JP2015520856A - ステロール／スタノール又はそれらの誘導体の迅速でハイスループットの分析 - Google Patents

ステロール／スタノール又はそれらの誘導体の迅速でハイスループットの分析 Download PDF

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Abstract

本発明は、複数の試料中の１以上のステロール／スタノール又はそれらの誘導体を分析するための迅速でハイスループットの方法に関する。この方法は、１以上のステロール／スタノール又はそれらの誘導体を含む複数の試料を、マルチベッセルプレート内の個々のベッセル中に導入する工程；マルチベッセルプレート内のそれぞれの試料の１以上のステロール／スタノール又はそれらの誘導体を開裂させて遊離ステロール／スタノールを形成する工程；それぞれの試料の遊離ステロール／スタノールを固相抽出によって抽出する工程；及び、それぞれの試料中の抽出された遊離ステロール／スタノールのレベルを、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法によって検出する工程を含む。この方法においては、遊離ステロール／スタノールは、検出工程の前に、官能基を遊離ステロール／スタノールに付加する更なる誘導体化工程にかけない。【選択図】図１Ａ

Description

[0001]本出願は、２０１２年５月２５日出願の米国仮特許出願６１／６５１，９８２；及び２０１２年９月４日出願の米国仮特許出願６１／６９６，６１３；（これらの両方はそれらの全部を参照として本明細書中に包含する）に対する優先権の利益を主張する。
[0002]本発明は、複数の試料中の１以上のステロール／スタノール又はそれらの誘導体を分析するための迅速でハイスループット（high-throughput）の方法に関する。
[0003]ステロールは、動物（ズーステロール（zoosterols）、例えばコレステロール）及び植物（フィトステロール（phytosterols））における細胞膜の不可欠な成分である。コレステロールは、重要な膜分子、並びにステロイドホルモン、ビタミンＤ、及び胆汁酸の前駆体であるので生命に不可欠である。人間は、そのコレステロールバランス（それが合成、吸収、及び***するコレステロールの量）が変動する。腸細胞中に摂取吸収された後に、実質的に全ての非コレステロールステロール及び多少のコレステロールが、膜ステロール排出輸送体によって腸管内腔中に戻される。殆どの人間は内腔ステロールの約５０％を腸細胞中に吸収するが、過剰吸収症者は６０〜８０％を吸収し、過小吸収症者は約２０〜３０％を吸収する。吸収された後、コレステロールはエステル化されて、トリグリセリド及びリン脂質と共にカイロミクロン中に取り込まれるが、フィトステロールはこのようには挙動しない。
[0004]フィトステロールは人間又は動物において生理学的機能を果たさず、人間又は動物によって合成又は速やかに吸収することができない。正常な生理機能を有する人間は非常に僅かなフィトステロール／スタノールしか吸収しないので、血液中のこれらのアッセイは腸管吸収のマーカーとして役立つ。同様に、コレステロール前駆体のステロールは合成バイオマーカーとして役立つ。フィトステロールが全身から吸収される過剰吸収症者は、増加した吸収マーカーによって診断可能である。稀なＡＢＣＧ５又はＡＢＣＧ８の機能喪失型突然変異を有すると、全てのフィトステロールが吸収され、***されず、これによってフィトステロール血症をもたらし、血漿フィトステロールレベルが１００倍以下上昇し、これは小児線状黄色腫及び若年性アテローム性動脈硬化症に関係する。これも吸収のマーカーであるコレステロール代謝産物のコレスタノールの非常に高いレベルは、幾つかの神経学的欠損と関係する稀な劣性状態である脳腱黄色腫症（ＣＴＸ）において起こる。コレステロール吸収（例えばβ−シトステロール、カンペステロール、コレスタノール）及びコレステロール合成（例えばデスモステロール）の両方のマーカーは、スタチンのようなコレステロール合成をブロックすることができる薬剤、或いはエゼチミブ、フェノフィブレート、補充フィトステロール又はスタノールのようなコレステロール吸収を減少させることができる薬剤によって測定及び操作することができる。
[0005]コレステロール代謝の遺伝性疾患の殆どは、血清中のステロールプロファイルの非侵襲解析によって診断することができる。更に、血漿ステロール／スタノールレベル、特にコレステロール吸収及び／又は合成バイオマーカーの迅速で正確な評価によって、患者の心血管疾患のリスクを予測し、リスク評価を個人化し、脂質低下ライフスタイル／薬剤治療を最適化し、そしてより有効なリポタンパク処置療法を計画することを助けることができる。
[0006]血清中のステロールの通常の分析は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）又は液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を、炎イオン化検出、電子イオン化質量分析（ＥＩ−ＭＳ）等のような種々の検出法と組み合わせて用いる。しかしながら、これらの技術は時間がかかり、通常は、試料分析の感度及び特異性を増加させるために誘導体化のような面倒な予備処理手順が必要である。
[0007]分析前の試料の予備処理は、時間がかかる可能性があり、適切に計画されていない場合には試料分析の感度を低下させる可能性がある。例えば、生体試料からのステロール／スタノールの手作業による抽出は、面倒で時間がかかるプロセスであり、人的エラー及び汚染が導入される可能性がある。ステロール／スタノールの誘導体化は、面倒な工程を導入してプロセスを実施する時間を増加させるだけでなく、誘導体化剤を用いるために不必要で望ましくない毒性が導入される可能性もある。
[0008]したがって、高い感度及び高い正確性で複数の試料中のステロール／スタノールの改良された分析を行うための迅速でハイスループットの技術を開発する必要が当該技術において存在する。本発明はこの必要性に答えるものである。
[0009]本発明の幾つかの態様は、複数の試料中の１以上のステロール／スタノール又はそれらの誘導体を分析するための迅速でハイスループット（high-throughput）の方法に関する。この方法は、１以上のステロール／スタノール又はそれらの誘導体を含む複数の試料をマルチベッセルプレート（マルチ容器プレート）（multi-vessel plate）内の個々のベッセル（個々の容器）（indivisual vessels）中に導入する工程；マルチベッセルプレート内のそれぞれの試料の１以上のステロール／スタノール又はそれらの誘導体を開裂させて（cleaving）遊離ステロール／スタノールを形成する工程；それぞれの試料の遊離ステロール／スタノールを固相抽出（solid phase extraction）によって抽出する工程；及び、それぞれの試料中の抽出された遊離ステロール／スタノールのレベルを、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（liquid chromatography tandem mass spectrometry）によって検出する工程；を含む。この方法において、遊離ステロール／スタノールは、検出工程の前に、遊離ステロール／スタノールに官能基を付加する更なる誘導体化工程にかけない。
[0010]本明細書に記載する方法は、試料からのステロール／スタノールの自動抽出と組み合わせた、種々のステロール／スタノールの同時定量のための高感度で迅速でハイスループットの方法を提供する。この方法は、分析の前にステロール／スタノールを誘導体化する必要がない。検出工程中の種々のステロール／スタノールの定量のためのプロセス全体は、約７分未満で行うことができる。
[0011]プロセス中において、それぞれの工程の後に試料又は試薬をベッセル中に導入又は移す際、或いは試料を保持、反応、及び／又は混合している間において、マルチベッセルプレートのそれぞれのベッセルを、高温に耐えるため、或いは試料が蒸発又は汚染されないようにするために、適合したマルチキャップマット（multi-cap mat）によって密封することができる。
[0012]代表的な態様においては、この迅速でハイスループットのステロール／スタノール分析試験は、４つの非コレステロールステロール／スタノールを測定する。β−シトステロール、カンペステロール、及びコレスタノールは、コレステロール吸収のマーカー（コレスタノール、吸収効率、又は脳腱黄色腫症（ＣＴＸ）を診断するためのマーカー）として測定され；コレステロールの形成における中間体ステロールであるデスモステロールはコレステロール合成のマーカーとして測定された。検出工程中におけるこれらの４つのマーカーを定量するプロセス全体は、約７分未満で行うことができる。
[0013]血漿中のステロール／スタノールレベルを分析することによって、患者がより多い吸収症又は合成症であるかどうかの情報を与えて、これによって医師が薬剤治療を個人化し、より有効なリポタンパク処置療法を計画することを助けることができる。
[0014]本発明の幾つかの態様を用いて、幾つかの状態の予備診断を与え、或いは状態の進行及び／又はその状態を処置するのに用いる治療法の効能を観察することができる。
[0015]本発明の更なる形態、有利性、及び特徴を本明細書において示し、これらは部分的には下記を考察することによって当業者に明らかになるか、或いは本発明の実施によって知見することができる。本出願において開示される発明は、これらの形態、有利性、及び特徴の任意の特定の組又は組み合わせに限定されない。示されている形態、有利性、及び特徴の種々の組み合わせは、本出願において開示される発明を構成すると意図される。
[0016]図１Ａは、自動固相抽出のために用いることができる機器のHamilton Microlab STARを示す写真である。図１ＡはHamilton Microlab STARの外観を示し、図１ＢはHamilton Microlab STARの内部を示す。 図１Ｂは、自動固相抽出のために用いることができる機器のHamilton Microlab STARを示す写真である。図１ＡはHamilton Microlab STARの外観を示し、図１ＢはHamilton Microlab STARの内部を示す。 [0017]図２は、好適なＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムである、Shimadzu Prominence Pumpを有するAB Sciex Model 5500質量分析計を示す写真である。
[0018]本発明は、複数の試料中の１以上のステロール／スタノール又はそれらの誘導体を分析するための迅速でハイスループットの方法に関する。この方法は、プロセスの１以上の工程の自動化されたハイスループットの実施を可能にするシステム又は装置を用いる。
[0019]このシステム／装置には、少なくとも１つのマルチベッセルプレートを含ませることができる。マルチベッセルプレートのそれぞれのベッセルは、試料を保持し、又は試料を１以上の溶媒又は試薬と混合及び／又は反応させるためのユニットである。それぞれのベッセルは、適当な混合を可能にするのに十分に幅広く且つ高く、且つマルチベッセルプレートを自動流体取扱装置及び／又は自動マルチベッセルプレート取扱装置内に取り付けるのを可能にするのに十分に薄いものである。このベッセルは、システムの要件に応じて丸いか又は平坦な底部を有していてよい。
[0020]マルチベッセルプレートは、試料の保持、混合、及び／又は反応中にマルチベッセルプレートのベッセルを密封することができる適合しているマルチキャップマットを有していてよい。マルチベッセルプレート内のベッセルの頂部に接触するマルチキャップマットのライニングは、所望の温度に加熱した際にベッセルを劣化させず且つ汚染させない材料で構成する。例えば、材料はテフロン（登録商標）であってよい。
[0021]場合によっては、マルチベッセルプレートと適合している寸法を有するマルチベッセルプレートホルダーを用いて、一時的な貯蔵のため、或いは試料の保持、混合、及び／又は反応中にマルチベッセルプレートを保持することができる。マルチベッセルプレートホルダーは密封ユニットを有していて、それによって密封ユニットを噛合した際に、マルチベッセルプレートホルダーが適合しているマルチキャップマットをマルチベッセルプレート内のベッセルの頂部上に押し付けてベッセルを密封して、高圧及び高温条件に耐えるようにすることができる。
[0022]このシステム／装置は、場合によっては種々の機能を有していてよいストックマルチベッセルプレートのライブラリーを保持していてよい。例えば、これらを用いて試料を収容すること、或いは特定の反応のため、又は試料中の特定の成分を抽出若しくは分離するための試薬と反応させることなどを行うことができる。マルチベッセルプレートは、必要に応じて形成することができる。例えば、マルチベッセル固相抽出プレートを形成するために、固相抽出カラム／プレートをそれぞれのベッセル中に配置し、適当な溶媒を自動でピペットによって添加して、カラム／プレートをその後の使用のために予備コンディショニングすることができる。
[0023]自動液体／流体取扱装置（又は自動マルチベッセルプレート取扱装置）をシステムにおいて用いることができる。この自動液体取扱装置は、秤量した試料及び／又は試薬をそれぞれのベッセル中に導入することができる。例えば、自動液体取扱装置に、秤量量の試料及び／又は溶媒をそれぞれのベッセル中に自動でピペットによって添加することができる自動ピペット添加装置を含ませることができる。
[0024]自動液体取扱装置にはまた、自動均質化（例えば自動振盪、混合、又は渦流混合（ボルテッキシング）（vortexing））、自動加熱／冷却、或いは同時自動均質化及び加熱／冷却のための部材を含ませることもできる。この自動加熱／冷却はまた、別のマルチベッセルプレート加熱／冷却ユニット上で行うこともできる。同様に、自動均質化は別のマルチベッセルプレート振盪／混合／渦流混合ユニット上で行うことができる。或いは、自動加熱／冷却及び均質化部材は、同じ自動装置内に組み合わせることができる。
[0025]このシステム／装置には更に、マルチベッセルプレート内の容器を標識するための装置、及び標識検出器を含ませることができる。例えば、標識装置は自動バーコード付与装置であってよく、標識検出器は自動バーコード検出器であってよい。標識装置及び標識検出器によって、得られた測定値をベッセル内のそれぞれの試料に正確にマッピングすることが可能になる。
[0026]このシステム／装置は更に、ステロール／スタノール試料を分析するためのマルチベッセルプレート測定ユニットを含む。測定ユニットは、それぞれのベッセルの試料中のそれぞれのステロール／スタノールを自動定量することができる。この測定ユニットはモジュール構造のものにして、それにより測定タスクに応じて異なる測定ユニットを交換することを可能にすることができる。好適な測定ユニットとしては、クロマトグラフィー−質量分析装置が挙げられる。例えば、測定ユニットは液体クロマトグラフィータンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）であってよい。
[0027]このシステム／装置には、マルチベッセルプレート／マット／ホルダーを、装置から、試料及び試薬を添加し、保持し、混合し、インキュベートし、及び測定するための装置に移動させる１以上のロボット又は別のロボット工学装置を有する統合ロボットシステムを含ませることができる。
[0028]このシステム／装置にはまた、データ処理及び制御ソフトウエアを含ませることもできる。知的ソフトウエアプログラムを用いて、マルチベッセルプレートをバッチで操作する際に異なる工程を並行して行うことによって、複数の試料の分析を時間に関して最適化することができる。
[0029]一形態においては、この方法は、１以上のステロール／スタノール又はそれらの誘導体を含む複数の試料をマルチベッセルプレート内の個々のベッセル中に導入する工程；マルチベッセルプレート内のそれぞれの試料の１以上のステロール／スタノール又はそれらの誘導体を開裂させて遊離ステロール／スタノールを形成する工程；それぞれの試料の遊離ステロール／スタノールを固相抽出によって抽出する工程；及び、それぞれの試料中の抽出された遊離ステロール／スタノールのレベルを液体クロマトグラフィータンデム質量分析によって検出する工程；を含む。この方法においては、遊離ステロール／スタノールは、検出工程の前に、遊離ステロール／スタノールに官能基を付加する更なる誘導体化工程にかけない。
[0030]ステロールにはズーステロール（zoo sterols）及びフィトステロール（phytosterols）が含まれる。主要なズーステロールはコレステロールである。コレステロールの合成は、その細胞合成（全ての細胞）及び吸収（腸細胞）によって定まる。合成連鎖における中間ステロールの幾つかは、スクアレン、ラトステロール、及びデスモステロールであり、これらの測定値はコレステロール合成のマーカーとして役立てることができる。コレステロールとの構造類似性を有するステロールは、非コレステロールステロールとも呼ばれる。人間の食餌には、植物（例えば、シトステロール、カンペステロール、及びスティグマステロール）、動物（例えばコレステロール）、貝類源（例えばデスモステロール及びフコステロール）、並びに酵母源からの多くの外因性ステロールが含まれる。
[0031]４０種類を超える異なる植物ステロール（又はフィトステロール）が存在する。フィトステロールはコレステロールと構造が同様であるが、それらの脂肪族側鎖中にメチル、エチル、又は他の基を有する。これらの相違によって、それらの吸収がコレステロールと比べて最小になる。シトステロールは、食餌中の非コレステロールステロールの８０％を構成する。
[0032]これらのステロールのそれぞれ及び当業者に公知の他のものは、本発明の目的のための「ステロール」の定義に含まれる。
[0033]スタノールは単飽和ステロールである。例えば、コレステロールのスタノール代謝産物はコレスタノールと呼ばれ；シトステロールのスタノール代謝産物はシトスタノールと呼ばれる。
[0034]これらのスタノールのそれぞれ及び当業者に公知の他のものは、本発明の目的のための「ステロール」の定義に含まれる。
[0035]本方法は、試料の大きな集合体の中の任意の１以上のステロール／スタノール又は誘導体のレベルの迅速でハイスループットの自動測定を提供する。分析される代表的なステロール／スタノールマーカーとしては、デスモステロール、カンペステロール、コレスタノール、β−シトステロール、スクアレン、ラトステロール、スティグマステロール、及び／又はフコステロールが挙げられるが、これらに限定されない。デスモステロール、カンペステロール、コレスタノール、及びβ−シトステロールは、本方法において分析される代表的なコレステロール合成及び吸収バイオマーカーである。
[0036]この方法を用いて、分析するステロール／スタノール又はそれらの誘導体を含む任意の生体試料からのステロール／スタノールを分析することができる。生体試料は、血漿、血清、赤血球、全血、血小板、白血球、又はこれらの混合物のような血液成分であってよい。分析するステロール／スタノールは、遊離ステロール／スタノール、或いは生体内作用中にステロール／スタノールから誘導される任意の形態（例えばステロール／スタノールエステル）として生体試料中に存在していてよい。
[0037]一態様においては、１以上のステロール／スタノール又はそれらの誘導体を含む複数の試料をマルチベッセルプレート内の個々のベッセル中に導入する工程は、秤量量のそれぞれの試料をそれぞれのベッセル中にピペットで添加すること（pipetting）によって行う。
[0038]ステロール／スタノールは、ステロール／スタノールエステル、ステロールグリコシド、アシル化ステリルグリコシド等のような種々の形態で生体試料中に存在する可能性がある。生体試料中のステロール／スタノールを分析する前に、存在する場合にはステロール／スタノール誘導体から遊離ステロール／スタノールを開裂させることができる。
[0039]一態様においては、それぞれの試料の１以上のステロール／スタノール又はそれらの誘導体を開裂させる工程は、マルチベッセルプレート内のそれぞれの試料中に開裂剤をピペットで添加する工程；それぞれのベッセル内の試料及び開裂剤を含む組成物を渦流混合する工程（ボルテックスする工程）（vortexing）；及びマルチベッセルプレートを所望の温度に加熱する工程；を含む。これらの工程は、自動液体取扱装置、自動均質化（例えば、自動振盪、混合、若しくは渦流混合）、又は自動加熱装置、或いは本明細書に記載する同時自動均質化及び加熱を可能にする装置を用いて行うことができる。
[0040]通常は、開裂工程はステロール／スタノール誘導体を加水分解する工程を含む。例えば、開裂工程には、ステロール／スタノールのエステルを鹸化する（即ちステロール／スタノールエステルを塩基加水分解する）ことを含ませることができる。鹸化反応は、通常は、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムのようなアルカリ水酸化物又はアルカリ性水酸化物触媒（alkali hydroxide or alkaline hydroxide catalyst）の存在下で行う。アルカリ水酸化物又はアルカリ性水酸化物触媒は、エタノール又はメタノールのような溶媒中に溶解することができる。鹸化反応のための温度は、通常は約４０〜約５０℃の範囲である。
[0041]遊離ステロール／スタノールは、固相抽出（solid-phase extraction）（ＳＰＥ）によって試料中の他の成分から更に抽出又は分離する。通常は、商業的に入手できる包装済のポリマー又はガラス製小型使い捨てカラム（カートリッジ）若しくはプレートを用いることができる。
[0042]一態様においては、抽出工程は、開裂工程の後に、マルチベッセルプレート内のそれぞれの試料をマルチベッセル固相抽出プレートに移す工程；及び、それぞれの試料の遊離ステロールをマルチベッセル固相抽出プレートからマルチベッセル回収プレート中に溶出する工程；を含む。これらの工程は、本明細書に記載する自動液体取扱装置を用いて行うことができる。
[0043]ＳＰＥプロセス中においては、試料を、圧力を加えるか又は加えないでＳＰＥカラム／プレートに通すことができる。ＳＰＥの固定相上に保持されるステロール／スタノールを、適当な溶出液を用いることによって固定相から取り除くことができる。溶出されたステロール／スタノールは、次に更なる分析のために回収する。代表的な溶出液としては、ジクロリドメタン、メタノール、又はアセトニトリルが挙げられる。例えば、デスモステロール、カンペステロール、コレスタノール、及びβ−シトステロールの１以上を分析する場合には、分析対象物の良好な回収のためにジクロリドメタンを用いることができる。
[0044]抽出工程には更に、ステロール／スタノール分析の前に、マルチベッセル回収プレート内のそれぞれの試料の溶出された遊離ステロール／スタノールを乾燥する工程；及び、マルチベッセル回収プレート内の乾燥した遊離ステロール／スタノールに再構成溶液を加えて遊離ステロール／スタノールを再構成する工程；を含ませることができる。代表的な再構成溶液としては、メタノール／イソプロパノール／ギ酸溶液、又はメタノール／アセトニトリル溶液が挙げられる。例えば、再構成溶液は、０．１％ギ酸中の８０：２０のメタノール：イソプロパノール、或いは５０：５０のメタノール：アセトニトリルであってよい。
[0045]遊離ステロール／スタノールの抽出及び分離の詳細な説明を実施例１において示す。
[0046]抽出されたステロール／スタノールは、クロマトグラフィー−質量分析によって検出することができる。例えば、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて、血漿及び血清中に含まれる種々のステロール／スタノールを単一の試験で分析することができる。
[0047]試料中のステロール／スタノールの定量分析を行うために、内部標準（internal standard）をマルチベッセルプレート内のそれぞれの試料に添加することができる。内部標準は、例えば内部標準の信号に対するステロール／スタノール試料の信号の比を、標準中に存在する分析対象物の濃度の関数としてプロットすることによって、較正（キャリブレーション）（calibration）のために用いることができる。例えば、内部標準は、コレステロール、或いはコレステリルステアレート、ケトコレステロール等のようなコレステロール誘導体であってよい。内部標準は重水素化内部標準であってよい。重水素化内部標準を用いる場合には、重水素化内部標準は、分析するステロール／スタノールの任意の１以上の重水素化形態であってよい。例えば、デスモステロール、カンペステロール、及びシトステロールを分析する場合には、ｄ６−デスモステロール、ｄ７−カンペステロール、及びｄ７−β−シトステロールの１以上を内部標準として用いることができる。内部標準は、ステロール／スタノール試料をマルチベッセルプレートに導入した後、開裂工程の前、抽出工程の前、又は検出工程の前に添加することができる。通常は、内部標準は、試料をマルチベッセルプレートに導入した直後に添加する。内部標準の添加は、本明細書に記載する自動液体取扱装置を用いて行うことができる。
[0048]以下の実施例は、本発明の特定の態様として、その実施及び有利性を示すために与える。実施例は例示の目的で与えるものであり、いかなるようにも明細書又は特許請求の範囲を限定することは意図しない。
実施例１：ステロール／スタノールのハイスループット分析方法：
[0049]このプロセスの全ての工程は、他に示さない限りにおいてHamilton Microlab STAR上で行った。
[0050]１５０μＬの試料（血漿又は血清）に、５０μＬの重水素化内部標準を加えた。十分に混合した後、１ｍＬのエタノール中２％水酸化カリウムを加え、試料を４５℃において３０分間鹸化反応にかけた。
[0051]Plexa Bond Elut固相抽出（ＳＰＥ）プレートを、５００μＬのメタノール、次に５００μＬのＨＰＬＣグレードの水で予備コンディショニングした。次に、それぞれの試料を１ｍＬのＨＰＬＣグレードの水で清浄化し、次にＳＰＥプレートに施した。正圧を用いて試料をＳＰＥプレートに通した。次に、５００μＬの塩化メチレンを用いて試料をＳＰＥプレートから試料回収プレート中に溶出した。次に、プレートをHamiltonから取り出し、Biotage（登録商標）SPE Dry上に６０℃において約３０分間配置した。次に、プレートをHamiltonに戻し、２００μＬの８０：２０メタノール：イソプロパノール−０．１％ギ酸で試料を再構成した。
[0052]次に、得られた試料をAB Sciex 5500 MS/MS上に注入した。観察した特異遷移は、デスモステロールに関してm/z 367/147；カンペステロールに関してm/z 383/147；コレスタノールに関してm/z 371/95；β−シトステロールに関してm/z 397/147；ｄ６−デスモステロールに関してm/z 373/161；ｄ７−カンペステロールに関してm/z 390/161；ｄ７−β−シトステロールに関してm/z 404/161；であった。試料は誘導体化せず、試料あたりの全実験時間は７分間であった。
実施例２：自動試料調製及び迅速ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のための方法：
[0053]上記の幾つかの態様において記載した適合したマルチキャップマットを有するマルチベッセルプレート、自動液体取扱装置、自動標識装置及び標識検出器、自動ＳＰＥ装置、自動マルチベッセルプレート測定ユニット、並びにデータ処理及び制御ソフトウエアを含む自動システム／装置を用いるステロール／スタノール試料予備処理及び検出を示すように、次の代表的な手順をHamilton Microlab STARシステムでプログラムした。
[0054]予備インキュベート試料調製：
１．試料アリコートチューブを、３２ポジションのHamilton試料キャリア中に１３〜１５のデッキ位置において配置する。ブランクのためのスペース中に空のチューブを配置する。
２．Hamiltonデスクトップ上の"Bartender"ソフトウエアからバッチバーコードを印刷する。
ａ．"Plate BC Sterols Hamilton"を選択する。
ｂ．印刷された最後の標識を表示し、バッチ番号上をダブルクリックしてそれを変更する。
ｃ．"screen data"の下の数値を変更してＯＫをクリックする。
３．File、Printに進み、「一連の標識の番号」を記入して、１つより多いバッチを一度に印刷する。
４．２．５ｍＬのガラスインサートを有する９６ポジションのMicroLiterプレートの前面上にバーコードを付与する（「９６ウェルガラスインサートプレート」と呼ぶ）。
５．Hamiltonデスクトップ上でMicrolab Star Runアイコンを開く。
６．Fileに進み、"Sterols V.1.1"を開く。
７．頂部の緑の矢印をクリックする。
８．幾つの試料がバッチ内にあるかを記入し、ＯＫをクリックする。
９．バーコードがエラーの場合には：試料キャリアを引き抜き、バーコードを取り付け、定位置に押し戻して、Repeatをクリックし、Executeをクリックする。
１０．未だエラーの場合には、手動でバーコード情報を入力する。
１１．運転しながらHamilton法を監視してエラーに対処する。全てのプロンプトにしたがう。
１２．チップを再装填する。充填されていない全てのセットを交換する。ソフトウエアにおいて、手動で番号をタイプしなければならない。
SLIMチップチャンネル；９６をカット（３００μＬ）；ＯＫをクリックする。
SLIM チップ96CO-RE；２８８をアンカット（３００μＬ）；ＯＫをクリックする。
１０００μＬフィルタリングチップ６７２；ＯＫをクリックする。
１３．試料及び９６ウェルガラスインサートプレートを、Hamiltonデッキ上の適切な位置の上に装填する。
ａ．Hamiltonデッキ上の３２ポジション試料キャリア、レーン１３〜１５；
ｂ．Hamiltonデッキ上の９６ウェルガラスインサートプレート、レーン３８、キャリア上のポジション４；
Hamiltonは、１５０μＬの標準、品質参照試料、及び試料（血漿又は血清）を９６ウェルガラスインサートプレート中にピペットで添加する。
１４．試料の移動が完了したら、Hamiltonプログラムは「ＩＳ試薬を正しい試薬プレート中に注入する」ように指示する。内部標準作動溶液は、Hamiltonデッキのレーン１９内のプレートキャリアＦのポジション５内に配さなければならない。次に、Hamiltonは、５０μＬの内部標準をプレート内のそれぞれのインサートにピペットで添加する。
１５．Hamiltonは、「ガラスチューブトレーをカバーして、加熱器／振盪機に移動させ、ＯＫをクリックする」ように指示する。Hamiltonは、「プレートを振盪機上に適切に配することを確実に行って、Velcroストラップを固定し、ＯＫをクリックする」ように指示する。Hamiltonはプレートを渦流混合する。
１６．渦流混合が完了したら、Hamiltonは「Velcoストラップ及びカバーを外し、ガラスチューブトレーを元の位置に戻して、ＯＫをクリックする」ように指示する。
１７．Hamiltonは、「２％ＫＯＨ試薬を適切な試薬プレート中に注入する」ように指示する。２％ＫＯＨ試薬は、Hamiltonデッキのレーン２５内のプレートキャリアＧのポジション５内に配さなければならない。Hamiltonは、１ｍＬの試薬をプレート内のそれぞれのインサートにピペットで添加する。
１８．Hamiltonは、「ガラスチューブトレーをカバーして１分間渦流混合し、Hamilton上の正しい位置に戻す」ように指示する。
１９．渦流混合が完了したら、Hamiltonは、「４５度の水浴中に３０分間配する」ように指示する。
[0055]固相抽出の調整：
２０．インキュベートが完了したら、水浴からプレートを取り出し、卓上に配置してＳＰＥプレート調整中は冷却する。
２１．Hamiltonは、「ＳＰＥプレートを廃棄物回収トレーの頂部上に配置して、適切な位置に配し、正しい試薬プレートをＭｅＯＨ及びＨ２Ｏで満たし、次にＯＫをクリックする」ように指示する。ＳＰＥプレート及び廃棄物回収トレーは、Hamiltonデッキのレーン３８内のキャリアＩのポジション４内に配さなければならない。ＭｅＯＨ試薬プレートは、Hamiltonデッキのレーン１９内のキャリアＦのポジション４内に配さなければならない。Ｈ２Ｏ試薬プレートは、Hamiltonデッキのレーン２５内のキャリアＧのポジション４内に配さなければならない。
２２．Hamiltonは、５００μＬのＭｅＯＨをＳＰＥプレートに添加する。Hamiltonは、５００μＬのＭｅＯＨをＳＰＥプレートにピペットで添加し、次に「ＳＰＥプレート及び廃棄物プレートを正圧マニホルドに移動させ、６ｐｓｉｇ以下の圧力を、３０秒間又は全ての試薬がプレートを通過するまで加え、完了したら、ＳＰＥプレート及び廃棄物プレートをHamilton上の正しい位置に戻して、ＯＫをクリックする」ように指示する。
２３．Hamiltonは、５００μＬのＨ２Ｏを加え、次に「ＳＰＥプレート及び廃棄物プレートを正圧マニホルドに移動させ、６ｐｓｉｇ以下の圧力を、３０秒間又は全ての試薬がプレートを通過するまで加え、完了したら、ＳＰＥプレート及び廃棄物プレートをHamilton上の正しい位置に戻して、ＯＫをクリックする」ように指示する。
[0056]インキュベート後の試料の調整：
２４．Hamiltonは、「ガラスチューブトレーからカバーを取り外し、必要ならばＨ２Ｏ試薬トラフを再充填する」ように指示し、次に５００μＬのＨ２Ｏを試料インサートのそれぞれの中にピペットで添加する。
２５．Hamiltonは、「ガラスチューブトレーをカバーして、１分間渦流混合し、Hamilton上の正しい位置に戻してＯＫをクリックする」ように指示する。
２６．Hamiltonは、試料をガラスインサートからＳＰＥプレートに移す。
２７．Hamiltonは、「ＳＰＥプレート及び回収トレーをHamiltonから取り外し、正圧マニホルド上に配置し、６ｐｓｉｇ以下の圧力を、３０秒間又は全ての試薬がプレートを通過するまで加える」ように指示する。
２８．Hamiltonは、「廃棄物回収プレートをキャリア内の最終試料プレートと交換し、ＳＰＥをHamiltonデッキに戻し、ＯＫを押す」ように指示する。最終試料プレートは、Hamiltonデッキ上のレーン３８内のＳＰＥプレートの下のキャリアＩのポジション４内に配さなければならない。
２９．Hamiltonは、「ジクロロメタンを正しい試薬プレート中に注入する」ように指示する。ジクロロメタンは、Hamiltonデッキ上のレーン１９内のキャリアＦ上のポジション３内に配さなければならない。
３０．Hamiltonは、５００μＬのジクロロメタンをＳＰＥプレート中にピペットで添加し、次に「ＳＰＥプレート及び最終試料トレーをHamiltonから取り外し、正圧マニホルド上に配置し、６ｐｓｉｇ以下の圧力を、３０秒間又は全ての試薬がプレートを通過するまで加える」ように指示する。
３１．Hamiltonは、「ディープウェル回収プレートを正圧マニホルドから取り出し、蒸発させるためにBiotage SPE Dry上に配置する」ように指示する。２０分後、Hamiltonは、「プレートをパラフィルムでカバーし、冷蔵庫内に５分間又は冷却されるまで配置する」ように指示する。この工程は、試料が完全に乾燥した時点（２０分より多くかかる可能性がある）にのみ行う。Hamiltonは、「正しい試薬プレート中に再構成溶液を注入し、再構成溶液を添加するために、乾燥したプレートをHamilton上の正しい位置に配置する」ように指示する。この工程は、プレートが触ってみて冷たくなった時点のみに行う。乾燥プレートは、レーン１９内のキャリアＦ上のポジション２内に配さなければならず、再構成溶液は、Hamiltonデッキ上のレーン２５内のキャリアＧ上のポジション３内に配さなければならない。
３２．Hamiltonは、乾燥試料プレートのそれぞれのウェルに２００μＬの再構成溶液を加え、次に「プレートをカバーし、加熱器振盪機に移す」ように指示する。Hamiltonは、最終試料プレートを渦流混合する。
３３．Hamiltonによって形成されるマッピングファイルを配する。ファイルを開いて、標準、ＱＣ、及び試験片のＩＤ番号をコピーする。
[0057]
Figure 2015520856
Figure 2015520856
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実施例３：ステロール／スタノールハイスループット自動プロセスの検証：
[0058]実施例１及び２に記載の代表的な手順にしたがって、デスモステロール、カンペステロール、コレスタノール、及びβ−シトステロールの予備処理及びハイスループット自動ステロール／スタノールアッセイを行った。
[0059]ハイスループット分析方法の検証は、議会によって制定された１９８８年の臨床検査室改善補正案（ＣＬＩＡ‘８８）、及び米国保険福祉食品医薬品局によって発行された「産業生物学的分析法の検証に関するガイダンス」と題された文献（２００１年５月）を全面的に順守して行った。
[0060]検証は、新規な生物学的分析方法を開発及び実施する際に有用な指標である。求める代表的な検証パラメーターとしては、アッセイにおける分析対象物の回収率及び回収率の再現性、分析対象物の希釈直線性、アッセイの精度（バッチ内及びバッチ間精度）、並びにこのハイスループット自動固相抽出ステロール／スタノールアッセイと、手動の液／液抽出（ヘキサンを使用）ステロール／スタノールアッセイとの間の方法比較が挙げられる。結果を下表１〜４に示す。
[0061]ステロール／スタノールアッセイにおける分析対象物（例えば、デスモステロール、カンペステロール、コレスタノール、又はβ−シトステロール）の回収率は、分析対象物の真の濃度に関して得られる検出器応答と比較した、試料に加え、及び試料から抽出された既知量の分析対象物から得られる検出器応答（即ちＬＣ−ＭＳ／ＭＳ検出器応答）である。回収率は、変動限界内の分析方法の抽出効率に関係する。
[0062]１つの非スパイク試料プール及び３つの異なる濃度レベルのスパイク試料プールを用いて、スパイク／回収試験を完了した。非スパイクプールにおいて測定されたステロール／スタノールの量は、血漿試料中に存在するステロール／スタノールの生来の量であった。４つ全部の分析対象物（デスモステロール、カンペステロール、コレスタノール、及びβ−シトステロール）を含むメタノール中の濃スパイク溶液を調製した。次に、この濃スパイク溶液を３つの異なる濃度レベルで血漿プールに加えて、スパイクプールレベル１、２、及び３を得た。この濃スパイク溶液の２％以下を血漿プールに加えた。濃スパイク溶液をアッセイの分析範囲に希釈してその実際の量を求めた。次に、スパイクプールレベル１、２、及び３にスパイクした分析対象物の量を計算し、非スパイク血漿プールにおいて測定された量と比較して理論量を求めた。次に、スパイクプールレベル１、２、及び３のそれぞれにおける測定量を、スパイクプールレベル１、２、及び３のそれぞれにおける対応する理論量と比較して、３つの濃度レベルにおける回収率（％）を得た。
[0063]分析対象物の回収率は必ずしも１００％ではないが、良好な分析方法の分析対象物の回収率の程度は、一貫しており、正確であり、再現可能であった。通常は、８５〜１１５％の範囲内の分析対象物の真の濃度の平均回収率は、当該技術において知られている回収率の許容範囲である。回収試験によって、ある方法が存在する分析対象物の全部を測定するか又は一部のみしか測定しないかを示すことができる。１００％より高い回収率は、当該技術において公知なように、その方法が分析対象物の過大測定値を引き起こす程度のエラーを有していることを示す。この自動ステロール／スタノールアッセイにおけるステロール／スタノールの回収率の結果、及び回収率の再現性を表１に示す。この結果は、これらの実証パラメーターは対応する合格基準に合格したことを示す。したがって、この結果によって、ハイスループットの自動ステロール／スタノールアッセイが、実施可能な生物学的分析方法として確認及び検証された。
Figure 2015520856
[0064]希釈直線性実験は、選択された試料希釈における異なる希釈レベルにおいて試験した試料に関するアッセイ結果の精度に関する情報を与える。直線性は、標準曲線に基づく分析対象物の算出量に対して規定される。希釈直線性が広範囲の希釈度にわたって良好である場合には、アッセイ方法は異なるレベルの分析対象物を有する試料をアッセイする柔軟性を与える。５％ウシ血清アルブミンによる高血漿中でのステロール／スタノール試料の逐次希釈（２倍、４倍、８倍、１６倍の希釈）によって、ステロール／スタノールハイスループット自動アッセイにおける希釈直線性を処理し、結果を表２に示す。１００％より高い直線性回収率は、この方法が、当該技術において公知なように分析対象物の過剰測定値を引き起こすエラーを有していることを示す。この結果は、希釈直線性パラメーターが、当該技術において知られている対応する合格基準（即ち、理論値の８０〜１２０％の平均回収率）に合格したことを示す。したがって、この結果により、ハイスループット自動ステロール／スタノールアッセイが、実施可能な生物学的分析方法として確認及び実証された。
Figure 2015520856
[0065]分析アッセイの精度は、単一の均質試料の複数のアリコートにアッセイを繰り返し行う場合の分析対象物の個々の測定値の近接度を示す。精度は、濃度あたり最小で５回の測定を用いて測定しなければならない。それぞれの濃度レベルにおいて求められる精度は、定量の下限（ＬＬＯＱ）（ＣＶの２０％を超えない可能性がある）を除いて変動係数（ＣＶ）の１５％を超えない可能性がある。ステロール／スタノールハイスループット自動アッセイの精度を評価してバッチ内及びバッチ間精度をそれぞれ求め、結果を表３に示す。表中において、プール１及び２は、それぞれ最も低い較正物質（ＬＬＯＱ）及び最も高い較正物質（ＵＬＯＱ）であった。全ての較正物質は５％ウシ血清アルブミンマトリクス中であった。プール３及び４は血清中の品質対照材料であった。プール５は血漿プールであった。これらの測定により、全てのマトリクス中における精度を、アッセイの全分析測定範囲にわたって評価した。
[0066]表３からの結果は、精度パラメーターが当該技術において公知の対応する合格基準（即ち、バッチ内（実験内）に関しては≦１５％、バッチ間（実験室内）に関しては≦２０％）に合格したことを示す。したがって、この結果により、ハイスループット自動ステロール／スタノールアッセイが、実施可能な生物学的分析方法として確認及び実証された。
Figure 2015520856
[0067]また、ハイスループット自動固相抽出ステロール／スタノールアッセイの結果を、手動液／液抽出（ヘキサンによる）ステロール／スタノールアッセイの結果とも比較した。この結果は、比較が当該技術において公知の対応する合格基準（即ち、平均差（％）：≦±２０％）に合格したことを示す。したがって、この結果により、ハイスループット自動ステロール／スタノールアッセイが、実施可能な生物学的分析方法として確認及び実証された。
Figure 2015520856
実施例４：ステロール／スタノールハイスループット自動分析の基準範囲：
[0068]実施例１及び２に記載の迅速ハイスループット自動プロセスを４７８の患者検体（２５４の女性患者及び２３４の男性患者）について行って、デスモステロール、カンペステロール、コレスタノール、及びβ−シトステロールに関する全基準範囲（過剰応答者範囲、最適応答者範囲、又は過小応答者範囲）を得た。ステロール／スタノールのそれぞれは、コレステロール吸収バイオマーカー及び／又はコレステロール合成バイオマーカーとして役立たせることができる。これらの基準範囲には、ステロール／スタノールの絶対基準レベルの範囲、及びそれぞれのステロール／スタノールに関してコレステロールの量に対するステロール／スタノールの量の比を用いる相対基準レベルの範囲の両方を含む。
[0069]結果をそれぞれの分析対象物に関する濃度に基づいて分類し、表５に示すように、おおまかな五分位範囲、及び３つの標準偏差（ＳＤ）範囲をそれぞれの分析対象物に関して計算した。本発明方法によって求められたデスモステロール、カンペステロール、コレスタノール、及びβ−シトステロールに関して得られた基準範囲を表６に示す。
Figure 2015520856
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Claims (21)

  1. 複数の試料中の１以上のステロール／スタノール又はそれらの誘導体を分析するための迅速でハイスループットの方法であって：
    １以上のステロール／スタノール又はそれらの誘導体を含む複数の試料をマルチベッセルプレート内の個々のベッセル中に導入する工程；
    マルチベッセルプレート内のそれぞれの試料の１以上のステロール／スタノール又はそれらの誘導体を開裂させてステロール／スタノールを形成する工程；
    それぞれの試料の遊離ステロール／スタノールを固相抽出によって抽出する工程；及び
    それぞれの試料中の抽出された遊離ステロール／スタノールのレベルを、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法によって検出する工程
    を含み、
    遊離ステロール／スタノールは、検出工程の前に、遊離ステロール／スタノールに官能基を付加する更なる誘導体化にかけない、前記方法。
  2. それぞれのベッセルが、適当な混合を可能にするのに十分に幅広く且つ高く、且つマルチベッセルプレートを自動流体取扱装置及び／又は自動マルチベッセルプレート取扱装置内に取り付けるのを可能にするのに十分に薄いものである、請求項１に記載の方法。
  3. 開裂工程が：
    マルチベッセルプレート内のそれぞれの試料中に開裂剤をピペットで添加する工程；
    それぞれのベッセル内の試料及び開裂剤を含む組成物を渦流混合する工程；及び
    マルチベッセルプレートを所望の温度に加熱する工程
    を含む、請求項１に記載の方法。
  4. マルチベッセルプレートのそれぞれのベッセルを、適合しているマルチキャップマットによって密封する、請求項３に記載の方法。
  5. 温度が４０〜５０℃の範囲である、請求項３に記載の方法。
  6. 開裂工程が、ステロール／スタノール又はそれらの誘導体を加水分解して遊離ステロール／スタノールを形成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  7. 加水分解工程がステロール／スタノール誘導体の鹸化を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 鹸化反応をアルカリ水酸化物又はアルカリ性水酸化物触媒の存在下で行う、請求項７に記載の方法。
  9. 触媒が水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである、請求項８に記載の方法。
  10. 抽出工程が：
    開裂工程の後に、マルチベッセルプレート内のそれぞれの試料をマルチベッセル固相抽出プレートに移す工程；及び
    それぞれの試料の遊離ステロールを、マルチベッセル固相抽出プレートからマルチベッセル回収プレート中に溶出する工程
    を含む、請求項１に記載の方法。
  11. 溶出工程を、ジクロリドメタンを用いて行う、請求項１０に記載の方法。
  12. 抽出工程が更に：
    マルチベッセル回収プレート内のそれぞれの試料の溶出された遊離ステロール／スタノールを乾燥する工程；及び
    マルチベッセル回収プレート内の乾燥した遊離ステロール／スタノールに再構成溶液を加えて遊離ステロール／スタノールを再構成する工程
    を含む、請求項１０に記載の方法。
  13. 再構成溶液がメタノール／イソプロパノール／ギ酸溶液である、請求項１２に記載の方法。
  14. マルチベッセルプレート内のそれぞれの試料に内部標準を添加する工程
    を更に含む、請求項１に記載の方法。
  15. 内部標準が重水素化内部標準である、請求項１４に記載の方法。
  16. マルチベッセルプレート内の複数の試料を標識する工程；及び
    逐次処理のために標識された試料を検出する工程
    を更に含む、請求項１に記載の方法。
  17. 標識工程を自動バーコード付与装置によって行い、検出工程を自動バーコード検出器によって行う、請求項１６に記載の方法。
  18. 試料が、血漿、血清、赤血球、全血、血小板、白血球、ステロール／スタノールエステル、遊離ステロール／スタノール、及びこれらの混合物からなる群から選択される血液成分である、請求項１に記載の方法。
  19. ステロール／スタノールが、デスモステロール、カンペステロール、コレスタノール、及びシトステロールの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
  20. ステロール／スタノールが、デスモステロール、カンペステロール、コレスタノール、及びシトステロールを含む、請求項１に記載の方法。
  21. プロセス全体を検出工程に関して約７分未満で行う、請求項１に記載の方法。
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