JP2015518485A - 熱発生のmiRNA調節剤 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年4月20日に出願された米国特許出願第61/636,059号;2012年8月10日に出願された米国特許出願第61/681,750号;および2013年3月14日に出願された米国特許出願第61/782,838号の優先権を主張し、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
肥満は蔓延の域に達し、すべての年齢層および社会経済的集団に影響を及ぼしている。世界保健機関は、2008年には、20歳以上の成人15億人が過体重であり、2億人を超える男性および3億人を超える女性が肥満であると推定した。これらの数値は、2030年までに、過体重の人が21億6千万人および肥満症の人が11億2千万人にまで増加すると推定されている。肥満は、所得の喪失、活動日の制限、長期欠勤、仕事での低生産性(プレゼンティーイズム)、生活の質の低下、永久的な能力障害、著しい罹患率および死亡率、ならびに寿命の短縮の源である。実際に、医療費、過剰な死亡率および能力障害によってもたらされる、米国およびカナダにおける過体重および肥満の年間の総経済コストは、2009年には約$3000億であると推定された。肥満の経済コストに関する国際的調査により、それらは総ヘルスケアコストの2%〜10%を占めることが示された。
I. 定義
別段の規定がない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されている意味と同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含め、本出願が優先する。
ある種の態様において、本発明は、熱発生を調節する方法を提供する。これらの方法は概して、細胞または組織を、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤(例えば、UCP1および/またはUCP2)の活性を調節するmiRNA剤と接触させる段階を含む。このような方法および組成物は、肥満の治療に特に有用である。
ある種の態様において、本発明は、熱発生制御因子(例えば、UCP1および/またはUCP2などのミトコンドリア脱共役剤)の調節のためにmiRNA剤を使用する。本明細書に開示される方法において使用するのに適したmiRNA剤には、非限定的に、miRNA、アゴミア、アンタゴミア、miR-マスク、miRNA-スポンジ、siRNA(一本鎖または二本鎖)、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、または標的核酸の少なくとも一部とハイブリダイズし、その機能を調節するその他のオリゴヌクレオチド模倣物が含まれる。
が含まれる。他の態様において、開示される方法において使用するための例示的なmiRNA分子には、本明細書の表1、11、13、および14に開示されているmiRNAが含まれる。1つの特定の態様において、miRNA剤は、ヒトmiR-22またはその機能的誘導体である。
1つの局面において、本発明は、ヒト対象において肥満を治療する方法を提供する。本方法は概して、少なくとも1つの熱発生制御因子(例えば、UCP1および/またはUCP2などのミトコンドリア脱共役剤)の活性を調節するmiRNA剤の有効量をヒト対象に投与する段階を含む。
またはリザーバーの埋め込みが賢明と考えられる。1つの態様において、薬学的組成物は複数のmiRNA剤種を含む。別の態様において、miRNA剤種は、天然の標的配列に関して、別の種と重複せずかつ隣接しない配列を有する。別の態様において、複数のmiRNA剤種は、天然の異なる標的遺伝子に特異的である。別の態様において、miRNA剤は対立遺伝子特異的である。別の態様において、複数のmiRNA剤種は、2つ以上のSNP対立遺伝子(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれを超える数のSNP対立遺伝子)を標的化する。
別の局面において、本発明は、熱発生を調節する、肥満を減少させる、またはインスリン感受性を高めるmiRNA剤をスクリーニングする方法を提供する。本方法は概して、指標細胞を提供する段階;該指標細胞を試験miRNA剤と接触させる段階;ならびに該miRNA剤の存在下および非存在下において、該指標細胞における少なくとも1つの熱発生制御因子の発現レベルおよび/または細胞活性を決定する段階であって、試験miRNA剤の存在下における熱発生制御因子の活性の変化により、その試験miRNA剤が熱発生を調節する、肥満を減少させる、またはインスリン感受性を高めるmiRNA剤として同定される段階を含む。ある種の態様において、本方法は、熱発生制御因子(例えば、UCP1、UCP2)の発現レベルおよび/または活性の増加を判定する段階を含む。指標細胞は哺乳動物細胞であってよい。ある種の態様において、哺乳動細胞は、ヒトゲノムの少なくとも一部を含むヒト細胞である。
1つの局面において、本明細書に開示される方法は、少なくとも1つの熱発生制御因子の活性を調節することができるmiRNA剤を含む薬学的組成物および製剤の投与を含み得る。
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、実施例はさらなる限定と解釈されるべきではない。本出願を通じて引用した配列リスト、図面、ならびにすべての参考文献、特許、および公開済み特許出願の内容は、参照により本明細書に明確に組み入れられる。
利用可能な科学情報および本発明者ら自身の実験データの批判的評価および再検討に基づいて、熱発生の調節に関与する83個のタンパク質を選択した。これらのタンパク質は、それらの機能に基づいて、熱発生の活性化因子または抑制因子として分類した。これらの熱発生制御因子タンパク質を表2に記載する。
miRNA剤の標的として適切な熱発生制御因子を選択するために、いくつかのインターネットベースの資源を使用して、miRNAとそれらの標的を一致させた(「マイクロノーム (micronome)」)。例示的なツールを表3に記載する。
A1. 1マイクロRNA‐複数mRNAの経路特異的パラダイムの第1例
ヒストンのメチル化状態は、ヒストンメチルトランスフェラーゼおよびデメチラーゼによって動的に調節され得る。ヒトリジン (K) 特異的デメチラーゼ3A (KDM3A) は、代謝遺伝子の発現を調節するのに極めて重要である。その機能喪失は、マウスにおいて肥満および高脂血症をもたらす。UCP1遺伝子のPPAR応答エレメント (PPRE) へのKDM3A結合のβアドレナリン刺激は、PPREにおけるH3K9me2(ヒストンH3のリジン9のジメチル化)のレベルを低下させるのみならず、PPREへのPPARGおよびRXRAならびにそれらのコアクチベーターPPARGC1A、CREBBP、およびNCOA1の動員を促進する。TargetScan Humanデータベース(リリース6.0)の問い合わせにより、ヒトKDM3A 3' UTR 29〜35領域がhsa-miR-22の保存された標的であることが明らかになった。いくつかの他のmiRNA標的データベースからも、hsa-miR-22とKDM3Aとのこの一致が確認された。したがって、hsa-miR-22アンタゴミアによるデメチラーゼKDM3Aの産生増加は、UCP1遺伝子プロモーター領域の脱メチル化をもたらし、よっていくつかの調節エレメントの結合およびUCP1産生の増加を促進するはずである。
本発明者らはまた、34のmiRNA標的および発現ツール(表4)を用いて、脂肪細胞の536個のmiRNA(表1)のうちのいずれかと83個の熱発生標的(表2)との間の潜在的関係を探索した。
パラメータ
1 関心対象の組織/細胞におけるmiRNAの発現
2 所与の遺伝子または遺伝子セットに対して1つのmiRNAを予測するアルゴリズムの数
3 アルゴリズムからのスコア/パーセント
4 1つのmiRNAによって標的化される好ましい遺伝子の数
5 標的遺伝子における1つのmiRNAに対する結合部位の数
6 標的遺伝子におけるいくつかのmiRNAに対する結合部位の数
7 標的遺伝子の間での1つのmiRNAのシード相補的配列の過剰提示(miRvestigator)
8 検証されたmiRNA-mRNA標的対
9 miRNA結合部位のゲノム位置(5'UTR‐プロモーター‐CDS‐3'UTR)
10 miRNAのイントロン位置
11 miRNAのクラスター化
12 関心対象の特定の組織/細胞におけるmiRNAの存在量
B1. UCP1を含む1つの例示的な複数miRNA‐1 mRNAのパラダイム
脂肪細胞において、重要な熱発生制御因子は最終的にはUCP1(サーモゲニンとも命名された)であり、したがってすべての熱発生制御因子は最終的にUCP1活性に影響を及ぼさなくてはならない。UCP1は、ミトコンドリア内膜を介してプロトン漏出を生じ、ひいてはATP合成から酸化的リン酸化を切り離すミトコンドリア輸送タンパク質である。結果として、エネルギーは熱という形で消散される(適応熱発生)(図5を参照されたい)Lowell et al., Nature (2000);Friedman et al., Bioinformatics (2010);Hsu et al., Nucleic acids research (2011);Rieger et al., Frontiers in Genetics (2011))。
UCP2は、WAT、骨格筋、膵島、および中枢神経系において発現されるミトコンドリア輸送タンパク質である。UCP1と同様に、これはミトコンドリア内膜を介してプロトン漏出を生じ、ひいてはATP合成から酸化的リン酸化を切り離す(適応熱発生、図5を参照されたい)(Lowell et al., Nature (2000))。
表2において選択された83個の熱発生制御因子分子を、高ストリンジェンシーの複数miRNA‐複数mRNA関連性についてスクリーニングした。7つの主要な予測ツールによるこれらの解析の結果を図4に示す。これら7つのツールを併せることで、4439個のmiRNA‐遺伝子対が得られた。これらのツール間の重複は、ツール数が増加するにつれて減少していき、7つのツールを考慮した場合には、わずか15個のmiRNA‐遺伝子対に達した。
いくつかのアプローチを用いて、経路特異的miRNAを同定することができる。例えば、推定的に同時調節される遺伝子の3'-UTRを、miRNAシード領域に由来する過剰提示される配列について検索することにより、共通の調節性miRNAを同定することができる。特定のmiRNAシード配列が、選択された83個の熱発生標的の3' UTRの間で過剰提示されるかどうかを判定するために、miRvestigatorウェブアプリケーション (miRvestigator. systemsbiology.net/) を使用した。以下のパラメータ(モチーフサイズ8 bp、デフォルトWeederモデル、シードモデル8mer、100%の相補性相同性、および0.25のゆらぎ塩基対許容)を用いて、hsa-miR-19a/19bによって認識されるモチーフ5'-UUUGUACA-3'が、表15に示されるように1.7 x 10-04の相補性p値を有して、83個の熱発生標的のうちの15個の間で過剰提示されると判断された。注目すべきことは、hsa-miR-19が豊富なヒト脂肪細胞miRNAとして報告されていることである。
多くの哺乳動物miRNAは、それら自体の特有の転写単位よりもむしろ、タンパク質コード遺伝子のイントロン内に位置する。イントロンmiRNAは典型的に、それらが属する前駆体mRNAと共に発現され、プロセシングされる。イントロンmiRNAおよびそれらの宿主遺伝子は独立して調節され得るが、イントロンmiRNAは、宿主遺伝子のUTRを標的化することによって、それ自体の宿主タンパク質コード遺伝子を下方制御することができる。宿主タンパク質コード遺伝子に対するフィードバック調節は、miRNA標的である転写因子を選択することによって、またはイントロンmiRNA宿主遺伝子産物とmiRNA標的遺伝子産物とのタンパク質間相互作用によって達成することができる。一例として、miR-33はSREBP宿主遺伝子と協調して作用してコレステロール恒常性を制御し、miR-33aおよびmiR-33bの薬理学的阻害は、脂質異常症の治療のために血漿HDLレベルを上昇させかつ血漿VLDLトリグリセリドレベルを低下させるための有望な治療戦略である。
ハイコンテントスクリーニング法を用いて、熱発生制御因子(例えば、UCP1およびUCP2)の活性を調節する新規miRNA剤をスクリーニングする。ハイコンテントスクリーニングは、分子の発見を容易にするために生細胞の画像を使用する、薬物発見の方法である。このような自動画像ベースのスクリーニング法は、細胞表現型を変化させる薬剤を同定するのに特に適している。
1. 分化プロトコール
ヒト前脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化に及ぼすmiRNA類似体の効果を評価するために、ヒト皮下前脂肪細胞(8匹の雌ドナー由来のSuperLot 0048、ZenBio、NC)を0日目に96ウェルプレートにプレーティングし、前脂肪細胞培地(DMEM/Ham's F-12(1:1、v/v)、HEPES緩衝液、ウシ胎仔血清、および抗生物質)中で一晩付着させた。翌日(1日目)、培地を除去し、分化培地(DMEM/Ham's F-12(1:1、v/v)、100μMアスコルビン酸、0.85μMインスリン、20 nM亜セレン酸ナトリウム、0.2 nMトリヨードチロニン、1μMデキサメタゾン、100μMイソブチルメチルキサンチン、100 nMロシグリタゾン、および抗生物質と交換した。細胞を37℃、5% C02にて2日間インキュベートした。2日後(3日目)、培地を除去し、新鮮な維持培地(DMEM/Ham's F-12(1:1、v/v)、100μMアスコルビン酸、0.85μMインスリン、20 nM亜セレン酸ナトリウム、0.2 nMトリヨードチロニン、および抗生物質)と交換した。3日目に、トランスフェクション剤Dharmafect1を用いて、細胞にmiRNA類似体(Dharmacon特異的miRIDIAN模倣物およびヘアピン阻害剤)をトランスフェクトした。処理はすべて3つ組で行った。トランスフェクション後、陰性対照は維持培地のみであり、陽性対照は、100 nMのPPARGアゴニストであるロシグリタゾンを含む維持培地であった。2日後、培地を除去し、新鮮な維持培地と交換した。その後、処理期間の終了時(15日目)まで2日ごとに維持培地を交換した。処理(合計15日間の培養)の終了時に、表現型決定および遺伝子型決定スクリーニングのために細胞を処理した。
miRNA類似体の標的細胞への浸透を促進するために、トランスフェクション試薬を使用する。一例として、本発明者らがトランスフェクション剤Dharmafect 1(Dharmacon、CO)を用いて前脂肪細胞において達成したトランスフェクション効率の程度を、本明細書に示す。トランスフェクション効率は2つの方法で評価した:
a. 蛍光miRNA類似体を用いたトランスフェクション後の細胞の落射蛍光の測定
Dy547標識された非標的指向miRIDIAN模倣物およびヘアピン阻害剤 (100 nM) を3日目にトランスフェクトした細胞において、15日目に蛍光を測定した(540励起/590放射)。図9に示されるように、トランスフェクションの12日後でさえ、蛍光miRNA類似体をトランスフェクトした細胞の有意により高い蛍光が認められた:
b. 対照遺伝子発現の減少
前脂肪細胞のトランスフェクションの成功を確認するために、対照遺伝子GAPDH(「ハウスキーピング遺伝子」)の発現の減少を、GAPDH特異的siRNAを前脂肪細胞にトランスフェクトしてから4日後(7日目)(図10A)および12日後(15日目)(図10B)に測定した。細胞溶解物を得て、Cells-to-Ct試薬によって得られた純粋RNAを用いてRT-PCRを行った。図10Aおよび10Bに示されるように、トランスフェクション後の4日目および12日目に、GAPDH mRNA発現の91%および86%のノックダウンが観察され、いずれも高度に有意であった。
処理(15日間の培養)の終了時に、脂質含量を評価するために細胞をオイルレッドOで染色した。図11A〜Fに示されるように、ロシグリタゾンを含まない培地の存在下では、前脂肪細胞は、脂質を負荷した成熟脂肪細胞への分化をほとんど示さなかった。2日間にわたり100 nMロシグリタゾンを含む分化培地、およびその後12日間にわたり維持培地が存在した場合(陰性対照)、脂質を負荷した成熟脂肪細胞へのいくらかの分化が認められる。実験を通して100 nMロシグリタゾンが存在した場合(陽性対照)、細胞の大部分が、脂質を負荷した成熟脂肪細胞になった。一例として、25 nM hsa-miR-30b模倣物の存在下では、細胞の約半数が、脂質を負荷した成熟脂肪細胞になった。非標的指向miRNA模倣物および阻害剤は、陰性対照と同様のパターンを示した。
ロシグリタゾンまたはmiRNA類似体によって誘導されるヒト前脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化中に起こるmRNA変化のプロファイリングを、RNA-Seq技術により行った。低分子RNA配列決定 (RNA-Seq) は、現在、事前の配列情報も二次構造情報も必要とせずに、公知および未知の全低分子RNAのトランスクリプトーム全域にわたるプロファイリングを可能にするハイスループット次世代配列決定プラットフォームである。
1. 分化プロトコール
ヒト白色脂肪細胞の褐色脂肪細胞への分化に及ぼすmiRNA類似体の効果を評価するために、ヒト皮下前脂肪細胞(8匹の雌ドナー由来のSuperLot 0048、ZenBio、NC)を0日目に96ウェルプレートにプレーティングし、前脂肪細胞培地(DMEM/Ham's F-12(1:1、v/v)、HEPES緩衝液、ウシ胎仔血清、および抗生物質)中で一晩付着させた。翌日(1日目)、培地を除去し、分化培地-2(DMEM/Ham's F-12(1:1、v/v)、HEPES緩衝液、ウシ胎仔血清、ビオチン、パントテン酸、ヒトインスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、専売PPARGアンタゴニスト、および抗生物質と交換した。細胞を37℃、5% C02にて7日間インキュベートした。7日後(7日目)、AM-1脂肪細胞維持培地(DMEM/Ham's F-12(1:1、v/v)、HEPES緩衝液、ウシ胎仔血清、ビオチン、パントテン酸、ヒトインスリン、デキサメタゾン、および抗生物質)との部分的培地交換を行った。細胞を37℃、5% C02にてさらに7日間インキュベートした。17日目に、トランスフェクション剤Dharmafect 3を用いて、細胞にmiRNA類似体(Dharmacon特異的miRIDIAN模倣物およびヘアピン阻害剤)をトランスフェクトした。処理はすべて3つ組で行った。トランスフェクション後、陰性対照は維持培地のみであり、陽性対照は、100 nMのPPARGアゴニストであるロシグリタゾンを含む維持培地であった。2日後、培地を除去し、新鮮な維持培地と交換した。その後、処理期間の終了時(30日目)まで2〜3日ごとに維持培地を交換した。処理(合計30日間の培養)の終了時に、表現型決定および遺伝子型決定スクリーニングのために細胞を処理した。
miRNA類似体の標的細胞への浸透を促進するために、トランスフェクション試薬を使用する。
a. 蛍光miRNA類似体を用いたトランスフェクション後の細胞の落射蛍光の測定
Dy547標識された非標的指向miRIDIAN模倣物およびヘアピン阻害剤 (100 nM) を17日目にトランスフェクトした細胞において、30日目に蛍光を測定した(540励起/590放射)。図16に示されるように、トランスフェクションの12日後でさえ、蛍光miRNA類似体をトランスフェクトした細胞の有意により高い蛍光が認められた。
b. 対照遺伝子発現の減少
脂肪細胞のトランスフェクションの成功を確認するために、対照遺伝子GAPDH(「ハウスキーピング遺伝子」)の発現の減少を、GAPDH特異的siRNAによる脂肪細胞のDharmafect 3(Dharmacon、CO)媒介性トランスフェクトションの4日後(22日目)および12日後(30日目)に測定した。細胞溶解物を得て、Cells-to-Ct試薬によって得られた純粋RNAを用いてRT-PCRを行った。トランスフェクション剤Dharmafect 3を用いて、成熟脂肪細胞(トランスフェクトすることが難しいことが知られている細胞型)の効率的なトランスフェクションが達成された。図17に示されるように、トランスフェクション後の4日目および12日目に、GAPDH mRNA発現の54%および73%のノックダウンが観察され、いずれも高度に有意であった。
処理(30日間の培養)の終了時に、脂質含量を評価するために細胞をオイルレッドOで染色した(図18)。16日目から30日目まで維持培地のみが存在した場合(対照)、脂肪細胞には大きな脂肪滴が負荷されているようである。実験を通して100 nMロシグリタゾンが存在した場合(陽性対照)、赤色染色の強度は減少しているように見え、脂肪滴はより小さいようである。一例として、25 nM hsa-miR-30b模倣物の存在下では、赤色染色の強度は同様に減少しているように見え、脂肪滴はより小さいようである。非標的指向miRNA類似体の存在下では、このような変化は認められなかった。
成熟脂肪細胞の効率的なトランスフェクションは達成が難しいことが知られているため、本発明者らは11種の異なるトランスフェクション剤を試験し、対照遺伝子GAPDHのmRNA発現の減少の程度を評価した。上記のプロトコールに従って、ヒト皮下前脂肪細胞を6ウェルプレートにプレーティングし、2週間かけて分化させた。その後、トランスフェクション剤をそれらの製造業者のプロトコールに従って使用して、GAPDHを標的化するmiRNA模倣物 (50 nM) を分化した脂肪細胞に導入した。トランスフェクトした細胞を試薬およびmiRNA模倣物と共に72時間インキュベートし、その後維持培地に切り換えた。トランスフェクションの14日後に、RNeasyミニキットを用いてRNAを単離し、対照遺伝子GAPDHおよび参照遺伝子18SについてのRT-PCR反応を、ウェル当たり100 ngのcDNAを用いて3つ組で行った。
上記の通りに、ヒト皮下脂肪細胞をウェル当たり391,000個細胞の密度で6ウェルプレートにプレーティングした。Dharmafect 4を用いて、14日目にこれらの脂肪細胞に以下のものをトランスフェクトした:
1. 以下のmiRNA類似体のうちの1つ (50 nM):
‐hsa-let-7a阻害剤(hsa-let-7aは、脂肪生成を調節することが報告されているユニバーサルmiRNAである)
‐hsa-miR-1模倣物(hsa-miR-1は、PRDM16およびUCP1を調節することが報告されている)
‐hsa-miR-19b模倣物(hsa-miR-19bは、本発明者らのインシリコ研究に従って、本発明者らの83個のmRNA標的のうちの多くと相互作用することが予測される、豊富な脂肪細胞miRNAである)、または
‐hsa-miR-30b模倣物(hsa-miR-30bは、本発明者らのインシリコ研究に従って、本発明者らの83個のmRNA標的のうちの多くと相互作用することが予測され、その過剰発現が脂質生成を促進するmiRNAである)
2. 陰性対照(模擬トランスフェクション)
3. 3つの陽性対照(脂肪生成および/または適応熱発生を変化させることが知られている、PPARGアゴニストであるロシグリタゾン (100 nM)、β3アドレナリン受容体アゴニストCL316,243 (10μM)、または甲状腺ホルモンであるトリヨードチロニン (10 nM))。
ルシフェラーゼレポーターアッセイ構築物を使用するハイスループットスクリーニングを用いて、熱発生に関与する新規miRNA標的を同定する。
1. レポーター遺伝子の3'UTR領域にヒトUCP1配列の2,218 bp 3'UTR断片がクローニングされている、強力な構成的プロモーター (RPL10-prom) によって駆動されるレポーター遺伝子を含むヒトUCP1 3'UTR構築物。推定上のUCP1 3'UTR構築物に特異的な効果を同定するために、このレポーター活性に及ぼす特異的miRNA模倣物、阻害剤、または非標的指向対照の効果を、空‐3'UTRおよびアクチンβ‐3'UTRのものと比較する。
2. ヒトUCP1遺伝子配列のメチル化領域およびエンハンサー領域を網羅する転写開始部位および上流領域に及ぶ、ヒトUCP1配列の4,147 bp 5'UTR断片によって駆動されるレポーター遺伝子を含むヒトUCP1プロモーター構築物。推定上のUCP1 5'UTR構築物に特異的な効果を同定するために、このレポーター活性に及ぼす特異的miRNA模倣物、阻害剤、または非標的指向対照の効果を、アクチンβ‐プロモーターのものと比較する。
3. HSV-TK遺伝子座由来の短い最小プロモーターと、ヒトUCP1遺伝子配列のエンハンサー領域に及ぶヒトUCP1配列の601 bp 5'UTR断片とによって駆動されるレポーター遺伝子を含むヒトUCP1エンハンサー領域構築物。推定上のUCP1 5'エンハンサー構築物に特異的な効果を同定するために、このレポーター活性に及ぼす特異的miRNA模倣物、阻害剤、または非標的指向対照の効果を、空5'エンハンサー領域のものと比較する。
‐Hela細胞においてmiRNA模倣物(特異的) * レポーター構築物8個
‐HepG2細胞においてmiRNA模倣物(特異的) * レポーター構築物8個
‐Hela細胞においてmiRNA模倣物非標的指向対照 * レポーター構築物8個
‐HepG2細胞においてmiRNA模倣物非標的指向対照 * レポーター構築物8個
‐Hela細胞においてmiRNA阻害剤(特異的) * レポーター構築物8個
‐HepG2細胞においてmiRNA阻害剤(特異的) * レポーター構築物8個
‐Hela細胞においてmiRNA阻害剤非標的指向対照 * レポーター構築物8個
‐HepG2細胞においてmiRNA阻害剤非標的指向対照 * レポーター構築物8個
熱発生に関与する新規miRNA標的を同定するために、プロテオミクスプロファイリングもまた使用する。
本発明者らは、Cell-SELEX技術を用いて、成熟ヒト皮下脂肪細胞を特異的に認識するDNAアプタマーを開発し、特徴づけた。Cell-SELEXにより、増幅および生細胞への結合の繰り返しによって、無傷細胞の表面上の自然環境において天然高次構造にある特定分子を認識するアプタマーが選択される。図23に図示されるこの細胞ベースの選択では、特定の公知および未知の細胞表面マーカーまたは膜受容体を、それらの天然環境において直接標的化することができ、細胞特異的アプタマーの直接的な濃縮が可能になる。Cell-SELEXは、標的細胞を用いた陽性選択と非標的化細胞を用いた陰性選択の組み合わせからなる。本発明の場合には、新たに単離されたヒト肝細胞を用いて陰性選択を行い、陽性選択ではヒト皮下脂肪細胞の初代培養物を使用した。32 merライブラリーからの2ラウンドの陰性選択および5ラウンドの陽性選択を完了した。単離されたアプタマーを配列決定し、結合試験のために合成し、6-フルオレセインアミダイト (FAM) で標識した。ヒト肝細胞(陰性細胞)および脂肪細胞(陽性細胞)を飽和濃度 (1μM) のFAM結合アプタマーで室温にて15分間標識し、蛍光活性化細胞選別 (FACS) によって解析した。図24に示されるように、いくつかのアプタマー(例えば、アプタマー974)は脂肪細胞にも肝細胞にも結合せず、いくつかのアプタマー(例えば、アプタマー975は脂肪細胞と肝細胞の両方に結合する、比:2.69)および他のアプタマーは、脂肪細胞に優先的に結合する(例えば、アプタマー972および973、それぞれ非:4.76および5.40)。これらの脂肪細胞特異的アプタマーのさらなる特徴づけは進行中である。
本明細書の実施例3〜5に記載されるインビトロ実験の結果を照合する。具体的には、マイクロRNA、mRNA、および標的タンパク質、ならびに経路の最初のセットを、関連性がありさらに管理可能な数の標的にさらに絞るために、ネットワーク検索および解析パッケージ(DAVID、Ingenuity Systems IPA、およびARIADNE Pathway Studioを用いて実験データを統合する。
肥満のいくつかの動物モデルが開発され、検証されている(Kanasaki K et al., J. Biomed. Biotechnol., 2011:197636 (2011);Speakman J et al., Obesity reviews : an official journal of the International Association for the Study of Obesity, 8 Suppl 1:55-61 (2007))。最もよく用いられるのは、レプチンシグナル伝達欠損Lepob/obマウスモデルおよびLeprdb/dbマウスモデル、ならびにC57BL/6Jマウスにおける高脂肪食モデルである (Wang CY et al., Methods in molecular biology, 821:421-433 (2012)。この食事誘導性肥満 (DIO) モデルは、現代社会における高脂肪食/高密度食の利用可能性の増加を密接に模倣している。
>染色体:GRCh37:4:141479988:141490559:-1
[本発明1001]
細胞における呼吸鎖脱共役を調節する方法であって、細胞を、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤の活性を調節するmiRNA剤と接触させる段階を含む、方法。
[本発明1002]
細胞が、前脂肪細胞、脂肪細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、肝細胞、筋細胞、またはそれらの前駆体である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
組織における熱発生を調節する方法であって、組織を、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤の活性を調節するmiRNA剤と接触させる段階を含む、方法。
[本発明1004]
組織が、褐色脂肪、白色脂肪、皮下脂肪組織、肝臓、または筋肉である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
組織をエクスビボでmiRNA剤と接触させる、本発明1004の方法。
[本発明1006]
その治療を必要とするヒト対象において肥満を治療する方法であって、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤の活性または発現を調節するmiRNA剤の有効量をヒト対象に投与する段階を含む、方法。
[本発明1007]
治療のために選択されるヒト対象が、肥満に対する遺伝的素因または後成的素因を有する、本発明1006の方法。
[本発明1008]
ミトコンドリア脱共役剤がUCP1またはUCP2である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1009]
miRNA剤が、
からなる群より選択されるmiRNAである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
miRNA剤が、表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択されるmiRNAである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1011]
miRNA剤が、
からなる群より選択されるmiRNAのアゴミア(agomir)またはアンタゴミア(antagomir)である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
miRNA剤が、表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択されるmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
miRNA剤が、hsa-miR-19b-2-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-211、hsa-miR-325、hsa-miR-382-3p/5p、hsa-miR-543、hsa-miR-515-3p、およびhsa-miR-545からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1014]
miRNA剤が、hsa-miR-331-5p、hsa-miR-552、hsa-miR-620、およびhsa-miR-1179からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1015]
miRNA剤が標的指向部分に連結される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1016]
標的指向部分がアプタマーである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1017]
標的指向部分がmiRNA剤を特定の細胞型または組織に送達する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1018]
miRNA剤が、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1019]
miRNA剤が、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1020]
miRNA剤が、ミトコンドリア脱共役タンパク質の活性化因子または抑制因子の活性を調節する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1021]
活性化因子または抑制因子が、表2に記載される活性化因子または抑制因子からなる群より選択される、本発明1018の方法。
[本発明1022]
miRNA剤が、活性化因子または抑制因子のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する、本発明1020または1021の方法。
[本発明1023]
miRNA剤が、活性化因子または抑制因子のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する、本発明1020または1021の方法。
[本発明1024]
ミトコンドリア脱共役タンパク質のmRNAまたはタンパク質発現が上方制御される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1025]
ミトコンドリア脱共役タンパク質のミトコンドリア脱共役活性が上方制御される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1026]
以下を含む、熱発生を調節するmiRNA剤をスクリーニングする方法:
a) ヒトゲノムを含む指標細胞を提供する段階;
b) 該指標細胞を試験miRNA剤と接触させる段階;ならびに
c) 該miRNA剤の存在下および非存在下において、該指標細胞における少なくとも1つの熱発生制御因子の細胞活性を決定する段階であって、試験miRNA剤の存在下における熱発生制御因子の活性の変化により、その試験miRNA剤が熱発生を調節するmiRNA剤として同定される、段階。
[本発明1027]
細胞が、脂肪細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、肝細胞、筋細胞、またはそれらの前駆体である、本発明1026の方法。
[本発明1028]
段階 (c) において決定される熱発生制御因子の細胞活性が、熱発生制御因子のmRNA発現レベル、タンパク質発現レベル、またはミトコンドリア脱共役活性である、本発明1026の方法。
[本発明1029]
熱発生制御因子がUCP1である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1030]
細胞における少なくとも1つの熱発生制御因子の活性を調節する、アゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1031]
表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択されるmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアである、本発明1030のアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1032]
以下:
からなる群より選択されるmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアである、本発明1030のアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1033]
hsa-miR-19b-2-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-211、hsa-miR-325、hsa-miR-382-3p/5p、hsa-miR-543、hsa-miR-515-3p、およびhsa-miR-545からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである、本発明1030のアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1034]
hsa-miR-331-5p、hsa-miR-552、hsa-miR-620、およびhsa-miR-1179からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである、本発明1030のアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1035]
標的指向部分に連結される、本発明1030〜1034のいずれかのアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1036]
標的指向部分がアプタマーである、本発明1035のアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1037]
標的指向部分がアゴミアまたはアンタゴミアを特定の細胞型または組織に送達する、本発明1035または1036のアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1038]
少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する、本発明1028〜1033のいずれかのアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1039]
少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する、本発明1030〜1037のいずれかのアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1040]
ミトコンドリア脱共役タンパク質の活性化因子または抑制因子の活性を調節する、本発明1030〜1037のいずれかのアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1041]
活性化因子または抑制因子が、表2に記載される活性化因子または抑制因子からなる群より選択される、本発明1030〜1037のいずれかのアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1042]
活性化因子または抑制因子のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する、本発明1030〜1037のいずれかのアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1043]
活性化因子または抑制因子のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する、本発明1030〜1037のいずれかのアゴミアまたはアンタゴミア。
[本発明1044]
hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される2つ以上のmiRNAを含む、薬学的組成物。
[本発明1045]
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、本発明1044の薬学的組成物。
[本発明1046]
2つ以上のmiRNAが組換えベクターから発現される、本発明1044の薬学的組成物。
[本発明1047]
組換えベクターが、DNAプラスミド、ウイルスベクター、およびDNAミニサークルからなる群より選択される、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1048]
hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される2つ以上のmiRNAを含む、本発明1044の薬学的組成物。
[本発明1049]
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、本発明1048の薬学的組成物。
[本発明1050]
2つ以上のmiRNAが組換えベクターから発現される、本発明1048の薬学的組成物。
[本発明1051]
組換えベクターが、DNAプラスミド、ウイルスベクター、およびDNAミニサークルからなる群より選択される、本発明1048の薬学的組成物。
[本発明1052]
hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを前脂肪細胞の集団に投与する段階を含む、前脂肪細胞を誘導して脂肪細胞に分化させる方法。
[本発明1053]
前脂肪細胞を脂肪細胞に分化させる誘導が、前脂肪細胞を100 nMロシグリタゾンに2日間曝露した後に維持培地に曝露した場合の、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化よりも大きい、本発明1052の方法。
[本発明1054]
1つまたは複数のmiRNAが、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、本発明1052の方法。
[本発明1055]
hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを脂肪細胞の集団に投与する段階を含む、脂肪細胞の脂質含量を減少させる方法。
[本発明1056]
脂肪細胞の脂質含量が、100 nMロシグリタゾンに2日間曝露した後に維持培地に曝露した脂肪細胞の脂質含量よりも低い、本発明1055の方法。
[本発明1057]
脂肪細胞の脂質含量が、培養期間中100 nMロシグリタゾンに曝露した脂肪細胞の脂肪含量よりも低い、本発明1055の方法。
[本発明1058]
培養期間が8〜16日である、本発明1057の方法。
[本発明1059]
培養期間が10〜14日である、本発明1058の方法。
[本発明1060]
培養期間が14日である、本発明1059の方法。
[本発明1061]
1つまたは複数のmiRNAが、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、本発明1055の方法。
[本発明1062]
hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを対象に投与する段階を含む、それを必要とする対象においてインスリン感受性を高める方法。
[本発明1063]
対象が哺乳動物である、本発明1062の方法。
[本発明1064]
哺乳動物がヒトである、本発明1063の方法。
[本発明1065]
1つまたは複数のmiRNAが、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、本発明1062の方法。
[本発明1066]
hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを細胞に投与する段階を含む、細胞における1つまたは複数の脱共役タンパク質の発現または活性を増加させる方法。
[本発明1067]
細胞が、褐色脂肪細胞、白色脂肪細胞、皮下脂肪細胞、肝臓細胞、または筋細胞からなる群より選択される、本発明1066の方法。
[本発明1068]
1つまたは複数の脱共役タンパク質がUCP-1またはUCP-2を含む、本発明1066の方法。
[本発明1069]
hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを対象に投与する段階を含む、それを必要とする対象において脂肪消失を引き起こす方法。
[本発明1070]
対象が哺乳動物である、本発明1069の方法。
[本発明1071]
哺乳動物がヒトである、本発明1070の方法。
[本発明1072]
肥満を治療するための医薬の製造における、表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアの使用。
[本発明1073]
1つまたは複数のmiRNAが、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、本発明1072の使用。
[本発明1074]
アゴミアまたはアンタゴミアが標的指向部分に連結される、本発明1072の使用。
[本発明1075]
標的指向部分がアプタマーである、本発明1074の使用。
[本発明1076]
肥満を治療するための、表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアを含む組成物。
[本発明1077]
1つまたは複数のmiRNAが、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、本発明1076の組成物。
[本発明1078]
アゴミアまたはアンタゴミアが標的指向部分に連結される、本発明1076の組成物。
[本発明1079]
標的指向部分がアプタマーである、本発明1076の組成物。
>染色体:GRCh37:4:141479988:141490559:-1
Claims (79)
- 細胞における呼吸鎖脱共役を調節する方法であって、細胞を、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤の活性を調節するmiRNA剤と接触させる段階を含む、方法。
- 細胞が、前脂肪細胞、脂肪細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、肝細胞、筋細胞、またはそれらの前駆体である、請求項1に記載の方法。
- 組織における熱発生を調節する方法であって、組織を、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤の活性を調節するmiRNA剤と接触させる段階を含む、方法。
- 組織が、褐色脂肪、白色脂肪、皮下脂肪組織、肝臓、または筋肉である、請求項3に記載の方法。
- 組織をエクスビボでmiRNA剤と接触させる、請求項4に記載の方法。
- その治療を必要とするヒト対象において肥満を治療する方法であって、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤の活性または発現を調節するmiRNA剤の有効量をヒト対象に投与する段階を含む、方法。
- 治療のために選択されるヒト対象が、肥満に対する遺伝的素因または後成的素因を有する、請求項6に記載の方法。
- ミトコンドリア脱共役剤がUCP1またはUCP2である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- miRNA剤が、表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択されるmiRNAである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- miRNA剤が、表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択されるmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- miRNA剤が、hsa-miR-19b-2-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-211、hsa-miR-325、hsa-miR-382-3p/5p、hsa-miR-543、hsa-miR-515-3p、およびhsa-miR-545からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- miRNA剤が、hsa-miR-331-5p、hsa-miR-552、hsa-miR-620、およびhsa-miR-1179からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- miRNA剤が標的指向部分に連結される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 標的指向部分がアプタマーである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 標的指向部分がmiRNA剤を特定の細胞型または組織に送達する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- miRNA剤が、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- miRNA剤が、少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- miRNA剤が、ミトコンドリア脱共役タンパク質の活性化因子または抑制因子の活性を調節する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 活性化因子または抑制因子が、表2に記載される活性化因子または抑制因子からなる群より選択される、請求項18に記載の方法。
- miRNA剤が、活性化因子または抑制因子のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する、請求項20または21に記載の方法。
- miRNA剤が、活性化因子または抑制因子のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する、請求項20または21に記載の方法。
- ミトコンドリア脱共役タンパク質のmRNAまたはタンパク質発現が上方制御される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ミトコンドリア脱共役タンパク質のミトコンドリア脱共役活性が上方制御される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 以下を含む、熱発生を調節するmiRNA剤をスクリーニングする方法:
a) ヒトゲノムを含む指標細胞を提供する段階;
b) 該指標細胞を試験miRNA剤と接触させる段階;ならびに
c) 該miRNA剤の存在下および非存在下において、該指標細胞における少なくとも1つの熱発生制御因子の細胞活性を決定する段階であって、試験miRNA剤の存在下における熱発生制御因子の活性の変化により、その試験miRNA剤が熱発生を調節するmiRNA剤として同定される、段階。 - 細胞が、脂肪細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、肝細胞、筋細胞、またはそれらの前駆体である、請求項26に記載の方法。
- 段階 (c) において決定される熱発生制御因子の細胞活性が、熱発生制御因子のmRNA発現レベル、タンパク質発現レベル、またはミトコンドリア脱共役活性である、請求項26に記載の方法。
- 熱発生制御因子がUCP1である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞における少なくとも1つの熱発生制御因子の活性を調節する、アゴミアまたはアンタゴミア。
- 表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択されるmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアである、請求項30に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
- hsa-miR-19b-2-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-211、hsa-miR-325、hsa-miR-382-3p/5p、hsa-miR-543、hsa-miR-515-3p、およびhsa-miR-545からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである、請求項30に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
- hsa-miR-331-5p、hsa-miR-552、hsa-miR-620、およびhsa-miR-1179からなる群より選択されるmiRNAのアンタゴミアである、請求項30に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
- 標的指向部分に連結される、請求項30〜34のいずれか一項に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
- 標的指向部分がアプタマーである、請求項35に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
- 標的指向部分がアゴミアまたはアンタゴミアを特定の細胞型または組織に送達する、請求項35または36に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
- 少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する、請求項28〜33のいずれか一項に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
- 少なくとも1つのミトコンドリア脱共役剤のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する、請求項30〜37のいずれか一項に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
- ミトコンドリア脱共役タンパク質の活性化因子または抑制因子の活性を調節する、請求項30〜37のいずれか一項に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
- 活性化因子または抑制因子が、表2に記載される活性化因子または抑制因子からなる群より選択される、請求項30〜37のいずれか一項に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
- 活性化因子または抑制因子のmRNAまたはプロモーター領域に直接結合する、請求項30〜37のいずれか一項に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
- 活性化因子または抑制因子のmRNAの5'UTRまたはコード配列に直接結合する、請求項30〜37のいずれか一項に記載のアゴミアまたはアンタゴミア。
- hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される2つ以上のmiRNAを含む、薬学的組成物。
- 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項44に記載の薬学的組成物。
- 2つ以上のmiRNAが組換えベクターから発現される、請求項44に記載の薬学的組成物。
- 組換えベクターが、DNAプラスミド、ウイルスベクター、およびDNAミニサークルからなる群より選択される、請求項47に記載の薬学的組成物。
- hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される2つ以上のmiRNAを含む、請求項44に記載の薬学的組成物。
- 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項48に記載の薬学的組成物。
- 2つ以上のmiRNAが組換えベクターから発現される、請求項48に記載の薬学的組成物。
- 組換えベクターが、DNAプラスミド、ウイルスベクター、およびDNAミニサークルからなる群より選択される、請求項48に記載の薬学的組成物。
- hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを前脂肪細胞の集団に投与する段階を含む、前脂肪細胞を誘導して脂肪細胞に分化させる方法。
- 前脂肪細胞を脂肪細胞に分化させる誘導が、前脂肪細胞を100 nMロシグリタゾンに2日間曝露した後に維持培地に曝露した場合の、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化よりも大きい、請求項52に記載の方法。
- 1つまたは複数のmiRNAが、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、請求項52に記載の方法。
- hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、hsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを脂肪細胞の集団に投与する段階を含む、脂肪細胞の脂質含量を減少させる方法。
- 脂肪細胞の脂質含量が、100 nMロシグリタゾンに2日間曝露した後に維持培地に曝露した脂肪細胞の脂質含量よりも低い、請求項55に記載の方法。
- 脂肪細胞の脂質含量が、培養期間中100 nMロシグリタゾンに曝露した脂肪細胞の脂肪含量よりも低い、請求項55に記載の方法。
- 培養期間が8〜16日である、請求項57に記載の方法。
- 培養期間が10〜14日である、請求項58に記載の方法。
- 培養期間が14日である、請求項59に記載の方法。
- 1つまたは複数のmiRNAが、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、請求項55に記載の方法。
- hsa-let-7aアゴミア、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-1アンタゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-19bアンタゴミア、hsa-miR-30bアゴミア、およびhsa-miR-30bアンタゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを対象に投与する段階を含む、それを必要とする対象においてインスリン感受性を高める方法。
- 対象が哺乳動物である、請求項62に記載の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項63に記載の方法。
- 1つまたは複数のmiRNAが、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、請求項62に記載の方法。
- hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを細胞に投与する段階を含む、細胞における1つまたは複数の脱共役タンパク質の発現または活性を増加させる方法。
- 細胞が、褐色脂肪細胞、白色脂肪細胞、皮下脂肪細胞、肝臓細胞、または筋細胞からなる群より選択される、請求項66に記載の方法。
- 1つまたは複数の脱共役タンパク質がUCP-1またはUCP-2を含む、請求項66に記載の方法。
- hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAを対象に投与する段階を含む、それを必要とする対象において脂肪消失を引き起こす方法。
- 対象が哺乳動物である、請求項69に記載の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項70に記載の方法。
- 肥満を治療するための医薬の製造における、表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアの使用。
- 1つまたは複数のmiRNAが、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、請求項72に記載の使用。
- アゴミアまたはアンタゴミアが標的指向部分に連結される、請求項72に記載の使用。
- 標的指向部分がアプタマーである、請求項74に記載の使用。
- 肥満を治療するための、表1、11、13、および14に記載されるmiRNAからなる群より選択される1つまたは複数のmiRNAのアゴミアまたはアンタゴミアを含む組成物。
- 1つまたは複数のmiRNAが、hsa-let-7aアンタゴミア、hsa-miR-1アゴミア、hsa-miR-19bアゴミア、およびhsa-miR-30bアゴミアからなる群より選択される、請求項76に記載の組成物。
- アゴミアまたはアンタゴミアが標的指向部分に連結される、請求項76に記載の組成物。
- 標的指向部分がアプタマーである、請求項76に記載の組成物。
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