時間〜約１週間、約４８時間〜約１週間、約６０時間〜約１週間、約２４時間〜約６日間、約２４時間〜約５日間、約２４時間〜約４日間、約２４時間〜約３日間、または、約２４時間〜約２日間である。
一部の実施態様において、半減期延長物質を含有するキメラタンパク質の、対象ごとの平均半減期は、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間（１日）、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間（２日）、約５４時間、約６０時間、約７２時間（３日）、約８４時間、約９６時間（４日）、約１０８時間、約１２０時間（５日）、約６日、約７日（１週間）、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、または約１４日である。
１．イムノグロブリン定常領域またはその一部
他の態様において、異種部分は、１以上のイムノグロブリン定常領域またはその一部（たとえば、Ｆｃ部分）を含有する。１つの実施態様において、キメラタンパク質は活性化可能な凝固因子、増強部分、および、少なくとも２つの異種部分を含有し、第一の異種部分は、活性化可能な凝固因子に連結されている第一のイムノグロブリン定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ部分）を含有し、第二の異種部分は、増強部分に連結されている第二のイムノグロブリン定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ部分）を含有する。第一のイムノグロブリン定常領域またはその一部、および、第二のイムノグロブリン定常領域またはその一部は、共有結合（たとえばジスルフィド結合）を形成することができ、それにより、活性化可能な凝固因子と増強部分を近接して配置させ、損傷部位で活性化可能な凝固因子と増強部分の間の相互作用を可能にする。
イムノグロブリン定常領域は、ＣＨ（定常重）ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２等）と表記されるドメインから構成される。アイソタイプによって（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ）、定常領域は、３つまたは４つのＣＨドメインから構成されても良い。一部のアイソタイプ（たとえば、ＩｇＧ）の定常領域は、ヒンジ領域も含有する。Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Yを参照のこと。
本発明のキメラタンパク質を製造するためのイムノグロブリン定常領域またはその一部は、多くの異なる源から入手しても良い。１つの実施態様において、イムノグロブリン定常領域またはその一部は、ヒトイムノグロブリンに由来する。しかしながら、イムノグロブリン定常領域またはその一部は、他の哺乳類種（たとえば、げっ歯類（たとえばマウス、ラット、ウサギ、モルモット）、他の非ヒト霊長類（たとえば、チンパンジー、マカカサル）を含む）のイムノグロブリン由来であっても良いことを理解されたい。さらに、イムノグロブリン定常領域またはその一部は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥならびに任意のイムノグロブリンアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）を含む、任意のイムノグロブリンクラス由来であってもよい。１つの実施態様において、ヒトのアイソタイプＩｇＧ１が用いられる。
様々なイムノグロブリン定常領域遺伝子配列（たとえば、ヒト定常領域遺伝子配列）が、第三者入手可能な預託形態で、入手可能である。定常領域ドメイン配列は、特定のエフェクター機能（または特定のエフェクター機能の欠損）を有すること、または、免疫原性を減じるための特定の改変とともに選択されてもよい。抗体および抗体をコードする遺伝子の配列の多くが公開されており、適切なＩｇ定常領域配列（たとえば、ヒンジ、ＣＨ２および／もしくはＣＨ３配列、またはその一部）を、当分野に認識されている技術を用いて、これらの配列から誘導することができる。次いで、任意の前述の方法を用いて得られた遺伝的材料を改変または合成して、本発明のポリペプチドを得ても良い。本発明の範囲には、定常領域ＤＮＡ配列の対立遺伝子、変異体および突然変異が包含されることをさらに認識されたい。
イムノグロブリン定常領域またはその一部の配列を、たとえば、対象のドメインを増幅させるために選択されたポリメラーゼ鎖反応およびプライマーを用いてクローニングしても良い。抗体由来のイムノグロブリン定常領域またはその一部の配列をクローニングするために、ｍＲＮＡをハイブリドーマ、膵臓、またはリンパ球から単離して、ＤＮＡへ逆転写し、ＰＣＲによって抗体遺伝子を増幅しても良い。ＰＣＲ増幅法は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号、第４，９６５，１８８号、およびたとえば、“PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications” Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270に詳細に記述されている。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーにより、または、公開された重鎖ＤＮＡ配列および軽鎖ＤＮＡ配列ならびにアミノ酸配列に基づいたより特異的なプライマーにより、開始されてもよい。上述のように、ＰＣＲを用いて抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離しても良い。この場合において、ライブラリは、コンセンサスプライマーまたはより大きな相同プローブ（たとえばマウス定常領域プローブ）によりスクリーニングされてもよい。抗体遺伝子の増幅に適切な多くのプライマーセットが当分野に公知である（たとえば、精製された抗体のＮ末端配列に基づいた５´プライマー（Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509）；ｃＤＮＡ末端の急速増幅（Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33)）；抗体リーダー配列（Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250）等）。抗体配列のクローニングは、Ｎｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号（１９９５年１月２５日出願、参照により本明細書に援用される）に詳述されている。
本明細書に用いられているイムノグロブリン定常領域は、すべてのドメインおよびヒンジ領域またはその一部を含むことができる。１つの実施態様において、イムノグロブリン定常領域またはその一部は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域（すなわち、ＦｃドメインまたはＦｃＲｎ結合パートナー）を含有する。
イムノグロブリン定常領域またはその一部は、ＦｃＲｎ結合パートナーであっても良い。ＦｃＲｎは、成人末梢組織で活性であり、消化管腔内、肺気道内、鼻腔表面、膣表面、結腸および直腸表面で発現される（米国特許第６，４８５，７２６号）。ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎに結合するイムノグロブリンの一部である。
ＦｃＲｎ受容体は、ヒトを含む数種の哺乳類種から単離されている。ヒトＦｃＲｎ、サルＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、およびマウスＦｃＲｎの配列が公知である（Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180:2377）。ＦｃＲｎ受容体は、比較的低いｐＨでＩｇＧに結合し（しかし、たとえばＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ等の他のイムノグロブリンクラスには結合しない）、内腔で経細胞的に漿膜方向へＩｇＧを能動輸送し、次いで、間質液中で見られる比較的高いｐＨでＩｇＧを放出する。肺および腸上皮（Israel et al. 1997, Immunology 92:69）、近位尿細管上皮細胞（Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358）ならびに鼻腔上皮、膣表面および胆道系表面を含む、成人の上皮組織において、ＦｃＲｎは発現される（米国特許第６，４８５，７２６号、第６，０３０，６１３号、第６，０８６，８７５号、国際特許公開ＷＯ０３／０７７８３４号、ＵＳ２００３−０２３５５３６Ａ１）。
本発明に有用なＦｃＲｎ結合パートナーには、全ＩｇＧ、ＩｇＧのＦｃ断片、およびＦｃＲｎ受容体の完全な結合領域を含む他の断片を含む、ＦｃＲｎ受容体により特異的に結合されることができる分子が包含される。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分領域は、Ｘ線結晶解析に基づき、記述されている（Burmeister et al. 1994, Nature 372:379）。ＦｃＲｎを有するＦｃの主な接触面は、ＣＨ２とＣＨ３ドメインの接合部分付近である。Ｆｃ−ＦｃＲｎの接触はすべて、単一Ｉｇ重鎖の内である。ＦｃＲｎ結合パートナーには、全ＩｇＧ、ＩｇＧのＦｃ断片、およびＦｃＲｎの完全な結合領域を含む他のＩｇＧ断片が含まれる。主な接触部位としては、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０−２５７、２７２、２８５、２８８、２９０−２９１、３０８−３１１、および３１４、ならびに、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５−３８７、４２８、および４３３−４３６が挙げられる。イムノグロブリンもしくはイムノグロブリン断片、または領域のアミノ酸ナンバリングに対する基準はすべて、Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Mdに基づいている。
ＦｃＲｎに結合されるＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎにより効果的に上皮バリアを横切ることができるため、それによって、所望される治療用分子の全身投与のための非侵襲的な手段を得ることができる。さらに、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含有する融合タンパク質は、ＦｃＲｎを発現する細胞によってエンドサイトーシスされる。しかし、分解の標的とされる代わりに、これらのタンパク質は循環系へ再度リサイクルされ、結果、これらタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期は延長される。ある実施態様において、イムノグロブリン定常領域の一部は、他のＦｃ領域または他のＦｃＲｎ結合パートナーと、通常はジスルフィド結合および他の非特異的相互作用を介して関連し、二量体および上位の多量体を形成するＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーである。
２つのＦｃＲｎ受容体は単一のＦｃ分子に結合することができる。結晶解析データから、各ＦｃＲｎ分子は、Ｆｃホモ二量体の１つの単一ポリペプチドに結合することが示されている。１つの実施態様において、ＦｃＲｎ結合パートナー（たとえば、ＩｇＧのＦｃ断片）の生物学的に活性な分子への連結によって、経口、口腔内、舌下、直腸内、経腟、経鼻もしくは肺経路を介してエアロゾル投与、または眼経路を介して、生物学的に活性な分子をデリバリーする手段を得ることができる。他の実施態様において、キメラタンパク質は、非侵襲的に（たとえば、皮下、静脈内）投与することができる。
ＦｃＲｎ結合パートナー領域は、ＦｃＲｎ受容体により特異的に結合されることができる分子またはその一部であり、結合の結果、Ｆｃ領域のＦｃＲｎ受容体により能動的に輸送される。特異的結合とは、生理学的条件下で比較的安定である複合体を形成する２つの分子を指す。特異的結合は、高度なアフィニティと低〜中程度のキャパシティにより特徴付けられ、多くの場合、低いアフィニティと中〜高度なキャパシティを有する非特異的結合とは明確に区別される。一般的に、アフィニティ定数ＫＡが１０６Ｍ−１よりも高い、または１０８Ｍ−１よりも高い場合には、結合は特異的であるとみなされる。必要に応じて、結合条件を変化させることにより、特異的結合に実質的な影響を与えることなく、非特異的結合を減少させることができる。たとえば分子の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合させる時間、ブロッキング剤（たとえば血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度等の適切な結合条件は、通常の技術を用いて当業者により最適化することができる。
ある実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）のＦｃ領域への結合特性を付与するのに十分である、１以上の断片化Ｆｃ領域を含有する。たとえば、ＦｃＲｎへ結合するＦｃ領域の一部（すなわち、ＦｃＲｎ結合部分）は、ＩｇＧ１のアミノ酸約２８２〜４３８（ＥＵナンバリング）（第一接触部位はＣＨ２ドメインのアミノ酸２４８、２５０−２５７、２７２、２８５、２８８、２９０−２９１、３０８−３１１および３１４、ならびにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５−３８７、４２８および４３３−４３６）を含有する。ゆえに、本発明のＦｃ領域は、ＦｃＲｎ結合部分を含有、またはＦｃＲｎ結合部分からなってもよい。ＦｃＲｎ結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプの重鎖由来であってもよい。１つの実施態様において、ヒトアイソタイプＩｇＧ１の抗体由来のＦｃＲｎ結合部分が用いられる。他の実施態様において、ヒトアイソタイプＩｇＧ４の抗体由来のＦｃＲｎ結合部分が用いられる。
本明細書においてＦ、Ｆ１またはＦ２と表記されるＦｃ部分は、多くの異なる源から入手されてもよい。１つの実施態様において、ポリペプチドのＦｃ部分は、ヒトイムノグロブリン由来である。しかしながら、Ｆｃ部分は、他の哺乳類種（たとえば、げっ歯類（たとえばマウス、ラット、ウサギ、モルモット）、他の非ヒト霊長類（たとえば、チンパンジー、マカカサル）を含む）のイムノグロブリン由来であっても良いことを理解されたい。さらに、Ｆｃドメインまたはその一部のポリペプチドは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥならびに任意のイムノグロブリンアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）を含む、任意のイムノグロブリンクラス由来であってもよい。他の実施態様において、ヒトのアイソタイプＩｇＧ１が用いられる。
ある実施態様において、Ｆｃ変異体は、前記野生型Ｆｃドメインを含有するＦｃ部分によりもたらされたエフェクター機能の少なくとも１つにおける変化（たとえば、Ｆｃ受容体（たとえば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩ）もしくは補体タンパク質（たとえば、Ｃ１ｑ）に結合するＦｃ領域の能力、または、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）、ファゴサイトーシスもしくは補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣＣ）を開始させるＦｃ領域の能力を改善、または減じさせること）をもたらす。他の実施態様において、Ｆｃ変異体は、遺伝子操作されたシステイン残基をもたらす。
本発明のＦｃ部分は、エフェクター機能および／またはＦｃＲもしくはＦｃＲｎ結合における変化（たとえば、増強または減少）を与えることが知られている、当分野公知のＦｃ変異体を用いても良い。具体的には、本発明の結合分子として、たとえば、国際特許出願公開ＷＯ８８／０７０８９Ａ１、ＷＯ９６／１４３３９Ａ１、ＷＯ９８／０５７８７Ａ１、ＷＯ９８／２３２８９Ａ１、ＷＯ９９／５１６４２Ａ１、ＷＯ９９／５８５７２Ａ１、ＷＯ００／０９５６０Ａ２、ＷＯ００／３２７６７Ａ１、ＷＯ００／４２０７２Ａ２、ＷＯ０２／４４２１５Ａ２、ＷＯ０２／０６０９１９Ａ２、ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２、ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２、ＷＯ０４／０２９２０７Ａ２、ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２、ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２、ＷＯ０４／０７４４５５Ａ２、ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２、ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２、ＷＯ０４／０４４８５９、ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１、ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２、ＷＯ０５／０９２９２５Ａ２、ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２、ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１、ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２およびＷＯ０６／０８５９６７Ａ２；米国特許出願公開ＵＳ２００７／０２３１３２９、ＵＳ２００７／０２３１３２９、ＵＳ２００７／０２３７７６５、ＵＳ２００７／０２３７７６６、ＵＳ２００７／０２３７７６７、ＵＳ２００７／０２４３１８８、ＵＳ２００７０２４８６０３、ＵＳ２００７０２８６８５９、ＵＳ２００８００５７０５６ ；または、米国特許第５，６４８，２６０号；第５，７３９，２７７号；第５，８３４，２５０号；第５，８６９，０４６号；第６，０９６，８７１号；第６，１２１，０２２号；第６，１９４，５５１号；第６，２４２，１９５号；第６，２７７，３７５号；第６，５２８，６２４号；第６，５３８，１２４号；第６，７３７，０５６号；第６，８２１，５０５号；第６，９９８，２５３号；第７，０８３，７８４号；第７，４０４，９５６号および第７，３１７，０９１号（各々、参照により本明細書に援用される）に開示されているアミノ酸の位置の１以上での変化（たとえば、置換）が挙げられる。１つの実施態様において、特定の変化（たとえば、当分野公知の１以上のアミノ酸特定の置換）が、開示されたアミノ酸の位置の１つ以上で為されても良い。他の実施態様において、開示されたアミノ酸の位置の１つ以上で異なる変化（たとえば、当分野公知の１以上のアミノ酸の位置の異なる置換）が為されても良い。
たとえば特定部位の突然変異誘導等の良く知られた方法に従い、ＩｇＧのＦｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナーを改変し、改変ＩｇＧまたはＦｃ断片またはＦｃＲｎにより結合される部分を作製してもよい。そのような改変としては、ＦｃＲｎ接触部位から離れた改変、ならびに、ＦｃＲｎへの結合を保存またはさらに増強させる接触部位内の改変が挙げられる。たとえば、以下のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｆｃγ１）における１アミノ酸残基は、ＦｃＲｎに対するＦｃ結合アフィニティを著しく損ねることなく、置換することができる：Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｋ２４８Ａ、Ｄ２４９Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｔ２５６Ａ、Ｅ２５８Ａ、Ｔ２６０Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２６９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｅ２７２Ａ、Ｌ２７４Ａ、Ｎ２７６Ａ、Ｙ２７８Ａ、 Ｄ２８０Ａ、Ｖ２８２Ａ、Ｅ２８３Ａ、Ｈ２８５Ａ、Ｎ２８６Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ａ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｙ２９６Ｆ、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｒ３０１Ａ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０５Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｄ３１２Ａ、Ｎ３１５Ａ、Ｋ３１７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｑ、Ｐ３３１Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｔ３３５Ａ、Ｓ３３７Ａ、Ｋ３３８Ａ、Ｋ３４０Ａ、Ｑ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ａ、Ｑ３４７Ａ、Ｒ３５５Ａ、Ｅ３５６Ａ、Ｍ３５８Ａ、Ｔ３５９Ａ、Ｋ３６０Ａ、Ｎ３６１Ａ、Ｑ３６２Ａ、Ｙ３７３Ａ、Ｓ３７５Ａ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｑ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｓ３８３Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｑ３８６Ａ、Ｅ３８８Ａ、Ｎ３８９Ａ、Ｎ３９０Ａ、Ｙ３９１Ｆ、Ｋ３９２Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｓ４００Ａ、Ｄ４０１Ａ、Ｄ４１３Ａ、Ｋ４１４Ａ、Ｒ４１６Ａ、Ｑ４１８Ａ、Ｑ４１９Ａ、Ｎ４２１Ａ、Ｖ４２２Ａ、Ｓ４２４Ａ、Ｅ４３０Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、Ｑ４３８Ａ、Ｋ４３９Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４４ＡおよびＫ４４７Ａ。ここで、たとえばＰ２３８Ａとは、２３８位で野生型のプロリンがアラニンに置換されることを表す。例として、特定の実施態様は、Ｎ２９７Ａ変異を組込み、高度に保存されたＮグリコシル化部位を除去する。アラニンに加え、他のアミノ酸が、上記の特定の位置で、野生型アミノ酸と置換されてもよい。変異を個々にＦｃへと導入させ、天然型Ｆｃとは異なる１００を超えるＦｃ領域を生じさせても良い。さらに、２、３またはそれ以上のこれらの個々の変異の組み合わせを共に導入し、数百以上のＦｃ部分を生じさせても良い。さらに、本発明の構築物のＦｃ部分のうちの１つを変異させ、他の構築物のＦｃ部分を全く変異させなくてもよく、またはそれら両方ともを異なる変異で変異させても良い。
上述の変異により、Ｆｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナーに、新たな機能性がもたらされるであろう。たとえば、１つの実施態様において、Ｎ２９７Ａを組込み、高度に保存されたＮグリコシル化部位を除去する。この変異の効果は、免疫原性の減少であり、それによってＦｃ領域の循環半減期が延長され、ＦｃＲｎに対するアフィニティを損ねることなく、Ｆｃ領域がＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＩＡに結合できないようにさせる（Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591）。上述の変異から生じる新たな機能性のさらなる例として、一部の例において、ＦｃＲｎに対するアフィニティが野生型のそれを超えて増加することがある。この増加したアフィニティは、「オン」比率の増加、「オフ」比率の減少、または「オン」比率の増加と「オフ」比率の減少の両方を反映したものである可能性がある。ＦｃＲｎに対するアフィニティの増加をもたらすと考えられている変異の例としては、限定されないが、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、および、Ｎ４３４Ａが挙げられる（Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591）。
さらに、少なくとも３つのヒトＦｃγ受容体が、低ヒンジ領域（通常、アミノ酸２３４〜２３７）内で、ＩｇＧの結合部位を認識すると思われている。それゆえ、新たな機能性および免疫原性減少の可能性の他の例は、この領域の変異から生じる可能性があり、たとえばヒトＩｇＧ１のアミノ酸２３３〜２３６「ＥＬＬＧ」を、ＩｇＧ２由来の対応配列「ＰＶＡ」へと置換する（１アミノ酸欠失）ことが例として挙げられる。そのような変異が導入されると、様々なエフェクター機能を調節するＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩが、ＩｇＧ１に結合しなくなることが示されている。Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 and Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613。
１つの実施態様において、イムノグロブリン定常領域またはその一部（たとえば、Ｆｃ部分）は、配列ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号２７）、および、任意選択的に、ＨＱＳＬＧＴＱ（配列番号２８）、ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号２９）、ＨＱＮＩＳＤＧＫ（配列番号３０）、または、ＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号３１）（米国特許第５，７３９，２７７号）から選択される配列をさらに含むポリペプチドである。
他の実施態様において、イムノグロブリン定常領域またはその一部は、他のイムノグロブリン定常領域またはその一部と１以上のジスルフィド結合を形成するヒンジ領域またはその一部中のアミノ酸配列を含有する。イムノグロブリン定常領域またはその一部によるジスルフィド結合は、凝固因子の活性化で、増強部分が凝固因子の活性を増強するために利用可能となるように、活性化可能な凝固因子を含有する第一のポリペプチドと増強部分を含有する第二のポリペプチドの共に置かれる。ヒンジ領域またはその一部は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、その断片またはそれらの任意の組み合わせの１以上のドメインにさらに連結されていてもよい。
ある実施態様において、イムノグロブリン定常領域またはその一部は、半グリコシル化されている。たとえば、２つのＦｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナーを含有するキメラタンパク質は、第一のグリコシル化されたＦｃ部分（たとえば、グリコシル化ＣＨ２領域）またはＦｃＲｎ結合パートナー、ならびに、第二の非グリコシル化Ｆｃ部分（たとえば非グリコシル化ＣＨ２領域）またはＦｃＲｎ結合パートナーを含有しても良い。１つの実施態様において、リンカーは、グリコシル化Ｆｃ部分と非グリコシル化Ｆｃ部分の間に挿入されても良い。他の実施態様において、Ｆｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナーは完全にグリコシル化されている（すなわち、Ｆｃ部分のすべてがグリコシル化されている）。他の実施態様において、Ｆｃ部分は非グリコシル化されていても良い（すなわち、Ｆｃ部分はいずれもグリコシル化されていない）。
ある実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、イムノグロブリン定常領域またはその一部（たとえば、Ｆｃ変異体）へのアミノ酸置換を含有し、それにより、Ｉｇ定常領域の抗原非依存性エフェクター機能、特に当該タンパク質の循環系半減期が変化する。
そのようなタンパク質は、これらの置換の無いタンパク質と比較して、ＦｃＲｎへの結合の増加または減少を示し、ゆえに、それぞれ、血清中の半減期が増加または減少する。ＦｃＲｎに対するアフィニティが改善されたＦｃ変異体は、より長い血清半減期を有することが予期され、そのような分子は、投与されるポリペプチドに長い半減期が期待される哺乳類の治療法（たとえば、慢性疾患または障害の治療）において有用なアプリケーションとなる（たとえば、米国特許第７，３４８，００４号、第７，４０４，９５６号、および第７，８６２，８２０号を参照のこと）。対照的に、ＦｃＲｎ結合アフィニティが減少したＦｃ変異体は、短い半減期を有することが予期され、そのような分子は、たとえば、短い循環時間が有利であるような哺乳類への投与（たとえば、ｉｎ ｖｉｖｏ診断イメージング）、または長い期間、循環系に存在すると毒性副作用がある開始ポリペプチドの場合に、有用となる。ＦｃＲｎ結合アフィニティが減少したＦｃ変異体はまた、胎盤を通過する可能性が少なく、ゆえに、妊娠中の女性における疾患または障害の治療に有用である。さらに、ＦｃＲｎ結合アフィニティが減少することが望ましい他のアプリケーションとしては、脳、腎臓および／または肝臓への局在が望まれる場合のアプリケーションが挙げられる。１つの例示的な実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、血管系から腎糸球体へとわたる輸送の減少を示す。他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、脳からの血液脳関門（ＢＢＢ）から血管裂孔へとわたる輸送の減少を示す。１つの実施態様において、改変されたＦｃＲｎ結合を有するタンパク質は、少なくとも１つのＦｃ部分、または、１以上のアミノ酸置換をＩｇ定常領域の「ＦｃＲｎ結合ループ」内に有するＦｃＲｎ結合パートナー（たとえば、１もしくは２のＦｃ領域または、ＦｃＲｎ結合パートナー）を含有する。ＦｃＲｎ結合ループは、野生型の全長Ｆｃ領域のアミノ酸残基２８０〜２９９から構成される（ＥＵナンバリングに従う）。他の実施態様において、改変されたＦｃＲｎ結合アフィニティを有する本発明のキメラタンパク質中のＩｇ定常領域またはその一部は、１５Å ＦｃＲｎの「接触域」内に１以上のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含有する。本明細書において、１５Å ＦｃＲｎの「接触域」という用語には、野生型の全長Ｆｃ部分の以下の位置の残基を含む：２４３−２６１、２７５−２８０、２８２−２９３、３０２−３１９、３３６−３４８、３６７、３６９、３７２−３８９、３９１、３９３、４０８、４２４、４２５−４４０（ＥＵナンバリング）。他の実施態様において、改変されたＦｃＲｎ結合アフィニティを有する本発明のＩｇ定常領域またはその一部は、以下のＥＵ位置の内の任意の１つに対応するアミノ酸の位置で、１以上のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナーを含有する：２５６、２７７−２８１、２８３−２８８、３０３−３０９、３１３、３３８、３４２、３７６、３８１、３８４、３８５、３８７、４３４（たとえば、Ｎ４３４ＡまたはＮ４３４Ｋ）、および４３８。ＦｃＲｎ結合活性を変えた例示的なアミノ酸置換は、国際特許出願公開ＷＯ０５／０４７３２７（参照により本明細書に援用される）に開示されている。
本発明に用いられるＦｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナーはまた、キメラタンパク質のグリコシル化を変える当分野公知のアミノ酸置換を含有してもよい。たとえば、活性化可能な凝固因子または増強部分に連結されたキメラタンパク質のＦｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナーは、グリコシル化（たとえば、Ｎ結合型グリコシル化またはＯ結合型グリコシル化）の減少をもたらす変異を有するＦｃ部分を有しても良く、または、野生型Ｆｃ部分の改変糖型を含有しても良い（たとえば、低フコースまたはフコース無しのグリカン）。
１つの実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に記述されるＩｇ定常領域またはその一部から独立して選択される構成Ｉｇ定常領域またはその一部の２以上を有する遺伝的に融合されたＦｃ領域（すなわち、ｓｃＦｃ領域）を含有してもよい。１つの実施態様において、二量体Ｆｃ領域のＦｃドメインは同一である。他の実施態様において、Ｆｃドメインのうちの少なくとも２つは異なっている。たとえば、本発明のタンパク質のＦｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナーは同じ数のアミノ酸残基を含有し、または、それらは１以上のアミノ酸残基（たとえば、約５アミノ酸残基まで（たとえば、１、２、３、４または５アミノ酸残基）））、約１０残基、約１５残基、約２０残基、薬３０残基、約４０残基、または約５０残基）で長さが異なっていても良い。さらに他の実施態様において、本発明のタンパク質のＦｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナーは、１以上のアミノ酸の位置で、配列が異なっていても良い。たとえば、Ｆｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナーのうちの少なくとも２つは、約５アミノ酸の位置で異なっていても良い（たとえば、１、２、３、４または５アミノ酸の位置、約１０の位置、約１５の位置、約２０の位置、約３０の位置、約４０の位置、または約５０の位置）。
２．ｓｃＦｃ領域
１つの実施態様において、本発明は、活性化可能な凝固因子、増強部分、および、単一ポリペプチド鎖内に少なくとも１つの遺伝的に融合されたＦｃ領域またはその一部（すなわち、単鎖Ｆｃ（ｓｃＦｃ）領域を含有するポリペプチド）を含有するプロセッシングされていないキメラポリペプチドを提示する。プロセッシングされていないポリペプチドは、フォールディンを受けて１つの機能性ｓｃＦｃ領域（Ｆｃペプチドリンカーにより連結されている）を形成することができる、同一線形ポリペプチド内に、少なくとも２つのイムノグロブリン定常領域またはその一部（たとえば、Ｆｃ部分またはドメイン（たとえば、２、３、４、５、６またはそれ以上のＦｃ部分またはドメイン））を含有する。たとえば、１つの実施態様において、本発明のポリペプチドは、半減期を改善するために、または、免疫エフェクター機能（たとえば、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、ファゴサイトーシス、または補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣＣ）等）を開始させるために、および／または、製造可能性を改善するために、そのｓｃＦｃ領域を介して、少なくとも１つのＦｃ受容体（たとえば、ＦｃＲｎ、ＦｃγＲ受容体（たとえば、ＦｃγＲＩＩＩ）または補体タンパク質（たとえば、Ｃ１ｑ））に結合することができる。
様々な別のデザインのポリペプチドが本発明の範囲内にある。たとえば、１つの実施態様において、ポリペプチドは以下の部分を含有する：
Ａ−Ｆ１−Ｐ１−Ｌ−Ｐ２−Ｂ−Ｆ２ (__)
アミノ末端からカルボキシ末端への直線配列であり、ここで、もし存在する場合、Ａは、活性化可能な凝固因子またはその一部であり、Ｆ１は第一のイムノグロブリン定常領域またはその一部であり、Ｐ１は第一の細胞内プロセッシング部位であり、ＬはｓｃＦｃリンカーであり、Ｐ２は第二の細胞内プロセッシング部位であり、Ｂは増強部分であり、Ｆ２は第二のイムノグロブリン定常領域またはその一部であり、および、「−」はペプチド結合を表す。化学式(__)は、少なくともＰ１またはＰ２、および任意選択的に両方を含有している。Ｐ１およびＰ２は、もし両方とも存在する場合、同一または異なっていても良い。化学式(__)は、少なくともＦ１、Ｆ２または両方を含有する。Ｆ１およびＦ２は、もし両方とも存在する場合、同一または異なっていても良い。
３．ＣＴＰ
ある態様において、本発明のキメラタンパク質は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）のβサブユニットまたはその断片、変異体もしくは誘導体を含有する異種部部を少なくとも１つ含有する。組換えタンパク質に挿入された１以上のＣＴＰペプチドは、そのタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させることが知られている。例えば、米国特許第５，７１２，１２２号（参照により本明細書にその全体が援用される）を参照のこと。
例示的なＣＴＰペプチドとしては、ＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬ（配列番号３２）またはＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号３３）が挙げられる。たとえば、米国特許出願公開ＵＳ２００９／００８７４１１ Ａ１（参照により援用される）を参照のこと。
ＸＴＥＮ配列
一部の実施態様において、キメラタンパク質の異種部分は、１以上のＸＴＥＮ配列、その断片、変異体もしくは誘導体を含有する。本明細書において「ＸＴＥＮ」配列とは、生理学的条件下では二次構造または三次構造が低度または無い配列である、小さな親水性アミノ酸から主に構成される、天然型ではない、実質的に非反復配列である、長さが伸長されたポリペプチドを指す。異種部分としては、ＸＴＥＮは半減期延長部分として機能することができる。さらに、ＸＴＥＮは、限定されないが、薬物動態パラメータおよび溶解特性の増強を含む、所望の特性をもたらしうる。
ＸＴＥＮ配列を含む異種部分を本発明のキメラタンパク質に組み込むことにより、当該キメラタンパク質に、以下の有益な特性の１つ以上をもたらすことができる：構造的柔軟性、水溶性の増強、高度なプロテアーゼ耐性、低い免疫原性、哺乳類受容体に対する低い結合、または流体力学的（またはストークス（Ｓｔｏｋｅｓ））半径の増加。
ある態様において、ＸＴＥＮ配列は、本発明のキメラタンパク質が、同一であるがＸＴＥＮ異種部分を伴わないキメラタンパク質と比較して、出血を長い間にわたる効果的な制御を示すように、たとえばｉｎ ｖｉｖｏ半減期の延長または総露出（曲線下面積（ＡＵＣ））の増加等の薬物動態特性を改善することができる。
本発明のキメラタンパク質の異種部分として用いることができるＸＴＥＮ配列の例は、たとえば、米国特許第７，８５５，２７９号および第７，８４６，４４５号、米国特許出願公開２００９／００９２５８２ Ａ１、２０１０／０２３９５５４ Ａ１、２０１０／０３２３９５６ Ａ１、２０１１／００４６０６０ Ａ１、２０１１／００４６０６１ Ａ１、２０１１／００７７１９９ Ａ１、２０１３／００１７９９７ Ａ１、もしくは、２０１２／０２６３７０１ Ａ１、もしくは、２０１１／０１７２１４６ Ａ１、または、国際特許出願公開ＷＯ ２０１００９１１２２ Ａ１、ＷＯ ２０１０１４４５０２ Ａ２、ＷＯ ２０１０１４４５０８ Ａ１、ＷＯ ２０１１０２８２２８ Ａ１、ＷＯ ２０１１０２８２２９ Ａ１、または、ＷＯ ２０１１０２８３４４ Ａ２、または、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／４８５１７（２０１１年８月１９日出願）（各々は参照により本明細書にその全体が援用される）に開示されている。
５．アルブミンまたはその断片、誘導体もしくは変異体
ある実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、アルブミンまたはその機能性断片を含有する異種部分を含有する。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡまたはＨＡ）は、その全長形態で６０９アミノ酸のタンパク質であり、血清の浸透圧の、主な原因物質であり、内因性リガンドおよび外因性リガンドの担体としても機能する。本明細書において「アルブミン」という用語には、全長アルブミンまたはその機能性断片、変異体、誘導体もしくはアナログが含まれる。アルブミンまたはその断片もしくは変異体の例は、米国特許出願公開２００８／０１９４４８１Ａ１、２００８／０００４２０６ Ａ１、２００８／０１６１２４３ Ａ１、２００８／０２６１８７７ Ａ１、もしくは、２００８／０１５３７５１ Ａ１、または、ＰＣＴ国際特許出願２００８／０３３４１３ Ａ２、２００９／０５８３２２ Ａ１、または、２００７／０２１４９４ Ａ２（それらは、参照によりその全体で本明細書に援用される）に開示されている。
１つの実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、アルブミン、またはその断片もしくは変異体を含有し、それらは、イムノグロブリン定常領域もしくはその一部（たとえば、Ｆｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ、ＰＥＧ、またはそれらの任意の組み合わせから選択される異種部分にさらに連結されている。
６．アルブミン結合部分
ある実施態様において、異種部分は、アルブミン結合ペプチド、細菌アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合抗体断片、またはそれらの任意の組み合わせを含有する、アルブミン結合部分である。
たとえば、アルブミン結合タンパク質は、細菌アルブミン結合タンパク質、ドメイン抗体を含有する抗体または抗体断片（たとえば、米国特許第６，６９６，２４５号を参照のこと）であっても良い。アルブミン結合タンパク質は、たとえば、連鎖球菌プロテインＧのうちの１つなどの細菌アルブミン結合タンパク質であっても良い（Konig, T. and Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83）。結合パートナーとして用いることができる他のアルブミン結合ペプチドの例は、たとえば、Ｃｙｓ−Ｘａａ１ −Ｘａａ２ −Ｘａａ３ −Ｘａａ４ −Ｃｙｓコンセンサス配列を有するものであり、ここで、Ｘａａ１ は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｒｐであり；Ｘａａ２ は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり；Ｘａａ３は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒであり；および、Ｘａａ４は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒ（配列番号３４）である（米国特許出願２００３／００６９３９５、またはＤｅｎｎｉｓら(Dennis et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 35035-35043)に記載）。
Kraulis et al., FEBS Lett. 378:190-194 (1996)および、Linhult et al., Protein Sci. 11:206-213 (2002)に開示される連鎖球菌タンパク質Ｇ由来のドメイン３は、細菌アルブミン結合ドメインの例である。アルブミン結合ドメインの例としては、コア配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号３５）（Dennis et al., J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002)を参照のこと）を有する一連のペプチドが挙げられる。アルブミン結合抗体断片の例は、Muller and Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 9:319-326 (2007); Rooverset al., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007)および、 Holt et al., Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008)（それらは参照により本明細書にその全体で援用される）に開示されている。そのようなアルブミン結合部分の例は、２−（３−マレイミドプロパンアミド）−６−（４−（４−ヨードフェニル）ブタンアミド）ヘキサノエート（「Ａｌｂｕ」タグ）（Trusselet al., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009)に開示されている）である。
脂肪酸、特に、長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）および長鎖脂肪酸様アルブミン結合化合物を用いて本発明のキメラタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長することができる。ＬＣＦＡ様アルブミン結合化合物の例は、１６−（ｌ−（３−（９−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）カルボニルオキシ）−メチル）−７−スルホ−９Ｈ−フルオレン−２−イルアミノ）−３−オキソプロピル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イルチオ）ヘキサデカン酸（たとえば、ＷＯ２０１０／１４０１４８を参照のこと）である。
７．ＰＡＳ配列
他の実施態様において、少なくとも１つの異種部分はＰＡＳ配列である。本明細書において、ＰＡＳ配列は、主にアラニンおよびセリン残基を含有するアミノ酸配列、または、主にアラニン、セリン、およびプロリン残基を含有するアミノ酸配列であり、当該アミノ酸配列が生理学的条件下でランダムコイル構造を形成するものを意味する。従って、ＰＡＳ配列は、キメラタンパク質の異種部分の一部として用いることができる、基礎的成分であり、アミノ酸ポリマーであり、または、アラニン、セリンおよびプロリンを含有する、実質的にからなる、または、からなる配列カセットである。しかし、当業者であれば、アラニン、セリンおよびプロリン以外の残基が少数の構成要素としてＰＡＳ配列に加えられた場合でも、アミノ酸ポリマーはランダムコイル構造を形成しうることを知っている。本明細書に用いられる「少数の構成要素」という用語は、アラニン、セリンおよびプロリン以外のアミノ酸がある程度（たとえば、約１２％まで。すなわち、ＰＡＳ配列の１００アミノ酸のうちの約１２。約１０％まで。すなわち、ＰＡＳ配列の１００アミノ酸のうちの約１０。約９％まで。すなわち、１００アミノ酸のうちの約９。約８％まで。すなわち、１００アミノ酸のうちの約８。約６％まで。すなわち、１００アミノ酸のうちの約６。約５％まで。すなわち、１００アミノ酸のうちの約５。約４％まで。すなわち、１００アミノ酸のうちの約４。約３％まで。すなわち、１００アミノ酸のうちの約３。約２％まで。すなわち、１００アミノ酸のうちの約２。約１％まで。すなわち、１００アミノ酸のうちの約１）ＰＡＳ配列に加えられることを意味する。アラニン、セリンおよびプロリンとは異なるアミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌから選択されても良い。
生理学的条件下で、ＰＡＳ連続配列は、ランダムコイル構造を形成し、それにより、キメラタンパク質に対するｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性の増加を調節することができる。ランダムコイルドメインは、それ自身による安定な構造または機能をとらないため、キメラタンパク質の活性化可能な凝固因子により調節される生物学的活性は、原則的に、持続される。他の実施態様において、ランダムコイルドメインを形成するＰＡＳ配列は、特に、血漿中のタンパク質分解、免疫原性、等電点／静電的振る舞い、細胞表面受容体への結合または内面化に関して生物学的に不活性であるが、生物分解が可能であり、それにより、たとえばＰＥＧ等の合成ポリマーを超える明確な利点がもたらされる。
ランダムコイル構造を形成するＰＡＳ配列の非限定的な例には、ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号３６）、ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ（配列番号３７）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ（配列番号３８）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ（配列番号３９）、ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳＰＳＳＰＡ（配列番号４０）、ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（配列番号４１）、ＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ（配列番号４２）またはそれらの任意の組み合わせから選択されるアミノ酸配列が含有される。ＰＡＳ配列のさらなる例は、たとえば、米国特許出願公開２０１０／０２９２１３０ Ａ１および国際特許出願公開ＷＯ ２００８／１５５１３４ Ａ１から知ることができる。
８．ＨＡＰ配列
ある実施態様において、少なくとも１つの異種部分は、グリシン富化ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）である。ＨＡＰ配列は、グリシンの反復配列を含有することができ、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、１２０アミノ酸、１４０アミノ酸、１６０アミノ酸、１８０アミノ酸、２００アミノ酸、２５０アミノ酸、３００アミノ酸、３５０アミノ酸、４００アミノ酸、４５０アミノ酸、または５００アミノ酸の長さを有する。１つの実施態様において、ＨＡＰ配列は、当該ＨＡＰ配列に融合された、または連結された部分の半減期を延長することができる。ＨＡＰ配列の非限定的な例としては、限定されないが、（Ｇｌｙ）ｎ、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、または、Ｓ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎが挙げられ、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。１つの実施態様において、ｎは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または、４０である。他の実施態様において、ｎは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００である。
９．トランスフェリンまたはその断片
ある実施態様において、少なくとも１つの異種部分は、トランスフェリンまたはその断片である。いずれのトランスフェリンを用いて、本発明のキメラタンパク質を作製してもよい。例として、野生型ヒトＴＦ（ＴＦ）は、およそ７５ｋＤａ（グリコシル化は含まれず）、６７９アミノ酸のタンパク質であり、２つの主なドメイン、Ｎ（約３３０アミノ酸）およびＣ（約３４０アミノ酸）を有し、遺伝子の複製から生じると考えられている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００１０６３、ＸＭ００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ０３９８４５、ＸＭ０３９８４７およびＳ９５９３６(www.ncbi.nlm.nih.gov/)（それらはすべて参照により本明細書にその全体で援用される）を参照のこと。トランスフェリンは２つのドメイン、ＮドメインおよびＣドメインを含有する。Ｎドメインは２つのサブドメイン、Ｎ１ドメインおよびＮ２ドメインを含有し、Ｃドメインは２つのサブドメイン、Ｃ１ドメインおよびＣ２ドメインを含有する。
１つの実施態様において、トランスフェリン異種部分は、トランスフェリンのスプライスバリアントを含有する。１つの例において、トランスフェリンスプライスバリアントは、ヒトトランスフェリンのスプライスバリアント（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６１１４０）であってもよい。他の実施態様において、キメラタンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリン配列の１以上のドメイン（たとえば、Ｎドメイン、Ｃドメイン、Ｎ１ドメイン、Ｎ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメインまたはそれらの任意の組み合わせ）を含有しても良い。
１０．ポリマー（たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））
他の実施態様において、少なくとも１つの異種部分は当分野公知の可溶性ポリマー（限定されないが、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストランまたはポリビニルアルコールを含む）である。一部の実施態様において、ＰＥＧ異種部分を含有するキメラタンパク質はさらに、イムノグロブリン定常領域もしくはその一部（たとえば、Ｆｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ、アルブミンまたはその断片もしくは変異体、または、それらの任意の組み合わせから選択される異種部分を含有する。さらに他の実施態様において、キメラタンパク質は、活性化可能な凝固因子またはその断片、およびＰＥＧ異種部分を含有し、ここで、キメラタンパク質はさらに、イムノグロブリン定常領域もしくはその一部（たとえば、Ｆｃ部分）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ、アルブミンまたはその断片もしくは変異体、または、それらの任意の組み合わせから選択される異種部分を含有する。さらに他の実施態様において、キメラタンパク質は、凝固因子またはその断片、第二の凝固因子またはその断片、および、ＰＥＧ異種部分を含有し、ここで、キメラタンパク質はさらに、イムノグロブリン定常領域もしくはその一部（たとえば、Ｆｃ部分）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ、アルブミンまたはその断片もしくは変異体、または、それらの任意の組み合わせから選択される異種部分を含有する。他の実施態様において、キメラタンパク質は凝固因子またはその断片、合成凝固促進ポリペプチド、およびＰＥＧ異種部分を含有し、ここで、キメラタンパク質はさらに、イムノグロブリン定常領域もしくはその一部（たとえば、Ｆｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ、アルブミンまたはその断片もしくは変異体、または、それらの任意の組み合わせから選択される異種部分を含有する。他の実施態様において、キメラタンパク質は、２つの合成凝固促進ペプチドおよびＰＥＧ異種部分を含有し、ここで、キメラタンパク質はさらに、イムノグロブリン定常領域もしくはその一部（たとえば、Ｆｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ、アルブミンまたはその断片もしくは変異体、または、それらの任意の組み合わせから選択される異種部分を含有する。さらに他の実施態様において、キメラタンパク質は凝固因子またはその断片、凝固因子の補因子（たとえば、凝固因子が第Ｘ因子である場合、第Ｖａ因子；または、凝固因子が第ＶＩＩ因子である場合、組織因子）、およびＰＥＧ異種部分を含有し、ここで、キメラタンパク質はさらに、イムノグロブリン定常領域もしくはその一部（たとえば、Ｆｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ、アルブミンまたはその断片もしくは変異体、または、それらの任意の組み合わせから選択される異種部分を含有する。
本発明により、たとえばポリペプチドの可溶性、安定性および循環時間の増加、または免疫原性の低下等の追加の利点をもたらしうる異種部分を含有する本発明のキメラタンパク質もまた提示される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）。改変のためのそのような異種部分は、限定されないが、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、またはそれらの任意の組み合わせからを含む、水溶性ポリマーから選択されても良い。
ポリマーは、任意の分子量のものであってもよく、および、分枝していても、分枝していなくてもよい。ポリエチレングリコールに関しては、１つの実施態様において、操作および製造の簡便さのために、分子量は約１ｋＤａ〜１００ｋＤａの間である。所望のプロファイル（たとえば、所望の放出持続期間、効果。もしあれば、任意の生物学的活性に対しては、操作のし易さ、抗原性の程度または欠損、およびタンパク質またはアナログに対する他の公知のポリエチレングリコールの効果）に基づいて、他のサイズを用いても良い。たとえば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００または、１００，０００ｋＤａの平均分子量を有していても良い。
一部の実施態様において、ポリエチレングリコールは分枝構造を有していても良い。分枝したポリエチレングリコールは、たとえば、米国特許第５，６４３，５７５号、Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999)；および Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999)（それらは、参照により本明細書にその全体で援用される）に開示されている。
本発明の各キメラタンパク質に付着されるポリエチレングリコール部分の数（すなわち、置換の程度）もまた、変化しうる。たとえば、ＰＥＧ化キメラタンパク質は、平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０またはそれ以上のポリエチレングリコール分子に結合されていても良い。同様に、たとえば、平均して、タンパク質分子当たり、１−３、２−４、３−５、４−６、５−７、６−８、７−９、８−１０、９−１１、１０−１２、１１−１３、１２−１４、１３−１５、１４−１６、１５−１７、１６−１８、１７−１９または、１８−２０のポリエチレングリコールの部分の範囲内の置換度であっても良い。置換の程度の決定法は、たとえば、Delgado et al., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992)に検討されている。
一部の実施態様において、キメラタンパク質は、ＰＥＧ化されていても良い。ＰＥＧキメラタンパク質は、少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を含有する。他の実施態様において、ポリマーは水溶性であっても良い。ポリマーの非限定的な例は、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、またはポリ（アクリロイルモルホリン）であっても良い。凝固因子に対するポリマー結合のさらなるタイプは、米国特許第７，１９９，２２３号に開示されている。また、Singh et al. Curr. Med. Chem. 15:1802-1826 (2008)を参照のこと。
１１．ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）
ある実施態様において、少なくとも１つの異種部分は、ポリマー（たとえば、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、またはその誘導体）である。ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、天然型アミロペクチンの誘導体であり、体内でαアミラーゼにより分解される。ＨＥＳは、炭水化物ポリマーであるアミロペクチンの置換誘導体であり、９５重量％までの濃度でトウモロコシデンプン中に存在する。ＨＥＳは、有益な生物学的特性を示し、血液量置換剤として用いられ、および、臨床において血液希釈療法に用いられている(Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987); および Weidler et al., Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498 (1991))。
アミロペクチンはグルコース部分を含有し、その主鎖中に、α−１，４−グリコシド結合が存在し、分枝部位で、α−１，６−グリコシド結合が存在する。この分子の物理化学的特性は主に、グリコシド結合のタイプにより決定される。ニック化されたα−１，４−グリコシド結合のために、１ターン当たり約６つのグルコース−マンノースを有するヘリカル構造が産生される。ポリマーの物理化学ならびに生化学特性は、置換を介して改変することができる。ヒドロキシエチル基の導入は、アルカリ性ヒドロキシエチル化を介して達成することができる。反応条件を適合させることにより、ヒドロキシエチル化に関して、非置換グルコース単量体における反応性ヒドロキシ基の異なる反応性を引き出すことが可能となる。この事実により、当業者は、限られた範囲で、置換パターンに影響を与えることができる。
ＨＥＳは、分子量分布および置換の程度により主に特徴付けられる。置換の程度はＤＳと表記され、モル置換に関連することが当業者に知られている。（上記に引用される、Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987)を参照のこと。特に２７３ページ）。
１つの実施態様において、ヒドロキシエチレンデンプンは、１〜３００ｋＤ、２〜２００ｋＤ、３〜１００ｋＤ、または４〜７０ｋＤの平均分子量（重量平均）を有している。ヒドロキシエチレンデンプンはさらに、０．１〜３、好ましくは０．１〜２、より好ましくは０．１〜０．９、好ましくは０．１〜０．８のモル置換度、およびヒドロキシエチル基に関して、２〜２０の範囲にあるＣ２：Ｃ６置換の間の比率を示しても良い。約１３０ｋＤの平均分子量を有するＨＥＳの非限定的な例は、０．２〜０．８（たとえば、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８）、好ましくは、０．４〜０．７（たとえば、０．４、０．５、０．６または０．７）の置換度を有するＨＥＳである。特定の実施態様において、約１３０ｋＤの平均分子量を有するＨＥＳは、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓから入手されるＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）である。ＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）は、人工コロイドであり、たとえば、血液量減少症の治療および予防の治療適応に用いられる、体積代用品に用いられる。ＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）の特徴は、１３０，０００±２０，０００Ｄの平均分子量、０．４のモル置換、および約９：１のＣ２：Ｃ６比率である。他の実施態様において、ヒドロキシエチレンデンプンの平均分子量の範囲は、たとえば、４〜７０ｋＤまたは、１０〜７０ｋＤまたは、１２〜７０ｋＤまたは、１８〜７０ｋＤまたは、５０〜７０ｋＤまたは、４〜５０ｋＤまたは、１０〜５０ｋＤまたは、１２〜５０ｋＤまたは、１８〜５０ｋＤまたは、４〜１８ｋＤまたは、１０〜１８ｋＤまたは、１２〜１８ｋＤまたは、４〜１２ｋＤまたは、１０〜１２ｋＤまたは、４〜１０ｋＤである。さらに他の実施態様において、ヒドロキシエチレンデンプンの平均分子量は、４ｋＤ超、７０ｋＤ未満の範囲（たとえば、約１０ｋＤ）、または、９〜１０ｋＤもしくは１０〜１１ｋＤもしくは９〜１１ｋＤの範囲、または、約１２ｋＤ、または、１１〜１２ｋＤもしくは、１２〜１３ｋＤもしくは、１１〜１３ｋＤの範囲、または、約１８ｋＤ、または１７〜１８ｋＤもしくは１８〜１９ｋＤもしくは１７〜１９ｋＤの範囲、または、約３０ｋＤ、または、２９〜３０、もしくは３０〜３１ｋＤの範囲、または、約５０ｋＤ、または４９〜５０ｋＤもしくは５０〜５１ｋＤもしくは４９〜５１ｋＤの範囲にある。
ある実施態様において、異種部分は、異なる平均分子量および／または異なる置換度および／または異なるＣ２：Ｃ６置換比率を有するヒドロキシエチレンデンプンの混合物であっても良い。それゆえ、ヒドロキシエチレンデンプンの混合物は、異なる平均分子量および異なる置換度および異なるＣ２：Ｃ６置換比率を有して用いられても良く、または、異なる平均分子量および異なる置換度および同一もしくはおよそ同一のＣ２：Ｃ６置換比率を有して用いられても良く、または、異なる平均分子量および同一もしくはおよそ同一の置換度および異なるＣ２：Ｃ６置換比率を有して用いられても良く、または、同一もしくはおよそ同一の平均分子量および異なる置換度および異なるＣ２：Ｃ６置換比率を有して用いられても良く、または、異なる分子量および同一もしくはおよそ同一の置換度および同一もしくはおよそ同一のＣ２：Ｃ６置換比率を有して用いられても良く、または、同一もしくはおよそ同一の平均分子量および異なる置換度および同一もしくはおよそ同一のＣ２：Ｃ６置換比率を有して用いられても良く、または、同一もしくはおよそ同一の平均分子量および同一もしくはおよそ同一の置換度および異なるＣ２：Ｃ６置換比率を有して用いられても良く、または、およそ同一の平均分子量およびおよそ同一の置換度およびおよそ同一のＣ２：Ｃ６置換比率を有して用いられても良い。
１２．ポリシアル酸（ＰＳＡ）
ある実施態様において、少なくとも１つの異種部分がポリマー（たとえば、ポリシアル酸（ＰＳＡ）またはその誘導体）である。ポリシアル酸（ＰＳＡ）は、ある細菌株および哺乳類のある細胞により産生されるシアル酸の天然型の非分枝ポリマーである（Roth J., et al. (1993) in Polysialic Acid: From Microbes to Man, eds Roth J., Rutishauser U., Troy F. A. (Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland), pp 335−348）。わずかな酸加水分解により、または、ノイラミニダーゼによる消化により、またはポリマーの天然細菌型由来の形態の分画により、ｎ＝約８０またはそれ以上のシアル酸残基から下限はｎ＝２までの様々な程度の重合において、それらを製造することができる。また、ホモポリマーの形態（すなわち、大腸菌株Ｋ１およびＢ群髄膜炎菌の莢膜多糖を含有するα−２，８結合ポリシアル酸、それらは神経細胞付着分子（Ｎ−ＣＡＭ）の胎児型においても見いだされる）が存在するように、異なるポリシアル酸の組成に変化する。ヘテロポリマー形態もまた存在する（たとえば、大腸菌株Ｋ９２およびＮ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＣ群多糖のα−２，８ α−２，９ポリシアル酸の交互配置）。シアル酸は、たとえばＷ１３５群またはＹ群のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ等の、他のシアル酸のモノマーとの交互配置コポリマー中に存在しても良い。ポリシアル酸は、病原性細菌による免疫システムおよび補体システムの回避、ならびに、胎児発生の間の未成熟神経のグリア接着の制御（ここで、ポリマーは抗接着機能を有する）（Cho and Troy, P.N.A.S., USA, 91 (1994) 11427-11431）を含む、重要な生物学的機能を有するが、哺乳類におけるポリシアル酸の受容体は判明していない。大腸菌株Ｋ１のα−２，８結合ポリシアル酸もまた、「コロミン酸」として知られており、本発明の例示のために（様々な長さで）用いられる。ポリペプチドへのポリシアル酸の付着または結合の様々な方法が開示されている（たとえば、米国特許第５，８４６，９５１号、ＷＯ−Ａ−０１８７９２２および、ＵＳ ２００７／０１９１５９７ Ａ１（それらは参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。
１３．クリアランス受容体
ある態様において、キメラタンパク質がクリアランス受容体、その断片、変異体または誘導体を含有する異種分子を少なくとも１つ含有する場合に、本発明のキメラタンパク質における活性化可能な凝固因子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が延長される。治療ペプチドが第Ｘ因子である特定の態様において、クリアランス受容体の可溶性形態（たとえば、低密度リポタンパク質関連タンパク質受容体ＬＲＰ１またはその断片）は、受容体のクリアランスするための第Ｘ因子の結合をブロックし、それにより、そのｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長させる。
ＬＲＰ１は、様々なタンパク質（たとえば、第Ｘ因子）の受容体介在クリアランスに関与する６００ｋＤａの内在性膜タンパク質である（たとえば、Narita et al., Blood 91:555-560 (1998)を参照のこと）
Ｄ．リンカー部分（Ｌ、Ｌ１またはＬ２）
本発明に有用なリンカー部分は、ペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーのいずれかであっても良い。１つの実施態様において、ペプチドリンカーは合成されていても良い。
本明細書において、「ペプチドリンカー」という用語は、ポリペプチド鎖の線形アミノ酸配列中の２つのドメインを連結するペプチドまたはポリペプチド配列（たとえば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）を指す。本発明のポリペプチドは、構築物を構成するイムノグロブリン定常領域またはその一部（たとえば、Ｆｃ部分）の２つを直接的に、または間接的に連結するペプチドリンカーをコードする核酸分子によりコードされる。これらのリンカーは本明細書において、「ｓｃＦｃリンカー」と呼称される。ｓｃＦｃリンカーが線形ポリペプチド配列の２つのＦｃ部分を連続的に連結する場合、それは「直接的」な連結となる。対照的に、ｓｃＦｃリンカーは、第一のＦｃ部分を結合部分へと連結させ、その結合部分が今度は第二のＦｃ部分に連結され、それにより間接的な連結を形成してもよい。これらのｓｃＦｃリンカー（Ｘ）により、単鎖の遺伝子構築物の形成がもたらされる。しかしながら、１つの実施態様においては、ｓｃＦｃポリペプチドはまた、ｓｃＦｃリンカーの開裂がもたらされる細胞内プロセッシング部位を含有し（ｃｓｃＦｃリンカー）、および、１つの実施態様においては、実質的に切除される（たとえば、細胞によりプロセッシングの間に）。ゆえにプロセッシングされる分子は、少なくとも２つのアミノ酸鎖を含有し、実質的に外来性のリンカーアミノ酸配列を欠く二量体分子である。一部の実施態様において、リンカーのすべて、または実質的にすべては切除され、一方で一部の実施態様においては、細胞内プロセッシング部位の一部は、残存する（たとえば、ＲＲＲＲ開裂部位の４つのアルギニン等）。
他の実施態様において、本明細書において「リンカー部分」と呼称される他のタイプのペプチドリンカーを用いて異なる部分を連結させてもよい（たとえば、活性化可能な凝固因子を増強部分に連結、活性化可能な凝固因子を異種部分に連結、および／または、増強部分を異種部分に連結）。このタイプのペプチドリンカーは、ポリペプチド分子に柔軟性を与えうる。リンカーは多くの場合開裂されないが、そのような開裂が望ましいものでありうる。リンカーの例示的な位置を、添付の図面に示す。リンカーは、活性化可能な凝固因子と増強部分の間、活性化可能な凝固因子とそれに連結された異種部分の間、または増強部分とそれに連結された異種部分の間（たとえば、これら部分のＮ末端またはＣ末端）に位置づけられても良い。１つの実施態様において、これらのリンカーは、プロセッシングの間に除去されない。
本発明のキメラタンパク質に存在しうる第三のタイプのリンカーは、開裂部位（すなわち、プロテアーゼ開裂部位基質、たとえば、第ＸＩａ因子、第Ｘａ因子またはトロンビン開裂部位）を含有し、Ｃ末端のＮ末端、または開裂部位の両側のいずれか上に追加のリンカーを含有しうる、プロテアーゼ開裂可能なリンカーである。凝固因子チモーゲンに組み込まれた際、これらの開裂可能なリンカーは、異種開裂部位を有するキメラ分子をもたらす。そのような部位の例示的な位置を添付の図面に示し、および、たとえば、凝固因子チモーゲンの重鎖と軽鎖の間、凝固因子チモーゲンの重鎖と第一の異種部分の間、増強部分と第二の異種部分の間が挙げられる。
１つの実施態様において、本発明のプロセッシングされないポリペプチドは、ｃｓｃＦｃリンカーを介して連結され、単一ポリペプチド鎖に含有されるＦｃ領域を形成する２以上のＦｃドメインまたは部分を含有する。ｃｓｃＦｃリンカーは少なくとも１つの細胞内プロセッシング部位（すなわち、細胞内酵素により開裂される部位）に隣接している。少なくとも１つの細胞内プロセッシング部位でのポリペプチドの開裂により、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含有するポリペプチドがもたらされる。１つの実施態様において、ｃｓｃＦｃリンカーは、Ｆ１またはＦ２（たとえば、活性化可能な凝固因子）を、任意選択的に細胞内プロセッシング部位を介して連結し、または、細胞内プロセッシング部位を介して増強部分を連結する。
上述のように、たとえばＦｃ部分に、活性化可能な凝固因子または増強部分を連結するために、他のペプチドリンカーを本発明の構築物中に任意選択的に用いても良い。本発明に関連して用いることができるリンカーのいくつかの例示的な位置としては、たとえば、添付の図面に概説され、および以下に詳述されるＧｌｙＳｅｒアミノ酸を含有するポリペプチドが挙げられる。１つの実施態様において、リンカーは、活性化可能な凝固因子、異種部分（たとえば、Ｆｃ）、開裂部位および増強部分からそれぞれ独立して選択される１以上の部分に隣接していてもよい。
１つの実施態様において、ペプチドリンカーは、合成である（すなわち、天然型ではない）。１つの実施態様において、ペプチドリンカーは、天然では連結されていない、または天然では遺伝的に融合されていないアミノ酸の第二の線形配列に、第一の線形アミノ酸配列を結合する、または遺伝的に融合するアミノ酸配列を含有するペプチド（またはポリペプチド）（天然型であってもなくてもよい）を含有する。たとえば、１つの実施態様において、ペプチドリンカーは、天然型ポリペプチドの改変型である、非天然型ポリペプチド（たとえば、付加、置換または欠失等の変異を含有する）を含有してもよい。他の実施態様において、ペプチドリンカーは、非天然型アミノ酸を含有しても良い。他の実施態様において、ぺプチドリンカーは、天然では存在しない、線形配列中にある天然型アミノ酸を含有しても良い。さらに他の実施態様において、ぺプチドリンカーは、天然型ポリペプチド配列を含有しても良い。
たとえば、ある実施態様において、ペプチドリンカーを用いて、同一のＦｃ部分を融合させ、それによって、ホモ二量体ｓｃＦｃ領域を形成してもよい。他の実施態様において、ペプチドリンカーを用いて、異なるＦｃ部分（たとえば、野生型Ｆｃ部分とＦｃ部分変異体）を融合させ、それによってヘテロ二量体ｓｃＦｃ領域を形成してもよい。
他の実施態様において、ペプチドリンカーは、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーを含有、または、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーからなる。１つの実施態様において、ｓｃＦｃリンカーまたはｃｓｃＦｃリンカーは、イムノグロブリンヒンジおよびｇｌｙ−ｓｅｒリンカーの少なくとも一部を含有する。本明細書において、「ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー」という用語は、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドを指す。例示的なｇｌｙ／ｓｅｒリンカーは、化学式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号４）のアミノ酸配列を含有し、ここで、ｎは、正の整数（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）である。ｇｌｙ／ｓｅｒリンカーの例は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号４）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号４）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６（配列番号４）である。他の例示的なｇｌｙ−ｓｅｒリンカーは、ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号４３）である。ある実施態様において、前記ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーは、ペプチドリンカー（たとえば、本明細書に記述される任意のペプチドリンカー配列）の他の２つの配列の間に挿入されていてもよい。他の実施態様において、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーは、ペプチドリンカー（たとえば、本明細書に記述される任意のペプチドリンカー配列）の他の配列の内の１つの末端または両方の末端に付着されてもよい。さらに他の実施態様において、２以上のｇｌｙ−ｓｅｒリンカーが、ペプチドリンカー中に連続して組み込まれている。１つの実施態様において、本発明のペプチドリンカーは、上部ヒンジ領域（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子由来の）の少なくとも一部、中部ヒンジ領域（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子由来の）の少なくとも一部、および、一連のｇｌｙ／ｓｅｒアミノ酸残基（たとえば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号４）等のｇｌｙ／ｓｅｒリンカー）を含有する。
本発明のペプチドリンカーは、少なくとも１アミノ酸の長さであり、長さを変化させるものであっても良い。１つの実施態様において、本発明のペプチドリンカーは、約１〜約５０アミノ酸の長さである。この文脈において用いられる場合、「約」という用語は、±２アミノ酸残基を示す。リンカーの長さは正の整数でなければならないため、約１〜約５０アミノ酸の長さは、１〜３から、４８〜５２アミノ酸の長さを意味する。他の実施態様において、本発明のペプチドリンカーは、約１０〜約２０アミノ酸の長さである。他の実施態様において、本発明のペプチドリンカーは、約１５〜約５０アミノ酸の長さである。他の実施態様において、本発明のペプチドリンカーは、約２０〜約４５アミノ酸の長さである。他の実施態様において、本発明のペプチドリンカーは、約１５〜約３５アミノ酸、または約２０〜約３０アミノ酸の長さである。他の実施態様において、本発明のペプチドリンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、または、２０００アミノ酸の長さである。１つの実施態様において、本発明のペプチドリンカーは、２０または３０アミノ酸の長さである。
一部の実施態様において、ペプチドリンカーは、少なくとも２アミノ、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００アミノ酸を含有してもよい。他の実施態様において、ペプチドリンカーは、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、または少なくとも１０００アミノ酸を含有しても良い。一部の実施態様において、ペプチドリンカーは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または、２０００アミノ酸を含有してもよい。ペプチドリンカーは、１〜５アミノ酸、１〜１０アミノ酸、１〜２０アミノ酸、１０〜５０アミノ酸、５０〜１００アミノ酸、１００〜２００アミノ酸、２００〜３００アミノ酸、３００〜４００アミノ酸、４００〜５００アミノ酸、５００〜６００アミノ酸、６００〜７００アミノ酸、７００〜８００アミノ酸、８００〜９００アミノ酸、９００〜１０００アミノ酸を含有してもよい。
ペプチドリンカーは、当分野公知の技法を用いてポリペプチド配列内に導入されても良い。改変は、ＤＮＡ配列解析により確認されてもよい。プラスミドＤＮＡを用いて、作製されたポリペプチドの安定的な産生のために、宿主細胞へと形質転換されてもよい。
ＩＩＩ．ポリペプチドの調製
様々な方法が、本発明のキメラタンパク質の遺伝子組み換え製造に利用可能である。１つの実施態様において、本発明は、本発明のキメラタンパク質をコードする核酸配列を含有する核酸構築物に関する。コード縮重のために、様々な核酸配列が、ポリペプチドのアミノ酸配列をコードすることを理解されたい。所望されるポリヌクレオチドは、ｄｅ ｎｏｖｏ固相ＤＮＡ合成により、または前に調整されたポリヌクレオチドのＰＣＲ突然変異誘導により、製造することができる。
オリゴヌクレオチド介在突然変異誘導は、アミノ酸置換をコードするコドンを導入する（たとえば、Ｆｃ変異体部分へと導入する）ための、置換、イン−フレーム挿入または改変（たとえば、改変コドン）を調製するための１つの方法である。たとえば、開始ポリペプチドＤＮＡを、所望される変異をコードするオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることにより、一本鎖ＤＮＡ鋳型へと改変する。ハイブリダイズの後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを包含する鋳型の全体的な第二の相補鎖を合成する。１つの実施態様において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製するためには、遺伝子操作（たとえば、プライマーベースのＰＣＲ突然変異誘導）で、本明細書に定義される改変を組み込むのに十分である。
遺伝子組み換え作製のために、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を、適切な発現ビヒクル（たとえば、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクター、または、ＲＮＡウイルスベクターの場合には、複製および翻訳に必要な要素を含有するベクター）へと挿入する。
キメラタンパク質をコードする核酸を、適切なリーディングフレームのベクターへ挿入する。次いで、発現ベクターを、ポリペプチドを発現する適切な標的細胞へとトランスフェクトする。当分野公知のトランスフェクションの技術としては、限定されないが、リン酸カルシウム沈殿（Wigler et al. 1978, Cell 14 : 725）および、エレクトロポレーション (Neumann et al. 1982, EMBO, J. 1:841）が挙げられる。様々な宿主発現ベクターシステムを用いて、真核細胞中で本明細書に記述されるキメラタンパク質を発現させてもよい。１つの実施態様において、真核細胞は、哺乳類細胞（たとえば、２９３細胞、ＰｅｒＣ６、ＣＨＯ、ＢＨＫ、Ｃｏｓ、ＨｅＬａ細胞）を含む、動物細胞である。キメラタンパク質が真核細胞中で発現される場合、キメラタンパク質をコードするＤＮＡは、キメラタンパク質が分泌されるようにするシグナル配列をコードしてもよい。当業者であれば、タンパク質が翻訳されている間にシグナル配列が細胞により開裂され、成熟キメラタンパク質が形成されることを理解するであろう。様々なシグナル配列が当分野に公知であり、たとえば、天然型第ＶＩＩ因子シグナル配列、天然型第ＩＸ因子シグナル配列、およびマウスＩｇＫ軽鎖シグナル配列がある。あるいは、シグナル配列が導入されない場合には、キメラタンパク質は、細胞溶解により回収されてもよい。
本発明のキメラタンパク質は、トランスジェニック動物（たとえば、げっ歯類、ヤギ、ヒツジ、ブタまたはウシ等）で合成されてもよい。「トランスジェニック動物」という用語は、外来遺伝子がそのゲノム中に組み込まれた非ヒト動物を指す。この遺伝子が生殖系組織に存在するため、親から子供へと受け継がれる。外来性の遺伝子は、単一細胞化された胚へと導入される（Brinster et al. 1985, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82 : 4438）。トランスジェニック動物の作成方法は、イムノグロブリン分子を作製するトランスジェニック技術を含む当分野において公知である（Wagner et al. 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6376; McKnight et al. 1983, Cell 34 : 335; Brinster et al. 1983, Nature 306: 332; Ritchie et al. 1984, Nature 312: 517; Baldassarre et al. 2003, Theriogenology 59 : 831 ; Robl et al. 2003, Theriogenology 59: 107; Malassagne et al. 2003, Xenotransplantation 10 (3): 267）。
発現ベクターは、遺伝子組み換え製造されたタンパク質の精製または識別を簡便にするタグをコードしてもよい。例としては、限定されないが、ベクターｐＵＲ２７８ (Ruther et al. 1983, EMBO J. 2: 1791)が挙げられ、配列をコードする本明細書に記述されるキメラタンパク質は、ハイブリッドタンパク質が産生されるように、ｌａｃ ｚコード領域と、イン−フレームでベクターへとライゲートされる；ｐＧＥＸベクターを用いて、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを有するタンパク質を発現させてもよい。これらのタンパク質は通常、可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着、次いで、グルタチオンが無い中での溶出により、細胞から容易に精製することができる。ベクターは、精製後にタグを容易に除去するために、開裂部位（たとえば、PreCission Protease (Pharmacia, Peapack, N. J. )）を含有する。
本発明の目的に対し、多くの発現ベクターシステムが用いられうる。これらの発現ベクターは、通常、エピソームまたは宿主染色体ＤＮＡの不可欠部分としてのいずれかで、宿主生物中で複製可能である。発現ベクターは、発現制御配列（限定されないが、プロモーター（たとえば、天然で関連したプロモーター、または異種プロモーター）、エンハンサー、シグナル配列、スプライスシグナル、エンハンサーエレメント、および転写終結配列を含む）を含有してもよい。好ましくは、発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができる、ベクター中の真核細胞プロモーターシステムである。発現ベクターはまた、たとえばウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはＳＶ４０ウイルス等の動物ウイルス由来であるＤＮＡエレメントを利用してもよい。他には、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニックなシステムの使用が含まれる。
一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列を有する形質転換細胞が検出されるように、選択マーカー（たとえば、アンピシリン抵抗性、ハイグロマイシン抵抗性、テトラサイクリン抵抗性またはネオマイシン抵抗性等）を含有する（たとえば、Itakuraらの米国特許第４，７０４，３６２号を参照のこと）。その染色体内に挿入されたＤＮＡを有する細胞は、トランスフェクト宿主細胞の選択を可能とする１以上のマーカーを導入することにより選択されてもよい。マーカーは、栄養要求性の宿主に原栄養を供給し、または、殺生物剤抵抗性（たとえば、抗生物質）、またはたとえば銅等の重金属に対する抵抗性をもたらしてもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結されていてもよく、または共形質転換により同一細胞内に導入されていてもよい。
好ましい発現ベクターは、ＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許第６，１５９，７３０号）である。このベクターは、サイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー、マウスβグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１およびエクソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子およびリーダー配列を含有する。このベクターは、可変および定常領域遺伝子の組み込み、細胞でのトランスフェクション、次いでＧ４１８含有培地中の選別およびメトトレキサート増幅で、非常に高レベルの抗体発現をもたらすことが判明している。ベクターシステムはまた、米国特許第５，７３６，１３７号および第５，６５８，５７０号に教示されている（各々は、参照により本明細書にその全体で援用される）。このシステムは高度な発現レベルをもたらす（たとえば、＞３０ｐｇ／細胞／日）。他のベクターシステムの例は、たとえば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
他の実施態様において、本発明のポリペプチドは、ポリシストロニックな構築物を用いて発現されてもよい。これらの発現システムにおいて、たとえば多量体結合タンパク質の複合的なポリペプチド等の対象の複合的遺伝子産物が、単一のポリシストロニック構築物から産生されてもよい。これらのシステムは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有利に用いて、比較的高レベルの本発明のポリペプチドを真核宿主細胞中で産生させる。互換性のあるＩＲＥＳ配列は、米国特許第６，１９３，９８０号に開示されている（本明細書に援用される）。当業者であれば、そのような発現システムを用いて本明細書に開示されるポリペプチドの全範囲を効率的に産生しうることが認識されるであろう。
より一般的には、ポリペプチドをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が調製された時点で、発現ベクターを適切な宿主細胞へと導入しても良い。すなわち、宿主細胞は形質転換されてもよい。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当分野の当業者に公知の様々な技法により行うことができる。これらの技法としては、限定されないが、トランスフェクション（電気泳動およびエレクトロポレーションを含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープ化ＤＮＡとの細胞融合、マイクロインジェクション、および生のウイルスとの感染等が挙げられる。たとえば、Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988)を参照のこと。最も好ましくは、宿主へのプラスミド導入は、エレクトロポレーションを介したものである。形質転換された細胞は、軽鎖および重鎖の産生に適した条件下で増殖され、重鎖および／または軽鎖タンパク質の合成に対して分析される。例示的なアッセイ技術としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞ソーター分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織学的方法等が挙げられる。
本明細書において、「形質転換」という用語は、遺伝子型を変化させ、その結果、レシピエント細胞における変化を生じさせる、レシピエント宿主細胞へのＤＮＡの導入を指す、最も広い意味で用いられなければならない。
同様に、「宿主細胞」も、遺伝子組み換えＤＮＡ技術を用いて構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターで形質転換された細胞を指す。組換え宿主からのポリペプチドの単離のプロセスに関する記述において、「細胞」および「細胞培養物」という用語は、他で明確に定義されない限り、ポリペプチドの源を表すために相互交換可能に用いられる。他で言い換えると、「細胞」からのポリペプチドの回収は、スピンダウンされた全細胞から、または、培地と懸濁細胞の両方を含有する細胞培養物から、のいずれかを意味する。
タンパク質発現に用いられる宿主細胞株は、最も好ましくは哺乳類起源のものであり、当業者が、その中で発現される所望の遺伝子産物に最も適している
特定の宿主細胞株であると選択的に決定するような能力があると信頼するものである。例示的な宿主細胞株としては、限定されないが、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０ Ｔ抗原を有するＣＶＩの派生物）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウスミエローマ）、Ｐ３.ｔｉｍｅｓ．６３−Ａｇ３．６５３（マウスミエローマ）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球），ＰｅｒＣ６、および２９３（ヒト腎臓）が挙げられる。宿主細胞株は通常、業者、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたは公開文献から入手可能である。
１つの実施態様において、宿主細胞は、成熟型ポリペプチドを形成するためにプロセッシングの間にｓｃＦｃリンカーを開裂するために必要な酵素（複数含む）を内生的に発現している（たとえば、そのようなリンカーが存在し、細胞内プロセッシング部位（複数含む）を含有する場合）。このプロセッシングの間に、ｓｃＦｃリンカーが実質的に除去され、外来性のアミノ酸の存在が減ぜられてもよい。本発明の実施態様において、宿主細胞は、ｓｃＦｃリンカーのプロセッシングが発生または改善されるように、細胞に対して外来性である１以上の酵素を発現するように形質転換される。
１つの実施態様において、細胞により内因的または外因的に発現されうる酵素は、ｆｕｒｉｎファミリーの酵素のメンバーである。ヒトｆｕｒｉｎ（すなわち、ＰＡＣＥ）の完全ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、１９９０年に公開されている。Van den Ouweland A M et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:664; 訂正表: Nucleic Acids Res. 18:1332 (1990)。
Ｂａｒｒらに発行された米国特許第５，４６０、９５０号は、組換えＰＡＣＥおよび、活性な成熟異種タンパク質の発現を改善するための異種タンパク質の基質前駆ポリペプチドとＰＡＣＥの共発現を記述している。
ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｎらに発行された米国特許第５，９３５，８１５号は、同様に、組換えヒトｆｕｒｉｎ（すなわち、ＰＡＣＥ）および、活性な成熟異種タンパク質の発現を改善するための異種タンパク質の基質前駆ポリペプチドとｆｕｒｉｎの共発現を記述している。この特許に開示されている、可能性のある基質前駆体としては、第ＩＸ因子の前駆体が含まれる。ＰＡＣＥに加え、哺乳類ｆｕｒｉｎ／サブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）／Ｋｅｘ２ｐ様前駆タンパク質転換酵素（ＰＣ）ファミリーの他のファミリーメンバーが、ＰＣＳＫ１（ＰＣ１／Ｐｃ３としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ２（ＰＣ２としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ３（ｆｕｒｉｎまたはＰＡＣＥとしてもまた知られる）、ＰＣＳＫ４（ＰＣ４としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ５（ＰＣ５またはＰＣ６としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ６（ＰＡＣＥ４としてもまた知られる）、または、ＰＣＳＫ７（ＰＣ７／ＬＰＣ、ＰＣ８、またはＳＰＣ７としてもまた知られる）を含むことが報告されている。これらの様々なメンバーがある保存された全体的な構造特性を共有する一方で、それらは組織分布、細胞内局在、開裂特異性、および優先する基質が異なっている。レビューとしては、Nakayama K (1997) Biochem J. 327:625-35を参照のこと。ＰＡＣＥと同様に、これらの前駆タンパク質転換酵素は一般的に、アミノ末端から始まり、シグナルペプチド、プロペプチド（自己触媒的に開裂されうる）、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＳｅｒおよびＡｓｎ／Ａｓｐ残基により特徴づけられるサブチリジン様酵素ドメイン、および触媒活性に必須であり、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列により特徴付けられるＨｏｍｏ Ｂドメインを含有している。ＰＡＣＥ、ＰＡＣＥ４、およびＰＣ５はまた、Ｃｙｓリッチドメインを含有しているが、その機能は不明である。さらに、ＰＣ５は、膜貫通ドメインを伴うアイソフォームおよび伴わないアイソフォームを有しており、これらの異なるアイソフォームは、それぞれＰＣ５ＢおよびＰＣ５Ａとして知られている。ＰＡＣＥの触媒ドメインのアミノ酸配列と、前駆タンパク質転換酵素のこのファミリーの他のメンバーの触媒ドメインのアミノ酸配列の間の比較により、以下の同一性の程度が明らかとなっている：ＰＣ４に対しては７０％、ＰＣＥ４およびＰＣ５に対しては６５％、ＰＣ１／ＰＣ３に対しては６１％、ＰＣ２に対しては５４％、およびＬＰＣ／ＰＣ７／ＰＣ８／ＳＰＣ７に対しては５１％（Nakayama K (1997) Biochem J. 327:625-35）。
ＰＡＣＥおよびＰＡＣＥ４は、部分的に重複しているが、明らかに異なる基質を有することが報告されている。特に、ＰＡＣＥ４は、ＰＡＣＥとは著しい対象を成し、ＦＩＸの前駆ポリペプチドのプロセッシングが出来ないことが報告されている（Wasley L C et al. (1993) J Biol Chem. 268:8458-65; Rehemtulla A et al. (1993) Biochemistry. 32:11586-90）。
Ｓｅｉｄａｈらに発行された米国特許第５，８４０，５２９号において、ヒトＰＣ７のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、ならびに、他のＰＣファミリーメンバーと比較して、ＰＣ７がＨＩＶ ｇｐ１６０をｇｐ１２０とｇｐ４１に開裂する素晴らしい能力が開示されている。
げっ歯類ＰＣ５のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、当初、Lusson J et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:6691-5によりＰＣ５として開示され、ＰＣ６としてNakagawa T et al. (1993) J Biochem (Tokyo) 113:132-5に開示された。Ｄａｙらに発行された米国特許第６，３８０，１７１号は、ヒトＰＣ５Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、膜貫通ドメインを伴わないアイソフォームを開示している。これらの酵素の配列およびクローニング方法は当分野公知である。
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子はまた、たとえば細菌または酵母または植物細胞等の非哺乳類細胞において発現されてもよい。この点において、様々な単細胞性の非哺乳類微生物（たとえば細菌等）も、形質転換されうることを認識されたい（すなわち、それらは、培養物中で増殖、または発酵することができる）。形質転換に感受性のある細菌としては、腸内細菌科のメンバー（たとえば、大腸菌系統またはサルモネラ）；バチルス科（たとえば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；肺炎球菌属；連鎖球菌；およびインフルエンザ菌）が挙げられる。細菌で発現された場合、ポリペプチドは通常、封入体の一部となることが良く知られている。ポリペプチドは単離され、精製され、次いで、機能性分子へとアセンブリされなければならない。
原核細胞に加え、真核微生物をまた用いても良い。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または普遍的なパン酵母は、真核性微生物の中で最も良く使用されているが、他の多くの系統も通常、利用可能である。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現に対しては、たとえばプラスミドＹＲｐ７（Stinchcomb et al., Nature, 282:39(1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157(1980)）が良く用いられている。このプラスミドにはすでにＴＲＰ１遺伝子（トリプトファン中で増殖する能力を欠損している酵母の変異株に対する選択マーカーを提供する）を含有している（たとえば、ＡＴＣＣ番号第４４０７６号、またはＰＥＰ４−１(Jones, Genetics, 85:12(1977)）。酵母宿主細胞ゲノムの特徴として、ｔｒｐｌ損傷の存在により、トリプトファンの無い中での増殖によって、形質転換の検出を効果的に行うことができる。
他の酵母宿主（たとえば、Ｐｉｃｈｉａ）を用いても良い。所望により、発現制御配列（たとえばプロモーター）、複製起源、終結配列等を有する酵母発現ベクター。典型的なプロモーターとしては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の解糖系酵素が挙げられる。誘導可能な酵母プロモーターとしては、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソチトクロームＣ、ならびに、メタノール、マルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素由来のプロモーターが挙げられる。
あるいは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入および、それに続くトランスジェニック動物のミルク中での発現のための導入遺伝子中に組み込まれても良い（たとえば、Ｄｅｂｏｅｒらの米国特許第５，７４１，９５７号、Ｒｏｓｅｎの米国特許第５，３０４，４８９号、およびＭｅａｄｅらの米国特許第５，８４９，９９２号を参照のこと）。適切な導入遺伝子としては、たとえばカゼインまたはベータラクトグロブリン等の乳腺特異的遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサーと操作可能に連結されているポリペプチドをコードする配列が挙げられる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ作製により，所望のポリペプチドを大量生産するためのスケールアップが可能となる。組織培養条件下で哺乳類細胞を培養するための技法は当分野に公知であり、たとえば、エアリフトリアクター中での、または継続的な攪拌リアクター中での同種懸濁培養、または、たとえば中空糸、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ、もしくはセラミックカートリッジでの固定細胞培養もしくは封入細胞培養が挙げられる。もし必要および／または所望であれば、ポリペプチドの溶液を、慣例のクロマトグラフィ法（たとえばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ、ＤＥＡＥセルロース上でのクロマトグラフィ、または（イムノ−）アフィニティクロマトグラフィにより、（たとえば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的生合成後、または、本明細書に記述されるＨＩＣクロマトグラフィに引き続き、もしくは後に）精製してもよい。アフィニティタグ配列（たとえば、Ｈｉｓ（６）タグ）をポリペプチド配列内に任意選択的に付着させ、または含有させ、下流精製を容易にしてもよい。
１つの実施態様において、本発明の宿主細胞は、ｓｃＦｃリンカーおよび、ｃｓｃＦｃリンカーをプロセッシングすることができる１以上の酵素を含有するポリペプチドをコードする遺伝子構築物を含有する。当該構築物および酵素（複数含む）は、単一のベクターまたは２つのベクターを用いて発現させてもよい。ゆえに、ｓｃＦｃリンカーをコードする遺伝子構築物により産生されたキメラタンパク質は、細胞内プロセッシングによる追加のポリペプチド鎖を有し得る。一部の実施態様において、キメラタンパク質は、開裂プロテアーゼ開裂部位（たとえば、ＲＲＲＲ）を含有してもよい。
１つの実施態様において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に関する。１つの実施態様において、核酸分子は、増強部分および、活性化可能なＦＶＩＩまたは活性化可能なＦＸから選択される活性化可能な凝固因子を含有するキメラタンパク質をコードし、ここで、増強部分は、ＦＶＩＩおよびＦＸの活性を増強する。他の実施態様において、核酸分子は、増強部分、活性化可能な凝固因子、および、活性化可能な凝固因子と増強部分の間の任意選択的なリンカー部分を含有するキメラタンパク質をコードする。
他の実施態様において、本発明は、凝固カスケードの構成要素により活性化可能な異種酵素開裂部位を含有する、ＦＶＩＩを含有するポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
発現された時点で、キメラ凝固因子は、当分野の標準的な方法（硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラムクロマトグラフィ、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動を含む）（概略は、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)を参照し、および、具体的には、本実施例に用いられている方法を参照のこと）に従い、精製されてもよい。薬剤への使用のためには、少なくとも約９０〜９５％の同質性の、実質的に純粋なタンパク質が好ましく、および、９８〜９９％以上の同質性が最も好ましい。
他の実施態様において、キメラ凝固因子は、組換えＤＮＡ技術と化学合成を組み合わせることにより作製されてもよい。たとえば、本発明には、宿主細胞と、凝固因子の軽鎖、プロテアーゼ開裂部位（たとえば、ＳＵＭＯ）、凝固因子の断片化重鎖、任意選択的なリンカー、および増強部分を含有するキメラ凝固因子をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトする方法が含まれる。小ユビキチン様修飾遺伝子（またはＳＵＭＯ）は、ユビキチン（Ｕｂ）およびユビキチン様（Ｕｂｌ）ファミリーのメンバーである。標的タンパク質へのＳＵＭＯの翻訳後付着は、ユビキチン結合カスケード（Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３酵素）と類似する酵素カスケードを介して発生し、最終的には、Ｕｂ／Ｕｂｌ Ｃ末端残基と基質リシン残基の間のイソペプチド結合の形成をもたらす。
Ｕｌｐとしてもまた知られる、高い活性のシステイニルプロテアーゼであるＳＵＭＯプロテアーゼは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＵｌｐ１（Ｕｂｌ特異的プロテアーゼ１）の組換え断片である。ＳＵＭＯプロテアーゼは高度に特異的な様式で、アミノ酸配列ではなくむしろユビキチン様（ＵＢＬ）タンパク質であるＳＵＭＯの三次元構造を認識して、開裂する。当該プロテアーゼを用いて、組換え融合タンパク質からＳＵＭＯを開裂することができる。ＳＵＭＯタンパク質の配列は、以下を含有する：
ＳＬＱＤＳＥＶＮＱＥＡＫＰＥＶＫＰＥＶＫＰＥＴＨＩＮＬＫＶＳＤＧＳＳＥＩＦＦＫＩＫＫＴＴＰＬＲＲＬＭＥＡＦＡＫＲＱＧＫＥＭＤＳＬＲＦＬＹＤＧＩＲＩＱＡＤＱＡＰＥＤＬＤＭＥＤＮＤＩＩＥＡＨＲＥＱＩＧＧ（配列番号６５）
一部の実施態様において、本発明には、宿主細胞に、凝固因子の軽鎖、任意選択的な細胞内プロセッシング部位、プロテアーゼ開裂部位（たとえば、ＳＵＭＯ）、凝固因子の断片化重鎖、任意選択的なリンカー、および増強部分を含有するキメラ凝固因子をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトする方法が含まれ、ここで、キメラ凝固因子は発現される。ある実施態様において、断片化重鎖は、野生型重鎖に相当するＮ末端由来の１以上のアミノ酸を含有しない。重鎖は、１以上のアミノ酸を失い、チオエステルペプチドへの化学的ライゲーションのためのＦＶＩＩまたはＦＸ上の天然型システイン残基を露出する。１つの実施態様において、断片化重鎖から失われているアミノ酸は、６アミノ酸（たとえば、ＦＶＩＩに対しては、ＩＶＧＧＫＶ（配列番号６０）、ＦＸに対してはＩＶＧＧＱＥ（配列番号６１））である。他の実施態様において、断片化重鎖から失われているアミノ酸は１１アミノ酸（たとえば、ＦＶＩＩに対しては、ＩＶＧＧＫＶＣＰＫＧＥ（配列番号６２）、ＦＸに対してはＩＶＧＧＱＥＣＫＤＧＥ（配列番号６３））である。他の実施態様において、宿主細胞は、細胞内プロセッシング酵素をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含有し、それにより、キメラ凝固因子由来の凝固因子の軽鎖がプロセッシングされる。凝固因子の軽鎖は、凝固因子の重鎖とジスルフィド結合を形成することができる。
ある実施態様において、当該方法にはさらに、ＳＵＭＯプロテアーゼを遺伝子組み換え的に発現されたキメラ凝固因子に組み合わせる（または加える）ことが含まれ、ここで、当該ＳＵＭＯプロテアーゼは、当該キメラ凝固因子由来のＳＵＭＯを開裂する。ＳＵＭＯの開裂によって、さらなる反応のための、凝固因子の断片化重鎖のＮ末端（たとえば、Ｃｙｓ）を露出させることができる。
他の実施態様において、当該方法にはさらに、連結されるチオエステルペプチドを凝固因子の断片化重鎖のＮ末端（たとえば、Ｃｙｓ）へと添加することを含む。１つの実施態様において、チオエステルペプチドは、トロンビン開裂部位（たとえば、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ）を含有してもよい。他の実施態様において、チオエステルペプチドは、トロンビン開裂部位（たとえば、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ）および自己犠牲的リンカー（たとえば、ＰＡＢＣ）を含有してもよい。他の実施態様において、チオエステルペプチドは、トロンビン開裂部位（たとえば、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ）、自己犠牲的リンカー（たとえば、ＰＡＢＣ）、および凝固因子の断片化重鎖のＮ末端から失われているアミノ酸と同一の１以上のアミノ酸を含有してもよい。１つの実施態様において、チオエステルペプチド中の１以上のアミノ酸は、断片化重鎖から失われている６つのアミノ酸（たとえば、ＦＶＩＩに対しては、ＩＶＧＧＫＶ（配列番号６０）、ＦＸに対してはＩＶＧＧＱＥ（配列番号６１））を含有する。他の実施態様において、チオエステルペプチド中の１以上のアミノ酸は、断片化重鎖から失われている１１のアミノ酸（たとえば、ＦＶＩＩに対しては、ＩＶＧＧＫＶＣＰＫＧＥ（配列番号６２）、ＦＸに対してはＩＶＧＧＱＥＣＫＤＧＥ（配列番号６３））を含有する。それゆえ、チオエステルぺプチドが凝固因子の断片化重鎖に融合されている場合、当該キメラ凝固因子は、活性化可能な凝固因子、任意選択的なリンカー、および増強部位を含有してもよく、ここで、当該活性化可能な凝固因子は、トロンビン開裂部位（たとえば、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ）、自己犠牲的リンカー（たとえば、ＰＡＢＣ）、および当該凝固因子の全長重鎖を含有する。
ＩＶ．本発明のポリペプチドの投与方法
本発明はまた、本発明のキメラタンパク質の治療有効量を投与することを含む、対象に対する止血障害を治療、改善、または予防する方法に関する。キメラタンパク質による治療、改善、および予防は、バイパス療法であってもよい。バイパス療法における対象は、すでに凝固因子（たとえば、第ＶＩＩＩ因子）に対する阻害物質を発現していてもよく、または、凝固因子阻害物質を発現する傾向にある。
対象への投与のための組成物には、本発明のキメラ凝固因子をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子（遺伝子治療応用に対して）、ならびにポリペプチド分子が含まれる。
１つの実施態様において、本発明のキメラタンパク質組成物は、止血を促進する少なくとも１つの他の剤と組み合わせて投与される。止血を促進する前記他の剤は、立証された凝固活性を有する治療物質である。例として、限定されないが、止血物質は、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビンもしくはフィブリノーゲン、または、これらのうちの任意のものの活性化形態が挙げられる。止血剤の凝固因子としてはまた、抗線維素溶解薬剤（たとえば、イプシロン−アミノ−カプロン酸、トラネキサム酸）が挙げられる。
本発明の１つの実施態様において、組成物（たとえば、ポリペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸分子）は、対象に投与された際に凝固因子が活性化可能な形態で存在するものである。そのような活性化可能な分子は、対象に投与された後、凝固部位でｉｎ ｖｉｖｏ活性化されてもよい。
本発明のキメラタンパク質は、静脈内、皮下、筋肉内、または任意の粘膜表面（経口、舌下、口腔内、舌下、経鼻、直腸内、経腟またはは肺経路）を介して、投与されても良い。キメラタンパク質は、キメラタンパク質を所望部位へゆっくりと放出させるバイオポリマー固形支持体内に移植されてもよく、または、結合されてもよい。
経口投与に対しては、医薬組成物は、従来法で調製された錠剤またはカプセルの形態をとってもよい。当該組成物はまた、たとえばシロップまたは懸濁液等の液体として調製されてもよい。当該液体は、懸濁化剤（たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂等）、乳化剤（レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（たとえば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコール、または分画化植物油）、および保存剤（たとえば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）を含んでも良い。調製物にはまた、香味料、着色料、および甘味剤が含まれても良い。あるいは、組成物は、水または他の適切なビヒクルとの構成のための乾燥製品として存在してもよい。
口腔内および舌下投与に対しては、組成物は、従来的なプロトコールに従い、錠剤、トローチまたは速溶性のフィルムの形態をとっても良い。
吸入による投与に対しては、本発明による使用のためのキメラタンパク質は、適切な高圧ガス（たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素または他の適切なガス）と共に、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態（たとえば、ＰＢＳ中）で、簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、計量された量を送達するためのバルブを備えることにより、決定することがでいる。たとえば、ラクトースまたはデンプン等の適切な粉末ベースと本化合物の粉末混合物を含有する、たとえば、吸入具または吸入器での使用のためのゼラチン等のカプセルおよびカートリッジ（薬包）を処方してもよい。
１つの実施態様において、本発明のポリペプチドの投与経路は、非経口である。本明細書において非経口という用語には、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣投与が含まれる。静脈内投与の非経口投与形態が好ましい。これらすべての投与形態が明確に本発明の範囲内にあることが予期され、さらに、投与の形態は、注射、特に静脈内注射もしくは動脈内注射、または点滴に対しては溶液である。通常、注射のための適切な医薬組成物は、緩衝液（たとえば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（たとえば、ポリソルベート）、任意選択的に安定化剤（たとえば、ヒトアルブミン）等を含有しうる。しかしながら、本明細書の教示内容と互換性のある他の方法においては、ポリペプチドは、有害細胞群の部位に直接送達され、それにより、病的組織の治療剤への露出を増加させることができる。
非経口投与の調製物には、滅菌された水性溶液または非水性溶液、懸濁液および乳液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（たとえば、オリーブオイル）および注射可能な有機エステル（たとえばオレイン酸エチル）である。水性担体としては、水、アルコール溶液／水性溶液、乳液または懸濁液（生理食塩水および緩衝化培地を含む）が挙げられる。本発明の主題において、薬学的に受容可能な担体としては、限定されないが、０．０１〜０．１Ｍ、および好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液または０．８％生理食塩水が挙げられる。他の一般的な非経口ビヒクルとしては、リン酸ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル、ぶどう糖および塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、水分および栄養素補充剤、電解質補充剤（たとえば、ぶどう糖リンゲルをベースにしたもの）等が挙げられる。保存剤および他の添加剤（たとえば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等）もまた存在していてもよい。
より具体的には、注射使用に適した医薬組成物として、滅菌された水性溶液（水に可溶である場合）もしくは水分散液、または、滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。そのような場合において、組成物は滅菌されていなければならず、容易に注射器で使用できる範囲において、液体でなければならない。製造および保管条件下で安定でなければならず、好ましくは、微生物（たとえば、細菌および真菌等）の汚染の影響に対して保護される。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）およびそれらの適切な混合物等を含有する溶媒または分散液培地であってもよい。たとえば、レシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合には必要とされる粒子サイズが維持されることにより、および、界面活性剤の使用により、適切な流動性が維持されてもよい。
微生物の影響の予防は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤（たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等）により達成されてもよい。多くの場合において、等張剤（たとえば、糖類、ポリアルコール類（たとえばマンニトール）、ソルビトールまたは塩化ナトリウム等）を組成物中に含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、当該組成物中に吸収を遅延させる剤（たとえば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含むことにより、もたらされてもよい。
どのような場合でも、滅菌された注射可能な溶液は、適切な溶媒で、必要とされる量で活性化合物（たとえば、ポリペプチドのみ、または他の活性剤と組み合わせて）を、本明細書に列挙される成分の１つと、または本明細書に列挙される成分の組み合わせの中に組み込ませ、必要に応じて、ろ過滅菌を行うことにより調製されてもよい。一般的に、分散液は、活性化合物を滅菌ビヒクル（基礎的な分散培地および、上述に列挙される他の必要とされる成分を含有する）へと組み込ませることにより調製される。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、それらにより、活性成分と、前もって滅菌ろ過されたそれらの溶液の所望される追加の任意の成分を合わせた粉末が得られる。注射のための調製物は、当分野公知の方法に従い処理され、たとえばアンプル、バッグ、瓶、シリンジまたはバイアル等の容器へと詰められ、および、無菌状態のもと、密封される。さらに、当該調製物は、包括化され、キットの形態で販売されてもよい。そのような製品は、好ましくは、関連組成物が、凝固系疾患に罹患している、または凝固系疾患に罹りやすい傾向にある対象の治療に有用であることを示すラベルまたは添付文書を有する。
医薬組成物はまた、座薬または停留浣腸（たとえば、ココアバターまたは他のグリセリド等の古典的な座薬ベースを含有する）として直腸投与に対して処方されてもよい。
本発明の組成物の有効量は、処置の状態に対して、多くの異なる因子（投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトか動物のいずれか、他の投与されている医薬、および、処置が予防的なものなのか、それとも治療的なものなのか、を含む）によって変化する。通常、患者はヒトであるが、非ヒト動物（トランスジェニック哺乳類）もまた処置されうる。治療用量は、安全性および有効性を最適化するために、当分野の当業者公知の日常的な方法を用いて設定されてもよい。
１つの実施態様において、生物学的に活性な部分（たとえば、ＦＶＩＩを含有する）の投与量は、約９０〜２７０ｕｇ／ｋｇまたは０．０９０〜０．２７０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。他の実施態様において、生物学的に活性な部分（たとえば、ＦＸを含有する）の投与量は、約１μｇ／ｋｇ〜４００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。
投与量は、１０００ｕｇ／体重ｋｇ〜０．１ｎｇ／体重ｋｇの範囲であってもよい。１つの実施態様において、投与量は、１ｕｇ／ｋｇ〜１００ｕｇ／ｋｇである。タンパク質は継続的に投与されてもよく、または、特定の時間間隔で投与されてもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、最適な投与量範囲および／または投与スケジュールを決定してもよい。凝固因子の活性を測定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ法は当分野に公知である（たとえば、ＳＴＡ−ＣＬＯＴ Ｖｌｌａ−ｒＴＦ凝固アッセイ）。さらに、有効投与量は、動物モデル（たとえば、血友病のイヌ）から得られた用量反応曲線から推定されてもよい（Mount et al. 2002, Blood 99 (8): 2670）。
上述の範囲の中間の投与量もまた、本発明の範囲内であることが意図される。対象は、そのような投与量を毎日、一日おき、週に一度、または実証的解析により決定された任意の他のスケジュールで投与されてもよい。例示的な処置は、延長された期間にわたる、複合的な投与量での投与を伴う（たとえば、少なくとも６か月の期間）。一部の方法において、２以上のポリペプチドが、指示される範囲内に各投与されるポリペプチドの投与量がある場合には、同時に投与されてもよい。
本発明のポリペプチドは、何度も投与されてもよい。単回投与の間の間隔は、日、週、月、または年であってもよい。また、間隔は、患者の改変ポリペプチドまたは抗原の血中レベルを測定することにより指示される、不定期なものであってもよい。あるいは、ポリペプチドは、頻繁な投与が必要とされない場合においては、徐放性製剤として投与されてもよい。投与量および頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期によって変化する。
投与量および投与頻度は、その処置が予防的なものであるか、または治療的なものであるかによって変化しうる。予防的な場合には、本発明のポリペプチドを含有する組成物またはそのカクテルは、疾患状態にはまだない患者に対して、疾患に対する患者の抵抗性を増強するため、または患者に対する疾患の影響を最小化するために投与される。そのような量は、「予防的有効量」であると定義される。比較的低い投与量が、長い期間にわたり、比較的不定期な間隔で投与される。一部の患者は、彼らの残りの人生にわたり、処置を受け続ける。
本発明のポリペプチドは、任意選択的に、処置（たとえば、予防的または治療的）の必要がある疾患または状態の処置に有効である他の剤と組み合わせて投与されてもよい。
本明細書において、補助的な療法と併せた、または組み合わせた本発明のポリペプチドの投与とは、連続的な、同時の、同延の、並行した、付随する、同時期の本開示ポリペプチドの投与または適用を意味する。当業者であれば、併用療法レジメンの様々な成分の投与または適用は、全体的な治療効果が増強されるように調節されうることを認識するであろう。当業者（たとえば医師）は、選択された補助療法に基づく過度の実験を行うことなく、本明細書の教示が無くとも、効果的な併用療法レジメンを理解することができるであろう。
本発明のポリペプチドは、たとえば、併用療法レジメンを提供するために、剤（複数含む）と併用して、または組み合わせて用いられても良いことがさらに認識されるであろう。本発明と併用される例示的な剤としては、治療される特定の疾患に対する最新の標準療法の代表的な剤が挙げられる。そのような剤は、化学的な性質のものであっても、または、生物学的な性質のものであってもよい。「生物学的」または「生物学的な剤」という用語は、生きている生物および／または治療剤としての使用が意図されるその産物から作製された任意の薬学的に活性な剤を指す。
本発明のポリペプチドと組み合わせて用いられる剤の量は、対象によって変化し、または、当分野公知のものに従い投与されてもよい。たとえば、Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287 ((Joel G. Hardman et al., eds., 9th ed. 1996中)を参照のこと。他の実施態様において、標準療法と一致するような剤の量が投与される。
上述のように、本発明のポリペプチドは、凝固障害のｉｎ ｖｉｖｏ治療に対し薬学的に有効な量で投与されてもよい。この点に関し、本発明のポリペプチドは、投与を容易にし、および活性剤の安定性が保たれるように処方されてもよい。好ましくは、本発明による医薬組成物は、薬学的に受容可能な、非毒性の滅菌された担体（たとえば、生理食塩水、非毒性緩衝液、保存剤等）を含有する。もちろん、本発明の医薬組成物は、ポリペプチドの薬学的有効量がもたらされるように、単回投与または複数回投与で投与されてもよい。
１つの実施態様において、本発明のキメラ凝固因子は、核酸分子として投与されてもよい。核酸分子は当分野公知の技術（ベクター、プラスミド、リポソーム、ＤＮＡ注射、エレクトロポレーション、遺伝子銃、静脈内注射または肝動脈注入を介するものを含む）を用いて投与されてもよい。遺伝子治療の実施態様において用いるためのベクターは、当分野に公知である。
本開示の範囲に沿って、前述の治療法に従い、治療効果または予防効果を生み出すのに十分な量で、ヒトまたは他の動物に本発明のキメラ凝固因子が投与されてもよい。
本発明のキメラタンパク質は、当業者に認識されうる、多くの用途（限定されないが、疾患または状態を有する対象の治療方法を含む）を有する。疾患または状態としては、限定されないが、止血障害が挙げられる。
１つの実施態様において、本発明は、本発明のキメラタンパク質の少なくとも１つの治療有効量を投与することを含む、止血障害を有する対象を治療する方法に関する。
本発明のキメラタンパク質は、フィブリン塊の形成を促進することにより、止血障害を治療または予防する。本発明のキメラタンパク質は、凝固カスケードの任意のメンバーを活性化することができる。当該凝固因子は、外因性経路、内因性経路、またはその両方に関与していてもよい。
本発明のキメラタンパク質を用いて、たとえば、当該キメラタンパク質に含まれる特定の凝固因子で治療可能であると公知である止血障害を治療することができる。本発明のキメラタンパク質の投与により治療されうる止血障害としては、限定されないが、血友病Ａ、血友病Ｂ、Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ症、第ＸＩ因子欠損（ＰＴＡ欠損）、第ＸＩＩ因子欠損、ならびに、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子の欠損または構造異常が挙げられる。
１つの実施態様において、止血障害は、遺伝性疾患である。１つの実施態様において、対象は血友病Ａであり、キメラタンパク質は、増強部分に連結された、または関連づけられたプロテアーゼ活性化可能な第ＶＩＩ因子を含有する。他の実施態様において、対象は血友病Ａを有し、キメラ凝固因子は増強部分に連結された、または関連づけられたプロテアーゼ活性化可能な第ＶＩＩ因子を含有する。他の実施態様において、対象は血友病Ｂであり、キメラタンパク質は増強部分に連結された、または関連付けられたプロテアーゼ活性化可能な第ＶＩＩ因子または第Ｘ因子を含有する。他の実施態様において、対象は、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩａ因子に対する阻害抗体を有し、キメラ凝固因子は増強部分に連結された、または関連づけられたプロテアーゼ活性化可能な第ＶＩＩ因子を含有する。さらに他の実施態様において、対象は第ＩＸ因子または第ＩＸａ因子に対する阻害抗体を有し、キメラタンパク質は増強部分に連結された、または関連づけられたプロテアーゼ活性化可能な第ＶＩＩ因子を含有する。他の実施態様において、対象は第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩａ因子に対する阻害抗体を有し、キメラ凝固因子は増強部分に連結された、または関連づけられたプロテアーゼ活性化可能な第Ｘ因子を含有する。さらに他の実施態様において、対象は第ＩＸ因子または第ＩＸａ因子に対する阻害抗体を有し、キメラタンパク質は増強部分に連結された、または関連づけられたプロテアーゼ活性化可能な第Ｘ因子を含有する
本発明のキメラ凝固因子を用いて、止血障害を有する対象を予防的に処置してもよい。本発明のキメラ凝固因子を用いて、止血障害を有する対象における急性出血症状を治療してもよい。
１つの実施態様において、止血障害は、凝固因子（たとえば、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、または第ＶＩＩＩ因子）の欠損の結果である。他の実施態様において、止血障害は、不完全な凝固因子の結果であっても良い。
他の実施態様において、止血障害は後天性疾患であってもよい。当該後天性疾患は、潜在的な二次性疾患または状態から生じ得る。関連の無い状態は、たとえば、これに限定されないが、癌、自己免疫疾患または妊娠であっても良い。後天性疾患は老齢または潜在的な二次性疾患を治療するための医薬（たとえば、癌の化学療法）から生じ得る。
本発明はまた、止血障害または、止血障害の発現をもたらす二次性疾患もしくは状態を有していない対象を治療する方法にも関連する。ゆえに、本発明は、本発明のキメラタンパク質の少なくとも１つの治療有効量を投与することを含む、全般的な止血剤を必要とする対象を治療する方法に関連する。たとえば、１つの実施態様において、全般的な止血剤を必要とする対象は、外科手術を受ける、または外科手術を受けようとするものである。本発明のキメラタンパク質は、予防的に、外科手術の前後に投与されてもよい。本発明のキメラタンパク質は、急性の出血症状を制御するために、外科手術の間、または外科手術の後に投与されてもよい。外科手術としては、限定されないが、肝臓移植、肝切除、または幹細胞移植が挙げられる。
他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質を用いて、止血障害を有していない、急性の出血症状のある対象を治療してもよい。急性の出血症状は、重篤な外傷（たとえば、外科手術、交通事故、創傷、銃創または制御できない出血をもたらす他の任意の外傷性事象）から生じるものであってもよい。
本発明は、以下の実施例（限定であると解釈されてはならない）によりさらに解説される。本明細書全体を通じて引用される全ての参照文献、特許および公開特許出願の内容は、参照により本明細書に援用される。
実施例全体を通じて、他で述べられない限り、以下の材料および方法を用いた。
実施例１．ＦＶＩＩ−１３３のクローニング
ＦＶＩＩ−１３３のＨｉｎｄＩＩＩ部位から第一のＥｃｏＲＩ部位のヌクレオチドを含有するＤＮＡ配列を合成し、ｐＢＵＤ−ＣＥ４．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位へとサブクローニングして、中間構築物を作製した。次に、ＦＶＩＩ−１３３の第一のＥｃｏＲＩ部位から第二のＥｃｏＲＩ部位のヌクレオチドを含有するＤＮＡ領域を合成し、当該中間構築物のＥｃｏＲＩ部位へとサブクローニングし、ＦＶＩＩ−１３３を作製した（図４Ａ）。
実施例２．ＦＶＩＩ−１３３の一過性発現
ＦＶＩＩ−１３３の発現のために、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、ビタミンＫ３（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を２μｇ／リットルまで補充したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（増殖培地）中で、懸濁細胞として３７℃／１０％ ＣＯ２で増殖させた。細胞は、３〜４日ごとに５ｘ１０５細胞／ｍｌの細胞密度で播種して継代培養した。
トランスフェクションの２４時間前に、細胞を７ｘ１０５細胞／ｍｌの密度で増殖培地中に播種した。トランスフェクションの日に、トランスフェクション溶液を、トランスフェクションされる細胞培養物の総量の５％と等しい量で作製した。トランスフェクション溶液中で、増殖培地に溶解して作製したばかりのＰＥＩ溶液（６０ｍｇ／Ｌ）に、ＤＮＡを添加した（最終濃度２０ｍｇ／Ｌ）。溶液を３０秒間攪拌し、室温で５分間インキュベートして、直接、細胞培養物へと添加した。４時間後、ビタミンＫ３および２００ｍＭのＬ−グルタミンを補充された細胞培養物の量と等しい量のＯｐｔｉＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を細胞に添加した。細胞培養を行い、上述のように増殖させ、毎日、培地試料を採取してタンパク質発現を評価した。採取の日に、細胞をスピンダウンして、プロテインＡプルダウンによるタンパク質精製またはタンパク質分析に備え、培地をろ過した。ＦＶＩＩ−１３３の発現のために、ＦＶＩＩ−１３３をコードするプラスミドを、ｓＴＦにＦｃを結合しているリンカー中のプロペプチドエンドペプチダーゼ部位を確実に開裂するために、プロペプチドエンドペプチダーゼＰＣ５をコードするプラスミドとともに共トランスフェクションした（図４Ａ）。
実施例３．一過性トランスフェクションから生成されたタンパク質の分析
一過性トランスフェクション由来のタンパク質の分析のために、ＦＶＩＩ−１３３とＰＣ５の共トランスフェクションから得られた馴化培地を、プロテインＡ免疫沈降へと供した。簡潔に述べると、細胞培養上清をおよそ５０μｌのプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ５０％スラリーと混合し、４℃で１時間、振動させながらインキュベートし、次いで、プロテインＡビーズを沈殿させるために遠心した。１ｍｌのＰＢＳに再懸濁、遠心および吸引（アスピレート）することによりビーズを２度、洗浄した。標準プロトコールに従い、ビーズを、還元条件下、または非還元条件下で、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）緩衝液で再懸濁し、５分間、１００℃で加熱し、スピンダウンし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードして泳動した。非還元条件下では、トロンビン活性化可能なＦＶＩＩ−Ｆｃ／ｓＴＦ−Ｆｃ二量体に対する予想分子量を有する１つのバンドが観察された（図４Ｃ）。還元条件下では、トロンビン活性化可能なＦＶＩＩ−ＦｃサブユニットおよびｓＴＦ−Ｆｃサブユニットを表す２つのバンドが観察された。
実施例４．ＦＶＩＩ−１３３の小スケール精製
ＦｃＲｎ Ｌｏａｄ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒ（０．５ｍｌ）を、ＦＶＩＩ−１３３で一過性トランスフェクションされた細胞由来のろ過された馴化培地５ｍｌへと添加した。ｐＨ調整した培地（約５．５ｍｌ）を、３０，０００ＭＷＣＯ、１５ｍｌの遠心フィルターユニット（カタログ＃ＵＦＣ ９０３００８）を用いて濃縮した。培地を１０分（‘）の間、４０００ｒｐｍで約２００ｕｌの量まで遠心し、チューブへと移して、量を、平衡緩衝液で４００ｕｌまで調整した。１０ｕｌのＦｃＲｎ樹脂を添加し、混合物を４℃で一晩、回転させた。樹脂を含む馴化培地をミニカラムにロードし、３０秒（“）の間、２０００ｒｐｍで遠心した。カラムを平衡緩衝液でしっかりと洗浄した。タンパク質を３０ｕｌの溶出緩衝液で溶出した。溶出緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０２％のＴｗｅｅｎ−８０（ｐＨ ７．５）を含有する。ＦｃＲｎ Ｌｏａｄ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒは、０．５ＭのＭＥＳおよび０．２％のＴｗｅｅｎ−８０（ｐＨ６．０）を含有する。ＦｃＲｎ樹脂は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに結合された可溶性ＦｃＲｎを含有する。平衡緩衝液は、１０ｍＭのＭＥＳ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＴｗｅｅｎ−８０（ｐＨ６．２）を含有する。
溶出された物質を、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。トロンビン活性化可能なＦＶＩＩ−ＦｃおよびｓＴＦ−Ｆｃサブユニットに対する予想分子量を有する２つのバンドが観察された（図５）。
実施例５．プロトロンビン時間分析によるＦＶＩＩ−１３３の活性
ＦＶＩＩａＦｃおよび精製ＦＶＩＩ−１３３の活性を、Ｄａｄｅ Ｉｎｎｏｖｉｎ試薬（Ｓｉｅｍｅｎｓ ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ ５３９１９６）（ＦＶＩＩａを含む、総ＦＶＩＩの活性を測定する）を用いた、プロトロンビン時間により測定した。メーカーの推奨に従った。ＦＶＩＩａＦｃに対してはおよそ１０，０００ＩＵ／ｍｇの活性が観察されたが、ＦＶＩＩ−１３３の活性は定量レベル以下であった。それゆえ、トロンビンの非存在下では、ＦＶＩＩ−１３３は、チモーゲンおよび不活性形態のままであった。
実施例６．トロンビン生成分析における、ＦＶＩＩ−１３３およびＦＶＩＩａＦｃの活性
トロンビン生成分析を、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ蛍光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および試薬、ならびに、メーカーの推奨に従い、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅの分析ソフトウェアで実施した。簡潔に述べると、ヒト血小板を５．４ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１４６ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８で洗浄し、ＦＶＩＩＩ欠損ヒト血漿（Ｓｉｅｍｅｎｓ）に再懸濁して、２ｘ１０８血小板／ｍｌの血小板濃度で血小板富化血漿（ＰＲＰ）を作製した。各反応は、示される場合、ＦＶＩＩＩ欠損ＰＲＰ、校正物質（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ）またはＴｙｒｏｄｅの緩衝液（１５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５．５ｍＭデキストロース、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、ＦＶＩＩ−１３３またはＦＶＩＩａＦｃ（５０ｎＭ最終濃度）および、脂質富化された組織因子（１／８希釈でのＰＲＰ試薬、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ）を含有した。内因性ＦＶＩＩａとの複合体としての組織因子は、少量のトロンビン生成を誘導することにより、反応を活性化することが予期される。図６に示されるように、ＦＶＩＩ−１３３は、組織因子（ＴＦ）の存在下、または非存在下で、ＦＶＩＩａＦｃよりも、より高い活性を示した。興味深いことに、ＦＶＩＩ−１３３は、ＴＦの存在下、または非存在下で、同様の活性を示したが、プロトロンビン時間分析は、ＦＶＩＩ−１３３は、トロンビンの非存在下では活性を有していないことを示している。このことから、ＰＲＰ中の微量のトロンビンまたはＴＦ（同様に、内因性ＦＶＩＩａとトロンビンを生成することができる）で、ＦＶＩＩ−１３３を活性化するのに十分であることが示唆される。さらに、これらのデータから、ＦＶＩＩ−１３３は、いったん活性化されると、高い活性を有する可能性があることを示している。
実施例７．Ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｅｌａｓｔｏｍｅｔｒｙアッセイにおける、ＦＶＩＩ−１３３およびＦＶＩＩａＦＣの活性
ＦＩＸ欠損マウスから採取したクエン酸化血液を、これらの実験に用いた。Ｔｈｒｏｍｂｏｅｌａｓｔｏｍｅｔｒｙは、ＲＯＴＥＭ分析器（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ）で、メーカーの推奨に従い行われた。簡潔に述べると、２８０ｕｌの血液を前もって温めたＲＯＴＥＭプラスチックカップへと移し、ＦＶＩＩａＦｃまたはＦＶＩＩ−１３３を最終濃度５０ｎＭまで添加した。ＥＸＴＥＭ試薬（ＴＦおよびカルシウム）を添加し、反応を開始させた。凝固時間（ＣＴ）およびα角を測定した。図７に示されるように、ＦＶＩＩ−１３３およびＦＶＩＩａＦｃの両方が、それぞれ、ビヒクルよりも有意に低いまたは高い凝固時間およびα角を示した。低い凝固時間および高いα角は、止血活性の増加を示唆する。これらのデータから、ＦＶＩＩ−１３３は、トロンビンで活性化された際、高い活性を示しうることが示唆される。
実施例８．活性化可能なＦＶＩＩおよび増強部分を含有する別のキメラ凝固因子の生成
図２に解説されるように、トロンビン活性化可能なＦＶＩＩ（その後にリンカーおよび増強部分（「増強部分」とも呼称される）が続く）の発現のための構築物を作製する。１つの実施態様において、増強部分は可溶性組織因子（成熟配列の１〜２１９残基）である。他の実施態様において、増強部分は、凝固促進ペプチドＳＹＮ３７３１またはＳＹＮ３５２４ (国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４１７７７（２０１２年６月９日出願。ＷＯ２０１２／１７０９６９として公開。その全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと)である。他の実施態様において、増強部分は、ＦＶＩＩａの活性を増加させる抗体由来の抗体断片である。たとえば、ＦＶＩＩａの活性を増強させる抗体は、Andersen LM et al. J Biol Chem. 287: 8994-9001 (Jan. 24, 2012)に、公開された。これらの構築物は哺乳類細胞中で一過性に発現され、精製され、上述のように活性（プロトロンビン時間、トロンビン生成およびＲＯＴＥＭアッセイ）を検証される。
実施例９．Ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｅｌａｓｔｏｍｅｔｒｙアッセイによる、ヒト血友病Ａ血液中のＦＶＩＩ−１３３のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
凝固活性を測定するために、ＦＶＩＩ−１３３タンパク質を血友病Ａドナー由来のクエン酸化ヒト全血に添加した。凝固はＣａＣｌ２の添加により開始された；凝固時間、凝固形成時間およびα角は、メーカーの推奨に従い、ＲＯＴＥＭ分析器（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ）で測定された。ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩ−１８４を並行して検証した；ＦＶＩＩａを活性の比較対照として用いて、ＦＶＩＩ−１８４は、融合タンパク質それ自身により活性化されうる内因性ＦＶＩＩａの寄与を測定するための対照として用いた（ＦＶＩＩ−１８４は、トロンビン開裂部位に必須のＡｒｇをＡｌａへと変異させたことによって、トロンビン活性化に非感受性となるよう設計された他は、ＦＶＩＩ−１３３と同じであるため）。図８に示されるように、この血友病Ａドナーにおける凝固時間は、２５００秒を記録した。全血にＦＶＩＩ−１３３を添加することにより、用量依存的に凝固時間がずっと短くなった。ＦＶＩＩ−１３３の１０および２ｎＭで記録された凝固時間は、それぞれ、ｒＦＶＩＩａの５０、１０ｎＭよりも短かった。凝固時間プロファイルに基づき、ＦＶＩＩ−１３３の活性は、ＦＶＩＩａよりも少なくとも１０倍高いことが推定された。ＦＶＩＩ−１３３の早い凝固時間は、その短い凝固形成時間および高いα角と相関し、ＦＶＩＩ−１３３の高い止血活性と一致した。ＦＶＩＩ１３３のトロンビン開裂部位の不活化により、大幅にその活性は減少した（ＦＶＩＩ−１８４の活性として、それは５０ｎＭでのみ検出可能で、ＦＶＩＩａよりもずっと低いものであったことから、ＦＶＩＩ−１３３の活性はそれ自身のトロンビン活性化されたＦＶＩＩａによりもたらされたものであり、内因性ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａによるものではないことが示唆された）。
実施例１０．ＲＯＴＥＭ分析による、ｈｅｍＢマウスにおけるＦＶＩＩ−１３３のｅｘ ｖｉｖｏ有効性
ｅｘ ｖｉｖｏの有効性を評価するために、血友病Ｂ（ｈｅｍＢ）マウスに、２０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＶＩＩ−１３３、または対照のｒＦＶＩＩａタンパク質を尾静脈注射で投与した。投与の２．５時間後、マウスから大静脈出血を介して、９：１のＣＴＩ比率で血液を採取した。血液に再度カルシウムを浸透させ、ただちにＲＯＴＥＭ分析器で測定した。図９に示すように、測定されたｈｅｍＢ血液の平均凝固時間は約１８００秒であった一方で、ＦＶＩＩ−１３３を注射されたマウスの全血の凝固時間はずっと短く、およそ５００秒であったことから、ＦＶＩＩ−１３３はｉｎ ｖｉｖｏで活性であったことが示唆された。
実施例１１．ｒＦＶＩＩａＦｃを超えて改善されたＦＶＩＩ−１３３のＰＫプロファイル
ＦＶＩＩ−１３３は、ＦＶＩＩチモーゲンとして循環するよう設計されたことから、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）介在クリアランスに対する感受性が低いことが予測される。ＦＶＩＩ−１３３の薬物動態特性を評価するために、精製ＦＶＩＩ−１３３、ｒＦＶＩＩａＦｃおよびｒＦＶＩＩａを１０ｎｍｏｌ／ｋｇでｈｅｍＢマウス（ｎ＝４）へと静脈内投与し、血漿試料を様々な時点で大静脈出血を介して採取した後、ＥＬＩＳＡアッセイによりＦＶＩＩ抗原、およびＦＶＩＩ−ＡＴＩＩＩ複合体に対して分析した。薬物動態パラメータは、Ｐｈｏｅｎｉｘプログラム（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）を用いたＰＫモデリングにより評価した。ＦＶＩＩ−１３３またはｒＦＶＩＩａＦｃのいずれかよりも、ｒＦＶＩＩａはかなり急速にクリアランスされたため（図１０Ａ）、我々は、ＦＶＩＩ−１３３の薬物動態分析に対する比較対照として、ｒＦＶＩＩａＦｃを用いた（図１０Ｂ）。時間曲線に対するタンパク質の血漿濃度は、２コンパートメントモデルに非常によく適合することが判明した；表４に示されるように、すべてのＰＫパラメータは、ｒＦＶＩＩａＦｃを超えるＦＶＩＩ−１３３の際立った改善を示唆した（より長い終末相半減期（ベータ半減期はそれぞれ、７．７８時間に対して１６．５６時間）およびより長い平均残留時間（ＭＲＴは７．４５時間に対し１９．２９時間））。
表４ ＰＫパラメータ：ＦＶＩＩ−１３３対ＦＶＩＩａＦｃ
さらに、かなりの量のｒＦＶＩＩａＦｃ／ＡＴＩＩＩ複合体が検出された一方で、血漿中のＦＶＩＩ−１３３／ＡＴＩＩＩ複合体はほとんど検出されなかった。これらの結果を合わせると、ＦＶＩＩ−１３３は、ＡＴＩＩＩ介在クリアランスを上手く回避しており、それによって、ｒＦＶＩＩａＦｃを超える、ＰＫプロファイルの著しい改善がもたらされたことが示唆される。
実施例１２．ＨｅｍＡマウスにおいて、ｒＦＶＩＩａを超えて延長されたＦＶＩＩ−２１２のＥｘ ｖｉｖｏ有効性
ＦＶＩＩ−２１２はＦＶＩＩ−１３３と同一であるが、改善発現ベクターにコードされている。ＦＶＩＩ−１３３と同様、ＦＶＩＩ−２１２は、ヒトＨｅｍＡ血液において、ＲＯＴＥＭアッセイに対しｒＦＶＩＩａよりも高いｉｎ ｖｉｔｒｏ凝固活性を示した（図１１）。しかしながら、ＨｅｍＡマウスの血液においては、ＦＶＩＩ−２１２の活性は、ｒＦＶＩＩａと類似していることが判明し（図１２）、このことから、ＦＶＩＩ−２１２は、ヒトよりもマウスにおいて活性が低いことが示唆された。
ＦＶＩＩ−２１２のｅｘ ｖｉｖｏ有効性を評価し、実施例１０の発見（ＨｅｍＢマウスにおけるＦＶＩＩ−１３３のｅｘ ｖｉｖｏ有効性）を裏付けるために、ＦＶＩＩ−２１２を１０ｎｍｏｌ／ｋｇでＨｅｍＡマウスに投与した；血液を様々な時点で採取し、凝固活性をＮＡＴＥＭプログラムの下、ＲＯＴＥＭ分析器により測定した。ｒＦＶＩＩａは、比較対照として並行して処理した。図１３に示されるように、投与後５分で採取された血液の凝固時間はｒＦＶＩＩ−２１２処置群およびｒＦＶＩＩａ処置群の間で類似であったが、もっと遅い時点で採取されたＦＶＩＩ−２１２群の血液は、ｒＦＶＩＩａ群の同じ時点で採取された血液よりも早く凝固した。この結果から、ｒＦＶＩＩａと比較して、ＦＶＩＩ−２１２のｅｘ−ｖｉｖｏ有効性が延長されたことが示唆される。
実施例１１に示されるように、ＦＶＩＩ−１３３はＨｅｍＢマウスにおいてｒＦＶＩＩａＦｃを超えるＰＫ特性の改善を示し、これは、このタンパク質の有効性の延長に寄与すると考えられた。ＨｅｍＢマウスにおけるＦＶＩＩ−１３３と同様に、ＨｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩ−２１２のクリアランスも、ｒＦＶＩＩａのそれよりもかなり遅く（図１４）、より長い終末相半減期は約１８時間であり（比較として、ｒＦＶＩＩａ活性で測定された場合の、ｒＦＶＩＩａのＨｅｍＡ血漿における半減期は約１時間）、ならびに、処置ＨｅｍＡマウスにおけるｒＦＶＩＩ−２１２−ＡＴＩＩＩ複合体は検出されなかった。
これらを合わせると、本実施例は上述の知見をさらに広げ、１）ＦＶＩＩ−２１２はＨｅｍＡマウスにおいて、ｒＦＶＩＩａを超えるｅｘ ｖｉｖｏ有効性の延長を示す；２）ＦＶＩＩ−２１２の有効性の延長は、ＰＫ特性が改善されたことによる；および、３）ＡＴＩＩＩ阻害に対する抵抗性によって、少なくとも部分的には、ＦＶＩＩ−２１２のＰＫが改善される、ことが示された。
実施例１３．ＦＶＩＩ−２１２のアミド分解活性
ＦＶＩＩ−２１２のアミド分解活性を、クロモザイム（ｃｈｒｏｍｏｚｙｍｅ）ｔ−ＰＡ基質を用いたトロンビン活性化の前後で測定した。トロンビン活性化に対しては、ＦＶＩＩ−２１２（１００ｎＭ）を２０分間、３７℃で、トロンビン（５０ｎＭ）とともに処置した。次いで、トロンビンをヒルジン（２５０ｎＭ）で阻害した。
図１５に示すように、ＦＶＩＩ−２１２はトロンビン活性化の前には活性を示さなかった。トロンビン活性化の後、ＦＶＩＩ−２１２に関連したアミド分解活性は、等モルレベルのｒＦＶＩＩａで観察されたものよりも高かった。これらのデータから、ＦＶＩＩ−２１２の活性はトロンビン活性化に依存したものであることが示唆される。
実施例１４．ＰＡＢＣ自己犠牲的リンカーを有するトロンビン活性化可能な凝固促進化合物
６つの異なるペプチド（化合物１〜６と指定される）、を本明細書に開示される実験に用いた（表５）。化合物１〜６の配列は、凝固因子またはその断片（この特定の実施例においては、ＦＸ）のＮ末端への、トロンビン開裂可能な基質および自己犠牲的スペーサーの連結を複製する。これらの化合物は、ＦＸａ凝固因子の重鎖の６つのＮ末端アミノ酸残基（Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ）を含有し、本明細書に開示される凝固促進化合物デザインの、凝固因子への適用可能性を示すモデルとして供される。
図１８において、１４ｎＭのトロンビンによる化合物１、２および３の開裂を図示する。この特定の実施例においては、水に溶解した５０μｌのペプチド（１ｍＭ）を、９００μＬのＰＢＳに添加し、次いで、５０μＬのトロンビン（２７８ｎＭ、１０μｇ／ｍＬ）を添加し、以下の概算開始濃度とした：トロンビン＝１４ｎＭ、ペプチド＝５０μＭ。混合物を室温でインキュベートした。様々な時点で分注物（９５μＬ）を、５μＬのヒルジン（２μＭ）でクエンチし、ＨＰＬＣ（Ｃ−１８カラム、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ、１２分をかけて０〜７０％、６０℃、０．５ｍＬ／分、λ＝２８０ｎｍ）へ注入した。ペプチドピークエリアの縮小を用いて産生量を算出した。
化合物２および３と比較して、トロンビン開裂可能な合成基質Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇおよび自己犠牲的スペーサーＰＡＢＣを組み込んだ構築物（化合物１）は、トロンビンに対し、より良い基質であった。化合物１へのＰＡＢＣの組み込みにより、化合物２と比較し、開裂率は少なくとも１０倍高くなった。
図１９において、１．４ｎＭトロンビンによる化合物１、４、５および６の開裂を図示する。化合物１、４および５は、ＰＡＢＣおよび異なるトロンビン開裂可能な基質を組み込んでいる。水に溶解した５０μＬのペプチド（１ｍＭ）を９００μＬのＰＢＳに添加した。混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、５０μＬのトロンビン（２７．８ｎＭ、１μｇ／ｍＬ）を添加して、以下の概算開始濃度とした：トロンビン＝１．４ｎＭ、ペプチド＝５０μＭ。混合物を３７℃でインキュベートした。様々な時点で分注物（９５μＬ）を、５μＬのヒルジン（２μＭ）でクエンチし、ＨＰＬＣ（Ｃ−１８カラム、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ、１２分をかけて０〜７０％、６０℃、０．５ｍＬ／分、λ＝２８０ｎｍ）へ注入した。ペプチドピークエリアの縮小を用いて産生量を算出した。
化合物１は、化合物４および５よりも、トロンビンに対する良い基質であった。１．４ｎＭ（トロンビンの生理学的関連濃度）で、化合物１の３０％が素早く開裂され、放出された。対照的に、ＰＡＢＣリンカーの無い化合物６のペプチドＩＶＧＧＱＥのトロンビン介在性放出は観察されなかった。
実施例１５．ＳＵＭＯ開裂部位を有するトロンビン活性化可能なＦＶＩＩ−１８６
ＦＶＩＩ−１８６のクローニングに対しては、ＦＶＩＩ−１８６のＨｉｎｄＩＩＩ部位からＥｃｏＲＩ部位のヌクレオチドを含有するＤＮＡ配列（表＃）を合成した。ＤＮＡをｐｃＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位へとサブクローニングした。
ＦＶＩＩ−１８６の一過性発現のために、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、ビタミンＫ３（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を２μｇ／リットルまで補充したＦＲＥＥＳＴＹＬＥ培地（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（増殖培地）の懸濁液中で、懸濁細胞として３７℃／１０％ ＣＯ２で増殖させた。細胞は、３〜４日ごとに５ｘ１０５細胞／ｍｌの細胞密度で播種して継代培養した。トランスフェクションの２４時間前に、細胞を７ｘ１０５細胞／ｍｌの密度で増殖培地中に播種した。トランスフェクションの日に、トランスフェクション溶液を、トランスフェクションされる細胞培養物の総量の５％と等しい量で作製した。トランスフェクション溶液中で、増殖培地に溶解して作製したばかりのＰＥＩ溶液（６０ｍｇ／Ｌ）に、ＤＮＡを添加した（最終濃度２０ｍｇ／Ｌ）。溶液を３０秒間攪拌し、室温で５分間インキュベートして、直接、細胞培養物へと添加した。４時間後、ビタミンＫ３および２００ｍＭのＬ−グルタミンを補充された細胞培養物の量と等しい量のＯＰＴＩＣＨＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を細胞に添加した。細胞培養を行い、上述のように増殖させ、毎日、培地試料を採取してタンパク質発現を評価した。採取の日に、細胞をスピンダウンして、プロテインＡプルダウンによるタンパク質精製またはタンパク質分析に備え、培地をろ過した。ＦＶＩＩ−１８６の発現に対しては、ＳＵＭＯにＦＶＩＩ軽鎖を結合しているリンカー中の前駆タンパク質転換酵素開裂部位（２Ｘ（ＲＫＲ）配列番号３）を確実に細胞内プロセッシングおよび開裂するために、ＦＶＩＩ−１８６をコードするプラスミドを、前駆タンパク質転換酵素ＰＡＣＥをコードするプラスミドとともに共トランスフェクションした（図２２）。
ＦＶＩＩ−１８６の精製のために、２．０ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）でｐＨ７．４に調整した後のＱ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の２５ｍＬカラム上に馴化培地をロードした。カラムを１０ｍＭのＭＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．５）で洗浄した。タンパク質は、１０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ６．５）で溶出した。ＦＶＩＩ−１８６を含有する分画をプールし、０．５ＭのＭＥＳ（ｐＨ５．５）でｐＨ６．２に調整した後のｒｈＦｃＲｎセファロースの２５ｍＬカラム上にロードした。５０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．２）で洗浄した後、結合した物質を１０ｍＭのＴｒｉｓ、２５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
ＦＶＩＩ−１８６を、以下のようにＳＵＭＯプロテアーゼにより開裂した。ＦＶＩＩ−１８６（０．８３ｍｇ／ｍＬ、１０μＬ）を、１０μＬの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００４％ Ｔｗｅｅｎ８０（０．４ｍＭの酸化グルタチオン含有）（ＧＳＳＧ）、２０ｍＭグルタチオン（ＧＳＨ）、０．２Ｕ／μＬ ＳＵＭＯプロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ． Ｎｏ．１２５８８−０１８）と４８時間、室温でインキュベートした。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２３、レーン３）において、所望のＦＶＩＩＨＣへのＦＶＩＩ−１８６のほぼ完全な転換が示された。
ＦＶＩＩ−１８６のＳＵＭＯプロテアーゼ開裂およびチオエステルペプチドとの天然型化学ライゲーションのために、ＦＶＩＩ−１８６（０．８３ｍｇ／ｍＬ、１０μＬ）を、１０μＬの、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００４％ Ｔｗｅｅｎ８０（陽性対照ペプチドとして０．４ｍＭ ＳＹＮ４７０含有）、０．４ｍＭ ＧＳＳＧ、２０ｍＭ ＧＳＨ、０．２Ｕ／μＬ ＳＵＭＯプロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ． Ｎｏ．１２５８８−０１８）と共に、室温で４８時間インキュベートした。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図＃、レーン４）において、ＦＶＩＩＨＣバンドの完全な消失および、陽性ペプチド対照とＦＶＩＩＨＣの結合物としての新たな１つのバンドが示された。
トロンビン活性化可能なＦＶＩＩ−１８６（ＴＡ−ＦＶＩＩ−１８６）を合成するために、ＦＶＩＩ−１８６（０．８３ｍｇ／ｍＬ、２００μＬ）を、２００μＬの、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００４％ Ｔｗｅｅｎ８０（０．４ｍＭ ＦＶＩＩ−ＰＡＢＣペプチド（すなわち、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ＰＡＢＣ−ＩＶＧＧＫＶ−ＣＯＳＢｎ）（配列番号６６）を含有）、０．４ｍＭ ＧＳＳＧ、２０ｍＭ ＧＳＨ、０．２Ｕ／μＬ ＳＵＭＯプロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ． Ｎｏ．１２５８８−０１８）とともに４８時間、室温でインキュベートし、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２３、レーン５）で分析した。反応混合物を０．５ｍＬの透析カセット（１０ｋ ＭＷＣＯ）に置き、１Ｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０（０．４ｍＭ ＧＳＳＧ、２ｍＭ ＧＳＨを含有）に対して、４℃で２４時間、透析した。結合物をさらに、上述のｒｈＦｃＲｎセファロースカラムにより精製した。
ＦＶＩＩａ発色アッセイを、トロンビン開裂およびＴＡ−ＦＶＩＩ−１８６の活性化の後に実施した（図２４）。このアッセイは、活性化されたＦＸ（ＦＸａ）により開裂される発色基質のレベルを測定することにより決定される、ＦＶＩＩａのＦＸを活性化する能力を測定することにより、ＦＸ活性化の活性度を測定する。ＴＡ−ＦＶＩＩ−１８６（２００ｎＭ）をトロンビン（１４０ｎＭ）で２０分間、３７℃で活性化した。トロンビンをクエンチするためにヒルジンを添加した。ｓＴＦ−ＰＬ混合物（ＳＴＡＣＬＯＴ（登録商標）ＦＶＩＩ−ｒＴＦキット）、ＦＸおよびＰＥＦＡＣＨＲＯＭＥ（登録商標）ＦＸａ基質を添加し、反応を、４０５ｎｍの吸光度を測定することによりモニターした。６つのＮ末端アミノ酸が無いＦＶＩＩ−１８６は、トロンビンの存在下で活性化しなかった。完全重鎖ＦＶＩＩに連結されたトロンビン開裂部位を有するＴＡ−ＦＶＩＩ−１８６のみが、トロンビン開裂後の活性を示した。活性が得られたことは、ＦＶＩＩの断片化重鎖のＮ末端システインにＦＶＩＩ ＰＡＢＣペプチドが成功裏に結合されたことを示し、重要なＮ末端イソロイシン残基が、トロンビンによる開裂で生成され、形成されたタンパク質が活性にとって必須の構造を有したことを示す。
本発明は、特定の機能およびその関連物の実施を解説するための機能的構成要素を用いて、上記のように記述される。これらの機能的構成要素の境界は、記述を簡便にするために本明細書において任意に定義されたものである。特定された機能およびその関連物がおおよそで実施される範囲内で、別の境界を定義することもできる。
特定の実施態様に関する上記の記述により、本発明の一般概念から逸脱することなく、当業者公知の知識を適用することによって、過度の実験を行うことなく他者がそのような特定の実施態様を容易に改変、および／または、様々な応用のために適合することができる、本発明の一般的性質が完全に明らかとなる。それゆえ、そのような適合および改変は、本明細書に提示される教示および示唆に基づく、本開示実施態様の均等の範囲内および同等の手段であることが意図される。本明細書の表現または専門用語は、本教示および示唆の観点から当業者が本明細書の表現または専門用語を解釈するための記述を目的としたものであり、限定ではない。
本発明の範囲は、上述の例示的な実施態様のいずれによっても限定されるべきではなく、以下の請求項およびその均等物に従ってのみ、定義されるべきである。本発明の他の実施態様は、本明細書に開示される本発明の実施および本明細書内容の検討から、当業者に明らかである。
本明細書に引用される全ての特許および公表文献は、参照によりその全体で本明細書に援用される。
配列表
配列番号４４ ＦＶＩＩ−１３３のＤＮＡ配列
配列番号４５ ＦＶＩＩ−１３３のアミノ酸配列。シグナル配列は点線の下線で示され、プロペプチドは波下線で示され、軽鎖と重鎖の間に挿入されたトロンビン開裂部位は二重下線で示され、Ｆｃ領域にＦＶＩＩを連結するリンカー領域は下線で示され、ＦｃとｓＴＦを連結する前駆タンパク質転換酵素プロセッシング部位を有するリンカーは、太字で示され、ｓＴＦをＦｃに連結するリンカー領域は破線の下線で示される。軽鎖は３９〜１８９残基にわたり、重鎖は１９５〜４４８残基にわたり、ｓＴＦは７４２〜９６０残基にわたる。
配列番号４６ ＦＶＩＩ−１８４のＤＮＡ配列
配列番号４７ ＦＶＩＩ−１８４のアミノ酸配列。シグナル配列は点線の下線で示され、プロペプチドは波下線で示され、軽鎖と重鎖の間に挿入された、変異トロンビン開裂部位（Ａｒｇ→Ａｌａ変異、１９４位残基、太字）は二重下線で示され、Ｆｃ領域にＦＶＩＩを連結するリンカー領域は下線で示され、ＦｃとｓＴＦを連結する前駆タンパク質転換酵素プロセッシング部位を有するリンカーは、太字で示され、ｓＴＦをＦｃに連結するリンカー領域は破線の下線で示される。軽鎖は３９〜１８９残基にわたり、重鎖は１９５〜４４８残基にわたり、ｓＴＦは７４２〜９６０残基にわたる。
配列番号３２
＞ＣＴＰ ペプチド１
DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL

配列番号３３
＞ＣＴＰ ペプチド２
SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ

配列番号３６
＞ＰＡＳ ペプチド１
ASPAAPAPASPAAPAPSAPA

配列番号３７
＞ＰＡＳ ペプチド２
AAPASPAPAAPSAPAPAAPS

配列番号３８
＞ＰＡＳ ペプチド３
APSSPSPSAPSSPSPASPSS

配列番号３９
＞ＰＡＳ ペプチド４
APSSPSPSAPSSPSPASPS

配列番号４０
＞ＰＡＳ ペプチド５
SSPSAPSPSSPASPSPSSPA

配列番号４１
＞ＰＡＳ ペプチド６
AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA

配列番号４２
＞ＰＡＳ ペプチド７
ASAAAPAAASAAASAPSAAA

配列番号３５
＞アルブミン結合ペプチドコア配列
DICLPRWGCLW


配列番号４８
＞ＧＦＰタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＡＧ３４５２１．１）
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTL
VTTFGYGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLV
NRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLAD
HYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKSR
TSGSPGLQEFDIKLIDTVDLESCN

配列番号４９
＞例：単鎖ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（下線のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーを有するＦｃ配列）
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS
DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGG
GSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV
KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE
KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT
TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号５０
＞成熟型ヒトアルブミンタンパク質配列（ＮＣＢＩ 参照配列ＮＰ＿０００４６８由来）
RGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCV
ADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPR
LVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADK
AACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKL
VTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVE
NDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYE
TTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKK
VPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVT
KCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVK
HKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL

配列番号５１
＞アルブミン結合ペプチド１
RLIEDICLPRWGCLWEDD

配列番号５２
＞アルブミン結合ペプチド２
QRLMEDICLPRWGCLWEDDF

配列番号５３
＞アルブミン結合ペプチド３
QGLIGDICLPRWGCLWGDSVK

配列番号５４
＞アルブミン結合ペプチド４
GEWWEDICLPRWGCLWEEED

配列番号５５
＞システイン含有ペプチド
GGGSGCGGGS

配列番号５６
＞ヒトＬＲＰ１配列（シグナルペプチドおよび膜貫通セグメントは下線；ＮＣＢＩ参照配列：ＣＡＡ３２１１２）
MLTPPLLLLLPLLSALVAAAIDAPKTCSPKQFACRDQITCISKGWRCDGERDCPDGSDEA
PEICPQSKAQRCQPNEHNCLGTELCVPMSRLCNGVQDCMDGSDEGPHCRELQGNCSRLGC
QHHCVPTLDGPTCYCNSSFQLQADGKTCKDFDECSVYGTCSQLCTNTDGSFICGCVEGYL
LQPDNRSCKAKNEPVDRPPVLLIANSQNILATYLSGAQVSTITPTSTRQTTAMDFSYANE
TVCWVHVGDSAAQTQLKCARMPGLKGFVDEHTINISLSLHHVEQMAIDWLTGNFYFVDDI
DDRIFVCNRNGDTCVTLLDLELYNPKGIALDPAMGKVFFTDYGQIPKVERCDMDGQNRTK
LVDSKIVFPHGITLDLVSRLVYWADAYLDYIEVVDYEGKGRQTIIQGILIEHLYGLTVFE
NYLYATNSDNANAQQKTSVIRVNRFNSTEYQVVTRVDKGGALHIYHQRRQPRVRSHACEN
DQYGKPGGCSDICLLANSHKARTCRCRSGFSLGSDGKSCKKPEHELFLVYGKGRPGIIRG
MDMGAKVPDEHMIPIENLMNPRALDFHAETGFIYFADTTSYLIGRQKIDGTERETILKDG
IHNVEGVAVDWMGDNLYWTDDGPKKTISVARLEKAAQTRKTLIEGKMTHPRAIVVDPLNG
WMYWTDWEEDPKDSRRGRLERAWMDGSHRDIFVTSKTVLWPNGLSLDIPAGRLYWVDAFY
DRIETILLNGTDRKIVYEGPELNHAFGLCHHGNYLFWTEYRSGSVYRLERGVGGAPPTVT
LLRSERPPIFEIRMYDAQQQQVGTNKCRVNNGGCSSLCLATPGSRQCACAEDQVLDADGV
TCLANPSYVPPPQCQPGEFACANSRCIQERWKCDGDNDCLDNSDEAPALCHQHTCPSDRF
KCENNRCIPNRWLCDGDNDCGNSEDESNATCSARTCPPNQFSCASGRCIPISWTCDLDDD
CGDRSDESASCAYPTCFPLTQFTCNNGRCININWRCDNDNDCGDNSDEAGCSHSCSSTQF
KCNSGRCIPEHWTCDGDNDCGDYSDETHANCTNQATRPPGGCHTDEFQCRLDGLCIPLRW
RCDGDTDCMDSSDEKSCEGVTHVCDPSVKFGCKDSARCISKAWVCDGDNDCEDNSDEENC
ESLACRPPSHPCANNTSVCLPPDKLCDGNDDCGDGSDEGELCDQCSLNNGGCSHNCSVAP
GEGIVCSCPLGMELGPDNHTCQIQSYCAKHLKCSQKCDQNKFSVKCSCYEGWVLEPDGES
CRSLDPFKPFIIFSNRHEIRRIDLHKGDYSVLVPGLRNTIALDFHLSQSALYWTDVVEDK
IYRGKLLDNGALTSFEVVIQYGLATPEGLAVDWIAGNIYWVESNLDQIEVAKLDGTLRTT
LLAGDIEHPRAIALDPRDGILFWTDWDASLPRIEAASMSGAGRRTVHRETGSGGWPNGLT
VDYLEKRILWIDARSDAIYSARYDGSGHMEVLRGHEFLSHPFAVTLYGGEVYWTDWRTNT
LAKANKWTGHNVTVVQRTNTQPFDLQVYHPSRQPMAPNPCEANGGQGPCSHLCLINYNRT
VSCACPHLMKLHKDNTTCYEFKKFLLYARQMEIRGVDLDAPYYNYIISFTVPDIDNVTVL
DYDAREQRVYWSDVRTQAIKRAFINGTGVETVVSADLPNAHGLAVDWVSRNLFWTSYDTN
KKQINVARLDGSFKNAVVQGLEQPHGLVVHPLRGKLYWTDGDNISMANMDGSNRTLLFSG
QKGPVGLAIDFPESKLYWISSGNHTINRCNLDGSGLEVIDAMRSQLGKATALAIMGDKLW
WADQVSEKMGTCSKADGSGSVVLRNSTTLVMHMKVYDESIQLDHKGTNPCSVNNGDCSQL
CLPTSETTRSCMCTAGYSLRSGQQACEGVGSFLLYSVHEGIRGIPLDPNDKSDALVPVSG
TSLAVGIDFHAENDTIYWVDMGLSTISRAKRDQTWREDVVTNGIGRVEGIAVDWIAGNIY
WTDQGFDVIEVARLNGSFRYVVISQGLDKPRAITVHPEKGYLFWTEWGQYPRIERSRLDG
TERVVLVNVSISWPNGISVDYQDGKLYWCDARTDKIERIDLETGENREVVLSSNNMDMFS
VSVFEDFIYWSDRTHANGSIKRGSKDNATDSVPLRTGIGVQLKDIKVFNRDRQKGTNVCA
VANGGCQQLCLYRGRGQRACACAHGMLAEDGASCREYAGYLLYSERTILKSIHLSDERNL
NAPVQPFEDPEHMKNVIALAFDYRAGTSPGTPNRIFFSDIHFGNIQQINDDGSRRITIVE
NVGSVEGLAYHRGWDTLYWTSYTTSTITRHTVDQTRPGAFERETVITMSGDDHPRAFVLD
ECQNLMFWTNWNEQHPSIMRAALSGANVLTLIEKDIRTPNGLAIDHRAEKLYFSDATLDK
IERCEYDGSHRYVILKSEPVHPFGLAVYGEHIFWTDWVRRAVQRANKHVGSNMKLLRVDI
PQQPMGIIAVANDTNSCELSPCRINNGGCQDLCLLTHQGHVNCSCRGGRILQDDLTCRAV
NSSCRAQDEFECANGECINFSLTCDGVPHCKDKSDEKPSYCNSRRCKKTFRQCSNGRCVS
NMLWCNGADDCGDGSDEIPCNKTACGVGEFRCRDGTCIGNSSRCNQFVDCEDASDEMNCS
ATDCSSYFRLGVKGVLFQPCERTSLCYAPSWVCDGANDCGDYSDERDCPGVKRPRCPLNY
FACPSGRCIPMSWTCDKEDDCEHGEDETHCNKFCSEAQFECQNHRCISKQWLCDGSDDCG
DGSDEAAHCEGKTCGPSSFSCPGTHVCVPERWLCDGDKDCADGADESIAAGCLYNSTCDD
REFMCQNRQCIPKHFVCDHDRDCADGSDESPECEYPTCGPSEFRCANGRCLSSRQWECDG
ENDCHDQSDEAPKNPHCTSPEHKCNASSQFLCSSGRCVAEALLCNGQDDCGDSSDERGCH
INECLSRKLSGCSQDCEDLKIGFKCRCRPGFRLKDDGRTCADVDECSTTFPCSQRCINTH
GSYKCLCVEGYAPRGGDPHSCKAVTDEEPFLIFANRYYLRKLNLDGSNYTLLKQGLNNAV
ALDFDYREQMIYWTDVTTQGSMIRRMHLNGSNVQVLHRTGLSNPDGLAVDWVGGNLYWCD
KGRDTIEVSKLNGAYRTVLVSSGLREPRALVVDVQNGYLYWTDWGDHSLIGRIGMDGSSR
SVIVDTKITWPNGLTLDYVTERIYWADAREDYIEFASLDGSNRHVVLSQDIPHIFALTLF
EDYVYWTDWETKSINRAHKTTGTNKTLLISTLHRPMDLHVFHALRQPDVPNHPCKVNNGG
CSNLCLLSPGGGHKCACPTNFYLGSDGRTCVSNCTASQFVCKNDKCIPFWWKCDTEDDCG
DHSDEPPDCPEFKCRPGQFQCSTGICTNPAFICDGDNDCQDNSDEANCDIHVCLPSQFKC
TNTNRCIPGIFRCNGQDNCGDGEDERDCPEVTCAPNQFQCSITKRCIPRVWVCDRDNDCV
DGSDEPANCTQMTCGVDEFRCKDSGRCIPARWKCDGEDDCGDGSDEPKEECDERTCEPYQ
FRCKNNRCVPGRWQCDYDNDCGDNSDEESCTPRPCSESEFSCANGRCIAGRWKCDGDHDC
ADGSDEKDCTPRCDMDQFQCKSGHCIPLRWRCDADADCMDGSDEEACGTGVRTCPLDEFQ
CNNTLCKPLAWKCDGEDDCGDNSDENPEECARFVCPPNRPFRCKNDRVCLWIGRQCDGTD
NCGDGTDEEDCEPPTAHTTHCKDKKEFLCRNQRCLSSSLRCNMFDDCGDGSDEEDCSIDP
KLTSCATNASICGDEARCVRTEKAAYCACRSGFHTVPGQPGCQDINECLRFGTCSQLCNN
TKGGHLCSCARNFMKTHNTCKAEGSEYQVLYIADDNEIRSLFPGHPHSAYEQAFQGDESV
RIDAMDVHVKAGRVYWTNWHTGTISYRSLPPAAPPTTSNRHRRQIDRGVTHLNISGLKMP
RGIAIDWVAGNVYWTDSGRDVIEVAQMKGENRKTLISGMIDEPHAIVVDPLRGTMYWSDW
GNHPKIETAAMDGTLRETLVQDNIQWPTGLAVDYHNERLYWADAKLSVIGSIRLNGTDPI
VAADSKRGLSHPFSIDVFEDYIYGVTYINNRVFKIHKFGHSPLVNLTGGLSHASDVVLYH
QHKQPEVTNPCDRKKCEWLCLLSPSGPVCTCPNGKRLDNGTCVPVPSPTPPPDAPRPGTC
NLQCFNGGSCFLNARRQPKCRCQPRYTGDKCELDQCWEHCRNGGTCAASPSGMPTCRCPT
GFTGPKCTQQVCAGYCANNSTCTVNQGNQPQCRCLPGFLGDRCQYRQCSGYCENFGTCQM
AADGSRQCRCTAYFEGSRCEVNKCSRCLEGACVVNKQSGDVTCNCTDGRVAPSCLTCVGH
CSNGGSCTMNSKMMPECQCPPHMTGPRCEEHVFSQQQPGHIASILIPLLLLLLLVLVAGV
VFWYKRRVQGAKGFQHQRMTNGAMNVEIGNPTYKMYEGGEPDDVGGLLDADFALDPDKPT
NFTNPVYATLYMGGHGSRHSLASTDEKRELLGRGPEDEIGDPLA

配列番号５７
＞ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）
LNDIFEAQKIEWH

配列番号５８
＞リポ酸塩アクセプターペプチド２（ＬＡＰ２）
GFEIDKVWYDLDA

配列番号４
＞ＨＡＰ化（ＨＡＰｙｌａｔｉｏｎ）モチーフ、ｎ＝１〜４００
(Gly4Ser)n

配列番号５９
＞ＣＴＰ
DSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ

配列番号６５
＞ＳＵＭＯ
SLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKR
QGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG

配列番号６６
＞ＦＶＩＩ−ＰＡＢＣペプチド
D-Phe-Pip-Arg-PABC-IVGGKV-COSBn

Claims (106)

  1. （ｉ）活性化可能な凝固因子（Ａｃ）、
    （ｉｉ）増強部分（Ｅｍ）、および、
    （ｉｉｉ）任意選択的に、活性化可能な凝固因子と増強部分の間のリンカー部分（ＬまたはＬ１）、
    を含有するキメラタンパク質。
  2. 前記活性化可能な凝固因子および前記増強部分が、互いに連結されているか、または関連づけられているが、化学的に架橋されていない、請求項１に記載のキメラタンパク質。
  3. 化学式Ａｃ−Ｌ−Ｅｍ、またはＥｍ−Ｌ−Ａｃで表される構造を有し、ここで、Ａｃは、活性化可能な凝固因子を含有し；ここで、Ｌは、任意選択的なリンカー部分を含有し；および、ここで、Ｅｍは増強部分を含有する、請求項１または２に記載のキメラタンパク質。
  4. 前記活性化可能な凝固因子が、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）ならびに前記ＨＣおよび前記ＬＣの間に挿入されたプロテアーゼ開裂部位を含有する凝固因子チモーゲンを含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  5. 前記増強部分が凝固補因子、凝固促進ペプチド、または抗原結合部分を含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  6. 前記凝固因子チモーゲンがＦＶＩＩタンパク質またはＦＸタンパク質である、請求項４または５のいずれかに記載のキメラタンパク質。
  7. 前記凝固促進ペプチドが合成物質である、請求項５または６のいずれかに記載のキメラタンパク質。
  8. 前記凝固促進ペプチドが、
    （ａ）化学式Ｃ１ＬＡＳＹＣ２を含むアミノ酸配列を含有し、ここで、
    Ｌは、Ｌ−ロイシンであり、
    Ａは、Ｌ−アラニンであり、
    Ｓは、Ｌ−セリンであり、
    Ｙは、Ｌ−チロシンであり、
    Ｌ、Ａ、ＳおよびＹのうち１つまたは２つは、Ｄ−およびＬ−アミノ酸から独立して選択される置換アミノ酸と任意選択的に置換され、
    １つの追加アミノ酸が、化学式（Ｉ）のＣ１およびＣ２の間のいずれかへ任意選択的に挿入され、および、
    Ｃ１およびＣ２は、側鎖を有するアミノ酸から独立して選択され、ここで、前記Ｃ１およびＣ２の側鎖は、ループを形成するために連結されており、または、
    （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列のレトロ−、インベルソ−、またはレトロ−インベルソ変異体を含有する、
    請求項５または６のいずれかに記載のキメラタンパク質。
  9. （ａ）前記凝固因子チモーゲンが、ＦＶＩＩタンパク質を含有し、および、前記凝固補因子が組織因子タンパク質を含有する、または、
    （ｂ）前記凝固因子チモーゲンがＦＸタンパク質を含有し、および、前記凝固補因子がＦＶａタンパク質を含有する、
    請求項４〜６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  10. 前記組織因子タンパク質が、可溶性の組織因子（ｓＴＦ）である、請求項９に記載のキメラタンパク質。
  11. 前記抗原結合部分が、ＦＶＩＩタンパク質またはＦＸタンパク質に結合することができ、および、それぞれ、前記ＦＶＩＩタンパク質または前記ＦＸタンパク質の活性を増強する、抗体またはその抗原結合断片を含有する、請求項５〜１０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  12. 前記プロテアーゼ開裂部位および前記ＨＣの間に挿入される、自己犠牲部分をさらに含有する、請求項１１に記載のキメラタンパク質。
  13. 前記プロテアーゼ開裂部位が、トロンビン（第ＩＩａ因子）、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、および第Ｘａ因子からなる群から選択されるプロテアーゼにより開裂され、ここで、前記プロテアーゼ開裂部位は、前記凝固因子チモーゲンに自然発生するものではない、請求項４〜１２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  14. 前記自己犠牲部分が、ｐ−アミノベンジルカルバミン酸塩（ＰＡＢＣ）、ｐ−アミノベンジルエーテル（ＰＡＢＥ）、またはｐ−アミノベンジル炭酸塩を含有する、請求項１２または１３のいずれかに記載のキメラタンパク質。
  15. 異種部分（Ｈｅｔ）をさらに含有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  16. 前記異種部分（Ｈｅｔ）が、半減期延長物質である、請求項１５に記載のキメラタンパク質。
  17. 前記半減期延長物質が、イムノグロブリン定常領域もしくはその一部、アルブミン、トランスフェリン、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ配列、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）のβサブユニット、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合小分子、またはそれらの組み合わせを含有する、請求項１６に記載のキメラタンパク質。
  18. 前記イムノグロブリン定常領域またはその一部が、Ｆｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナーを含有する、請求項１６に記載のキメラタンパク質。
  19. 第二の異種部分（Ｈｅｔ２）および、任意選択的に、第一のリンカー部分（ＬまたはＬ１）と同一である、または異なる第二のリンカー部分（Ｌ２）をさらに含有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  20. 前記第二の異種部分（Ｈｅｔ２）が、半減期延長物質を含有する、請求項１９に記載のキメラタンパク質。
  21. 前記半減期延長物質が、イムノグロブリン定常領域もしくはその一部、アルブミン、トランスフェリン、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ配列、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）のβサブユニット、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合小分子、またはそれらの組み合わせを含有する、請求項２０に記載のキメラタンパク質。
  22. 前記イムノグロブリン定常領域またはその一部が、Ｆｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナーを含有する、請求項２１に記載のキメラタンパク質。
  23. 前記キメラタンパク質が、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、前記第一のポリペプチド鎖が、活性化可能な凝固因子（Ａｃ）を含有し、前記第二のポリペプチド鎖が、増強部分（Ｅｍ）を含有し、ここで、前記第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖が、互いに関連付けられている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  24. 前記キメラタンパク質が、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、前記第一のポリペプチド鎖が、活性化可能な凝固因子（Ａｃ）、前記第一の異種部分（Ｈｅｔ１）、および前記第一の任意選択的なリンカー部分（Ｌ１）を含有し、ならびに、前記第二のポリペプチドが、増強部分（Ｅｍ）、前記第二の異種部分（Ｈｅｔ２）、および前記第二の任意選択的なリンカー部分（Ｌ２）を含有し、ここで、前記第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖が、互いに関連付けられている、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  25. 前記キメラタンパク質が、
    （ａ）前記リンカー部分を介してＨｅｔ１に連結されたＡｃ、およびＨｅｔ２に連結されたＥｍ、
    （ｂ）第一のリンカー部分を介してＨｅｔ１に連結されたＡｃ、および第二のリンカー部分を介してＨｅｔ２に連結されたＥｍ、
    （ｃ）Ｈｅｔ１に連結されたＡｃ、およびＥｍは前記リンカー部分を介してＨｅｔ２に連結されている、
    （ｄ）Ｈｅｔ１に連結されたＡｃ、およびＨｅｔ２に連結されたＥｍ、
    （ｅ）前記リンカー部分を介してＨｅｔ１に連結されたＥｍ、およびＨｅｔ２に連結されたＡｃ、
    （ｆ）前記第一のリンカー部分を介してＨｅｔ１に連結されたＥｍ、および前記第二のリンカー部分を介してＨｅｔ２に連結されたＡｃ、
    （ｇ）Ｈｅｔ１に連結されたＥｍ、およびＡｃは前記リンカー部分を介してＨｅｔ２に連結されている、ならびに、
    （ｈ）Ｈｅｔ１に連結されたＥｍ、およびＨｅｔ２に連結されたＡｃ、
    からなる群から選択される構造を有する、請求項２４に記載のキメラタンパク質。
  26. ２つのポリペプチドを含有し、ここで、
    （ａ）前記第一のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、前記第二のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、
    （ｂ）前記第一のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、前記第二のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、
    （ｃ）前記第一のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、前記第二のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、
    （ｄ）前記第一のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、前記第二のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｌ１−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、
    （ｅ）前記第一のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｌ１−Ｈｅｔ２により表される構造を含有し、および、前記第二のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｈｅｔ１により表される構造を含有する、
    （ｆ）前記第一のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、前記第二のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、
    （ｇ）前記第一のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、前記第二のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、ならびに、
    （ｈ）前記第一のポリペプチドは、化学式Ｅｍ−Ｈｅｔ１により表される構造を含有し、および、前記第二のポリペプチドは、化学式Ａｃ−Ｈｅｔ２により表される構造を含有する、
    ここで、前記２つのポリペプチド鎖のＨｅｔ１およびＨｅｔ２は、ジスルフィド結合を形成する、請求項２５に記載のキメラタンパク質。
  27. 少なくとも１つのリンカー部分を含有する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  28. ２つのリンカー部分を含有する、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  29. 前記２つのリンカー部分が、同一である、請求項２８に記載のキメラタンパク質。
  30. 前記２つのリンカー部分が、異なっている、請求項２８に記載のキメラタンパク質。
  31. 少なくとも１つのリンカー部分が、約１０〜約５０アミノ酸を含有するアミノ酸配列を有する、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  32. 前記少なくとも１つのリンカー部分が、約２０〜約３０アミノ酸を含有するアミノ酸配列を有する、請求項３１に記載のキメラタンパク質。
  33. 前記リンカー部分が、ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドを含有する、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  34. 前記ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドが、化学式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、または、化学式Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎのアミノ酸配列を含有し、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される正の整数である、請求項３３に記載のキメラタンパク質。
  35. 前記（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎペプチドが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、および、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４からなる群から選択されるアミノ酸を含有する、請求項３４に記載のキメラタンパク質。
  36. 前記（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎペプチドが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６ペプチドである、請求項３５に記載のキメラタンパク質。
  37. 単一ポリペプチド鎖である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  38. 前記増強部分および前記第一の異種部分に連結されたｓｃＦｃリンカー（Ｘ）、または、前記活性化可能な凝固因子および前記第二の異種部分に連結されたｓｃＦｃリンカー（Ｘ）、をさらに含有する、請求項３７に記載のキメラタンパク質。
  39. （１）Ａｃ−Ｈｅｔ１−Ｘ−Ｅｍ−Ｈｅｔ２；
    （２）Ａｃ−Ｈｅｔ１−Ｘ−Ｅｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ２；
    （３）Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ１−Ｘ−Ｅｍ−Ｈｅｔ２；
    （４）Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ１−Ｘ−Ｅｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ２；
    （５）Ｈｅｔ２−Ｅｍ−Ｘ−Ｈｅｔ１−Ａｃ；
    （６）Ｈｅｔ２−Ｌ２−Ｅｍ−Ｘ−Ｈｅｔ１−Ａｃ；
    （７）Ｈｅｔ２−Ｅｍ−Ｘ−Ｈｅｔ１−Ｌ１−Ａｃ；および、
    （８）Ｈｅｔ２−Ｌ２−Ｅｍ−Ｘ−Ｈｅｔ１−Ｌ１−Ａｃ
    からなる群から選択される化学式を含有し、ここで、
    （ａ）Ａｃは、前記活性化可能な凝固因子であり、
    （ｂ）Ｌ１は、前記第一の任意選択的なリンカー部分であり、
    （ｃ）Ｈｅｔ１は、前記第一の異種部分であり、
    （ｄ）Ｘは、前記ｓｃＦｃリンカーであり、
    （ｅ）Ｅｍは、前記増強部分であり、
    （ｆ）Ｌ２は、前記任意選択的な第二のリンカー部分であり、
    （ｇ）Ｈｅｔ２は、前記第二の異種部分であり、および、
    （ｈ）（−）は、ペプチド結合または１以上のアミノ酸である、請求項３８に記載のキメラタンパク質。
  40. Ｈｅｔ１またはＨｅｔ２の各々が、半減期延長物質である、請求項３９に記載のキメラタンパク質。
  41. Ｈｅｔ１およびＨｅｔ２は、Ｆｃ部分またはＦｃＲｎ結合部分であり、ここで、Ｈｅｔ１およびＥ２は、同一であるか、または異なっている、請求項４０に記載のキメラタンパク質。
  42. 前記ｓｃＦｃリンカーは、プロセッシング可能なリンカー（ｃｓｃＦｃ）である、請求項３９または４１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  43. 前記ｃｓｃＦｃリンカーが、少なくとも１つの細胞内プロセッシング部位を含有する、請求項４２に記載のキメラタンパク質。
  44. 前記ｃｓｃＦｃリンカーが、同一、または異なる細胞内プロセッシング酵素により認識される２つの細胞内プロセッシング部位を含有する、請求項４２または４３のいずれかに記載のキメラタンパク質。
  45. 前記細胞内プロセッシング部位が、酵母Ｋｅｘ２、ＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ２、ＰＣＳＫ３、ＰＣＳＫ４、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、またはＰＣＳＫ７からなる群から選択される細胞内プロセッシング酵素により認識される、請求項４４に記載のキメラタンパク質。
  46. 前記少なくとも１つの細胞内プロセッシング部位が、ＰＣＳＫ５によりプロセッシングされる、請求項４４または４５のいずれかに記載のキメラタンパク質。
  47. 前記２つの細胞内プロセッシング部位のそれぞれが、ＰＣＳＫ５によりプロセッシングされる、請求項４４または４５のいずれかに記載のキメラタンパク質。
  48. 前記２つの細胞内プロセッシング部位が、同一である、請求項４７に記載のキメラタンパク質。
  49. 前記２つの細胞内プロセッシング部位が、異なっている、請求項４７に記載のキメラタンパク質。
  50. 前記細胞内プロセッシング酵素によりプロセッシングされた前記細胞内プロセッシング部位が、アミノ酸配列Ｒ−Ｘ−［Ｒ／Ｋ］−Ｒを含有し、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であってもよく、および、[Ｒ／Ｋ]は、アミノ酸がＲまたはＫであっても良いことを示す、請求項４３〜４９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  51. 前記ＰＣＳＫ５酵素開裂部位のそれぞれが、独立して、配列ＲＲＲＲ（配列番号２）または配列（ＲＫＲ）ｎ（配列番号３）（ここで、ｎは２である）を含有する、請求項５０に記載のキメラタンパク質。
  52. 前記ｃｓｃＦｃリンカーのＣ末端の前記ＰＣＳＫ５酵素開裂部位が、配列ＲＲＲＲ（配列番号２）を含有し、および、前記ｃｓｃＦｃリンカーのＮ末端の前記ＰＣＳＫ５酵素開裂部位が、配列（ＲＫＲ）２（配列番号３）を含有する、請求項５１に記載のキメラタンパク質。
  53. 前記ｓｃＦｃリンカーが、約１０〜約５０アミノ酸の長さを有する、請求項３８〜５２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  54. 前記ｓｃＦｃリンカーが、約２０〜約３０アミノ酸の長さを有する、請求項３８〜５２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  55. 前記ｓｃＦｃリンカーが、ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドを含有する、請求項３８〜５２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  56. 前記ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドが、化学式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、または、化学式Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎのアミノ酸配列を含有し、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される正の整数である、請求項５５に記載のキメラタンパク質。
  57. 前記（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎペプチドが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、および、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４からなる群から選択されるアミノ酸を含有する、請求項５５に記載のキメラタンパク質。
  58. 前記（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎペプチドが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６ペプチドである、請求項５７に記載のキメラタンパク質。
  59. 前記凝固因子チモーゲンが、ＦＶＩＩタンパク質である、請求項４〜５８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  60. 前記ＦＶＩＩタンパク質が、第ＶＩＩ因子の高度特異的活性変異体である、請求項５９に記載のキメラタンパク質。
  61. 前記凝固因子チモーゲンが、ＦＸタンパク質である、請求項４〜５８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  62. 前記ＦＸタンパク質は第Ｘ因子の高度特異的活性変異体である、請求項６１に記載のキメラタンパク質。
  63. 前記活性化可能な凝固因子は、ｉｎ ｖｉｖｏで活性化される、請求項１〜６２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  64. 前記プロテアーゼ開裂部位は、トロンビン開裂部位である、請求項４〜６３のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  65. 前記トロンビン開裂部位は、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号６）、ＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号７）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号９）、ＬＶＰＲＧ（配列番号１０）、およびＡＬＲＰＲ（配列番号１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項６４に記載のキメラタンパク質。
  66. 前記プロテアーゼ開裂部位は、ＦＸＩａ開裂部位である、請求項４〜６５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  67. 前記ＦＸＩａ開裂部位は、ＫＬＴＲ（配列番号１３）、またはＤＦＴＲ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含有する、請求項６６に記載のキメラタンパク質。
  68. 細胞内プロセッシング部位が、前記凝固因子チモーゲンの軽鎖と前記プロテアーゼ開裂部位の間に挿入される、請求項４〜６７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  69. 前記細胞内プロセッシング部位が、酵母Ｋｅｘ２、ＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ２、ＰＣＳＫ３、ＰＣＳＫ４、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、およびＰＣＳＫ７からなる群から選択される細胞内プロセッシング酵素により開裂される、請求項６８に記載のキメラタンパク質。
  70. 前記細胞内プロセッシング酵素が、ＰＣＳＫ５である、請求項６９に記載のキメラタンパク質。
  71. 前記自己犠牲的部分が、芳香環を含有する、請求項１２〜７０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  72. 前記芳香環が、ベンジル、シンナミル、ナフチル、およびビフェニルからなる群から選択される、請求項７１に記載のキメラタンパク質。
  73. 前記芳香環が、複素環である、請求項７１または７２に記載のキメラタンパク質。
  74. 前記芳香環が、少なくとも１つの置換基を含有する、請求項７１〜７３のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  75. 前記少なくとも１つの置換基が、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＯ３＋、ＮＨＣＯＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＣＦ３、アルキル、ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ８ハロゲン化アルキル、カルボン酸塩、硫酸塩、スルファミン酸塩、またはスルホン酸塩からなる群から選択される、請求項７４に記載のキメラタンパク質。
  76. 前記芳香環の少なくとも１つのＣが、Ｎ、Ｏ、またはＣ−Ｒ１で置換され、ここで、Ｒ１は、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＯ３＋、ＮＨＣＯＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＣＦ３、アルキル、ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ８ハロゲン化アルキル、カルボン酸塩、硫酸塩、スルファミン酸塩、またはスルホン酸塩からなる群から独立して選択される、請求項７５に記載のキメラタンパク質。
  77. 前記可溶性ＴＦが、成熟型ＴＦペプチドのアミノ酸１〜２１９（すなわち、配列番号１５のアミノ酸３３〜２５１）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含有する、請求項１０〜７６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  78. 少なくとも１つの追加異種部分をさらに含有する、請求項１８〜８７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  79. ポリシアル化された、ペグ化された、グリコシル化された、ヘシル化された（ｈｅｓｙｌａｔｅｄ）、γ−カルボキシル化された、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜７８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  80. 請求項１〜７９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質またはその相補物をコードする核酸分子。
  81. 第一のヌクレオチド配列（ＮＡ１）および第二のヌクレオチド配列（ＮＡ２）を含有し、ここで、ＮＡ１は、請求項２３〜３７および５９〜７９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の第一のポリペプチドまたはその相補物をコードし、および、ＮＡ２は、請求項２３〜３７および５９〜７９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の第二のポリペプチドまたはその相補物をコードする、核酸分子のセット。
  82. 請求項８０または８１に記載の核酸分子（複数含む）またはその相補物を含有するベクター。
  83. 第一のベクター（Ｖ１）および第二のベクター（Ｖ２）を含有し、ここで、Ｖ１は、請求項８１に記載のＮＡ１またはその相補物を含有し、および、Ｖ２は、請求項８１に記載のＮＡ２またはその相補物を含有する、ベクターのセット。
  84. 前記キメラタンパク内の細胞内プロセッシング部位のうちの少なくとも１つをプロセッシングする細胞内プロセッシング酵素をコードするヌクレオチド配列またはその相補物をさらに含有する、請求項８２もしくは８３のいずれかに記載のベクターまたはベクターのセット。
  85. 請求項８２〜８４のいずれか１項に記載のベクターを含有する宿主細胞。
  86. ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、またはＣＨＯ細胞である、請求項８５に記載の宿主細胞。
  87. 請求項８５または８６に記載の宿主細胞を培養すること、および前記培養培地から前記キメラタンパク質を回収することを含む、キメラタンパク質を製造するための方法。
  88. 請求項１〜７９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、請求項８０もしくは８１のいずれかに記載の核酸分子または核酸分子のセット、請求項８２〜８４のいずれか１項に記載のベクターまたはベクターのセット、および、薬学的に受容可能な担体を含有する、医薬組成物。
  89. 請求項１〜７９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、請求項８０もしくは８１に記載の核酸分子または核酸分子のセット、請求項８２〜８４のいずれかに記載のベクターまたはベクターのセット、請求項８５もしくは８６のいずれか１項に記載の宿主細胞、または請求項８５に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与すること、を含む、それを必要とする対象における出血性疾患もしくは出血性障害を治療、改善、または予防するための方法。
  90. 前記出血性疾患または障害は、血液凝固障害が原因である、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記血液凝固障害が、血友病Ａまたは血友病Ｂである、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記出血性疾患または障害が、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、および腸腰筋鞘の出血から選択される、請求項８９〜９１のいずれか１項に記載の方法。
  93. 請求項１〜７９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、請求項８０もしくは８１に記載の核酸分子または核酸分子のセット、請求項８２〜８４のいずれかに記載のベクターまたはベクターのセット、請求項８５もしくは８６のいずれか１項に記載の宿主細胞、または請求項８８に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与すること、を含む、哺乳類の対象における凝固因子欠損症を治療、改善、または予防するための方法であって、前記凝固因子は、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸおよびＦＸＩからなる群から選択される、方法。
  94. 前記治療すること、改善すること、または予防することが、バイパス治療である、請求項８９〜９３のいずれか１項に記載の方法。
  95. 前記対象が、第ＶＩＩＩ因子に対する阻害物質を発現している、または発現する傾向がある、請求項８９〜９４のいずれか１項に記載の方法。
  96. 前記対象は、ヒト対象である、請求項８９〜９５のいずれか１項に記載の方法。
  97. 血液凝固障害を有する対象を治療、改善、または予防するための、請求項１〜７９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、請求項８０もしくは８１に記載の核酸分子または核酸分子のセット、請求項８２〜８４のいずれかに記載のベクターまたはベクターのセット、請求項８５もしくは８６のいずれか１項に記載の宿主細胞、または請求項８８に記載の医薬組成物。
  98. 血液凝固障害の治療、予防または改善のための薬剤製造のための、請求項１〜７９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、請求項８０もしくは８１に記載の核酸分子または核酸分子のセット、請求項８２〜８４のいずれかに記載のベクターまたはベクターのセット、請求項８５もしくは８６に記載の宿主細胞、または請求項８８に記載の医薬組成物の使用。
  99. 請求項１〜７９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を製造する方法であって、固相ペプチド合成を使用することを含む、方法。
  100. オルソゴナル（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）な固相ペプチド合成を使用することを含む、請求項９９に記載の方法。
  101. 化学式Ａｃ−Ｌ１−Ｅｍで表される、アミノ末端からカルボキシ末端への線形構造を含有するキメラタンパク質であって、ここで、Ａｃは、プロテアーゼ活性化可能なＦＶＩＩ凝固因子であり、Ｅｍは、可溶性組織因子であり、およびＬ１はリンカー部分（Ａｃのカルボキシ末端とＥｍのアミノ末端を連結するｇｌｙ／ｓｅｒペプチドを含有）であり；ここで、前記プロテアーゼ活性化可能なＦＶＩＩ凝固因子Ａｃは、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）ならびにＬＣのカルボキシ末端とＨＣのアミノ末端の間に挿入されるトロンビン開裂部位を含有する、キメラタンパク質。
  102. 第一のポリペプチド（化学式Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ１で表されるアミノ末端からカルボキシ末端への線形構造を有する）および第二のポリペプチド（化学式Ｅｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ２で表されるアミノ末端からカルボキシ末端への線形構造を有する）の２つのポリペプチドを含有するキメラタンパク質であって、ここで、
    （ａ）Ａｃは、プロテアーゼ活性化可能なＦＶＩＩ凝固因子であり、
    （ｂ）Ｈｅｔ１は、二量体Ｆｃ領域のＦｃ部分であり、および、
    （ｃ）Ｌ１は、Ａｃのカルボキシ末端とＨｅｔ１のアミノ末端を連結するｇｌｙ／ｓｅｒペプチドを含有するリンカー部分であり、
    （ｄ）Ｅｍは、可溶性組織因子であり、
    （ｅ）Ｈｅｔ２は、二量体Ｆｃ領域のＦｃ部分であり、および、
    （ｆ）Ｌ２は、Ｈｅｔ２のアミノ末端とＥｍのカルボキシ末端を連結するｇｌｙ／ｓｅｒペプチドを含有するリンカー部分であり、
    ここで、前記Ｈｅｔ１およびＨｅｔ２部分は、二量体Ｆｃ領域を形成し、および、
    ここで、前記プロテアーゼ活性化可能なＦＶＩＩ凝固因子Ａｃは、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）ならびにＬＣのカルボキシ末端とＨＣのアミノ末端の間に挿入されるトロンビン開裂部位を含有する、キメラタンパク質。
  103. 化学式Ａｃ−Ｌ１−Ｈｅｔ１−Ｘ−Ｅｍ−Ｌ２−Ｈｅｔ２で表される、アミノ末端からカルボキシ末端への線形構造を含有するキメラタンパク質であって、ここで、
    （ａ）Ａｃは、プロテアーゼ活性化可能なＦＶＩＩ凝固因子であり、
    （ｂ）Ｈｅｔ１は、二量体Ｆｃ領域のＦｃ部分であり、
    （ｃ）Ｌ１は、Ａｃのカルボキシ末端とＨｅｔ１のアミノ末端を連結するｇｌｙ／ｓｅｒペプチドを含有するリンカー部分であり、
    （ｄ）Ｘは、Ｈｅｔ１のカルボキシ末端とＥｍのアミノ末端を連結する開裂可能なｓｃＦｃリンカーであり、
    （ｅ）Ｅｍは、可溶性組織因子であり、
    （ｆ）Ｌ２は、Ｈｅｔ２のアミノ末端とＥｍのカルボキシ末端を連結するｇｌｙ／ｓｅｒペプチドを含有するリンカー部分であり、および、
    （ｇ）Ｈｅｔ２は、二量体Ｆｃ領域のＦｃ部分であり、
    ここで、前記Ｈｅｔ１およびＨｅｔ２部分は、二量体Ｆｃ領域を形成し、
    ここで、前記プロテアーゼ活性化可能なＦＶＩＩ凝固因子Ａｃは、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）ならびにＬＣのカルボキシ末端とＨＣのアミノ末端の間に挿入されるトロンビン開裂部位を含有し、および、
    ここで、前記ｃｓｃＦｃ開裂可能なリンカーは、２つのＰＣＳＫ５酵素開裂部位（それらは配列ＲＲＲＲ（配列番号２）を含有するアミノ末端部位および配列（ＲＫＲ）２（配列番号３）を含有するカルボキシ末端部位である）に隣接されているｇｌｙ／ｓｅｒペプチドを含有する、キメラタンパク質。
  104. 請求項３８〜７９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現することを含む、キメラタンパク質の製造方法であって、ここで、前記ｓｃＦｃリンカーは、細胞内プロセッシング酵素により細胞内で開裂される、方法。
  105. 前記キメラタンパク質をさらに精製する、請求項１０４に記載の方法。
  106. 前記キメラタンパク質が、共有結合的に互いに関連している２つのポリペプチド鎖を有する、請求項１０５に記載の方法。
JP2015516265A 2012-06-08 2013-06-07 キメラ性凝固因子 Pending JP2015525222A (ja)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261657685P 2012-06-08 2012-06-08
US61/657,685 2012-06-08
US201361759817P 2013-02-01 2013-02-01
US61/759,817 2013-02-01
US201361801603P 2013-03-15 2013-03-15
US61/801,603 2013-03-15
US201361829775P 2013-05-31 2013-05-31
US61/829,775 2013-05-31
PCT/US2013/044842 WO2013185114A2 (en) 2012-06-08 2013-06-07 Chimeric clotting factors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2015525222A true JP2015525222A (ja) 2015-09-03

Family

ID=49712879

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015516265A Pending JP2015525222A (ja) 2012-06-08 2013-06-07 キメラ性凝固因子

Country Status (8)

Country Link
US (3) US10202595B2 (ja)
EP (1) EP2863940A4 (ja)
JP (1) JP2015525222A (ja)
CN (1) CN104427995A (ja)
AU (1) AU2013270683A1 (ja)
CA (1) CA2875247A1 (ja)
HK (1) HK1207591A1 (ja)
WO (1) WO2013185114A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018199214A1 (ja) * 2017-04-27 2018-11-01 中外製薬株式会社 薬物動態が改善された血液凝固第ｉｘ因子

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3527218A1 (en) * 2011-06-10 2019-08-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
US10202595B2 (en) 2012-06-08 2019-02-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric clotting factors
CA2875246A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Biogen Idec Ma Inc. Procoagulant compounds
PT2956477T (pt) 2013-02-15 2021-02-05 Bioverativ Therapeutics Inc Gene do fator viii otimizado
JP6609561B2 (ja) 2014-02-04 2019-11-20 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッド 翻訳後修飾を濃縮するための、フロースルーモードにおける陽イオン交換クロマトグラフィーの使用
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
WO2016150449A1 (en) * 2015-03-23 2016-09-29 Dana Genetic A/S Recombinant soluble human tissue factor, method of its production and uses thereof
US11753461B2 (en) * 2016-02-01 2023-09-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor VIII genes
WO2017212476A1 (en) * 2016-06-05 2017-12-14 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Novel molecules for the treatment of inflammation
CN106279437B (zh) * 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
US11123438B2 (en) 2016-08-19 2021-09-21 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Linker peptide for constructing fusion protein
CN107759696A (zh) * 2016-08-19 2018-03-06 安源医药科技（上海）有限公司 人白介素7融合蛋白及其制备方法
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US20210093735A1 (en) * 2018-04-26 2021-04-01 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for treatment of hemophilia
CN114364796B (zh) * 2019-09-02 2023-07-11 甘李药业股份有限公司 嵌合蛋白
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation

Family Cites Families (151)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
WO1986006101A1 (en) 1985-04-12 1986-10-23 Genetics Institute, Inc. Novel procoagulant proteins
KR910006424B1 (ko) 1985-08-21 1991-08-24 인코텍스 비.브이 편성브리프(brief) 제조방법
WO1987004187A1 (en) 1986-01-03 1987-07-16 Genetics Institute, Inc. METHOD FOR PRODUCING FACTOR VIII:c-TYPE PROTEINS
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5610278A (en) 1986-06-24 1997-03-11 Novo Nordisk A/S Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments
EP0279582A3 (en) 1987-02-17 1989-10-18 Pharming B.V. Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US6060447A (en) 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
US5171844A (en) 1987-06-12 1992-12-15 Gist-Brocades N.W. Proteins with factor viii activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
DE3720246A1 (de) 1987-06-19 1988-12-29 Behringwerke Ag Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
FR2619314B1 (fr) 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
JP3045539B2 (ja) 1989-02-21 2000-05-29 ワシントン ユニバーシティ 改変型生殖ホルモン
US5935815A (en) 1989-10-25 1999-08-10 Katholieke Universiteit Leuven Process for micro biological production of proteins
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
GB9024129D0 (en) 1990-11-06 1990-12-19 Thrombosis Research Trust Inhibitors and substrates of thrombin
WO1992009698A1 (en) 1990-11-26 1992-06-11 Genetics Institute, Inc. Expression of pace in host cells and methods of use thereof
US5846951A (en) 1991-06-06 1998-12-08 The School Of Pharmacy, University Of London Pharmaceutical compositions
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
DE69332859T2 (de) 1992-11-13 2003-12-18 Idec Pharma Corp Konsensus-kozak-sequenzen zur säugetier-exprimierung
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5840529A (en) 1995-08-02 1998-11-24 Clinical Research Institute Of Montreal Mammalian pro-hormone convertase
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
US6458563B1 (en) 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
CA2203745A1 (en) 1996-07-26 1998-01-26 Robert Day Pro-protein converting enzyme
AU3968897A (en) 1996-08-02 1998-02-25 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
ID24565A (id) 1997-03-14 2000-07-27 Idec Pharma Corp Metoda untuk integrasi gen pada tempat yang spesifik dalam sel mamalia melalui rekombinasi homolog dan vektor untuk pencapaian yang sama
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2292236T3 (es) 1998-04-02 2008-03-01 Genentech, Inc. Variantes de anticuerpos y sus fragmentos.
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
AU2001259063A1 (en) 2000-04-12 2001-10-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US6962972B2 (en) 2000-05-16 2005-11-08 Lipoxen Technologies Limited Derivatization of proteins
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
ATE489395T1 (de) 2000-12-12 2010-12-15 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
US6888319B2 (en) 2001-03-01 2005-05-03 Palomar Medical Technologies, Inc. Flashlamp drive circuit
US7211395B2 (en) 2001-03-09 2007-05-01 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
US20040106794A1 (en) 2001-04-16 2004-06-03 Schering Corporation 3,4-Di-substituted cyclobutene-1,2-diones as CXC-chemokine receptor ligands
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
DE60128914T2 (de) 2001-10-05 2008-05-08 Affimed Therapeutics Ag Antikörper menschlichen Ursprungs zur Hemmung der Thrombozytenaggregation
FR2831170B1 (fr) 2001-10-19 2004-03-19 Inst Nat Sante Rech Med Proteines c modifiees activables directement par la thrombine
KR101271635B1 (ko) 2001-12-21 2013-06-12 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 알부민 융합 단백질
US20080194481A1 (en) 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
EP1463751B1 (en) 2001-12-21 2013-05-22 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20040018557A1 (en) 2002-03-01 2004-01-29 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
AU2002316574B2 (en) 2002-03-15 2008-05-01 Brandeis University Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
WO2003100053A1 (en) 2002-05-22 2003-12-04 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for the treatment of hemophilia a
FR2841904B1 (fr) 2002-07-03 2004-08-20 Inst Nat Sante Rech Med Analogues de facteurs x clivables par la thrombine
DK1545613T3 (da) 2002-07-31 2011-11-14 Seattle Genetics Inc Auristatinkonjugater og deres anvendelse til behandling af cancer, en autoimmun sygdom eller en infektiøs sygdom
ES2381617T5 (es) 2002-08-14 2016-02-24 Macrogenics, Inc. Anticuerpos específicos frente a FcgammaRIIB y sus procedimientos de uso
EP2042517B1 (en) 2002-09-27 2012-11-14 Xencor, Inc. Optimized FC variants and methods for their generation
PT1562972E (pt) 2002-10-15 2010-11-10 Facet Biotech Corp Alteração de afinidades de ligação ao fcrn ou semi-vidas séricas de anticorpos por mutagénese
GB2395337B (en) 2002-11-14 2005-12-28 Gary Michael Wilson Warning Unit
EP1587540B1 (en) 2003-01-09 2021-09-15 MacroGenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
US7041635B2 (en) 2003-01-28 2006-05-09 In2Gen Co., Ltd. Factor VIII polypeptide
CN102139114A (zh) 2003-02-26 2011-08-03 尼克塔治疗公司 聚合物-因子viii部分缀合物
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
ES2333598T5 (es) * 2003-05-06 2013-09-04 Biogen Idec Hemophilia Inc Proteinas quimericas del factor de coagulacion fc para tratar la hemofilia.
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
JP4644663B2 (ja) 2003-06-03 2011-03-02 セル ジェネシス インコーポレイテッド ペプチド開裂部位を用いた単一ベクターからの組換えポリペプチドの高められた発現のための構成と方法
EP1654290B1 (en) 2003-08-12 2019-03-13 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
EP2385069A3 (en) 2003-11-12 2012-05-30 Biogen Idec MA Inc. Neonatal Fc rReceptor (FcRn)- binding polypeptide variants, dimeric Fc binding proteins and methods related thereto
WO2005077981A2 (en) 2003-12-22 2005-08-25 Xencor, Inc. Fc POLYPEPTIDES WITH NOVEL Fc LIGAND BINDING SITES
DE602005015542D1 (de) 2004-01-12 2009-09-03 Applied Molecular Evolution Varianten der fc-region
AU2005216251B2 (en) 2004-02-23 2011-03-10 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
HUE045882T2 (hu) 2004-03-23 2020-01-28 Ascendis Pharma Gmbh Polimer prodrug önmagát lehasító linkerrel
US7276585B2 (en) 2004-03-24 2007-10-02 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the Fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7691962B2 (en) 2004-05-19 2010-04-06 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
EP1919950A1 (en) 2004-07-15 2008-05-14 Xencor, Inc. Optimized fc variants
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
US7393833B2 (en) 2005-03-09 2008-07-01 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Chimeric proteins with phosphatidylserine binding domains
US20060269480A1 (en) 2005-05-31 2006-11-30 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Multi-triggered self-immolative dendritic compounds
BRPI0614761A2 (pt) 2005-08-12 2009-05-19 Human Genome Sciences Inc proteìnas de fusão de albumina
US7846445B2 (en) 2005-09-27 2010-12-07 Amunix Operating, Inc. Methods for production of unstructured recombinant polymers and uses thereof
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
US8048848B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Prolor Biotech Ltd. Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof
EP1816201A1 (en) * 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
WO2007104529A2 (en) 2006-03-13 2007-09-20 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against il-6 and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
CN101406105B (zh) 2006-03-13 2010-11-10 皇家飞利浦电子股份有限公司 用于固态照明***的自适应控制装置和方法
TWI428448B (zh) 2006-03-24 2014-03-01 Syntonix Pharmaceuticals Inc 作為第九因子（ｆａｃｔｏｒ ｉｘ）原肽處理酶之ｐｃ５
ES2353084T3 (es) 2006-04-07 2011-02-25 Novo Nordisk Health Care Ag Complejo covalente de factor vii y factor tisular.
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
GB0614780D0 (en) 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
CA2663352A1 (en) 2006-09-14 2008-03-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
TWI412367B (zh) 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
US20080260738A1 (en) 2007-04-18 2008-10-23 Moore Margaret D Single chain fc, methods of making and methods of treatment
AU2008254951A1 (en) 2007-05-14 2008-11-27 Biogen Idec Ma Inc. Single-chain Fc (ScFc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
ATE502114T1 (de) 2007-06-21 2011-04-15 Univ Muenchen Tech Biologisch aktive proteine mit erhöhter in-vivo- und/oder in-vitro-stabilität
CN103298935A (zh) 2007-08-15 2013-09-11 阿穆尼克斯公司 用于改善生物活性多肽性能的组合物和方法
WO2010083536A1 (en) 2009-01-19 2010-07-22 Bayer Healthcare Llc Protein conjugate having an endopeptidase-cleavable bioprotective moiety
US8680050B2 (en) 2009-02-03 2014-03-25 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same
US8703717B2 (en) 2009-02-03 2014-04-22 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
KR101544245B1 (ko) 2009-02-03 2015-08-12 아뮤닉스 오퍼레이팅 인코포레이티드 연장된 재조합 폴리펩티드 및 이를 포함하는 조성물
WO2010115866A1 (en) 2009-04-06 2010-10-14 Novo Nordisk A/S Targeted delivery of factor viii proteins to platelets
WO2010140148A1 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Yeda Research And Development Co . Ltd Prodrugs containing albumin binding probe
NO2440241T3 (ja) 2009-06-08 2018-01-06
CA2764108A1 (en) 2009-06-08 2010-12-16 Amunix Operating Inc. Glucose-regulating polypeptides and methods of making and using same
RU2563231C2 (ru) * 2009-06-25 2015-09-20 Дзе Юниверсити Оф Норт Каролина Эт Чепел Хилл Химерные молекулы фактора vii
EP3222287A1 (en) 2009-08-24 2017-09-27 Amunix Operating Inc. Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same
WO2011028344A2 (en) 2009-08-25 2011-03-10 Amunix Operating Inc. Interleukin-1 receptor antagonist compositions and methods of making and using same
JP5903048B2 (ja) 2009-12-06 2016-04-13 バイオジェン ヘモフィリア インコーポレイテッド 第ＶＩＩＩ−Ｆｃ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法
DK2591006T3 (da) 2010-07-09 2019-07-29 Bioverativ Therapeutics Inc Processerbare enkeltkædede molekyler og polypeptider fremstillet ved anvendelse deraf
US9611310B2 (en) 2010-07-09 2017-04-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor VIII processing and methods thereof
KR20180118808A (ko) 2010-07-09 2018-10-31 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 인자 iｘ 폴리펩티드 및 이들의 사용 방법
US20130017997A1 (en) 2010-08-19 2013-01-17 Amunix Operating Inc. Factor VIII Compositions and Methods of Making and Using Same
EP3527218A1 (en) 2011-06-10 2019-08-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
EP4169525A1 (en) 2011-07-08 2023-04-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
BR112014017165B1 (pt) 2012-01-12 2023-05-02 Bioverativ Therapeutics Inc Proteína quimérica compreendendo uma proteína de fator viii, composição farmacêutica, e seus usos
EA201491388A1 (ru) 2012-02-15 2015-01-30 Байоджен Айдек Ма Инк. Рекомбинантные белки фактора viii
US10202595B2 (en) 2012-06-08 2019-02-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric clotting factors
CA2875246A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Biogen Idec Ma Inc. Procoagulant compounds

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018199214A1 (ja) * 2017-04-27 2018-11-01 中外製薬株式会社 薬物動態が改善された血液凝固第ｉｘ因子
JPWO2018199214A1 (ja) * 2017-04-27 2020-03-12 中外製薬株式会社 薬物動態が改善された血液凝固第ｉｘ因子
JP7261739B2 (ja) 2017-04-27 2023-04-20 中外製薬株式会社 薬物動態が改善された血液凝固第ｉｘ因子

Also Published As

Publication number Publication date
CN104427995A (zh) 2015-03-18
US10202595B2 (en) 2019-02-12
US20220135959A1 (en) 2022-05-05
WO2013185114A3 (en) 2014-01-30
CA2875247A1 (en) 2013-12-12
US20190225957A1 (en) 2019-07-25
EP2863940A2 (en) 2015-04-29
EP2863940A4 (en) 2016-08-10
AU2013270683A1 (en) 2014-12-11
WO2013185114A2 (en) 2013-12-12
US11168316B2 (en) 2021-11-09
HK1207591A1 (en) 2016-02-05
US20150353911A1 (en) 2015-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220135959A1 (en) Chimeric clotting factors
EP2591099B1 (en) Chimeric clotting factors
TWI826778B (zh) 嵌合因子 viii 多肽及其用途
TWI667258B (zh) 因子ｖｉｉｉ與ｘｔｅｎ及范威爾邦德（ｖｏｎ ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子蛋白質之複合物及其用途
KR101579083B1 (ko) 연장된 반감기를 갖는 변형된 응고 인자 ＶＩＩａ
TW202003554A (zh) 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途
US20140248686A1 (en) Therapeutic polypeptides with increased in vivo recovery
JP2023101713A (ja) 血友病ａを処置する方法