JP2015512655A - 免疫レパートリ分析におけるサンプル混入の検出および定量化 - Google Patents
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Abstract
Description
いくつかについては、下記および本明細書の全体を通して概説される。
Harbor Laboratory Press)などの標準の実験マニュアルにおいて見つけることができる。
ついての値は、組織サンプル中に存在し得る他の個人のものと区別され得る。これらのマーカに基づく関心のある個人の遺伝的個性が、あらかじめ知られていない場合、それは、アッセイにおいて生成される情報から決定されてもよい。関心のある個人のDNAが、大部分の核酸、たとえば80パーセント、90パーセント、95パーセントなどあろうと仮定すると、遺伝子マーカの様々な対立遺伝子に対応する配列リードの分布は、遺伝子マーカ座1について図1Cにおいて示されるように、関心のある個人に対応する対立遺伝子、つまり、大多数の対立遺伝子に偏るであろう。座1について、遺伝子マーカ、S1が、6つの対立遺伝子、S1A、S1B、S1C、S1D、S1E、およびS1Fを有するとする。最も大きな数の配列リード(152)を有する対立遺伝子、S1Cは、関心のある個人の対立遺伝子に相当するであろう。S1Cの配列リード(150)のうちのいくつかは、他の個人によるものであってもよく、いくつかは、他の対立遺伝子、たとえば(154)の中に分布してもよい。他の遺伝子座由来の配列リードの独立した数から、連立一次方程式を立て、関心のある個人および他の個人由来の核酸の割合の推定値を得るために解かれてもよい(たとえば、2つの未知数は、x1=関心のある個人由来の遺伝子マーカの全配列リードの割合およびx2=他の個人由来の遺伝子マーカの全配列リードの割合としてもよい)。それぞれの遺伝子マーカについての様々な対立遺伝子の間の配列リードの分布は、関心のある個人の特徴である対立遺伝子を同定するために使用され得る。クロノタイププロファイル測定の最大感度についての基準(たとえば、白血病クローンなどの相互に関連のあるクロノタイプの検出のための)は、図1Cにおいて線(155)によって示されるように、最大の非患者対立遺伝子の値によって提供される。対立遺伝子、S1Dを有する単一の混入ゲノムがあると仮定されている場合、S1Dよりも大きな値を有するいかなるクロノタイプも、患者クロノタイプの正確な測定になるであろう。S1D対立遺伝子未満のレベルのクロノタイププロファイルにおいて存在するいかなるクロノタイプについても、クロノタイプが患者から生じたものではない可能性がある。
、再構成核酸(Pr(124)およびCr(128))ならびに非再構成核酸(Pn(126)およびCn(130))にさらに分けられる。上記に言及されるように、いくつかの状況下で、比Pr/Pnは、比Cr/Cnと非常に異なり得る。それぞれのバンドにおいて、遺伝子マーカ遺伝子座、S1〜S4は、混入核酸に対する患者核酸の比を決定するために利用可能であり、これは、(Pn+Pr)/(Cn+Cr)=Rstr1であり、ここで、Rstr1は、他の個人由来の遺伝子マーカの配列リードに対する、患者核酸由来の遺伝子マーカの配列リードの比、つまり、上記からx1/x2である。
とも2つの方法で決定されてもよい。削除されるセグメント中に位置する多型遺伝子マーカを使用して、患者(または関心のある個人)および混入核酸由来の非再構成核酸の相対量を比較してもよい。すなわち、比Pn/Cn=Rstr2は、非再構成核酸由来の遺伝子マーカの配列リードから計算されてもよい。その代わりに、内部標準を使用して、非再構成配列の全数が数えられてもよい。第1のおよび/または第2の削除されるセグメントについてのそのような内部標準は、より十分に下記に議論されるように、従来の技術を使用して、上記のNCBI配列から容易に構成される。全核酸に関して、そのような測定は、数量、Pn+Cn=Wxの決定を可能にし、ここで、Wxが、非再構成核酸の全数または全濃度である。
本発明の一態様において、混入クロノタイプが、遺伝的個性マーカの代わりとして配列タグを使用することによって検出され、かつ定量化されてもよい。本態様において、患者サンプル中のそれぞれのクロノタイプが、下記により十分に記載されるように、配列タグによって決定され、標識される。クロノタイプの形態をしているキャリーオーバ混入の存在は、クロノタイプが、作業中のサンプルまたは他のサンプルから生じたかどうかを決定するために、配列タグを使用することによって検出されてもよい。これは、それぞれの患者サンプルから決定される配列タグの記録を維持することによって達成され、次いで、次の測定が行われる場合は常に、作業中の測定の配列タグが、前の測定のものと比較される。クロノタイプと関連する配列タグのそのような記録は、それぞれの測定からの多くのタグならびに従来のアルゴリズムを使用する電子記録の検索および比較の容易性のために、大容量記憶装置上に電子記録として好都合に維持される。マッチが見つかった場合、最も可能性の高い原因は、キャリーオーバ混入である、ただし、測定に用いられる配列タグの集団が、十分に大きいことを条件とする。上記に議論されるサンプリングによって標識するためのクロノタイプ集団に対する配列タグ集団のサイズの同様な例示的な比は、キャリーオーバ混入の検出に適用可能である。一実施形態において、そのような比が、100:1以上であり、他の実施形態において、そのような比が、1000:1以上である。
いくつかの実施形態において、本発明は、速やかにかつ効率的にクロノタイププロファイルを決定するために、T細胞受容体(TCR:T cell receptor)またはB細胞受容体(BCR:B cell receptor)またはその定められたフラグメントなどの免疫分子のレパートリから配列データを得、かつ分析するためのステップ
を含む。配列データは、典型的に、免疫分子を分析するために使用されるDNAシークエンサからの配列リード、つまりベースコールの配列の大きな集合体および関連するクオリティースコアを含む。クロノタイププロファイルの構成における重要な課題は、抽出ステップ、シークエンシング化学、増幅化学、およびその他同種のものなどの、真の差異を含有する配列リードを、非生物学的な源由来のエラーを含有するものから、速やかにかつ正確に区別することである。本発明の一態様は、そのようなコンジュゲートの配列リードが同じもとのクロノタイプに由来するかどうかを決定するのを補助するために、サンプル中のそれぞれのクロノタイプに対してユニークな配列タグを付加するステップを含む。本発明の一態様に従って、配列タグが、タグ−分子コンジュゲートを形成するために、体細胞組換え核酸分子に対して付加され、そのようなコンジュゲートのそれぞれの再構成核酸が、ユニークな配列タグを有する。通常、そのような付加は、核酸分子がT細胞および/またはB細胞を含有するサンプルから抽出された後に、行われる。好ましくは、そのようなユニークな配列タグは、ハミング距離またはその他同種のものなどの、配列についての従来の距離測定値によって決定されるように、互いに、可能な限り、非常に異なる。タグ−分子コンジュゲート中の配列タグの間の距離を最大限にすることによって、シークエンシングおよび増幅のエラーの率が高いとしても、コンジュゲートの配列タグは、異なるコンジュゲートの任意の他のタグ配列のものに対してよりも、その原型となるタグ配列に対してはるかに類似したままである。たとえば、16塩基長配列タグが用いられ、クロノタイプのセット上のそれぞれのそのようなタグが、クロノタイプ上のあらゆる他の配列タグから、少なくとも50パーセントまたは8ヌクレオチドのハミング距離を有する場合、配列タグのミスリード(および関係ない配列タグを有するクロノタイプの配列リードの不正確なグルーピング)のために、あるそのようなタグを他のものに変換するのに、少なくとも8つのシークエンシングまたは増幅のエラーが、必要であろう。一実施形態において、配列タグが、タグ−分子コンジュゲートを形成するための再構成核酸分子に対する付加後に、タグ−分子コンジュゲートのタグの間のハミング距離が、そのような配列タグの全長の少なくとも25パーセントの数となるように、選択される。(すなわち、それぞれの配列タグは、そのヌクレオチドの少なくとも25パーセントにおいて、あらゆる他のそのようなタグと配列が異なる);他の実施形態において、そのような配列タグの間のハミング距離が、そのような配列タグの全長の少なくとも50パーセントの数である。
ら、ネイチャーバイオテクノロジー(Nature Biotechnology)、第4巻(8):p.2685〜2693(2012年)など。
読化学にとって効率的ないくつかの配列タグ構造は、4つの天然のヌクレオチドを、コンビナトリアル合成において交互に使用される、共通の要素をもたないサブセットに分け、それによって、所定の長さ以上のホモポリマーセグメントを防ぐことによって作製されてもよい。たとえば、zをAまたはC、xをGまたはTとすると、
[(z)1(z)2...(z)i][(x)1(x)2...(x)j]...
の配列タグ構造が得られ、
ここで、iおよびjが、同じであっても、異なっていてもよいが、任意のホモポリマーセグメントのサイズを制限するように選択される。一実施形態において、iおよびjが、1〜6の範囲にある。そのような実施形態において、配列タグが、12〜36ヌクレオチドの範囲の長さを有していてもよく、他の実施形態において、そのような配列タグが、12〜24ヌクレオチドの範囲の長さを有していてもよい。他の実施形態において、ヌクレオチドの他の対合が、使用されてもよく、たとえば、zが、AもしくはTであり、xが、GもしくはCであるまたはzが、AもしくはGであり、xが、TもしくはCである。その代わりに、z’を、4つの天然のヌクレオチドのうちの3つの任意の組み合わせとし、x’を、z’ではない任意のヌクレオチドとする(たとえば、z’が、A、C、またはGであり、x’が、Tである)。これにより、以下のような配列タグ構造が得られる:
[(z’)1(z’)2...(z’)i]x’[(z’)1(z’)2...(z’)i]x’...
ここで、iが、上記のように選択され、x’の存在が、任意の望まれないホモポリマーを終結させるために句読点としての役割を果たす。
の再構成核酸分子が、ユニークな配列タグを付加するであろう。フォワードおよびリバースプライマー対の他方のプライマー(1106)は、C領域(1110)にアニールし、アニーリング、伸長、および融解の複数のサイクルの後に、アンプリコン(1112)が形成され、それによって、集団(1102)のクロノタイプを含むV(D)J領域に対してユニークな配列タグを付加する。すなわち、アンプリコン(1112)は、付加反応由来のタグ−分子コンジュゲートを含む。
るかまたは天然の突然変異プロセスによるかを決定する困難さのために、配列リードデータからクロノタイプを再構築する際に困難さを高める。IgHをコードするすべての核酸が別個でユニークな配列タグを収容するので、本発明に従う配列タグの使用は、そのような問題を非常に軽減する。図5において示されるように、本発明に従う配列リード(500)は、それぞれ、配列タグのコピー(502)およびクロノタイプのコピー(504)を含む。クロノタイプ部分におけるそれぞれのポジションのヌクレオチドを比較することができるように、同じ配列タグを有する配列リードがすべて集められる。したがって、たとえIgHコード配列が、たった一塩基異なっていても、それらは、別個の配列タグを収容し、サンプル中の密接に関係するIgHコード核酸は、クロノタイプ決定プロセスにおいて互いに比較されないであろう。上記に言及されるように、配列タグにおけるエラーは深刻ではない。なぜなら、クロノタイプと関連する配列タグの配列は配列スペースにおいて非常に異なっているので、ある配列タグが配列スペースにおいて任意の他の配列タグに近くなることなく膨大な数の塩基変化が維持され得るからである。
)により再増幅される。プライマーP7はまた、1回のシークエンシングの実行におけるサンプルの任意選択の多重化のための第2の配列タグ(221)を含む。第2のPCR後に、アンプリコン(280)が産生され、組み込まれたP5およびP7配列によりブリッジPCRが実行されてもよい。
いくつかの実施形態において、本発明は、増幅およびシークエンシング前に、「モザイクタグ」を含んでいてもよいユニークな配列タグにより、ゲノムDNAのフラグメントなどの核酸を標識するための方法を使用する。そのような配列タグは、増幅およびシークエンシングのエラーを同定するのに有用である。モザイクタグは、先行技術の全くランダムな配列タグで起こり得る不適切なアニーリング、プライミング、ヘアピン形成、またはその他同種のものによる、シークエンシングおよび増幅の人工物を最小限にする。一態様において、モザイクタグが、交互の定常領域および可変領域を含む配列タグであり、それぞれの定常領域が、モザイクタグ中にポジションを有し、ヌクレオチドの所定の配列を含み、それぞれの可変領域が、モザイクタグ中にポジションを有し、所定の数のランダムに選択されたヌクレオチドを含む。例説によって、22塩基長モザイクタグは、以下の形態を有していてもよい。
グが、ランダムに選択されたヌクレオチドを有する、少なくとも8つのヌクレオチドのポジションを含み、他の実施形態において、モザイクタグが少なくとも15のヌクレオチド長を有する場合は常に、それらは、ランダムに選択されたヌクレオチドを有する、少なくとも12のヌクレオチドのポジションを含む。他の態様において、7ヌクレオチド超の長さを有するモザイクタグ内の可変領域が、なくてもよい。
[(N1N2...NKj)(b1b2...bLj)]M
ここでそれぞれのNi(i=1、2、...Kj)が、A、C、G、およびTからなる群からランダムに選択されるヌクレオチドであり、Kjが、M以下であるそれぞれのjについて、1〜10の範囲の整数であり(すなわち領域N1N2...NKjは可変領域である)、それぞれのbi(i=1、2、...Lj)は、ヌクレオチドであり、Ljが、M以下であるそれぞれのjについて、1〜10の範囲の整数であり、すべての配列タグが、(i)すべてのjについての同じKjを有し、(ii)すべてのjについて同じ配列b1b2...bLjを有し(すなわち領域b1b2...bLjは、定常領域である)、Mが、2以上の整数であるステップ、(c)タグ−鋳型コンジュゲートを増幅するステップ、(d)増幅されたそれぞれのタグ−鋳型コンジュゲートについて複数の配列リードを生成するステップ、ならびに(e)同一の配列タグを有するそれぞれの複数の配列リードのそれぞれのヌクレオチドのポジションでコンセンサスヌクレオチドを決定することによって、核酸のそれぞれのヌクレオチド配列を決定するステップ。いくつかの実施形態において、複数の配列リードが、少なくとも104であり、他の実施形態において、複数の配列リードが、少なくとも105であり、さらに他の実施形態において、複数の配列リードが、少なくとも106であり、いくつかの実施形態において、上記の配列タグの全長が、15〜80ヌクレオチドの範囲にある。
本発明の一態様に従って、サンプルのクロノタイプが、それらの配列タグに基づいて配列リードを最初にグルーピングすることによって決定される。そのようなグルーピングは、従来の配列アラインメント法によって達成されてもよい。アライメント法を選択するための手引きは、参照によって組み込まれるバツォグロウ(Batzoglou)、バイオインフォマティクスにおけるブリーフィング(Briefings in Bio informatics)、第6巻:p.6〜22(2005年)において入手可能である。
配列リードがユニークな配列タグに対応するグループに集められた後、次いで、関連するクロノタイプの配列は、サンプル由来のクロノタイプの配列を決定するために分析されてもよい。図5は、ユニークな配列タグにより関連するクロノタイプの配列を決定するための例示的なアライメントおよび方法を示す。この例において、11の配列リード(500)が、それらのそれぞれの配列タグ(502)を介してアライメントされ、その後、1、2、3、4、...、nと示される配列リードのクロノタイプ部分のそれぞれのポジションのヌクレオチドが、比較される。たとえば、ポジション6(506)のヌクレオチドは、t、t、g、t、t、t、t、t、t、c、tである;すなわち、9つのベースコールはtであり、1つは「g」(508)であり、1つは「c」(510)である。一実施形態において、あるポジションでのクロノタイプ配列の正確なベースコールが、任意の大多数の塩基が一致するものとなる。ポジション6(506)の例において、ベースコールは、それが、そのポジションで大多数の配列リードにおけるヌクレオチドであるので、「t」となる。他の実施形態において、配列リードのベースコールのクオリティースコア、隣接する塩基の一致、またはその他同種のものなどの他の因子が、クロノタイプ配列についての正確なベースコールを決定するために考慮に入れられてもよい。
クロノタイププロファイルは、種々様々の組織中に存在する免疫細胞のサンプルから得られる。関心のある免疫細胞は、T細胞および/またはB細胞を含む。T細胞(Tリンパ球)は、たとえば、T細胞受容体(TCR)を発現する細胞を含む。B細胞(Bリンパ球)は、たとえば、B細胞受容体(BCR)を発現する細胞を含む。T細胞は、細胞表面マーカによって区別されてもよいヘルパーT細胞(エフェクターT細胞またはTh細胞)、細胞障害性T細胞(CTL:cytotoxic T cell)、記憶T細胞、および調節性T細胞を含む。一態様において、T細胞のサンプルが、少なくとも1,000のT細胞を含むが、より典型的には、サンプルが、少なくとも10,000のT細胞、より典型的には、少なくとも100,000のT細胞を含む。他の態様において、サンプルが1000〜1,000,000細胞の範囲の多くのT細胞を含む。免疫細胞のサンプルはまた、B細胞を含んでいてもよい。B細胞は、たとえば、血漿B細胞、記憶B細胞、B1細胞、B2細胞、辺縁層B細胞、および濾胞B細胞を含む。B細胞は、免疫グロブリンを発現することができる(抗体またはB細胞受容体とも呼ばれる)。上記のように、一態様において、B細胞のサンプルが、少なくとも1,000のB細胞を含むが、より典型的には、サンプルが、少なくとも10,000のB細胞、より典型的には、少なくとも100,000のB細胞を含む。他の態様において、サンプルが、1000〜1,000,000のB細胞の範囲の多くのB細胞を含む。
ができる。生検は、組織の一部が摘出されるコアまたは切開バイオプシーとすることができる。生検は、全病変を摘出するための試みがなされる切除バイオプシーとすることができる。生検は、組織または液体のサンプルが針で摘出される細針吸引バイオプシーとすることができる。
おいて、そのようなサンプルが、少なくとも100万の細胞を含む。
amplification)、多重置換増幅(MDA:multiple displacement amplification)、または同様の技術などの偏りのない技術によって増幅されてもよい。たとえばホーキンス(Hawkins)ら、カレントオピニオンインバイオテクノロジー(Curr.Opin.Biotech.)、第13巻:p.65〜67(2002年);ディーン(Dean)ら、ゲノムリサーチ(Genome Research)、第11巻:p.1095〜1099(2001年);ワング(Wang)ら、核酸リサーチ(Nucleic Acids Research)、第32巻:e76(2004年);ホソノ(Hosono)ら、ゲノムリサーチ(Genome Research)、第13巻:p.954〜964(2003年)など。
phy)、ポール・トラバース(Paul Travers)、およびマーク・ウォルポート(Mark Walport)、ジェーンウェーの免疫学(Janeway’s Immunology)第7版、ガーランドサイエンス(Garland Science)、2007年)。
ピーは、計算することができる。細胞の数が知られていない場合、特定のタイプの細胞が通常同等の量のRNAを生成するので、全RNAからそれを推定することができる。したがって、1μg当たりの再編成免疫受容体分子のコピーから、細胞当たりのこれらの分子の数を推定することができる。
核酸の標的集団、特に再構成免疫分子のアンプリコンは、様々な増幅技術によって生成されてもよい。本発明の一態様において、マルチプレックスPCRが、T細胞受容体もしくはその一部分またはB細胞受容体もしくはその一部分などの再構成免疫分子の混合物のメンバーを増幅するために使用される。そのような免疫分子のマルチプレックスPCRを実行するための手引きは、参照によって組み込まれる、以下の参考文献において見つけられる:モーリー(Morley)、米国特許第5,296,351号明細書;ゴースキ(Gorski)、米国特許第5,837,447号明細書;ダウ(Dau)、米国特許第6,087,096号明細書;ヴォン・ドンゲン(Von Dongen)ら、米国特許出願公開第2006/0234234号明細書;欧州特許第1544308B1号明細書など。本発明のいくつかの実施形態において、クロノタイププロファイルを生成するためのステップが、(a)T細胞受容体遺伝子の一部分および/またはB細胞受容体遺伝子の一部分を増幅するステップならびに(b)結果として生じるアンプリコンの核酸をシークエンシングするステップを含む。他のところで説明されるように、シークエンシングされたアンプリコン核酸の数は、応用法によって変動してもよい。たとえば、白血病患者がさらに寛解しているかどうかを決定するためのクロノタイププロファイルは、任意の腫瘍クローンの検出限界が非常に低くなるのように大きくなるであろう。いくつかの実施形態において、シークエンシングされるアンプリコン核酸の数が、少なくとも1000であり、他の実施形態において、シークエンシングされるアンプリコン核酸の数が、少なくとも104であり、他の実施形態において、シークエンシングされるアンプリコン核酸の数が、少なくとも105である。そのような生成ステップはまた、配列リードをクロノタイプに合体させる、クロノタイプを列挙するまたは表にする、クロノタイプの頻度分布を形成する、クロノタイプの関係するサブセットを同定する、クロノタイプ頻度情報を表示する、およびその他同種のもののさらなるステップを含んでいてもよい。
ongen)ら、米国特許出願公開第2006/0234234号明細書において見つけられてもよい。簡潔に言えば、例示的なプロトコールは、以下のとおりである:反応バッファー:ABIバッファーIIまたはABIゴールドバッファー(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、サンディエゴ、カリフォルニア州);50μl最終反応容積;100ngサンプルDNA;10pmolのそれぞれのプライマー(下記に記載されるように増幅のバランスをとるために調節にかける);200μΜ最終濃度のdNTP;1.5mM最終濃度のMgCl2(標的配列およびポリメラーゼに依存して最適化にかける);Taqポリメラーゼ(1〜2U/チューブ);サイクリング条件:95℃で7分間、あらかじめ活性化する;60℃でのアニーリング;サイクリング時間:30秒間の変性;30秒間のアニーリング;30秒間の伸長。本発明の方法において増幅のために使用することができるポリメラーゼは、市販で入手可能であり、たとえば、Taqポリメラーゼ、AccuPrimeポリメラーゼ、またはPfuを含む。使用するためのポリメラーゼの選択は、忠実度または効率が好ましいかどうかに基づくものとすることができる。
、一次PCRは、異なるプライマーによる示差的な増幅を最小限にするために、十分に少数のサイクル(たとえば5〜10)を有するであろう。第2の増幅は、プライマーの1つのペアにより行われ、よって、示差的な増幅の問題は、最小限となる。一次PCRの1パーセントは、二次PCRに直接使用される。2つの増幅の間に使用される35サイクル(100倍希釈ステップを伴わない約28サイクルと等価)は、サイクルの内訳が1回の一次サイクルおよび34回の二次サイクルまたは25回の一次サイクルおよび10回の二次サイクルかどうかに関係なく、強い増幅を示すのに十分であった。たとえ理想的に一次PCRにおける1サイクルだけを行うことが増幅バイアスを減少させ得るとしても、他に考慮すべきことがある。これについての一態様は、レプリゼンテーションである。これは、出発インプット量が最終的に得られるリードの数に対して過剰でない場合、役割を果たす。たとえば、1,000,000のリードが得られ、1,000,000のインプット分子から出発する場合、100,000分子からわずかなレプリゼンテーションを二次増幅に使用すると、もとのサンプルにおける異なる種の相対的存在量を推定する精度を下げるであろう。2ステップの間の100倍希釈は、一次PCR増幅が100分子よりもかなり多く生成しない限り、レプリゼンテーションが低下することを意味する。これは、最低8サイクル(256倍)であるが、より無理なく10サイクル(約1,000倍)が、使用されてもよいことを示す。その代わりとなるのは、一次PCRの1%超を二次に使用することであるが、一次PCRにおいて使用されるプライマーの濃度が高いために、これらのプライマーが増幅に干渉せず、また、配列の間の増幅バイアスを悪化させないことを保証するために、大きな希釈係数が使用され得る。他の代わりとなるのは、そのより小さな希釈を可能にするために、一次PCR由来のプライマーを排除するために精製または酵素ステップを追加することである。この例において、一次PCRを、10サイクルとし、第2のPCRを、25サイクルとした。
上記に言及されるように、様々な内部標準は、サンプル中の関心のある分析物の絶対量を推定するために、方法の増幅反応に対して追加されてもよい。PCRを用いる実施形態については、内部標準を設計し、調製するための手引きは、ロシェモレキュラーバイオケミカルズアプリケーションノート(Roche Molecular Biochemicals Application Note)LC 11/2000または同様の参考文献において見つけられてもよい。簡潔に言えば、内部標準について設計目標は、定量化されている標的分子と同じ増幅効率を有する化合物を提供することである。そのような目標は、以下の特性を含む内部標準を選択することによって達成されてもよい:(a)標的分子に対して相同的(同じ長さおよびGC含量を有することを含む);(b)標的分子と同じプライマー結合部位;(c)十分に定義された源由来の(たとえば直線化されたプラスミドDNA、精製PCR産物、合成DNA、またはその他同種のもの);(d)容易に検出可能(たとえばシークエンシングエラーの存在下においてでさえ容易に識別可能な別個の配列);(e)非常に正確な濃度で反応の中に導入される。
プライマーは、プライマー(222)およびプライマー(220)と同じであってもよい。
核酸をシークエンシングするための任意のハイスループット技術は、本発明の方法において使用することができる。好ましくは、そのような技術は、それから少なくとも1000のクロノタイプを決定することができる、好ましくは、少なくとも10,000〜1,000,000のクロノタイプを決定することができる多くの配列データを対費用効果の高い方式で生成する能力を有する。DNAシークエンシング技術は、標識ターミネータまたはプライマーを使用する古典的なジデオキシシークエンシング反応(サンガー法)およびスラブまたはキャピラリー中でのゲル分離、可逆的終結標識ヌクレオチドを使用する合成によるシークエンシング、パイロシークエンシング、454シークエンシング、標識オリゴヌクレオチドプローブのライブラリーに対する対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、標識クローンのライブラリーに対する対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを使用する合成によるシークエンシング、その後に続くライゲーション、重合ステップの間の標識ヌクレオチドの組み込みのリアルタイムモニタリング、ポロニーシークエンシング(polony sequencing)、ならびにSOLiDシークエンシングを含む。分離された分子のシークエンシングは、ポリメラーゼまたはリガーゼを使用する順次または単一の伸長反応およびプローブのライブラリーとの単一または順次のディファレンシャルハイブリダイゼーションによって、より最近になって実証された。これらの反応は、並行して多くのクローン配列に対して実行され、並行して1億を超える配列の現在の商用応用法における実証を含む。これらのシークエンシングアプローチは、したがって、T細胞受容体(TCR)および/またはB細胞受容体(BCR)のレパートリを研究するために使用することができる。本発明の一態様において、それらが並行してシークエンシングされる固体表面上で個々の分子を空間的に単離するためのステップを含む、シークエンシングのハイスループット方法が、用いられる。そのような固体表面は、非多孔性表面(ソレクサ(Solexa)シークエンシング、たとえばベントレー(Bentley)ら、ネイチャー(Nature)、第456巻:p.53〜59(2008年)もしくは全ゲノム解析シークエンシング(Complete Genomics sequencing)、たとえばドルマナック(Drmanac)ら、サイエンス(Science)、第327巻:p.78〜81(2010年)においてなど)、ビーズまたは粒子結合鋳型を含んでいてもよいウェルのアレイ(454、たとえばマルグリース(Margulies)ら、ネイチャー(Nature)、第437巻:p.376〜380(2005年)またはIon Torrentシークエンシング、米国特許出願公開第2010/0137143号明細書もしくは米国特許出願公開第2010/0304982号明細書によるなど)、微細加工膜(SMRTシークエンシング、たとえばイード(Eid)ら、サイエンス(Science)、第323巻:p.133〜138(2009年)によるなど)、またはビーズアレイ(SOLiDシークエンシングもしくはポロニーシークエンシング、たとえばキム(Kim)ら、サイエンス(Science)、第316巻:p.1481〜1414(2007年)によるなど)を含んでいてもよい。他の態様において、そのような方法は、それらが固体表面上で空間的に単離される前にまたはされた後に、単離された分子を増幅するステップを含む。事前の増幅は、エマルションPCRなどのエマルションベースの増幅またはローリングサークル増幅を含んでいてもよい。特に関心があるのは、ソレクサ(Solexa)ベースのシークエンシングであり、個々の鋳型分子は、固体表面上で空間的に単離され、その後、それらは、ブリッジPCRによって並行して増幅され、別々のクローン集団またはクラスターを形成し、次いで、ベントレー(Bentley)ら(上記に引用)およびメーカーの説明書(たとえばTruSeq(商標)サンプル調製キットおよびデータシート(Sample Preparation Kit and Data Sheet)、イルミナ(Illumina,Inc.)、サンディエゴ、カリフォルニア州、2010年);さらに、参照によって組み込まれる以下の参考文献
:米国特許第6,090,592号明細書;米国特許第6,300,070号明細書;米国特許第7,115,400号明細書;および欧州特許第0972081B1号明細書において記載されるように、シークエンシングされる。一実施形態において、固体表面上に配置され、増幅される個々の分子が、1cm2当たり少なくとも105クラスターの密度で、または1cm2当たり少なくとも5×105の密度で、または1cm2当たり少なくとも106のクラスターの密度でクラスターを形成する。一実施形態において、比較的高いエラー率を有するシークエンシング化学が、用いられる。そのような実施形態において、そのような化学によって産生される平均クオリティースコアが、配列リード長についての単調減少関数である。一実施形態において、そのような減少が、配列リードの0.5パーセントが、ポジション1〜75において少なくとも1つのエラーを有する、配列リードの1パーセントが、ポジション76〜100において少なくとも1つのエラーを有する、および配列リードの2パーセントが、ポジション101〜125において少なくとも1つのエラーを有することに相当する。
らびに(d)クロノタイププロファイルを生成するために核酸サンプル由来の核酸分子の異なる配列の存在量を決定するステップ。一実施形態において、シークエンシングのステップが、ネステッドセットのそれぞれについて複数の配列リードを産生するステップを含む。他の実施形態において、それぞれの体細胞再編成領域が、V領域およびJ領域を含み、それぞれの複数の配列リードが、V領域における異なるポジションから出発し、その関連するJ領域の方向に伸長する。
配列リードデータからのクロノタイプの構成は、異なる方法が異なる期待リード長およびデータクオリティーを有するので、そのようなデータを生成するために使用されるシークエンシング方法に部分的に依存する。あるアプローチにおいて、ソレクサ(Solexa)シークエンサが、分析のための配列リードデータを生成するために用いられる(ファハム(Faham)およびウィリス(Willis)、上記に引用において記載されるように)。一実施形態において、少なくとも100万の鋳型分子を産生するために、少なくとも0.5〜1.0×106リンパ球を提供するサンプルが、得られ、これは、任意選択の増幅後に、鋳型分子の対応する100万以上のクローン集団(またはクラスター)を産生してもよい。ソレクサ(Solexa)アプローチを含むほとんどの高処理シークエンシングアプローチについて、クラスターレベルでのそのような余分なサンプリングは、配列決定の正確さを増加させるためにそれぞれの鋳型配列がかなり冗長に決定されるので、望ましい。ソレクサ(Solexa)に基づく手段については、好ましくは、それぞれの独立した鋳型の配列が、10回以上決定される。異なる期待リード長およびデータクオリティーを有する他のシークエンシングアプローチについては、様々なレベルの冗長性が、配列決定の同等の精度のために使用されてもよい。当業者らは、上記のパラメーター、たとえばサンプルサイズ、冗長性、およびその他同種のものが、特定の応用法に関係する設計の選択肢であることを認識する。
場合、別々の鋳型は、配列リードの異なるポジションについて選択されたプライマーによりサンプル分子を増幅することによって最初に生成される。この概念は、プライマー(404、406、および408)が、単一の反応においてアンプリコン(それぞれ410、412、および414)を生成するために用いられる図4Aにおいて示される。そのような増幅は、同じ反応または別々の反応において実行されてもよい。一態様において、PCRが用いられる場合は常に、別々の増幅反応は、別々の鋳型の生成のために使用され、これらは、さらには、組み合わせられ、同じ鎖に沿った複数の配列リードを生成するために使用される。この後者のアプローチは、複数の鋳型の等しい増幅を保証するためにプライマー濃度(および/または他の反応パラメーター)のバランスをとる必要性を回避するのに好ましい(本明細書において「バランスのとれた増幅」または「不偏増幅」と呼ばれることもある)。別々の反応における鋳型の生成は、図4B〜4Cにおいて示される。そこで、IgH(400)を含有するサンプルは、3つの部分(470、472、および474)に分けられ、これらは、アンプリコン(それぞれ420、422、および424)を産生するために、J領域プライマー(401)およびV領域プライマー(それぞれ404、406、および408)を使用する別々のPCRに対して追加される。後者のアンプリコンは、次いで、ブリッジPCRおよびイルミナ(Illumina)GAシークエンサまたは同様の機器でのシークエンシングのための鋳型(482)を調製するためにP5およびP7プライマーを使用する二次PCR(480)において組み合わせられる(478)。
Introduction to Algorithms)、第3版(MITプレス(The MIT Press)、2009年)において一般に記載されるように用いられる。
もよく、ここで、それらは、ブリッジPCRまたは同様の技術によってさらに増幅される。
のリードがマッピングされた参照配列のそれぞれのポジションは、体細胞変異について分析される。一実施形態において、妥当な突然変異として非参照塩基を認める判定基準が、以下のものを含む:1)所定の突然変異塩基を有する少なくともN個のリード、2)少なくともN/Mリードの所定の割合(Mは、この塩基のポジションでマッピングされたリードの全数である)、ならびに3)二項分布、突然変異塩基でのN個のリードの平均Qスコアおよび非突然変異塩基を有するリードの数(M−N)に基づく統計的なカット。好ましくは、上記のパラメーターは、クロノタイプ当たりの突然変異の偽発見率が、1000のうちの1未満、より好ましくは10000のうちの1未満となるように、選択される。
本発明は、本発明の方法を実行するための物質および試薬を含むキットを含む。一実施形態において、本発明のキットが、組織サンプル中の再構成核酸の総量または濃度を決定するためのプライマーおよび再構成配列内部標準を含む。他の実施形態において、本発明のキットが、(a)組織サンプル中の再構成核酸の総量または濃度を決定するためのプライマーおよび再構成配列内部標準ならびに(b)組織サンプル中の全核酸の総量または濃度を決定するためのプライマーおよび全核酸内部標準を含む。後者の実施形態の一態様において、そのような全核酸内部標準が、恒常的にかつ普遍的に発現されるハウスキーピング遺伝子からなる群から選択されまたはそれに由来し、さらなるそのような態様において、そのような全核酸内部標準が、以下の遺伝子からなる群から選択されるまたはそれに由来する:GAPDH、β2−ミクログロブリン、18SリボソームRNA、およびβ−アクチン。他の実施形態において、本発明のキットが、(a)組織サンプル中の再構成核酸の総量または濃度を決定するためのプライマーおよび再構成配列内部標準、(b)組織サンプル中の全核酸の総量または濃度を決定するためのプライマーおよび全核酸内部標準、ならびに(c)組織サンプル中の非再構成核酸の総量または濃度を決定するためのプライマーならびに第1および/または第2の削除されるセグメントの内部標準を含む。さらに他の実施形態において、本発明のキットが、(a)組織サンプル中の再構成核酸の総量または濃度を決定するためのプライマーおよび再構成配列内部標準、(b)組織サンプル中の全核酸の総量または濃度を決定するためのプライマーおよび全核酸内部標準、(c)組織サンプル中の非再構成核酸の総量または濃度を決定するためのプライマーならびに第1および/または第2の削除されるセグメントの内部標準、ならびに(d)再構成核酸および非再構成核酸の両方に位置する1つ以上の遺伝子座の遺伝子マーカの対立遺伝子の値を決定するためのプライマーを含む。さらに他の実施形態において、本発明のキットが、(a)組織サンプル中の再構成核酸の総量または濃度を決定するためのプライマーおよび再構成配列内部標準、(b)組織サンプル中の全核酸の総量または濃度を決定するためのプライマーおよび全核酸内部標準、(c)非再構成核酸において存在し、かつ再構成核酸において存在しない1つ以上の遺伝子座の遺伝子マーカの対立遺伝子の値を決定するためのプライマー、ならびに(d)再構成核酸および非再構成核酸の両方に位置する1つ以上の遺伝子座の遺伝子マーカの対立遺伝子の値を決定するためのプライマーを含む。
位が、同じ配列を有し、ペアのリバースプライマーのすべてのテールのプライマー結合部位が、同じ配列を有する。さらなる実施形態において、フォワードおよびリバースプライマーのペアのテールのプライマー結合部位の配列が、異なる。
本明細書において他に明確に定義されない限り、本明細書において使用される核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語および記号は、当分野における標準的な論文およびテキストに従う。たとえばコーンバーグ(Kornberg)およびベイカー(Baker)、DNA複製(DNA Replication)、第2版(W.H.フリーマン(W.H.Freeman)、ニューヨーク、1992年);レインガー(Lehninger)、生化学(Biochemistry)、第2版(ワース出版(Worth
Publishers)、ニューヨーク、1975年);ストラッチャン(Strachan)およびリード(Read)、ヒト分子遺伝学(Human Molecular
Genetics)、第2版(ワイリーリス(Wiley−Liss)、ニューヨーク、1999年);アッバース(Abbas)ら、細胞および分子免疫学(Cellular and Molecular Immunology)、第6版(サンダース(Saunders)、2007年)。
based amplification)、ローリングサークル増幅、およびその他同種のものを含むが、これらに限定されない:マリス(Mullis)ら、米国特許第4,683,195号明細書;米国特許第4,965,188号明細書;米国特許第4,683,202号明細書;米国特許第4,800,159号明細書(PCR);ゲルファント(Gelfand)ら、米国特許第5,210,015号明細書(「taqman」プローブによるリアルタイムPCR);ウイットワー(Wittwer)ら、米国特許第6
,174,670号明細書;カシャン(Kacian)ら、米国特許第5,399,491号明細書(「NASBA」);リサルディ(Lizardi)、米国特許第5,854,033号明細書;アオノ(Aono)ら、日本特許出願公開第4−262799号公報(ローリングサークル増幅)など。一態様において、本発明のアンプリコンが、PCRによって産生される。増幅反応が進行する中で、反応産物の測定を可能にする検出化学が利用可能な場合、増幅反応は、「リアルタイム」増幅、たとえば下記に記載される「リアルタイムPCR」またはレオーネ(Leone)ら、核酸リサーチ(Nucleic Acids Research)、第26巻:p.2150〜2155(1998年)などにおいて記載される「リアルタイムNASBA」であってもよい。本明細書において使用されるように、用語「増幅」は、増幅反応を実行することを意味する。「反応混合物」は、反応を実行するための必要な反応物をすべて含有する溶液を意味し、これは、反応の間に選択されるレベルのpHを維持するための緩衝剤、塩、補助因子、捕捉剤、およびその他同種のものを含むが、これらに限定されない。
286巻:p.958〜961(1999年);ヤッサイ(Yassai)ら、免疫遺伝学(Immunogenetics)、第61巻:p.493〜502(2009年);ケドツェルスカ(Kedzierska)ら、分子免疫学(Mol.Immunol)、第45巻(3):p.607〜618(2008年)など。用語「クロノタイププロファイル」は、リンパ球の選択されるサブセット(たとえば組織浸潤リンパ球、免疫表現性サブセット、もしくはその他同種のもの)に由来してもよいまたは完全な免疫受容体と比較して多様性が低下した免疫受容体の一部分をコードしてもよい再編成免疫受容体コード核酸の種々様々のリストおよび存在量を含む。いくつかの実施形態において、クロノタイププロファイルが、少なくとも103の別個のクロノタイプを含んでいてもよく、他の実施形態において、クロノタイププロファイルが、少なくとも104の別個のクロノタイプを含んでいてもよく、他の実施形態において、クロノタイププロファイルが、少なくとも105の別個のクロノタイプを含んでいてもよく、他の実施形態において、クロノタイププロファイルが、少なくとも106の別個のクロノタイプを含んでいてもよい。そのような実施形態において、そのようなクロノタイププロファイルが、別個のクロノタイプのそれぞれの存在量または相対的頻度をさらに含んでいてもよい。一態様において、クロノタイププロファイルが、個人のリンパ球の集団における、それぞれ、T細胞受容体(TCR)もしくはB細胞受容体(BCR)をコードする別個の再構成ヌクレオチド配列(それらの存在量と共に)またはそのフラグメントのセットのヌクレオチド配列が、集団の実質的にすべてのリンパ球について、別個のリンパ球またはそれらのクローン亜集団と一対一の対応を有する。一態様において、クロノタイプを特定する核酸セグメントが、それらの多様性(つまりセットにおける別個の核酸配列の数)が、個人における実質的にすべてのT細胞もしくはB細胞またはそのクローンが、そのようなレパートリのユニークな核酸配列を運ぶように十分に大きくなるように、選択される。すなわち、好ましくは、サンプルのそれぞれ異なるクローンは、異なるクロノタイプを有する。本発明の他の態様において、レパートリに対応するリンパ球の集団は、循環B細胞であっても、循環T細胞であっても、前述の集団のいずれかの亜集団であってもよく、CD4+T細胞もしくはCD8+T細胞もしくは細胞表面マーカによって特定される他の亜集団などを含むが、これらに限定されない。そのような亜集団は、特定の組織、たとえば骨髄もしくはリンパ節もしくはその他同種のもの由来のサンプルを採取することによってまたは1つ以上の細胞表面マーカ、サイズ、形態、もしくはその他同種のものに基づいて、サンプル(末梢血など)由来の細胞をソートするもしくは濃縮することによって、得られてもよい。さらに他の態様において、レパートリに対応するリンパ球の集団が、腫瘍組織、感染組織、またはその他同種のものなどの疾患組織に由来してもよい。一実施形態において、ヒトTCRβ鎖またはそのフラグメントを含むクロノタイププロファイルが、0.1×106〜1.8×106の範囲もしくは0.5×106〜1.5×106の範囲のまたは0.8×106〜1.2×106の範囲の、多くの別個のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、ヒトIgH鎖またはそのフラグメントを含むクロノタイププロファイルが、0.1×106〜1.8×106の範囲もしくは0.5×106〜1.5×106の範囲のまたは0.8×106〜1.2×106の範囲の多くの別個のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、本発明のクロノタイププロファイルが、IgH鎖のV(D)J領域の実質的にすべてのセグメントをコードするヌクレオチド配列のセットを含む。一態様において、本明細書において使用される「実質的にすべて」が、0.001パーセント以上の相対的存在量を有するすべてのセグメントを意味するまたは他の態様において、本明細書において使用される「実質的にすべて」が、0.0001パーセント以上の相対的存在量を有するすべてのセグメントを意味する。他の特定の実施形態において、本発明のクロノタイププロファイルが、TCRβ鎖のV(D)J領域の実質的にすべてのセグメントをコードするヌクレオチド配列のセットを含む。他の実施形態において、本発明のクロノタイププロファイルが、25〜200ヌクレオチドの範囲の長さを有し、TCRβ鎖のV、D、およびJ領域のセグメントを含むヌクレオチド配列のセットを含む。他の実施形態において、本発明のクロノタイププロファイルが、25〜200ヌクレオチドの範囲の長さを有し、IgH鎖
のV、D、およびJ領域のセグメントを含むヌクレオチド配列のセットを含む。他の実施形態において、本発明のクロノタイププロファイルが、別個のIgH鎖を発現するリンパ球の数と実質的に等価な、多くのヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、本発明のクロノタイププロファイルが、別個のTCRβ鎖を発現するリンパ球の数と実質的に等価な、多くの別個のヌクレオチド配列を含む。さらに他の実施形態において、「実質的に等価な」が、99パーセントの確率で、クロノタイププロファイルが、0.001パーセント以上の頻度で個人の集団のすべてのリンパ球によって運ばれるまたは発現されるIgHもしくはTCRβをコードするヌクレオチド配列またはその一部分を含むであろうということを意味する。さらに他の実施形態において、「実質的に等価な」が、99パーセントの確率で、ヌクレオチド配列のレパートリが、0.0001パーセント以上の頻度で存在するすべてのリンパ球によって運ばれるまたは発現されるIgHもしくはTCRβをコードするヌクレオチド配列またはその一部分を含むであろうということを意味する。いくつかの実施形態において、クロノタイププロファイルが、105〜107のリンパ球を含むサンプルに由来する。そのような数のリンパ球は、1〜10mLの末梢血サンプルから得られてもよい。
「遺伝子マーカ」は、個人を同定するために使用されてもよい、遺伝子座でのDNAの多型セグメントを意味する。遺伝子マーカは、その配列または隣接する配列もしくはフランキング配列によって同定されてもよい。典型的に、遺伝子マーカは、集団の異なる個人において複数の配列または値を有することができる。例示的な遺伝子マーカは、縦列型反復配列(STR:short tandem repeat)、一塩基多型(SNP:single nucleotide polymorphism)、およびその他同種のものを含むが、これらに限定されない。DNAの多型セグメントは、ゲノムDNAであっても、逆転写RNAであってもよい。一実施形態において、多型セグメントが、ゲノムDNAである。一実施形態において、本発明で使用される遺伝子マーカが、従来の技術を使用して増幅およびシークエンシングによって同定される。他の実施形態において、遺伝子マーカが、クロノタイププロファイルを生成するためのプロセスの間に、免疫分子と一緒
に増幅され、シークエンシングされる。
参照配列および他の配列(「比較配列」)の比較に関して使用される「相同的パーセント」、「同一パーセント」、または同様の用語は、2つの配列の間の最適なアライメントにおいて、比較配列が、示されるパーセンテージに等価な多くのサブユニットポジションにおいて参照配列と同一であることを意味し、サブユニットは、ポリヌクレオチド比較のためのヌクレオチドまたはポリペプチド比較のためのアミノ酸である。本明細書において使用されるように、比較されている配列の「最適なアライメント」は、サブユニットの間のマッチを最大限にし、アライメントを構成する際に用いられるギャップの数を最小限に
するアライメントである。同一性パーセントは、ニードルマン(Needleman)およびワンチ(Wunsch)、分子生物学(J.Mol.Biol)、第48巻:p.443〜453(1970年)(ウィスコンシン配列分析パッケージの「GAP」プログラム、遺伝子コンピュータグループ、マディソン、ウィスコンシン州)などによって記載されるものなどのアルゴリズムの市販で入手可能な手段により決定されてもよい。アライメントを構成し、類似性のパーセンテージ同一性または他の測定値を計算するための当技術分野における他のソフトウェアパッケージは、スミス(Smith)およびウォーターマン(Waterman)、応用数学における進歩(Advances in Applied Mathematics)、第2巻:p.482〜489(1981年)(ウィスコンシン配列分析パッケージ、遺伝子コンピュータグループ、マディソン、ウィスコンシン州)のアルゴリズムに基づく「BestFit」プログラムを含む。言いかえれば、たとえば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも95パーセント同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列におけるヌクレオチドの5パーセントまでが、欠失されても他のヌクレオチドと置換されてもよいまたは参照配列におけるヌクレオチドの全数の5パーセントまでの多くのヌクレオチドが、参照配列に挿入されてもよい。
30巻:p.1292〜1305(2002値)において概説される。「ネステッドPCR」は、第1のPCRのアンプリコンが、少なくとも1つが第1のアンプリコンの内部の位置に対して結合するプライマーの新しいセットを使用する第2のPCRについてのサンプルになる2段階PCRを意味する。本明細書において使用されるように、ネステッド増幅反応に関する「最初のプライマー」は、第1のアンプリコンを生成するために使用されるプライマーを意味し、「二次プライマー」は、第2のまたはネステッドアンプリコンを生成するために使用される1つ以上のプライマーを意味する。「多重PCR」は、複数の標的配列(または単一の標的配列および1つ以上の参照配列)が同じ反応混合物中で同時に実行されるPCRを意味する。たとえばバーナード(Bernard)ら、分析生化学(Anal.Biochem.)、第273巻:p.221〜228(1999年)(2色リアルタイムPCR)。通常、プライマーの別個のセットが、増幅されているそれぞれの配列に用いられる。典型的に、マルチプレックスPCRにおける標的配列の数は、2〜50または2〜40または2〜30の範囲にある。「定量PCR」は、サンプルまたは検体中の1つ以上の特異的な標的配列の存在量を測定するために設計されたPCRを意味する。定量PCRは、そのような標的配列の絶対的な定量化および相対的な定量化の両方を含む。定量測定値は、標的配列と別々にまたは一緒にアッセイされてもよい1つ以上の参照配列または内部標準を使用して生成される。参照配列は、サンプルまたは検体に対して内因性また外因性であってもよく、後者の場合において、1つ以上の競合的な鋳型を含んでいてもよい。典型的な内因性の参照配列は、以下の遺伝子の転写セグメントを含む:β−アクチン、GAPDH、β2−ミクログロブリン、リボソームRNA、およびその他同種のもの。参照によって組み込まれる以下の参考文献において例証されるように、定量PCRについての技術は、当業者らによく知られている:フリーマン(Freeman)ら、バイオ技術(Biotechniques)、第26巻:p.112〜126(1999年);ベッカー−アンドレ(Becker−Andre)ら、核酸リサーチ(Nucleic Acids Research)、第17巻:p.9437〜9447(1989年);ジマーマン(Zimmerman)ら、バイオ技術(Biotechniques)、第21巻:p.268〜279(1996年);ディビアッコ(Diviacco)ら、遺伝子(Gene)、第122巻:p.3013〜3020(1992年);ベッカー−アンドレ(Becker−Andre)ら、核酸リサーチ(Nucleic Acids Research)、第17巻:p.9437〜9446(1989年)など。
Laboratory)、ニューヨーク、1989年)、および同様の参考文献などの論文からの手引きと共に、当業者の知識の範囲内に十分にあることが当業者らに明らかである。本明細書において使用されるように、用語「オリゴヌクレオチド」は、たとえば3〜60の単量体ユニットを有するまたはいくつかの実施形態において、12〜60単量体ユニットを有するより小さなポリヌクレオチドを指す。様々な実施形態において、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、「ATGCCTG」などの文字(大文字または小文字)の配列によって示されてもよく、ヌクレオチドは、左から右に5’→3’の順であり、他に示されないまたは文脈から明白でない限り、「A」は、デオキシアデノシンを示し、「C」は、デオキシシチジンを示し、「G」は、デオキシグアノシンを示し、「T」はチミジンを示し、「I」はデオキシイノシンを示し、「U」はウリジンを示すことが理解されるであろう。
forward)伸長、鋳型の損失、ポリメラーゼの損失、キャッピングの失敗、脱保護の失敗、およびその他同種のものなどの現象による。
記録することによって生成される。そのような最初のデータは、配列リードに変換される。
ば1〜5ヌクレオチド)、縦列に反復する配列モチーフを含む遺伝子マーカを指す。マイクロサテライトは、リピートモチーフ散在(repeat−motif interspersion)または「不可解な単純配列(cryptically simple sequence)」を含有してもよい(タウツ,D.(Tautz,D.)ら(1986年)ネイチャー(Nature)第322巻(6080):p.652〜656)。そのようなリピートモチーフ散在は、マイクロサテライトが、縦列に反復する配列モチーフと同じ長さを有するが、異なるリピート配列を有する1つ以上の散在したリピートを含有する、単純なリピートモチーフ散在を含む(アイヒラー,E.E.(Eichler,E.E.)ら(1994年)ネイチャージェネティクス(Nat.Genet.)第8巻:p.88〜94;アイヒラー,E.E.(Eichler,E.E.)(1996年)ヒト分子遺伝学(Hum.Mol.Genet.)第5巻:p.319〜330)。たとえば、縦列に反復する配列モチーフがTGCCである場合、単純なリピートモチーフ散在は、以下のように現われてもよく:TGCC(TCTG)2(TGCC)3、散在したリピート「TCTG」は、TGCC縦列反復配列モチーフのリピートを中断する。リピートモチーフ散在はまた、より複雑なリピートモチーフ散在を含み、リピートモチーフ散在は、縦列反復配列モチーフと同じ長さをしていない。たとえば、縦列反復配列モチーフが、TGCCである場合、複雑なリピートモチーフ散在は、以下のように現われてもよく:<$1
HIL>TGC(TGCC)2縦列反復配列モチーフは、TGおよびTGCによって中断される。他のより複雑なリピートモチーフ散在は、同じマイクロサテライトにおける単純なリピートモチーフ散在および複雑なリピートモチーフ散在の組み合わせを含む。たとえば、そのような複雑な配列リピートモチーフ散在は、以下のように現われてもよく:(TGCC)n(TCTG)o(TGCC)3TG(TGCC)3TGC(TGCC)2TGCCC(TGCC)p、散在したリピートの両方の形態が、縦列に反復する配列モチーフ、TGCCを中断する。散在したリピートを有するおよび有していないマイクロサテライトは、本明細書において使用される用語「マイクロサテライト」または「STR」によって包含される。
Claims (22)
- 微小残存病変についてモニターされている患者においてキャリーオーバ混入を決定するための方法であって、
以下の(i)−(v)のステップにより前記患者のクロノタイププロファイルを定期的に測定することによって、微小残存病変について前記患者をモニターするステップ:
(i)T細胞およびB細胞の少なくとも一方を含む、個人由来のサンプルを得るステップ、
(ii)タグ−分子コンジュゲートを形成するために、T細胞受容体遺伝子または前記T細胞およびB細胞の少なくとも一方の免疫グロブリン遺伝子の再構成核酸の分子に対して配列タグを付加するステップであって、前記タグ−分子コンジュゲートの実質的にすべての分子が、ユニークな配列タグを有するステップ、
(iii)前記タグ−分子コンジュゲートを増幅するステップ、
(iv)前記タグ−分子コンジュゲートをシークエンシングするステップ、
(v)同等の配列タグによってアライメントされた配列リードからクロノタイプを決定するとともに、そのようなクロノタイプからクロノタイププロファイルを生成するステップ;ならびに
クロノタイププロファイルのそれぞれの測定についての配列タグのヌクレオチド配列を記録するステップ;ならびに
任意の前のクロノタイププロファイル由来の配列タグの存在、不在、およびレベルの少なくとも1つによって、次のクロノタイププロファイルにおいてキャリーオーバ混入を決定するステップ
を含む、方法。 - アライメントする前記ステップが、前記同等の配列タグの前記クロノタイプのそれぞれのヌクレオチドポジションでの大多数のヌクレオチドを決定することによって、前記タグ−分子コンジュゲートのそれぞれの前記クロノタイプのそれぞれのヌクレオチド配列を決定するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記付加するステップが、再構成核酸の前記分子をサンプリングすることによって標識するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記付加するステップが、再構成核酸の前記分子の少なくとも100倍の濃度で前記配列タグが存在するような反応混合物中で実行される、請求項3に記載の方法。
- 前記配列タグが、再構成核酸の前記分子に特異的なプライマーの中に組み込まれる、請求項4に記載の方法。
- 前記クロノタイプが、それぞれ、免疫受容体または免疫受容体構成成分のセグメントをコードする25〜400ヌクレオチド配列であり、前記免疫受容体または免疫受容体構成成分は、IgHのVDJ再編成、IgHのDJ再編成、IgKのVJ再編成、IgLのVJ再編成、TCRβのVDJ再編成、TCRβのDJ再編成、TCRαのVJ再編成、TCRγのVJ再編成、TCRδのVDJ再編成、およびTCRδのVD再編成からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 個人のT細胞およびB細胞の少なくとも一方を含む組織サンプルのクロノタイププロファイルにおいて混入のレベルを決定するための方法であって、
個人由来の組織サンプルを得るステップであって、前記組織サンプルが、前記個人由来の核酸および場合により1人以上の他の個人由来の核酸を含み、前記核酸が、T細胞およびB細胞の少なくとも一方由来の再構成核酸、ならびに非再構成核酸を含むステップ、
前記組織サンプルの核酸からクロノタイププロファイルを生成するステップ、
遺伝子マーカからの前記個人および前記1人以上の他の個人の遺伝子同定に基づいて、前記1人以上の他の個人および前記個人由来の核酸の割合を得るために、前記組織サンプル由来の前記核酸の1つ以上の遺伝子座の前記遺伝子マーカをシークエンシングするステップであって、前記遺伝子マーカが、前記再構成核酸および前記非再構成核酸の両方にある遺伝子座に存在するステップ、ならびに
前記クロノタイププロファイルにおける混入核酸のレベルを、前記組織サンプルの前記核酸中に存在する前記1人以上の他の個人由来の核酸の割合として決定するステップ、
を含む方法。 - 前記割合が、前記個人を同定する1つ以上の前記遺伝子マーカの配列リードおよび前記1人以上の他の個人の1つ以上の前記遺伝子マーカの配列リードの数から決定される、請求項7に記載の方法。
- 最も大きな数の配列リードを有する遺伝子座の前記遺伝子マーカが、前記個人と同定され、それぞれの遺伝子座の残りの遺伝子マーカが、前記1人以上の他の個人由来の核酸と同定される、請求項7に記載の方法。
- 混入の前記レベルが、他の座で前記個人と同定された遺伝子マーカの配列リードの最も小さな数によって割った、ある座での相互混入核酸と同定された遺伝子マーカの配列リードの最も大きな数に対して比例する、請求項9に記載の方法。
- 前記組織サンプルにおける前記核酸の総量を測定するステップ、
前記組織サンプルにおける前記再構成核酸の総量を測定するステップ、
前記個人由来のおよび前記1人以上の他の個人由来の前記非再構成核酸の割合を得るために、前記非再構成核酸において存在し、前記再構成核酸に存在しない、核酸の削除可能なセグメントにおける1つ以上の遺伝子座の遺伝子マーカをシークエンシングするステップ、ならびに
前記組織サンプルの前記核酸における混入再構成核酸のレベルから、前記クロノタイププロファイルにおける前記混入核酸レベルを決定するステップであって、前記混入再構成核酸のレベルが、核酸の総量、前記再構成核酸の総量、前記個人および前記1人以上の他の個人由来の前記核酸の前記割合、ならびに前記個人および前記1人以上の他の個人の前記非再構成核酸の割合から決定されるステップ、
をさらに含む、請求項7に記載の方法。 - 前記削除可能なセグメントが、V(D)J組換えの間に削除される核酸のセグメントである、請求項11に記載の方法。
- 前記核酸が、ヒトB細胞由来の再構成核酸を含み、前記削除可能なセグメントが、染色体14上のD領域コード遺伝子とV領域コード遺伝子との間の領域を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記核酸が、ヒトT細胞由来の再構成核酸を含み、前記削除可能なセグメントが、染色体11上のD領域コード遺伝子とV領域コード遺伝子との間の領域を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記核酸の前記総量を測定する前記ステップが、前記核酸の共通セグメントの数を1つ以上の内部標準の数と比較することができるように、全核酸についての1つ以上の内部標準の既知量を前記組織サンプル由来の前記核酸と組み合わせるステップを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記共通セグメントが、GAPDH、β2−ミクログロブリン、18SリボソームRNA、およびβ−アクチンからなる群から選択される遺伝子の一部分を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記核酸の前記総量を測定する前記ステップが、前記クロノタイププロファイルのクロノタイプの数を、再構成核酸についての1つ以上の内部標準の数と比較することができるように、再構成核酸についての1つ以上の内部標準の既知量を前記組織サンプル由来の前記核酸と組み合わせるステップを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記クロノタイプのそれぞれが、V(D)Jコード領域の一部分の配列を含み、前記測定するステップが、PCRにおいて、同一セットのプライマーを使用して、前記組織サンプル由来の前記核酸および再構成核酸についての前記1つ以上の内部標準を増幅するステップを含む、請求項17に記載の方法。
- 前記組織サンプルにおける前記核酸の総量を測定するステップ、
前記組織サンプルにおける前記再構成核酸の総量を測定するステップ、
前記組織サンプルにおける前記非再構成核酸の総量を測定するステップ、ならびに
前記組織サンプルの前記核酸における混入再構成核酸のレベルから、前記クロノタイププロファイルにおける前記混入核酸レベルを決定するステップであって、前記混入再構成核酸のレベルが、核酸の総量、前記再構成核酸の総量、前記個人および前記1人以上の他の個人由来の前記核酸の前記割合、ならびに前記再構成核酸の総量から決定されるステップ、
をさらに含む、請求項7に記載の方法。 - 前記非再構成核酸の前記総量が、非再構成核酸において存在し、再構成核酸において存在しない削除可能なセグメントの数を前記1つ以上の内部標準の数と比較することができるように、非再構成核酸についての1つ以上の内部標準の既知量を前記組織サンプル由来の前記核酸と組み合わせることを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記核酸が、ヒトB細胞由来の再構成核酸を含み、前記削除可能なセグメントが、染色体14上のD領域コード遺伝子とV領域コード遺伝子との間の領域を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記核酸が、ヒトT細胞由来の再構成核酸を含み、前記削除可能なセグメントが、染色体11上のD領域コード遺伝子とV領域コード遺伝子との間の領域を含む、請求項20に記載の方法。
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