JP2022501005A - アッセイを改善する為の化合物、組成物、及び方法 - Google Patents
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-
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Abstract
Description
本発明は、米国国防総省(DARPA)によって授与された助成金番号HR0011−12−2−0001による政府の支援を受けてなされたものである。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
単一分子のビーズベースのイムノアッセイを、本明細書に記載される様に、固体支持体及び検出試薬を使用して開発した(「Protein SiRCA技術」と呼ばれる)。これらのアッセイを類似のiPCRアッセイと比較して、Protein SiRCA技術が非特異的結合及び抗体交差反応性からのバックグラウンドをどの様に減らす事ができるかを示した。
Claims (40)
- (i)以下:
コード化剤(例えば、色素)、
第1の核酸配列(例えば、オリゴヌクレオチド及び/又はプライマー)、及び
第1の分子認識要素(例えば、抗体)
を含む固体支持体(例えば、ビーズ)と、
(ii)第2の分子認識要素(例えば、抗体)及び第2の核酸配列を含む検出試薬と、
を含むキットであって、
前記第1の核酸配列の少なくとも一部及び前記第2の核酸配列の少なくとも一部は、核酸増幅プロセスに参加する様に構成されている、キット。 - 前記固体支持体はリンカー(例えば、特異的結合ペアの1つの成員)を更に含み、前記リンカーは、前記固体支持体の表面上にあり、任意に、前記固体支持体は、複数のリンカーで被覆及び/又は官能化されている、請求項1に記載のキット。
- 前記第1の分子認識要素及び/又は前記第1の核酸配列は、前記リンカー(例えば、特異的結合ペアの1つの成員)に(例えば、共有結合及び/又は非共有結合で)取り付けられている、請求項1又は2に記載のキット。
- 前記リンカーは、ストレプトアビジンであり、前記第1の分子認識要素は、ビオチン化分子認識要素であり、前記第1の分子認識要素は、ストレプトアビジン及びビオチンの結合を介して前記固体支持体に取り付けられている、請求項1〜3のいずれか一項に記載のキット。
- 前記リンカーは、ストレプトアビジンであり、前記第1の核酸配列は、ビオチン化されており、前記第1の核酸配列は、ストレプトアビジン及びビオチンの結合を介して前記固体支持体に取り付けられている、請求項1〜4のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第1の核酸配列は、約10ヌクレオチド、20ヌクレオチド又は25ヌクレオチド〜約30ヌクレオチド、40ヌクレオチド、50ヌクレオチド又は60ヌクレオチドを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第2の核酸配列は、約20ヌクレオチド、30ヌクレオチド、40ヌクレオチド、50ヌクレオチド又は60ヌクレオチド〜約70ヌクレオチド、80ヌクレオチド、90ヌクレオチド、100ヌクレオチド、110ヌクレオチド、120ヌクレオチド、130ヌクレオチド、140ヌクレオチド、150ヌクレオチド、160ヌクレオチド、170ヌクレオチド、180ヌクレオチド、190ヌクレオチド、200ヌクレオチド、220ヌクレオチド、240ヌクレオチド、260ヌクレオチド、280ヌクレオチド又は300ヌクレオチドを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第2の核酸配列は、前記第1の核酸配列中の配列(例えば、約5個以上の連続したヌクレオチド)と実質的に同一である配列(例えば、約5個以上の連続したヌクレオチド)を含み、任意に、前記第1の核酸配列中の配列と実質的に同一である配列は、前記第2の核酸配列の5’領域中に存在する、請求項1〜7のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第1の核酸配列及び/又は前記第2の核酸配列は一本鎖DNAを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第1の核酸配列及び/又は前記第2の核酸配列は二本鎖DNAを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第1の核酸配列及び/又は前記第2の核酸配列はRNAである、請求項1〜10のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第1の核酸配列及び/又は前記第2の核酸配列は、1つ以上の化学修飾された塩基(例えば、天然には通常見られない1つ以上の化学修飾された塩基)を含み、任意に、前記化学修飾された塩基は、PCR反応の特異性を向上させ、及び/又は核酸配列(例えば、オリゴ)間の非特異的結合を減少させる、請求項1〜11のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第2の核酸配列は、前記第2の分子認識要素に共有結合で取り付けられている、請求項1〜12のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第2の分子認識要素は抗体であり、前記第2の核酸配列は、前記抗体の1つ以上のアミノ酸に取り付けられており、任意に、前記第2の核酸配列は、前記抗体のフラグメント結晶化可能(Fc)領域に共有結合で取り付けられている、請求項1〜13のいずれか一項に記載のキット。
- 増幅剤(例えば、リバースプライマー、ssDNAスプリント及びリガーゼ等)を更に含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載のキット。
- 前記増幅剤は、前記第2の核酸配列の一部に相補的である核酸配列を有し、任意に、前記第2の核酸配列の一部は、前記第2の核酸配列の3’領域中にある、請求項1〜15のいずれか一項に記載のキット。
- 前記増幅剤は、前記固体支持体に取り付けられており、任意に、前記増幅剤はビオチン化されている、請求項1〜16のいずれか一項に記載のキット。
- 前記固体支持体及び前記検出試薬は別々に保管され、及び/又は前記検出試薬及び存在する場合には前記増幅剤は別々に保管される、請求項1〜17のいずれか一項に記載のキット。
- 前記固体支持体及び前記増幅剤は、前記増幅剤が存在して前記固体支持体に取り付けられていない場合に、別々に保管される、請求項1〜18のいずれか一項に記載のキット。
- コード化剤(例えば、色素)、
核酸配列、及び
分子認識要素(例えば、抗体)
を含む、固体支持体(例えば、ビーズ)。 - リンカー(例えば、結合ペアの1つの成員)を更に含み、前記リンカーは、前記固体支持体の表面上にあり、任意に、前記固体支持体は、複数のリンカーで被覆及び/又は官能化されている、請求項20に記載の固体支持体。
- 前記分子認識要素及び/又は前記核酸配列は、前記リンカーに取り付けられている、請求項20又は21に記載の固体支持体。
- 前記リンカーは、ストレプトアビジンであり、前記分子認識要素は、ビオチン化分子認識要素であり、前記分子認識要素は、ストレプトアビジン及びビオチンの結合を介して前記固体支持体に取り付けられている、請求項20〜22のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 前記リンカーは、ストレプトアビジンであり、前記核酸配列は、ビオチン化されており、ストレプトアビジン及びビオチンの結合を介して前記固体支持体に取り付けられている、請求項20〜23のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 前記核酸配列は、約10ヌクレオチド、20ヌクレオチド又は25ヌクレオチド〜約30ヌクレオチド、40ヌクレオチド、50ヌクレオチド又は60ヌクレオチドを含む、請求項20〜24のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 第1のコード化シグナルを提供する第1のコード化剤(例えば、色素)、
第1の核酸配列、及び
第1の分子認識要素(例えば、抗体)
を各固体支持体が含む第1の複数の固体支持体と、
第2のコード化シグナルを提供する第2のコード化剤(例えば、色素)、
第2の核酸配列、及び
第2の分子認識要素(例えば、抗体)
を各固体支持体が含む第2の複数の固体支持体と
を含む複数の固体支持体であって、
前記第1のコード化シグナルは、前記第2のコード化シグナルとは異なり、前記第1の核酸配列は、前記第2の核酸配列とは異なり、且つ前記第1の分子認識要素は、前記第2の分子認識要素とは異なる、複数の固体支持体。 - 第1の分子認識要素(例えば、抗体)及び
第1の核酸配列
を各検出試薬が含む第1の複数の検出試薬と、
第2の分子認識要素(例えば、抗体)及び
第2の核酸配列
を各検出試薬が含む第2の複数の検出試薬と
を含む複数の検出試薬であって、
前記第1の核酸配列及び前記第2の核酸配列は、それぞれ第1の部分及び第2の部分を含み、
前記第1の核酸配列についての前記第1の部分の核酸配列は、前記第2の核酸配列についての前記第1の部分の核酸配列とは異なり、且つ前記第1の核酸配列及び前記第2の核酸配列についての前記第2の部分の核酸配列は同じである、複数の検出試薬。 - 前記第1の核酸配列及び前記第2の核酸配列についての第1の部分は、それぞれの配列の5’領域中にあり、前記第2の部分は、それぞれの配列の3’領域中にある、請求項27に記載の複数の検出試薬。
- 試料中の標的を検出する方法であって、
請求項1〜19のいずれか一項に記載のキットの固体支持体、請求項20〜25のいずれか一項に記載の固体支持体、又は請求項26に記載の複数の固体支持体の固体支持体と標的を含む試料とを混ぜ合わせて、標的に結合された固体支持体を含む第1の組成物を形成する事と、
任意に、前記標的が結合された固体支持体を(例えば、水溶液で)洗浄する事と、
検出試薬と前記標的が結合された固体支持体とを混ぜ合わせて、固体支持体、標的、及び検出試薬を含む複合体を形成する事と、ここで、前記検出試薬は、第2の分子認識要素及び第2の核酸配列を含み、前記第1の核酸配列の少なくとも一部及び前記第2の核酸配列の少なくとも一部は、核酸増幅プロセスに参加する様に構成されており、
任意に、前記複合体を(例えば、水溶液で)洗浄する事と、
任意に、増幅剤(例えば、リバースプライマー、ssDNAスプリント及びリガーゼ等)と前記複合体とを混ぜ合わせる事と、
任意に、前記固体支持体から前記第1の核酸配列を放出させる事と、
前記第2の核酸配列の少なくとも一区画を増幅する事により、前記試料中の標的を検出する事と
を含む、方法。 - 前記増幅剤と前記複合体とを混ぜ合わせる事を含み、前記増幅剤と前記複合体とを混ぜ合わせる事は、前記固体支持体から前記増幅剤を放出する事を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記検出試薬は、前記第1の組成物中に存在する、請求項29又は30に記載の方法。
- 前記増幅剤は前記第1の組成物中に存在し、任意に、前記増幅剤(例えば、リバースプライマー)は、前記固体支持体に取り付けられている、請求項29〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して実施される、請求項29〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 近接ライゲーションアッセイ又は近接伸長アッセイを使用して実施される、請求項29〜33のいずれか一項に記載の方法。
- アッセイシグナル(例えば、蛍光シグナル、例えば、dsDNAにインターカレートする色素から又はクエンチャー及び色素を含むプローブの加水分解からの蛍光シグナル等)を検出する事により前記標的を検出する事を更に含む、請求項29〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 複数のウェルを含むマイクロ流体デバイスにおいて実施される多重化アッセイ(例えば、イムノポリメラーゼ連鎖反応(iPCR)アッセイ)であり、複数のウェルの少なくとも1つのウェルにおいて前記固体支持体を1つ以上の更なる固体支持体から隔離する事を更に含む、請求項29〜35のいずれか一項に記載の方法。
- アッセイに関する特異性を向上させる及び/又はバックグラウンドシグナルを低減させる方法であって、
請求項1〜19のいずれか一項に記載のキットの固体支持体、請求項20〜25のいずれか一項に記載の固体支持体、又は請求項26に記載の複数の固体支持体を準備する事と、
前記固体支持体又は前記複数の固体支持体の存在下にアッセイを行う事により、前記アッセイに関する特異性を向上させる及び/又はバックグラウンドシグナルを低減させる事と
を含む、方法。 - 前記アッセイは、多重化イムノPCR(iPCR)アッセイである、請求項37に記載の方法。
- 前記固体支持体又は前記複数の固体支持体中の固体支持体と非標的分子(例えば、誤った抗原)との間で観察される交差反応性を減らす、請求項29〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固体支持体又は前記複数の固体支持体中の固体支持体の観察される非特異的結合を減らす、請求項29〜39のいずれか一項に記載の方法。
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