JP2015521463A - 標的化イズロニダーゼ化合物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、（a）α-L-イズロニダーゼ（IDUA）酵素、その断片又は類似体と、（b）ターゲティング部分とを含む化合物、例えば化合物がIDUAとAngiopep-2を含む融合タンパク質である化合物に関する。特定の実施形態において、これらの化合物は、ターゲティング部分の存在のため、酵素単独よりも効率的に、脳血管関門を通過することができる又はリソソーム内に蓄積することができる。本発明はまた、かかる化合物を用いたムコ多糖症I型（MPS-I）の治療方法に関する。【選択図】図２３

Description

本発明は、α-L-イズロニダーゼ酵素及びターゲティング部分を含む化合物、並びに、その酵素の欠乏により生じる障害、例えばムコ多糖症I型（MPS-I）の治療におけるかかるコンジュゲートの使用に関する。
リソソーム蓄積症（lysosomal storage disorder）は、約50の希有な遺伝性障害の群であり、この障害において対象は、適切な代謝に必要なリソソーム酵素を欠損している。これら疾患は典型的には、常染色体又はX連鎖劣性遺伝子により生じる。群として、これら障害の発症率は約1:5000〜1:10,000である。
MPS-Iは、グリコサミノグリカン（GAG）のリソソーム分解に必要な酵素である、α-L-イズロニダーゼ（IDUA）の欠乏により生じる。α-L-イズロニダーゼは、2つのGAG、すなわちヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸に存在する硫酸化α-L-イズロン酸からスルフェート（硫酸）を除去する。この障害に罹患している人は、これらのGAGの分解及び再利用ができない。この欠乏は、全身にわたるGAGの蓄積をもたらし、これは神経系、関節や、心臓、肝臓、肺及び皮膚を含む様々な器官系に深刻な影響をもたらす。粗大化顔貌、肥大した頭部及び腹部、並びに皮膚障害を含む、数々の身体症状もある。最も重症な症例では、この疾患は10歳以前に致死性となり得るのであり、重症の精神遅滞を伴う。
MPS-Iに治癒法はない。対症処置に加えて、治療的アプローチには骨髄移植及び酵素補充療法がある。骨髄移植は、MPS-I患者における転帰を改善することが観察されているが、この治療を受けた患者には、移植片拒絶（例えば移植片対宿主病）を発症する又は死亡さえする実質的なリスクがある（Peters et al., Blood 91:2601-8, 1998）。IDUAの静脈内投与による酵素補充療法もまた、肝臓、心臓及び肺などの臓器の改善、並びに種々の体力テストの改善を含む利点を有することが示されてきた（Sifuentes et al., Mol. Genet. Metab. 90:171-80, 2007及びClarke et al., Pediatrics 123:229-40, 2009）。骨髄移植と同様に、このアプローチがMPS-Iと関連する中枢神経系欠陥に対して有意な効果を有するとは予測されない。なぜなら、この酵素が血液脳関門（BBB；Miebach, Acta Paediatr. Suppl. 94:58-60, 2005）を通過しないからである。
髄腔内送達（Munoz-Rojas et al., Am. J. Med. Genet. A146A:2538-44, 2008）を含む、脳へのIDUAの送達を増加させる方法が研究されてきたのであり、現在も研究されている。しかし、髄腔内送達は高度に侵襲的な技術である。
Peters et al., Blood 91:2601-8, 1998 Sifuentes et al., Mol. Genet. Metab. 90:171-80, 2007 Clarke et al., Pediatrics 123:229-40, 2009 Miebach, Acta Paediatr. Suppl. 94:58-60, 2005 Munoz-Rojas et al., Am. J. Med. Genet. A146A:2538-44, 2008
したがって、他の症状に加えて神経疾患症状に対処する、より非侵襲的で効果的なMPS-I治療方法が、きわめて望まれている。
本発明は、ターゲティング部分及びIDUA酵素を含む化合物に関する。これら化合物は、MPS-Iを治療するために使用され得るIDUA-Angiopep-2融合タンパク質により例示される。この融合タンパク質はBBBを通過できるので、周辺疾患症状を治療できるだけでなく、CNS症状の治療にも有効であり得る。加えて、ターゲティング部分、例えばAngiopep-2は、酵素をリソソームにターゲティングすることができるので、この融合タンパク質は、酵素単体より有効であることが予測される。
したがって、第1の態様において、本発明は、（a）ターゲティング部分（例えば、200、150、125、100、80、60、50、40、35、30、25、24、23、22、21、20、又は19アミノ酸未満であってもよいペプチド又はペプチド性ターゲティング部分）と、（b）IDUA酵素、その活性断片、又はその類似体とを含む化合物であって、ターゲティング部分と酵素、断片又は類似体とがリンカーで連結されている化合物を特徴とする。ある実施形態において、IDUA酵素又はIDUA断片は、成熟ヒトIDUA（配列番号１のアミノ酸27〜653）又は酵素活性を有するその断片のアミノ酸配列を有する。IDUA類似体は、ヒトIDUAの配列と実質的に同一（例えば、少なくとも60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一）である。特定の実施形態において、IDUA酵素は、ヒトIDUA又はヒトの成熟形態（アミノ酸27〜653）の配列を有する。
第1の態様において、ターゲティング部分は、配列番号1〜105及び107〜117のいずれか（例えば、Angiopep-2（配列番号97））と実質的に同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。他の実施形態において、ターゲティング部分は式Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys（式Ia）を含み、式中、X3はAsn又はGlnであり、X4はAsn又はGlnであり、X5はPhe、Tyr、又はTrpであり、ターゲティング部分は、場合により式Iaに記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含んでもよい。他の実施形態において、ターゲティング部分は式Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2（式Ib）を含み、式中、X3はAsn又はGlnであり、X4はAsn又はGlnであり、X5はPhe、Tyr、又はTrpであり、Z1は不在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、又はCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり、Z2は不在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr、又はThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり、ターゲティング部分は、場合により式Ib、Z1又はZ2に記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含んでもよい。他の実施形態において、ターゲティング部分は式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6（式IIa）を含み、式中、X1はLys又はD-Lysであり、X2はArg又はD-Argであり、X5はPhe又はD-Pheであり、X6はLys又はD-Lysであり、X1、X2、X5、又はX6の少なくとも1つがD-アミノ酸である。他の実施形態において、ターゲティング部分は式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7（式IIb）を含み、式中、X1はLys又はD-Lysであり、X2はArg又はD-Argであり、X5はPhe又はD-Pheであり、X6はLys又はD-Lysであり、X7はTyr又はD-Tyrであり、X1、X2、X5、X6、又はX7の少なくとも1つがD-アミノ酸である。他の実施形態において、ターゲティング部分は式Z1-X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7-Z2（式IIc）を含み、式中、X1はLys又はD-Lysであり、X2はArg又はD-Argであり、X5はPhe又はD-Pheであり、X6はLys又はD-Lysであり、X7はTyr又はD-Tyrであり、Z1は不在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、又はCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり、Z2は不在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr、又はThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり、X1、X2、X5、X6、又はX7の少なくとも1つがD-アミノ酸であり、ポリペプチドは、場合によりZ1又はZ2に記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含んでもよい。
第1の態様において、リンカーは共有結合（例えばペプチド結合）又は1又はそれ以上のアミノ酸である。化合物は融合タンパク質（例えば、Angiopep-2-IDUA、IDUA-Angiopep-2、又はAngiopep-2-IDUA-Angiopep-2、又は図3に示す構造）であってもよい。化合物は、第2のリンカーにより化合物に連結されている第2のターゲティング部分をさらに含んでいてもよい。
本発明はまた、第1の態様の化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を特徴とする。
別の態様において、本発明は、MPS-I（例えば、ハーラー（Hurler）症候群、ハーラー-シャイエ（Hurler-Scheie）症候群、又はシャイエ（Scheie）症候群）を有する被験体の治療又は予防的処置方法を特徴とする。この方法は、被験体に第1の態様の化合物又は本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。被験体は、重度型のMPS-I（例えばハーラー症候群）又は中度型のMPS-I（例えばハーラー-シャイエ）又は軽度型のMPS-I(例えばシャイエ症候群)のいずれを有していてもよい。被験体は、神経症状（例えば精神遅滞）を経験していてもよい。この方法は、6ヶ月齢、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15若しくは18歳未満の被験体に対して実施又は開始してもよい。被験体は乳幼児（例えば、1歳未満）であってもよい。
ある実施形態において、ターゲティング部分は抗体（例えば、内因性BBB受容体、例えばインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、及びIGF受容体等に特異的な抗体又は免疫グロブリン）ではない。
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、表1の配列のいずれか又はその断片と実質的に同一のものである。特定の実施形態において、ペプチドベクターは、Angiopep-1（配列番号67）、Angiopep-2（配列番号97）、Angiopep-3（配列番号107）、Angiopep-4a（配列番号108）、Angiopep-4b（配列番号109）、Angiopep-5（配列番号110）、Angiopep-6（配列番号111）、Angiopep-7（配列番号112）又は逆Angiopep-2（配列番号117）の配列を有する。ターゲティング部分又は化合物を、特定の細胞型（例えば、肝臓、肺、腎臓、脾臓、及び筋肉のいずれか1、2、3、4、若しくは5種）に効率的に輸送するか、又はそれは哺乳動物のBBBを効率的に通過することができる（例えば、Angiopep-1、-2、-3、-4a、-4b、-5、及び-6）。別の実施形態において、ターゲティング部分又は化合物は、特定の細胞型（例えば、肝臓、肺、腎臓、脾臓、及び筋肉のいずれか1、2、3、4、若しくは5種）に進入することができるが、BBBを効率的に通過することはできない（例えば、Angiopep-7を含むコンジュゲート）。ターゲティング部分は、任意の長さのもの、例えば、少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、35、50、75、100、200、若しくは500アミノ酸、又はこれらの数の間の任意の範囲であってよい。特定の実施形態において、ターゲティング部分は、200、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7又は6未満のアミノ酸（例えば10〜50アミノ酸長）である。ターゲティング部分は、組換え遺伝子技術又は化学合成により製造することができる。
Figure 2015521463
Figure 2015521463
Figure 2015521463
Figure 2015521463
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、式：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19
〔式中、X1〜X19の各々（例えば、X1〜X6、X8、X9、X11〜X14、及びX16〜X19）は、独立して、任意のアミノ酸（例えば、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、及びValなどの天然アミノ酸）であるか、又は存在せず、X1、X10及びX15のうちの少なくとも1個（例えば、2個若しくは3個）はアルギニンである。〕
を有するアミノ酸配列を含みうる。いくつかの実施形態において、X7はSer若しくはCysであるか；又はX10及びX15はそれぞれ独立して、Arg若しくはLysである。いくつかの実施形態において、X1〜X19の残基は、包括的に、配列番号1〜105及び107〜116（例えば、Angiopep-1、Angiopep-2、Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、及びAngiopep-7）のいずれか1つの任意のアミノ酸配列と実質的に同一である。いくつかの実施形態において、アミノ酸X1〜X19のうちの少なくとも1個（例えば、2、3、4若しくは5個）はArgである。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、該ポリペプチドのN末端、該ポリペプチドのC末端、又はその両方に1個以上の追加のシステイン残基を有する。
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys（式Ia）〔式中、X3はAsn又はGlnであり；X4はAsn又はGlnであり；X5はPhe、Tyr又はTrpであり；該ポリペプチドは、場合により長さが200アミノ酸未満（例えば、150、100、75、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、12、10、11、8若しくは7アミノ酸未満、又はこれらの数値の間の任意の範囲）であり；該ポリペプチドは、場合により式Iaに記載されたアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体（例えば、Lys、Arg、X3、X4、X5又はLysのD-異性体）を含んでもよく；該ポリペプチドは表２におけるペプチドではない。〕を含みうる。
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、アミノ酸配列Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys（式Ia）〔式中、X3はAsn又はGlnであり；X4はAsn又はGlnであり；X5はPhe、Tyr又はTrpであり；該ポリペプチドは、長さが19アミノ酸未満（例えば、18、17、16、15、14、12、10、11、8若しくは7アミノ酸未満、又はこれらの数値の間の任意の範囲）であり；該ポリペプチドは、場合により式Iaに記載されたアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体（例えば、Lys、Arg、X3、X4、X5又はLysのD-異性体）を含んでもよい。〕を含みうる。
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2（式Ib）〔式中、X3はAsn又はGlnであり；X4はAsn又はGlnであり；X5はPhe、Tyr又はTrpであり；Z1は不在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly又はCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり；Z2は不在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr又はThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり；該ポリペプチドは、場合により式Ib、Z1又はZ2に記載されたアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含んでもよい。〕のアミノ酸配列を含みうる。
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分はアミノ酸配列Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lysを含みうる。他の実施形態において、ターゲティング部分はLys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyrのアミノ酸配列を有する。さらに他の実施形態において、ターゲティング部分はLys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cysのアミノ酸配列を有する。
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、X1-X2-Asn-Asn-X5-X6（式IIa）〔式中、X1はLys又はD-Lysであり；X2はArg又はD-Argであり；X5はPhe又はD-Pheであり；X6はLys又はD-Lysであり；X1、X2、X5又はX6の少なくとも1つ（例えば少なくとも2つ、3つ又は4つ）はD-アミノ酸である。〕のアミノ酸配列を有し得る。
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7（式IIb）〔式中、X1はLys又はD-Lysであり；X2はArg又はD-Argであり；X5はPhe又はD-Pheであり；X6はLys又はD-Lysであり；X7はTyr又はD-Tyrであり；X1、X2、X5、X6又はX7の少なくとも1つ（例えば少なくとも2つ、3つ、4つ又は5つ）はD-アミノ酸である。〕のアミノ酸配列を有し得る。
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、式Z1-X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7-Z2（式IIc）〔式中、X1はLys又はD-Lysであり；X2はArg又はD-Argであり；X5はPhe又はD-Pheであり；X6はLys又はD-Lysであり；X7はTyr又はD-Tyrであり；Z1は不在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly又はCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり；Z2は不在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr又はThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり；X1、X2、X5、X6又はX7の少なくとも1つはD-アミノ酸であり；該ポリペプチドは、場合によりZ1又はZ2に記載されたアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含んでもよい。〕を含み得る。
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、以下：Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr（3D-An2）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P1）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P1a）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P1b）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys（P1c）；D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys（P1d）；Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P2）；Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P3）；Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P4）；Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P5）；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P5a）；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P5b）；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys（P5c）；Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cys（P6）；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Tyr-Cys（P6a）；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Tyr-Cys（P6b）；及びD-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-D-Tyr-Cys（P6c）；又はこれらの断片でありうる。他の実施形態において、ターゲティング部分は、0〜5個（例えば、0〜4個、0〜3個、0〜2個、0〜1個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、2〜5個、2〜4個、2〜3個、3〜5個、3〜4個又は4〜5個）のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する上記ペプチドの1つの配列を有する。
上記態様のいずれかにおいて、ポリペプチドは、以下：Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；若しくはLys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys、又はこれらの断片でありうる。
上記態様のいずれかにおいて、ポリペプチドは、以下：Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr（3D-An2）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P1）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P1a）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P1b）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys（P1c）；D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys（P1d）、又はこれらの断片（例えば、P1、P1a、P1b、P1c又はP1dのN末端から1〜7アミノ酸の欠失； P1、P1a、P1b、P1c又はP1dのC末端からの1〜5アミノ酸の欠失；あるいはP1、P1a、P1b、P1c又はP1dのN末端から1〜7アミノ酸の欠失とP1、P1a、P1b、P1c又はP1dのC末端からの1〜5アミノ酸の欠失）でありうる。
本明細書において記載するターゲティング部分のいずれかにおいて、この部分は、本明細書に記載するアミノ酸配列から（例えば、Lys-Arg-X3-X4-X5-Lysから）作製することができる、1、2、3、4又は5アミノ酸（例えば、1〜3アミノ酸）の付加又は欠失を含んでもよい。
本明細書において記載するターゲティング部分のいずれかにおいて、この部分は、ポリペプチドのN末端、ポリペプチドのC末端又はその両方に、1又はそれ以上の追加のシステイン残基を有してもよい。他の実施形態において、ターゲティング部分は、ポリペプチドのN末端、ポリペプチドのC末端又はその両方に、1又はそれ以上のチロシン残基を有してもよい。またさらなる実施形態において、ターゲティング部分は、ポリペプチドのN末端、ポリペプチドのC末端又はその両方に、アミノ酸配列Tyr-Cys及び／又はCys-Tyrを有してもよい。
上記態様のいずれかの特定の実施形態において、ターゲティング部分は、15より少ないアミノ酸長（例えば、10より少ないアミノ酸長）である。
上記態様のいずれかの特定の実施形態において、ターゲティング部分は、アミド化されたC末端を有してもよい。他の実施形態において、ターゲティング部分は、BBBを通過して輸送される（例えば、Angiopep-2よりも効率的にBBBを通過して輸送される）。特定の実施形態において、化合物は、酵素単独よりも高い割合（速度）（例えば、少なくとも10％、20％、30％、50％、100％、200％、300％、500％、1000％、2000％、3000％、5000％、10000％高い）でBBBを通過して輸送される。
上記態様のいずれかの特定の実施形態において、融合タンパク質、ターゲティング部分、又はIDUA酵素、断片若しくは類似体を改変（修飾）する（例えば、本明細書に記載のように）。融合タンパク質、ターゲティング部分、又は酵素、断片若しくは類似体を、アミド化、アセチル化するか、又はその両方を行うことができる。そのような改変（修飾）を、ポリペプチドのアミノ又はカルボキシ末端で行うことができる。融合タンパク質、ターゲティング部分、又は酵素、断片若しくは類似体はまた、本明細書に記載の任意のポリペプチドのペプチド模倣物質（例えば、本明細書に記載のもの）を含んでもよい。融合タンパク質、ターゲティング部分、又は酵素、断片若しくは類似体は、多量体形態、例えば、二量体形態（例えば、システイン残基を介してジスルフィド結合により形成される）にあってもよい。
特定の実施形態では、ターゲティング部分、IDUA酵素、断片若しくは類似体は、本明細書に記載のアミノ酸配列を有するが、ただし少なくとも１つのアミノ酸置換（例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、若しくは12の置換）、挿入、又は欠失を有する。ポリペプチドは、例えば、1〜12、1〜10、1〜5、又は1〜3のアミノ酸置換、例えば、1〜10（例えば9、8、7、6、5、4、3、2まで）のアミノ酸置換を有しうる。アミノ酸置換は、保存的又は非保存的でありうる。例えば、ターゲティング部分は、配列番号1、Angiopep-1、Angiopep-2、Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、及びAngiopep-7のいずれかのアミノ酸配列の位置1、10及び15に対応する位置の1、2又は3箇所にアルギニンを有しうる。
上記態様のいずれかにおいて、前記化合物は特に、配列番号1〜105及び107〜117のいずれかを含むか、又はそれからなるポリペプチド（例えば、Angiopep-1、Angiopep-2、Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、及びAngiopep-7）を除外する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチド及びコンジュゲートは、配列番号102、103、104、及び105のポリペプチドを除外する。
上記態様のいずれかにおいて、リンカー（X）は、当技術分野で公知であるか、又は本明細書に記載の任意のリンカーであってよい。特定の実施形態において、リンカーは、共有結合（例えば、ペプチド結合）、化学連結剤（例えば、本明細書に記載のもの）、アミノ酸又はペプチド（例えば、2、3、4、5、8、10個又はそれ以上のアミノ酸）である。
特定の実施形態において、リンカーは、式：
Figure 2015521463
 〔式中、nは2〜15の整数（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14若しくは15）であり；YはA上のチオールであり、ZはB上の一級アミンであるか、又はYはB上のチオールであり、ZはA上の一級アミンである。〕
を有する。特定の実施形態において、リンカーは、N-スクシンイミジル(アセチルチオ)アセテート（SATA）リンカー又はヒドラジドリンカーである。リンカーは、酵素（例えば、IDUA）又はターゲティング部分（例えば、Angiopep-2）と、遊離アミン、システイン側鎖（例えば、Angiopep-2-Cys若しくはCys-Angiopep-2のもの）を介して又はグリコシル化部位を介してコンジュゲートしうる。
特定の実施形態において、化合物は、構造：
Figure 2015521463
 〔式中、「Lys-NH」基は、酵素中に存在するリジン、又はN末端若しくはC末端リジンを表す。〕
を有する。別の例において、化合物は、構造：
Figure 2015521463
 又は
Figure 2015521463
 〔式中、各−NH−基は、それぞれターゲティング部分及び酵素に存在する一級アミノを表す。〕
を有する。特定の実施形態において、ターゲティング部分はAngiopep-2であり、酵素はヒトIDUAである。
他の実施形態において、化合物は、構造：
Figure 2015521463
 〔式中、xは1〜10であり、nは1〜5であり、各−NH−基は、それぞれターゲティング部分及び酵素に存在する一級アミノを表す。〕
を有する。特定の実施形態において、ターゲティング部分はAngiopep-2であり、酵素はヒトIDUAである。nは、1、2、3、4、又は5のいずれであってもよい（例えば1又は3）。xは、例えば1、3、5、7、又は10である（例えば5）。
特定の実施形態において、化合物は、ターゲティング部分（例えば、Angiopep-2）と、IDUA酵素、酵素断片又は酵素類似体を含む融合タンパク質である。
「被験体」は、ヒト又は非ヒト動物（例えば哺乳動物）を意味する。
「ターゲティング部分」とは、特定の細胞型（例えば、肝臓、肺、腎臓、脾臓、若しくは筋肉）に、特定の細胞区画（compartment）（例えばリソソーム）に、又はBBBを通過して、輸送されることができるポリペプチド又はポリペプチド模倣物質などの化合物又は分子を意味する。特定の実施形態において、ターゲティング部分は、脳の内皮細胞上に存在する受容体に結合し、それによって、トランスサイトーシスによりBBBを通過して輸送されることができる。ターゲティング部分は、細胞又はBBBの完全性に影響することなく、高レベルの経内皮輸送が得られる分子であってよい。ターゲティング部分は、ポリペプチド又はペプチド模倣物質であってよく、天然のものであっても、又は化学合成若しくは組換え遺伝子技術により製造されたものであってもよい。
被験体における疾患、障害又は症状を「治療すること」とは、治療薬を被験体に投与することにより、疾患、障害又は症状の少なくとも1種の症候を減少させることを意味する。
被験体における疾患、障害又は症状を「予防的に処置すること」とは、疾患症候の発症の前に、治療薬を被験体に投与することにより、疾患、障害又は症状の発生頻度を低下させる又は重症度を低減することを意味する。
「BBBを通過して効率的に輸送される」ポリペプチドとは、少なくともAngiopep-6と同程度に効率的にBBBを通過する（すなわち、参照により本明細書に組み入れられるものとする、2007年5月29日出願の米国特許出願第11/807,597号に記載のin situ脳灌流アッセイにおいて、Angiopep-1（250 nM）よりも38.5％以上高い）ことができるポリペプチドを意味する。従って、「BBBを通過して効率的に輸送されない」ポリペプチドは、より低いレベルで脳に輸送される（例えば、Angiopep-6よりも低い効率で輸送される）。
「特定の細胞型に効率的に輸送される」ポリペプチド又は化合物とは、ポリペプチド又は化合物が、対照物質より、又はコンジュゲートの場合、コンジュゲートされていない薬剤と比較して、少なくとも10％（例えば、25％、50％、100％、200％、500％、1,000％、5,000％、若しくは10,000％）を超える程度で、その細胞型に蓄積することができる（細胞への輸送の増加、細胞からの排出の減少、又はその組合せのいずれかによる）ことを意味する。そのような活性は、参照により本明細書に組み入れられるものとする国際特許出願公開第WO 2007/009229号に詳細に記載されている。
「実質的な同一性」又は「実質的に同一の」は、2つの配列（参照配列と対象の配列）を最適に整列した場合、参照配列と同じポリペプチド又はポリヌクレオチド配列をそれぞれ有するか、あるいは、参照配列内の対応する位置において同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドが規定したパーセントであるポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、参照配列と実質的に同一であるアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％の同一性を有する。ポリペプチドについては、比較配列の長さは、一般に少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、90、100、150、200、250、300、又は350個の連続するアミノ酸（例えば、全長配列）であろう。核酸については、比較配列の長さは一般に少なくとも5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個の連続するヌクレオチド（例えば、全長ヌクレオチド配列）であろう。配列同一性は配列分析ソフトウエア（例えば、Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center、1710 University Avenue、Madison、WI 53705の配列分析ソフトウエアパッケージ）を用いてデフォルト設定で測定することができる。かかるソフトウエアは様々な置換、欠失、及び他の改変に対して相同性の程度を割り当てることにより類似配列をマッチさせることができる。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
IDUA酵素前駆体のアミノ酸配列である。成熟酵素はこの配列のアミノ酸27〜653を含む。 ヒスチジン（his）タグあり又はなしのいずれかでAngiopep-2（An2）に融合したIDUAをコードするcDNA構築物のプラスミドマップである。構築物はpcDNA3.1などの好適な発現ベクター中にサブクローニングした。 8つのIDUA及びEPiC-IDUA融合タンパク質の概略図である。 抗IDUA抗体、抗Angiopep-2抗体又は抗ヘキサヒスチジン抗体を用いたウエスタンブロットであり、CHO-S細胞培地中で検出されたIDUA及びEPiC-IDUA融合タンパク質の発現レベルを示す。 Aは、クーマシー染色SDS-PAGEゲルのイメージであり、CHO-S培地から精製されたIDUA及びEPiC-IDUA融合タンパク質を示す。Bは、クーマシー染色SDS-PAGEゲルのイメージであり、Hisタグが除去された又は除去されていないIDUA-His及びAn2-IDUA-Hisタンパク質を示す。下は、Hisタグの存在又は不在（Hisタグの除去を確認するため）及びAn2タグの存在を検出するための抗His抗体又は抗An2抗体を用いたウエスタンブロットである。 CHO細胞における組換えIDUAの精製のためのプロトコールを示す表である。 Aは、SP-セファロース（強カチオン交換樹脂）を用いた最終ステップの間のIDUAの精製プロフィールを示すグラフである。挿入図は、溶出時の種々の画分におけるIDUAのレベルを示すクーマシー染色SDS-PAGEゲルのイメージである。Bは、Hisタグあり又はなしの種々のバッチからのIDUA及びAn2-IDUAの再現可能な精製を示すクーマシー染色SDS-PAGEゲルである。Cは、in vitro脳灌流及びin vitroアッセイのために十分な量のIDUA及びAn2-IDUAの精製を示すクーマシー染色SDS-PAGEゲルである。 基質4-メチルウンベリフェリル-α-L-イズロニドに対するIDUA酵素の反応を示す概略図である。この基質はIDUAにより加水分解されて4-メチルウンベリフェロン（4-MU）となり、これは放出波長450nm及び励起波長365nMを用いてFarrandフィルターフルオロメーターにより蛍光的に検出される。 IDUA-His8、IDUA、An2-IDUA-His8、及び市販のIDUA-His10が同様の酵素活性を有することを示す表である。 MPS-I線維芽細胞におけるIDUA、IDUA-His及びAn2-IDUA-HisによるGAGの低減を示すグラフである。 細胞培養培地中の漸増濃度のIDUA又はAn2-IDUA酵素に暴露した後のMPS-I線維芽細胞における細胞内IDUA活性を示す一連のグラフである。 過剰のM6P、RAP又はAn2の存在下におけるMPS-I線維芽細胞によるIDUAタンパク質の取込みを示すグラフである。 A〜Cは、漸増する量のAn2（図13のA）及びM6P（図13のB）を用いたMPS-I線維芽細胞によるIDUAタンパク質のM6P受容体依存的取込みを示すグラフである。Cは、漸増する量のLRP1インヒビターRAPの存在下におけるIDUA及びAn2-IDUAの取込みを示す。 Aは、An2ペプチド（1mM）、M6P（5mM）及びRAP（1μm）ペプチド（LRP1インヒビター）の存在下におけるU-87神経膠芽腫細胞によるIDUA及びAn2-IDUA（2又は24時間の暴露）の取込みを示す一連のグラフである。Bは、LRP1によるAn2-IDUAの共免疫沈降を示す一連のウエスタンブロットであり、An2-IDUAがLRP1と相互作用することを証明している。 Aは、IDUA融合タンパク質におけるPNGase F切断部位を示す概略図である。Bは、非変性又は変性An2-IDUAの脱グリコシル化を示すクーマシー染色SDS-PAGEゲルのイメージである。Cは、PNGase Fによる処理前及び後のIDUA/又はAn2-IDUAを示すクーマシー染色SDS-PAGEゲルのイメージである。Dは、U87細胞におけるIDUA及びAn2-IDUA取込みに対する脱グリコシル化の影響を示すグラフである。 健常な線維芽細胞及びMPS-I線維芽細胞におけるAn2のリソソーム取込みを示す一連の蛍光共焦点顕微鏡写真である。 U87細胞によるIDUA、An2-IDUA、Alexa-488-IDUA及びAlexa488-An2-IDUAの取込みを示すグラフである。 BBBを通過するIDUA及びAn2-IDUAのin situ輸送を示す一連のグラフである。 ウシ脳毛細血管内皮細胞と新生ラット星状膠細胞との共培養物から構成されるin vitro BBBモデル（CELLIAL technologies）を示す概略図である。このモデルを用いてBBBを通過する輸送を評価する。 図19に示したin vitro BBBモデルを用いた脳毛細血管内皮細胞を介したAn2-IDUA及びIDUAのトランスサイトーシスの評価を示すグラフである。 RAP又はAn2の存在下におけるin vitro BBBモデルを用いた脳毛細血管内皮細胞を介したAn2-IDUA及びIDUAのトランスサイトーシスの評価を示すグラフである。 MPS-I患者の線維芽細胞におけるAn2-IDUAの用量応答を示すグラフである。 MPS-Iノックアウトマウスの脳ホモジネートにおけるIDUA酵素活性を示すグラフである。ホモジネートは、ノックアウトマウスへのAn2-IDUAの静脈内（IV）注射の60分後に調製した。 MPS-Iノックアウトマウスの脳ホモジネートにおけるIDUA酵素活性を示すグラフである。ホモジネートは、ノックアウトマウスへのAn2-IDUAの静脈内（IV）注射の60分後に調製した。
詳細な説明
本発明は、リンカー（例えばペプチド結合）で連結されたIDUA酵素及びターゲティング部分（例えば、Angiopep-2）を含む化合物に関する。ターゲティング部分は、リソソームへ及び／又はBBBを通過して酵素を輸送することができる。そのような化合物の例として、Angiopep-2-IDUA融合タンパク質がある。これらのタンパク質は、酵素アッセイ及びMPS-Iの細胞モデルの両方においてIDUA酵素活性を維持する。ターゲティング部分（Angiopep-2など）は、BBBを通過してタンパク質を輸送することができるため、これらのコンジュゲートは、末梢活性を有するだけではなく、中枢神経系（CNS）においても活性を有すると予想される。さらに、ターゲティング部分（Angiopep-2など）は、リソソームへのLRP-1受容体を発現する細胞に取り込まれる。従って、本発明者は、これらのターゲティング部分はリソソーム内の酵素濃度を高め、それによって、具体的にはLRP-1受容体を発現する組織及び器官（例えば肝臓、腎臓及び脾臓）において、より有効な治療をもたらすことができると考える。
これらの特徴は、IDUAの静脈内投与はそれ自体が有効なCNS送達をもたらすものではないため、現在の治療方法の最大の欠点の一部を克服することができる。BBBをバイパスする物理的方法、例えば高度に侵襲的でありそのため一般的にはCNS送達の問題の魅力的な解決手段とはならない髄腔内又は頭蓋内投与とは対照的に、本発明は非侵襲的な脳送達を可能にする。さらに、リソソームへの治療薬の輸送の改善によって、標準的な酵素補充療法と比較して、用量の低減又は投与頻度の低減が可能となる。
MPS-I
MPS-Iは、GAGの代謝がIDUA酵素の機能不全に基づいて破壊されているリソソーム蓄積症である。この酵素は、2つのGAG、すなわちヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸に存在する硫酸化α-L-イズロン酸からのスルフェート（硫酸）の除去を触媒し、これがGAGの分解に必要とされる。この機能不全は、正確に代謝されることができないGAGの細胞内集積に至り、これが肝臓、心臓、肺、眼及び骨などの種々の臓器における問題を生じる。さらに、神経学的問題がこれらの疾患の多くに存在する。MPS-Iは常染色体劣性形式で遺伝する。
MPS-Iは疾患の重症度に基づいて分類されている。一般的にMPS-Iは3つの一般群、すなわちハーラー（Hurler）症候群と呼ばれる重度疾患、より重度の低い型（ハーラー-シャイエ（Hurler-Scheie）症候群）、及び軽度型（シャイエ（Scheie）症候群）に分類されるが、疾患の重症度は一般的に連続的な疾患スペクトラムであると考えられる。最も重度の疾患は、IDUA活性の完全な喪失によって生じうる。重度疾患は、精神的退化、身長の低下、肥大臓器、顔貌、例えば平坦な顔面、鼻梁の陥凹及び突出した額、並びに臓器及び骨の肥大を特徴とする。閉塞若しくは感染などの呼吸障害又は心合併症のためにしばしば10歳以前に死に至る。
中度症例では、症候は、3〜8歳で現れ始める。これらの患者は、中度の精神遅滞及び学習困難、低身長、顕著な小顎、進行性の関節硬直、脊髄圧迫、角膜混濁、難聴、心臓疾患、粗大化顔貌、及び臍ヘルニアを有し得る。青年期に呼吸障害、睡眠時無呼吸及び心臓疾患を発症し得る。平均余命は一般的に10代後半から20代前半である。
軽度症例では、認識低下がないか又は軽症であり、5歳以後に症候が現れ始める。周辺症状の一部、例えば緑内障、網膜変性、角膜混濁、手根管症候群又は他の神経圧迫、関節のこわばり、鷲手及び足の変形、短頸、及び大動脈弁疾患、閉塞性気道疾患、並びに睡眠時無呼吸がある。
MPS-Iを引き起こす100種以上の突然変異が同定されている（Prommajan et al., Mol. Vis. 17:456-60, 2011）。これらの突然変異の大部分はミスセンス又はナンセンス変異である。W402X及びQ70Xは白人人口において最も一般的である。突然変異を同定するための詳しい分析が実施されている。例えばBeesley et al., Hum. Genet.109:503-11, 2001; Venturi et al., Hum. Mutat. 20:231, 2002; 及びSun et al., Genet. Mol. Biol. 34:195-200, 2011を参照のこと。
IDUA
本発明は、MPS-Iの治療に有用であるIDUA酵素、又は酵素活性を有するその類似体若しくは断片を用いる。この化合物としては、IDUA、酵素活性を保持しているIDUAの断片、又はヒトIDUA配列に対して実質的に同一（例えば、少なくとも70、80、85、90、95、96、97、98又は99％の同一性）であるアミノ酸配列を含みかつ酵素活性を保持しているIDUA類似体が挙げられる。
ヒトIDUAの配列を図１に示す。成熟IDUAは、全長配列からのN末端26アミノ酸の切断によって形成される。
特定の断片又は類似体が酵素活性を有するかどうか試験するために、当業者は、適当な任意のアッセイを用いることができる。IDUA活性を測定するためのアッセイは、例えば、Hopwood et al., Clin. Sci. 62:193-201, 1982及びHopwood et al., Clin. Chim. Acta 92:257-65, 1979に記載されたものを含み当技術分野で公知である。同様の蛍光分析アッセイもまた以下に記載する。これらのアッセイのいずれかを使用して、当業者は特定のIDUA断片又は類似体が酵素活性を有するかどうか決定することができる。
特定の実施形態において、IDUA断片を使用する。IDUA断片は、少なくとも50、100、150、200、250、300、350、400、450又は500アミノ酸長とすることができる。特定の実施形態において、酵素は、例えば本明細書に記載するポリペプチド修飾のいずれかを用いて、修飾されていてもよい。
IDUA突然変異とIDUA酵素の機能との間の構造-機能関係を解明するためにかなりの研究が行われている。この目的のため、Henrissa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7090-4, 1995に記載されているように、関連するタンパク質間の保存に基づいてIDUAの触媒領域が予測された。さらに、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Thermoanerobacterium saccharolyticum）由来の関連タンパク質β-キシロシダーゼの構造の結晶構造に基づいてホモロジーモデルが作成され、特定の突然変異がわずかな又は大きな変化をタンパク質構造にもたらし、それが突然変異を有する個体が軽度又は重度疾患を示すかどうかに寄与する理由の理解につながった（Rempel et al., Mol. Genet. Metab. 85:28-37, 2005）。他の研究により、重度症例に関連する突然変異が、軽度症例に関連する突然変異よりもIDUA内の多くの数の原子に影響を及ぼす傾向があることが示された（Sugawara et al., J. Hum. Genet. 53:467-74, 2008）。また最近の研究により、Vanza et al., Am. J. Med. Genet. A 149A:965-74, 2009に記載のように、IDUAのC末端が臨床兆候に重要である可能性があることが示唆されている。したがって、この研究はIDUAの構造とその機能との関係を提供している。
ターゲティング部分
本発明の化合物は、本明細書に記載の任意のターゲティング部分、例えば、表1に記載の任意のペプチド（例えば、Angiopep-1、Angiopep-2若しくは逆Angiopep-2）、又はその断片若しくは類似体を特徴とする。特定の実施形態において、ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドに対して少なくとも35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％又はさらには100％の同一性を有してもよい。ポリペプチドは、本明細書に記載の配列の1つと比較して1個以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個）の置換を有してもよい。他の改変を、以下でより詳細に説明する。
本発明はまた、これらのポリペプチドの断片（例えば、機能的断片）をも特徴とする。特定の実施形態において、この断片を、特定の細胞型（例えば、肝臓、眼、肺、腎臓、若しくは脾臓）に効率的に輸送するか、若しくはその中に蓄積させるか、又はBBBを通過して効率的に輸送することができる。前記ポリペプチドのトランケーションは、ポリペプチドのN末端、ポリペプチドのC末端、又はその組合せから1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個又はそれ以上のアミノ酸であってよい。他の断片としては、前記ポリペプチドの内部部分が欠失した配列が挙げられる。
さらなるポリペプチドを、本明細書に記載のアッセイ又は方法の1つを用いることにより同定することができる。例えば、候補ポリペプチドを、従来のペプチド合成により製造し、パクリタキセルとコンジュゲートさせ、実験動物に投与することができる。生物学的に活性なポリペプチドコンジュゲートは、例えば、腫瘍細胞を注入され、コンジュゲートで処置されなかった（例えば、コンジュゲート化されていない薬剤で処置された）対照と比較してコンジュゲートで処置された動物の生存率を増加させる能力に基づいて同定することができる。例えば、生物学的に活性なポリペプチドを、in situ脳灌流アッセイにおいて、実質中のその位置に基づいて同定することができる。
同様に、他の組織での蓄積を決定するためのアッセイを実施することができる。ポリペプチドの標識されたコンジュゲートを動物に投与し、様々な器官における蓄積を測定することができる。例えば、検出可能な標識（例えば、Cy5.5などの近赤外線蛍光分光標識）にコンジュゲートさせたポリペプチドは、生存しているin vivoでの可視化を可能にする。そのようなポリペプチドを動物に投与し、器官中のポリペプチドの存在を検出し、かくして、所望の器官におけるポリペプチドの蓄積の速度及び量を決定することができる。他の実施形態において、ポリペプチドを放射性アイソトープ（例えば、125I）で標識することができる。次いで、ポリペプチドを動物に投与する。一定時間後、動物を犠牲にし、器官を取り出す。次いで、各器官における放射性アイソトープの量を、当技術分野で公知の任意の手段を用いて測定することができる。特定の器官における標識された候補ポリペプチドの量と、標識された対照ポリペプチドの量とを比較することにより、候補ポリペプチドが特定の組織に接近し、そこに蓄積する能力を確認することができる。好適な陰性対照としては、特定の細胞型に効率的に輸送されないことが知られた任意のペプチド又はポリペプチド（例えば、BBBを通過しないAngiopepと関連するペプチド、又は任意の他のペプチド）が挙げられる。
さらなる配列は、米国特許第5,807,980号（例えば、本明細書に記載の配列番号102）、第5,780,265号（例えば、配列番号103）、第5,118,668号（例えば、配列番号105）に記載されている。アプロチニン類似体をコードするヌクレオチド配列の例は、atgagaccag atttctgcct cgagccgccg tacactgggc cctgcaaagc tcgtatcatc cgttacttct acaatgcaaa ggcaggcctg tgtcagacct tcgtatacgg cggctgcaga gctaagcgta acaacttcaa atccgcggaa gactgcatgc gtacttgcgg tggtgcttag（配列番号106；Genbankアクセッション番号X04666）である。アプロチニン類似体の他の例を、国際特許出願第PCT/CA2004/000011号に開示された合成アプロチニン配列（又はその一部）を用いてタンパク質BLAST（Genbank: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を実施することにより見出すことができる。アプロチニン類似体の例は、アクセッション番号CAA37967（GI:58005）及び1405218C（GI:3604747）の下でも見出される。
改変ポリペプチド
本発明において用いられる融合タンパク質、ターゲティング部分、及びIDUA酵素、断片若しくは類似体は、改変アミノ酸配列を有してもよい。特定の実施形態において、前記改変は所望の生物活性（例えば、BBBを通過する能力又は酵素活性）を有意に破壊しない。この改変は、元のポリペプチドの生物活性を減少させる（例えば、少なくとも5％、10％、20％、25％、35％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、若しくは95％）、それに対する影響を有さないか、又はそれを増加させる（例えば、少なくとも5％、10％、25％、50％、100％、200％、500％、若しくは1000％）ことができる。改変ペプチドベクター又はポリペプチド治療薬は、in vivoでの安定性、生体利用能、毒性、免疫学的活性、免疫学的同一性、及びコンジュゲーション特性などのポリペプチドの特性を有するか、又はそれを最適化することができる。
改変としては、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによるもの、又は当技術分野で公知の化学的改変技術によるものが挙げられる。改変は、ポリペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシ末端を含むポリペプチド中のどこでも行うことができる。同じタイプの改変が、所与のポリペプチド中のいくつかの部位に同じ又は異なる程度で存在してもよく、ポリペプチドは2種以上の改変を含んでもよい。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝状であってもよく、それらは分枝鎖を含むか又は含まない環状であってもよい。環状、分枝状、及び分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスの結果生じてもよいし、又は合成的にそれを作製することもできる。他の改変としては、PEG化、アセチル化、アシル化、アセトシドメチル（Acm）基の付加、ADP-リボシル化、アルキル化、アミド化、ビオチン化、カルバモイル化、カルボキシエチル化、エステル化、フィアビンへの共有結合、ヘム部分への共有結合、ヌクレオチド若しくはヌクレオチド誘導体の共有結合、薬剤の共有結合、マーカー（例えば、蛍光若しくは放射性）の共有結合、脂質若しくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、糖鎖付加、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質溶解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化及びユビキチン化などのタンパク質へのアミノ酸の転移RNA媒介性付加が挙げられる。
改変ポリペプチドはまた、ポリペプチド配列中の保存的又は非保存的な、アミノ酸挿入、欠失、又は置換（例えば、Dアミノ酸、デスアミノ酸）を含んでもよい（例えば、そのような変化がポリペプチドの生物活性を実質的に変化させない場合）。特に、本発明のポリペプチドのいずれかのアミノ又はカルボキシ末端への1個以上のシステイン残基の付加は、例えば、ジスルフィド結合による、これらのポリペプチドのコンジュゲーションを容易にすることができる。例えば、Angiopep-1（配列番号67）、Angiopep-2（配列番号97）又はAngiopep-7（配列番号112）を、アミノ末端に1個のシステイン残基（それぞれ、配列番号71、113及び115）又はカルボキシ末端に1個のシステイン残基（それぞれ、配列番号72、114及び116）を含むように改変することができる。アミノ酸置換は、保存的（すなわち、ある残基を同じ一般タイプ若しくはグループの別の残基により置換する場合）又は非保存的（すなわち、ある残基を別のタイプのアミノ酸により置換する場合）であってよい。さらに、非天然アミノ酸を、天然アミノ酸に置換することができる（すなわち、非天然保存的アミノ酸置換又は非天然非保存的アミノ酸置換）。
合成的に作製されたポリペプチドは、DNAによって天然にコードされないアミノ酸の置換（例えば、天然にはない又は非天然アミノ酸）を含んでもよい。非天然アミノ酸の例としては、D-アミノ酸、システインの硫黄原子に結合したアセチルアミノメチル基を有するアミノ酸、PEG化アミノ酸、式NH2(CH2)nCOOH（式中、nは2〜6である）のωアミノ酸、サルコシン、t-ブチルアラニン、t-ブチルグリシン、N-メチルイソロイシン、及びノルロイシンなどの中性非極性アミノ酸が挙げられる。フェニルグリシンはTrp、Tyr、又はPheに置換することができる；シトルリン及びメチオニンスルホキシドは中性非極性であり、システイン酸は酸性であり、オルニチンは塩基性である。プロリンをヒドロキシプロリンで置換することができ、それはコンフォメーション付与特性を保持する。
置換的突然変異誘発により類似体を作製することができ、それは元のポリペプチドの生物活性を保持する。「保存的置換」として同定された置換の例を表2に示す。そのような置換が望ましくない変化をもたらす場合、表2に「例示的置換」として特色付けられるか、又はアミノ酸クラスを参照して本明細書にさらに記載される他のタイプの置換を導入し、生成物をスクリーニングする。
機能又は免疫学的同一性における実質的な改変を、（a）例えば、シート若しくはらせんコンフォメーションとしての、置換領域中のポリペプチド主鎖の構造、（b）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（c）側鎖のかさ高さ、の維持に対するその影響が大きく異なる置換を選択することにより達成する。天然残基は、一般的な側鎖特性に基づいて以下のグループに分割される：
（1）疎水性：ノルロイシン、メチオニン（Met）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、ヒスチジン（His）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、フェニルアラニン（Phe）、
（2）中性疎水性：システイン（Cys）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、
（3）酸性／負荷電：アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、
（4）塩基性：アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、ヒスチジン（His）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、
（5）鎖の向きに影響する残基：グリシン（Gly）、プロリン（Pro）、
（6）芳香族：トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、フェニルアラニン（Phe）、ヒスチジン（His）、
（7）極性：Ser、Thr、Asn、Gln、
（8）塩基性／正荷電：Arg、Lys、His、及び
（9）荷電：Asp、Glu、Arg、Lys、His。
他のアミノ酸置換を表2に列挙する。
Figure 2015521463
ポリペプチド誘導体及びペプチド模倣物質
天然アミノ酸からなるポリペプチドに加えて、ペプチド模倣物質又はポリペプチド類似体も本発明により包含され、本発明の化合物において用いられる融合タンパク質、ターゲティング部分、又はリソソーム酵素、酵素断片若しくは酵素類似体を形成することができる。ポリペプチド類似体は、鋳型ポリペプチドのものと類似する特性を有する非ペプチド薬剤として製薬業界において一般的に用いられている。非ペプチド化合物は「ペプチド模倣物質」又はペプチド模倣剤と呼ばれる（Fauchereら、Infect. Immun. 54:283-7, 1986及びEvansら、J. Med. Chem. 30:1129-39, 1987）。治療上有用なペプチド又はポリペプチドと構造的に関連するペプチド模倣物質を用いて、等価な、又は増強された治療又は予防効果をもたらすことができる。一般的には、ペプチド模倣物質は、天然受容体結合ポリペプチドなどの模範的ポリペプチド（すなわち、生物活性若しくは薬理活性を有するポリペプチド）と構造的に類似するが、当技術分野で周知の方法（Spatola, Peptide Backbone Modifications, Vega Data, 1:267, 1983；Spatolaら、Life Sci. 38:1243-9, 1986；Hudsonら、Int. J. Pept. Res. 14:177-85, 1979；及びWeinstein, 1983, Chemistry and Biochemistry, of Amino Acids, Peptides and Proteins, Weinstein(編)Marcel Dekker, New York）によって、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-（シス及びトランス）、-CH2SO-、-CH(OH)CH2-、-COCH2-などの結合により置換されていてもよい1個以上のペプチド結合を有する。そのようなポリペプチド模倣物質は、より経済的な生産、より高い化学的安定性、増強された薬理学的特性（例えば、半減期、吸収、効力、効率）、低下した抗原性などの天然ポリペプチドを超える有意な利点を有しうる。
本明細書に記載のターゲティング部分はBBBを効率的に通過するか、又は特定の細胞型（例えば、本明細書に記載のもの）に標的化することができるが、その有効性はプロテアーゼの存在により減少し得る。同様に、本発明の化合物において用いられるリソソーム酵素、酵素断片又は酵素類似体の有効性も同様に減少し得る。血清プロテアーゼは、切断のためのL-アミノ酸及びペプチド結合などの特定の基質要求性を有する。さらに、血清中のプロテアーゼ活性の多くの顕著な成分であるエキソペプチダーゼは通常、ポリペプチドの第1のペプチド結合に対して作用し、遊離N末端を要する（Powellら、Pharm. Res. 10: 1268-73, 1993）。これに照らせば、改変された型のポリペプチドを使用することが有利であることが多い。改変ポリペプチドは、元のL-アミノ酸ポリペプチドの構造特性を保持するが、有利には、プロテアーゼ及び／又はエキソペプチダーゼによる切断の影響を容易に受けない。
コンセンサス配列の1個以上のアミノ酸の同じタイプのD-アミノ酸との体系的置換（例えば、エナンチオマー；L-リジンの代わりにD-リジン）を用いて、より安定なポリペプチドを作製することができる。かくして、本明細書に記載のポリペプチド誘導体又はペプチド模倣物質は、全てのL-、全てのD-又は混合D,Lポリペプチドであってよい。ペプチダーゼは基質としてD-アミノ酸を用いることができないため、N末端又はC末端D-アミノ酸の存在は、ポリペプチドのin vivoでの安定性を増加させる（Powellら、Pharm. Res. 10:1268-73, 1993）。逆-Dポリペプチドは、L-アミノ酸を含むポリペプチドと比較して、逆配列に整列された、D-アミノ酸を含むポリペプチドである。かくして、L-アミノ酸ポリペプチドのC末端残基は、D-アミノ酸ポリペプチドにとってN末端になるなどである。逆D-ポリペプチドは、L-アミノ酸ポリペプチドと同じ三次コンフォメーション、従って、同じ活性を保持するが、in vitro及びin vivoで酵素的分解に対してより安定であり、かくして、元のポリペプチドよりも高い治療効力を有する（Brady及びDodson, Nature 368:692-3, 1994；Jamesonら、Nature 368:744-6, 1994）。逆-D-ポリペプチドに加えて、コンセンサス配列又は実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む制限付きの（constrained）ポリペプチドを、当技術分野で周知の方法により作製することができる（Rizoら、Ann. Rev. Biochem. 61:387-418, 1992）。例えば、制限付きのポリペプチドを、ジスルフィド架橋を形成することができるシステイン残基を付加することにより作製し、それによって環状ポリペプチドを得ることができる。環状ポリペプチドは遊離N又はC末端を有さない。従って、それらはエキソペプチダーゼによるタンパク質溶解の影響を受けにくいが、それらは勿論、エンドペプチダーゼの影響を受けやすく、ポリペプチド末端で切断しない。N末端若しくはC末端D-アミノ酸を有するポリペプチドと環状ポリペプチドのアミノ酸配列は通常、それぞれ、N末端若しくはC末端D-アミノ酸残基の存在、又はその環状構造を除いて、それらが対応するポリペプチドの配列と同一である。
分子内ジスルフィド結合を含む環状誘導体を、アミノ及びカルボキシ末端などの環化のために選択される位置に好適なS-保護されたシステイン又はホモシステイン残基を組込みながら、従来の固相合成により調製することができる（Sahら、J. Pharm. Pharmacol. 48:197, 1996）。鎖集合の完了後、（1）S-保護基を選択的に除去して、対応する2個の遊離SH-官能基の結果として生じる支持体上での酸化を用いてS-S結合を形成させた後、支持体から生成物を従来通り除去し、好適な精製手順を行うか、又は（2）側鎖を完全に脱保護すると共に支持体からポリペプチドを除去した後、高度に希釈した水性溶液中で遊離SH-官能基を酸化することにより、環化を実施することができる。
分子内アミド結合を含む環状誘導体を、環化のために選択される位置に、好適なアミノ及びカルボキシル側鎖保護されたアミノ酸誘導体を組込みながら、従来の固相合成により調製することができる。分子内-S-アルキル結合を含む環状誘導体を、環化のために選択される位置に、好適なアミノ保護側鎖を有するアミノ酸残基及び好適なS保護システイン又はホモシステインを組込みながら、従来の固相化学により調製することができる。
ポリペプチドのN末端又はC末端残基に作用するペプチダーゼに対する抵抗性を付与するための別の有効な手法は、改変ポリペプチドがもはやペプチダーゼの基質ではなくなるように、ポリペプチド末端に化学基を付加することである。1つのそのような化学的改変は、いずれかの末端、又は両方の末端でのポリペプチドのグリコシル化である。特定の化学的修飾（改変）、特に、N末端グリコシル化は、ヒト血清中でのポリペプチドの安定性を増加させることが示された（Powellら、Pharm. Res. 10:1268-73, 1993）。血清安定性を増強する他の化学的修飾としては、限定されるものではないが、アセチル基などの1〜20個の炭素の低級アルキルからなるN末端アルキル基の付加、及び／又はC末端アミド若しくは置換アミド基の付加が挙げられる。特に、本発明は、N末端アセチル基及び／又はC末端アミド基を担持するポリペプチドからなる改変ポリペプチドを含む。
また、誘導体がポリペプチドの所望の機能的活性を保持するという条件で、通常はポリペプチドの一部ではないさらなる化学部分を含む他のタイプのポリペプチド誘導体も本発明に含まれる。そのような誘導体の例としては、（1）アミノ末端若しくは別の遊離アミノ基のN-アシル誘導体（ここで、アシル基はアルカノイル基（例えば、アセチル、ヘキサノイル、オクタノイル）、アロイル基（例えば、ベンゾイル）若しくはF-moc（フルオレニルメチル-O-CO-）などのブロッキング基であってよい）；（2）カルボキシ末端又は別の遊離カルボキシ若しくはヒドロキシル基のエステル；（3）アンモニア若しくは好適なアミンとの反応により産生されたカルボキシ末端若しくは別の遊離カルボキシル基のアミド；（4）リン酸化誘導体；（5）抗体又は他の生物学的リガンドとコンジュゲートした誘導体、及び他のタイプの誘導体、が挙げられる。
本明細書に記載のポリペプチドへの追加アミノ酸残基の付加の結果生じるより長いポリペプチド配列も、本発明に包含される。そのようなより長いポリペプチド配列は、上記のポリペプチドと同じ生物活性及び特異性を有すると期待することができる。実質的な数の追加アミノ酸を有するポリペプチドは除外されないが、いくつかの大きいポリペプチドは有効な配列を隠す配置をとり、それによって標的（例えば、LRP受容体ファミリーのメンバー）への結合を阻害し得ると認識されている。これらの誘導体は競合的アンタゴニストとして作用し得る。かくして、本発明はポリペプチド又は伸長を有する本明細書に記載のポリペプチドの誘導体を包含するが、この伸長は化合物の細胞標的化活性又は酵素活性を破壊しないのが望ましい。
本発明に含まれる他の誘導体は、短いストレッチのアラニン残基又はタンパク質溶解のための推定部位などにより（例えば、カテプシンによる、例えば、米国特許第5,126,249号及び欧州特許第495 049号を参照されたい）、直接的に、又はスペーサーを介して互いに共有結合した、本明細書に記載のような、2個の同じか、又は2個の異なるポリペプチドからなる二重ポリペプチドである。本明細書に記載のポリペプチドの多量体は、同じか、又は異なるポリペプチド又はその誘導体から形成された分子のポリマーからなる。
本発明はまた、そのアミノ若しくはカルボキシ末端、又はその両方で、異なるタンパク質のアミノ酸配列に連結された、本明細書に記載のポリペプチド、又はその断片を含むキメラ又は融合タンパク質であるポリペプチド誘導体も包含する。そのようなキメラ又は融合タンパク質を、該タンパク質をコードする核酸の組換え発現により製造することができる。例えば、キメラ又は融合タンパク質は、等価な、又はより高い機能的活性を有するキメラ又は融合タンパク質を望ましくもたらす1個の記載のポリペプチドと共有される少なくとも6個のアミノ酸を含んでもよい。
ペプチド模倣物質を同定するためのアッセイ
上記のように、本明細書に記載のポリペプチドの主鎖形状及びファーマコフォア展示を複製するために作製された非ペプチジル化合物（ペプチド模倣物質）は、より高い代謝安定性、より高い効力、より長い作用期間、及びより良好な生体利用能の特性を有することが多い。
ペプチド模倣化合物を、生物ライブラリー、空間的にアドレス指定可能な平行固相若しくは液相ライブラリー、解析を要する合成ライブラリー方法、「1ビーズ1化合物」ライブラリー方法、及びアフィニティクロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー方法などの、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー方法におけるいくつかの手法のいずれかを用いて取得することができる。生物ライブラリー手法はペプチドライブラリーに限られるが、他の4つの手法はペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の小分子ライブラリーにも適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des. 12:145, 1997）。分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当技術分野で、例えば、DeWittら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909, 1993）；Erbら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422, 1994）；Zuckermannら（J. Med. Chem. 37:2678, 1994）；Choら（Science 261:1303, 1993）；Carellら（Angew. Chem, Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994及び同書、2061）；及びGallopら（Med. Chem. 37:1233, 1994）に見出すことができる。化合物のライブラリーを、溶液中（例えば、Houghten, Biotechniques 13:412-21, 1992）又はビーズ（Lam, Nature 354:82-4, 1991）、チップ（Fodor, Nature 364:555-6, 1993）、細菌若しくは胞子（米国特許第5,223,409号）、プラスミド（Cullら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-9, 1992）上若しくはファージ（Scott及びSmith, Science 249:386-90, 1990）上、又はルシフェラーゼ上で提供し、酵素標識を好適な基質の生成物への変換の決定により検出することができる。
本明細書に記載のポリペプチドを同定した後は、限定されるものではないが、溶解度の差（例えば、沈降）、遠心分離、クロマトグラフィー（例えば、アフィニティ、イオン交換、及びサイズ排除）などの任意の数の標準的な方法、又はペプチド、ペプチド模倣物質、若しくはタンパク質の精製のために用いられる任意の他の標準的な技術により単離及び精製することができる。同定された目的のポリペプチドの機能特性を、当技術分野で公知の任意の機能アッセイを用いて評価することができる。細胞内シグナル伝達における下流の受容体機能を評価するためのアッセイを用いるのが望ましい（例えば、細胞増殖）。
例えば、本発明のペプチド模倣化合物を、以下の3段階プロセス：（1）本明細書に記載のポリペプチドを走査して、本明細書に記載の特定の細胞型に標的化するのに必要な二次構造の領域を同定すること；（2）コンフォメーションが制限されたジペプチド代理物を用いて、主鎖形状を改良し、これらの代理物に対応する有機プラットフォームを提供すること；及び（3）最良の有機プラットフォームを用いて、天然ポリペプチドの所望の活性を模倣するように設計された候補のライブラリー中の有機ファーマコフォアを展示すること、を用いて取得することができる。より詳しくは、この3段階は以下の通りである。段階1においては、リード候補ポリペプチドを走査し、その構造を短縮して、その活性のための要件を同定する。一連の元のポリペプチド類似体を合成する。段階2においては、最良のポリペプチド類似体を、コンフォメーションが制限されたジペプチド代理物を用いて調査する。ヨードリジジン-2-オン、ヨードリジジン-9-オン及びキノリジジノンアミノ酸（それぞれ、I2aa、I9aa及びQaa）を、最良のペプチド候補の主鎖形状を研究するためのプラットフォームとして用いる。これらの、及び関連するプラットフォーム（Halabら、Biopolymers 55:101-22, 2000及びHanessianら、Tetrahedron 53:12789-854, 1997に概説されている）を、ポリペプチドの特定の領域に導入して、異なる向きのファーマコフォアの方向を合わせることができる。これらの類似体の生物学的評価により、活性のための形状要件を模倣する改良されたリードポリペプチドを同定する。段階3においては、最も活性の高いリードポリペプチドに由来するプラットフォームを用いて、天然ペプチドの活性を担うファーマコフォアの有機代理物を展示する。このファーマコフォアと足場を、平行合成形式で混合する。ポリペプチドの誘導及び上記段階を、当技術分野で公知の方法を用いる他の手段により達成することができる。
前記ポリペプチド、ポリペプチド誘導体、ペプチド模倣物質又は本明細書に記載の他の小分子から決定された構造機能相関を用いて、類似するか、又はより良好な特性を有する類似体分子構造をリファインし、調製することができる。従って、本発明の化合物はまた、本明細書に記載のポリペプチドの構造、極性、電荷特性及び側鎖特性を共有する分子も含む。
まとめると、本明細書の開示に基づいて、当業者であれば、薬剤を特定の細胞型（例えば、本明細書に記載のもの）に対して標的化するための化合物を同定するのに有用であるペプチド及びペプチド模倣物質スクリーニングアッセイを開発することができる。本発明のアッセイを、低スループット、高スループット、又は超高スループットスクリーニング形式のために開発することができる。本発明のアッセイは、自動化に従うアッセイを含む。
リンカー
IDUA酵素、酵素断片又は酵素類似体を、ターゲティング部分に直接的に（例えば、ペプチド結合などの共有結合を介して）結合してもよいし、又はリンカーを介して結合することもできる。リンカーとしては、化学的連結剤（例えば、切断可能なリンカー）及びペプチドが挙げられる。
いくつかの実施形態において、リンカーは化学的連結剤である。IDUA酵素、酵素断片又は酵素類似体とターゲティング部分を、スルフヒドリル基、アミノ基（アミン）、及び／若しくは炭水化物又は任意の好適な反応基を介してコンジュゲートさせることができる。ホモ二官能性及びヘテロ二官能性架橋剤（コンジュゲーション剤）が、多くの商業的起源から利用可能である。架橋連結に利用可能な領域を、本発明のポリペプチド上に見出すことができる。架橋剤は、可撓性アーム、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個の炭素原子を含んでもよい。架橋剤の例としては、BS3（[ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート]；BS3は、接近可能な一級アミンを標的化するホモ二官能性N-ヒドロキシスクシンイミドエステルである）、NHS/EDC（N-ヒドロキシスクシンイミドとN-エチル-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド；NHS/EDCは一級アミン基とカルボキシル基とのコンジュゲーションを可能にする）、スルホ-EMCS（[N-e-マレイミドカプロン酸]ヒドラジド；スルホ-EMCSは、スルフヒドリル基及びアミノ基に対して反応するヘテロ二官能性反応基(マレイミド及びNHS-エステル)である）、ヒドラジド（多くのタンパク質は露出した炭水化物を含み、ヒドラジドは一級アミンにカルボキシル基を連結するための有用な試薬である）、並びにSATA（N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート；SATAは、アミンと反応し、保護されたスルフヒドリル基を付加する）が挙げられる。
共有結合を形成するために、化学反応基として、ヒドロキシル部分が、ペプチドを改変するのに必要なレベルで生理学的に許容し得る、様々な活性カルボキシル基（例えば、エステル）を用いることができる。具体的な薬剤としては、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、N-ヒドロキシ-スルホスクシンイミド（スルホ-NHS）、マレイミド-ベンゾイル-スクシンイミド（MBS）、γ-マレイミド-ブチリルオキシスクシンイミドエステル（GMBS）、マレイミドプロピオン酸（MPA）、マレイミドヘキサン酸（MHA）、及びマレイミドウンデカン酸（MUA）が挙げられる。
一級アミンは、NHSエステルのための主要な標的である。タンパク質のN末端上に存在する接近可能なα-アミン基及びリジンのε-アミンはNHSエステルと反応する。NHSエステルコンジュゲーション反応物が一級アミンと反応する時にアミド結合が形成され、N-ヒドロキシスクシンイミドを遊離する。これらのスクシンイミドを含有する反応基を、本明細書ではスクシンイミジル基と呼ぶ。本発明の特定の実施形態において、タンパク質上の官能基はチオール基であり、化学反応基はγ-マレイミド-ブチリルアミド（GMBA若しくはMPA）などのマレイミド含有基であろう。そのようなマレイミド含有基を、本明細書ではマレイド基と呼ぶ。
マレイミド基は、反応混合物のpHが6.5〜7.4である場合、ペプチド上のスルフヒドリル基に対して最も選択的である。pH 7.0では、マレイミド基とスルフヒドリル（例えば、血清アルブミン又はIgGなどのタンパク質上のチオール基）との反応速度は、アミンとの反応速度よりも1000倍速い。かくして、マレイミド基とスルフヒドリルとの間に安定なチオエーテル結合を形成させることができる。
他の実施形態において、リンカーは、少なくとも1個のアミノ酸（例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、40又は50個のアミノ酸のペプチド）を含む。特定の実施形態において、リンカーは1個のアミノ酸（例えば、Cysなどの任意の天然アミノ酸）である。他の実施形態において、米国特許第7,271,149号に記載のような、配列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n（式中、nは1、2、3、4、5又は6である）を有するペプチドなどのグリシン-リッチペプチドを用いる。他の実施形態において、米国特許第5,525,491号に記載のような、セリン-リッチペプチドリンカーを用いる。セリンリッチペプチドリンカーとしては、式[X-X-X-X-Gly]y（式中、Xのうち最大2個はThrであり、残りのXはSerであり、yは1〜5である）のもの（例えば、Ser-Ser-Ser-Ser-Gly（式中、yは2以上である））が挙げられる。いくつかの事例においては、リンカーは1個のアミノ酸（例えば、Gly又はCysなどの任意のアミノ酸）である。他のリンカーとしては、固定リンカー（例えば、PAPAP及び(PT)nP、ここでnは2、3、4、5、6又は7である）、並びにα-へリックスリンカー（例えば、A(EAAAK)nA、ここでnは1、2、3、4又は5である）が挙げられる。
好適なリンカーの例は、コハク酸、Lys、Glu、及びAsp、又はGly-Lysなどのジペプチドである。リンカーがコハク酸である場合、その1個のカルボキシル基は、アミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成し、その他のカルボキシル基は、例えば、ペプチド又は置換基のアミノ基とアミド結合を形成することができる。リンカーがLys、Glu、又はAspである場合、そのカルボキシル基はアミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成し、そのアミノ基は、例えば、置換基のカルボキシル基とアミド結合を形成することができる。Lysをリンカーとして用いる場合、さらなるリンカーを、Lysのε-アミノ基と置換基との間に挿入することができる。1つの特定の実施形態において、さらなるリンカーは、例えば、Lysのε-アミノ基と、及び置換基に存在するアミノ基と、アミド結合を形成するコハク酸である。一実施形態において、さらなるリンカーは、Glu又はAsp（例えば、Lysのε-アミノ基とアミド結合を形成し、置換基に存在するカルボキシル基と別のアミド結合を形成する）である、すなわち、置換基はNε-アシル化リジン残基である。
MPS-Iの治療（処置）
本発明はまた、MPS-Iの治療方法に関する。MPS-Iは、グリコサミノグリカン（GAG）の細胞蓄積（個体がこれらの産物を分解する能力がないことによって生じる）を特徴とする。
特定の実施形態において、治療（処置）は、IDUA遺伝子に変異を有すると診断されたが、まだ疾患症候はない被験体（例えば、乳幼児又は2歳未満の被験体）に対して行う。他の実施形態において、治療（処置）は、少なくとも1つのMPS-I症候（例えば、本明細書に記載した症候のいずれか）を有する個体に対して行う。
治療（処置）は、任意の年齢、乳幼児から始まり成人までの被験体に行うことができる。被験体は、出生時、6ヵ月齢又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15若しくは18歳に治療を開始することができる。
投与及び用量
本発明はまた、治療上有効な量の本発明の化合物を含む医薬組成物を特徴とする。本組成物を、様々な薬剤送達系における使用のために製剤化することができる。1種以上の生理学的に許容される賦形剤又は担体を、適切な製剤のために本組成物中に含有させることもできる。本発明における使用のための好適な製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 第17版、1985に見出される。薬剤送達のための方法の簡単な概説については、例えば、Langer（Science 249:1527-1533, 1990）を参照されたい。
医薬組成物は、予防的及び／又は治療的処置のための、非経口、鼻内、局所、経口、又は経皮手段などによる局所投与のために意図される。医薬組成物を、非経口的に（例えば、静脈内、筋肉内、若しくは皮下注射）、又は経口摂取によるか、又は血管症状若しくは癌症状に罹患した領域での局所適用若しくは関節内注入により投与することができる。さらなる投与経路としては、血管内、動脈内、腫瘍内、腹腔内、心室内、硬膜内、並びに鼻、眼、強膜内、眼窩内、直腸、局所、若しくはエアロゾル吸入投与が挙げられる。デポー注射又は浸食性埋込み物若しくは成分などの手段による、持続放出投与も本発明に特に含まれる。かくして、本発明は、許容される担体、好ましくは、水性担体、例えば、水、緩衝化水、生理食塩水、PBSなどに溶解又は懸濁した上記薬剤を含む非経口投与のための組成物を提供する。前記組成物は、pH調節剤及び緩衝化剤、等張性調節剤、湿潤剤、界面活性剤などの生理学的条件を近似するように必要な製薬上許容される補助物質を含んでもよい。本発明はまた、錠剤、カプセル剤などの製剤化のための結合剤又は充填剤などの不活性成分を含んでもよい、経口送達のための組成物も提供する。さらに、本発明は、クリーム、軟膏などの製剤化のための溶媒又は乳化剤などの不活性成分を含んでもよい、局所投与のための組成物を提供する。
これらの組成物を、従来の滅菌技術により滅菌するか、又は滅菌濾過することができる。得られる水性溶液を、使用のために充填するか、又は凍結乾燥し、凍結乾燥調製物を投与前に滅菌水性担体と混合することができる。調製物のpHは、典型的には、3〜11、より好ましくは5〜9又は6〜8、最も好ましくは7〜8、例えば、7〜7.5であろう。固体形態の得られる組成物を、それぞれ固定量の上記薬剤（1又は複数）を含む複数の単回用量単位中、例えば、錠剤又はカプセル剤の密閉包装中に充填することができる。固体形態の前記組成物を、局所適用可能なクリーム又は軟膏のために設計された絞れるチューブなどの、自在量のための容器中に充填することもできる。
有効量を含む組成物を、予防的又は治療的処置のために投与することができる。予防的適用においては、組成物を、IDUA遺伝子における変異を有すると診断された被験体に投与することができる。本発明の組成物を、被験体（例えば、ヒト）に、上記障害の発症を遅延させる、減少させる、又は好ましくは防止するのに十分な量で投与することができる。治療的適用においては、MPS-Iに既に罹患している被験体（例えば、ヒト）に、その障害及びその合併症の症候を治癒するか、又は少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与する。この目的を達成するのに十分な量を、「治療上有効な量」、疾患又は医学的症状に関連する少なくとも1つの症候を実質的に改善するのに十分な量と定義する。例えば、MPS-Iの治療においては、前記疾患又は症状の任意の症候を減少させ、防止し、遅延させ、抑制するか、又は停止させる薬剤又は化合物は治療上有効であろう。薬剤若しくは化合物の治療上有効な量は、疾患若しくは症状を治癒させるのに必要ではないが、疾患若しくは症状の開始を遅延させる、妨害するか、若しくは防止するか、又は疾患若しくは症状の症候が改善するか、又は疾患若しくは症状の期間が変化するか、又は例えば、個体における重篤度が低いか、又は回復が加速されるような、疾患若しくは症状のための治療を提供するであろう。
この使用にとって有効な量は、疾患若しくは症状の重篤度及び被験体の体重及び全身状態に依存し得る。ラロニダーゼ（laronidase）は、0.58mg/kg体重の毎週の静脈内投与が推奨される。本発明の化合物は、例えば同等の投与量（すなわち、ラロニダーゼに対する輸送部分及びリンカーの追加の分子量を考慮して）及び頻度で投与しうる。化合物は、イズロナーゼ（iduronase）等量で、例えば、0.01、0.05、0.1、0.5、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0又は5mg/kgを、毎月、隔週、毎週、週に2回、一日おき、毎日又は1日2回で投与することができる。哺乳動物（例えば、ヒト）に適用される本発明の方法において用いられる本発明の組成物の治療上有効な量を、当業者であれば、哺乳動物の年齢、体重、及び症状における個々の差異を考慮して決定することができる。本発明の特定の化合物はBBBを通過しリソソームに侵入する高い能力を示すため、本発明の化合物の用量は、コンジュゲート化されていない薬剤の治療効果のために必要な相当する用量よりも低いものであってよい（例えば、約90％、75％、50％、40％、30％、20％、15％、12％、10％、8％、7％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、又は0.1％に等しい又はそれ未満）。治療される被験体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）において望ましい結果（例えば、GAG蓄積の低減）をもたらす量である有効量の本発明の薬剤を、該被験体に投与する。当業者であれば、治療上有効な量を経験的に決定することもできる。
有効量を含む本発明の組成物の単回又は複数回投与を、治療する医師により選択される用量レベル及びパターンで実行することができる。用量及び投与スケジュールを、被験体における疾患又は症状の重篤度に基づいて決定及び調整し、臨床医により一般的に実施されるか、又は本明細書に記載の方法に従う治療過程を通してモニターすることができる。
本発明の化合物を、従来の治療方法若しくは療法と共に用いるか、又は従来の治療方法若しくは療法とは別々に用いることができる。
本発明の化合物を他の薬剤との併用療法において投与する場合、それらを個体に対して連続的に、又は同時に投与することができる。あるいは、本発明に係る医薬組成物は、本明細書に記載のような製薬上許容される賦形剤、及び当技術分野で公知の別の治療薬若しくは予防剤と共に、本発明の化合物の組合せを含んでもよい。
以下の実施例は、本発明を例示する目的であり、本発明を限定するものではない。
[実施例1]
IDUA融合タンパク質構築物及び哺乳動物細胞における発現
完全長ヒトIDUA cDNAクローン（NM_000203.2）をOriGeneから入手した。Angiopep-2（An2）のコード配列及びTEV切断可能ヒスチジンタグのコード配列を、PCRで作製した。Hisタグ有り及び無しのcDNA構築物を、適切な発現ベクター、例えばpcDNA3.1（Qiagen GigaPrep）（図2）内にCMVプロモータの制御下でサブクローニングした。すべての研究対象候補のIDUA及びEPiC-IDUAプラスミド（切断可能ヒスチジンタグ有り/無し）を、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（PEI）を用い、Freestyle CHO発現培地（無血清培地、Invitrogen）を用いて、市販のCHO-S発現系（FreeStyle(商標)Max発現系、Invitrogen）内にトランスフェクトした。これらの系において、細胞を懸濁液中で増殖させ、発現プラスミドのトランスフェクションに続いて、融合タンパク質を培養培地で分泌させた。培養及びトランスフェクションパラメータを、小規模実験における最大発現のために最適化した（30ml）。細胞培養培地での組換え融合タンパク質の発現を、蛍光発生基質4-メチルウンベリフェリルα-L-イズロニドを用いてIDUA酵素活性を測定すること、及び、抗IDUA、抗Angiopep-2、又は抗ヘキサヒスチジン抗体を使用したウエスタンブロッティングによりモニターした。図3に示すように、8つのIDUA及びEPiC-IDUA融合タンパク質を設計し、ウエスタンブロットにより細胞培地で検出された発現レベルにより示されるようにCHO-S細胞内で発現させた（図4）。以下の構築物を除き、良好な発現レベルが観察された:IDUA-An2-His、An2-IDUA-An2、及びAn2-IDUA-An2。
[実施例2]
IDUA融合構築物の発現及び精製
以下のステップは、IDUA融合タンパク質のトランスフェクション、発現、及び精製のための最適化された条件を記述する。
トランスフェクションは以下のとおり実施した。トランスフェクションの前日に、***CHO-S細胞（細胞5×108個/360mlの培地）を、Gibco FreeStyle CHO発現培地+8mM L-グルタミンを培養培地として用いて3-L無菌フラスコ内で***させた。翌日に細胞を計数し、総細胞数を細胞約1×109個とした。2つのT-75無菌培養フラスコを用意し、「DNA」及び「PEI」とラベルした。70mlの培養培地をそれぞれの管に添加した。2mlの1mg/ml PEI（2mg）を「PEI」とラベルした管に添加し、1mgのDNAを「DNA」とラベルした管に添加した（DNA:PEI比=1:2）。両方のフラスコを穏やかに混合し、室温で15分間立てておいた。次にPEI溶液をDNA溶液に添加した（逆ではない）。次に管を穏やかに混合し、室温で正確に15分間立てておいた。DNA/PEI複合体（140ml）を3-Lフラスコ内の360mlの懸濁培養物に添加し、フラスコを37℃、8％CO2に設定されたインキュベータ内のオービタルシェーカープラットフォーム（130rpm）上でインキュベートした。4時間のインキュベーション後、500mlの培養培地を添加し、インキュベータの温度を31℃まで下げた。フラスコを5日間、31℃、130rpm、8％CO2下でインキュベートした。次に、遠心分離（2000rpm、5分）により細胞を回収し、馴化培地を濾過し（0.22μm）、4℃で貯蔵した。
タバコエッチウイルス（Tobacco Etch Virus）に見出される高度に部位特異的なシステインプロテアーゼであるTEVプロテアーゼによる切断可能部位の消化を含む2段階クロマトグラフィーで、ヒスチジンタグを含有する融合タンパク質の精製を実施した。精製順序は以下のとおりである。細胞培養上清の清澄化を、遠心分離により又は清澄化フィルタ（5〜0.6μm）を用いて実施し、続いて0.2μmカットオフフィルタで滅菌濾過した。Ni-NTA（ニッケル2+-ニトリロ三酢酸） Superflow樹脂（QIAGEN）を用いたニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ポリヒスチジンタグ付加タンパク質の捕獲を以下のとおり実施した。まず、カラムを50mM Na2HPO4 pH8.0、200mM NaCl、10％グリセロール、25mMイミダゾールで平衡化した。次に清澄化された上清をロードし、続いてUV280吸光度が安定するまで平衡化バッファーを用いて洗浄した。50mM Na2HPO4 pH8.0、200mM NaCl、10％グリセロール、250mMイミダゾールでカラムからタンパク質を溶出した。最後に、0.5M NaOHを用いて30分の接触時間でカラムをその場で浄化し、続いて平衡化バッファーを用いて再生させた。
ヒスチジンタグの除去を以下のとおり実施した。高量のタンパク質を含有する画分を、TEVプロテアーゼバッファー（50mM Tris-HCl pH8.0、0.5mM EDTA、及び1mM DTT）で透析した。次に融合タンパク質を、TEVプロテアーゼとともに16時間+4℃でインキュベートした。最後に、融合タンパク質をNi-NTA平衡化バッファー（50mM Na2HPO4pH8.0、200mM NaCl、10％グリセロール、25mMイミダゾール）で透析した。
Ni-NTA Superflow樹脂（QIAGEN）を用い、フロースルーモードで、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによるポリヒスチジンタグ、TEV-His-タグ付加、及び非切断タンパク質の捕獲を以下のとおり実施した。まず、カラムを50mM Na2HPO4 pH8.0、200mM NaCl、10％グリセロール、25mMイミダゾールで平衡化した。消化されたタンパク質をカラムにロードし、続いてUV280吸光度が安定するまで平衡化バッファーを用いて洗浄した。融合タンパク質をフロースルーで収集した。望ましくない物質を、50mM Na2HPO4 pH8.0、200mM NaCl、10％グリセロール、250mMイミダゾールで溶出した。最後に、PBSバッファーでの融合タンパク質を含有するフロースルー画分のバッファー交換により、調合を実施した。
第1のNi-NTAクロマトグラフィーステップ後に、溶出されたHis-タグタンパク質は良好な純度を示す（図5A）。さらに、Hisタグ付加をTEV切断により除去し、精製IDUA又はAn2-IDUAを提供することができた（図5B）。
ヒスチジン無しのタンパク質も精製した。ヒスチジンタグの使用は、タンパク質精製を数ステップの容易なものとするためであるが、それはTEVプロテアーゼでの消化によるタグの除去も必要とする。大小にかかわらず、すべてのタグがタンパク質の生物活性に干渉し、その挙動に影響する可能性がある。加えて、構築物内にTEV消化部位を含めるために、切断後にC末端側に残る余分なアミノ酸が必要だった。これもやはりタンパク質の挙動に影響し得る。最後に、市販のTEVプロテアーゼの使用は、たとえ小規模でも厄介であり、製造コストの約10％までを占め得る。この問題を克服するために、Hisタグ無しの構築物を設計し（図2）、高純度を得るための精製プロセスを開発した。図6に記載のプロトコルを用い、Hisタグ無しのIDUAを精製した。SP-セファロース（強カチオン交換樹脂）を用いた最終ステップでのIDUAの精製プロファイルを、図7Aに示す。溶出中の画分のSDS-PAGE/クーマシー（図7Aに挿入）により示されるように、高純度を得ることができた。さらに図7B及び7Cは、IDUA及びAn2-IDUAを複数のバッチから、in vivo脳灌流及びin vitro実験に十分な量で再現性よく精製できたことを示す。
[実施例3]
EPiC-IDUA活性試験
EPiC-IDUA酵素活性を、未精製タンパク質（依然として培養培地中にある）を用いた、4-メチルウンベリフェリル-α-L-イズロニド（4-MUBI）を基質とする蛍光定量アッセイにより、in vitroで判定した。基質をIDUAにより4-メチルウンベリフェロン（4-MU）へと加水分解し、それをFarrandフィルタ蛍光光度計で450nmの発光波長及び365nMの励起波長を用いて蛍光定量的に検出した。IDUA活性に比例する4-MUの濃度をアッセイで判定するため、既知量の4-MUの標準曲線を用いた。
融合タンパク質において酵素の活性は保存され、蛍光定量的ユニットは、基質に添加されるEPiC-IDUA融合タンパク質の質量に比例することが予測される。
インハウスで細胞培養の細胞培養上清中に発現させた3つの異なるタンパク質の酵素活性を調べ、市販のIDUA-10xHisと比較した。インハウスで作製した酵素の酵素活性は、IDUA-10xHisと類似のレベルを示し（図9）、An2との融合後に酵素活性が保存されていることを示した。
発現タンパク質が細胞中のGAG蓄積を減少させることができるかどうかを判定するため、MPS-I患者から採取された線維芽細胞を用いた。MPS-I又は健常ヒト線維芽細胞（Coriell institute）を、10％ウシ胎児血清（FBS）を有するDulbecco改変イーグル培地（DMEM）中に細胞250,000個/ウェルで6ウェル皿にプレートし、37℃、5％CO2下で培養した。4日後、細胞をリン酸ウシ血清（phosphate bovine serum:PBS）で1回、低スルフェートF-12培地（Invitrogen、catalog # 11765-054）で1回洗浄した。10％透析FBS（Sigma、catalog # F0392）及び10μCi 35S-硫酸ナトリウムを含有する1mlの低スルフェートF-12培地を、組換えIDUA及びEPiC-IDUAタンパク質の不在又は存在下で細胞に添加した。線維芽細胞を37℃、5％CO2下でインキュベートした。48時間後、培地を除去し、細胞をPBSで5回洗浄した。次に、細胞を0.4ml/ウェルの1N NaOH中で溶解し、60℃で60分間加熱し、タンパク質を可溶化した。μBCAタンパク質アッセイのため、アリコートを除去する。放射活性を液体シンチレーションカウンタで計数する。データをタンパク質μg当たりの35S CPMとして表す。
第1の実験において、IDUA（Hisタグ有り及び無し）及び1つのEPiC-IDUA誘導体のみを試験した。第1の融合タンパク質についての結果は、Angiopep-2との融合後に酵素の活性が保存されていることを示した。健常線維芽細胞において測定されるものに対してMPS-I線維芽細胞におけるGAGの減少の用量反応を観察した（図10）。図22に示すように、同様の結果がAn2-IDUAについても観察された。
[実施例4]
MPS-I線維芽細胞における細胞内取込み（エンドサイトーシス）のin vitro評価
（a）組換えIDUAタンパク質が細胞により取り込まれるかどうかを判定し、及び（b）ネイティブIDUAと融合IDUAとの間の取込みレベルを比較するため、MPS-I線維芽細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）を有するDulbecco改変イーグル培地（DMEM）中に細胞100,000個/ウェルで12ウェル皿にプレートし、37℃、5％CO2下で培養した。4日後、培地を変え、IDUA及びAn2-IDUA融合タンパク質の取込みをin vitroで以下のとおり評価した。精製IDUA及びAn2-IDUAの濃度を高めながら、それぞれのMPS-I線維芽細胞ウェルに添加した。細胞を37℃で最大24時間さらに培養した。細胞をPBSで十分に洗浄し、24時間の曝露期間内の異なる時点で培地を除去した。最後に、細胞を0.4Mギ酸ナトリウム、pH3.5、0.2％ Triton X-100中で溶解した。酵素活性アッセイをそれぞれの条件について実施した。結果を図11に示す。
これら結果に基づくと、An2-IDUAはネイティブ酵素IDUAと同様の線維芽細胞に関するアフィニティ定数を有し、An2ペプチドがIDUAの取込み及びエンドサイトーシスに影響を与えないことを示している。取込みは24時間まで時間依存的で線形であることが見出された。加えて、取込み機構は高アフィニティを有する飽和機構であるようである。
[実施例5]
M6P、An2、及びRAP存在下でのMPS-I線維芽細胞によるin vitro取込み
前節に記載のMPS-I線維芽細胞を24時間、2.4nMのIDUA又はAn2-IDUAとともに、過剰量のM6P、RAP、又はAn2の存在下でインキュベートした。図12に示すように、An2-IDUA及びネイティブIDUAの両方のMPS-I線維芽細胞内への取込みが、主にM6P受容体依存性である。
酵素のM6P受容体依存性取込みを、M6P、An2の量を漸増させながら、また、ネイティブ及びEPIC酵素の量を漸増させながら、LRP1インヒビターであるRAPの存在下でさらに研究した。結果を図13A〜13Cに示す。これら実験は、MPS-I線維芽細胞において、An2-IDUA及びネイティブIDUAの両方の取込みが、用量依存的に遊離M6Pとの共インキュベーションにより阻害されたことを確認した。加えて、An2及びLRP1インヒビターRAPは、高酵素濃度であっても、MPS-I線維芽細胞によるAn2-IDUA及びネイティブIDUA取込みに一切影響を与えなかった。
[実施例6]
LRP1高発現U87神経膠芽腫細胞によるin vitro取込み
LRP1受容体の高発現で知られるU87神経膠芽腫細胞における、IDUA及びAn2-IDUAの取込みを評価した。この実験は、細胞によるIDUA及びAn2-IDUAの取込み機構をさらに理解し、EPIC化合物がLRP1受容体を介する取込みにおいて役割を果たし得るかどうかを特に判定するために行われた。U87細胞を培養し、An2ペプチド（1mM）、M6P（5mM）及びRAP（1μm）ペプチド（LRP1インヒビター）の存在下で2時間及び24時間IDUA及びAn2-IDUAに曝露した。図14Aに示す結果は、以下のことを示す:1） U-87におけるAn2-IDUA及びネイティブIDUAの取込みレベルは、MPS-I線維芽細胞と同様である;及び2） U-87において、An2-IDUA及びネイティブIDUAの両方の取込みが主にM6PR依存性である。
次にLRP1 RAW 264.7細胞発現細胞をIDUA又はAn2-IDUAとともにインキュベートした。IDUAに対する抗体で免疫沈降法を実施し、続いてLRP1についてウエスタンブロッティングした。LRP1はプルダウン（沈降）し（図14B）、An2-IDUAがLRP1と相互作用することを示している。
[実施例7]
U87神経膠芽腫細胞による脱グリコシル化IDUA/An2-IDUAのin vitro取込み
PNGase Fを用いた脱グリコシル化後のIDUA及びAn2-IDUAのU87神経膠芽腫細胞における取込みを評価した。この実験は、細胞によるIDUA及びAn2-IDUAのM6P受容体依存性取込み機構を検証するために行われた。IDUA/An2-IDUAをN-グリコシダーゼFに曝露することにより、マンノース-6-リン酸残基（M6P）を含むグリコシル化の除去を実施した。N-グリコシダーゼFはPNGase Fとしても知られ、高マンノースの最内側のGlcNAc残基とアスパラギン残基との間を切断するアミダーゼである（図15A）。脱グリコシル化前、An2-IDUAは変性されているか、又は、未変性状態であるかのいずれかである（図15B）。
U87細胞内の酵素活性の検証前に、SDS-Page/クーマシーにより酵素を解析した（図15C）。U87細胞をグリコシル化/脱グリコシル化IDUA/An2-IDUAに24時間、48nMの酵素濃度で曝露した。これらの結果（図15D）は、グリコシル化がIDUA/An2-IDUAの取込み機構において主要な役割を果たすことを示す。これは、MPS1線維芽細胞及び高比率のLRP1受容体を発現するU87細胞による取込みが主にマンノース6リン酸（M6P）受容体依存性であることを示す、上のすべての結果を確証する。U87細胞において測定された低レベルの酵素活性は、上のクーマシーゲルにおいてグリコシル化/非グリコシル化形態の間のバンドのスメアにより示されるように、PGNase F処理後の酵素の不完全な脱グリコシル化と関係付けることができる。
[実施例8]
リソソームにおけるAn2-IDUAのin vitro取込み及び局在
An2-IDUA融合タンパク質がリソソームに到達するかどうかを判定するために、異なる実験アプローチを用いて共局在研究を実施した。このin vitro方法を条件付ける（qualify）ため、An2を蛍光色素Alexa Fluor 488（緑色プローブ）で標識した。MPS-I患者由来線維芽細胞における蛍光タンパク質の取込み後、リソソームをlysotracker（赤色プローブ）で染色した。共焦点顕微鏡検査は、lysotracker及びAlexa488-An2の良好な共局在を示した（図16）。
非タグ付加IDUA/An2-IDUAの酵素活性を緑色蛍光Alexa Fluor 488タグ付加物質と比較することにより、U87神経膠芽腫細胞におけるIDUA及びAn2-IDUAの取込みを評価した。この実験は、タグ付加が取込みに有害な影響を及ぼすかどうかを検証するために行われた。細胞を0、100、及び1000ngのタグ付加/非タグ付加酵素に曝露した後に、U87細胞における酵素活性を評価した。これらの結果は、IDUA及びAn2-IDUAをAlexa Fluor488色素でタグ付加することが、MPS-I線維芽細胞における酵素活性及び取込みを損なわないことを示す（図17）。
[実施例9]
in vitro輸送研究（トランスサイトーシス）-BBB輸送
IDUA及びEPiC-IDUA誘導体の輸送を測定し特性決定するために、Pierce（Rockford、IL、USA）から入手したIodo-beadsキット及びD-Saltデキストラン脱塩カラムを用いて、精製タンパク質を標準的な手法で放射性標識した。定量を、トランスウェルプレートを用いて、モデルを通過する放射性標識分子量を測定することにより行った。加えて、SDS-PAGEにより又はLS/MSにより、融合タンパク質の完全性を解析し、分子量の判定を可能にし、トランスサイトーシス中に分解が一切生じていないことを保証した。
これら融合タンパク質の脳取込みの試験を、マウスでin vivo脳取込みモデルにより行った（in situ脳灌流としても知られる）。この技術は、血液成分の除去を可能にし、脳を直接放射性標識分子に曝露することを可能にする。簡潔に述べると、マウス脳毛細血管の管腔側からの[125I]-タンパク質の取込みを、マウス脳における薬物取込み研究のために本研究室で採用しているin situ脳灌流法を用いて測定した（Cisterninoら、Pharm. Res. 18:183-90、2001; Dagenaisら、J. Cereb. Blood Flow Metab. 20:381-6、2000）。脳を2〜10分間、1.15ml/分の流速、37℃で、放射性標識化合物で灌流した。放射性標識分子の灌流後、脳を60秒間Krebsバッファーでさらに灌流し、過剰量の[125I]-タンパク質を洗い流した。次にマウスを屠殺し、灌流を停止し、右半球を氷上で単離し、氷***液を用いてデキストラン-70クッション上で前述のとおり毛細血管除去をすぐに実施した（Banksら、J. Pharmacol. Exp. Ther. 302:1062-9、2002）。ホモジネート、上清、ペレット及び灌流液のアリコートを収集し、その含有量を測定し、見かけの分布容積（Vd）を評価した。したがって、BBB初期移動定速（initial transfer constant rate）（Kin）及び放射性化合物の領域分布を判定でき、これは、血清タンパク質との相互作用なしにBBBを通過する化合物の能力を評価することを可能にする。脳実質におけるEPiC-IDUAの目標取込み速度（Kin）は、最低で10-4ml/g/秒となる。比較として、グルコースについて報告されているKinは9.5×10-3であり（Mandulaら、J. Pharmacol. Exp. Ther. 317:667-75、2006）、アルコールについてのKinは1.8×10-4であり（Grattonら、J. Pharm. Pharmacol. 49:1211-6、1997）、モルヒネについてのKinは1.6×10-4である（Seelbachら、J. Neurochem. 102:1677-90、2007）。
BBB輸送評価をIDUA及びEPIC-IDUAについて以下のパラメータで実施した:50nMの放射性標識物質濃度、1.15ml/分で37℃での2分間の灌流時間、及び30秒のすすぎ時間。結果（図18）は、IDUAのみ脳毛細血管内で結合する又は捕捉される可能性があり、脳実質に到達するのは低量であることを示す。1つの説明は、IDUAが約9の等電点を有するという事実であり得る。したがって、このタンパク質は中性pHで正に荷電している。An2-IDUAの場合、脳全体で分布容積の増加を観察した。興味深いことに、ネイティブ酵素と比較して脳実質内に高量（約7倍）が見出された。全体としてこれら結果は、An2の添加がBBBを通過するIDUAの輸送を増加させることを示す。
[実施例10]
BBBモデル（CELLIAL technologies）を用いたin vitro BBB評価
BBBを通過するEPiC-酵素誘導体の輸送もまた、ウシ脳毛細血管内皮細胞と新生ラット星状細胞との共培養物からなるin vitro BBBモデルを用いて評価した（図19）。IDUA及びAn2-IDUA誘導体の輸送を測定し特性決定するために、精製タンパク質を標準的な手法で放射性標識した。定量を、トランスウェルプレートを用いて、モデルを通過する放射性標識分子量を測定することにより行った。加えて、SDS-PAGEにより又はLS/MSにより、融合タンパク質の完全性を解析し、分子量の判定を可能にし、トランスサイトーシス中に分解が一切生じていないことを保証した。An2-IDUA及びIDUA酵素の輸送を、in vitroBBBプロトコルを用いて比較した。図20に示す結果は、BBBを通過するEPIC-IDUAの輸送が、酵素のみと比較して約2倍増加したことを示す。
BBB内皮細胞を通過するEPIC-IDUA及びIDUAの輸送もまた、RAP及びAn2のようなLRP1受容体競合物質の存在下で評価した。図21に示す結果は、IDUAのBBB内皮細胞の通過は、An2輸送依存性であることを示す。
[実施例11]
MPS-IノックアウトマウスにおけるAn2-IDUAの酵素活性
An2-IDUAの静脈内注射1時間後にMPS-Iノックアウトマウスから調製されたマウス脳のホモジネートにおいてIDUA活性を測定した。図23は、An2-IDUAの単回注射が、MPS-Iノックアウトマウス脳ホモジネートにおけるIDUA酵素活性を35％回復させることを示す。同様の結果（酵素活性の約20％の回復）を示す2回目の実験を図24に示す。
[実施例12]
IDUAのペプチドとの化学的コンジュゲーション
ペプチドターゲティング部分、例えばAngiopep-2等を、化学リンカーによりIDUAに結合することができる。一例において、これは上述のSATAリンカーを用いて達成される。化学的コンジュゲーションは以下のスキームを用いて達成することができる。
Figure 2015521463
このスキームにおいて、4当量のSATAをpH8のリン酸バッファー中の酵素と反応させることにより、リンカーを酵素とコンジュゲートする。次に、酵素-リンカーをヒドロキシルアミンで脱保護し、IDUAの遊離スルフヒドリル中間体を得る。次に、この化合物を6当量のMHA-Angiopep-2とコンジュゲートし、酵素-ペプチドコンジュゲートを生成した。
別の一例において、下に示すとおり、酵素をトラウト試薬（2-イミノチオラン（2-iminothialone））と反応させ、次にこれを6当量のMHA-Angiopep-2とコンジュゲートした。
Figure 2015521463
他の実施形態
本明細書で言及したすべての特許、特許出願、及び刊行物（2012年6月15日出願のUS出願第61/660,564号、及び2012年11月30日出願のUS出願第61/732,189号）は、それぞれの独立した特許、特許出願、又は刊行物を参照により組み込むと具体的且つ個別に示した場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれるものとする。

Claims (33)

  1. （a）150アミノ酸未満のペプチド又はペプチド性ターゲティング部分と、（b）IDUA酵素、その活性断片、又はその類似体とを含む化合物であって、該ターゲティング部分と該酵素、断片又は類似体とがリンカーで連結されている、化合物。
  2. 前記ターゲティング部分が配列番号1〜105及び107〜117のいずれかと少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の化合物。
  3. 前記ターゲティング部分がAngiopep-2（配列番号97）の配列を含む、請求項2に記載の化合物。
  4. 前記ターゲティング部分が式Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys（式Ia）を含み、
    式中、
    X3はAsn又はGlnであり、
    X4はAsn又はGlnであり、
    X5はPhe、Tyr、又はTrpであり、
    前記ターゲティング部分が、場合により式Iaに記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含む、請求項1に記載の化合物。
  5. 前記ターゲティング部分が式Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2（式Ib）を含み、
    式中、
    X3はAsn又はGlnであり、
    X4はAsn又はGlnであり、
    X5はPhe、Tyr、又はTrpであり、
    Z1は不在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、又はCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり、
    Z2は不在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr、又はThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり、
    前記ターゲティング部分が、場合により式Ib、Z1又はZ2に記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含む、請求項1に記載の化合物。
  6. 前記ターゲティング部分が式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6（式IIa）を含み、
    式中、
    X1はLys又はD-Lysであり、
    X2はArg又はD-Argであり、
    X5はPhe又はD-Pheであり、
    X6はLys又はD-Lysであり、
    X1、X2、X5又はX6の少なくとも1つがD-アミノ酸である、請求項1に記載の化合物。
  7. 前記ターゲティング部分が式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7（式IIb）を含み、
    式中、
    X1はLys又はD-Lysであり、
    X2はArg又はD-Argであり、
    X5はPhe又はD-Pheであり、
    X6はLys又はD-Lysであり、
    X7はTyr又はD-Tyrであり、
    X1、X2、X5、X6又はX7の少なくとも1つがD-アミノ酸である、請求項1に記載の化合物。
  8. 前記ターゲティング部分が式Z1-X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7-Z2（式IIc）を含み、
    式中、
    X1はLys又はD-Lysであり、
    X2はArg又はD-Argであり、
    X5はPhe又はD-Pheであり、
    X6はLys又はD-Lysであり、
    X7はTyr又はD-Tyrであり、
    Z1は不在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、又はCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり、
    Z2は不在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr、又はThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり、
    X1、X2、X5、X6又はX7の少なくとも1つがD-アミノ酸であり、
    前記ターゲティング部分が、場合によりZ1又はZ2に記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含む、請求項1に記載の化合物。
  9. 前記リンカーが共有結合又は1又はそれ以上のアミノ酸である、請求項1〜8のいずれかに記載の化合物。
  10. 前記共有結合がペプチド結合である、請求項9に記載の化合物。
  11. 前記化合物が融合タンパク質である、請求項10に記載の化合物。
  12. 前記融合タンパク質が、Angiopep-2-IDUA、IDUA-Angiopep-2、又はAngipep-2-IDUA-Angiopep-2を含む、請求項11に記載の化合物。
  13. 前記リンカーが化学的コンジュゲートである、請求項1〜8のいずれかに記載の化合物。
  14. 以下の構造:
    Figure 2015521463
     〔式中、「Lys-NH」基は、酵素に存在するリジン又はN末端若しくはC末端リジンのいずれかを表す。〕
    を有する、請求項13に記載の化合物。
  15. 以下の構造:
    Figure 2015521463
     を有する、請求項14に記載の化合物。
  16. 以下の構造:
    Figure 2015521463
     又は
    Figure 2015521463
     〔式中、各-NH-基は、それぞれターゲティング部分及び酵素に存在する一級アミノを表す。〕
    を有する、請求項13に記載の化合物。
  17. 以下の構造:
    Figure 2015521463
     又は
    Figure 2015521463
     を有する、請求項16に記載の化合物。
  18. 以下の構造:
    Figure 2015521463
     〔式中、xは1〜10であり、nは1〜5であり、各-NH-基は、それぞれターゲティング部分及び酵素に存在する一級アミノを表す。〕
    を有する、請求項13に記載の化合物。
  19. 以下の構造:
    Figure 2015521463
     を有する、請求項18に記載の化合物。
  20. xが5である、請求項18又は19に記載の化合物。
  21. nが1、2又は3である、請求項18〜20のいずれかに記載の化合物。
  22. 前記リンカーがグリコシル化部位を介してコンジュゲートされている、請求項13に記載の化合物。
  23. 前記リンカーがヒドラジド又はヒドラジド誘導体である、請求項22に記載の化合物。
  24. 前記化合物が第2のターゲティング部分をさらに含み、第2のターゲティング部分が前記化合物に第2のリンカーにより連結されている、請求項1〜23のいずれかに記載の化合物。
  25. 請求項1〜24のいずれかに記載の化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  26. ムコ多糖症1型（MPS-I）を有する被験体の治療又は予防的処置方法であって、該被験体に請求項1〜24のいずれかに記載の化合物を投与することを含む方法。
  27. 前記被験体が重度型のMPS-Iを有する、請求項26に記載の方法。
  28. 前記被験体が中度型のMPS-Iを有する、請求項26に記載の方法。
  29. 前記被験体が軽度型のMPS-Iを有する、請求項26に記載の方法。
  30. 前記被験体が神経症状を有する、請求項26に記載の方法。
  31. 前記被験体が5歳未満で治療を開始する、請求項26に記載の方法。
  32. 前記被験体が3歳未満で治療を開始する、請求項31に記載の方法。
  33. 前記被験体が乳幼児である、請求項32に記載の方法。
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