EP4136449A1 - Lateral flow assay - Google Patents

Lateral flow assay

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Publication number
EP4136449A1
EP4136449A1 EP21717922.5A EP21717922A EP4136449A1 EP 4136449 A1 EP4136449 A1 EP 4136449A1 EP 21717922 A EP21717922 A EP 21717922A EP 4136449 A1 EP4136449 A1 EP 4136449A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
lateral flow
flow assay
assay according
zone
marking
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP21717922.5A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Friedrich Scholz
Theresa Heckmann
Lukas RÜTTINGER
Anne-Marie GAD
Hans-Hermann SÖFFING
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Senova Gesellschaft fuer Biowissenschaft und Technik mbH
Original Assignee
Senova Gesellschaft fuer Biowissenschaft und Technik mbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Senova Gesellschaft fuer Biowissenschaft und Technik mbH filed Critical Senova Gesellschaft fuer Biowissenschaft und Technik mbH
Publication of EP4136449A1 publication Critical patent/EP4136449A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles

Definitions

  • the present invention relates to a lateral flow assay, a method for quantifying an analyte and a device for reading out a lateral flow assay.
  • LFA Lateral Flow Assay
  • POCT point-of-care test
  • a liquid sample e.g. from a patient
  • the sample interacts with the individual components of the LFA and causes optical changes in the LFA.
  • optical indicators can be observed and evaluated by the user or by optical reading devices.
  • a read-out device typically has an optical sensor that detects the variation of the optical signal very accurately.
  • the LFAs are based on the principles of immunoassays, in which the presence of a substance, called an analyte, is detected in liquid samples such as blood, urine, saliva or environmental samples.
  • a liquid sample, which contains the analyte, is applied to the sample application field of the LFA.
  • an LFA consists of a sample zone, a reaction zone and a detection zone.
  • the sample zone is also known as the sample application field or sample pad.
  • the reaction zone comprises affinity molecules, which are also referred to as receptor elements.
  • the detection zone also includes affinity molecules.
  • a receptor element is inserted directly after the sample application area and a second receptor element is immo bilized in the so-called test zone of the LFA.
  • the two receptor elements are positioned in such a way that the first receptor molecule, after contact with the sample, is transported together with the analyte to the second receptor element by capillary flow forces.
  • the second receptor element which is fixed on the solid phase, binds the analyte or the first receptor element from the sample.
  • the analyte from the sample interacts with the receptor element directly after the sample application field.
  • This receptor element is usually conjugated to optical signal-emitting particles or molecules (marking).
  • the sample, with the analyte and the labeled receptor molecule (“labeling complex") then flows on to the test zone on which a second receptor element is immobilized.
  • the analyte and the two receptor elements interact, whereby an optical signal is formed on the test zone, depending on the marking used. This signal can be quantified by a readout device.
  • the first receptor element binds the analyte, which in turn binds to the second receptor element, one speaks of a sandwich assay.
  • the signal intensity on the test line increases with increasing analyte concentration.
  • the label can be bound to the analyte (or a structurally similar molecule).
  • This reagent marking complex
  • This reagent is then located in a defined amount directly after the sample application field and, after the sample application, migrates with the analyte from the sample to the test zone to which the receptor element is fixed.
  • the receptor element is bound to the marker and placed directly after the sample application area.
  • the analyte or a structure-like molecule is immobilized in the test zone. The analyte also migrates from the sample with the conjugate to the test zone.
  • the analyte from the sample, receptor molecule and the analyte introduced into the assay then interact with one another at the test zone and cause a signal in the test zone.
  • the signal intensity decreases with increasing analyte concentration.
  • the solid phase of the LFA which contains the test zone, provides a zone in which a receptor element or the analyte (or structure-like molecule), referred to as a ligand, is immobilized.
  • Porous materials such as nitrocellulose, nylon, cellulose acetate and other porous materials are used as the solid phase.
  • the sample task area mostly consists of fiberglass or cellulose membranes.
  • the marking complexes are introduced into the pad adjoining the sample application area, with this membrane also mostly consisting of glass fiber and cellulose membranes.
  • LFA formats are also used as dipstick formats, in which a receptor molecule is also bound to the solid phase.
  • This test strip is then dipped into the sample containing the analyte.
  • This sample can then either release the marking complex or the marking complex can be added to the sample beforehand.
  • the marker complexes then interact with the analytes from the sample and / or the receptor molecule on the solid phase and either form a colored field or line in the test zone or not.
  • One LFA can also be used to detect multiple analytes. For example, when drugs are detected from biological samples, multiple drugs are detected. Such LFA are mostly offered with several test zones, whereby exactly one drug can be detected in one test zone. For the detection of small analytes (100-1000 Da), mostly competitive assay formats are used in which the signal in the test zone decreases with increasing analyte concentration, as shown in the following patents: US Pat. No. 4,703,017; U.S. 5,451,504; and US 5,798,273
  • sandwich assay formats are mostly used, in which the signal increases with increasing analyte concentration in the test zone.
  • Sandwich assay formats based on LFA are described, inter alia, in the following patents: US 20150094227.
  • the receptor molecules are marked with colored molecules or particles in order to make the complex of analyte and antibody or antibodies visible.
  • Typical markings for LFA are colored nanoparticles or dyes.
  • protocols that describe the attachment of the label to ligands.
  • LFA are evaluated through the eye of the user.
  • readout devices are used for quantification, which can deduce the analyte concentration in the sample from the intensity of the color of the test zone.
  • Such reading devices usually have a light source with which the test zone is irradiated and a detection unit which quantifies the light intensity of the light modified by the test zone.
  • the light from the light source for example an LED
  • the light from the light source is detected by one or more photodiodes or a camera.
  • Read-out units typically have several LEDs in order to quantify the various test and control zones. The measured signal is then converted into an analyte concentration by the device and shown to the user on a display.
  • such readout units are described in EP 1484601, KR102005597B1, US 20150094227, US 7,297,529.
  • LFA only have a measuring range of approx. 1.5-2 log levels. This is not sufficient for the quantification of some analytes. For example, it is necessary to precisely quantify the CRP in the blood in the concentration range of 0.5 - 150 pg / ml and thus over a measuring range of 2.5 log levels. The LFA procedures described for this are mostly inadequate.
  • the object of the present invention was to provide a lateral flow assay which allows an analyte to be quantified, in particular over a larger measuring range than in the prior art.
  • the task is solved by a lateral flow assay with
  • the first affinity molecules have an optically measurable marking which has at least 2 different absorption maxima of different heights, which are used for quantification.
  • the lateral flow assay according to the invention has a sample zone, a reaction zone and at least one detection zone.
  • the sample is applied in the sample zone in order to bind the first affinity molecules in the subsequent reaction zone.
  • Second affinity molecules are immobilized in the detection zone, so that complexes of first affinity molecules, analyte and second affinity molecules accumulate there in the sense of a sandwich assay.
  • the first affinity molecules raise an optically measurable mark that has two different absorption maxima of different heights, which can thus be used for quantification.
  • measurements are made at both absorption maxima.
  • the first measurements are in the area of the first absorption maximum or those in the second absorption maximum are in a range that allows good and reliable quantification.
  • the first and second affinity molecules can be antibodies or antibody fragments, for example. Protein A, protein G, streptavidin, neutravidin or derivatives thereof are also suitable. Further suitable affinity molecules are known to the person skilled in the art.
  • the optically measurable marking is preferably achieved by marking compounds which are selected from dyes, nanomaterials or combinations thereof.
  • Metal nanomaterials, latex nanomaterials, cellulose-based nanomaterials, silica nanomaterials or combinations thereof are particularly suitable as nanomaterials.
  • the optically measurable marking with two different absorption maxima can be achieved on the one hand by two different marking compounds.
  • the marking could be a blue and a red dye, which have absorption maxima of different heights.
  • the two different absorption maxima used according to the invention are preferably at least 50 nm apart, preferably at least 70 nm apart and even more preferably at least 100 nm apart.
  • the one absorption maximum is preferably at least 1.5 times higher than the other absorption maximum.
  • the ratio is preferably at least 2 or at least 3. It does not matter whether the absorption maximum, which is higher than the other absorption maximum, is at a higher or lower wavelength.
  • the absorbance or transmission of the marker molecules is measured at both absorption maxima. Due to the different height of the two absorption maxima, different measuring ranges are obtained.
  • the lateral flow assay of the present invention can also contain other common features, such as a control zone in which the correct The functionality of the test is checked and a suction zone to promote the migration of the samples.
  • the invention also relates to a method for quantifying an analyte comprising the steps
  • the invention also relates to a device for reading out the lateral flow assay according to the invention
  • At least one detection device for measuring the at least two wavelengths of the lighting device
  • detection conjugates are used for labeling with LFAs, which have a defined absorption maximum, such as gold nanoparticles with an absorption maximum between 520-540 nm.
  • the dynamic range of the method is determined by the fact that the color in the test zone is saturated with a few nanoparticles and can no longer be resolved by the reading devices. This problem also occurs when using other colored nanomaterials such as latex nanoparticles, cellulose-based nanoparticles or other metal-based metal nanoparticles. When using less colored nanomaterials, the dynamic range can be shifted to higher concentrations, in which case the The sensitivity of the method is lower and the overall width of the dynamic range does not change.
  • marking complexes are used which have at least two different absorption maxima at clearly un different wavelengths.
  • the absorption maxima of the marking complex differ in height.
  • the marking complexes can be detected with different sensitivities using optical measuring methods.
  • small amounts of the marking complex for example if the amount of analyte corresponds to the detection limit of the measurement method, only the stronger absorption maximum of the marking complex is recognized, with the second, weaker absorption maximum not being able to be detected.
  • the quantifiable amount of the marking complex is limited accordingly by the measuring system. From a corresponding amount of marking complex, the measuring system can no longer resolve the optical signal of different amounts of the marking complex. If there are two absorption maxima of the same marking complex available, the amount of marking complex can still be quantified when using the weaker absorption maxima if the measurement method has already reached saturation when measuring the stronger absorption maxima.
  • the markings used have two or more absorption maxima in the range between 200-2000 nm.
  • gold nanorods, silver nanoplates or silica nanoshells are used.
  • latex or silica nanoparticles containing various dyes can also be used.
  • the different absorption maxima are typically at least 100 nm apart.
  • spectra of gold nanorods with different absorption spectra are shown by way of example. These nanorods have an absorption maxima in the range between 520-540 nm and a second absorption maxima in the range between 600-800 nm.
  • the shape and size of the marking can be used for the Different application, but it is preferred that the materials are homogeneous in size and shape within a process.
  • the gold nanorods in the spectra shown by way of example have a length between 50-70 nm and a diameter of 10-20 nm.
  • nanomaterials are also bound to one or more affinity molecules on the surface.
  • the ligands were bound to the nanomaterials either by passive adsorption or covalently by chemical reactions.
  • Antibodies are used, for example, as ligands.
  • a further aspect of the method is a reading device which can quantify the amount of the marking complex in the test zone.
  • the amount of the marking complex accumulated in the test zone is quantified at two different wavelengths.
  • a preferred device be seated one or more light sources, which emits light according to the different wavelengths of the absorption maxima.
  • the device has one or more detectors that detect the light that is reflected or absorbed by the test zone.
  • the detector can be a camera, which images the test zone and the discoloration of the test band is then quantified by the device.
  • Another possibility for a detector are photodiodes, which detect the light that is reflected or absorbed on the membrane.
  • the reading device quantifies the amount of the marking complex using light of the two different wavelengths.
  • the wavelengths of the light correspond to the absorption maxima of the marking complex.
  • the reader can then calculate the concentration of the analyte.
  • a schematic representation is shown in FIG.
  • the invention also relates to a method for quantifying an analyte comprising the steps:
  • gold nanorods have plasmon resonance, which can be influenced by the size of the rods, the absorption properties can be controlled by the synthesis conditions.
  • the absorption spectrum of a 10 nm diameter and 40 nm long gold nanorod has two absorption maxima.
  • An absorption maximum, caused by the transversely directed surface plasmon resonance of the gold nanorod, is at 525 nm.
  • the second absorption maximum, caused by the longitudinally directed surface plasmon resonance, is at 800 nm.
  • the absorption maximum at 800 nm has an absorption 4.1 times as high like the maximum at 525 nm. Marking complex
  • gold nanorods are used to produce a detection molecule.
  • anti-CRP antibodies were passively bound to the citrate-stabilized gold nanorods by adding the antibody directly to a solution of the nanorods. After a 30-minute incubation, the remaining binding sites on the nanorods were blocked with BSA and the marking complex was washed by centrifugation at 8000 g and resuspension in water. The solution was adjusted to an OD 10 at 525 nm.
  • the marking complex was introduced into a glass fiber membrane with an Airjet Quanti module from the Biodot XYZ Series dosing platform. With the spray function, the marking complex was sprayed onto the pad at a pressure of approx. 4 psi and a metering rate of 10 pl cm -1.
  • the glass fiber membrane with the introduced marking complex was then dried for at least two hours at 37 ° C. in a drying cabinet.
  • the Cavro unit of the Biodot dosage platform was used to apply 1 pg of anti-CRP Ab / ml in PB buffer at a dosage rate of 1 ml / cm. After the coating, the membrane was dried at 37 ° C. for 1 h.
  • a sample zone, a reaction zone, a detection zone and a suction zone were glued to a backing card and then cut into 4 mm wide strips.
  • the reading device consists of an illumination source which has two LEDs with wavelengths of 525 nm and 800 nm. These LEDs were placed in such a way that they emit the light evenly onto the detection zone of the lateral flow assay.
  • a camera is located above the detection zone, which takes a picture of the detection zone. The device takes both an image with the camera under illumination of 525 nm and an image with illumination at 800 nm. An algorithm can then be used to calculate a concentration of the CRP in the sample from the images.
  • FIG. 3 shows the measuring range of the method when using 525 nm as the detection wavelength and when using 800 nm as the wavelength, as well as the resulting entire measuring range.
  • Silver nanomaterials were produced which have two different absorption maxima due to plasmon resonance.
  • One absorption maximum was 400 nm and the second at 600 nm.
  • the absorption maximum at 600 nm has an absorption that is 5 times as high as the maximum at 400 nm.
  • Anti-TSH antibodies were conjugated to these silver nanomaterials and this conjugate was then used as a labeling complex.
  • a nitrocellulose membrane was also coated with anti-TSH antibodies.
  • the marking complex was added to the sample and the coated nit rocellulose was immersed in this sample, incubated for 5 minutes and then evaluated with a reading device which can quantify the marking complex accumulated in the detection zone at two different wavelengths. Over a measuring range of 0.05-100 mIII / ml TSH with a coefficient of variation of ⁇ 15% TSH could be detected in the TSH-containing samples.
  • silica nanoparticles Two different dyes with different absorption maxima and extinction coefficients were included in silica nanoparticles. One absorption maximum was 450 nm and the second was 620 nm. The absorption maximum of the silica nanoparticle at 620 nm has an absorption 2.5 times as high as the maximum at 450 nm.
  • Anti-IgE antibodies were covalently immobilized on these silicon nanoparticles. This marking complex was placed in a glass fiber membrane and dried in vacuo. To coat a nitrocellulose membrane, 1 pg / cm of a mixture of four known egg allergens (ovomucoid, ovalbumin, ovotransferrin and lysozymes) in PBS buffer was added to a nitrocellulose membrane. For the production of ready-to-use test strips, a sample zone, a detection zone, a reaction zone and a suction zone were glued to a backing card and then cut into 4 mm wide strips. These test strips were placed in a case.
  • the readout unit After applying 100 ⁇ l of a sample to the sample zone, the test was placed in the readout unit.
  • the readout unit has two LEDs with wavelengths of 450 nm and 620 nm and can detect the reflected light at 450 nm as well as at 620 nm in the test zone through a line of photodiodes. It was possible to detect IgE over a measuring range of 2-5000 kU / l with a coefficient of variation of ⁇ 15% in the egg allergen-specific IgE-containing samples.

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Abstract

Lateral Flow Assay mit - einer Probenzone zum Auftragen einer Probe - einer Reaktionszone mit ersten Affinitätsmolekülen - einer Nachweiszone mit zweiten Affinitätsmolekülen dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Affinitätsmoleküle eine optisch messbare Markierung aufweisen, die mindestens 2 verschiedene Absorptionsmaxima unterschiedlicher Höhe aufweist, die zur Quantifizierung verwendet werden.

Description

Lateral Flow Assav
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Lateral Flow Assay, ein Verfahren zur Quantifizierung eines Analyten sowie eine Vorrichtung zum Auslesen eines La teral Flow Assays.
Lateral Flow Assay (LFA) finden weit verbreitet Anwendung zum Nachweis von verschiedensten Analyten in verschiedenen Proben. Dabei werden die LFA so wohl in gut ausgestatten Laboren oder aber außerhalb der Labore von untrai niertem Personal als Point-of-Care-Test (POCT) eingesetzt. In einem typischen LFA wird eine flüssige Probe (z.B. eines Patienten) auf das Probenaufgabefeld des LFA aufgeben. Die Probe interagiert mit den einzelnen Komponenten des LFA und verursacht optische Veränderungen des LFA. Diese optischen Indikato ren können durch den Anwender oder aber auch durch optische Auslesegeräte beobachtet und ausgewertet werden. Ein Auslesegerät besitzt dabei typischer weise einen optischen Sensor, der die Variation des optischen Signals sehr ak kurat erfasst.
Die LFAs basieren dabei auf den Prinzipien der Immunoassays, bei denen die Anwesenheit einer Substanz, bezeichnet als Analyt, in flüssigen Proben wie Blut, Urin, Speichel oder Umweltproben nachgewiesen wird. Eine flüssige Probe, wel che den Analyten enthält, wird dabei auf das Probenaufgabenfeld des LFA auf gegeben.
Typischerweise besteht ein LFA aus einer Probenzone, einer Reaktionszone und einer Nachweiszone.
Die Probenzone wird auch als Probenaufgabefeld oder Sample Pad bezeichnet.
Die Reaktionszone umfasst Affinitätsmoleküle, die auch als Rezeptorelemente bezeichnet werden.
Auch die Nachweiszone umfasst Affinitätsmoleküle. Dabei ist ein Rezeptorelement direkt nach dem Probenaufgabefeld eingebracht und ein zweites Rezeptorelement auf der sogenannten Testzone des LFA immo bilisiert. Dabei sind die beiden Rezeptorelemente so positioniert, dass das erste Rezeptormolekül nach Kontakt mit der Probe zusammen mit dem Analyten bis zu dem zweiten Rezeptorelement durch kapillare Flusskräfte transportiert wird. Das zweite Rezeptorelement, welches auf der festen Phase fixiert ist, bindet den Analyten oder das erste Rezeptorelement aus der Probe.
Wird die Probe auf das Aufgabefeld gegeben, interagiert der Analyt aus der Probe mit dem Rezeptorelement direkt nach dem Probenaufgabefeld. Dieses Rezeptorelement ist in der Regel an optisch signalgebende Partikel oder Mole küle (Markierung) konjugiert. Die Probe, mit dem Analyten und dem markierten Rezeptormolekül ("Markierungskomplex") fließt anschließend weiter zu der Testzone, auf der ein zweites Rezeptorelement immobilisiert ist. An der Test zone interagieren Analyt und die beiden Rezeptorelemente, wodurch sich ein optisches Signal, je nach verwendeter Markierung, auf der Testzone ausbildet. Dieses Signal kann durch ein Auslesegerät quantifiziert werden.
Bindet das erste Rezeptorelement den Analyten, welcher wiederum an das zweite Rezeptorelement bindet, spricht man von einem Sandwich Assay. Dabei steigt mit zunehmender Analytkonzentration die Signalintensität auf der Testli nie.
Ist nur ein Rezeptorelement vorhanden und zusätzlich ein Molekül das struktur gleiche oder strukturähnliche Abschnitte des Analyten besitzt, spricht man von einem kompetitiven Assay. Dabei kann zum Beispiel die Markierung an den Ana lyten (oder ein strukturähnliches Molekül) gebunden werden. Dieses Reagenz (Markierungskomplex) befindet sich dann in definierter Menge direkt nach dem Probenaufgabefeld und wandert nach Probenaufgabe mit dem Analyten aus der Probe bis zur Testzone, an welcher das Rezeptorelement fixiert ist. In einem anderen Assayformat ist das Rezeptorelement an die Markierung ge bunden und direkt nach dem Probenaufgabefeld eingebracht. Der Analyt oder ein strukturähnliches Molekül ist in der Testzone immobilisiert. Dabei wandert der Analyt aus der Probe mit dem Konjugat ebenfalls bis zur Testzone. An der der Testzone interagieren dann Analyt aus der Probe, Rezeptormolekül und der in den Assay eingebrachte Analyt miteinander und verursachen ein Signal in der Testzone. Bei beiden kompetitiven Assayformaten sinkt die Signalintensität mit zunehmender Analytkonzentration.
Die feste Phase des LFA, welche die Testzone enthält, stellt dabei eine Zone bereit, in der ein Rezeptorelement oder der Analyt (oder strukturähnliches Mo lekül), bezeichnet als Ligand, immobilisiert ist. Dabei werden poröse Materialien wie Nitrocellulose, Nylon, Cellulose Acetat und andere poröse Materialien als feste Phase eingesetzt. Das Probenaufgabenfeld besteht zumeist aus Glasfaser oder Cellulosemembranen. In das an das Probenaufgabenfeld anschließende Pad werden die Markierungskomplexe eingebracht, wobei diese Membran eben falls zumeist aus Glasfaser und Cellulosemembranen bestehen.
Einige LFA Formate werden auch als Dipstick Format eingesetzt, bei denen ein Rezeptormolekül ebenfalls an die feste Phase gebunden ist. Dieser Teststreifen wird dann in die Probe getaucht, welche den Analyten enthält. Diese Probe kann dann entweder den Markierungskomplex freisetzen oder aber der Markierungs komplex kann der Probe vorher zugesetzt werden. Die Markierungskomplexe interagieren dann mit den Analyten aus der Probe und/oder dem Rezeptormo lekül auf der festen Phase und bilden entweder ein farbiges Feld oder Linie in der Testzone aus, oder nicht.
Ein LFA kann auch zur Detektion mehrere Analyten verwendet werden. Zum Beispiel werden beim Nachweis von Drogen aus biologischen Proben mehrere Drogen nachgewiesen. Solche LFA werden zumeist mit mehreren Testzonen an- geboten, wobei auf einer Testzone genau eine Droge nachgewiesen werden kann. Bei dem Nachweis von kleinen Analyten (100-1000 Da) werden zumeist kom petitive Assayformate eingesetzt, bei denen mit zunehmender Analytkonzent- ration das Signal in der Testzone sinkt, wie in folgenden Patenten gezeigt: U.S. 4,703,017; US 5,451,504; und US 5,798,273
Beim Nachweis von größeren Analyten (1.000-1.000.000 Da) werden zumeist Sandwich Assayformate eingesetzt, bei denen das Signal mit zunehmender Ana- lytkonzentration in der Testzone ansteigt. Unter anderem sind Sandwich Assay formate auf LFA Basis in folgenden Patenten beschrieben: US 20150094227.
Wie bereits erwähnt, werden die Rezeptormoleküle mit farbigen Molekülen oder Partikeln markiert, um den Komplex aus Analyt und Antikörper oder Antikörpern sichtbar zu machen. Typische Markierungen für LFA sind farbige Nanopartikel oder Farbstoffe. Es gibt eine Vielzahl von Protokollen, die die Anbindung der Markierung an Liganden beschreiben. Traditionell werden LFA durch das Auge des Anwenders ausgewertet. Allerdings gibt es eine Vielzahl von Anwendungen, bei der eine Quantifizierung der Analytkonzentration notwendig ist. Daher wer den zur Quantifizierung verschiedenste Auslesegeräte eingesetzt, die durch die Intensität der Färbung der Testzone auf die Analytkonzentration in der Probe schließen können.
Solche Auslesegerät besitzen zumeist eine Leuchtquelle, mit der die Testzone bestrahlt wird und eine Detektionseinheit, die die Lichtintensität des durch die Testzone modifizieren Lichtes quantifiziert. Dabei wird zumeist das Licht der Leuchtquelle (zum Beispiel eine LED), welches von der Testzone entweder re flektiert oder absorbiert wird, durch eine oder mehrere Photodioden oder eine Kamera detektiert. Typischerweise besitzen Ausleseeinheiten mehrere LEDs, um die verschieden Test- und Kontrollzonen zu quantifizieren. Das gemessene Sig nal wird durch das Gerät anschließend in eine Analytkonzentration umgewandelt und dem Anwender auf einem Display angezeigt. Zum Beispiel werden solche Ausleseeinheiten in EP 1484601, KR102005597B1, US 20150094227, US 7,297,529 beschrieben. Ein typisches Problem von den beschrieben Lateral Flow Assays und der Quan tifizierung des Signals ist der beschränkte dynamische Bereich. LFA besitzen dabei nur einen Messbereich von ca. 1,5-2 log Stufen. Dies reicht für die Quan tifizierung einiger Analyten nicht aus. Beispielsweise ist es notwendig, das CRP im Blut im Konzentrationsbereich von 0,5 - 150 pg/ml und damit über einen Messbereich von 2,5 Log-Stufen genau zu quantifizieren. Die dafür beschrieben LFA Verfahren sind zumeist unzureichend.
Einige Maßnahmen wurden bereits beschrieben, um bessere Messbereiche zu erzielen, zum Beispiel durch fluoreszenzbasierte Markierungen und das Auswer ten der Fluoreszenzintensität der Testbanden (US20100135857A1; US10048259B2). Andere Erfindungen beschreiben Signalverstärkungsreaktio nen (US20160169887A1) oder benutzen Photothermische Sensoren als Detek tionssystem und Metallnanopartikel als Markierungsmoleküle, um die Sensitivi- tät und den dynamischen Bereich zu erhöhen (US10094823B2; US9625385B2; US10094823B2). Dabei können mit den genannten Methoden verbesserte Mess bereiche erzielt werden. Allerdings erhöht sich dabei der messtechnische Auf wand und damit die Kosten des Auslesegerätes.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, einen Lateral Flow Assay bereit zu stellen, der eine Quantifizierung eines Analyten erlaubt, insbesondere über ei nen größeren Messbereich als im Stand der Technik.
Gelöst wird die Aufgabe durch einen Lateral Flow Assay mit
- eine Probenzone zum Aufträgen einer Probe
- einer Reaktionszone mit ersten Affinitätsmolekülen
- einer Nachweiszone mit zweiten Affinitätsmolekülen dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Affinitätsmoleküle eine optisch mess bare Markierung aufweisen, die mindestens 2 verschiedene Absorptionsmaxima unterschiedlicher Höhe aufweist, die zur Quantifizierung verwendet werden.
Der erfindungsgemäße Lateral Flow Assay weist, wie im Stand der Technik üb lich, eine Probenzone, eine Reaktionszone und mindestens eine Nachweiszone auf.
In der Probenzone wird die Probe aufgetragen, um in der sich daran anschlie ßenden Reaktionszone erste Affinitätsmoleküle zu binden. In der Nachweiszone sind zweite Affinitätsmoleküle immobilisiert, so dass sich dort im Sinne eines Sandwich-Assays Komplexe aus ersten Affinitätsmolekülen, Analyt und zweiten Affinitätsmolekülen anreichern.
Entscheidend ist, dass die ersten Affinitätsmoleküle eine optisch messbare Mar kierung aufwerfen, die zwei verschiedene Absorptionsmaxima unterschiedlicher Höhe aufweist, die so zur Quantifizierung verwendet werden können.
Wichtig ist, dass die beiden Absorptionsmaxima eine unterschiedliche Höhe auf weisen, so dass sie, je nach Konzentration des Analyten, unterschiedlich hohe Absorptionswerte geben.
Erfindungsgemäß wird bei beiden Absorptionsmaxima gemessen. Je nach Kon zentration des Analyten sind entweder die ersten Messungen im Bereich des ersten Absorptionsmaximum oder die im zweiten Absorptionsmaximum in einem Bereich, der eine gute und sichere Quantifizierung erlaubt.
Die ersten und zweiten Affinitätsmoleküle können beispielsweise Antikörper o- der Antikörperfragmente sein. Auch Protein A, Protein G, Streptavidin, Neutra- vidin oder Derivate davon sind geeignet. Dem Fachmann sind weitere geeignete Affinitätsmoleküle bekannt. Die optisch messbare Markierung wird bevorzugt durch Markierungsverbindun gen erreicht, die aus Farbstoffen, Nanomaterialen oder Kombinationen hiervon ausgewählt sind.
Als Nanomaterialien eignen sich insbesondere Metallnanomaterialien, Latexna- nomaterialien, cellulosebasierte Nanomaterialen, Silica-Nanomaterialien oder Kombinationen hiervon.
Die optisch messbare Markierung mit zwei verschiedenen Absorptionsmaxima kann zum einen durch zwei verschiedene Markierungsverbindungen erreicht werden. Beispielsweise könnte die Markierung ein blauer und ein roter Farbstoff sein, die Absorptionsmaxima unterschiedlicher Höhe aufweisen.
Bevorzugt wird jedoch eine Markierungsverbindung verwendet, die mindestens zwei verschiedene Absorptionsmaxima unterschiedlicher Höhe aufweist.
Die erfindungsgemäß eingesetzten zwei verschiedenen Absorptionsmaxima lie gen bevorzugt mindestens 50 nm auseinander, bevorzugt mindestens 70 nm auseinander und noch mehr bevorzugt mindestens 100 nm auseinander.
Bevorzugt liegt das eine Absorptionsmaximum mindestens 1,5 mal höher als das andere Absorptionsmaximum. Bevorzugt ist das Verhältnis mindestens 2 oder mindestens 3. Es ist dabei egal, ob das Absorptionsmaximum, das höher ist als das andere Absorptionsmaximum, bei höherer oder niedriger Wellenlänge liegt.
Gemessen wird die Absorbanz oder Transmission der Markierungsmoleküle bei beiden Absorptionsmaxima. Durch die unterschiedliche Höhe der beiden Absorp tionsmaxima werden unterschiedliche Messbereiche erhalten.
Der Lateral Flow Assay der vorliegenden Erfindung kann auch weitere übliche Merkmale enthalten, beispielsweise eine Kontrollzone, in der die korrekte Funktionsweise des Tests überprüft wird und eine Saugzone, um das Wandern der Proben zu fördern.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Quantifizierung eines Ana- lyten umfassend die Schritte
- Aufträgen einer Probe auf den erfindungsgemäßen Lateral Flow Assay
- Messen des Signals bei mindestens zwei Wellenlängen
- Berechnen der Konzentration des Analyten.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung zum Auslesen des erfin dungsgemäßen Lateral Flow Assay umfassend
- mindestens eine Beleuchtungseinrichtung mit mindestens zwei Wellenlängen
- eine Haltevorrichtung für einen Lateral Flow Assay
- mindestens eine Detektionseinrichtung zur Messung der mindestens zwei Wellenlängen der Beleuchtungseinrichtung
- eine Auswerteinheit zur Berechnung der Konzentration des Analyten.
Üblicherweise werden bei LFAs zur Markierung Detektionskonjugate eingesetzt, welche über ein definiertes Absorptionsmaximum verfügen, wie zum Beispiel Goldnanopartikel mit einem Absorptionsmaxima zwischen 520-540 nm. Mit ei nem Auslesegerät kann die Färbung der Testzone, verursacht durch zum Bei spiel Goldnanopartikel quantifiziert werden. Dabei ist der dynamische Bereich des Verfahrens dadurch determiniert, das die Färbung in der Testzone mit we nigen Nanopartikeln gesättigt ist und von den Auslesegeräten nicht mehr auf gelöst werden kann. Dieses Problem tritt auch bei Verwendung von anderen gefärbten Nanomaterialen wie beispielsweise Latexnanopartikeln, Cellulose-ba- sierte Nanopartikeln oder anderen Metall-basierten Metallnanopartikeln auf. Bei Verwendung von weniger gefärbten Nanomaterialien kann der dynamische Be reich zu höheren Konzentrationen verschoben werden, wobei dann die Sensitivität des Verfahrens geringer wird und sich die Gesamtbreite des dyna mischen Bereichs nicht ändert.
In dem hier beschrieben Verfahren werden Markierungskomplexe eingesetzt, welche über mindestens zwei verschiedene Absorptionsmaxima bei deutlich un terschiedlichen Wellenlängen verfügen. Außerdem unterscheiden sich die Ab sorptionsmaxima des Markierungskomplexes in der Höhe. Damit können die Markierungskomplexe durch optische Messverfahren unterschiedlich sensitiv detektiert werden. Bei geringen Mengen des Markierungskomplexes, zum Bei spiel wenn die Menge an Analyt der Nachweisgrenze des Messverfahrens ent spricht, wird nur das stärkere Absorptionsmaximum des Markierungskomplexes erkannt, wobei das zweite, schwächer Absorptionsmaximum nicht detektiert werden kann. Bei höheren Konzentrationen des Markierungskomplexes ist die quantifizierbare Menge des Markierungskomplexes entsprechend vom Messsys tem limitiert. Das Messsystem kann ab einer entsprechenden Menge an Markie rungskomplex das optische Signal unterschiedlicher Mengen des Markierungs komplex nicht mehr auflösen. Stehen zwei Absorptionsmaxima desselben Mar kierungskomplexes zur Verfügung, kann bei Verwendung des schwächeren Ab sorptionsmaxima die Menge des Markierungskomplexes noch quantifiziert wer den, wenn das Messverfahren bei Messung des stärkeren Absorptionsmaxima bereits die Sättigung erlangt hat.
Die verwendeten Markierungen verfügen dabei über zwei oder mehrere Absorp tionsmaxima im Bereich zwischen 200-2000 nm. Typischerweise werden Gold- Nanostäbchen, Silber-Nanoplättchen oder Silica-Nanoshells eingesetzt. Es kön nen aber auch Latex oder Silica-Nanopartikel verwendet werden, die verschie dene Farbstoffe enthalten. Die verschiedenen Absorptionsmaxima liegen dabei typischerweise um mindestens 100 nm auseinander. In Figur 2 sind beispielhaft Spektren von Gold-Nanostäbchen mit unterschiedliche Absorptionsspektren dargestellt. Diese Nanostäbchen verfügen über ein Absorptionsmaxima im Be reich zwischen 520-540 nm und ein zweites Absorptionsmaxima im Bereich zwi schen 600-800 nm. Die Form und die Größe der Markierung können sich für die Anwendung unterscheiden, bevorzugt ist aber, dass die Materialien homogen in Größe und Form innerhalb eines Verfahrens sind. Die Gold-Nanostäbchen der beispielhaft gezeigten Spektren haben dabei eine Länge zwischen 50-70 nm und ein Durchmesser von 10-20 nm.
Diese Nanomaterialien sind außerdem an ein oder mehrere Affinitätsmoleküle auf der Oberfläche gebunden. Dabei wurden die Liganden entweder durch pas sive Adsorption oder kovalent durch chemische Reaktionen an die Nanomateri alien gebunden. Als Ligand werden dabei zum Beispiele Antikörper eingesetzt.
Ein weiterer Aspekt des Verfahrens stellt ein Auslesegerät dar, welches die Menge des Markierungskomplexen in der Testzone quantifizieren kann. Dabei wird die Menge des in der Testzone angereicherte Markierungskomplexes bei zwei verschieden Wellenlängen quantifiziert. Eine bevorzugte Vorrichtung be sitzt dabei eine oder mehrere Lichtquellen, welches Licht entsprechend der ver schiedenen Wellenlänge der Absorptionsmaxima emittiert. Außerdem besitzt das Gerät einen oder mehrere Detektoren der das Licht, welches von der Test zone reflektiert oder absorbiert, detektiert. Der Detektor kann dabei eine Ka mera sein, welche die Testzone abbildet und anschließend die Verfärbung der Testbande durch das Gerät anschließend quantifiziert wird. Eine andere Mög lichkeit für einen Detektor sind Photodioden, welche das Licht, das auf der Membran reflektiert oder absorbiert wird, detektieren. Um Licht verschiedenen Wellenlängen zu emittieren können entweder verschiedene LED eingesetzt wer den oder es wird eine Lichtquelle eingesetzt und im Anschluss das emittierte Licht durch optische Bauteile wie optische Filter oder Gitter so modifiziert, das nur noch Licht definierter Wellenlängen die Testzone erreicht. Das Auslesegerät quantifiziert dabei die Menge des Markierungskomplexes unter Anwendung von Licht der beiden verschiedenen Wellenlängen. Die Wellenlängen des Lichtes ent sprechen dabei den Absorptionsmaxima des Markierungskomplexes. Durch An wendung geeigneter Algorithmen kann anschließend das Auslesegerät die Kon zentration des Analyten berechnen. Eine schematische Darstellung ist Figur 1 gezeigt. Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Quantifizierung eines Ana- lyten umfassend die Schritte:
Aufträgen einer Probe auf einen Lateral Flow Assay mit einer Probenzone zum Aufträgen einer Probe einer Reaktionszone mit ersten Affinitätsmolekülen einer Nachweiszone mit zweiten Affinitätsmolekülen wobei die ersten Affinitätsmoleküle eine optisch messbare Markierung aufwei sen, die mindestens 2 verschiedene Absorptionsmaxima unterschiedli cher Höhe aufweist, die zur Quantifizierung verwendet werden
Messen des Signals bei mindestens zwei Wellenlängen, wobei die mindes tens zwei Wellenlängen Absorptionsmaxima der optischen Markierung ent sprechen
Berechnen der Konzentration des Analyten.
Beispiele
Beispiel 1
Synthese und Eigenschaften von Gold Nanostäbchen
Da Gold-Nanostäbchen über Plasmonenresonanz verfügen, welche durch die Größe der Stäbchen beeinflusst werden können, können die Absorptionseigen schaften durch die Synthesebedingungen gesteuert werden. Das Absorptions spektrum eines 10 nm im Durchmesser und 40 nm langen Goldnanostäbchens besitzt zwei Absorptionsmaxima. Ein Absorptionsmaximum, verursacht durch die quer gerichtete Oberflächen Plasmonenresonanz des Gold-Nanostäbchens, liegt bei 525 nm. Das zweite Absorptionsmaximum, verursacht durch die längs gerichtete Oberflächenplasmonenresonanz liegt bei 800 nm. Dabei besitzt das Absorptionsmaxima bei 800 nm eine 4,1 mal so hohe Absorption wie das Ma- xima bei 525 nm. Markierunaskomplex
Diese Goldnanostäbchen werden zur Herstellung eines Detektionsmoleküls ver wendet. Dazu wurden anti-CRP Antikörper passiv an die Citrat-stabilisierten Gold-Nanostäbchen gebunden, indem der Antikörper direkt zu einer Lösung der Nanostäbchen gegeben wurde. Nach einer 30-minütigen Inkubation wurden restliche Bindungsstellen auf den Nanostäbchen mit BSA geblockt und der Mar kierungskomplex durch Zentrifugation bei 8000 g und erneutem re-suspendie- ren in Wasser gewaschen. Die Lösung wurde auf eine OD 10 bei 525 nm einge stellt.
Nanostäbchen-basierter LFA
Die Einbringung des Markierungskomplexes in eine Glasfasermembran erfolgte mit einem Airjet Quanti Modul der Biodot XYZ Series Dosierplattform. Mit der Sprühfunktion wurde der Markierungskomplex mit einem Druck von ca. 4 psi und einer Dosierrate von 10 pl cm-1 auf das Pad gesprüht. Anschließend wurde die Glasfasermembran mit dem eingebrachten Markierungskomplex (Reaktions zone) für mindestens zwei Stunden bei 37 °C im Trockenschrank getrocknet. Zur Beschichtung einer Nitrocellulosemembran wurden mit der Cavro Einheit der Biodot Dosierplatform 1 pg anti-CRP Ak/mI in PB Puffer mit einer Dosierrate von 1 mI/cm aufgegeben. Nach der Beschichtung wurde die Membran für 1 h bei 37°C getrocknet. Für die Herstellung von gebrauchsfertigen Teststreifen wurden ein Probenzone, eine Reaktionszone, eine Nachweiszone und eine Saugzone auf eine Backing Card geklebt und anschließend in 4 mm breite Streifen geschnit ten.
Ausleseaerät
Das Auslesegerät besteht aus eine Beleuchtungsquelle, welche über zwei LED mit den Wellenlängen 525 nm und 800 nm verfügt. Diese LED wurden so plat ziert, dass sie das Licht gleichmäßig auf die Nachweiszone des Lateral Flow As- says emittieren. Über der Nachweiszone befindet sich eine Kamera, die ein Bild von der Nachweiszone aufnimmt. Das Gerät nimmt sowohl ein Bild mit der Ka mera bei einer Beleuchtung mit 525 nm, als auch ein Bild mit einer Beleuchtung bei 800 nm auf. Anschließend kann durch einen Algorithmus aus den Bildern eine Konzentration des CRP in der Probe berechnet werden.
Verfahren
Es werden 100 mI eine Probe auf die Probenzone des LFA aufgegeben und 10 Minuten inkubiert. Nach 10 Minuten wird die Verfärbung der Nachweiszone mit dem Auslesegerät vermessen und die CRP Konzentration ausgegeben. Dabei konnten über einen Messbereich von 0,5-200 pg CRP mit einem Variationskoef fizienten von <15% CRP in den CRP-haltigen Proben nachgewiesen werden. Fi gur 3 zeigt dabei den Messbereich des Verfahrens bei Anwendung von 525 nm als Detektionswellenlänge und bei Anwendung von 800 nm als Wellenlänge so wie den resultierenden gesamten Messbereich.
Beispiel 2
Es wurden Silbernanomaterialien, welche über zwei verschiedene Absorptions- maxima aufgrund der Plasmonenresonanz verfügen hergestellt. Ein Absorpti onsmaximum lag bei 400 nm und das zweite bei 600 nm. Dabei besitzt das Absorptionsmaximum bei 600 nm eine 5 mal so hohe Absorption wie das Maxi mum bei 400 nm.
An diese Silbernanomaterialien wurden anti-TSH Antikörper konjugiert und die ses Konjugat anschließend als Markierungskomplex verwendet. Für einen Late ral Flow Assay wurde eine Nitrocellulosemembran ebenfalls mit anti-TSH Anti körpern beschichtet.
Der Markierungskomplex wurde zu der Probe gegeben und die beschichtete Nit rocellulose wurde in diese Probe eingetaucht, 5 Minuten inkubiert und anschlie ßend mit einem Auslesegerät, welches den in der Nachweiszone angereicherten Markierungskomplex bei zwei verschiedenen Wellenlängen quantifizieren kann, ausgewertet. Dabei konnten über einen Messbereich von 0,05-100 mIII/ml TSH mit einem Variationskoeffizienten von <15% TSH in den TSH-haltigen Proben nachgewiesen werden. Beispiel 3
Es wurden zwei verschiedene Farbstoffe mit unterschiedenen Absorptionsma- xima und Extinktionskoeffizienten in Silica-Nanopartikel eingeschlossen. Ein Ab sorptionsmaximum lag bei 450 nm und das zweite bei 620 nm. Dabei besitzt das Absorptionsmaximum des Silicananopartikels bei 620 nm eine 2,5 mal so hohe Absorption wie das Maxima bei 450 nm.
An diese Silcananopartikel wurden kovalent anti-IgE Antikörper immobilisiert. Dieser Markierungskomplex wurde in eine Glasfasermembran eingebracht und im Vakuum getrocknet. Zur Beschichtung einer Nitrocellulosemembran wurde 1 pg/cm einer Mischung von vier bekannten Eiallergene (Ovomucoid, Ovalbumin, Ovotransferrin und Lysozyme) in PBS Puffer auf eine Nitrocellulosemembran do siert. Für die Herstellung von gebrauchsfertigen Teststreifen wurden eine Pro benzone, eine Nachweiszone, eine Reaktionszone und eine Saugzone auf eine Backing Card geklebt und anschließend in 4 mm breite Streifen geschnitten. Diese Teststreifen wurden in ein Gehäuse platziert.
Nach Aufgabe von 100 pl einer Probe auf die Probenzone wurde der Test in die Ausleseeinheit platziert. Die Ausleseeinheit verfügt über zwei LED mit den Wel lenlängen 450 nm und 620 nm und kann das reflektierte Licht bei 450 nm als auch bei 620 nm der Testzone durch eine Photodiodenzeile detektieren. Dabei konnten über einen Messbereich von 2-5000 kU/l IgE mit einem Variationsko effizienten von <15% in den Eiallergen-spezifischen IgE-haltigen Proben nach gewiesen werden.

Claims

Patentansprüche
1. Lateral Flow Assay mit einer Probenzone zum Aufträgen einer Probe einer Reaktionszone mit ersten Affinitätsmolekülen einer Nachweiszone mit zweiten Affinitätsmolekülen dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Affinitätsmoleküle eine optisch messbare Markierung aufweisen, die mindestens 2 verschiedene Absorptionsmaxima unterschiedlicher Höhe aufweist, die zur Quantifizierung verwendet werden.
2. Lateral Flow Assay nach Anspruch 1 wobei die ersten und die zweiten Affi nitätsmoleküle unabhängig voneinander Antikörper, Antikörperfragmente, Antigene, Antigenfragmente, Antigen-ähnliche Strukturen, Protein A, Pro tein G, Streptavidin oder Neutravidin sind.
3. Lateral Flow Assay nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die optische messbare Markierung durch Markierungsverbindungen ausgewählt aus Farbstoffen, Nanomaterialien oder Kombinationen hiervon erfolgt.
4. Lateral Flow Assay nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanomaterialen Metallnanomaterialien, Latexnanomaterialien, cellulose basierte Nanomaterialen, Silica-Nanomaterialien oder Kombinationen hier von sind.
5. Lateral Flow Assay nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die optische messbare Markierung zwei verschiedene Markierungsverbindun gen umfasst.
6. Lateral Flow Assay nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die optische messbare Markierung eine Markierungsverbindungen umfasst, die mindestens 2 verschiedene Absorptionsmaxima unterschiedlicher Höhe aufweist.
7. Lateral Flow Assay nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zu sätzlich eine Kontrollzone vorhanden ist.
8. Lateral Flow Assay nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zu sätzlich eine Saugzone vorhanden ist.
9. Lateral Flow Assay nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zwei der mindestens zwei Absorptionsmaxima einen Abstand von mindestens 100 nm aufweisen.
10. Lateral Flow Assay nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ei nes der mindestens zwei Absorptionsmaxima mindestens 1,5 mal höher ist als das Absorptionsmaximum eines anderen Absorptionsmaximums.
11. Verfahren zur Quantifizierung eines Analyten umfassend die Schritte
Aufträgen einer Probe auf einen Lateral Flow Assay nach einem der Ansprüche 1 bis 10
Messen des Signals bei mindestens zwei Wellenlängen, wobei die min destens zwei Wellenlängen Absorptionsmaxima der optischen Markie rung entsprechen
Berechnen der Konzentration des Analyten.
12. Vorrichtung zum Auslesen des Lateral Flow Assay nach einem der Ansprü che 1 bis 10 umfassend mindestens eine Beleuchtungseinrichtung mit mindestens zwei Wel lenlängen eine Haltevorrichtung für einen Lateral Flow Assay mindestens eine Detektionseinrichtung zur Messung der mindestens zwei Wellenlängen der Beleuchtungseinrichtung eine Auswerteinheit zur Berechnung der Konzentration des Analyten.
13. Verwendung eines Lateral Flow Assay nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten durch Mes sen der optischen Absorption bei zwei verschiedenen Wellenlängen die Absorptionsmaxima der optischen Markierung entsprechen.
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