JP2015509201A - 熱コントラスト検定およびリーダー - Google Patents

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Abstract

コントラストリーダーと連結して用いられる検定が開示される。この検定では、試験細片が、対象の検体がサンプル中に存在する場合に、熱応答を進展させることのできる材料を含む。熱コントラスト検定リーダーは、テスト領域に試験細片を受け入れるための開口と、テスト位置に指向されたエネルギー源と、テスト位置に指向された熱センサとを持つハウジングを含む。熱センサは、対象の検体がサンプル中に存在する場合に、テスト位置での熱源の活性化により試験細片の熱を感知するように構成されている。熱センサは、センサ出力に結合され、診断出力を提供するように構成された診断回路を用いて、センサ出力を提供することができる。診断出力は、センサ出力の関数として、患者の診断状態を示すことができる。本発明は、また対象の検体を検出する方法、および側方流動検定と熱コントラスト検定リーダーとを含むキットを提供する。

Description

本発明は、サンプル（試料）中の検体を検出するための検定およびリーダー（読取機）に関する。特に、本発明は、熱コントラストに基づいて作動する検定およびリーダーに関する。
ＬＦＡ（側方流動検定(lateral flow assay)、または側方流動免疫学的検定、いわゆる迅速診断テスト−ＲＤＴ、または生物学的検定）技術が研究室の内と外の両方で広範に使用できることが分かってきた。典型的な分析においては、患者からの流体サンプルが試験紙（又は、試験細片）(test strip)に塗布される。該サンプルは試験紙上の化学薬品と反応し、試験紙に光学変化特性を生ずる。可視的表示器（visual indicator）は人によって観察でき、例えば、市販又は家庭用の検査薬による妊娠判定に用いられる。しかしながら、もっと正確な読みを、検定（又は、分析）リーダー（assay reader）を用いて得ることができる。そのようなリーダーは、例えば、光学的な変化を、人間による観察よりもっと正確にかつ繰り返し感知することができる敏感な光学センサを含むことができる。典型的な検定（分析）リーダーの一例は、２００７年１１月２０日に発行された米国特許第７，２９７，５２９号（発明者 Polito等）に示されている。
米国特許第７，２９７，５２９号
迅速に病名を特定できれば、迅速な処置を可能にし、転帰（outcome）を改善する。この可能性により、高所得者が住む環境および資源の乏しい環境の両方において、生体分子検定を可能にする迅速な臨床検査診断装置（point-of-care diagnostic devices）またはシステムの開発と使用が、増進されてきた。ＬＦＡは、安価であり、簡単に可搬でき、また頑丈であるので、医薬や農業や市販の個人的使用例えば妊娠検査のために、ありふれたものとなっている。ＬＦＡはまた多くの伝染病、例えばマラリア、エイズ関連のクリプトコックス髄膜炎、肺炎球菌肺炎及び近年の結核等の検査に、広く用いられている。
いくつかのＬＦＡの分析性能は実験室ベースの方法に匹敵するが、大部分のＬＦＡの分析感度（いわゆる検出限界）はｍＭからμＭの範囲にあり、この範囲は他の分子技法、例えば酵素結合免疫測定法（ＥＬＩSＡ）より、著しく感度が小さい。結果として、ＬＦＡは抗原のレベルが低い時には、疾病経過における早期検定に特に有用ではない。抗原検出の感度をより高めるために、マイクロ流体工学、バイオバーコード及び酵素をベースとする検定の開発に研究の焦点が当てられてきた。なぜなら、これらの技術は、ｎＭからｐＭまでの範囲の検出能力があると考えられる。しかしながら、これらの方法の全てはまだ開発段階にあり、エンドユーザが看護現場で使用するのに信頼性及びコスト対効果の面で採用されるには至っていない。
良く知られているように、材料(materials)の光学的、熱的および電気的特性は、ナノスケールで、動的に変化する。特に、金属ナノ粒子の改良された光熱的特性(photothermal signature)は、悪性腫瘍の熱的切除、腫瘍細胞の転移の検出、光熱の遺伝子導入、化学療法薬の治療効果の増進、および細胞内のナノ粒子の移動の追跡等のために利用されてきた。
一形態において、本発明は熱コントラスト検定リーダーに関する。該熱コントラスト検定リーダーは、エネルギー源、センサ、Ｉ／Ｏ回路、および検定細片（assay strip;検定ストリップ）を受け入れるための開口を含む。該リーダーは、検定細片の検査領域上でのエネルギー源活性化時において、センサ結果を出力信号に変換するように構成されている。
一形態において、本発明は、検体システムからなる検体キットに関する。該検体キットは、サンプルパッド、試験紙、検体結合分子に共役(又は、接合)される(conjugated)ナノ粒子、テスト領域、制御領域およびサンプルが使用された時の流動伝達用に構成された吸収性のパッドから構成されている。このキットは、また熱コントラスト検体リーダーを含む。
さらなる一形態として、本発明は、検体システムの試験紙をサンプルと接触させた後に、検体システム中の試験紙のテスト領域をエネルギー源に晒すことを含むサンプル中の検体を検知する方法に関する。このサンプルは、毛管現象により試験紙を通って移動し、該検体システムは、サンプル中の検体と結び付く検体結合分子に共役されるナノ粒子を含み、テスト領域は捕獲分子を含む。この方法はまたテスト領域中に検体が存在するまたは存在しないことを検知するために、テスト領域に発生する熱をセンサにより測定することを含む。
本発明によれば、視覚的リーダーを用いる検定よりもはるかに低い濃度の検体をサンプル中から検出できると共に、エンドユーザが簡易に用いることのできる熱コントラスト検定リーダー、検定キット、及び検定方法を提供することができる。また、検体を定量することができる。
図１は、側方流動検定試験紙およびリーダーシステムを示す簡単化された説明図である。 図２Ａは、可搬検体リーダーの簡単化されたブロック図である。 図２Ｂは、図２Ａの卓上検定リーダーの簡単化されたブロック図である。 図３は、図２Ａの検体リーダーの簡単化されたブロック図である。 図４Ａは、ＬＦＡの熱応答時間グラフである。 図４Ｂは、ＬＦＡの熱応答時間グラフである。 図５は、金のナノ粒子（ＧＮＰ）を使用した熱コントラスト検定を示すグラフである。 図６は、熱コントラストが、クリプトコッカス抗原（ＣｒＡｇ）のための免疫クロマトグラフの側方流動検体の存在の検出をいかに増大させるかを示すグラフである。高濃度での信号の高さは、ＬＦＡの高線量フック効果(high dose hook effect)に起因している。破線は、制御サンプルからのバックグランドを示す。 図７Ａは、色々なナノ粒子に対する、ナノ粒子濃度対温度変化のグラフである。 図７Ｂは、色々な材料のための温度変化のグラフである。 図８Ａは、ｈＣＧ（Human chorionic gonadotropin；ヒト絨毛性ゴナドトロピン(性腺刺激ホルモン)）のための熱コントラスト検定結果を表わす図である。 図８Ｂは、ｈＣＧのための熱コントラスト検定結果を表わすグラフである。 図９は、マラリア抗原のための熱コントラスト検定結果を表わすグラフである。 図１０Ａは、ＳＡＲ（specific absorption rate）を用いて説明したグラフである。 図１０Ｂは、ＳＡＲを用いて説明したグラフである。 図１１は、ＳＡＲを縦軸にしてｈＣＧのために熱コントラスト検定した結果を表わすグラフである。 図１２Ａは、ＣｒＡｇディップスチック（dipstick;計量棒）におけるＧＮＰの多分散性を示すピクチャである。 図１２Ｂは、ｈＣＧディップスチックにおけるＧＮＰの多分散性を示すピクチャである。 図１２Ｃは、合成されたＧＮＰディップスチックにおけるＧＮＰの多分散性を示すピクチャである。 図１３は、均一サイズの合成されたＧＮＰのプロット図である。
本発明は、熱コントラスト検定リーダーと連結して用いられる検定システムに関する。本発明はまた熱コントラスト検定及びリーダーシステムを用いてサンプル中の検体を検出するための方法に関する。本発明は、サンプル中に存在するかもしれない特定の対象合成物への暴露(exposure)に応答して変化する熱特性を示す検定試験紙又は検定試験細片を含む。本発明は、そのような試験紙又は試験細片の熱特性を読み取るためのリーダーを含む。本発明の態様は、以下に詳細に説明される。
熱コントラスト検定システムは、熱コントラスト検定リーダーと連結して作動するように構成された検定である。熱コントラスト検定システムは、視覚型リーダーを用いる検定よりもはるかに低い濃度の検体をサンプル中から検出するのに用いることができるというメリットを有する。熱コントラスト検定システムは、色々なサンプル中の検体に対する高感度検出システムである。これは、視覚的検出方法を用いる同等のＬＦＡよりも格段に早く病気や病状を検出できるというメリットを有する。さらに、方法の簡単さのために、エンドユーザは、簡易かつ正確にシステムを用いることができるようになる。このシステムは、臨床検査施設や資源の乏しい環境に対して大いに適している。以下に説明される実施形態は、感度、ダイナミックレンジ、及び臨床的に用いられるＬＦＡの定量化を拡大するのに用いることができる熱コントラスト検定システムに関する。
本実施形態には、また熱コントラスト検定リーダーとここで説明される検定システムとを含むキットが含まれる。キットは、エンドユーザがこの検定システムを用いて所望のサンプルを処理し、次いで熱コントラスト検定リーダーを用いて対象の検体および／あるいは対象の検体の量を検出するのに用いられることができる。このキットは、このキットの使用に関連する取扱いの説明も含む。
電磁的励起も本発明の範囲内ではあるが、この実施形態は、主に、ナノ粒子のレーザ励起に関するものである。ここで説明されるナノ粒子のレーザ（又は、光）励起は、赤外線センサまたは他の熱センサにより読み取ることができる熱を発生するためのナノ粒子の励起に関するが、他の実施形態もまた可能であり、この発明の範囲内であることは理解されるべきである。センサ出力に結合された診断回路は、患者の病状の診断出力指標を該センサ出力の関数として提供するように構成されている。
ここで説明される検定システムは、検体結合分子(analyte binding molecules)に共役 (又は、接合)される(conjugated)ナノ粒子を用いてサンプル中の対象の検体を検出するのに用いられることができる。特に、検定におけるナノ粒子は、入力光を熱に効率よく変換するのに用いられることができる。この検定においては、膜(薄膜)が検体を潜在的に含むサンプルと接触させられる。サンプルは一般的に毛管作用により膜を通って移動するので、検体結合分子に共役されるナノ粒子は、対象の検体に結合してナノ粒子／検体複合体を形成する。ここで用いられる"ナノ粒子／検体複合体"は、サンプルからの検体に結合した、検体結合分子に共役されたナノ粒子の総称である。ナノ粒子／検体複合体は、膜を通りぬけて、所望の検体に結合する捕獲分子を含むテスト領域の方へ移動し続ける。ナノ粒子／検体複合体は、この捕獲分子により捕えられ、テスト領域中に留められる。ここで記述される熱コントラスト検定リーダーは、その後検体の存在または不存在を検出するのに用いられることができる。さらに、熱コントラスト検定リーダーは、またテスト領域中にある検体の量を計ることができ、その結果として、サンプルを定量することができる。熱コントラスト検定リーダーは、通常、以下に説明するような構成の熱源と熱センサを含む。
検定システム、すなわちＬＦＡは、通常、サンプルパッド、膜（薄膜）、検体結合分子に共役されるナノ粒子および検体の捕獲分子を含む。ＬＦＡシステムは、また共役パッド、吸収パッド、裏当て、テスト領域、制御領域および／またはこれらの全ての要素の組合せを含む。テスト領域は一般的に検体捕獲分子(analyte capture molecules)を含む。制御領域は、制御抗体のような制御分子を含むことができる。共役パッドは一般的に検体結合分子に共役されるナノ粒子を含む。
ここで用いられる"膜"は、サンプル中にある対象の検体を検出するための、膜と１以上の試薬とからなるテスト装置または試験紙（test strip)を総称する。"膜"と"試験紙"とは同じ意味で互いに用いられることができる。
熱コントラスト検定リーダーと連結して使用されることができる検定は、側方流動検定を含む。側方流動検定の種々の形態は、周知の技術であり、例えば米国特許公開ＵＳ２００３／０１１９２０２（発明者 Kaylor等）や米国特許公開ＵＳ２０１０／０１３６５６６（発明者 Mehra等）に記述されている。図１は、既知であると共に本発明の範囲内にある側方流動検定を実施するための一模範実施形態を示す図である。
図１は、本発明による、側方流動検定試験及びリーダーシステムの一実施形態を示す簡単化された説明図である。試験紙１００は患者からのサンプル１０４を受け取るように構成されたサンプルパッド１０２を含む。毛管現象により、サンプル１０４は、サンプルパッド１０２から矢印１０６により指示された方向すなわち吸収パッド１０８に向って流れる。サンプル１０４は、共役 (又は、接合)パッド（conjugate pad)１１０および膜１１２を通って、テスト領域１１４に達するまで流れる。分離された制御領域１１６がまた設けられている。試験紙１００、サンプルパッド１０２、吸収パッド１０８、共役パッド１１０、テスト領域１１４及び制御領域１１６は、すべて流動伝達をする。ここで用いられる"流動伝達"は前述の素材間または表面間を液体が流れる又は流動する能力を総称する。
図１の差し込み図に記されているように、テスト領域の一具体例は、該テスト領域１１４で、抗原と結合されたモノクローナル抗体に結合する金ナノ粒子を含むことができる。テスト領域１１４中で結合された金ナノ粒子の結合量は、エネルギー１２０を適用することにより生ずるテスト領域１１４の加熱され具合で決定されることができる。テスト領域に向けられた熱センサ１２２は、テスト領域１１４中に存在するナノ粒子の量および抗原の量に関連するテスト領域１１４の温度を測定する。以下にもっと詳細に説明するように、これは患者の状態を診断するのに用いられることができる。エネルギー１２０は、テスト領域を加熱するいかなる形態のエネルギーであってもよい。エネルギー源１２０およびセンサ１２２は、一つのユニットに収納することができる。一方、これらは別々に収納されてもよい。
図１の差し込み図に記されているように、検体結合分子および捕獲分子はモノクローナル抗体であるとして示されている。検体結合分子および捕獲分子は同じタイプの分子、即ち抗体であることができる。そのような事例では、これらは好ましくは異なる位置（site）で検体と結合する。換言すれば、検体結合分子と捕獲分子は、好ましくは、検体の同じ位置または同じエピトープ（epitope)には結合しない。これに代えて、検体結合分子と捕獲分子は、二つの異なる分子であってもよいが、両分子は異なる位置で検体と結合することができるものである。
上で説明した例示的実施形態では、ニトロセルローズ細片(strip)が臨床材料に浸される又は接触された後に、抗体を被覆されたＧＮＰが毛管作用によって該ニトロセルローズ細片内に移される。対象の抗原が存在する時には、該対象の抗原はモノクローナル抗体被覆ＧＮＰに結合する。この結合された複合体は、抗原−抗体−ＧＮＰ複合体を認識する膜上の抗体により捕獲された時に、"ディップスチック（dipstick）"の芯だし(wicking up)を停止する。これは、ＬＦＡのテスト領域１１４でのＧＮＰの蓄積につながり、確かなテスト結果を創出することにつながる。ＧＮＰは、それらのサイズが膜１１２の孔を通って移動できるように設計でき、ＧＮＰは簡単に抗体で覆われることができ、およびＧＮＰは可視光に強く作用して簡単に見ることができる濃い色を発生する等の理由で、ＬＦＡのために用いられてきた。他の波長の光と強く相互作用するＧＮＰ、例えば近赤外で最大の光を吸収する金ナノロッド（gold nanorod；金ナノ棒)は、熱コントラスト検出のために用いられることができる。
図２Ａは、本発明の一実施形態による可搬検定リーダー２００の簡単化されたブロック図である。リーダー２００は、開口２０４を有する筺体２０２を含み、スロット又はホルダー２０６中にＬＦＡ１００を受け入れるように構成されている。図２Ａでは、レーザ２２０はＬＦＡ１００のテスト領域に向けてエネルギー１２０を発生する。図２Ａでは、例えば、エネルギーはオプションのレンズ２２２を用いてテスト領域に収束される可視光又は近赤外光とすることができる。ここで説明されたように、ナノ粒子に指向された可視光又は近赤外光は、ナノ粒子を加熱することができる。これは、赤外線センサのようなセンサ１２２で検知されることができる。テスト結果は、例えばＬＣＤディスプレイからなるディスプレイ２３０上に表示されることができる。このディスプレイは、単純な合格／不合格表示のような、量的出力又は質的出力を提供することができる。オプションのユーザ入力２３２が設けられている。例えば、この入力は、オペレータがテストを開始するのを許可する一個のボタンであってもよいし、または装置２００により用いられる閾値のようなパラメータをオペレータが更新するのを許可する数字キーパッドあるいはテンキーのようなもっと複雑な入力手段であってもよい。入力２３２は、タッチパネルを提供するために、ディスプレイ２３０上にオーバーレイするようにしてもよい。
装置２００の動作は、以下に、より詳細に述べるように、電子回路２４０により制御される。これは、例えば、マイクロプロセッサ、アナログ／デジタル変換器，Ｉ／Ｏ回路等を含む。電源２４２が設けられている。好ましくは、該電源２４２は、バッテリーのような可搬できる電源である。電源は、オプションとして、他の電源に接続するか又は太陽電池等を用いて再充電できるようなものであってもよい。
さらに、装置２００は、以下に、より詳細に説明される入／出力（Ｉ／Ｏ）回路３１０を含む。Ｉ／Ｏ回路３１０は、装置２００によって集められたデータが送信されるか、または他の装置に提供されるようにする。例えば、テスト結果は、その後の評価のために、ある地点に集積される又は中央局又はクラウドサーバに送信されることができる。
図２Ｂは、"卓上（bench top）"に構成された検定リーダー２００の簡単化されたブロック図である。図２Ｂの形態において、ＰＣとして示されるコンピュータはテスト（試験）を実行するのに用いられる。ＰＣ２６０は、Ｉ／Ｏ回路２６２を介してレーザ２２０及び赤外線センサ１２２に接続されている。Ｉ／Ｏ回路２６２は、例えば、デジタル／アナログ変換器、アナログ／デジタル変換器、切替可能な出力等を含むことができる。典型的には、図２Ｂに示されているＰＣ２６０は、可搬装置に用いられているものよりもっと計算能力が高いものである。このことにより、さらなるテスト又はより進化したテストをすることが可能になる。
任意の適切な部品を用いることができるが、一つの好ましい実施形態では、エネルギー源２２０は、レーザ、例えば５３２ｎｍ緑（グリーン）レーザ（すなわち、ＬＲＳ−０５３２−ＰＦＭ＿００２００−０３，LaserGlow Technologies Inc）からなる。収束光学機器２２２は、例えば平凸収束レンズからなることができる。適切な赤外線センサは、赤外線カメラ（Ａ２０又はＥ３０、ＦＬＩＲ等）又は赤外線センサ（ＭＬＸ９０６１４、Melexis）である。しかしながら、本発明はこの機器に限定されない。
図３は、装置２００の簡単化されたブロック図であり、メモリ３０２に格納された命令(instruction)に従って動作するマイクロプロセッサ３００を含む。マイクロプロセッサ３００は、電源２１８を起動することによりエネルギー源２２０を制御する。ＬＦＡの加熱(図３には示されていない)は、アナログ／デジタル変換器３０４へ出力を提供する熱センサ１２２により検出される。オプションの細片センサ(strip sensor)３０６が設けられている。細片センサ３０６は、スロット２０６中のＬＦＡ１００の存在を検知するように構成されており、それによって、マイクロプロセッサ３００がエネルギー源２２０が起動することを許可し、テストが開始される。
図３は、電源２４２に接続されたオプションの再充電回路３０８を示す。この再充電回路は、例えば外部電源、太陽電池、機械的なクランク(mechanical crank)等の電源２４２を用いて、再充電されるようにする。
入／出力回路３１０が、またマイクロプロセッサ３００に接続されている。これは、いかなるタイプの入力又は出力装置、例えばディスプレイ、キーボード又はマニュアル入力、可聴出力、ＵＳＢやイーサネット接続のようなデジタル出力、ＲＦ（無線周波数）やＩＲ(赤外線)入力及び／又は出力、セルダーデータ接続、イーサネット接続等を含む。ＲＦ接続の例は、ブルーツース（登録商標）であるが、これに限定されず他の短距離通信技術、ワイファイ接続等であってもよい。セルダー電話接続は、装置が、データを通信するため及び／又はオプションの音声通信を提供するために、セルダー電話ネットワークを用いて通信するようにする。データは、伝染病に関する時空間情報を収集するための、テスト結果および地理情報（ＧＰＳの位置）を含むことができる。
Ｉ／Ｏ３１０を用いると、装置２００により収集されたデータが他の位置又は場所に送られるようにすることができる。例えば、現場(field)で用いられている時には、装置２００はテスト結果を中央のデータベースに返信することができる。この返信は、適当な技術を用いて行うことができる。例えば、データは、インターネット接続、セルダーネットワーク等を介して送られることができる。この接続は物理的な有線接続、又はワイファイ、ブルーツース等を用いる無線で行うことができる。さらに、Ｉ／Ｏはメモリ３０２に格納されている情報を更新するのに用いられることができる。例えば、プログラム命令、キャリブレーション（校正）情報又は他のデータが更新されることができる。Ｉ／Ｏ３１０は、またディスプレイ２３０及び／又は入力２３２を用いて遠隔地からオペレータと通信するのに用いられることができる。
動作の間、ＬＦＡ１００(図３には示されていない)は筺体２０２の中、例えばスルースロット（through slot）２０６(図２Ａに示されている)の中に置かれている。テストプロセスは、細片センサ３０６からの信号、または他のトリガ、例えば入／出力回路３１０を用いる手(マニュアル)入力に応答して、マイクロプロセッサ３００により開始される。一つの態様では、オプションのステッピングモータ３０７が設けられ、マイクロプロセッサ３００により制御される。ステッピングモータ３０７は、装置２００内にあるＬＦＡ１００の動きを自動化するのに用いられる。多数の細片センサ３０６、又は他の機器は、装置２００内にあるＬＦＡ１００の位置をモニタしたい場合に用いられることができる。このモニタにより、マイクロプロセッサ３００はエネルギー源２２０に電力を印加する指令を出して、ＬＦＡ１００を加熱するようにする。加熱の状況はセンサ１２２により感知され、アナログ／デジタル変換器３０４を用いてデジタル信号に変換される。このデジタル信号に基づいて、マイクロプロセッサ３００は、入／出力回路３１０を用いてテスト結果を示す出力を提供する。
さらに、図３は印加されたエネルギーの強さを感知するために、エネルギー源２２０の通路に配置されているフィードバックセンサ３０３を示す。フィードバックセンサ３０３からの出力は、アナログ／デジタル変換器３０５を通ってプロセッサ３００に提供される。例えば、センサ３０３はレーザ２２０からの出力の強度を感知するための光センサであることができる。この情報は、装置の動作の調整と感知された熱の校正とに用いられることができる。さらに、フィードバックは、エネルギー源２２０が弱い信号を出力しているかあるいは完全に故障しているかを検知、診断するのに用いられることができる。
メモリ３０２は、情報を短期間及び長期間蓄積するために、マイクロプロセッサにより用いられる。例えば、装置２００のアドレス情報３２０はメモリ３０２に格納されることができる。このアドレスは、例えば、装置２００を一意的に又は半一意的に特定するアドレスであり、インターネット（ＩＰ）アドレス、マック（Ｍac）アドレス，または他のアドレス形式を含むが、これらに限定されるものではない。メモリ３０２は、またセンサ１２２から受信したデータを校正するのに用いられる校正情報３２２を格納するのに用いられる。校正情報は、いくつかの方法により、例えば装置の製造中に、回路３１０を用いての入力により、あるいはＬＦＡ１００を用いて、例えば図１に示されている制御領域１１６を用いて行われる校正に基づいて、決定されることができる。この校正情報は、センサ１２２により提供される読みに対する基準値(baseline)又は他のタイプのオフセット値を提供することができる。メモリ３０２は、またマイクロプロセッサ３００の動作を制御するのに用いられる操作命令を含むことができる。
図４Ａ及び４Ｂは、エネルギー１２０が印加される時（Ｔｓ）のＬＦＡ１００の熱応答を示すグラフである。熱量は、ＲＭで示されている所で最大に達する。さらに、図４Ａ及び４Ｂに示されているように、応答は、最も急勾配の上りで始まり、最大レベルＲＭに近づくにつれてゆっくりとレベルを上げる曲線を有する。マイクロプロセッサ３００は、印加されたエネルギー信号に対する熱応答を分析することにより、診断回路としての動作をする。例えば、単純な閾値レベルが用いられ、最大の応答がこの閾値レベルと比較される。これは、この比較に基づいて、例えば"合格／不合格"出力を、出力として提供することができる。さらに、量的出力が、該最大応答レベルに基づいて提供されることができる。この量的出力は、テスト領域１１４(図１参照)で捕獲された金のナノ粒子の量を示すことができる。これは例えば抗原の量と関係があり、よって患者の病気の進み具合と関係がある。
本発明の一具体例では、診断は、応答(response)の分析結果に基づいてなされる。例えば、図４Ａ及び４Ｂに、応答の初期勾配が示されている。この初期勾配に基づいて、熱が最大値に達するまで加熱することなしにＲＭの値を推定することが可能である。この技術は、テストプロセスの速度を速めるのに用いられることができる。さらに、この情報は、またセンサ１２２により検知されたＲＭの値を検証するのに用いられることができる。例えば、ＲＭの推定値がＲＭの測定値と大きく異なるならば、それは部品が故障したか、試験紙が破損したか、または測定に何か他のエラーが発生したか等を示すことができる。さらに、上述したように、校正情報は、測定の正確さを改善するのに用いられることができる。例えば、校正情報は、応答信号が比較される応答基準値を提供することができる。このように、応答閾値レベルは校正情報に基づいて調節されることができる。
エネルギー源２２０はいかなる適当なエネルギー源であってもよい。一つの好ましい実施形態では、エネルギー源はレーザからなる。種々のレーザが加熱源として知られており、例えば連続波レーザ、パルス波レーザ、又は小型化レーザ(reduced size laser)等がある。熱コントラスト感度は、よりパワーの大きいレーザを用いることにより、及び／又はＧＮＰの種々の濃度に対応させてレーザの強度を調節して、ダイナミックレンジを広げることによって、増大されることができる。レーザは可視領域にある光を放射することができる。また、近赤外領域にある光を放射するレーザを用いてもよい。一般に、レーザは、ナノ粒子内の吸収が最大になるが、背景材料からの干渉を最小にするように、選択または調節される。ＬＦＡシステム中で用いられるレーザの強度(パワー)の大きさは、変えることが可能であり、その大きさは検定装置（検定部品）に依存する。実施形態では、レーザの強度は、約５Ｗと約５０Ｗの間(連続波レーザ)であった。しかしながら、より大きいあるいはより小さいエネルギーレベルが他の実施形態では用いられることができる。例えば、パルスレーザを印加すると、トータルのエネルギーは小さいが高いエネルギー密度を得ることができる。以下に説明する背景吸収(background absorption)を低減すると、より大きいレーザ強度により、さらに改善された感度と信号強度を得ることができるようになる。
一般に、膜（薄膜）、及び裏当て又は裏張り（backing）は、最小の光吸収をする材料を含む。背景の加熱は、より大きなエネルギーを使用してより大きな信号強度を得る能力に制限を加える。最小の光吸収をもつ材料を選択することにより、背景の熱の読みは低減され、熱の検出がテスト領域中のナノ粒子からのものであり、検定システムの材料からのものでないことを保証する。ＬＦＡシステム中の膜は、一般に複数の隙間又は孔を含む有孔材料である。液体は、これらの隙間又は孔を通って一般に毛細管現象により流れることができる。有孔材料は、天然物又は合成物質から作られることができる。ＬＦＡシステムに使用するのに適当な有孔材料は、例えば、ニトロセルローズ、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエチレン、ナイロン、セルローズアセテート、ポリエステル、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン等を含む。好ましい実施形態では、光吸収が最小である膜を使用する。当該技術分野で既に知られている他の有孔材料もまた用いることができる。種々の裏当てが当該技術分野で既知であり、該裏当ては主にＬＦＡを構造的に支持する働きをしている。熱コントラスト検知のために、光吸収が最小の材料をここに説明されているＬＦＡ中の裏当てとして用いるのが好ましい。一つの好ましい実施形態では、裏当ては、ガラス又はプラスチック（例えば、ポリスチレン）で作られることができる。サンプルパッドは、種々の材料、例えば、ポリエステル、ポリアクリル酸、他のポリマー材料、又はガラスファイバーから作られることができる。共役パッド及び吸収パッドは、例えばセルローズ系材料等から作られることができる。
金属のナノ粒子は、光刺激により熱を発生する。この熱発生は、励起状態から基底状態への遷移の間に金属―誘電体接触面で表面プラズモン（surface plasmons）により起きる。ＧＮＰにより発生する熱量は、例えば次の式で表わすことができる。

Ｑ＝ＮＱｎａｎｏ＝ＮＣａｂｓＩ 式（１）
ここに、全体の熱の発生量（Ｑ，Ｗ／ｍ３）は、１個のＧＮＰの熱の発生量（Ｑｎａｎｏ）の複合的寄与によるものであり、ＧＮＰの濃度Ｎ（＃／ｍ３）、ＧＮＰの吸収断面積Ｃａｂｓ（ｍ２）、及びレーザ強度Ｉ（Ｗ／ｍ２）の積として表わされる。
ナノ粒子は、種々の材料、形、及びサイズからなることができる。ナノ粒子は、金のナノ粒子、銀のナノ粒子、銅のナノ粒子、プラチナのナノ粒子、アルミニュームのナノ粒子、カドミウムのナノ粒子、合成物粒子、すなわち銀と金、グラフェン（graphene）ナノ粒子等であることができる。一つの好ましい実施形態では、ＬＦＡ検体システムは金のナノ粒子からなる。他のタイプのナノ粒子もまた用いられることができ、本発明の範囲内である。他の実施形態では、２以上のナノ粒子を組み合わせて用いることができる。これらは、多くの検体を特定するために、あるいは信号を増幅又は高めるために用いられることができる。
ナノ粒子は、さまざまなサイズを含むことができ、また一般的には膜を通って進むことができるようにしなければならない。好ましくは、ナノ粒子の直径は、１０ｎｍから２００ｎｍの範囲であることができる。ナノ粒子のサイズの選択と最適化は、一部分は、エネルギーの吸収に依存する。エネルギー源としてのレーザと金のナノ粒子を用いた一つの好ましい実施形態では、プラズモン共鳴と呼ばれる物理現象が光の吸収効果を増進し、このため熱の発生を増進する。直径が約１００ｎｍまでの金のナノ粒子が用いられる。それより大きいサイズも有用でまた用いることができ、本発明の範囲に含まれる。他のいくつかの実施形態では、４０−８０ｎｍのサイズのＧＮＰが高い吸収効率（Ｑａｂｓ＝Ｃａｂｓ／Ａと定義される。ここに、Ｃａｂｓは吸収断面積、Ａは粒子の投影断面積である）をもち、このため熱発生の観点から好まれている。
種々の形のナノ粒子がここで記述されるＬＦＡシステムに用いられることができ、全てが本発明の範囲内にある。ナノ粒子は、例えば、ナノスフェア（球体）、ナノロッド、ナノシェル、ナノキューブ、ナノアーチン（nanourchins）、ナノピラミッド、ナノスター等でありうる。好ましい実施形態では、ナノ粒子は、ナノスフェア、ナノロッド及び／又はナノシェルである。ナノ粒子の他のいかなる形も用いられることができる。高い光吸収効率を有し、他の特性に関する検定に機能的であるナノ粒子が好ましい。ナノスフェア（ナノ球体）の形を持つ粒子に対しては、有効半径（等体積球）が吸収効率を計算するのに用いられることができる。
現在のＬＦＡ内で用いられているＧＮＰの多分散性は、ＣｒＡｇ及びｈＣＧディップスチック（dipsticks）に対する図１２Ａ−Ｃ及び図１３で見られるように、よく制御されていない。多分散性のより良い制御は、より一様なナノ粒子のサイズ分布につながる。これは、熱コントラスト検知に対して、より小さな標準偏差をもたらすことができ、よって信号の安定性と一貫性を改善する。より一様なナノ粒子は、またより高い光吸収と熱発生をもたらすことができる。例えば、異なるサイズをもつＧＮＰはいくつかの異なるピークの吸収波長をもつ。多分散されたＧＮＰ群にとっては、ピークの吸収波長で熱を発生するＧＮＰは少なくなり、このため熱の発生量は低減する。ナノ粒子のサンプルでは、一様なサイズのよく分散されたナノ粒子は、ナノ粒子クラスター(clusters)にとって好ましい。ナノ粒子をクラスターすると、ナノ粒子による吸収が一様でなくなる方向に導くことができる。ナノ粒子は、オプションとして、クラスタリングを低減するようにコーティングされて、吸収の一様性(uniformity)を増大するようにすることができる。このコーティングは、もしこれが存在するとした場合には、ナノ粒子内での吸収を低減しないようにするのが好ましい。
ナノ粒子のサイズ分布は変えることができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の少なくとも約６０％は、ナノ粒子の平均直径の±１０ｎｍの範囲内にある。好ましくは、ナノ粒子の少なくとも約７０％が、ナノ粒子の平均直径の約±５ｎｍの範囲内にあるのが望ましい。より好ましくは、ナノ粒子の少なくとも約７０％が、ナノ粒子の平均直径の約±３ｎｍの範囲内にあるのが望ましい。さらにより好ましくは、ナノ粒子の少なくとも約７５％が、ナノ粒子の平均直径の約±３ｎｍの範囲内にあるのが望ましい。なお、これらの範囲外のナノ粒子も、本発明の範囲内である。
ＬＦＡシステムで用いられるナノ粒子の量または濃度は、特定の検定、特定のナノ粒子、あるいは検体結合分子等に応じて変えることができる。一般的に、ナノ粒子の量は、約１−１００μｇのオーダーであることができる。この範囲外のナノ粒子の量もまた使用することができ、この発明の範囲内にある。一つの実施形態では、ＣｒＡｇ検定は、１つのＬＦＡにつきＧＮＰの約４μｇを用いる。使用されるナノ粒子の量は、いくつかあるファクターの中で特に、結合分子の結合親和力や、患者のサンプル内の対象の検体の濃度範囲に依存して、規定の範囲より大きく又は小さくすることができる。
種々のサンプル中の検体は測定可能であり、一般にいかなるタイプの液体サンプルであってもよい。このサンプルは、生物サンプル、化学サンプル、環境サンプル（環境試料）、食料サンプル等でありうる。生物サンプルは、例えば、血液、血漿、血清、尿、汗、胆汁、脳脊髄液、糞尿物質、膣液、唾液等を含むことができる。他の生物サンプルもまた分析することができ、全てが本発明の範囲内にある。検体が入っているサンプルは直接または希釈液で希釈して用いられる。希釈液は種々の溶液であることができ、当該技術分野では既知のものである。例示的な実施形態では、希釈液は食塩水である。
種々の検体が、本発明の方法と装置を用いて検出されることができる。目的となる検体は、たんぱく質、ペプチド、核酸、ハプテン、化学薬品等であることができる。検体は、また治療薬剤、乱用薬物、ホルモン、ビタミン、グルコースたんぱく質、抗体、ステロイド、細菌又は細菌感染、菌類、ウイルス、寄生虫、細菌の成分と生成物、アレルゲン、抗原等を含むことができる。検体は、また興味のある化合物の誘導体又は代謝産物をも含むことができる。
いくつかの実施形態では、検体は、病気、例えばマラリアやＴＢ（結核）等と関連付けられることができる。他の実施形態では、検体は、生理的又は病理的状態、例えば妊娠と関連付けられることができる。検体の例としては、クリプトコッカス抗原（ＣｒＡｇ）、マラリア抗原、結核抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（性腺刺激ホルモン）（ｈＣＧ）、ヒト黄体化ホルモン（ｈＬＨ）、ヒト卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＦ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、Ｂ型肝炎抗体、ＨＩＶ（エイズ・ウイルス）抗原、連鎖球菌Ａ、連鎖球菌属バクテリア、ＳＴＤ（性病）、Ｐ熱帯性マラリア、発熱パネル等を含む。
検体結合分子と捕獲分子は、対象の検体に結合することのできるいかなる分子であってもよい。いくつかの実施形態では、検体結合分子と捕獲分子は、生体巨大（高）分子、例えば抗体又は抗体の一部である。これらの分子は、またレセプター（受容体）、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、グリコペプチド、リポタンパク、核タンパク、核酸、アプタマー等であることができる。一つの例示的実施形態では、検体結合分子と捕獲分子は、抗体（免疫体）である。いくつかの実施形態では、検体結合分子は捕獲分子と同じである。他の実施形態では、検体結合分子は捕獲分子と異なるものである。
ナノ粒子を検体結合分子に共役する又は結合するための種々の方法が当該技術分野では既知であり、これらの全ては本発明の範囲内である。一般に、高温、高又は低湿度、及び／又は放射状態で、改善された安定性を示す共役化学(conjugation chemistry)が好ましい。化学結合は、粒子を検体結合分子にリンクさせる化学官能基及び／又は分子を使用することを意味している。一例は、粒子の表面上にあるカルボン酸の位置に、カルボジイミド仲介分子を介して検体上のアミン官能基をリンクさせるようにすることである。共役又は接合(conjugation)は、受動的吸着(passive adsorption)を含むことができる。受動的吸着は当該技術分野で既知であり、例えばＵＳ２０１０／０１３６５６６に開示されている。
捕獲分子を膜に付着させるための種々の液体散布及びスプレー技術が当該技術分野で既知である。これらのいかなるものも使用でき、捕獲分子の吸着と安定性をより良好にするスプレー技術が好ましい。検体結合分子に共役されるナノ粒子は、また共役パッド上にスプレーされることができる。例示的実施形態では、BioDot（登録商標）からの種々の液体散布装置がこれらの目的のために用いられることができる。
本発明は、またサンプル中の検体を検出する方法も含む。ＬＦＡの分析感度は、ここで説明されている熱コントラスト技術を用いることにより、視覚的検出方法よりも実質的に１０，０００倍より大きく改善されることができる。
本方法は、サンプルをサンプルパッドに接触させ、液体が毛管作用により膜を通って流れるようにすることを含む。検体結合分子に共役されるナノ粒子（共役ナノ粒子）は、サンプルアプリケーション（sample application）に応じて、毛管作用により膜内を移動する。対象の検体が存在する時には、該対象の検体は前記共役ナノ粒子に結合する。テスト領域内の捕獲分子がナノ粒子／検体複合体を認識し捕獲すると、該ナノ粒子／検体複合体は膜を通しての移動を停止する。このことは、ＬＦＡのテストゾーン又はテスト領域に、ナノ粒子／検体複合体が蓄積されるようにする。この方法は、さらに、テスト領域をエネルギー源に晒すことにより、テスト領域中の検体を検出しその量を計るために、熱コントラスト検定リーダを使用することを含む。センサにより発生された出力は、対象の検体の存在及び／又は量を示す。
この方法はまた多くの検体を検出することを含む。多くの検体は、各テスト領域が異なる捕獲分子をもつ、多くのテスト領域を持つことにより検出されることができる。このため、第１のナノ粒子／検体複合体は、第１の検体に結合する第１の捕獲分子を有するテスト領域１に結合し、第２のナノ粒子／検体複合体は、第１の検体ではなく、第２の検体に結合する第２の捕獲分子を有するテスト領域２に結合する。このようにして、ＬＦＡシステムは、多くのテスト領域を含むように構成することにより、多くの検体を特定するように拡張されることができる。多くの検体は、また異なる開始位置（starting positions）を持つ多くのナノ粒子を用いて検出されることができる。ナノ粒子は、異なる複合体及び異なる検体結合分子を持つことができる。これらは、膜を通って異なる流れを持つように調節されることができる。多くの検体は、同一のサンプルまたは異なるサンプル中に存在することができる。いくつかの実施形態では、多くの検体が同じテスト領域中でテストされることができる。多くの検体の検出により、同じテスト領域中で、各々の検体に対する識別をし、好ましくは検体の量を伴った識別をする。いくつかの実施形態では、多くの検体は、また一つのテスト領域中で、累積的に検出及び／又は定量化されることができる。例えば、異なるレーザ波長で吸収する異なる粒子を用いることにより、対応する波長でのレーザ励起を用いる多重化（multiplexing）が可能になる。
本方法は、また異なる粒子の二次的に制御された流れを用いることにより、信号を増幅することを含むことができる。一つの例示的な実施形態では、一次の（primary）金ナノ粒子を用いたＬＦＡからの信号は、銀染色（silver staining）又は二次ナノ粒子結合を用いることにより増幅されることができる。銀染色の過程では、金ナノ粒子は、表面に銀殻を成長させるための核形成部位としての機能を果たすことができる。二次ナノ粒子結合の過程では、二次ナノ粒子は信号を増幅するために対象の検体を捕獲する第１の粒子に結合する。
本方法は、またテスト領域中に存在する検体の量を計ることを含む。膜の熱変化の測定値は、テスト領域中に存在する検体の量と相互に関連付けることができる。ＬＦＡシステムは、検体の存在又は不存在だけでなく、膜中に存在する検体のレベルを提供し、その結果としてサンプル中の検体に関する情報を提供できるという利点を有する。このことは、特に、患者の病気、感染又は病状の程度を診断又は決定できるという利点がある。
テスト領域がエネルギー源に晒された後、検体の存在と量は、膜のテスト領域における熱の変化又は温度を測定することにより検出されることができる。一方、温度変化の初速度は、また固有吸収率（ＳＡＲ;specific absorption rate）を決定するために測定されることができる。ＳＡＲは、テスト領域中に存在する検体の量を決定するのに用いられることができる。ＳＡＲは、実質的に、上記式１中のＱである。それは、ナノ粒子が一旦レーザのようなエネルギー源によって励起された時に、該ナノ粒子から放出される熱エネルギー量（Ｗ／ｍ３）に関連する。式１に示されているように、それは、レーザフルエンス（laser fluence）とナノ粒子の数に正比例する。また、それは、検体中の抗原の量に直に関係する。
分析感度の改良はさておき、ＬＦＡはまた将来の分析のためにアーカイブに保管されることができる。他の検出方法とは異なり、熱コントラスト方法を用いると信号にロスがない。蛍光測定では、染料が光破壊により時間と共にそれらの信号を失うことになる。検定から２週間後の熱コントラストの読みは、ほとんど同一であり変化がない。このことは、熱コントラストの読みのために、現場において臨床検査でのＬＦＡ処理をすることと、同一のＬＦＡシステムの処理をするように中央検査室へ照会することとを可能にするという利点がある。換言すれば、検体信号は、サンプルが流された後、すぐに測定される必要がない。この信号は、何回も、例えば検定の準備が終わった後すぐに、およびまた後刻に、測定されることができる。この方法はまた、検定細片をサンプルに接触させた後、１２時間後、２４時間後またはそれ以上の時間後に、テスト領域をエネルギー源に晒し、テスト領域にある検体を測定することを含むことができる。
クリプトコッカス症は、全てのエイズ関連日和見感染症(AIDS-related opportunistic infections)による死の一番の原因であり、またアフリカにおける大人の骨髄炎の最もよく起きる原因であり、毎年、世界的に５００，０００人より多くの死亡原因となっている、アフリカの大人における骨髄炎の最も普通の原因である。クリプトコッカス症骨髄炎は、昔から、培養、墨汁(India ink)又は連続倍数希釈による半定量化を有するＣｒＡｇテスト（すなわち、倍数連続希釈を行う時の最後の陽性試験として定義されるＣｒＡｇタイター（ＣｒＡｇ titer））の組合せにより診断されている。
本発明は、ＣｒＡｇ抗原の検出と定量化のための方法を含む。この方法は、サンプルをサンプルパッドに接触させることと、流体が毛管作用により膜を通って流れるようにすることを含む。ＣｒＡｇ結合分子に共役されるナノ粒子（共役ナノ粒子）は、サンプルアプリケーションに応答して毛管作用により膜内に移動する。ＣｒＡｇが存在する時には、該ＣｒＡｇは前記共役ナノ粒子に結合する。テスト領域中の捕獲分子がナノ粒子／ＣｒＡｇ複合体を認識し結合すると、ナノ粒子／ＣｒＡｇ複合体は膜を通って動くのを停止する。これにより、ＬＦＡのテスト領域に、ナノ粒子／ＣｒＡｇ複合体が集積するようになる。熱コントラストシステムは、第１にテスト領域をレーザのような熱源に晒し、それから熱センサにより試験紙から発生された熱を測定することにより、テスト領域にあるＣｒＡｇの検出とその量を計るために用いられることができる。
図６は、ラテックス凝集法（Ｒ２＝０．９８）によって１：１０２４ＣｒＡｇタイター(titer)の当量濃度に至るまで対数線形勾配で、熱コントラストは、比色検出(colorimetric detection)よりも、分析感度において３２倍の大きさの改善を生じたことを示している。この１：１０２４タイター以上では、低減した視覚強度と安定した熱強度を有する高線量"フック"効果(high dose "hook" effect)があった。これは、検定の希釈を変えることによってか、または検定作業を変えることにより克服することができる。さらに、検定の正確さは、分散係数を低減するために、これらのナノ粒子のサイズを規格化することにより改善することができる。因みに、クリプトコックス髄膜炎を患っている患者の中で観察される平均のＣｒＡｇタイターは、しばしば１：１０２４から１：２０４８までである。しかしながら、抗ＨＩＶ治療にも拘わらず、１００％の感度と９６％の特異性をもつクリプトコックス髄膜炎の発生後期を予測する無症候性疾患を持つ無症候の人間の中には、１：８より大きいＣｒＡｇタイターで、数週間から数カ月にわたっての亜急性発症がある。進化したＡＩＤＳに罹って生活している人に血清ＣｒＡｇスクリーニングおよび先制の抗真菌薬治療をすることにより、症候性髄膜炎に対する臨床的進行は停止する。非侵襲性のスクリーニングは、ＣｒＡｇが尿中で検出されることを可能にするが、尿は血液よりも２２倍低いＣｒＡｇ濃度を有している。このように、改善されたＬＦＡ感度を有する熱コントラストは、ＡＩＤＳに罹っている無症状の人の非侵襲性のスクリーニングを可能にすることができ、ＣｒＡｇを定量化して患者のリスクのレベルを分類できる能力をもつ。
本発明は、ｈＣＧ抗原（ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗原）の検出と定量化のための方法を含む。この方法は、サンプルをサンプルパッドに接触させることと、液体が毛管作用により膜を通って流れるようにすることを含む。ｈＣＧ結合分子に共役されるナノ粒子（共役ナノ粒子）は、サンプルアプリケーションに応答して毛管作用により膜内に移動する。ｈＣＧ抗原が存在する時には、ｈＣＧは前記共役ナノ粒子に結合する。テスト領域中の捕獲分子がナノ粒子／ｈＣＧ複合体を認識し結合すると、該ナノ粒子／ｈＣＧ複合体は、膜を通って移動するのを停止する。これにより、ＬＦＡのテスト領域にナノ粒子／ｈＣＧ複合体が集積されるようになる。熱コントラストシステムは、テスト領域をまずレーザのような熱源に晒し、それから熱センサにより試験紙から発生する熱を測定することにより、テスト領域中のｈＣＧの検出とその量を計るのに用いられることができる。
本発明は、マラリア抗原の検出と定量化のための方法を含む。この方法は、サンプルをサンプルパッドに接触させることと、液体が毛管作用により膜を通って流れるようにすることを含む。マラリア抗原に共役されるナノ粒子(共役ナノ粒子)は、サンプルアプリケーションに応答して毛管作用により膜内に移動する。マラリア抗原が存在する時には、該マラリア抗原は前記共役ナノ粒子に結合する。テスト領域中の捕獲分子がナノ粒子／マラリア抗原複合体を認識し結合すると、該ナノ粒子／マラリア抗原複合体は、膜を通って移動するのを停止する。これにより、ＬＦＡのテスト領域にナノ粒子／マラリア抗原複合体が集積されるようになる。熱コントラストシステムは、テスト領域をまずレーザのような熱源に晒し、それから熱センサにより試験紙から発生する熱を測定することにより、テスト領域中のマラリア抗原の検出とその量を計るのに用いられることができる。
本発明は、ＴＢ抗原（結核抗原）の検出と定量化のための方法を含む。この方法は、サンプルをサンプルパッドに接触させることと、液体が毛管作用により膜を通って流れるようにすることを含む。ＴＢ抗原に共役されるナノ粒子(共役ナノ粒子)は、サンプルアプリケーションに応答して毛管作用により膜内に移動する。ＴＢ抗原が存在する時には、該ＴＢ抗原は前記共役ナノ粒子に結合する。テスト領域中の捕獲分子がナノ粒子／ＴＢ抗原複合体を認識し結合すると、該ナノ粒子／ＴＢ抗原複合体は、膜を通って移動するのを停止する。これにより、ＬＦＡのテスト領域にナノ粒子／ＴＢ抗原複合体が集積されるようになる。熱コントラストシステムは、テスト領域をまずレーザのような熱源に晒し、それから熱センサにより試験紙から発生する熱を測定することにより、テスト領域中のＴＢ抗原の検出とその量を計るのに用いられることができる。
例１ ＧＮＰの合成と分析
金ナノ粒子（ＧＮＰ）の合成： ３０ｎｍのＧＮＰは、クロロ金酸のクエン酸塩還元により合成され、それから、Frens G.、Perault等、及びNeha等により説明されているように、水溶液中での安定性を維持するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で被覆された。(Frens G.Nat.Phys.Sci.１９７３; Perault, Steven D.等. Nano Leters 2009 9(5) 1909-1915; Neha B. Shah 等. Moleular Pharmaceutics 2012 9(8) 2146-2155参照)
ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計、原子発光分析法、動的光散乱およびＴＥＭによるＧＮＰの特性解析は、合成の成功を保証し、濃度とサイズを定量化するために行われた。滴定される複数の濃度のＧＮＰ水溶液が用意され、各溶液の１０μＬが滴としてスライドガラスに移された。ＣＷレーザ（５３２ｎｍ，Millennia, Diode pumped）からのレーザは、それから１分間の間、これらの滴に当てられ、それによりＧＮＰの熱発生が誘起された。赤外線カメラ（ＦＬＩＲサーモビジョン（登録商標）Ａ２０）が、レーザ照射の間、温度変化を間接的に測定されるサンプルの上に、ある角度で装着された。各サンプルの最大の温度変化は熱画像(thermal images)から測定され、プロットされた。
溶液中のＧＮＰの熱コントラスト対視覚コントラストが比較された。ＧＮＰの一連の異なる濃度が用意された。ＧＮＰ溶液の１０μＬが顕微鏡スライドの上に置かれた。視覚分析のために、画像がデジタルカメラにより撮影され、Image Jで後に分析された。熱分析のためには、ＧＮＰ溶液が、レーザ（０．５Ｗ，５３２ｎｍ）に照射され、温度変化が赤外線カメラで記録された。
ＧＮＰは、視覚コントラストによるＧＮＰの２．５×１０１１ナノ粒子／ｍＬに対して、熱コントラストの場合には、２．５×１０９ナノ粒子／ｍＬに減らしても検出できるという結果が得られた。このことは、熱コントラストによる検出は１００倍(図５)分析感度を改善できることを証明した。ＧＮＰの熱コントラストは、また標準の微小体積プレートリーダーを用いる標準の光学密度測定と比較された。その微小体積プレートリーダーの原理は、微小流体ＥＬＩＳＡに広く用いられている。同じサンプルの体積（１０μＬ）で、熱コントラストは、光学密度測定より５０倍の改善が示された。さらに、熱コントラスト感度は、より大きな電力のレーザを用い及び／又はＧＮＰの異なる密度に対してレーザ電力を調節することにより改善することができ、熱コントラストのダイナミックレンジを広げることができる。重要なことは、レーザをナノ粒子（金ナノ粒子）がより高く吸収する波長に調節することにより感度を増進できるということである。
例２ クリプトコッカス抗原（ＣｒＡｇ）の検出
熱検出対比色検出（すなわち、視覚コントラスト）の分析効率は、Immy社から提供され、Qin等の中に記述されているクリプトコッカス抗原（ＣｒＡｇ）を検出するために、ＦＤＡ認可のＬＦＡを用いてテストされた。２０１１年７月にＦＤＡ認可されたＬＦＡであるクリプトコッカス抗原ＬＦＡ(Immy社、Norman OK)の熱コントラスト画像は、血清中のクリプトコッカス種複合体（クリプトコッカスネオフォルマンスとクリプトコッカスガトリー）のカプセルの多糖類抗原と脳脊髄液（ＣＳＦ）を検出している。クリプトコックス髄膜炎を患っている患者から採取した血清検体は、検出限界を評価するために２倍の連続希釈をした。このテストは、製造業者の指示に従ってなされた。熱コントラストは、１分間、レーザによりテストラインを照射することにより行われた。赤外線カメラが温度変化を記録した。各々の水平テストバンド（帯）上の３つの点（スポット）が照射され、平均最大温度変化が測定された。各濃度において、３つの別々のＬＦＡディップスチックが走査された。その結果は図６に示されている。
視覚コントラストの定量化：ＧＮＰ滴に対して、デジタルカメラで画像が撮影された。滴は、フラットベッドスキャナ（モデル：Visioneer Onetouch 7400）で走査された。興味のある領域（ＲＯＩ）、すなわち滴とディップスチックのためのテストバンドに対する平均グレー強度が分析された。同じ体積のＧＮＰ溶液（１０μＬ）が、またTake３マイクロボリュームプレートとシナージＨＴマルチモードマイクロプレートリーダー(BioTek, Winooski, VT)を備えた分光光度計により５３０ｎｍで測定された。
ラテックス凝集法（Immy社）により、１：３２７６８タイターで陽性の血清検体のＬＦＡ連続２倍希釈が比べられた。その結果は、ＬＦＡに関して、熱コントラストの方が、比色分析の視覚的検出よりもはるかに感度が良いことを示した。図６は、１：１０２４ＣｒＡｇタイターの当量濃度までの対数線形勾配に関して、熱コントラストは、比色検出より分析感度において３２倍の改善があったことを示している。この１：１０２４タイター以上では、低減した視覚強度(visual intensity)と安定した熱強度(thermal intensity)を有する高線量"フック"効果があった。
ＦＤＡ認可のクリプトコッカス抗原（ＣｒＡｇ）ＬＦＡを用いると、熱コントラストでは３２倍の分析感度の改善が見られ(図６)、同時に抗原濃度を定量化できた。"リーダーを備えた使い捨てＲＤＴ"モデルにおけるこの増強された感度は、ＣｒＡｇスクリーニングを可能にし、症候性及び無症候性ＣｒＡｇ＋のための資源制限領域における定量化は、定性的なＬＦＡによっては以前には気づかれていなかった患者の先制抗真菌療法を可能にした。
例３ ＬＦＡの分析感度の改善
ＬＦＡの分析感度のさらなる改善を調査するために、種々の金ナノ粒子、例えば棒状（ロッド）、貝殻状（シェル）及び球状の断面の吸収を実験的に求めた測定値に基づくモデリングが行われた。金ナノロッド、ナノシェル、及び金ナノ球を含む金ナノ粒子が評価された。図７Ａに示されているように、等しいレーザ出力及びナノ粒子濃度において、典型的ナノロッドとナノシェルは、金ナノ球よりも、それぞれ、４．６倍及び３６倍の熱をより多く発生する。粒子サイズの影響を低減するために、吸収断面積（Ｃabs）は、熱発生能力をより正確に評価するために、粒子体積（Ｖ）により正規化された。この比較のために用いられたＧＮＰのサイズは、球の径Ｄ＝３０ｎｍ、ナノロッドのＤ＝１2.７ｎｍ，長さＬ＝４９．５ｎｍ、及びナノシェルのＤcore＝１２０ｎｍ（シリカ）、Ｄshell＝１５０ｎｍ（金）であった。熱コントラスト（ΔＴsignal）とナノ粒子濃度が正規化される。この正規化を用いると、金ナノロッドは、金ナノ球及びナノシェルより熱発生において約１桁のオーダーの効率を上げることができた（図７Ａの差し込み図参照）。さらに、現在のＬＦＡ（すなわち、厚い基材を有する薄いニトロセルローズ膜）は、基材に熱を生ずる又はノイズを生ずるレーザエネルギー（５３２ｎｍでの）のかなりの量を吸収する。このため、吸収（すなわち、大きい伝播又は反射）の少ない基材、例えばプラスチックやガラスを用いると、より大きなレーザ光量（Ｉ）が使用できるようになる。ブランクディップスチック（blank dipstick）及びプラスチック及びガラスカバーのガラスが、それぞれ、１分間、５３２ｎｍのレーザに照射された。レーザ照射の間の温度変化は赤外線カメラで測定され、最大の温度変化が求められた(図７Ｂ参照)。高い吸収ナノ粒子と低い吸収ＬＦＡ基材との組み合わせは、感度を増すことができる。金のナノロッドが金のナノ球より異なる波長で効率よく吸収できることは注目に値する。
さらに熱コントラストでの１０００倍の増加は、電力密度(power density)を１００倍（すなわち、０．０１Ｗから１Ｗまで）増し、１０倍の吸収（Ｃabs）能力を持つナノ粒子を用いることにより得ることができる。より高いレーザ出力は、上記したバックグラウンド吸収を減らすことにより用いることができるようになる。
検定の分析感度は、ここで説明した改良をすると、視覚的検出方法よりも、上記された１０倍と上記で予測された１０００倍とを考慮すると、約１０，０００倍まで改善されることができる。
例４ ｈＣＧの検出
サンプル中のｈＣＧ（妊娠検査）は、ＧＮＰを有するＬＦＡを用いて行われた。該ｈＣＧ ＬＦＡは、Fisher Scientificから購入された(Sure-Vue Serum/Urine ｈＣＧ テストキット)。
図８Ａ及び図８Ｂに示されているように、熱コントラストは、視覚的検出に比べて、ｈＣＧの存在に対する感度が増加することを示した。熱コントラストを使用した場合には、検出限界である２０倍の増加を示した。
例５ マラリアの検出
マラリア抗原の存在は、またＧＮＰを有するＬＦＡを用いてテストされた。マラリアＬＦＡは、Alere社から購入された（BinaxNOW（登録商標）マラリアテスト）。
図９に示されているように、示されている熱コントラストは、視覚的検出に比べて、マラリア抗原の存在に対する感度を増加した。熱コントラストを用いると、検出限界である８倍の増加を示した。
例６ ＴＢの検出
ＴＢの存在は、ＧＮＰを有するＬＦＡを用いてテストされた。ＴＢ ＬＦＡは、Alere社で製造された（Determine （登録商標）TB LAM迅速テスト）。その結果は、表１に示されている。熱コントラストは、痰培養の参照基準に基づいて視覚的に検出されなかったＴＢ ＬＦＡ（すなわち、偽の否定(false negatives)）の大多数を検出している。
これは、熱コントラストが偽の否定のテスト結果を減らすから、テストの感度が増加することを物語っている。
例７ ｈＣＧに対する固有又は特定吸収率の使用
この実験は、熱コントラストが固有又は特定吸収率（ＳＡＲ;specific absorption rate）を用いて行われることができるかどうかを調べるために実施された。例１−７における熱コントラストは、ΔＴに基づいて行われた。該ＳＡＲは、温度変化の初期勾配に基づいている。
図１０Ａは、引き延ばされた時間周期に渡っての温度変化を示す。図１０Ｂは、最初の２０秒の温度変化を示している。図１０Ａ及び図１０Ｂに示されているように、熱コントラストは、ＳＡＲを計算することにより行われることができる。これは、干渉を最小にするために、その時以前の測定を可能にする。特に、ゆっくり時間をかけての加熱は、素材中での拡散を導くことになる。拡散が最小になるように、加熱が大変急速に行われる場合には、温度変化の割合は完全にＳＡＲ（又は、式１中のＱ）に関連することになる。そのため、テスト中に、ＧＮＰの存在と抗原の存在をより直接的に把握することができる。このことは、パルス状レーザーを使用できることを意味する。図１１は、ＳＡＲが温度変化の代わりに測定されたことを除いて、例４で上記したようなｈＧＣを用いた実験結果を示す。図から分かるように、ＳＡＲは、感度又は正確さを失うことなく、検体の検出に用いられることができる。
例８ 単分散粒子の使用
ナノ粒子は、例１に記されているように、Frensの方法を用いて作られ、分散度のために分析された。
図１２Ａ、図１２Ｂ、及び図１２Ｃに見られるように、合成されたＧＮＰは、ディップスチック中のＧＮＰよりより均一に分散される。
図１３は、図１２のＴＥＭ画像中に見られる結果を定量化したものである。特に、異なるサイズのＧＮＰの個数が追加されている。グラフは、従来のディップスチック中の分布がFrensの方法により合成されたものに対してはるかに広範であることを示している。
本発明は好ましい実施形態を参照して説明されたが、当業者は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなしに形態や細部を変更できることを認識するであろう。
１００・・・試験紙（試験細片）、１０２・・・サンプルパッド、１０４・・・サンプル（試料）、１０８・・・吸収パッド、１１０・・・共役(又は、結合)パッド、１１２・・・膜（薄膜）、１１４・・・テスト領域、１１６・・・制御領域、１２０・・・エネルギー源、１２２・・・センサ（赤外線センサ）、２００・・・可搬検定リーダー、２０２・・・筺体、２０４・・開口、２０６・・・スロット、２２０・・・レーザ、２２２・・・収束光学機器（レンズ）、２３０・・・ディスプレイ、２４０・・・回路。

Claims (27)

  1. エネルギー源、センサ，Ｉ／Ｏ回路、及び検定細片を受け入れるための開口を含む熱コントラスト検定リーダーであって、
    検定細片のテスト領域上でのエネルギー源の活性化により、センサの検知結果を出力信号に変換するように構成された熱コントラスト検定リーダー。
  2. 前記エネルギー源がレーザである、請求項１に記載の熱コントラスト検定リーダー。
  3. 前記センサが赤外線カメラである、請求項１に記載の熱コントラスト検定リーダー。
  4. 前記検定細片のテスト領域がナノ粒子を含む、請求項１に記載の熱コントラスト検定リーダー。
  5. 前記熱コントラスト検定リーダーが卓上装置であり、前記出力信号が前記卓上装置上のディスプレイに表示される、請求項１に記載の熱コントラスト検定リーダー。
  6. 前記熱コントラスト検定リーダーが携帯機器であり、前記出力信号が該携帯機器上のディスプレイに表示される、請求項１に記載の熱コントラスト検定リーダー。
  7. 前記出力信号が有線接続により他の装置へ送信される、請求項１に記載の熱コントラスト検定リーダー。
  8. 前記出力信号が無線接続により他の装置へ送信される、請求項１に記載の熱コントラスト検定リーダー。
  9. サンプルパッド、試験細片、検体結合分子に共役されるナノ粒子、テスト領域、制御領域、及びサンプルが適用される時に流動伝達用に構成された吸収パッドを含む検定システムと、
    熱コントラスト検定リーダーとを含む、検定キット。
  10. 前記ナノ粒子が、銀、グラフェン（graphene）、金、及びそれらの組合せを含む、請求項９に記載の検定キット。
  11. 前記ナノ粒子が、ナノ球、ナノロッド、ナノシェル、及びそれらの組合せを含む、請求項９に記載の検定キット。
  12. 前記試験細片は、ニトロセルローズの薄膜を含む、請求項９に記載の検定キット。
  13. 前記熱コントラスト検定リーダーは、エネルギー源とセンサを含む、請求項９に記載の検定キット。
  14. 前記検体は、ＣｒＡｇ、Ｔｂ抗原、ｈＣＧ、マラリア抗原、連鎖球菌Ａ、ブドウ球菌、ＳＴＤ、Ｐ．熱帯性マラリア、発熱パネル、又はこれらの組合せである、請求項９に記載の検定キット。
  15. 前記サンプルは、血液、血漿、尿、唾液、又はそれらの組合せである、請求項９に記載の検定キット。
  16. 前記テスト領域は捕獲分子を含み、該テスト領域の捕獲分子は前記検体結合分子と同じである、請求項９に記載の検定キット。
  17. 前記テスト領域は捕獲分子を含み、該テスト領域の捕獲分子はナノ粒子に共役される検体結合分子とは異なる、請求項９に記載の検定キット。
  18. 複数の異なる検体は一つの検定システム中で検出される、請求項９に記載の検定キット。
  19. 前記熱コントラスト検定リーダーは、サンプル中に存在する検体の量を提供する、請求項９に記載の検定キット。
  20. 前記検体信号は、サンプルの適用後少なくとも約２４時間後に測定されることができる、請求項９に記載の検定キット。
  21. 検定システムの試験細片サンプルに接触させた後に、該検定システム中の試験細片の領域をエネルギー源に晒すことであって、前記サンプルは毛管作用で前記試験細片を通って移動し、前記検定システムは前記サンプル中の検体に結合する検体結合分子に共役されるナノ粒子を含み、テスト領域は捕獲分子を含み、
    前記テスト領域中の検体の存在、不存在を検出するためにセンサによりテスト領域中に発生された熱を測定することとを含む、
    サンプル中の検体を検出する方法。
  22. 検出される前記検体は、ＣｒＡｇ、Ｔｂ抗原、ｈＣＧ、マラリア抗原、またはこれらの組合せである、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記サンプルは、血液、尿、唾液、血漿、又はこれらの組合せである、請求項２１に記載の方法。
  24. 複数の異なる検体が一つの検体システム中で検出される、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記センサがサンプル中に存在する検体の定量化出力を提供する、請求項２１に記載の方法。
  26. 前記検体信号がすぐには測定されない、請求項２１に記載の方法。
  27. 前記検体信号が銀増幅（silver amplification）を用いて増幅される、請求項２１に記載の方法。
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