CN105521490B - miRNA-888-3p在椎间盘退行性疾病诊治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及miRNA‑888‑3p在椎间盘退行性疾病诊治中的应用。经实验证明，miRNA‑888‑3p可以有效地区分椎间盘退行性疾病样本和健康人的样本。本发明还公开了miRNA‑888‑3p制备治疗椎间盘退行性疾病的药物中的应用。本发明为在分子水平上临床诊断椎间盘退行性疾病提供了新的方法，同时为椎间盘退行性疾病的基因治疗提供了新的靶点。

Description

miRNA-888-3p在椎间盘退行性疾病诊治中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地涉及miRNA-888-3p在椎间盘退行性疾病诊断、治疗中的用途。

背景技术

微小RNA(miRNA或microRNA)是一种长度为18～25个核苷酸单链的内源性非编码性小RNA，是由前体在酶的加工下生成，前体的序列一般为70～120个核苷酸。通过与靶基因序列特异性相互作用在转录水平调节基因表达，参与多种生物学过程，进化过程保守。对miRNA空间表达的***性分析表明，很多miRNAs以组织特异性方式表达。每一种miRNA可以定位于很多种mRNA，miRNA与RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因mRNA5’-UTR或者3’-UTR中的互补序列相结合，抑制蛋白质翻译，或是引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达，因此很多种转录子可能受到miRNA的精细调节，使转录-翻译***有效运转，进而细胞得以快速而有效地控制阈值依赖性的细胞事件。目前普遍认为miRNA的功能是参与生命的一些基本过程如生长发育、器官形成、造血、细胞增殖与凋亡、应激反应和肿瘤生成等。

椎间盘退行性疾病是指椎间盘组织在多种原因综合作用下发生细胞介导的生物化学变化，引起老化加速、椎间盘力学特性改变，使临近骨关节、韧带发生相应变化，造成脊柱不稳，压迫脊髓、神经根、动脉，引起相应临床症状和体征的综合征。它包括椎间盘源性腰痛、椎间盘突出症、退行性脊椎不稳症、退行性椎管狭窄症、退行性滑脱症等，是临床上常见疾病之一。其病因尚不清楚，目前普遍认为椎间盘退行性疾病的发生是遗传和环境因素共同作用的结果。随着基因检测技术的发展，近年来，人们逐渐意识到遗传易感性即遗传因素对于揭示椎间盘退行性疾病发病的重要作用。

目前椎间盘退行性疾病一般采取保守治疗，即从保守治疗依次到微创、常规手术治疗、非融合固定治疗、融合固定治疗的阶梯。越是高级阶梯的治疗，创伤越大，对机体自然解剖状态的干预越大，每一高级阶梯的治疗可作为对相对低级阶梯治疗的补救措施。对患者采取的治疗方案要根据患者病情所处的阶段，同时也要考虑到患者个体因素，如创伤、风险、费用以及患者的意愿。但是无论哪种手术方式，均不能在椎间盘退变的早期进行有效地干预，不能延缓或逆转疾病的发展。开放手术(椎间盘切除融合内固定术)虽能较为彻底的切除退变椎间盘，但手术创伤大，费用高，内固定限制了脊柱的活动度，加速邻近节段椎间盘的退变。微创手术不能彻底切除退变椎间盘组织，术后症状可能不能完全缓解，术后复发的可能性较大。

基因治疗为椎间盘退变的治疗开辟了新途径，并取得了鼓舞人心的成果。目前已经报道了一些miRNA与椎间盘退行性疾病有关如miRNA-623、miRNA-625等，但目前基因治疗的研究仍停留在基础实验阶段，如若应用于临床还有很多难题亟待解决。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种miRNA-888-3p在椎间盘退行性疾病诊治中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了miRNA-888-3p在制备治疗椎间盘退行性疾病药物中的应用，所述miRNA-888-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的实验证明miRNA-888-3p与椎间盘退行性疾病相关，

进一步，所述药物包含miRNA-888-3p抑制剂。

进一步，所述miRNA-888-3p抑制剂能够抑制miRNA-888-3p的表达或者能够抑制miRNA-888-3p的功能。

进一步，miRNA-888-3p抑制剂包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物。

优选地，所述miRNA-888-3p抑制剂是miRNA-888-3p的反义寡核苷酸或拮抗剂。

本发明提供了一种治疗椎间盘退行性疾病的药物，所述药物包括上述的miRNA-888-3p抑制剂。

根据miRNA-888-3p序列设计出它的特异性反义寡核苷酸，将反义寡核苷酸转移到人体内后，它们能够明显下调miRNA-888-3p的表达。“反义寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，AS-Ons或ASO)”又称为“反义核苷酸”，是指长度约为18-26nt(更特别的约19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其类似物。

在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(locked nucleicacid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2’氧原子和4’碳原子连接起来的修饰技术。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。

本发明的治疗椎间盘退行性疾病的药物还包含药物学上可以接受的载体，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

所述药物可以单独施用或者与其他能够抑制椎间盘退行性疾病的药物进行组合施用。

所述药物可以离体施用：将miRNA-888-3p的反义寡核苷酸或者拮抗剂、miRNA-888-3p反义寡核苷酸的表达载体在体外导入或转染人体自身或异体细胞(或异种细胞)，经体外细胞扩增后，输回人体。

所述药物可以体内施用：将miRNA-888-3p的反义寡核苷酸或者拮抗剂、miRNA-888-3p反义寡核苷酸的表达载体直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸DNA或RNA。

所述的受试者可以是人类或者其他哺乳动物。更具体地，受试者是器官、组织、细胞。

本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。

本发明提供了miRNA-888-3p在制备椎间盘退行性疾病早期诊断试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种诊断早期椎间盘退行性疾病的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测miRNA-888-3p的表达水平的试剂。与健康人组织中的miRNA-888-3p的表达水平比较，若通过试剂盒检测受试者组织中miRNA-888-3p的表达水平显著升高，则判断该受试者患有椎间盘退行性疾病。

进一步，上述的试剂包括针对miRNA-888-3p的引物和/或探针。所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断椎间盘退行性疾病的miRNA的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合判断椎间盘退行性疾病的情况也包含在本发明的保护范围之内。

本发明提供了一种诊断椎间盘退行性疾病的芯片，所述芯片包括固相载体以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miRNA-888-3p的部分或全部序列。所述寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断椎间盘退行性疾病的miRNA的寡核苷酸探针，将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合判断椎间盘退行性疾病的情况也包含在本发明的保护范围之内。

进一步，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

本发明的miRNA-888-3p可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达miRNA-888-3p的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、非病毒性载体、真核载体。

病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。

非病毒载体包括裸质粒DNA载体，如pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等；阳离子聚合物，主要包括聚乙烯亚胺、聚左旋赖氨酸、富精氨酸蛋白、聚乙二醇以及阳离子共聚体等；基于抗体的靶向基因传递***组蛋白类；脂质体或脂质复合物，是目前使用最为普遍的非病毒载体。

应当知道，本发明的miRNA-888-3p包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体。

本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miRNA-888-3p功能的条件下，对miRNA-888-3p进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了miRNA-888-3p表达与椎间盘退行性疾病相关，通过检测受试者组织中miRNA-888-3p的表达水平，可以判断受试者是否患有椎间盘退行性疾病，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

附图说明

图1显示利用QPCR检测miRNA-888-3p在椎间盘退行性疾病组织中的表达情况；

图2显示利用QPCR检测miRNA-888-3p在椎间盘退行性疾病细胞系中的表达情况；

图3显示anti-miRNA-888-3p对miRNA-888-3p表达的抑制作用。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1与椎间盘退行性疾病相关的miRNA的筛选

1、样本获取：各收集10例健康人组织样本和椎间盘退行性疾病患者髓核组织样本。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、样本总RNA的提取

使用QIAGEN公司的组织RNA提取试剂盒提前总RNA。具体步骤如下：

1)在较少RNase干扰的清洁区，使用含适量液氮的研钵称取组织样本约20mg，用杵棒研磨至粉末状；

2)将样本转移到一个不含RNA酶的2ml的离心管中；

3)加入300μl Lysis solution，置于匀浆器内，充分研磨1-5min；

4)12000g，4℃，离心10min，转移上清至新的1.5ml的离心管中；

5)加入600μl RNase-Free Water，用漩涡器混匀；

6)加入20μl蛋白酶K，在55℃水浴锅中温浴15min，不断涡旋混匀；

7)14000g，室温，离心1min，使细胞碎片沉淀于离心管底部，取上清转移到另外一个不含RNA酶1.5ml的离心管中；

8)加入450μl的95％乙醇，涡旋混匀；

9)取650μl含乙醇的裂解液加到离心柱中，14000g离心1min；弃下层，将柱子重新置于收集管中；

10)依照裂解液的容量，重复步骤9)；

11)加入400μl Wash solution，14000g离心2min；弃下层，将柱置于一新的收集管中；

12)加入100μl Enzyme Incubation Buffer和15μl DNase I，14000g离心1min，将收集管中的溶液重新移入柱中，室温放置15min；

13)加入400μl Wash solution，14000g离心1min，弃下层，将柱子重新置于收集管中；

14)加入400μl Wash solution，14000g离心2min，弃收集管，把柱子放入1.7mlElution管中；

15)加入30μl Elution Buffer，200g离心2min，使溶液充分与柱结合；

16)14000g离心1min，将RNA使用无RNA去离子水溶解，待用。

3、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)

NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent Technologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，一般认为28S:18S≥2可以初步判定总RNA质量较好。

4、miRNA的提取和标记

1)用Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提获得miRNA，具体操作按照相应说明书。样品用T4RNA连接酶标记步骤依照Thomson的方法。miRNA标记方法大致如下：1.4μg miRNA和500ng 5’-磷酸盐-胞嘧啶-尿嘧啶cy3-3’(Dharmacon，Chicago，USA)及2单位T4RNAligase(NEB，Ipswich，USA)，于4℃孵育2小时。每份miRNA样品均设等量的相应阴性对照。

2)标记的RNA用0.3M醋酸钠和2.5倍体积的乙醇进行沉淀，再用15μl含3×SSC、0.2％SDS和15％甲酰胺的杂交液重悬，所有的杂交重复两次，杂交用LifterSlipTM(Erie，PA USA)以保证杂交液在芯片和盖片之间均匀流动。

3)将杂交室放在杂交仪BioMixerTMII上(CapitalBio Corp，Beijing，China)于42℃水浴过夜，用洗液洗两遍。

5、miRNA芯片操作：

miRNA芯片，采用博奥生物有限公司的miRNA表达谱芯片(单通道芯片)，按照说明书的指示进行miRNA表达谱的检测。

6、结果：

分析miRNA芯片表达谱的检测结果，可知miRNA-888-3p在椎间盘退行性疾病患者组织中和健康人的组织中的表达存在显著差异，与健康人的髓核组织相比，在椎间盘退行性疾病髓核组织中miRNA-888-3p的水平显著升高。

实施例2QPCR验证差异表达的miRNA-888-3p

1、根据miRNA芯片的检测结果选择miRNA-888-3p进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择椎间盘退行性疾病患者髓核组织样本和健康人髓核组织样本各60例。

2、RNA提取过程同实施例1。

3、逆转录：

1)将2μg的总RNA模板与1μl 2μM miRNA逆转录引物、1μl 2μM U6snRNA逆转录引物、1μl dNTP(10mM)混合物和无RNase的去离子水混合，终体积为20μl，混匀。

2)65℃孵育5min。

3)立即在冰上冷却。

4)依次加入以下成分：4μl 5×缓冲液、2μl DTT(0.1M)、1μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，将溶液混匀。

5)37℃温育5min。

6)加入1μl M-MLV逆转录酶，混匀。

7)37℃反应1h后，于70℃，15min终止反应，-20℃冻存备用。

miRNA逆转录引物序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，U6snRNA逆转录引物序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。

4、QPCR反应：采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

1)配制以下反应体系：

SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM)1μl，反向引物(5μM)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。

2)设置扩增程序：

95℃10min，(95℃20s，60℃55s)×50个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。扩增miRNA-888-3p的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物为如SEQ ID NO.5所示。以U6snRNA作为参照基因，其上游引物序列为SEQ ID NO.6所示；下游引物序列为SEQ ID NO.7所示。通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、结果

如图1所示，与健康人的髓核组织相比，椎间盘退行性疾病患者髓核组织中miRNA-888-3p的表达水平显著升高，与miRNA芯片结果一致。

实施例3miRNA-888-3p在椎间盘退行性疾病细胞中的表达

1、细胞培养

1)将获取的髓核组织在无菌条件下用D-HANKS液冲洗3次。

2)用剪刀将髓核组织剪碎(约1mm³大小)，置于无菌离心管中。

3)使用0.25％胰蛋白酶于37℃消化20min，每5min摇动一次。

4)800rpm离心5min，弃去上清液。

5)0.2％Ⅱ型胶原酶37℃消化4h，用200目筛网过滤。

6)滤液以800rpm离心5min，弃去上清液。

7)DMEM/F12培养基冲洗，800rpm离心5min，重复3次。

8)细胞计数后接种于培养瓶，含15％胎牛血清及1％P/S的DMEM/F12培养基作为培养液，于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

2、QPCR

2.1细胞总RNA提取：利用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，按照说明书指示进行。

2.2QPCR：步骤同实施例2。

3、结果

如图2所示，与健康人髓核细胞相比，椎间盘退行性疾病的髓核细胞miRNA-888-3p的表达明显升高(P<0.05)。

实施例4研究miRNA-888-3p对椎间盘退行性疾病细胞增殖能力的影响

1、设计合成针对miRNA-888-3p的反义寡核苷酸(anti-miRNA-888-3p)

根据miRNA-888-3p的序列信息由大连宝生物生物技术有限公司设计合成anti-miRNA-888-3p和随机对照序列。

2、细胞培养：椎间盘退行性疾病患者的髓核细胞培养方法同实施例3。

3、细胞转染

将髓核细胞分为两组，分别为抑制阴性对照组(anti-NC)、miRNA-888-3p抑制组(anti-miRNA-888-3p)。将阴性对照组及抑制组分别转染anti-NC和anti-miRNA-888-3p，运用转染试剂LipofectamineTM 2000进行转染，转染方法参照说明书。anti-NC和anti-miRNA-888-3p的工作浓度均为5μM。转染后48h收集各组细胞用于后续实验。

4、QPCR实验

细胞总RNA提取和PCR步骤同实施例3。

结果如图3所示，与抑制阴性对照组(anti-NC)相比，miRNA-888-3p抑制组(anti-miRNA-888-3p)的miRNA-888-3p的水平显著下降，表明anti-miRNA-888-3p能够有效抑制miRNA-888-3p的表达。

5、细胞增殖实验

将转染48h的髓核细胞使用0.25％胰酶消化成细胞悬液，以5×10⁴个/ml接种于96孔细胞培养板，每孔0.1ml，60min后，MTT法测各孔490nm波长光吸收值。用光吸收值大小代表活细胞的相对数量。

6、结果

miRNA-888-3p抑制组(anti-miRNA-888-3p)相对光密度值为1.512±0.213，抑制阴性对照组(anti-NC)相对光密度值为0.215±0.033。与抑制阴性对照组(anti-NC)相比，miRNA-888-3p抑制组(anti-miRNA-888-3p)光吸收值显著上升(P<0.05)。上述实验结果表明miRNA-888-3p抑制髓核细胞增殖。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.miRNA-888-3p抑制剂在制备治疗椎间盘退行性疾病药物中的应用，其特征在于，所述miRNA-888-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA-888-3p抑制剂能够抑制miRNA-888-3p的表达或者能够抑制miRNA-888-3p的功能。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述miRNA-888-3p抑制剂是miRNA-888-3p的反义寡核苷酸或拮抗剂。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。

5.检测miRNA-888-3p表达水平的试剂在制备椎间盘退行性疾病早期诊断试剂盒中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂包括针对miRNA-888-3p的引物和/或探针。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括芯片，所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miRNA-888-3p的部分或全部序列。