JP2015500228A - 抗がん融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
ドメイン(a)と少なくとも1つのドメイン(b)を含む融合タンパク質であって、ドメイン(a)は、フラグメントがhTRAIL95より小さくない位置のアミノ酸から始まる、hTRAILタンパク質配列の機能的フラグメントであるか、または、少なくとも70%の配列同一性、好ましくは85%の同一性を有し、かつアミノ酸hTRAIL281で終わる前記機能的フラグメントのホモログであり、ドメイン(b)は、タンパク質合成を阻害するエフェクターペプチドの配列であり、ここでドメイン(b)の配列が、ドメイン(a)のC末端またはN末端に付着している、前記融合タンパク質。この融合タンパク質は、がん疾患の処置に用いることができる。
Description
本発明は、治療的な融合タンパク質、特に組み換え融合タンパク質の分野に関する。より具体的には、本発明は、可溶性ヒトTRAILタンパク質の配列とタンパク質合成を阻害するペプチド毒素の配列のフラグメントを含む融合タンパク質、それらを含有する医薬組成物、治療における、特に抗がん剤としてのそれらの使用、ならびに、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、該ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、および、これらの発現ベクターを含有する宿主細胞に関する。
サイトカインファミリーのメンバーであるTRAILタンパク質(腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド(Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis Inducing Ligand))は、Apo2L(Apo2−リガンド)としても知られ、腫瘍細胞およびウイルスに感染した細胞におけるアポトーシスの強力なアクチベーターである。TRAILは、体内に天然に存在するリガンドである。TRAILタンパク質、そのアミノ酸配列、コードするDNA配列、およびタンパク質発現系は、EP0835305A1に初めて開示された。
TRAILタンパク質は、アポトーシス促進性の表面TRAIL受容体1および2(TRAIL−R1/R2)に結合し、続くこれらの受容体の活性化により、その抗がん活性を発揮する。これらの受容体は、DR4およびDR5(死受容体(death receptor)4および死受容体5)としても知られ、TNF受容体ファミリーのメンバーであり、様々なタイプのがん細胞に過剰発現されている。これらの受容体の活性化は、サプレッサー遺伝子p53に非依存的なアポトーシスの外部シグナリング経路を誘導することができ、これは、活性化されたカスパーゼ8により、実行型(executive)カスパーゼの活性化と、それによる核酸の分解をもたらす。TRAILの活性化の間に放出されるカスパーゼ8はまた、切断型Bidタンパク質の放出を引き起こすこともでき、Bidタンパク質はミトコンドリアへ移行されて、ここでチトクロムcの放出を刺激し、よって死受容体からのアポトーシスのシグナルが間接的に増幅される。
TRAILは、このタンパク質に抵抗性を示す健常細胞においてはアポトーシスを本質的に誘導することなく、腫瘍細胞に対して選択的に作用する。したがって、血液悪性腫瘍および固形腫瘍を含む様々なタイプの広範な腫瘍細胞には作用するが、正常細胞には危害を加えず、潜在的に比較的わずかな副作用しか及ぼさない抗がん剤として、TRAILの極めて大きな可能性が認識された。
TRAILは、このタンパク質に抵抗性を示す健常細胞においてはアポトーシスを本質的に誘導することなく、腫瘍細胞に対して選択的に作用する。したがって、血液悪性腫瘍および固形腫瘍を含む様々なタイプの広範な腫瘍細胞には作用するが、正常細胞には危害を加えず、潜在的に比較的わずかな副作用しか及ぼさない抗がん剤として、TRAILの極めて大きな可能性が認識された。
TRAILタンパク質は、281アミノ酸の長さを有するII型膜タンパク質である。アミノ酸残基114−281を含むその細胞外領域は、プロテアーゼによる切断により20kDaサイズの可溶性sTRAIL分子を形成し、これも生物学的に活性である。TRAILおよびsTRAILの両方の形態は、標的細胞上に存在するTRAIL受容体との相互作用を介して、アポトーシスの引き金を引く能力がある。TRAIL分子の可溶性部分の強い抗腫瘍性活性と、極めて低い全身毒性とが、細胞株テストを使用して実証された。また、hTRAILのアミノ酸114−281に相当するアミノ酸配列を有し、INNの下デュラナミン(dulanermin)で知られる、組み換えヒト可溶性TRAIL(rhTRAIL)を用いた予備的なヒト臨床研究も、その良好な耐性と用量制限毒性がないことを示した。
例えばEP 1 688 498において、hTRAIL122−281の組み換え円順列変異体に対して近年報告されたように、114−281より短いTRAILのフラグメントもまた、膜の死受容体と結合し、これらの受容体を介してアポトーシスを誘導することができる。
今までに報告された肝細胞に対する組み換えTRAILタンパク質の毒性効果は、修飾、すなわちポリヒスチジンタグの存在と関係しているように思われ、その上、タグがないTRAILは全身毒性がないことを示した。
今までに報告された肝細胞に対する組み換えTRAILタンパク質の毒性効果は、修飾、すなわちポリヒスチジンタグの存在と関係しているように思われ、その上、タグがないTRAILは全身毒性がないことを示した。
しかしながら、患者に対する臨床試験において、単独療法としてのTRAILの実際の有効性は低いことが証明された。また問題となるのは、多くのがん細胞が示す、TRAILに対する本来の抵抗性または獲得抵抗性であった(例えばWO2007/022214を参照)。抵抗性は様々な機序による可能性があり、がんのタイプに特異的であるか、または患者に依存性である(Thorburn A, Behbakht K, Ford H. TRAIL receptor-targeted therapeutics: resistance mechanisms and strategies to avoid them. Drug Resist Updat 2008; 11: 17-24)。この抵抗性が、TRAILの抗がん剤としての有用性を制限する。TRAILに対する抵抗性の機序は完全には理解されていないが、これは、細胞表面受容体レベルからシグナリング経路内の実行型カスパーゼに及ぶTRAIL誘導アポトーシス経路の様々なレベルで現れ得ると考えられる。
この低効率性とTRAILに対する腫瘍の抵抗性とを克服するために、放射線治療剤および化学治療剤を用いた様々な併用療法が考案され、それによってアポトーシスの相乗効果が得られた(WO2009/002947;A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews 14 (2003) 337-348;RK Srivastava, Neoplasis, Vol 3, No 6, 2001, 535-546、Soria JC et al., J. Clin. Oncology, Vol 28, No 9 (2010), p. 1527-1533)。選択された従来の化学治療剤(パクリタキセル、カルボプラチン)とモノクローナル抗VEGF抗体との組み合わせにおける、がん処置のためのrhTRAILの使用は、WO2009/140469に記載されている。しかしながら、かかる組み合わせは必然的に、従来の化学治療または放射線治療の周知の欠陥を暗示する。しかし従来の技術は、TRAILタンパク質を他のタンパク質またはそのフラグメントと融合させることにより得た、TRAILに対する細胞の抵抗性を消滅させることを示唆するいかなるデータについても沈黙している。
さらに、TRAIL治療に関連する問題は、その低い安定性および投与後の体内からの急速な排出であるように見える。
抗がん療法はまた、腫瘍細胞のタンパク質合成の阻害に向けられてもよい。腫瘍細胞の増殖を、細胞内のタンパク質合成を阻害することによって阻害する有益な効果が知られている。がん療法としてまた補完的がん療法として、タンパク質合成のプロセスを阻害または調節する物質の臨床的使用の試みがなされている。
細胞タンパク質の合成を阻害する物質は、細菌、真菌または植物由来の触媒ペプチドまたはタンパク質毒素である。触媒ドメインのみを保有し、結合ドメインを欠いている一本鎖毒素(ヘミ毒素(hemitoxin)としても知られている)は、それらの天然の遊離形態において、細胞に対して実質的に非毒性である。2つ以上の鎖からなる毒素(ホロ毒素としても知られる)は、触媒ドメインに加えて結合ドメインを有するが、細胞の選択性を欠いているため、全身投与後に健常組織に対する望ましくない毒性および多くの副作用を示す。
抗がん療法はまた、腫瘍細胞のタンパク質合成の阻害に向けられてもよい。腫瘍細胞の増殖を、細胞内のタンパク質合成を阻害することによって阻害する有益な効果が知られている。がん療法としてまた補完的がん療法として、タンパク質合成のプロセスを阻害または調節する物質の臨床的使用の試みがなされている。
細胞タンパク質の合成を阻害する物質は、細菌、真菌または植物由来の触媒ペプチドまたはタンパク質毒素である。触媒ドメインのみを保有し、結合ドメインを欠いている一本鎖毒素(ヘミ毒素(hemitoxin)としても知られている)は、それらの天然の遊離形態において、細胞に対して実質的に非毒性である。2つ以上の鎖からなる毒素(ホロ毒素としても知られる)は、触媒ドメインに加えて結合ドメインを有するが、細胞の選択性を欠いているため、全身投与後に健常組織に対する望ましくない毒性および多くの副作用を示す。
より高い特異性を達成するために、毒素またはタンパク質毒素の触媒ドメインを、腫瘍細胞上に存在するマーカーに選択的に結合する担体−リガンドに結合(conjugate)させる。タンパク質を標的とするドメインまたはリガンドの使用は、タンパク質の毒性ドメインの、細胞への特異的送達を可能にする。免疫毒素は、毒素が、抗体、成長因子、インターロイキン、および腫瘍壊死因子などの免疫系タンパク質である結合リガンドに結合している、コンジュゲートまたは融合タンパク質である。成長因子VEGF、FGF、およびPDGFと、リボソーム活性化タンパク質(RIP毒素)の群からの毒素のコンジュゲート、TNFとRIP毒素のコンジュゲート、IL−2とPsuedomonas外毒素のコンジュゲート、IL−13とPsuedomonas外毒素のコンジュゲート、ならびにIL2−ジフテリア毒素のコンジュゲートを含有する処置において使用される調製物Ontake(登録商標)などの、既知のコンジュゲートが存在する。別の例としては、ゲロニンおよびアブリンなどの毒素と、インテグリン、フィブロネクチン、I−CAMおよびグランザイムBのコンジュゲートのほか、エブリン(ebulin)とトランスフェリンのコンジュゲートなどがある(Hall, W.A. Targeted toxin therapy for malignant astrocytoma. Neurosurgery 2000, 46, 544-551)。WO2002/069886およびUS2003176331には、毒素の標的化送達のための、ゲロニンのRIP毒素と第2のポリペプチドのコンジュゲートの可能性が言及されている。このような第2ポリペプチドの多くの可能なタイプの中でTRAILタンパク質も言及されているが、しかし、このタイプのキメラの構造と特性に関する任意の詳細は開示されている。
WO2008052322には、RIP毒素の担体として細胞表面構造に結合する、非免疫グロブリンポリペプチドの使用の可能性が記載されている。WO2008080218には、多数挙げられたTRAILの1つを含むサイトカインが、改変された毒素の担体として作用し得ることが示されているが、説明は、TRAILおよび毒素を含む治療的に有効な分子およびその特性を定義することができるであろう任意の情報を欠いている。
U.S. 6,627,197には、タンパク質合成を不活性化する毒素、HIVプロテアーゼにより切断可能なペプチド、細胞表面に結合する要素としてのレクチン、標的フラグメント、および疎水性物質を含む構築物が、抗ウイルス剤として適用されることが記載されている。
U.S. 6,627,197には、タンパク質合成を不活性化する毒素、HIVプロテアーゼにより切断可能なペプチド、細胞表面に結合する要素としてのレクチン、標的フラグメント、および疎水性物質を含む構築物が、抗ウイルス剤として適用されることが記載されている。
従来技術ではまた、キメラタンパク質における、特異的プロテアーゼによって認識される切断部位の使用が知られており、これは腫瘍環境内で毒素を放出させ、その結果、それらの腫瘍細胞への内部移行を可能にする。例えば、US7,252,993には、リシンの毒性フラグメントと、標的ペプチド―HIVプロテアーゼによって認識されるリンカーを介して結合したDP178ケモカインとを含有する、キメラタンパク質を開示している。しかしこの記述は、TRAIL−毒素キメラの構造、特性および適用に関する詳細な情報を提供しない。
本発明は、ペプチド毒素のエフェクターペプチドとしての毒性特性と、TRAILタンパク質のアポトーシス促進特性およびがん細胞上に存在する構造を特異的に標的とすることを組み合わせた、新規な融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は、TRAILに由来する結合ドメイン、および、タンパク質合成阻害特性を有するエフェクターペプチドとしての、ペプチド毒素ドメインを含む。
本発明は、ペプチド毒素のエフェクターペプチドとしての毒性特性と、TRAILタンパク質のアポトーシス促進特性およびがん細胞上に存在する構造を特異的に標的とすることを組み合わせた、新規な融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は、TRAILに由来する結合ドメイン、および、タンパク質合成阻害特性を有するエフェクターペプチドとしての、ペプチド毒素ドメインを含む。
hTRAIL由来のドメインの存在のために、本発明のタンパク質はがん細胞に選択的に指向され、がん細胞において、タンパク質の要素はその効果を発揮する。
具体的には、エフェクターペプチドとしてのペプチド毒素は、がん細胞におけるタンパク質合成プロセスを阻害する。本発明のタンパク質の腫瘍環境への送達は、身体の健常細胞に対する毒性や副作用の最小化、ならびに投与頻度の低減を可能とする。さらに、本発明によるタンパク質を使用した標的化療法は、高い毒性と高用量を投与する必要性とに起因するタンパク質合成の阻害に基づく、以前から知られている非特異的療法の低効率の問題を回避することができる。
具体的には、エフェクターペプチドとしてのペプチド毒素は、がん細胞におけるタンパク質合成プロセスを阻害する。本発明のタンパク質の腫瘍環境への送達は、身体の健常細胞に対する毒性や副作用の最小化、ならびに投与頻度の低減を可能とする。さらに、本発明によるタンパク質を使用した標的化療法は、高い毒性と高用量を投与する必要性とに起因するタンパク質合成の阻害に基づく、以前から知られている非特異的療法の低効率の問題を回避することができる。
本発明の融合タンパク質は、多くの場合、可溶性hTRAILおよびその配列のフラグメントを含むその変異体よりも効き目があることが判明した。これまで、本発明の融合タンパク質に使用されるエフェクターペプチドは、好ましくない動態、非特異的プロテアーゼによる急速な分解、または経路の活性化の正しい順序(標的部位におけるエフェクターペプチドの適切な作用を可能にするのに必要である)の欠如により引き起こされる体内への蓄積のために、医学の分野ではほとんど使用されていなかった。融合タンパク質へのエフェクターペプチドの取り込みは、それらの作用が所望される部位への、それらの選択的な送達を可能にする。さらに、エフェクターペプチドの付着は、タンパク質の質量を増やし、その結果半減期が延長し、腫瘍中のタンパク質貯留が増加し、その効率が増進する。加えて、新規の融合タンパク質はまた、多くの場合、TRAILに対する自然の抵抗性または誘導抵抗性にも打ち勝つ。
図の説明
次に、本発明を、図面の図を参照して詳細に説明する。
図1は、rhTRAIL114−281と比較した、例18a、例25a、例37aおよび例42aの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんColo205を負ったHsdCpb:NMRI-Foxn1 ninマウスにおける腫瘍体積変化(初期ステージの%)を示す。
図2は、rhTRAIL114−281と比較した、例18a、例25a、例37aおよび例42aの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんColo205を負ったHsdCpb:NMRI-Foxn1 ninマウスにおける腫瘍成長阻害値(%TGI)を示す。
図3は、rhTRAIL114−281と比較した、例18aおよび例35aの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんA549を負ったCby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスにおける腫瘍体積変化(初期ステージの%)を示す。
図4は、rhTRAIL114−281と比較した、例18aおよび例35aの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんA549を負ったCby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスにおける腫瘍成長阻害値(%TGI)を示す。
次に、本発明を、図面の図を参照して詳細に説明する。
本発明の詳細な説明
本発明は、融合タンパク質であって、
― フラグメントがhTRAIL95より小さくない位置のアミノ酸から始まる、可溶性hTRAILタンパク質配列の機能的フラグメントであるか、または、少なくとも70%の配列同一性、好ましくは85%の同一性を有し、かつアミノ酸hTRAIL281で終わる、前記機能的フラグメントのホモログである、ドメイン(a)、および
本発明は、融合タンパク質であって、
― フラグメントがhTRAIL95より小さくない位置のアミノ酸から始まる、可溶性hTRAILタンパク質配列の機能的フラグメントであるか、または、少なくとも70%の配列同一性、好ましくは85%の同一性を有し、かつアミノ酸hTRAIL281で終わる、前記機能的フラグメントのホモログである、ドメイン(a)、および
― タンパク質合成を阻害するエフェクターペプチドの配列である少なくとも1つのドメイン(b)であって、ここでドメイン(b)の配列が、ドメイン(a)のC末端および/またはN末端に付着されている前記ドメイン(b)、
を含み、ここで融合タンパク質が、細胞表面の炭水化物受容体に結合するドメインを含まない、前記融合タンパク質に関する。
を含み、ここで融合タンパク質が、細胞表面の炭水化物受容体に結合するドメインを含まない、前記融合タンパク質に関する。
「可溶性hTRAILの配列の機能的な可溶性フラグメント」という用語は、哺乳動物細胞において、該細胞の表面にあるその受容体に結合することで、アポトーシスシグナルを誘導する能力がある、可溶性hTRAILのかかるフラグメントのいずれをも意味するものと理解されるべきである。
TRAIL配列の少なくとも70%または85%の相同性の存在が、当該技術分野において知られているということもまた、当業者に十分理解されるだろう。
本発明の融合タンパク質におけるエフェクターペプチドのドメイン(b)は、hTRAILタンパク質でも、hTRAILタンパク質の一部またはフラグメントでもないことが理解されるべきである。
TRAIL配列の少なくとも70%または85%の相同性の存在が、当該技術分野において知られているということもまた、当業者に十分理解されるだろう。
本発明の融合タンパク質におけるエフェクターペプチドのドメイン(b)は、hTRAILタンパク質でも、hTRAILタンパク質の一部またはフラグメントでもないことが理解されるべきである。
本発明に従う「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって共に繋がった複数のアミノ酸から作られる分子として理解されるべきである。それゆえに、本発明による「ペプチド」という用語は、オリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含む。
本発明において、ペプチドのアミノ酸配列は、ペプチドのN末端(N末)からそのC末端(C末)へ向かう方向に、当該技術分野で採用されている従来の方式で、提示されるだろう。それゆえに、いかなる配列も、その線状で提示されたものの左側にN末端を、右側にC末端を有する。
本発明において、ペプチドのアミノ酸配列は、ペプチドのN末端(N末)からそのC末端(C末)へ向かう方向に、当該技術分野で採用されている従来の方式で、提示されるだろう。それゆえに、いかなる配列も、その線状で提示されたものの左側にN末端を、右側にC末端を有する。
数字番号の付いたTRAILの用語は、本明細書において、hTRAILの既知の配列中のこの番号のアミノ酸を示すために使用される。
本発明の融合タンパク質は、ドメイン(a)のC末端および/またはN末端に付着されたエフェクターペプチドのドメイン(b)を、少なくとも1つ組み込む。
特定の態様において、ドメイン(a)は、hTRAIL95からhTRAIL121までの範囲(両端を含む)のアミノ酸で始まり、アミノ酸hTRAIL281で終わる、hTRAIL配列のフラグメントである。
具体的に、ドメイン(a)は、hTRAIL95−281、hTRAIL114−281、hTRAIL116−281、hTRAIL119−281、hTRAIL120−281およびhTRAIL121−281に対応する配列からなる群から選択してもよい。hTRAIL95−281、hTRAIL114−281、hTRAIL116−281、hTRAIL119−281、hTRAIL120−281およびhTRAIL121−281が、GenBankのアクセッションNo. P50591で公開され、本発明の配列表に配列番号141として示されているhTRAILの既知の配列において、それぞれ95番、114番、116番、119番、120番および121番でマークされたアミノ酸で始まり、最後のアミノ酸281で終わるヒトTRAILタンパク質のフラグメントを表すことは当業者にとって明白であろう。
本発明の融合タンパク質は、ドメイン(a)のC末端および/またはN末端に付着されたエフェクターペプチドのドメイン(b)を、少なくとも1つ組み込む。
特定の態様において、ドメイン(a)は、hTRAIL95からhTRAIL121までの範囲(両端を含む)のアミノ酸で始まり、アミノ酸hTRAIL281で終わる、hTRAIL配列のフラグメントである。
具体的に、ドメイン(a)は、hTRAIL95−281、hTRAIL114−281、hTRAIL116−281、hTRAIL119−281、hTRAIL120−281およびhTRAIL121−281に対応する配列からなる群から選択してもよい。hTRAIL95−281、hTRAIL114−281、hTRAIL116−281、hTRAIL119−281、hTRAIL120−281およびhTRAIL121−281が、GenBankのアクセッションNo. P50591で公開され、本発明の配列表に配列番号141として示されているhTRAILの既知の配列において、それぞれ95番、114番、116番、119番、120番および121番でマークされたアミノ酸で始まり、最後のアミノ酸281で終わるヒトTRAILタンパク質のフラグメントを表すことは当業者にとって明白であろう。
他の具体的態様において、ドメイン(a)は、hTRAIL95より小さくない位置のアミノ酸で始まり、アミノ酸hTRAIL281で終わる可溶性hTRAILタンパク質配列の機能的フラグメントのホモログであって、その配列は、少なくとも70%、好ましくは85%、オリジナル配列と一致する。
この態様の具体的な変形において、ドメイン(a)は、hTRAIL95−281、hTRAIL114−281、hTRAIL116−281、hTRAIL119−281、hTRAIL120−281およびhTRAIL121−281に対応する配列からなる群から選択されるフラグメントのホモログである。
この態様の具体的な変形において、ドメイン(a)は、hTRAIL95−281、hTRAIL114−281、hTRAIL116−281、hTRAIL119−281、hTRAIL120−281およびhTRAIL121−281に対応する配列からなる群から選択されるフラグメントのホモログである。
hTRAILフラグメントのホモログは、このフラグメントのアミノ酸配列の変更/改変であると理解されるべきであり、ここで、1個のアミノ酸、2個のアミノ酸、3個のアミノ酸、4個のアミノ酸、5個のアミノ酸、6個のアミノ酸、およびアミノ酸の15%以下を含む、少なくとも1個のアミノ酸が変化しており、ここで、改変された配列のフラグメントは、hTRAIL配列の機能性、すなわち哺乳動物細胞において細胞表面の死受容体に結合してアポトーシスを誘導する能力を保存している。アミノ酸配列の改変は、例えば、アミノ酸の置換、欠失および/または付加を含んでもよい。
好ましくは、改変された配列を有するhTRAILフラグメントのホモログは、ネイティブな(native)hTRAILのフラグメントと比較して、死受容体のDR4(TRAIL−R1)またはDR5(TRAIL−R2)との改変された親和性を示す。
好ましくは、改変された配列を有するhTRAILフラグメントのホモログは、ネイティブな(native)hTRAILのフラグメントと比較して、死受容体のDR4(TRAIL−R1)またはDR5(TRAIL−R2)との改変された親和性を示す。
「改変された親和性」という用語は、上昇された親和性および/または、受容体の選択性が変更された親和性を指す。
好ましくは、改変された配列を有するhTRAILフラグメントのホモログは、ネイティブなhTRAILのフラグメントと比較して、死受容体のDR4およびDR5に対して上昇した親和性を示す。
特に好ましくは、改変された配列を有するhTRAILフラグメントのホモログは、死受容体DR4と比較して、死受容体DR5に対して上昇した親和性を示し、すなわちDR5/DR4選択性の上昇を示す。
また好ましくは、改変された配列を有するhTRAILフラグメントのホモログは、死受容体DR1(TRAIL−R3)および/またはDR2(TRAIL−R4)に対する親和性に関連して、該受容体DR4および/またはDR5に対する選択性が上昇したことも示す。
好ましくは、改変された配列を有するhTRAILフラグメントのホモログは、ネイティブなhTRAILのフラグメントと比較して、死受容体のDR4およびDR5に対して上昇した親和性を示す。
特に好ましくは、改変された配列を有するhTRAILフラグメントのホモログは、死受容体DR4と比較して、死受容体DR5に対して上昇した親和性を示し、すなわちDR5/DR4選択性の上昇を示す。
また好ましくは、改変された配列を有するhTRAILフラグメントのホモログは、死受容体DR1(TRAIL−R3)および/またはDR2(TRAIL−R4)に対する親和性に関連して、該受容体DR4および/またはDR5に対する選択性が上昇したことも示す。
死受容体のDR4およびDR5対する親和性ならびに/または選択性の上昇をもたらすhTRAILの改変は、例えば刊行物、Tur V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, Cool RH, Samali A, Serrano L, Quax WJ. DR4-selective tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) variants obtained by structure-based design. J. Biol. Chem. 2008 Jul 18;283(29):20560-8(DR4に対して上昇した選択性を有する、D218H突然変異を記載する)、または、Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP.Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis.2009 Jun;14(6):778-87(DR4に対して低下した親和性を有する、D269H突然変異を記載する)から、当業者に知られている。DR1およびDR2の受容体と比較した、DR4およびDR5から選択された1つの受容体に対する親和性の上昇、およびDR4と比較した受容体DR5に対する親和性の上昇をもたらすhTRAIL突然変異体は、WO2009077857およびWO2009066174にも記載されている。
好適な突然変異は、ネイティブなhTRALの位置における131、149、159、193、199、201、204、204、212、215、218および251からなる群から選択される1つまたは2つ以上の突然変異であり、特に、突然変異は、リジン、ヒスチジンもしくはアルギニンなどの塩基性アミノ酸、またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸などのアミノ酸の置換を含む。特に、WO2009066174に記載のように、G131R、G131K、R149I、R149M、R149N、R149K、S159R、Q193H、Q193K、N199H、N199R、K201H、K201R、K204E、K204D、K204L、K204Y、K212R、S215E、S215H、S215K、S215D、D218Y、D218H、K251D、K251EおよびK251Qからなる群から選択される1つまたは2つ以上の突然変異を特定することができる。
好適な突然変異はまた、アミノ酸195、269および214からなる群から選択されるネイティブなhTRAILの位置における1つまたは2つ以上の突然変異でもあり、特に突然変異は、リジン、ヒスチジンまたはアルギニンなどの塩基性アミノ酸のアミノ酸置換を含む。特に、WO2009077857に記載のように、D269H、E195RおよびT214Rからなる群から選択される、1つまたは2つ以上の突然変異を特定することができる。
具体的な態様において、hTRAILのフラグメントのホモログであるドメイン(a)は、WO2009066174に記載のような、ネイティブなTRAIL配列のD218H突然変異体、または、Gasparian ME et al. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. 2009 Jun; 14(6): 778-87に記載のような、ネイティブなTRAIL配列のY189N−R191K−Q193R−H264R−I266R−D269H突然変異体から選択される。
具体的な態様において、hTRAILのフラグメントのホモログであるドメイン(a)は、WO2009066174に記載のような、ネイティブなTRAIL配列のD218H突然変異体、または、Gasparian ME et al. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. 2009 Jun; 14(6): 778-87に記載のような、ネイティブなTRAIL配列のY189N−R191K−Q193R−H264R−I266R−D269H突然変異体から選択される。
ドメイン(a)、すなわちTRAILのフラグメントは、融合タンパク質の構築物の、細胞表面上の死受容体への結合を担うドメインである。さらに、結合の際にドメイン(a)は、その既知のアゴニスト活性、すなわちアポトーシスの外因性経路の活性化を発揮するであろう。
本発明の融合タンパク質は、細胞表面上の炭水化物受容体に結合可能なドメインの配列を含まない。細胞表面上の炭水化物受容体への結合は、非特異的結合である。
特に、本発明の融合タンパク質は、細胞表面上の糖受容体に結合可能なレクチンドメイン(糖タンパク質)の配列を含まない。細胞表面上の糖受容体に結合可能なレクチンドメインという用語は、特に、タンパク質毒素のサブユニット(鎖)Aおよびそのフラグメント、ならびに、単独で生じ、酵素の機能性を含む異なる機能性のドメインを伴わないレクチンタンパク質の両方として、理解されるべきである。
本発明の融合タンパク質は、細胞表面上の炭水化物受容体に結合可能なドメインの配列を含まない。細胞表面上の炭水化物受容体への結合は、非特異的結合である。
特に、本発明の融合タンパク質は、細胞表面上の糖受容体に結合可能なレクチンドメイン(糖タンパク質)の配列を含まない。細胞表面上の糖受容体に結合可能なレクチンドメインという用語は、特に、タンパク質毒素のサブユニット(鎖)Aおよびそのフラグメント、ならびに、単独で生じ、酵素の機能性を含む異なる機能性のドメインを伴わないレクチンタンパク質の両方として、理解されるべきである。
別の態様において、ドメイン(a)以外の本発明の融合タンパク質は、細胞表面上の受容体に結合する他のいかなるドメインも含まない。
本発明の融合タンパク質のドメイン(b)は、エフェクターペプチド、すなわち、細胞内のタンパク質合成プロセスを阻害するペプチド毒素のドメインである。
本発明の融合タンパク質のドメイン(b)のエフェクターペプチドは、細胞におけるタンパク質合成プロセスの翻訳段階を阻害することにより、タンパク質合成を阻害する毒素であってもよい。
本発明の融合タンパク質のドメイン(b)のエフェクターペプチドは、細胞におけるタンパク質合成プロセスの転写およびRNA産生の阻害により、タンパク質合成を阻害する毒素であってもよい。
本発明の融合タンパク質のドメイン(b)は、エフェクターペプチド、すなわち、細胞内のタンパク質合成プロセスを阻害するペプチド毒素のドメインである。
本発明の融合タンパク質のドメイン(b)のエフェクターペプチドは、細胞におけるタンパク質合成プロセスの翻訳段階を阻害することにより、タンパク質合成を阻害する毒素であってもよい。
本発明の融合タンパク質のドメイン(b)のエフェクターペプチドは、細胞におけるタンパク質合成プロセスの転写およびRNA産生の阻害により、タンパク質合成を阻害する毒素であってもよい。
一態様において、ペプチド毒素は、リボソームレベルでのタンパク質の酵素的な翻訳を阻害するペプチドである。本発明のこの態様において、1つの変形においてペプチド毒素は、N−グリコシダーゼ、リボヌクレアーゼおよびADP−リボシルトランスフェラーゼの活性から選択される酵素触媒活性を有する。
当業者には明らかであるように、ペプチド毒素は、エフェクターペプチドとしてのその主な活性に加えて、細胞におけるタンパク質合成の阻害をもたらし得る1または2以上の他の活性を有し得ることが理解されるべきであり、これは例えばW. J. Pneumans et al., The FASEB Journal, 2001, Vol. 15, str. 1493-1506に記載されている。
当業者には明らかであるように、ペプチド毒素は、エフェクターペプチドとしてのその主な活性に加えて、細胞におけるタンパク質合成の阻害をもたらし得る1または2以上の他の活性を有し得ることが理解されるべきであり、これは例えばW. J. Pneumans et al., The FASEB Journal, 2001, Vol. 15, str. 1493-1506に記載されている。
N−グリコシダーゼ活性を有するエフェクターペプチドは、28S rRNAのサブユニット60内の1つの特定のアデニン残基の切断によって、リボソームの改変(脱プリン)を行う。この改変は不可逆的であり、リボソームと翻訳因子EFとの結合を防いで、翻訳を遮断する。
N−グリコシダーゼの触媒活性を有するエフェクターペプチドは、1型リボソーム不活性化タンパク質(RIP)、2型RIPタンパク質の触媒サブユニット(鎖)A、および、元の配列と少なくとも85%の配列同一性の保存N−グリコシダーゼ活性を有するそれらの改変、からなるペプチド毒素の群から選択することができる。
N−グリコシダーゼ活性を有する1型RIP毒素は、一本鎖タンパク質であり、触媒ドメインのみを有する。
N−グリコシダーゼの触媒活性を有するエフェクターペプチドは、1型リボソーム不活性化タンパク質(RIP)、2型RIPタンパク質の触媒サブユニット(鎖)A、および、元の配列と少なくとも85%の配列同一性の保存N−グリコシダーゼ活性を有するそれらの改変、からなるペプチド毒素の群から選択することができる。
N−グリコシダーゼ活性を有する1型RIP毒素は、一本鎖タンパク質であり、触媒ドメインのみを有する。
植物由来の以下の既知の毒素を、一本鎖1型RIP毒素の群からの具体的なエフェクターペプチドとして挙げることができる:ゲロニン(Gelonium multiflorumから)、モモルディン(Momordica属の植物から単離されたタンパク質)、サポリン(Saponaria Officinalisから)、ドデカンドリン(Phytolacca dodecandraから)、ボウガニン(bouganin)(Bougainvillea spectabilisから)、ヤマゴボウからのPAPタンパク質(Phytolacca Americana)、トリコサンチン(Trichosanthes kirilowiiから)、トリコアングイン(trichoanguin)(Trichosanthes anguinaから)、アグロスチン(agrostin)(Agrostemma githagoから)、ジアントリン(diantrin)、ルフィンP1(Luffa cylindricaから)、モモルカリン(Momordica charantiaから)、およびトリチン。
本態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号55(ボウガニン)、配列番号58(PAP毒素ホモログ)、配列番号59(サポリンのフラグメント)、配列番号60(トリコサンチン)、配列番号61(トリコアングイン)、配列番号65(ルフィンP1)、配列番号67(モモルカリン)、および配列番号78(ゲロニンの触媒ドメイン)として指定される。
本態様におけるエフェクターペプチドのさらなる例は、ゲロニン(配列番号198)のアナログおよび改変ネイティブ配列を有するトリコサンチンのアナログ(配列番号199および配列番号200)である。
改変トリコサンチンの一例は配列番号199であり、ここでトリコサンチンの既知の配列は、毒素の免疫原性を低下させるように改変されている。すなわち、トリコサンチンの既知の配列において、「YFF」81−83モチーフが「ACS」により置き換えられ、同様に、「KR」173−174アミノ酸が、「CG」残基より置き換えられる(アミノ酸残基番号は、GenBank:AAB22585.1に公開された配列と一致している)(An Q, Wei S, Mu S, Zhang X, Lei Y, Zhang W, Jia N, Cheng X, Fan A, Li Z, Xu Z. J Biomed Sci.2006 Sep;13(5):637-43))。
本態様におけるエフェクターペプチドのさらなる例は、ゲロニン(配列番号198)のアナログおよび改変ネイティブ配列を有するトリコサンチンのアナログ(配列番号199および配列番号200)である。
改変トリコサンチンの一例は配列番号199であり、ここでトリコサンチンの既知の配列は、毒素の免疫原性を低下させるように改変されている。すなわち、トリコサンチンの既知の配列において、「YFF」81−83モチーフが「ACS」により置き換えられ、同様に、「KR」173−174アミノ酸が、「CG」残基より置き換えられる(アミノ酸残基番号は、GenBank:AAB22585.1に公開された配列と一致している)(An Q, Wei S, Mu S, Zhang X, Lei Y, Zhang W, Jia N, Cheng X, Fan A, Li Z, Xu Z. J Biomed Sci.2006 Sep;13(5):637-43))。
改変トリコサンチンのさらなる例は配列番号200であり、ここでトリコサンチンの既知の配列は、次のように改変された。すなわち、「YFF」81−83モチーフが「ACS」により置き換えられて毒素の免疫原性を低下させ、「KR」173−174アミノ酸が「CG」残基より置き換えられて(An Q, Wei S, Mu S, Zhang X, Lei Y, Zhang W, Jia N, Cheng X, Fan A, Li Z, Xu Z. J Biomed Sci.2006 Sep;13(5):637-43)、VLS(血管漏出症候群)問題を低減させ、バリン残基2および66がアラニンに置換された;および、ロイシン132はグリシンに置きかえられた(アミノ酸残基番号は、GenBank:AAB22585.1に公開された配列と一致している)(Baluna R, Rizo J, Gordon BE, Ghetie V, Vitetta ES.. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Mar 30;96(7):3957-62))。配列番号198の変異V70Aを有するゲロニンアナログは知られており、文献に記載されている(Baluna et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 3957-3962, March 199)。
配列番号199として指定されたトリコサンチンアナログは知られており、文献に記載されている(An Q, et al. J Biomed Sci. 2006 Sep;13(5):637-43)。
配列番号200として指定されたトリコサンチンアナログは新規であり、文献には記載されていなかった。
N−グリコシダーゼ活性を有する2型RIP毒素は、2本鎖のタンパク質であり、触媒ドメイン(サブユニットA)および、細胞表面上に存在する炭水化物(糖)受容体に結合することができるレクチン結合ドメイン(サブユニットB)を有する。本発明によれば、レクチン結合ドメインを欠いている2型RIP毒素の触媒サブユニットAは、エフェクターペプチドとして使用することができる。
配列番号200として指定されたトリコサンチンアナログは新規であり、文献には記載されていなかった。
N−グリコシダーゼ活性を有する2型RIP毒素は、2本鎖のタンパク質であり、触媒ドメイン(サブユニットA)および、細胞表面上に存在する炭水化物(糖)受容体に結合することができるレクチン結合ドメイン(サブユニットB)を有する。本発明によれば、レクチン結合ドメインを欠いている2型RIP毒素の触媒サブユニットAは、エフェクターペプチドとして使用することができる。
このタイプのエフェクターペプチドとして、以下の植物毒素の触媒サブユニットAを挙げることができる:リシン(Ricinnus communisから)、アブリン(Abbrus precatriusから)、モデシン(Adenia digitataから)、ビスクミン(ヤドリギ(misletoe)Viscum albumからの毒素)、ボルケンシン(Adenia volkensiiから)、エブリン(ebulin)1(Sambucus ebulusから)、ニグリンb(Sambucus nigraから)および志賀細菌毒素(Shigella dysenteriaeから)、または元の配列と少なくとも85%の配列同一性の、保存N−グリコシダーゼ活性を有するそれらの改変。
この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、以下のように指定される:配列番号56および配列番号57(リシンのサブユニットA;およびリシンの変異サブユニットA)、配列番号195(リシンの改変サブユニットA);配列番号62(ヤドリギ毒素のサブユニットA)、配列番号63(エブリン1のサブユニットA)、配列番号64(ニグリンbのサブユニットA)、配列番号66(ボルケンシンのサブユニットA)、配列番号70(志賀毒素サブユニットAの変異体)、および配列番号82(アブリンのサブユニットA);配列番号194(Baluna et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 3957-3962, March 1999に記載のものに突然変異V71A、G115A、およびS232Qを有する、アブリンの改変サブユニットA、アミノ酸残基番号はGenBank:CAA38655.1に公開された配列と一致)。
この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、以下のように指定される:配列番号56および配列番号57(リシンのサブユニットA;およびリシンの変異サブユニットA)、配列番号195(リシンの改変サブユニットA);配列番号62(ヤドリギ毒素のサブユニットA)、配列番号63(エブリン1のサブユニットA)、配列番号64(ニグリンbのサブユニットA)、配列番号66(ボルケンシンのサブユニットA)、配列番号70(志賀毒素サブユニットAの変異体)、および配列番号82(アブリンのサブユニットA);配列番号194(Baluna et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 3957-3962, March 1999に記載のものに突然変異V71A、G115A、およびS232Qを有する、アブリンの改変サブユニットA、アミノ酸残基番号はGenBank:CAA38655.1に公開された配列と一致)。
この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、以下のように指定される:配列番号56および配列番号57(リシンのサブユニットAおよびリシンの変異サブユニットA)、配列番号195(Baluna et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 3957-3962, March 1999に記載のものに欠失78LDV80を有する、リシンの改変サブユニットA、アミノ酸残基番号は、GenBank:ABG65738.1に公開された配列と一致);配列番号62(ヤドリギ毒素のサブユニットA)、配列番号63(エブリン1のサブユニットA)、配列番号64(ニグリンbのサブユニットA)、配列番号66(ボルケンシンのサブユニットA)、配列番号70(志賀毒素サブユニットAの変異体)、および配列番号82(アブリンのサブユニットA);配列番号194(Baluna et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 3957-3962, March 1999に記載のものに突然変異V71A、G115A、およびS233Qを有する、アブリンの改変サブユニットA、アミノ酸残基番号は、GenBank:CAA38655.1に公開された配列と一致)。
リボヌクレアーゼの触媒活性を有するエフェクターペプチド(リボ毒素とも呼ばれる)はエンドヌクレアーゼに属し、28S rRNA中でホスホジエステル結合を切断し、これによりリボソームを阻害し、翻訳を停止させる。この群のエフェクターペプチドとしては、真菌毒素α−サクリン、ミトギリン、Aspergillus restrictusからのレストリクトシン(restrictocin)、およびヒルステリン(hirsutelin)(Hirsutella thompsoniiから)を挙げることができる。
この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号71(レストリクトシン)および配列番号72(ヒルステリン)として指定される。
この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号71(レストリクトシン)および配列番号72(ヒルステリン)として指定される。
ADP−リボシルトランスフェラーゼの触媒活性を有するエフェクターペプチドは、ADP−リボシル化を引き起こし、したがって主に伸長/翻訳因子EF−2であるタンパク質合成機構の成分の不活性化、および翻訳の阻害を引き起こす。エフェクターペプチドのこの群は、Corynebacterium diphtheriaeからのジフテリア毒素、Pseudomonas aeruginosaからの外毒素A、および元の配列と少なくとも85%の配列同一性の保存ADP−リボシルトランスフェラーゼ活性を有するこれらの改変の、触媒ドメインに属する。
Pseudomonas aeruginosa外毒素Aとジフテリア毒素の触媒ドメインの改変は、ペプチドの末端フラグメントの切断、ならびに触媒ドメインまたはそのフラグメント中の置換または欠失を含む。好適な置換および欠失のいくつかは、Weldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16;113(16):3792-800;Onda M et al.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5;108(14):5742-7に開示されている。
Pseudomonas aeruginosa外毒素Aとジフテリア毒素の触媒ドメインの改変は、ペプチドの末端フラグメントの切断、ならびに触媒ドメインまたはそのフラグメント中の置換または欠失を含む。好適な置換および欠失のいくつかは、Weldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16;113(16):3792-800;Onda M et al.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5;108(14):5742-7に開示されている。
この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号69で示される既知のPseudomonas aeruginosa外毒素触媒ドメインA(触媒ドメインAのネイティブ配列)、および配列番号68、配列番号83、配列番号84、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、および配列番号207として示されるその変異アナログである。
この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号68で示される既知のPseudomonas aeruginosa外毒素A、および配列番号69、配列番号83、配列番号84、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、および配列番号207として示されるそのアナログである。配列番号69、配列番号83、配列番号84、配列番号203、および配列番号206として示されるPseudomonas aeruginosa外毒素Aのアナログは知られており、文献に記載されている。
この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号68で示される既知のPseudomonas aeruginosa外毒素A、および配列番号69、配列番号83、配列番号84、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、および配列番号207として示されるそのアナログである。配列番号69、配列番号83、配列番号84、配列番号203、および配列番号206として示されるPseudomonas aeruginosa外毒素Aのアナログは知られており、文献に記載されている。
配列番号201、配列番号202、配列番号204、配列番号205、および配列番号207として示されるPseudomonas aeruginosa外毒素Aのアナログは新規であり、文献に記載されていない。
既知の配列番号203は、Onda M et al.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5;108(14):5742-7に記載されたPseudomonas aeruginosa外毒素AのHA22−LR−8M変異体であり、免疫原性を減少させる8つの変異を有する。
既知の配列番号206は、Weldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16;113(16):3792-800に記載されたPseudomonas aeruginosa外毒素Aの、欠失変異体HA22−LRである。
新規な配列番号201は、Pseudomonas aeruginosaの外毒素Aの触媒ドメインのアナログであり、ここで3つの点変異R318K、N441QおよびR601Kが既知の配列に導入されて、免疫原性を減少させる(アミノ酸残基番号は、GenBank:AAB59097.1に公開された配列と一致する)。
既知の配列番号203は、Onda M et al.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5;108(14):5742-7に記載されたPseudomonas aeruginosa外毒素AのHA22−LR−8M変異体であり、免疫原性を減少させる8つの変異を有する。
既知の配列番号206は、Weldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16;113(16):3792-800に記載されたPseudomonas aeruginosa外毒素Aの、欠失変異体HA22−LRである。
新規な配列番号201は、Pseudomonas aeruginosaの外毒素Aの触媒ドメインのアナログであり、ここで3つの点変異R318K、N441QおよびR601Kが既知の配列に導入されて、免疫原性を減少させる(アミノ酸残基番号は、GenBank:AAB59097.1に公開された配列と一致する)。
新規な配列番号202は、Weldon JE et al., Blood. 2009 Apr 16; 113(16): 3792-800に記載されたPseudomonas aeruginosaの外毒素Aの触媒ドメインの欠失変異体A2−LRであり、さらに、Choe M, Webber KO, Pastan I. Cancer Res. 1994 Jul 1;54(13):3460-7に記載された免疫原性を低下させるさらなる突然変異および、WO 2007/016150に記載の別の突然変異が導入されている。
新規な配列番号204はPseudomonas aeruginosa外毒素Aの触媒ドメインの変異体であり、これはWeldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16;113(16):3792-800に記載の変異体HA22 M3(欠失および突然変異C312S)と、Onda M et al.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5;108(14):5742-7)に記載の免疫原性を低下させる8つの突然変異を有する変異体HA22 8Mとの組み合わせである。
新規な配列番号204はPseudomonas aeruginosa外毒素Aの触媒ドメインの変異体であり、これはWeldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16;113(16):3792-800に記載の変異体HA22 M3(欠失および突然変異C312S)と、Onda M et al.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5;108(14):5742-7)に記載の免疫原性を低下させる8つの突然変異を有する変異体HA22 8Mとの組み合わせである。
新規な配列番号205はPseudomonas aeruginosa外毒素Aの触媒ドメインの変異体であり、これはWeldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16;113(16):3792-800に記載の変異体HA22 M3(すなわち欠失および突然変異C312Sを有するもの)と、Onda M et al.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5;108(14):5742-7に記載の免疫原性を低下させる8つの突然変異に、さらにネイティブのPseudomonas aeruginosa毒素に存在するフューリンによって認識される切断部位の領域の欠失を有するものとの組み合わせである。
新規な配列番号207はPseudomonas aeruginosa外毒素Aの触媒ドメインの変異体であり、これはWeldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16;113(16):3792-800に記載の変異体HA22 M3(欠失および突然変異C312S)と、Onda M et al.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5;108(14):5742-7に記載の変異体HA22 8M(すなわち免疫原性を低下させる8つの突然変異)に追加の突然変異R601Kを有するものとの組み合わせである。
新規な配列番号207はPseudomonas aeruginosa外毒素Aの触媒ドメインの変異体であり、これはWeldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16;113(16):3792-800に記載の変異体HA22 M3(欠失および突然変異C312S)と、Onda M et al.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5;108(14):5742-7に記載の変異体HA22 8M(すなわち免疫原性を低下させる8つの突然変異)に追加の突然変異R601Kを有するものとの組み合わせである。
この態様におけるエフェクターペプチドの別の例示的な配列は、ジフテリア毒素の既知のサブユニットA(触媒ドメイン)、およびその既知の活性フラグメントであって、配列番号79、配列番号80、および配列番号81、配列番号196で指定されたもの(2つの突然変異V7AおよびV27Aを導入することにより改変されたジフテリア毒素のサブユニットA。改変は、Baluna R, Rizo J, Gordon BE, Ghetie V, Vitetta ES. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Mar 30;96(7):3957-62により、VLS(血管漏出症候群)を除去するように選択された)、および配列番号197で指定されたものである(ジフテリア毒素の改変は、3つのアミノ酸6VDS9の欠失および突然変異V29Aを導入して、Baluna R, Rizo J, Gordon BE, Ghetie V, Vitetta ES. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Mar 30;96(7):3957-62により、VLS(血管漏出症候群)を除去するようになされた)。
本発明の融合タンパク質のドメイン(b)のエフェクターペプチドは、例えば細菌において知られている毒素−抗毒素系に属する、タンパク質合成を阻害するペプチド毒素であってもよい。かかる毒素は、異なるメカニズムを介して作用して、タンパク質合成を遮断することができる:細胞膜と結合し、こうして膜電位の急速な崩壊と付随する呼吸の停止がもたらされる;トポイソメラーゼに結合することによる、ポリメラーゼ(DNAおよびRNA)の阻害;またはエンドリボヌクレアーゼ(RNase)として作用すること。
mRNase活性を有する毒素−抗毒素系の構成要素である毒素の例は、以下である:配列番号77で示される、RNase活性を有するStaBタンパク質(Szymanik M., Doctoral thesis. 2006. Warsaw University, Warsaw);Salmonella typhiからのKid毒素(Bravo A, de Torrontegui G, Diaz R. Identification of components of a new stability system of plasmid R1, ParD, that is close to the origin of replication of this plasmid. Mol Gen Genet. 1987 Nov; 210(1):101-10)、およびE. coliからのRelE毒素(Gotfredsen M, Gerdes K. The Escherichia coli relBE genes belong to a New toxin-antitoxin gene family. Mol Microbiol. 1998 Aug; 29(4): 1065-76)、これらは配列番号73(Kidタンパク質)および配列番号74(RelEタンパク質)として示される。
mRNase活性を有する毒素−抗毒素系の構成要素である毒素の例は、以下である:配列番号77で示される、RNase活性を有するStaBタンパク質(Szymanik M., Doctoral thesis. 2006. Warsaw University, Warsaw);Salmonella typhiからのKid毒素(Bravo A, de Torrontegui G, Diaz R. Identification of components of a new stability system of plasmid R1, ParD, that is close to the origin of replication of this plasmid. Mol Gen Genet. 1987 Nov; 210(1):101-10)、およびE. coliからのRelE毒素(Gotfredsen M, Gerdes K. The Escherichia coli relBE genes belong to a New toxin-antitoxin gene family. Mol Microbiol. 1998 Aug; 29(4): 1065-76)、これらは配列番号73(Kidタンパク質)および配列番号74(RelEタンパク質)として示される。
トポイソメラーゼ毒素に結合することによってポリメラーゼを阻害する、毒素−抗毒素系の構成要素である毒素の例は、CcdBファミリーE. coliタンパク質からの毒素、およびDNA分解およびRNAポリメラーゼ阻害の保存された活性を有するそれらの変異体であり、例えばCcdBET2毒素である(E. Trovatti et al, Bioorg Med Chem Lett. 2008 Dec 1;18(23):6161-4)。この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号74(CcdBタンパク質)および配列番号75(CcdBタンパク質変異体)として示される。
細胞膜と結合することにより膜電位の急速な崩壊と付随する呼吸の停止がもたらされる、毒素−抗毒素系の構成要素である毒素の例は、細胞質膜TisBおよびHokに挿入する疎水性残基の長いストレッチを含有する、小さな塩基性タンパク質である。HokまたはTisBの膜挿入は、電気化学ポテンシャルの喪失を引き起こし、これは細胞内ATPの減少の原因となる。したがって、TisBとHokの両方が、細菌膜を損傷することにより細胞を殺すことができる(Unoson C, Wagner EG. A small SOS-induced toxin is targeted against the inner membrane in Escherichia coli. Mol Microbiol. 2008 Oct;70(1):258-70. Epub 2008 Aug 29)。この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号208として示される。
細胞膜と結合することにより膜電位の急速な崩壊と付随する呼吸の停止がもたらされる、毒素−抗毒素系の構成要素である毒素の例は、細胞質膜TisBおよびHokに挿入する疎水性残基の長いストレッチを含有する、小さな塩基性タンパク質である。HokまたはTisBの膜挿入は、電気化学ポテンシャルの喪失を引き起こし、これは細胞内ATPの減少の原因となる。したがって、TisBとHokの両方が、細菌膜を損傷することにより細胞を殺すことができる(Unoson C, Wagner EG. A small SOS-induced toxin is targeted against the inner membrane in Escherichia coli. Mol Microbiol. 2008 Oct;70(1):258-70. Epub 2008 Aug 29)。この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号208として示される。
上述のように、いくつかのエフェクターペプチドは新規であり、以前には記載されていなかった。
したがって本発明は、配列番号200のトリコサンチンの突然変異体、配列番号201のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体、配列番号202のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体、配列番号204のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体、配列番号205のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体、および配列番号207のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体、からなる群から選択される新規なペプチドに関する。
これらの新規なペプチドは、特に本発明の抗がん融合タンパク質のドメイン(b)のエフェクターペプチドとして、有用性を見出した。
これらの新規なペプチドは、親ペプチドの免疫原性を低下させるように特に設計されている。
したがって、これらの新規ペプチドの具体的な特徴は、低い免疫原性である。
したがって本発明は、配列番号200のトリコサンチンの突然変異体、配列番号201のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体、配列番号202のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体、配列番号204のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体、配列番号205のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体、および配列番号207のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体、からなる群から選択される新規なペプチドに関する。
これらの新規なペプチドは、特に本発明の抗がん融合タンパク質のドメイン(b)のエフェクターペプチドとして、有用性を見出した。
これらの新規なペプチドは、親ペプチドの免疫原性を低下させるように特に設計されている。
したがって、これらの新規ペプチドの具体的な特徴は、低い免疫原性である。
有利なのは、配列番号200のトリコサンチンの突然変異体からなる群から選択されるペプチドである。
また有利なのは、配列番号201のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体からなる群から選択されるペプチドである。
また有利なのは、配列番号202のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体からなる群から選択されるペプチドである。
また有利なのは、配列番号204のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体、配列番号205のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体、および配列番号207のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体からなる群から選択されるペプチドである。
また有利なのは、配列番号201のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体からなる群から選択されるペプチドである。
また有利なのは、配列番号202のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体からなる群から選択されるペプチドである。
また有利なのは、配列番号204のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体、配列番号205のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体、および配列番号207のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体からなる群から選択されるペプチドである。
がん細胞の表面に存在するTRAIL受容体に結合すると、融合タンパク質は、二重の効果を発揮する。ドメイン(a)、すなわちTRAILの機能的フラグメントまたは保存された機能性を有するそのホモログは、その既知のアゴニスト活性を発揮する、すわなち、細胞表面の死受容体に結合して、アポトーシスの外因性経路を活性化するであろう。融合タンパク質のドメイン(b)のエフェクターペプチドは、腫瘍細胞においてタンパク質合成を阻害することにより、TRAILドメインの活性と並行してその作用を細胞内で潜在的に発揮することができるであろう。
融合タンパク質の細胞内への内部移行後の、エフェクターペプチド−機能的ドメイン(b)の活性化は、本発明の融合タンパク質のドメイン(a)を、ドメイン(b)からリソソーム(lisosomal)酵素(非特異的プロテアーゼ)で切断することにより、非特異的に生じ得る。
融合タンパク質の細胞内への内部移行後の、エフェクターペプチド−機能的ドメイン(b)の活性化は、本発明の融合タンパク質のドメイン(a)を、ドメイン(b)からリソソーム(lisosomal)酵素(非特異的プロテアーゼ)で切断することにより、非特異的に生じ得る。
しかし、融合タンパク質は、細胞環境中に存在するプロテアーゼによって認識される切断部位のドメインを含むのが好ましい。
したがって、本発明の好ましい態様においては、ドメイン(a)およびドメイン(b)は、細胞環境に、特に腫瘍細胞環境に存在する例えばメタロプロテアーゼ、ウロキナーゼまたはフューリンなどのプロテアーゼによって認識される切断部位の配列を含む、少なくとも1つのドメイン(c)によって連結されている。
プロテアーゼにより認識される配列は、以下から選択することができる:
− メタロプロテアーゼMMPにより認識される配列Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro/PLGLAGEP、または、それが付着した配列の最後のアミノ酸と共にメタロプロテアーゼMMPにより認識される配列を形成するそのフラグメント、
したがって、本発明の好ましい態様においては、ドメイン(a)およびドメイン(b)は、細胞環境に、特に腫瘍細胞環境に存在する例えばメタロプロテアーゼ、ウロキナーゼまたはフューリンなどのプロテアーゼによって認識される切断部位の配列を含む、少なくとも1つのドメイン(c)によって連結されている。
プロテアーゼにより認識される配列は、以下から選択することができる:
− メタロプロテアーゼMMPにより認識される配列Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro/PLGLAGEP、または、それが付着した配列の最後のアミノ酸と共にメタロプロテアーゼMMPにより認識される配列を形成するそのフラグメント、
− ウロキナーゼuPAにより認識される配列Arg Val Val Arg/RVVR、または、それが付着した配列の最後のアミノ酸と共にウロキナーゼにより認識される配列を形成するそのフラグメント、
およびそれらの組み合わせ、または
− フューリンにより認識される配列Arg Gln Pro Arg/RQPR、Arg Gln Pro Arg Gly/RQPRG、Arg Lys Lys Arg/RKKR、またはフューリンにより認識されるその他の非定型配列であって、M. Gordon et all. In Inf. and Immun, 1995, 63, No. 1, p. 82-87により開示されたもの、またはフューリンにより認識されるネイティブ配列Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu (RHRQPRGWEQL)。
およびそれらの組み合わせ、または
− フューリンにより認識される配列Arg Gln Pro Arg/RQPR、Arg Gln Pro Arg Gly/RQPRG、Arg Lys Lys Arg/RKKR、またはフューリンにより認識されるその他の非定型配列であって、M. Gordon et all. In Inf. and Immun, 1995, 63, No. 1, p. 82-87により開示されたもの、またはフューリンにより認識されるネイティブ配列Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu (RHRQPRGWEQL)。
本発明の一態様において、プロテアーゼ切断部位は、任意の順番で互いに隣接して位置している、メタロプロテアーゼMMPにより認識される配列、および/またはウロキナーゼuPAにより認識される配列、および/またはフューリンにより認識される配列の組み合わせである。
好ましくは、一態様において、ドメイン(c)は、Arg Gln Pro Arg/RQPR、Arg Gln Pro Arg Gly/RQPRG、Arg Val Lys Arg/RVKRおよびArg Lys Lys Arg/RKKRから選択される、フューリンによって認識される配列である。
プロテアーゼである、メタロプロテアーゼMMP、ウロキナーゼuPAおよびフューリンは、腫瘍環境において過剰発現される。プロテアーゼにより認識される配列の存在は、ドメイン(a)のドメイン(b)からの切断を可能にし、すなわち、機能的ドメイン(b)の放出、したがって活性化の促進を可能とする。
好ましくは、一態様において、ドメイン(c)は、Arg Gln Pro Arg/RQPR、Arg Gln Pro Arg Gly/RQPRG、Arg Val Lys Arg/RVKRおよびArg Lys Lys Arg/RKKRから選択される、フューリンによって認識される配列である。
プロテアーゼである、メタロプロテアーゼMMP、ウロキナーゼuPAおよびフューリンは、腫瘍環境において過剰発現される。プロテアーゼにより認識される配列の存在は、ドメイン(a)のドメイン(b)からの切断を可能にし、すなわち、機能的ドメイン(b)の放出、したがって活性化の促進を可能とする。
プロテアーゼ切断部位の存在は、融合タンパク質の非特異的プロテアーゼによるランダムな分解が起こる前に腫瘍環境において過剰発現されるプロテアーゼによる、hTRAILフラグメントからの切断の結果、エフェクターペプチドの迅速な放出を可能にすることによって、ペプチドをその作用場所に輸送する機会を増加させる。
この点に関して、好ましいエフェクターペプチドはジフテリア毒素およびPseudomonas外毒素であり、これらは、フューリンによって認識される切断部位の天然に存在する配列、Arg Val Arg Arg/RVRR(ジフテリア毒素)およびArg Gln Pro Arg Gly/RQPRG(Pseudomonas外毒素)を含有する。
さらに、輸送ドメイン(d)が、本発明の融合タンパク質のエフェクターペプチドのドメイン(b)に付着してもよい。
この点に関して、好ましいエフェクターペプチドはジフテリア毒素およびPseudomonas外毒素であり、これらは、フューリンによって認識される切断部位の天然に存在する配列、Arg Val Arg Arg/RVRR(ジフテリア毒素)およびArg Gln Pro Arg Gly/RQPRG(Pseudomonas外毒素)を含有する。
さらに、輸送ドメイン(d)が、本発明の融合タンパク質のエフェクターペプチドのドメイン(b)に付着してもよい。
ドメイン(d)は、以下からなる群から選択することができる:
−(d1)Pseudomonas aeruginosa由来の細胞膜を通って輸送するドメイン、
−(d2)膜を通って輸送し小胞体を標的化するドメイン、
−(d3)細胞膜を通って輸送し、6、7、8、9、10または11個の(Arg/R)残基からなる、ポリアルギニン配列、
またはそれらのフラグメントであって、それが付着した配列の最後のアミノ酸と共に輸送ドメイン(d1)、(d2)または(d3)を形成する前記フラグメント、および
−これらの組み合わせ。
−(d1)Pseudomonas aeruginosa由来の細胞膜を通って輸送するドメイン、
−(d2)膜を通って輸送し小胞体を標的化するドメイン、
−(d3)細胞膜を通って輸送し、6、7、8、9、10または11個の(Arg/R)残基からなる、ポリアルギニン配列、
またはそれらのフラグメントであって、それが付着した配列の最後のアミノ酸と共に輸送ドメイン(d1)、(d2)または(d3)を形成する前記フラグメント、および
−これらの組み合わせ。
ドメイン(d1)、(d2)および(d3)の組み合わせは、特に、(d1)/(d2)、(d1)/(d3)または(d1)/(d2)/(d3)の組み合わせを含んでよい。
さらに、ドメイン(d1)、(d2)および(d3)の組み合わせは、互いに隣接して位置し、ドメイン(b)の一端に接続されているドメイン、および/またはドメイン(b)の異なる末端に連結されたドメインを含んでよい。
融合タンパク質が、ドメイン(b)に付着したドメイン(d)と、ドメイン(a)と(b)の間の切断部位のドメイン(c)の両方を有する場合には、ドメイン(c)は、構築物の切断後に輸送ドメイン(d)がドメイン(b)に付着したままであるように配置されることが、理解されるべきである。換言すれば、融合タンパク質が輸送ドメイン(d)および切断部位ドメイン(c)の両方を有する場合、ドメイン(d)はドメイン(b)と(c)の間に配置されるか、またはドメイン(d)の付着場所の反対側となるドメイン(b)の端部に配置される。
さらに、ドメイン(d1)、(d2)および(d3)の組み合わせは、互いに隣接して位置し、ドメイン(b)の一端に接続されているドメイン、および/またはドメイン(b)の異なる末端に連結されたドメインを含んでよい。
融合タンパク質が、ドメイン(b)に付着したドメイン(d)と、ドメイン(a)と(b)の間の切断部位のドメイン(c)の両方を有する場合には、ドメイン(c)は、構築物の切断後に輸送ドメイン(d)がドメイン(b)に付着したままであるように配置されることが、理解されるべきである。換言すれば、融合タンパク質が輸送ドメイン(d)および切断部位ドメイン(c)の両方を有する場合、ドメイン(d)はドメイン(b)と(c)の間に配置されるか、またはドメイン(d)の付着場所の反対側となるドメイン(b)の端部に配置される。
本発明はまた、ドメイン(d)、好ましくはPseudomonas aeruginosa移行ドメインが、2つの(c)ドメインの間に位置する変異体、すなわち、構築物の切断後に、輸送ドメイン、好ましくはPseudomonas aeruginosa移行ドメインが、TRAILドメインにもエフェクターペプチドドメインにも付着していない変異体も含む。
本発明は、ドメイン(d)がドメイン(c)とドメイン(a)の間に配置された変異体、すなわち、構築物の切断後に、輸送ドメインがTRAILドメインに付着したままである変異体は、含まない。
本発明は、ドメイン(d)がドメイン(c)とドメイン(a)の間に配置された変異体、すなわち、構築物の切断後に、輸送ドメインがTRAILドメインに付着したままである変異体は、含まない。
Pseudomonas aeruginosa毒素の移行ドメインである輸送ドメイン、またはPseudomonas aeruginosa毒素由来のリソソーム膜を通して輸送するドメインの別のフラグメントは、細胞膜を横切って移行する能力を有し、腫瘍細胞の区画にエフェクターペプチドを導入するために使用することができる。Pseudomonas aeruginosaの移行ドメインの配列は周知であり、配列番号139で示されている。
好ましくは、Pseudomonas aeruginosa移行ドメインは、ドメイン(a)と(b)の間に配置され、さらに(c)ドメインによって隔てられている。
また、好ましくは、小胞体に輸送するドメイン(d2)は、エフェクターペプチドのC末端に付着し、本発明の融合タンパク質のC末端に位置する。
好ましくは、Pseudomonas aeruginosa移行ドメインは、ドメイン(a)と(b)の間に配置され、さらに(c)ドメインによって隔てられている。
また、好ましくは、小胞体に輸送するドメイン(d2)は、エフェクターペプチドのC末端に付着し、本発明の融合タンパク質のC末端に位置する。
また好ましくは、細胞膜を通って輸送するポリアルギニン配列は、エフェクターペプチドのC末端に付着し、エフェクタードペプチドとドメイン(a)の間に配置されている;好ましくは、これはさらにドメイン(c)によりドメイン(d)から隔てられている。
小胞体に向かう配列(d2)は、当分野で知られている、小胞体に向かう任意のシグナル配列であってよく、例えば、限定はされないが以下である:Lys Asp Glu Leu/KDEL、His Asp Glu Leu/HDEL、Arg Asp Glu Leu/RDEL、Asp Asp Glu Leu/DDEL、Ala Asp Glu Leu/ADEL、Ser Asp Glu Leu/SDEL、およびLys Glu Asp Leu/KEDL。
ドメイン(d2)は好ましくは、Lys Asp Glu Leu/KDELおよびLys Glu Asp Leu/KEDLから選択される。
好ましくは、輸送配列(d2)は、本発明の融合タンパク質のC末端に位置する。
小胞体に向かう配列(d2)は、当分野で知られている、小胞体に向かう任意のシグナル配列であってよく、例えば、限定はされないが以下である:Lys Asp Glu Leu/KDEL、His Asp Glu Leu/HDEL、Arg Asp Glu Leu/RDEL、Asp Asp Glu Leu/DDEL、Ala Asp Glu Leu/ADEL、Ser Asp Glu Leu/SDEL、およびLys Glu Asp Leu/KEDL。
ドメイン(d2)は好ましくは、Lys Asp Glu Leu/KDELおよびLys Glu Asp Leu/KEDLから選択される。
好ましくは、輸送配列(d2)は、本発明の融合タンパク質のC末端に位置する。
別の態様において、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、さらに、PEG分子の融合タンパク質への付着に適切な配列を含むドメイン(e)が配置される(PEG化リンカー)。かかるリンカーは、既知の配列Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu/ASGCGPEであってよい。PEG化リンカーはまた、以下の群から選択することができる:
Ala Ala Cys Ala Ala/AACAA、
Ser Gly Gly Cys Gly Gly Ser/SGGCGGS、および
Ser Gly Cys Gly Ser/SGCGS。
好ましくはPEG化リンカーの配列は、Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu/ASGCGPEである。
Ala Ala Cys Ala Ala/AACAA、
Ser Gly Gly Cys Gly Gly Ser/SGGCGGS、および
Ser Gly Cys Gly Ser/SGCGS。
好ましくはPEG化リンカーの配列は、Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu/ASGCGPEである。
融合タンパク質の主要な機能的要素および切断部位ドメイン(単数または複数)とは別に、本発明の融合タンパク質は、柔軟な立体リンカーの1または2以上の中性配列を含んでもよい。このような立体リンカーは周知であり、文献に記載されている。融合タンパク質配列へのこれらの組み込みは、宿主細胞においてその過剰発現のプロセスによって産生されるタンパク質の正しいフォールディングを提供することを目的とする。具体的には、立体リンカーは、グリシン、グリシン−セリン、またはグリシン−システイン−アラニンリンカーであってよい。
具体的には、立体リンカーは、グリシンとセリン残基の組み合わせ、例えばGly Gly Gly Gly Ser/GGGGSまたは立体リンカーに作用するそれらの任意のフラグメントであってよく、例えば、フラグメントGly Gly Gly Ser/GGGS、Gly Gly Gly/GGGまたはGly Gly Gly Gly/GGGGである。別の態様において、立体リンカーはグリシン、セリンおよびアラニン残基の組み合わせ、例えばAla Ser Gly Gly/ASGGまたは立体リンカーに作用するそれらの任意のフラグメントであってよく、例えばAlaSerGly/ASGである。立体リンカーの組み合わせを用いることも可能であり、例えば配列Gly Gly Gly Ser Gly/GGGGSまたは立体リンカーに作用するそれらの任意のフラグメント、例えばフラグメントGly Gly Gly/GGGと、立体リンカーに作用する別のフラグメントとの組み合わせである。このような場合において、立体リンカーは、グリシン、セリンおよびアラニン残基の組み合わせであってよく、例えばGly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Gly/GGGSASGGである。さらに別の態様において、立体リンカーはセリンおよびヒスチジン残基の組み合わせ、Ser His His Ser/SHHSまたはSer His His Ala Ser/SHHASであってよい。
別の態様において、立体リンカーはアラニンとシステイン残基の組み合わせであってよく、例えばCAAACAAC(Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys)、CAACAAAC(Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys)またはこれらのフラグメントである。
別の態様において、適切な立体リンカーは、上記の立体リンカーの任意のタイプの組み合わせによって形成される。かかる組み合わせの例は、次により表される:Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGGSGGGGS)、Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys(GGGCAAACAAC)、およびGly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys(GGGGSGGGCAAACAAC)。
一態様において、立体リンカーはまた、単一のシステイン残基などの単一のアミノ酸残基から選択してもよい。
さらに、立体リンカーはまた、非特異的な様式で起こる機能的ドメイン(b)の活性化のために有用であり得る。非特異的な様式でのドメイン(b)の活性化は、本発明の融合タンパク質のドメイン(a)をドメイン(b)から、立体リンカーのpH依存性加水分解によって切断することにより、行なうことができる。
別の態様において、適切な立体リンカーは、上記の立体リンカーの任意のタイプの組み合わせによって形成される。かかる組み合わせの例は、次により表される:Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGGSGGGGS)、Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys(GGGCAAACAAC)、およびGly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys(GGGGSGGGCAAACAAC)。
一態様において、立体リンカーはまた、単一のシステイン残基などの単一のアミノ酸残基から選択してもよい。
さらに、立体リンカーはまた、非特異的な様式で起こる機能的ドメイン(b)の活性化のために有用であり得る。非特異的な様式でのドメイン(b)の活性化は、本発明の融合タンパク質のドメイン(a)をドメイン(b)から、立体リンカーのpH依存性加水分解によって切断することにより、行なうことができる。
さらに、本発明の融合タンパク質は、インテグリンと結合するモチーフを含有するリンカーを含んでもよい。かかるリンカーは、細胞表面へのさらなる結合を提供し、全身毒性を減少させることができる。
インテグリンは、多くの細胞型の表面に存在するα−βヘテロダイマーである。インテグリンのリガンドは、例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、およびラミニンなどの細胞外マトリックス接着タンパク質である。フィブロネクチンおよびいくつかの他のリガンドの場合において、RGDモチーフはインテグリンとの相互作用に関与する。このモチーフを含有するペプチドは、インテグリンα5β1を特異的に認識し、転移を形成するそれらの能力を制限することによって、腫瘍細胞の侵襲性を抑制する効果を有する(Ghelsen et al., (1988) J. Cell Biol. 106, 925-930)。ファージディスプレイ法を使用して、6−アミノ酸ペプチドのライブラリーから、NGRモチーフを含む配列を単離し、これは、インテグリンα5β1に特異的に結合してこれを認識する(Koivunen et al.., J Biol Chem. 1993 Sep 25; 268(27): 20205-10)。また、2つのモチーフ(NGRおよびRGD)が、血管形成に関与する別の因子にアンタゴニストとして結合することも実証された。RGDはまた、血管新生の過程で特異的に過剰提示されるインテグリンとも相互作用し(Friedlander et al. Definition of two angiogenic pathways by distinct αv integrins. Science (Washington DC), 270: 1500-1502, 1995)、一方NGRは、がんの侵襲性に関与し、腫瘍および強い血管新生にさらされる他の細胞の血管内に特に強力に露出されるタンパク質である、アミノペプチダーゼNと相互作用する((Pasqualini et al., Aminopeptidase N is a receptor for tumor-homing peptides and a target for inhibiting angiogenesis. Cancer Res. 2000 Feb 1;60(3):722-7)。
インテグリンは、多くの細胞型の表面に存在するα−βヘテロダイマーである。インテグリンのリガンドは、例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、およびラミニンなどの細胞外マトリックス接着タンパク質である。フィブロネクチンおよびいくつかの他のリガンドの場合において、RGDモチーフはインテグリンとの相互作用に関与する。このモチーフを含有するペプチドは、インテグリンα5β1を特異的に認識し、転移を形成するそれらの能力を制限することによって、腫瘍細胞の侵襲性を抑制する効果を有する(Ghelsen et al., (1988) J. Cell Biol. 106, 925-930)。ファージディスプレイ法を使用して、6−アミノ酸ペプチドのライブラリーから、NGRモチーフを含む配列を単離し、これは、インテグリンα5β1に特異的に結合してこれを認識する(Koivunen et al.., J Biol Chem. 1993 Sep 25; 268(27): 20205-10)。また、2つのモチーフ(NGRおよびRGD)が、血管形成に関与する別の因子にアンタゴニストとして結合することも実証された。RGDはまた、血管新生の過程で特異的に過剰提示されるインテグリンとも相互作用し(Friedlander et al. Definition of two angiogenic pathways by distinct αv integrins. Science (Washington DC), 270: 1500-1502, 1995)、一方NGRは、がんの侵襲性に関与し、腫瘍および強い血管新生にさらされる他の細胞の血管内に特に強力に露出されるタンパク質である、アミノペプチダーゼNと相互作用する((Pasqualini et al., Aminopeptidase N is a receptor for tumor-homing peptides and a target for inhibiting angiogenesis. Cancer Res. 2000 Feb 1;60(3):722-7)。
インテグリンと結合することができる本発明の融合タンパク質からのリンカーは、モチーフAsn Gly Arg(NGR)、Asp Gly Arg(DGR)またはArg Gly Asp(RGD)を含む。
本発明のタンパク質の好ましい態様において、インテグリンと結合するモチーフを含むリンカーは、配列番号140によって指定される。
配列番号140(Cys Phe Cys Asp Gly Arg Cys Asp Cys Ala/CFCDGRCDCA)は、システイン配列によって安定化されるモチーフAsp Gly Arg(DGR)を含み、これは周知であり、Wang H, Yan Z, Shi J, Han W, Zhang Y Protein Expr Purif. 2006 Jan; 45(1): 60-5に記載されている。
本発明のタンパク質の好ましい態様において、インテグリンと結合するモチーフを含むリンカーは、配列番号140によって指定される。
配列番号140(Cys Phe Cys Asp Gly Arg Cys Asp Cys Ala/CFCDGRCDCA)は、システイン配列によって安定化されるモチーフAsp Gly Arg(DGR)を含み、これは周知であり、Wang H, Yan Z, Shi J, Han W, Zhang Y Protein Expr Purif. 2006 Jan; 45(1): 60-5に記載されている。
本発明の融合タンパク質の特定の態様は、翻訳プロセスの阻害によって細胞内で作用するペプチドを含む融合タンパク質であって、次に指定されたペプチドの群から選択されるものである:
配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166、配列番号167、および配列番号168。
配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166、配列番号167、および配列番号168。
本発明の融合タンパク質におけるTRAILの抗がん活性は、他の成分の活性化により潜在的に増加させることができる―例えば、28S rRNAのアデニンの脱プリン化、因子EF2のADP−リボシル化、28SRNAのアデニンのN−グリコシル化、28S RNAの切断、mRNAの切断またはDNA分解であり、これらはタンパク質合成の阻害をもたらし、したがってプロテオームレベルでの細胞の反応を遮断し、アポトーシス経路を遮断するタンパク質の過剰産生を低減し、最終的にアポトーシス経路を再確立する。さらに、細胞のタンパク質合成プロセスの遮断は、細胞サイクルの制御点により(例えば、サイクリン依存性キナーゼなど)、TRAILの、DR系の機能的細胞受容体に対する付着から生じるシグナルと相乗して、内部誘導性アポトーシスを活性化することができる。
本発明の融合タンパク質は、多くの場合、可溶性TRAILおよび配列のフラグメントを含むその変異体よりも強力な活性を発揮することが見出された。これまで、本発明の融合タンパク質において使用される既知のエフェクターペプチドのうち、インターロイキン−2に融合したジフテリア毒素(Ontake(登録商標))のみが、医学で使用されてきた。本発明の融合タンパク質に使用される他のエフェクターペプチドは、医学においてそのように適用されておらず、その理由は、不利な反応速度、非特異的プロテアーゼによる迅速な分解、および標的部位でのエフェクターペプチドの機能を可能にするために必要な活性化経路の適切な配列の欠如に起因する、身体における蓄積などである。融合タンパク質の取り込みは、その作用が必要とされる場所へのその選択的送達を可能にする。
また、エフェクターペプチドの付着はタンパク質の重量を増加させ、これは腫瘍中のタンパク質の半減期の延長および貯留の増加をもたらし、その結果効率を増加させる。さらに、多くの場合、新たな融合タンパク質は、おそらくタンパク質合成に関与する細胞機構の不安定化を介して、TRAILに対する天然または誘導性の抵抗性を克服する。がん細胞は、特にアポトーシス経路(Bcl−2、IAP、XIAPまたはcFLIP)を遮断するタンパク質の過剰産生によって、TRAILの細胞毒性活性に対する耐性を獲得する可能性があるため、タンパク質合成の細胞機構を遮断することは、プロテオームレベルでの細胞反応の遮断をもたらし、したがってアポトーシス経路を遮断しない。
上述した代表的な融合タンパク質の構造の詳細な説明は以下に提示の実施例に示されている。
上述した代表的な融合タンパク質の構造の詳細な説明は以下に提示の実施例に示されている。
本発明によると、融合タンパク質とは、2つもしくは3つ以上のタンパク質またはそのフラグメントを含む単一のタンパク質分子が、化学的リンカーを追加せずに、それら各ペプチド鎖内のペプチド結合を介して共有結合されることを意味する。
融合タンパク質はまた、代わりに、タンパク質構築物またはキメラタンパク質としても記載することができる。本発明によると、「構築物」または「キメラタンパク質」という用語は、使用される場合、上で定義された融合タンパク質を指すものとして理解されるべきである。
当業者にとって、このように定義された融合タンパク質が、ペプチドとタンパク質の化学合成の既知の方法によって合成され得ることは明らかであろう。
融合タンパク質はまた、代わりに、タンパク質構築物またはキメラタンパク質としても記載することができる。本発明によると、「構築物」または「キメラタンパク質」という用語は、使用される場合、上で定義された融合タンパク質を指すものとして理解されるべきである。
当業者にとって、このように定義された融合タンパク質が、ペプチドとタンパク質の化学合成の既知の方法によって合成され得ることは明らかであろう。
融合タンパク質は、化学的ペプチド合成の方法、特に、好適な樹脂を担体として使用する固相におけるペプチド合成の技術を使用して、合成することができる。かかる技術は従来型であり、当技術分野において知られ、とりわけ、例えばBodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer- Verlag, New York、Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Companyのような単行本に記載されている。
融合タンパク質は、ペプチドの化学合成の方法により、連続したタンパク質として合成することができる。あるいは、タンパク質の個々のフラグメント(ドメイン)を別々に合成し、次に、一方のペプチドフラグメントのアミノ末端を、もう一方のペプチドのカルボキシル末端から縮合させることによって、ペプチド結合を介して1つの連続したペプチドに化学結合させてもよい。かかる技術は従来周知である。
しかしながら、好ましくは、本発明の融合タンパク質は、宿主細胞において融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の遺伝子発現の方法によって生成された、組み換えタンパク質である。
融合タンパク質は、ペプチドの化学合成の方法により、連続したタンパク質として合成することができる。あるいは、タンパク質の個々のフラグメント(ドメイン)を別々に合成し、次に、一方のペプチドフラグメントのアミノ末端を、もう一方のペプチドのカルボキシル末端から縮合させることによって、ペプチド結合を介して1つの連続したペプチドに化学結合させてもよい。かかる技術は従来周知である。
しかしながら、好ましくは、本発明の融合タンパク質は、宿主細胞において融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の遺伝子発現の方法によって生成された、組み換えタンパク質である。
結果として生じたペプチドの構造を検証するために、ペプチドの分子量を決定するための高分解能質量分析技術などの、ペプチドのアミノ酸組成を分析する既知の方法を使用してもよい。ペプチド配列を確認するために、ペプチドを連続的に分解してアミノ酸の配列を同定するタンパク質シーケンサーもまた使用することができる。
本発明のさらなる側面は、ポリヌクレオチド配列、特に、上で定義された融合タンパク質をコードするDNA配列である。
好ましくは、ポリヌクレオチド配列、特に、本発明に従う、上で定義された融合タンパク質をコードするDNAは、E. coliにおける発現に最適化された配列である。
本発明のさらなる側面は、ポリヌクレオチド配列、特に、上で定義された融合タンパク質をコードするDNA配列である。
好ましくは、ポリヌクレオチド配列、特に、本発明に従う、上で定義された融合タンパク質をコードするDNAは、E. coliにおける発現に最適化された配列である。
本発明の他の側面はまた、ポリヌクレオチド配列、特に上で定義された本発明のDNA配列を含む発現ベクターでもある。
本発明の他の側面はまた、上で定義された発現ベクターを含む宿主細胞でもある。
本発明の融合タンパク質の発現にとって好ましい宿主細胞は、E. coli細胞である。
本発明の他の側面はまた、上で定義された発現ベクターを含む宿主細胞でもある。
本発明の融合タンパク質の発現にとって好ましい宿主細胞は、E. coli細胞である。
融合タンパク質などの、組み換えタンパク質の生成のための方法は、周知である。簡潔には、この技術は、ポリヌクレオチド分子、例えば標的タンパク質のアミノ酸配列をコードし、宿主における標的タンパク質の発現に向かわせるDNA分子、の生成にある。ポリヌクレオチド分子をコードする標的タンパク質を、次に、該ポリペプチドの有効な発現を確保する適切な発現ベクターに取り込む。次に、組み換え発現ベクターを、形質移入/形質転換用の宿主細胞に導入し、結果として、形質転換された宿主細胞が産生される。この後に標的タンパク質を過剰発現させるために形質転換した細胞を培養し、得られたタンパク質を精製し、タンパク質の発現または精製に使用されたタグ配列を切断により任意に切り取る。
発現と精製に好適な技術は、例えば、研究論文Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), and A. Staron et al., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995に記載されている。
発現と精製に好適な技術は、例えば、研究論文Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), and A. Staron et al., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995に記載されている。
コスミド、プラスミドまたは改変されたウイルスは、宿主細胞におけるDNA配列の導入および複製のための発現ベクターとして使用することができる。典型的には、プラスミドが、発現ベクターとして使用される。好適なプラスミドは周知であり、市販されている。
本発明の発現ベクターは、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、および、好適な宿主細胞に取り込まれた該コード配列の転写と翻訳とに必要な調節配列を含む。調節配列の選択は、宿主細胞のタイプに依存し、当業者によって容易に実施することができる。かかる調節配列の例は、転写のプロモーターおよびエンハンサーまたはRNAポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列であり、コード配列の前に挿入される転写開始シグナル、およびコード配列の後に挿入される転写終結配列を含む。また、使用する宿主細胞およびベクターに依るが、複製起点、追加のDNA制限部位、エンハンサーおよび転写の誘導を可能にする配列などの他の配列を発現ベクターに導入してもよい。
本発明の発現ベクターは、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、および、好適な宿主細胞に取り込まれた該コード配列の転写と翻訳とに必要な調節配列を含む。調節配列の選択は、宿主細胞のタイプに依存し、当業者によって容易に実施することができる。かかる調節配列の例は、転写のプロモーターおよびエンハンサーまたはRNAポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列であり、コード配列の前に挿入される転写開始シグナル、およびコード配列の後に挿入される転写終結配列を含む。また、使用する宿主細胞およびベクターに依るが、複製起点、追加のDNA制限部位、エンハンサーおよび転写の誘導を可能にする配列などの他の配列を発現ベクターに導入してもよい。
発現ベクターはまた、マーカー遺伝子配列も含むことができ、それは、形質転換細胞に明確な表現型を与え、形質転換細胞の特異的な選択を可能にする。さらに、該ベクターはまた、挿入された標的タンパク質のコード配列を含む組み換えプラスミドにより形質転換された細胞と、挿入のないプラスミドを取り込んだ細胞を区別すること可能にする、第2のマーカー配列も含んでもよい。ほとんどの場合、典型的な抗生物質抵抗性マーカーを使用するが、当該分野で知られている任意の他のレポーター遺伝子を使用してもよく、細胞の中のその存在(in vivo)によって、オートラジオグラフィー技術、分光光度法または生物発光および化学発光を使用して容易に判定することができる。例えば、宿主細胞に依るが、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子を使用してもよい。
さらに、発現ベクターは、適切な細胞区画、例えば折り畳みが促進される周辺質、にタンパク質を輸送するシグナル配列を含んでもよい。加えて、N末端に付着されるHisTagまたはC末端に付着されるGSTなどのラベル/タグをコードする配列が存在してもよく、それは、続く、ニッケルカラムでの親和性クロマトグラフィーによる、親和性の原理を使用して産生されるタンパク質の精製を促進する。その溶解性を増大させる配列だけでなく、宿主細胞におけるタンパク質分解からタンパク質を保護する追加の配列もまた、存在してもよい。
標的タンパク質の配列に付着された補助的な要素は、その活性を遮断するか、または、例えば毒性などにより、別の理由で有害となり得る。かかる要素は除去されなければならず、酵素的または化学的な切断によって達成され得る。具体的には、6−ヒスチジンタグのHisTagまたは親和性クロマトグラフィーによるタンパク質精製を可能にするために付着されたこのタイプの他のマーカーは、可溶性TRAILタンパク質の肝毒性に対して記載されたその効果のために、除去されるべきである。原核細胞:Escherichia coliまたはBacillus subtilisなどの細菌性細胞、Saccharomyces cervisiaeまたはPichia pastorisなどの酵母、および真核細胞株(昆虫、哺乳動物、植物)を含む、様々な周知の宿主細胞に基づく異種発現系を使用してよい。
好ましくは、培養および遺伝子操作が容易であることと、得られる産生物が大量であることとのために、E. coli発現系を使用する。したがって、本発明の融合タンパク質をコードする標的配列を含むポリヌクレオチド配列は、E. coliにおける発現に最適化されるであろう。すなわち、それは、コード配列の中に、先端技術において知られている配列の可能な変異体から選択される、E. coliにおける発現に最適なコドンを含むであろう。さらに、発現ベクターは、コード配列に付着された、E. coliに好適な前記要素を含むであろう。
したがって、本発明の好ましい態様において、本発明の融合タンパク質をコードする配列を含み、かつE. coliにおける発現に最適化されたポリヌクレオチド配列は、以下:
配列番号85;配列番号86;配列番号87;配列番号88;配列番号89;配列番号90;配列番号91;配列番号92;配列番号93;配列番号94;配列番号95;配列番号96;配列番号97;配列番号98;配列番号99;配列番号100;配列番号101;配列番号102;配列番号103;配列番号104;配列番号105;配列番号106;配列番号107;配列番号108;配列番号109;配列番号110;配列番号111;配列番号111;配列番号113;配列番号114;配列番号115;配列番号116;配列番号117;配列番号118;配列番号119;配列番号120;配列番号121;配列番号122;配列番号123;配列番号124;配列番号125;配列番号126;配列番号127;配列番号128;配列番号129;配列番号130;配列番号131;配列番号132;配列番号133;配列番号134;配列番号135;配列番号136;配列番号137;配列番号138;配列番号169;配列番号170;配列番号171;配列番号172;配列番号173;配列番号174;配列番号175;配列番号176;配列番号177;配列番号178;配列番号179;配列番号180;配列番号181;配列番号182;配列番号183;配列番号184;配列番号185;配列番号186;配列番号187;配列番号188;配列番号189;配列番号190;配列番号191;配列番号192;および配列番号193;
からなるポリヌクレオチド配列の群から選択され、これらはそれぞれ、以下のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードする:
配列番号85;配列番号86;配列番号87;配列番号88;配列番号89;配列番号90;配列番号91;配列番号92;配列番号93;配列番号94;配列番号95;配列番号96;配列番号97;配列番号98;配列番号99;配列番号100;配列番号101;配列番号102;配列番号103;配列番号104;配列番号105;配列番号106;配列番号107;配列番号108;配列番号109;配列番号110;配列番号111;配列番号111;配列番号113;配列番号114;配列番号115;配列番号116;配列番号117;配列番号118;配列番号119;配列番号120;配列番号121;配列番号122;配列番号123;配列番号124;配列番号125;配列番号126;配列番号127;配列番号128;配列番号129;配列番号130;配列番号131;配列番号132;配列番号133;配列番号134;配列番号135;配列番号136;配列番号137;配列番号138;配列番号169;配列番号170;配列番号171;配列番号172;配列番号173;配列番号174;配列番号175;配列番号176;配列番号177;配列番号178;配列番号179;配列番号180;配列番号181;配列番号182;配列番号183;配列番号184;配列番号185;配列番号186;配列番号187;配列番号188;配列番号189;配列番号190;配列番号191;配列番号192;および配列番号193;
からなるポリヌクレオチド配列の群から選択され、これらはそれぞれ、以下のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードする:
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166、配列番号167、および配列番号168。
好ましい態様において、本発明はまた、上で示された配列番号85から配列番号138および配列番号169から配列番号193のポリヌクレオチド配列の群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、E. coliの形質転換に好適な発現ベクター、ならびにかかる発現ベクターで形質転換されたE. coli細胞を提供する。
好ましい態様において、本発明はまた、上で示された配列番号85から配列番号138および配列番号169から配列番号193のポリヌクレオチド配列の群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、E. coliの形質転換に好適な発現ベクター、ならびにかかる発現ベクターで形質転換されたE. coli細胞を提供する。
形質転換、すなわち、細菌性宿主細胞、具体的にはE. coliへのDNA配列の導入は、例えば、低温(4℃)でのカルシウムイオンによる処置の後、熱ショック(37−42℃で)に供するか、または電気穿孔によって、DNAを取り込ませるよう調製されたコンピテント細胞に対して通常実施される。かかる技術は周知であり、通常、発現系の製造業者によって決定されるか、または文献および実験室での作業のためのマニュアル、例えばManiatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982などに記載されている。
E. coli発現系における本発明の融合タンパク質の過剰発現の手順は、以下にさらに記載されるであろう。
本発明はまた、活性成分としての、上で定義された本発明の融合タンパク質、ならびに好適な、薬学的に許容し得る担体、希釈剤および従来型の補助成分を含む医薬組成物も提供する。医薬組成物は、担体もしくは希釈剤の中に溶解されるかまたは分散された、本発明の融合タンパク質と薬学的に許容し得る補助的な成分との有効量を含み、好ましくは、単位剤形で処方された医薬組成物、または、複数回の用量を含む処方物の形態であろう。他の成分、担体および希釈剤だけでなく、医薬品形態およびそれらの処方の方法も、当業者に知られており、文献に記載されている。例えば、それらは、研究論文Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USAに記載されている。
本発明はまた、活性成分としての、上で定義された本発明の融合タンパク質、ならびに好適な、薬学的に許容し得る担体、希釈剤および従来型の補助成分を含む医薬組成物も提供する。医薬組成物は、担体もしくは希釈剤の中に溶解されるかまたは分散された、本発明の融合タンパク質と薬学的に許容し得る補助的な成分との有効量を含み、好ましくは、単位剤形で処方された医薬組成物、または、複数回の用量を含む処方物の形態であろう。他の成分、担体および希釈剤だけでなく、医薬品形態およびそれらの処方の方法も、当業者に知られており、文献に記載されている。例えば、それらは、研究論文Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USAに記載されている。
用語「薬学的に許容し得る担体、希釈剤および補助成分」は、当該技術分野で知られている、任意の溶媒、分散媒、界面活性剤、抗酸化剤、安定剤、保存剤(例えば、抗菌剤、抗真菌剤)、等張化剤を含む。本発明の医薬組成物は、経口、非経口、吸入、局所のための液状の、固形のおよびエアロゾルの形態などの、選択される投与経路および所望の剤形、ならびに、選択される形態が、注入によるように投与経路のために殺菌されたものである必要があるべきかどうかに依存して、様々なタイプの担体、希釈剤および賦形剤を含んでもよい。本発明に従い、医薬組成物の投与の好ましい経路は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、腫瘍内などの注入経路を含む非経口であるか、または、単発または連続的な静脈内点滴による。
一態様において、本発明の医薬組成物は、直接腫瘍に注入することによって投与してもよい。他の態様において、本発明の医薬組成物は、静脈内に投与してもよい。さらに他の態様において、本発明の医薬組成物は、皮下または腹腔内に投与することができる。非経口投与のための医薬組成物は、必要ならば、適切なpHに緩衝された体液と等浸透圧の、薬学的に許容し得る水性または非水性培地における水溶液または分散液であってよく、抗酸化剤、緩衝剤、静菌性剤、および該組成物をレシピエントの組織または血液に適合させる可溶性物質もまた含んでもよい。当該組成物に含まれてもよい他の成分は、例えば、水、エタノールなどのアルコール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなどのポリオール、トリグリセリド、植物油、リポソームなどの脂質である。妥当な流動性および該物質の粒子サイズは、レシチンなどのコーティング物質、ならびに、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリソルベートおよび同類のものなどの界面活性剤により提供されてよい。
液体非経口組成物に好適な等張化剤は、例えば、グルコースなどの糖および塩化ナトリウムならびにそれらの組み合わせである。
あるいは、注入または点滴による投与のための医薬組成物は、例えば、パイロジェンフリー滅菌水などの好適な担体中に使用直前に再構成するための、凍結乾燥粉末などの粉末形態であり得る。
非経口投与のための本発明の医薬組成物はまた、溶液、スプレーまたはエアロゾルを含む経鼻投与の形態を有してもよい。好ましくは、鼻腔内投与のための形態は、水性溶液であり、鼻の分泌物と類似の特徴を維持するように、約5.5から約6.5までのpHに維持するために、等張であるか、または緩衝化されているであろう。さらに、それは、周知の鼻腔内用調製物におけるような保存剤または安定化剤を含むことができる。
あるいは、注入または点滴による投与のための医薬組成物は、例えば、パイロジェンフリー滅菌水などの好適な担体中に使用直前に再構成するための、凍結乾燥粉末などの粉末形態であり得る。
非経口投与のための本発明の医薬組成物はまた、溶液、スプレーまたはエアロゾルを含む経鼻投与の形態を有してもよい。好ましくは、鼻腔内投与のための形態は、水性溶液であり、鼻の分泌物と類似の特徴を維持するように、約5.5から約6.5までのpHに維持するために、等張であるか、または緩衝化されているであろう。さらに、それは、周知の鼻腔内用調製物におけるような保存剤または安定化剤を含むことができる。
本組成物は、1種または2種以上の成分の酸化を遅らせる、様々な抗酸化剤を含んでもよい。さらに、微生物の作用を防止するために、本組成物は、例えば非限定的に、パラベン類、クロロブタノール、チメロサール、ソルビン酸、およびこのタイプの類似の知られている物質を含む様々な抗菌剤および抗真菌剤を含んでもよい。一般に、本発明の医薬組成物は、例えば少なくとも約0.01wt%の活性成分を含むことができる。より具体的に、本組成物は、活性成分を、本組成物単位の1重量%から75重量%まで、または例えば25重量%から60重量%までの量において含んでもよいが、示された値に限定されるものではない。人間を含む患者に投与される本発明による組成物の用量の実際の量は、体重、病気の重篤度、処置される疾患のタイプ、先のまたは同時の治療的介入、患者および投与経路などの、物理的および生理学的な要因により決定することができる。好適な単位用量、全用量および本組成物中の活性成分の濃度は、処置する医師により決定されるべきである。
本組成物は、例えば、患者の体重1kgあたり約1マイクログラム〜約1000mgの用量において、例えば体重1kgあたり5mg〜100mgの範囲において、または体重1kgあたり5mg〜500mgの範囲において、投与してもよい。融合タンパク質およびそれを含む組成物は、抗がん性または抗腫瘍性を呈し、がん疾患の処置のために使用することができる。本発明はまた、上で定義される本発明の融合タンパク質の、ヒトを含む哺乳動物におけるがん疾患を処置するための使用をも提供する。本発明はまた、ヒトを含む哺乳動物における新生物/がん疾患を処置する方法を提供し、該方法は、かかる処置を必要とする対象に、上で定義されたような本発明の融合タンパク質の、抗新生物/抗がんに有効な量を、任意に適切な医薬組成物の形態において、投与することを含む。
本発明の融合タンパク質は、白血病、肉芽種症、ミエローマなどの血液悪性腫瘍および他の血液悪性腫瘍の処置のために使用することができる。融合タンパク質はまた、乳がん、非小細胞肺がんを含む肺がん、結腸がん、膵がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、腎臓がん、脳腫瘍および同類のものなどの固形腫瘍の処置のためにも使用されことができる。がんの処置における融合タンパク質の適切な投与経路は、具体的に、本発明の融合タンパク質を注入または点滴の形態において、この投与経路に適切な組成および形態において、投与することからなる、非経口経路である。本発明は、以下の基本手順および具体的な融合タンパク質の例において、より詳細に記載されるであろう。
融合タンパク質の過剰発現のための基本手順
プラスミドの調製
標的融合タンパク質のアミノ酸配列を、それをコードし、かつEscherichia coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNA配列を生成するための鋳型として使用した。かかる手順により、Escherichia coliにおける標的タンパク質の合成のさらなるステップの効率を増大させることができる。その結果得られたヌクレオチド配列を、次いで、自動合成した。加えて、制限酵素NdeIの切断部位(リーディング鎖の5’末端において)およびXhoIの切断部位(リーディング鎖の3’末端において)を、生じた標的タンパク質をコードする得られた該遺伝子に加えた。これらを、ベクターpET28a(Novagen)の中に該遺伝子をクローニングするために使用した。それらはまた、該タンパク質をコードする遺伝子を他のベクターにクローニングするためにも使用してもよい。この構築物から発現される標的タンパク質は、N末端において、トロンビンに認識される部位の手前に置かれ、続く親和性クロマトグラフィーによるその精製に役立つ、ポリヒスチジンタグ(6ヒスチジン)を任意に備え得る。いくつかの標的は、いかなるタグもなく、特にヒスチジンタグもなく発現され、続いてそれらをSPセファロースで精製した。
プラスミドの調製
標的融合タンパク質のアミノ酸配列を、それをコードし、かつEscherichia coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNA配列を生成するための鋳型として使用した。かかる手順により、Escherichia coliにおける標的タンパク質の合成のさらなるステップの効率を増大させることができる。その結果得られたヌクレオチド配列を、次いで、自動合成した。加えて、制限酵素NdeIの切断部位(リーディング鎖の5’末端において)およびXhoIの切断部位(リーディング鎖の3’末端において)を、生じた標的タンパク質をコードする得られた該遺伝子に加えた。これらを、ベクターpET28a(Novagen)の中に該遺伝子をクローニングするために使用した。それらはまた、該タンパク質をコードする遺伝子を他のベクターにクローニングするためにも使用してもよい。この構築物から発現される標的タンパク質は、N末端において、トロンビンに認識される部位の手前に置かれ、続く親和性クロマトグラフィーによるその精製に役立つ、ポリヒスチジンタグ(6ヒスチジン)を任意に備え得る。いくつかの標的は、いかなるタグもなく、特にヒスチジンタグもなく発現され、続いてそれらをSPセファロースで精製した。
得られた構築物の正確さを、先ず、酵素NdeIおよびXhoIを使用する単離プラスミドの制限分析により確認し、その後、標的タンパク質の全リーディングフレームを自動シークエンシングすることにより確認した。シークエンシングのために使用したプライマーは、ベクター中に存在するT7プロモーター(5’−TAATACGACTCACTATAGG−3’)およびT7ターミネーター(5’−GCTAGTTATTGCTCAGCGG−3’)の配列に相補的であった。得られたプラスミドを、製造業者の推奨に従って形質転換された市販のE. coli株において、標的融合タンパク質を過剰発現させるために使用した。選択培地(LB寒天、カナマイシン50μg/ml、1%グルコース)上で得られたコロニーを、カナマイシン(50μg/ml)および1%グルコースが補充されたLB液体培地中で終夜培養物を調製するために使用した。振盪培養器における約15hの成長の後、その培養物を、適切な培養に植菌するために使用した。
融合タンパク質の過剰発現および精製―基本手順A
カナマイシン(30μg/ml)および100μMの硫酸亜鉛を有するLB培地に、終夜培養物を植菌した。その培養物を、600nmでの光学密度(OD)が0.60−0.80に達するまで、37℃でインキュベートした。その後、IPTGを、0.25−1mMの範囲の最終濃度まで添加した。25℃で振盪しながらのインキュベーション(3.5−20h)の後、培養物を25min、6,000gで遠心分離した。細菌ペレットを、50mMのKH2PO4、0.5MのNaCl、10mMのイミダゾールを含むpH7.4の緩衝液中で再懸濁した。懸濁液を、氷上で8分間超音波処理した(40%の振幅、15秒パルス、10sのインターバル)。得られた抽出物を、40分間、20000g、4℃における遠心分離により清澄化した。Ni−セファロース(GE Healthcare)樹脂を、緩衝液での平衡化により前処置し、これを、細菌性細胞抽出物の調製のために使用した。その樹脂を、次いで、抽出物の遠心分離後に得られた上清と共に4℃で終夜インキュベートした。
カナマイシン(30μg/ml)および100μMの硫酸亜鉛を有するLB培地に、終夜培養物を植菌した。その培養物を、600nmでの光学密度(OD)が0.60−0.80に達するまで、37℃でインキュベートした。その後、IPTGを、0.25−1mMの範囲の最終濃度まで添加した。25℃で振盪しながらのインキュベーション(3.5−20h)の後、培養物を25min、6,000gで遠心分離した。細菌ペレットを、50mMのKH2PO4、0.5MのNaCl、10mMのイミダゾールを含むpH7.4の緩衝液中で再懸濁した。懸濁液を、氷上で8分間超音波処理した(40%の振幅、15秒パルス、10sのインターバル)。得られた抽出物を、40分間、20000g、4℃における遠心分離により清澄化した。Ni−セファロース(GE Healthcare)樹脂を、緩衝液での平衡化により前処置し、これを、細菌性細胞抽出物の調製のために使用した。その樹脂を、次いで、抽出物の遠心分離後に得られた上清と共に4℃で終夜インキュベートした。
その後、それをクロマトグラフィーカラム中にロードし、15〜50容積の緩衝液(50mMのKH2PO4、0.5MのNaCl、20mMのイミダゾール、pH7.4)で洗浄した。得られたタンパク質を、0.5MのNaClを有する50mMのKH2PO4緩衝液(pH7.4)中のイミダゾール勾配を使用してカラムから溶出させた。得られた画分を、SDS−PAGEにより分析した。適切な画分を組み合わせて、50mMのTris緩衝液(pH7.2)、150mMのNaCl、500mMのL−アルギニン、0.1mMのZnSO4、0.01%のTween 20に対して、4℃で終夜透析し、同時に、Histagが存在している場合は、Histagをトロンビン(1:50)で切断した。切断の後、トロンビンを、ベンズアミジンセファロース(登録商標)樹脂を使用する精製によりHistagを伴って発現した標的融合タンパク質から、分離した。Histagなしで発現した標的融合タンパク質の精製は、SPセファロースで実施した。その産物の純度を、SDS−PAGE電気泳動により分析した(Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982)。
融合タンパク質の過剰発現および精製―基本手順B
カナマイシン(30μg/ml)および100μMの硫酸亜鉛を有するLB培地に、終夜培養物を植菌した。培養物を、600nmでの光学密度(OD)が0.60−0.80に達するまで、37℃でインキュベートした。その後、IPTGを、最終濃度が0.5−1mMの範囲になるまで添加した。25℃で振盪しながらの20hのインキュベーション後に、培養物を25min、6,000gで遠心分離した。過剰発現後の細菌性細胞を、50mMのKH2PO4、0.5MのNaCl、10mMのイミダゾール、5mMのβ−メルカプトエタノール、0.5mMのPMSF(フッ化フェニルメチルスルホニル)を含む緩衝液(pH7.8)中、フレンチプレスにて破壊した。得られた抽出物を、50分間、8000gでの遠心分離により清澄化した。Ni−セファロース樹脂を、得られた上清と共に終夜インキュベートした。次いで、タンパク質が結合した樹脂を、クロマトグラフィーカラム中に充填した。
カナマイシン(30μg/ml)および100μMの硫酸亜鉛を有するLB培地に、終夜培養物を植菌した。培養物を、600nmでの光学密度(OD)が0.60−0.80に達するまで、37℃でインキュベートした。その後、IPTGを、最終濃度が0.5−1mMの範囲になるまで添加した。25℃で振盪しながらの20hのインキュベーション後に、培養物を25min、6,000gで遠心分離した。過剰発現後の細菌性細胞を、50mMのKH2PO4、0.5MのNaCl、10mMのイミダゾール、5mMのβ−メルカプトエタノール、0.5mMのPMSF(フッ化フェニルメチルスルホニル)を含む緩衝液(pH7.8)中、フレンチプレスにて破壊した。得られた抽出物を、50分間、8000gでの遠心分離により清澄化した。Ni−セファロース樹脂を、得られた上清と共に終夜インキュベートした。次いで、タンパク質が結合した樹脂を、クロマトグラフィーカラム中に充填した。
未結合のタンパク質を含む画分を洗い流すために、カラムを、15〜50容積の緩衝液(50mMのKH2PO4、0.5MのNaCl、10mMのイミダゾール、5mMのβ−メルカプトエタノール、0.5mMのPMSF(フッ化フェニルメチルスルホニル)(pH7.8))で洗浄した。その後、ベッドに特異的に結合しているタンパク質の大部分を洗い流すために、カラムを、50mMのKH2PO4、0.5MのNaCl、500mMのイミダゾール、10%グリセロール、0.5mMのPMSFを含む緩衝液(pH7.5)で洗浄した。得られた画分を、SDS−PAGEにより分析した(Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982)。標的タンパク質を含む画分を組み合わせて、タンパク質がヒスチジンタグを伴って発現された場合に、トロンビン(タンパク質4mgあたり1U、8h、16℃で)で切断し、ポリヒスチジンタグを除去した。次いで、その画分を、処方緩衝液(500mMのL−アルギニン、50mMのTris、2.5mMのZnSO4(pH7.4))に対して透析した。
この説明において、ヒスチジンタグと共に当初発現され、続いて該タグを除去されたタンパク質は、実施例番号に続いて上付きのa)で表される。ヒスチジンタグなしで当初から発現されたタンパク質は、実施例番号に続いて上付きのb)で表される。
2−D電気泳動による融合タンパク質の特徴付け
得られたタンパク質をさらに特徴付け、クロマトグラフィー条件を正確に選択するために、タンパク質の等電点を決定した。この目的のために、二次元電気泳動(2−D)方法を以下のスケジュールに従って二段階で使用した。
ステップ1.pH勾配におけるタンパク質の等電点電気泳動法および変性条件
2−D電気泳動による融合タンパク質の特徴付け
得られたタンパク質をさらに特徴付け、クロマトグラフィー条件を正確に選択するために、タンパク質の等電点を決定した。この目的のために、二次元電気泳動(2−D)方法を以下のスケジュールに従って二段階で使用した。
ステップ1.pH勾配におけるタンパク質の等電点電気泳動法および変性条件
濃度1〜2mg/mlのタンパク質調製物を、アセトン中に10%のトリクロロ酢酸および0.07%のβ−メルカプトエタノールを含有する沈殿溶液と1:1の割合で混合することにより、沈殿させた。混合物を−20℃で30分間インキュベートし、次いで15,000gおよび4℃で25分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを冷アセトンと0.07%β−メルカプトエタノールで2回洗浄した。次にアセトンの残留物を、臭いが検出されなくなるまで蒸発させた。タンパク質ペレットを、250mlの再水和緩衝液、8Mの尿素、1%のCHAPS、15mMのDTT、0.5%の両性電解質(GE Healthcare)に、その後に用いるストリップに依存して、3−11または6−11のpHのプロファイルで懸濁した。タンパク質溶液を等電点電気泳動用のセラミックチャンバーに入れ、次いで適切なpHプロファイル(3−11または6−11)で13cmのDrysStrip(GE Healthcare)に供した。全体を鉱油の層で覆った。チャンバーはEttan IPGphor III装置に入れ、ここで、等電点電気泳動を、ストリップの寸法およびpHプロファイルに割り当てられた次のプログラムに従って行った。
20℃で16時間脱水。
固定されたpH勾配で電界にフォーカス
その後、焦点のタンパク質を含有するストリップを脱イオン水で1分間洗浄し、クーマシーブリリアントで染色し、ついで脱色し、タンパク質の位置をマークする画像としてアーカイブに保管した。脱色したストリップは、次の組成の緩衝液で15分間、2回平衡化した:50mMのトリス−HCl(pH8.8)、6Mの尿素、1%DTT、2%SDS、30%グリセロール。
固定されたpH勾配で電界にフォーカス
ステップ2.SDS−PAGEによる第2方向への分離。
ストリップは、標準サイズ毎に単一のウェルを含有する12.5%ポリアクリルアミドゲル上に置き、次に分離を、200Vの電圧で3時間、SDS−PAGE用装置で実施した。ゲルはクーマシーブリリアントで染色し、適用されたスケールでアーカイブに保管した。タンパク質は、サイズの標準に基づいてその重量を決定することにより同定され、そのIPIは、製造業者(GE Healthcare)が提供する曲線に基づき6−11の尺度で(アノードとしてマークされた端からのストリップの長さの%に対するpHの比率)、または等電点電気泳動校正キット(GE Healthcare)により実験的に決定された曲線に基づいて3−11の尺度で、読み取った。
ストリップは、標準サイズ毎に単一のウェルを含有する12.5%ポリアクリルアミドゲル上に置き、次に分離を、200Vの電圧で3時間、SDS−PAGE用装置で実施した。ゲルはクーマシーブリリアントで染色し、適用されたスケールでアーカイブに保管した。タンパク質は、サイズの標準に基づいてその重量を決定することにより同定され、そのIPIは、製造業者(GE Healthcare)が提供する曲線に基づき6−11の尺度で(アノードとしてマークされた端からのストリップの長さの%に対するpHの比率)、または等電点電気泳動校正キット(GE Healthcare)により実験的に決定された曲線に基づいて3−11の尺度で、読み取った。
例
本発明の融合タンパク質の代表例を、以下の例に示す。
以下のアミノ酸配列成分の記号を使用する。
LINKER1:立体リンカー配列(Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGS)
LINKER2:立体リンカー配列(Gly Gly Gly Gly/GGGG)
LINKER3:立体リンカー配列(Ala Ser Gly Gly/ASGG)
LINKER4:立体リンカー配列(Gly Gly Gly Ser/GGGS)
LINKER5:立体リンカー配列(Ser His Ala Ser/SHAS)
FURIN:フューリンにより切断される配列(Arg Lys Lys Arg/RKKR)
UROKIN:ウロキナーゼにより切断される配列(Arg Val Val Arg/RVVR)
PEG:PEG化リンカー配列(Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu/ASGCGPE)
TRANS1:輸送配列(Lys Asp Glu Leu/KDEL)
TRANS2:輸送配列(Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg/RRRRRRRR)
TRANS3:(Lys Glu Asp Leu/KEDL)
LINKER6:(Cys Ala Ala Ala Cys AlaAla Cys/CAAACAAC)
LINKER7:(Gly Gly Gly/GGG)
MMP:(Pro Leu Gly Leu Ala Gly/PLGLAG)
FURIN.NAT:(Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu/RHRQPRGWEQL)
本発明の融合タンパク質の代表例を、以下の例に示す。
以下のアミノ酸配列成分の記号を使用する。
LINKER1:立体リンカー配列(Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGS)
LINKER2:立体リンカー配列(Gly Gly Gly Gly/GGGG)
LINKER3:立体リンカー配列(Ala Ser Gly Gly/ASGG)
LINKER4:立体リンカー配列(Gly Gly Gly Ser/GGGS)
LINKER5:立体リンカー配列(Ser His Ala Ser/SHAS)
FURIN:フューリンにより切断される配列(Arg Lys Lys Arg/RKKR)
UROKIN:ウロキナーゼにより切断される配列(Arg Val Val Arg/RVVR)
PEG:PEG化リンカー配列(Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu/ASGCGPE)
TRANS1:輸送配列(Lys Asp Glu Leu/KDEL)
TRANS2:輸送配列(Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg/RRRRRRRR)
TRANS3:(Lys Glu Asp Leu/KEDL)
LINKER6:(Cys Ala Ala Ala Cys AlaAla Cys/CAAACAAC)
LINKER7:(Gly Gly Gly/GGG)
MMP:(Pro Leu Gly Leu Ala Gly/PLGLAG)
FURIN.NAT:(Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu/RHRQPRGWEQL)
例1.配列番号1の融合タンパク質
配列番号1のタンパク質は、430アミノ酸の長さおよび48.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列により形成され、エフェクターペプチドのドメイン(b)は248アミノ酸のボウガニン(boguanin)ドメインA(配列番号55)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号55)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
配列番号1のタンパク質は、430アミノ酸の長さおよび48.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列により形成され、エフェクターペプチドのドメイン(b)は248アミノ酸のボウガニン(boguanin)ドメインA(配列番号55)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号55)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号1および配列番号85である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号1)を、そのコードDNA配列(配列番号85)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号1)を、そのコードDNA配列(配列番号85)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例2.配列番号2の融合タンパク質
配列番号2のタンパク質は、267アミノ酸の長さおよび50.8kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はリシンAの267アミノ酸ドメイン(配列番号56)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)はドメイン(b)から、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化配列(ASGCGPE)、およびフューリンにより認識される切断部位の配列(RKKR)によって隔てられている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、構築物全体のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−LINKER1−(配列番号56)−TRANS1
配列番号2のタンパク質は、267アミノ酸の長さおよび50.8kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はリシンAの267アミノ酸ドメイン(配列番号56)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)はドメイン(b)から、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化配列(ASGCGPE)、およびフューリンにより認識される切断部位の配列(RKKR)によって隔てられている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、構築物全体のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−LINKER1−(配列番号56)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号2および配列番号86である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号2)を、そのコードDNA配列(配列番号86)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例2a)およびヒスチジンタグなし(例2b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号2)を、そのコードDNA配列(配列番号86)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例2a)およびヒスチジンタグなし(例2b)の両方で発現された。
例3.配列番号3の融合タンパク質
配列番号2のタンパク質は、378アミノ酸の長さおよび42kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はリシンAドメインの267アミノ酸変異体(配列番号57)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)はドメイン(b)から、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化配列(ASGCGPE)、フューリンにより認識される切断部位の配列(RKKR)、および立体リンカー配列(GGGGS)によって隔てられている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、構築物全体のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−LINKER1−(配列番号57)−TRANS1
配列番号2のタンパク質は、378アミノ酸の長さおよび42kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はリシンAドメインの267アミノ酸変異体(配列番号57)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)はドメイン(b)から、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化配列(ASGCGPE)、フューリンにより認識される切断部位の配列(RKKR)、および立体リンカー配列(GGGGS)によって隔てられている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、構築物全体のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−LINKER1−(配列番号57)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号3および配列番号87である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号3)を、そのコードDNA配列(配列番号87)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号3)を、そのコードDNA配列(配列番号87)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例4.配列番号4の融合タンパク質
配列番号4のタンパク質は、473アミノ酸の長さおよび53.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はPAP毒素の290アミノ酸ホモログ(配列番号58)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)はドメイン(b)から、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)によって隔てられている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、構築物全体のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−LINKER1−(配列番号58)−TRANS1
配列番号4のタンパク質は、473アミノ酸の長さおよび53.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はPAP毒素の290アミノ酸ホモログ(配列番号58)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)はドメイン(b)から、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)によって隔てられている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、構築物全体のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−LINKER1−(配列番号58)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号4および配列番号88である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号4)を、そのコードDNA配列(配列番号88)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号4)を、そのコードDNA配列(配列番号88)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例5.配列番号5の融合タンパク質
配列番号5のタンパク質は、430アミノ酸の長さおよび48.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はサポリンの252アミノ酸フラグメント(配列番号59)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)はドメイン(b)から、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)によって隔てられている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−LINKER1−(配列番号59)
配列番号5のタンパク質は、430アミノ酸の長さおよび48.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はサポリンの252アミノ酸フラグメント(配列番号59)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)はドメイン(b)から、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)によって隔てられている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−LINKER1−(配列番号59)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号5および配列番号89である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号5)を、そのコードDNA配列(配列番号89)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号5)を、そのコードDNA配列(配列番号89)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例6.配列番号6の融合タンパク質
配列番号6のタンパク質は、442アミノ酸の長さおよび49.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はサポリンの252アミノ酸フラグメント(配列番号59)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、2つの立体リンカー配列(GGGGS)、およびフューリンにより切断される配列(RKKR)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−PEG−LINKER1−LINKER1−FURIN−(配列番号59)
配列番号6のタンパク質は、442アミノ酸の長さおよび49.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はサポリンの252アミノ酸フラグメント(配列番号59)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、2つの立体リンカー配列(GGGGS)、およびフューリンにより切断される配列(RKKR)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−PEG−LINKER1−LINKER1−FURIN−(配列番号59)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号6および配列番号90である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号6)を、そのコードDNA配列(配列番号90)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号6)を、そのコードDNA配列(配列番号90)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例7.配列番号7の融合タンパク質
配列番号7のタンパク質は、429アミノ酸の長さおよび47.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は247アミノ酸ペプチドトリコサンチン(配列番号60)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号60)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
配列番号7のタンパク質は、429アミノ酸の長さおよび47.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は247アミノ酸ペプチドトリコサンチン(配列番号60)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号60)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号7および配列番号91である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号7)を、そのコードDNA配列(配列番号91)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号7)を、そのコードDNA配列(配列番号91)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例8.配列番号8の融合タンパク質
配列番号8のタンパク質は、427アミノ酸の長さおよび47.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は247アミノ酸ペプチドトリコサンチン(配列番号61)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号61)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
配列番号8のタンパク質は、427アミノ酸の長さおよび47.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は247アミノ酸ペプチドトリコサンチン(配列番号61)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号61)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号8および配列番号92である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号8)を、そのコードDNA配列(配列番号92)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号8)を、そのコードDNA配列(配列番号92)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例9.配列番号9の融合タンパク質
配列番号9のタンパク質は、427アミノ酸の長さおよび47.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はヤドリギ(mistletoe)レクチンAの249アミノ酸鎖(配列番号62)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号62)−LINKER1−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
配列番号9のタンパク質は、427アミノ酸の長さおよび47.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はヤドリギ(mistletoe)レクチンAの249アミノ酸鎖(配列番号62)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号62)−LINKER1−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号9および配列番号93である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号9)を、そのコードDNA配列(配列番号93)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号9)を、そのコードDNA配列(配列番号93)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例10.配列番号10の融合タンパク質
配列番号10のタンパク質は、462アミノ酸の長さおよび51.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はエブリンの273アミノ酸サブユニットA(配列番号63)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(GGGG)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号63)−LINKER1−PEG−FURIN−LINK2−(TRAIL114−281)
配列番号10のタンパク質は、462アミノ酸の長さおよび51.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はエブリンの273アミノ酸サブユニットA(配列番号63)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(GGGG)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号63)−LINKER1−PEG−FURIN−LINK2−(TRAIL114−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号10および配列番号94である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号10)を、そのコードDNA配列(配列番号94)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号10)を、そのコードDNA配列(配列番号94)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例11.配列番号11の融合タンパク質
配列番号11のタンパク質は、454アミノ酸の長さおよび50.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はニグリンの272アミノ酸サブユニットA(配列番号64)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号64)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
配列番号11のタンパク質は、454アミノ酸の長さおよび50.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はニグリンの272アミノ酸サブユニットA(配列番号64)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号64)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号11および配列番号95である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号11)を、そのコードDNA配列(配列番号95)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号11)を、そのコードDNA配列(配列番号95)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例12.配列番号12の融合タンパク質
配列番号12のタンパク質は、221アミノ酸の長さおよび25.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は47アミノ酸ルフィンP1ペプチド(配列番号65)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)およびフューリンにより切断される配列(RKKR)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−FURIN−(配列番号65)
配列番号12のタンパク質は、221アミノ酸の長さおよび25.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は47アミノ酸ルフィンP1ペプチド(配列番号65)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)およびフューリンにより切断される配列(RKKR)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−FURIN−(配列番号65)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号12および配列番号96である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号12)を、そのコードDNA配列(配列番号96)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号12)を、そのコードDNA配列(配列番号96)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例13.配列番号13の融合タンパク質
配列番号13のタンパク質は、221アミノ酸の長さおよび26kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は47アミノ酸ルフィンP1ペプチド(配列番号65)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(ASGG)および(GGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(ASGG)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER4−PEG−FURIN−LINKER3−(配列番号65)
配列番号13のタンパク質は、221アミノ酸の長さおよび26kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は47アミノ酸ルフィンP1ペプチド(配列番号65)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(ASGG)および(GGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(ASGG)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER4−PEG−FURIN−LINKER3−(配列番号65)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号13および配列番号97である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号13)を、そのコードDNA配列(配列番号97)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号13)を、そのコードDNA配列(配列番号97)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例14.配列番号14の融合タンパク質
配列番号14のタンパク質は、254アミノ酸の長さおよび29.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL95−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は47アミノ酸ルフィンP1ペプチド(配列番号65)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、およびフューリンにより切断される配列(RKKR)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、構築物全体のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL95−281)−LINKER1−PEG−FURIN−(配列番号65)−TRANS1
配列番号14のタンパク質は、254アミノ酸の長さおよび29.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL95−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は47アミノ酸ルフィンP1ペプチド(配列番号65)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、およびフューリンにより切断される配列(RKKR)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、構築物全体のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL95−281)−LINKER1−PEG−FURIN−(配列番号65)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号14および配列番号98である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号14)を、そのコードDNA配列(配列番号98)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例14a)およびヒスチジンタグなし(例14b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号14)を、そのコードDNA配列(配列番号98)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例14a)およびヒスチジンタグなし(例14b)の両方で発現された。
例15.配列番号15の融合タンパク質
配列番号15のタンパク質は、438アミノ酸の長さおよび49kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はボルケンシンの244アミノ酸サブユニットA(配列番号66)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号66)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
配列番号15のタンパク質は、438アミノ酸の長さおよび49kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はボルケンシンの244アミノ酸サブユニットA(配列番号66)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号66)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号15および配列番号99である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号15)を、そのコードDNA配列(配列番号99)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例15a)およびヒスチジンタグなし(例15b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号15)を、そのコードDNA配列(配列番号99)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例15a)およびヒスチジンタグなし(例15b)の両方で発現された。
例16.配列番号16の融合タンパク質
配列番号16のタンパク質は、431アミノ酸の長さおよび48.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はボルケンシンの244アミノ酸サブユニットA(配列番号66)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、構築物全体のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−LINKER1−(配列番号66)−TRANS1
配列番号16のタンパク質は、431アミノ酸の長さおよび48.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はボルケンシンの244アミノ酸サブユニットA(配列番号66)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、構築物全体のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−LINKER1−(配列番号66)−TRANS1
前記構造のアミノ酸配列(配列番号16)を、そのコードDNA配列(配列番号100)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例17.配列番号17の融合タンパク質
配列番号17のタンパク質は、428アミノ酸の長さおよび47.8kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はボルケンシンの246アミノ酸サブユニットA(配列番号67)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号67)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
配列番号17のタンパク質は、428アミノ酸の長さおよび47.8kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はボルケンシンの246アミノ酸サブユニットA(配列番号67)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号67)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号17および配列番号101である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号17)を、そのコードDNA配列(配列番号101)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号17)を、そのコードDNA配列(配列番号101)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例18.配列番号18の融合タンパク質
配列番号18のタンパク質は、515アミノ酸の長さおよび55.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、Pseudomonas aeruginosa外毒素の改変配列のフラグメントの342アミノ酸ホモログ(配列番号68)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)および立体リンカー配列(ASGG)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、構築物全体のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER4−LINKER3−(配列番号68)−TRANS1
配列番号18のタンパク質は、515アミノ酸の長さおよび55.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、Pseudomonas aeruginosa外毒素の改変配列のフラグメントの342アミノ酸ホモログ(配列番号68)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)および立体リンカー配列(ASGG)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、構築物全体のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER4−LINKER3−(配列番号68)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号18および配列番号102である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号18)を、そのコードDNA配列(配列番号102)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例18a)およびヒスチジンタグなし(例18b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号18)を、そのコードDNA配列(配列番号102)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例18a)およびヒスチジンタグなし(例18b)の両方で発現された。
例19.配列番号19の融合タンパク質
配列番号19のタンパク質は、526アミノ酸の長さおよび57.1kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL119−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの342アミノ酸ホモログA(配列番号68)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(ASGG)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL119−281)−LINKER4−PEG−FURIN−LINKER3−(配列番号68)−TRANS1
配列番号19のタンパク質は、526アミノ酸の長さおよび57.1kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL119−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの342アミノ酸ホモログA(配列番号68)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(ASGG)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL119−281)−LINKER4−PEG−FURIN−LINKER3−(配列番号68)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号19および配列番号103である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号19)を、そのコードDNA配列(配列番号103)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号19)を、そのコードDNA配列(配列番号103)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例20.配列番号20の融合タンパク質
配列番号20のタンパク質は、526アミノ酸の長さおよび57.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの354アミノ酸ホモログ(配列番号84)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(ASGG)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER4−PEG−FURIN−LINKER3−(配列番号84)−TRANS1
配列番号20のタンパク質は、526アミノ酸の長さおよび57.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの354アミノ酸ホモログ(配列番号84)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(ASGG)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER4−PEG−FURIN−LINKER3−(配列番号84)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号20および配列番号104である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号20)を、そのコードDNA配列(配列番号104)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例20a)およびヒスチジンタグなし(例20b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号20)を、そのコードDNA配列(配列番号104)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例20a)およびヒスチジンタグなし(例20b)の両方で発現された。
例21.配列番号21の融合タンパク質
配列番号21のタンパク質は、534アミノ酸の長さおよび58.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの354アミノ酸ホモログ(配列番号69)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(ASGG)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER4−PEG−FURIN−LINKER3−(配列番号69)
配列番号21のタンパク質は、534アミノ酸の長さおよび58.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの354アミノ酸ホモログ(配列番号69)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(ASGG)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER4−PEG−FURIN−LINKER3−(配列番号69)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号21および配列番号105である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号21)を、そのコードDNA配列(配列番号105)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号21)を、そのコードDNA配列(配列番号105)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例22.配列番号22の融合タンパク質
配列番号22のタンパク質は、534アミノ酸の長さおよび56.1kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列の342アミノ酸フラグメント(配列番号83)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、立体リンカー配列(GGGS)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER4−(配列番号83)
配列番号22のタンパク質は、534アミノ酸の長さおよび56.1kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列の342アミノ酸フラグメント(配列番号83)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、立体リンカー配列(GGGS)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER4−(配列番号83)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号22および配列番号106である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号22)を、そのコードDNA配列(配列番号106)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号22)を、そのコードDNA配列(配列番号106)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例23.配列番号23の融合タンパク質
配列番号23のタンパク質は、526アミノ酸の長さおよび57.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL119−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列の342アミノ酸フラグメント(配列番号83)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(ASGG)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL119−281)−LINKER4−PEG−FURIN−LINKER3−(配列番号83)−TRANS1
配列番号23のタンパク質は、526アミノ酸の長さおよび57.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL119−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列の342アミノ酸フラグメント(配列番号83)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(ASGG)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL119−281)−LINKER4−PEG−FURIN−LINKER3−(配列番号83)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号23および配列番号107である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号23)を、そのコードDNA配列(配列番号107)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号23)を、そのコードDNA配列(配列番号107)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例24.配列番号24の融合タンパク質
配列番号24のタンパク質は、526アミノ酸の長さおよび57.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列の342アミノ酸フラグメント(配列番号83)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(ASGG)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL119−281)−LINKER4−PEG−FURIN−LINKER3−(配列番号83)−TRANS1
配列番号24のタンパク質は、526アミノ酸の長さおよび57.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列の342アミノ酸フラグメント(配列番号83)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(ASGG)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL119−281)−LINKER4−PEG−FURIN−LINKER3−(配列番号83)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号24および配列番号108である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号24)を、そのコードDNA配列(配列番号108)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号24)を、そのコードDNA配列(配列番号108)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例25.配列番号25の融合タンパク質
配列番号25のタンパク質は、423アミノ酸の長さおよび47.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、志賀毒素stxの239アミノ酸変異体(配列番号70)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(SHHAS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号70)−LINKER5−FURIN−LINKER1−(TRAIL114−281)
配列番号25のタンパク質は、423アミノ酸の長さおよび47.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、志賀毒素stxの239アミノ酸変異体(配列番号70)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(SHHAS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号70)−LINKER5−FURIN−LINKER1−(TRAIL114−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号25および配列番号109である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号25)を、そのコードDNA配列(配列番号109)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号25)を、そのコードDNA配列(配列番号109)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例26.配列番号26の融合タンパク質
配列番号26のタンパク質は、432アミノ酸の長さおよび47.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL120−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、志賀毒素stxの239アミノ酸変異体(配列番号70)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)、PEG化配列(ASGCGPE)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(GGGS)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL120−281)−LINKER4−PEG−FURIN−LINKER4−(配列番号70)−TRANS1
配列番号26のタンパク質は、432アミノ酸の長さおよび47.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL120−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、志賀毒素stxの239アミノ酸変異体(配列番号70)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)、PEG化配列(ASGCGPE)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(GGGS)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL120−281)−LINKER4−PEG−FURIN−LINKER4−(配列番号70)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号26および配列番号110である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号26)を、そのコードDNA配列(配列番号110)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例26a)およびヒスチジンタグなし(例26b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号26)を、そのコードDNA配列(配列番号110)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例26a)およびヒスチジンタグなし(例26b)の両方で発現された。
例27.配列番号27の融合タンパク質
配列番号27のタンパク質は、526アミノ酸の長さおよび38kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、149アミノ酸の制限ペプチド(配列番号71)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、およびPEG化リンカー配列(ASGCGPE)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号71)−LINKER1−LINKER1−FURIN−PEG−(TRAIL114−281)
配列番号27のタンパク質は、526アミノ酸の長さおよび38kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、149アミノ酸の制限ペプチド(配列番号71)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、およびPEG化リンカー配列(ASGCGPE)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号71)−LINKER1−LINKER1−FURIN−PEG−(TRAIL114−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号27および配列番号111である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号27)を、そのコードDNA配列(配列番号111)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例27a)およびヒスチジンタグなし(例27b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号27)を、そのコードDNA配列(配列番号111)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例27a)およびヒスチジンタグなし(例27b)の両方で発現された。
例28.配列番号28の融合タンパク質
配列番号28のタンパク質は、335アミノ酸の長さおよび37.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、149アミノ酸の制限ペプチド(配列番号71)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−LINKER1−(配列番号71)−TR2
配列番号28のタンパク質は、335アミノ酸の長さおよび37.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、149アミノ酸の制限ペプチド(配列番号71)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−LINKER1−(配列番号71)−TR2
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号28および配列番号112である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号28)を、そのコードDNA配列(配列番号112)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例28a)およびヒスチジンタグなし(例28b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号28)を、そのコードDNA配列(配列番号112)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例28a)およびヒスチジンタグなし(例28b)の両方で発現された。
例29.配列番号29の融合タンパク質
配列番号29のタンパク質は、319アミノ酸の長さおよび35.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、130アミノ酸のヒルステリン(hirsutellin)ペプチド(配列番号72)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、およびPEG化リンカー配列(ASGCGPE)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号72)−LINKER1−LINKER1−FURIN−PEG−(TRAIL114−281)
配列番号29のタンパク質は、319アミノ酸の長さおよび35.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、130アミノ酸のヒルステリン(hirsutellin)ペプチド(配列番号72)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、およびPEG化リンカー配列(ASGCGPE)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号72)−LINKER1−LINKER1−FURIN−PEG−(TRAIL114−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号29および配列番号113である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号29)を、そのコードDNA配列(配列番号113)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例29a)およびヒスチジンタグなし(例29b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号29)を、そのコードDNA配列(配列番号113)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例29a)およびヒスチジンタグなし(例29b)の両方で発現された。
例30.配列番号30の融合タンパク質
配列番号30のタンパク質は、290アミノ酸の長さおよび32.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、109アミノ酸のKidタンパク質(配列番号73)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、およびフューリンにより切断される配列(RKKR)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−(配列番号73)−TRANS1
配列番号30のタンパク質は、290アミノ酸の長さおよび32.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、109アミノ酸のKidタンパク質(配列番号73)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、およびフューリンにより切断される配列(RKKR)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−(配列番号73)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号30および配列番号114である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号30)を、そのコードDNA配列(配列番号114)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号30)を、そのコードDNA配列(配列番号114)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例31.配列番号31の融合タンパク質
配列番号31のタンパク質は、277アミノ酸の長さおよび31.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、109アミノ酸のCcdBタンパク質(配列番号74)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、およびフューリンにより切断される配列(RKKR)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−(配列番号74)
配列番号31のタンパク質は、277アミノ酸の長さおよび31.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、109アミノ酸のCcdBタンパク質(配列番号74)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、およびフューリンにより切断される配列(RKKR)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−(配列番号74)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号31および配列番号115である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号31)を、そのコードDNA配列(配列番号115)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号31)を、そのコードDNA配列(配列番号115)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例32.配列番号32の融合タンパク質
配列番号32のタンパク質は、228アミノ酸の長さおよび25.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、CcdBタンパク質の47アミノ酸変異体(配列番号75)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、およびフューリンにより切断される配列(RKKR)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−(配列番号75)−TRANS1
配列番号32のタンパク質は、228アミノ酸の長さおよび25.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、CcdBタンパク質の47アミノ酸変異体(配列番号75)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、およびフューリンにより切断される配列(RKKR)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−(配列番号75)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号32および配列番号116である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号32)を、そのコードDNA配列(配列番号116)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例32a)およびヒスチジンタグなし(例32b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号32)を、そのコードDNA配列(配列番号116)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例32a)およびヒスチジンタグなし(例32b)の両方で発現された。
例33.配列番号33の融合タンパク質
配列番号33のタンパク質は、275アミノ酸の長さおよび31.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、94アミノ酸のRelEタンパク質(配列番号76)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、およびフューリンにより切断される配列(RKKR)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−(配列番号76)−TRANS1
配列番号33のタンパク質は、275アミノ酸の長さおよび31.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、94アミノ酸のRelEタンパク質(配列番号76)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、およびフューリンにより切断される配列(RKKR)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−(配列番号76)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号33および配列番号117である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号33)を、そのコードDNA配列(配列番号117)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号33)を、そのコードDNA配列(配列番号117)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例34.配列番号34の融合タンパク質
配列番号34のタンパク質は、271アミノ酸の長さおよび30.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、90アミノ酸のStaBタンパク質(配列番号77)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、およびフューリンにより切断される配列(RKKR)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−(配列番号77)−TRANS1
配列番号34のタンパク質は、271アミノ酸の長さおよび30.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、90アミノ酸のStaBタンパク質(配列番号77)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、およびフューリンにより切断される配列(RKKR)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−(配列番号77)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号34および配列番号118である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号34)を、そのコードDNA配列(配列番号118)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号34)を、そのコードDNA配列(配列番号118)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例35.配列番号35の融合タンパク質
配列番号35のタンパク質は、429アミノ酸の長さおよび48.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、251アミノ酸ゲロニンペプチド(配列番号78)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号78)−LINKER1−LINKER1−(TRAIL114−281)
配列番号35のタンパク質は、429アミノ酸の長さおよび48.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、251アミノ酸ゲロニンペプチド(配列番号78)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号78)−LINKER1−LINKER1−(TRAIL114−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号35および配列番号119である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号35)を、そのコードDNA配列(配列番号119)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号35)を、そのコードDNA配列(配列番号119)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例36.配列番号36の融合タンパク質
配列番号36のタンパク質は、434アミノ酸の長さおよび48.6kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL120−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、251アミノ酸ゲロニンペプチド(配列番号78)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号78)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL120−281)
配列番号36のタンパク質は、434アミノ酸の長さおよび48.6kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL120−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、251アミノ酸ゲロニンペプチド(配列番号78)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号78)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL120−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号36および配列番号120である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号36)を、そのコードDNA配列(配列番号120)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号36)を、そのコードDNA配列(配列番号120)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例37.配列番号37の融合タンパク質
配列番号37のタンパク質は、427アミノ酸の長さおよび48kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、251アミノ酸ゲロニンペプチド(配列番号78)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−PEG−LINKER1−(配列番号78)−TRANS1
配列番号37のタンパク質は、427アミノ酸の長さおよび48kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、251アミノ酸ゲロニンペプチド(配列番号78)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−PEG−LINKER1−(配列番号78)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号37および配列番号121である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号37)を、そのコードDNA配列(配列番号121)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号37)を、そのコードDNA配列(配列番号121)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例38.配列番号38の融合タンパク質
配列番号38のタンパク質は、433アミノ酸の長さおよび48.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、251アミノ酸ゲロニンペプチド(配列番号78)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号78)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
配列番号38のタンパク質は、433アミノ酸の長さおよび48.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、251アミノ酸ゲロニンペプチド(配列番号78)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号78)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号38および配列番号122である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号38)を、そのコードDNA配列(配列番号122)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号38)を、そのコードDNA配列(配列番号122)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例39.配列番号39の融合タンパク質
配列番号39のタンパク質は、558アミノ酸の長さおよび61.4kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ジフテリア毒素の387アミノ酸サブユニットA(配列番号79)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号79)−LINKER1−LINKER1−(TRAIL121−281)
配列番号39のタンパク質は、558アミノ酸の長さおよび61.4kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ジフテリア毒素の387アミノ酸サブユニットA(配列番号79)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号79)−LINKER1−LINKER1−(TRAIL121−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号39および配列番号123である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号39)を、そのコードDNA配列(配列番号123)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号39)を、そのコードDNA配列(配列番号123)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例40.配列番号40の融合タンパク質
配列番号40のタンパク質は、481アミノ酸の長さおよび53.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ジフテリア毒素の193アミノ酸触媒ドメイン(配列番号80)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、Pseudomonas毒素由来の輸送ドメインの配列(配列番号139)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−FURIN−(配列番号139)−LINKER1−(配列番号80)
配列番号40のタンパク質は、481アミノ酸の長さおよび53.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ジフテリア毒素の193アミノ酸触媒ドメイン(配列番号80)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、Pseudomonas毒素由来の輸送ドメインの配列(配列番号139)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−FURIN−(配列番号139)−LINKER1−(配列番号80)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号40および配列番号124である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号40)を、そのコードDNA配列(配列番号124)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例40a)およびヒスチジンタグなし(例40b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号40)を、そのコードDNA配列(配列番号124)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例40a)およびヒスチジンタグなし(例40b)の両方で発現された。
例41.配列番号41の融合タンパク質
配列番号41のタンパク質は、481アミノ酸の長さおよび53.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ジフテリア毒素の189アミノ酸触媒ドメイン(配列番号81)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(GGGGS)、Pseudomonas毒素由来の輸送ドメインの配列(配列番号139)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号81)−FURIN−LINKER1−(配列番号139)−FURIN−LINKER1−LINKER1−(TRAIL121−281)
配列番号41のタンパク質は、481アミノ酸の長さおよび53.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ジフテリア毒素の189アミノ酸触媒ドメイン(配列番号81)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および立体リンカー配列(GGGGS)、Pseudomonas毒素由来の輸送ドメインの配列(配列番号139)、フューリンにより切断される配列(RKKR)、および2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号81)−FURIN−LINKER1−(配列番号139)−FURIN−LINKER1−LINKER1−(TRAIL121−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号41および配列番号125である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号41)を、そのコードDNA配列(配列番号125)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号41)を、そのコードDNA配列(配列番号125)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例42.配列番号42の融合タンパク質
配列番号42のタンパク質は、432アミノ酸の長さおよび48.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、アブリンの251アミノ酸ドメインA(配列番号82)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号82)−LINKER1−LINKER1−(TRAIL114−281)
配列番号42のタンパク質は、432アミノ酸の長さおよび48.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、アブリンの251アミノ酸ドメインA(配列番号82)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号82)−LINKER1−LINKER1−(TRAIL114−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号42および配列番号126である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号42)を、そのコードDNA配列(配列番号126)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例42a)およびヒスチジンタグなし(例42b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号42)を、そのコードDNA配列(配列番号126)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例42a)およびヒスチジンタグなし(例42b)の両方で発現された。
例43.配列番号43の融合タンパク質
配列番号43のタンパク質は、443アミノ酸の長さおよび49.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、アブリンの251アミノ酸ドメインA(配列番号82)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、インテグリンリガンドの配列(配列番号140)、ウロキナーゼにより切断される配列(RVVR)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号82)−LINKER1−(配列番号140)−UROKIN−LINKER1−(TRAIL114−281)
配列番号43のタンパク質は、443アミノ酸の長さおよび49.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、アブリンの251アミノ酸ドメインA(配列番号82)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、インテグリンリガンドの配列(配列番号140)、ウロキナーゼにより切断される配列(RVVR)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号82)−LINKER1−(配列番号140)−UROKIN−LINKER1−(TRAIL114−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号43および配列番号127である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号43)を、そのコードDNA配列(配列番号127)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例43a)およびヒスチジンタグなし(例43b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号43)を、そのコードDNA配列(配列番号127)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例43a)およびヒスチジンタグなし(例43b)の両方で発現された。
例44.配列番号44の融合タンパク質
配列番号44のタンパク質は、433アミノ酸の長さおよび48.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、アブリンの251アミノ酸ドメインA(配列番号82)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)およびウロキナーゼにより切断される配列(RVVR)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号82)−LINKER1−LINKER1−UROKIN−(TRAIL114−281)
配列番号44のタンパク質は、433アミノ酸の長さおよび48.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、アブリンの251アミノ酸ドメインA(配列番号82)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)およびウロキナーゼにより切断される配列(RVVR)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号82)−LINKER1−LINKER1−UROKIN−(TRAIL114−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号44および配列番号128である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号44)を、そのコードDNA配列(配列番号128)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例44a)およびヒスチジンタグなし(例44b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号44)を、そのコードDNA配列(配列番号128)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例44a)およびヒスチジンタグなし(例44b)の両方で発現された。
例45.配列番号45の融合タンパク質
配列番号45のタンパク質は、441アミノ酸の長さおよび50kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、アブリンの251アミノ酸ドメインA(配列番号82)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、8つのアルギニン残基からなる輸送配列(RRRRRRRR)、ウロキナーゼにより切断される配列(RVVR)、および順番に2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号82)−TRANS2−UROKIN−LINKER1−LINKER1−(TRAIL114−281)
配列番号45のタンパク質は、441アミノ酸の長さおよび50kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、アブリンの251アミノ酸ドメインA(配列番号82)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、8つのアルギニン残基からなる輸送配列(RRRRRRRR)、ウロキナーゼにより切断される配列(RVVR)、および順番に2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号82)−TRANS2−UROKIN−LINKER1−LINKER1−(TRAIL114−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号45および配列番号129である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号45)を、そのコードDNA配列(配列番号129)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号45)を、そのコードDNA配列(配列番号129)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例46.配列番号46の融合タンパク質
配列番号46のタンパク質は、550アミノ酸の長さおよび61.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、アブリンの251アミノ酸ドメインA(配列番号82)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、ウロキナーゼにより切断される配列(RVVR)、Pseudomonas由来の輸送ドメイン配列(配列番号139)、立体リンカー配列(GGGGS)、およびウロキナーゼにより切断される配列(RVVR)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL114−281)−LINKER1−UROKIN−(配列番号139)−LINKER1−UROKIN−(配列番号82)
配列番号46のタンパク質は、550アミノ酸の長さおよび61.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、アブリンの251アミノ酸ドメインA(配列番号82)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、ウロキナーゼにより切断される配列(RVVR)、Pseudomonas由来の輸送ドメイン配列(配列番号139)、立体リンカー配列(GGGGS)、およびウロキナーゼにより切断される配列(RVVR)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL114−281)−LINKER1−UROKIN−(配列番号139)−LINKER1−UROKIN−(配列番号82)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号46および配列番号130である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号46)を、そのコードDNA配列(配列番号130)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例46a)およびヒスチジンタグなし(例46b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号46)を、そのコードDNA配列(配列番号130)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例46a)およびヒスチジンタグなし(例46b)の両方で発現された。
例47.配列番号47の融合タンパク質
配列番号47のタンパク質は、459アミノ酸の長さおよび51.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL95−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、アブリンの251アミノ酸ドメインA(配列番号82)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)、ウロキナーゼにより切断される配列(RVVR)、およびPEG化リンカー配列(ASGCGPE)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号82)−LINKER1−LINKER1−UROKIN−PEG−(TRAIL95−281)
配列番号47のタンパク質は、459アミノ酸の長さおよび51.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL95−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、アブリンの251アミノ酸ドメインA(配列番号82)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)、ウロキナーゼにより切断される配列(RVVR)、およびPEG化リンカー配列(ASGCGPE)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号82)−LINKER1−LINKER1−UROKIN−PEG−(TRAIL95−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号47および配列番号131である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号47)を、そのコードDNA配列(配列番号131)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例47a)およびヒスチジンタグなし(例47b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号47)を、そのコードDNA配列(配列番号131)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例47a)およびヒスチジンタグなし(例47b)の両方で発現された。
例48.配列番号48の融合タンパク質
配列番号48のタンパク質は、443アミノ酸の長さおよび49.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、アブリンの251アミノ酸ドメインA(配列番号82)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、ウロキナーゼにより切断される配列(RVVR)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−UROKIN−LINKER1−(配列番号82)
配列番号48のタンパク質は、443アミノ酸の長さおよび49.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、アブリンの251アミノ酸ドメインA(配列番号82)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、ウロキナーゼにより切断される配列(RVVR)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−UROKIN−LINKER1−(配列番号82)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号48および配列番号132である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号48)を、そのコードDNA配列(配列番号132)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号48)を、そのコードDNA配列(配列番号132)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例49.配列番号49の融合タンパク質
配列番号49のタンパク質は、447アミノ酸の長さおよび50.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、アブリンの251アミノ酸ドメインA(配列番号82)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、ウロキナーゼにより切断される配列(RVVR)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−UROKIN−LINKER1−(配列番号82)−TRANS1
配列番号49のタンパク質は、447アミノ酸の長さおよび50.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、アブリンの251アミノ酸ドメインA(配列番号82)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、ウロキナーゼにより切断される配列(RVVR)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−UROKIN−LINKER1−(配列番号82)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号49および配列番号133である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号49)を、そのコードDNA配列(配列番号133)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例49a)およびヒスチジンタグなし(例49b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号49)を、そのコードDNA配列(配列番号133)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例49a)およびヒスチジンタグなし(例49b)の両方で発現された。
例50.配列番号50の融合タンパク質
配列番号50のタンパク質は、441アミノ酸の長さおよび49.4kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、アブリンの251アミノ酸ドメインA(配列番号82)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)、ウロキナーゼにより切断される配列(RVVR)、およびPEG化リンカー配列(ASGCGPE)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号82)−LINKER1−LINKER1−UROKIN−PEG−(TRAIL114−281)
配列番号50のタンパク質は、441アミノ酸の長さおよび49.4kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、アブリンの251アミノ酸ドメインA(配列番号82)であり、ドメイン(a)のN末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)、ウロキナーゼにより切断される配列(RVVR)、およびPEG化リンカー配列(ASGCGPE)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号82)−LINKER1−LINKER1−UROKIN−PEG−(TRAIL114−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号50および配列番号134である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号50)を、そのコードDNA配列(配列番号134)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例50a)およびヒスチジンタグなし(例50b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号50)を、そのコードDNA配列(配列番号134)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例50a)およびヒスチジンタグなし(例50b)の両方で発現された。
例51.配列番号51の融合タンパク質
配列番号51のタンパク質は、515アミノ酸の長さおよび55.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は、D218H変異を含有するTRAIL121−281(配列番号142)であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの342アミノ酸ホモログ(配列番号68)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)および(ASGG)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号142)−LINKER4−LINKER3−(配列番号68)−TRANS1
配列番号51のタンパク質は、515アミノ酸の長さおよび55.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は、D218H変異を含有するTRAIL121−281(配列番号142)であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの342アミノ酸ホモログ(配列番号68)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)および(ASGG)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号142)−LINKER4−LINKER3−(配列番号68)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号51および配列番号135である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号51)を、そのコードDNA配列(配列番号135)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例51a)およびヒスチジンタグなし(例51b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号51)を、そのコードDNA配列(配列番号135)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例51a)およびヒスチジンタグなし(例51b)の両方で発現された。
例52.配列番号52の融合タンパク質
配列番号52のタンパク質は、515アミノ酸の長さおよび55.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は、変異Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266R/D269Hを含有するTRAIL121−281(配列番号143)であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの342アミノ酸ホモログ(配列番号68)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)および(ASGG)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号143)−LINKER4−LINKER3−(配列番号68)−TRANS1
配列番号52のタンパク質は、515アミノ酸の長さおよび55.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は、変異Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266R/D269Hを含有するTRAIL121−281(配列番号143)であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの342アミノ酸ホモログ(配列番号68)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)および(ASGG)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号143)−LINKER4−LINKER3−(配列番号68)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号52および配列番号136である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号52)を、そのコードDNA配列(配列番号136)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号52)を、そのコードDNA配列(配列番号136)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例53.配列番号53の融合タンパク質
配列番号53のタンパク質は、515アミノ酸の長さおよび55.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は、D218H変異を含有するTRAIL121−281(配列番号142)であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの342アミノ酸ホモログ(配列番号83)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)およびPEG化リンカー配列(ASGCGPE)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号142)−LINKER4−PEG−(配列番号83)−TRANS1
配列番号53のタンパク質は、515アミノ酸の長さおよび55.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は、D218H変異を含有するTRAIL121−281(配列番号142)であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの342アミノ酸ホモログ(配列番号83)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)およびPEG化リンカー配列(ASGCGPE)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号142)−LINKER4−PEG−(配列番号83)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号53および配列番号137である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号53)を、そのコードDNA配列(配列番号137)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号53)を、そのコードDNA配列(配列番号137)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例54.配列番号54の融合タンパク質
配列番号54のタンパク質は、515アミノ酸の長さおよび55.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は、変異Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266R/D269Hを含有するTRAIL121−281(配列番号143)であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの342アミノ酸ホモログ(配列番号83)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)および(ASGG)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号143)−LINKER4−LINKER3−(配列番号83)−TRANS1
配列番号54のタンパク質は、515アミノ酸の長さおよび55.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は、変異Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266R/D269Hを含有するTRAIL121−281(配列番号143)であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの342アミノ酸ホモログ(配列番号83)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)および(ASGG)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号143)−LINKER4−LINKER3−(配列番号83)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号54および配列番号138である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号54)を、そのコードDNA配列(配列番号138)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例54a)およびヒスチジンタグなし(例54b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号54)を、そのコードDNA配列(配列番号138)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例54a)およびヒスチジンタグなし(例54b)の両方で発現された。
例55.配列番号144の融合タンパク質
配列番号144のタンパク質は、433アミノ酸の長さおよび48.8kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は、TRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はドメイン(a)のN末端に付着しており、アブリンAドメインの251アミノ酸変異体(配列番号194)である。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)、およびフューリンにより認識される切断部位(RKKR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号194)−LINKER1−LINKER1−FURIN−(TRAIL114−281)
配列番号144のタンパク質は、433アミノ酸の長さおよび48.8kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は、TRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はドメイン(a)のN末端に付着しており、アブリンAドメインの251アミノ酸変異体(配列番号194)である。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)、およびフューリンにより認識される切断部位(RKKR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号194)−LINKER1−LINKER1−FURIN−(TRAIL114−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号144および配列番号169である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号144)を、そのコードDNA配列(配列番号169)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号144)を、そのコードDNA配列(配列番号169)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例56.配列番号145の融合タンパク質
配列番号145のタンパク質は、450アミノ酸の長さおよび50.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はドメイン(a)のC末端に付着しており、リシンAドメインの264アミノ酸欠失変異体(配列番号195)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、フューリンにより認識される配列および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−LINKER1−(配列番号195)−TRANS3
配列番号145のタンパク質は、450アミノ酸の長さおよび50.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はドメイン(a)のC末端に付着しており、リシンAドメインの264アミノ酸欠失変異体(配列番号195)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、PEG化リンカー配列(ASGCGPE)、フューリンにより認識される配列および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−LINKER1−(配列番号195)−TRANS3
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号145および配列番号170である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号145)を、そのコードDNA配列(配列番号170)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号145)を、そのコードDNA配列(配列番号170)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例57.配列番号146の融合タンパク質
配列番号146のタンパク質は、481アミノ酸の長さおよび53kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は、TRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はドメイン(a)のN末端に付着しており、ジフテリア毒素の189アミノ酸変異活性ドメイン(配列番号196)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、フューリンにより認識される切断部位配列(RKKR)、立体リンカー配列(GGGGS)、およびPseudomonas毒素由来の輸送ドメインの配列(配列番号139)、フューリンにより認識される別の切断部位配列(RKKR)、続いて2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号196)−FURIN−LINKER1−配列番号139−FURIN−LINKER1−LINKER1−(TRAIL121−281)
配列番号146のタンパク質は、481アミノ酸の長さおよび53kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は、TRAIL114−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はドメイン(a)のN末端に付着しており、ジフテリア毒素の189アミノ酸変異活性ドメイン(配列番号196)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、フューリンにより認識される切断部位配列(RKKR)、立体リンカー配列(GGGGS)、およびPseudomonas毒素由来の輸送ドメインの配列(配列番号139)、フューリンにより認識される別の切断部位配列(RKKR)、続いて2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号196)−FURIN−LINKER1−配列番号139−FURIN−LINKER1−LINKER1−(TRAIL121−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号146および配列番号171である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号146)を、そのコードDNA配列(配列番号171)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号146)を、そのコードDNA配列(配列番号171)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例58.配列番号147の融合タンパク質
配列番号147のタンパク質は、478アミノ酸の長さおよび52.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はドメイン(a)のN末端に付着しており、ジフテリア毒素の186アミノ酸変異活性ドメイン(配列番号197)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、フューリンにより認識される切断部位配列(RKKR)、立体リンカー配列(GGGGS)、およびPseudomonas毒素由来の輸送ドメインの配列(配列番号139)、フューリンにより認識される別の切断部位配列(RKKR)、続いて2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号197)−FURIN−LINKER1−配列番号139−FURIN−LINKER1−LINKER1−(TRAIL121−281)
配列番号147のタンパク質は、478アミノ酸の長さおよび52.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はドメイン(a)のN末端に付着しており、ジフテリア毒素の186アミノ酸変異活性ドメイン(配列番号197)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、フューリンにより認識される切断部位配列(RKKR)、立体リンカー配列(GGGGS)、およびPseudomonas毒素由来の輸送ドメインの配列(配列番号139)、フューリンにより認識される別の切断部位配列(RKKR)、続いて2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号197)−FURIN−LINKER1−配列番号139−FURIN−LINKER1−LINKER1−(TRAIL121−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号147および配列番号172である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号147)を、そのコードDNA配列(配列番号172)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号147)を、そのコードDNA配列(配列番号172)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例59.配列番号148の融合タンパク質
配列番号148のタンパク質は、433アミノ酸の長さおよび48.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はドメイン(a)のN末端に付着しており、ゲロニンの251アミノ酸突然変異体(配列番号198)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより認識される切断部位配列(RKKR)、PEG化リンカー(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号198)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
配列番号148のタンパク質は、433アミノ酸の長さおよび48.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はドメイン(a)のN末端に付着しており、ゲロニンの251アミノ酸突然変異体(配列番号198)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、フューリンにより認識される切断部位配列(RKKR)、PEG化リンカー(ASGCGPE)、および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号198)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号148および配列番号173である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号148)を、そのコードDNA配列(配列番号173)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例59a)およびヒスチジンタグなし(例59b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号148)を、そのコードDNA配列(配列番号173)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例59a)およびヒスチジンタグなし(例59b)の両方で発現された。
例60.配列番号149の融合タンパク質
配列番号149のタンパク質は、258アミノ酸の長さおよび29.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL95−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はドメイン(a)のC末端に付着しており、47アミノ酸のP1ルフィンペプチド(配列番号65)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、3つの立体リンカー配列(GGGGS)、(GGGG)および(CAAACAAC)、続いてフューリンにより認識される切断部位の配列(RDDR)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL95−281)−LINKER1−LINKER7−LINKER6−FURIN−(配列番号65)−TRANS1
配列番号149のタンパク質は、258アミノ酸の長さおよび29.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL95−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はドメイン(a)のC末端に付着しており、47アミノ酸のP1ルフィンペプチド(配列番号65)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、3つの立体リンカー配列(GGGGS)、(GGGG)および(CAAACAAC)、続いてフューリンにより認識される切断部位の配列(RDDR)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL95−281)−LINKER1−LINKER7−LINKER6−FURIN−(配列番号65)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号149および配列番号174である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号149)を、そのコードDNA配列(配列番号174)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号149)を、そのコードDNA配列(配列番号174)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例61.配列番号150の融合タンパク質
配列番号150のタンパク質は、253アミノ酸の長さおよび29.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL95−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はドメイン(a)のN末端に付着しており、47アミノ酸のP1ルフィンペプチド(配列番号65)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、フューリンにより認識される切断部位配列(RKKR)および立体リンカー配列(GGG)と(CAAACAAC)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号65)−TRANS1−FURIN−LINKER7−LINKER6−(TRAIL95−281)
配列番号150のタンパク質は、253アミノ酸の長さおよび29.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL95−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はドメイン(a)のN末端に付着しており、47アミノ酸のP1ルフィンペプチド(配列番号65)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、フューリンにより認識される切断部位配列(RKKR)および立体リンカー配列(GGG)と(CAAACAAC)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号65)−TRANS1−FURIN−LINKER7−LINKER6−(TRAIL95−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号150および配列番号175である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号150)を、そのコードDNA配列(配列番号175)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号150)を、そのコードDNA配列(配列番号175)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例62.配列番号151の融合タンパク質
配列番号151のタンパク質は、539アミノ酸の長さおよび59.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はドメイン(a)のN末端に付着しており、トリコサンチンの247アミノ酸突然変異体(配列番号199)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、フューリンにより認識される切断部位配列(RKKR)および立体リンカー配列(GGGGS)、続いてPseudomonas毒素由来の輸送ドメインの配列(配列番号139)、フューリンにより認識される別の切断部位(RKKR)および2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号199)−FURIN−LINKER1−配列番号139−FURIN−LINKER1−LINKER1−(TRAIL121−281)
配列番号151のタンパク質は、539アミノ酸の長さおよび59.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はドメイン(a)のN末端に付着しており、トリコサンチンの247アミノ酸突然変異体(配列番号199)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、フューリンにより認識される切断部位配列(RKKR)および立体リンカー配列(GGGGS)、続いてPseudomonas毒素由来の輸送ドメインの配列(配列番号139)、フューリンにより認識される別の切断部位(RKKR)および2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号199)−FURIN−LINKER1−配列番号139−FURIN−LINKER1−LINKER1−(TRAIL121−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号151および配列番号176である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号151)を、そのコードDNA配列(配列番号176)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号151)を、そのコードDNA配列(配列番号176)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例63.配列番号152の融合タンパク質
配列番号152のタンパク質は、429アミノ酸の長さおよび47.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はドメイン(a)のN末端に付着しており、トリコサンチンの247アミノ酸突然変異体(配列番号200)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)およびフューリンにより認識される切断部位配列(RKKR)、続いてPEG化配列(ASGCGPE)および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号200)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
配列番号152のタンパク質は、429アミノ酸の長さおよび47.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)はドメイン(a)のN末端に付着しており、トリコサンチンの247アミノ酸突然変異体(配列番号200)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)およびフューリンにより認識される切断部位配列(RKKR)、続いてPEG化配列(ASGCGPE)および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号200)−LINKER1−FURIN−PEG−LINKER1−(TRAIL121−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号152および配列番号177である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号152)を、そのコードDNA配列(配列番号177)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号152)を、そのコードDNA配列(配列番号177)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例64.配列番号153の融合タンパク質
配列番号153のタンパク質は、515アミノ酸の長さおよび55.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、点変異R318K、N441Q、およびR601Kを有する342アミノ酸の改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列(配列番号201)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGS)と(ASGG)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER4−LINKER3−配列番号201−(TRANS1)
配列番号153のタンパク質は、515アミノ酸の長さおよび55.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、点変異R318K、N441Q、およびR601Kを有する342アミノ酸の改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列(配列番号201)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGS)と(ASGG)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER4−LINKER3−配列番号201−(TRANS1)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号153および配列番号178である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号153)を、そのコードDNA配列(配列番号178)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号153)を、そのコードDNA配列(配列番号178)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例65.配列番号154の融合タンパク質
配列番号154のタンパク質は、402アミノ酸の長さおよび43.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、Pseudomonas aeruginosa外毒素配列の225アミノ酸欠失変異体(配列番号202)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGS)と(GGGGG)およびフューリンにより認識される切断部位配列(RKKR)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER4−LINKER2−FURIN−(配列番号202)−TRANS3
配列番号154のタンパク質は、402アミノ酸の長さおよび43.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、Pseudomonas aeruginosa外毒素配列の225アミノ酸欠失変異体(配列番号202)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGS)と(GGGGG)およびフューリンにより認識される切断部位配列(RKKR)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER4−LINKER2−FURIN−(配列番号202)−TRANS3
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号154および配列番号179である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号154)を、そのコードDNA配列(配列番号179)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例65a)およびヒスチジンタグなし(例65b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号154)を、そのコードDNA配列(配列番号179)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例65a)およびヒスチジンタグなし(例65b)の両方で発現された。
例66.配列番号155の融合タンパク質
配列番号155のタンパク質は、403アミノ酸の長さおよび44.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の226アミノ酸欠失変異体(配列番号203)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)と(GGGG)およびフューリンにより認識される切断部位配列(RKKR)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
TRAIL121−281−LINKER1−LINKER2−FURIN−配列番号203−TRANS3
配列番号155のタンパク質は、403アミノ酸の長さおよび44.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の226アミノ酸欠失変異体(配列番号203)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)と(GGGG)およびフューリンにより認識される切断部位配列(RKKR)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
TRAIL121−281−LINKER1−LINKER2−FURIN−配列番号203−TRANS3
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号155および配列番号180である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号155)を、そのコードDNA配列(配列番号180)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例66a)およびヒスチジンタグなし(例66b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号155)を、そのコードDNA配列(配列番号180)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例66a)およびヒスチジンタグなし(例66b)の両方で発現された。
例67.配列番号156の融合タンパク質
配列番号156のタンパク質は、470アミノ酸の長さおよび51.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の279アミノ酸欠失変異体(配列番号204)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)およびPEG化リンカー(ASGCGPE)、続いてフューリンにより認識される配列(RKKR)およびフューリンにより認識される切断部位のネイティブ配列(RHRQPRGWEQL)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−FURIN.NAT−(配列番号204)−TRANS3
配列番号156のタンパク質は、470アミノ酸の長さおよび51.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の279アミノ酸欠失変異体(配列番号204)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)およびPEG化リンカー(ASGCGPE)、続いてフューリンにより認識される配列(RKKR)およびフューリンにより認識される切断部位のネイティブ配列(RHRQPRGWEQL)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG−FURIN−FURIN.NAT−(配列番号204)−TRANS3
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号156および配列番号181である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号156)を、そのコードDNA配列(配列番号181)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例67a)およびヒスチジンタグなし(例67b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号156)を、そのコードDNA配列(配列番号181)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例67a)およびヒスチジンタグなし(例67b)の両方で発現された。
例68.配列番号157の融合タンパク質
配列番号157のタンパク質は、478アミノ酸の長さおよび51.8kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の279アミノ酸欠失変異体(配列番号205)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しに続いてフューリンにより認識される切断部位(RKKR)、フューリンにより認識される切断部位のネイティブ配列(RHRQPRGWEQL)および立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しが組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−LINKER1−FURIN−FURIN.NAT−LINKER1−LINKER1−(配列番号205)−TRANS3
配列番号157のタンパク質は、478アミノ酸の長さおよび51.8kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の279アミノ酸欠失変異体(配列番号205)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しに続いてフューリンにより認識される切断部位(RKKR)、フューリンにより認識される切断部位のネイティブ配列(RHRQPRGWEQL)および立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しが組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−LINKER1−FURIN−FURIN.NAT−LINKER1−LINKER1−(配列番号205)−TRANS3
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号157および配列番号182である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号157)を、そのコードDNA配列(配列番号182)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例68a)およびヒスチジンタグなし(例68b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号157)を、そのコードDNA配列(配列番号182)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例68a)およびヒスチジンタグなし(例68b)の両方で発現された。
例69.配列番号158の融合タンパク質
配列番号158のタンパク質は、402アミノ酸の長さおよび44.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、Pseudomonas aeruginosa外毒素配列の214アミノ酸変異欠失変異体(配列番号206)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、続いて立体リンカー配列(GGGG)、フューリンにより認識される切断部位(RKKR)およびフューリンにより認識される切断部位のネイティブ配列(RHRQPRGWEQL)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−LINKER2−FURIN−FURIN.NAT−(配列番号206)−TRANS3
配列番号158のタンパク質は、402アミノ酸の長さおよび44.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、Pseudomonas aeruginosa外毒素配列の214アミノ酸変異欠失変異体(配列番号206)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)、続いて立体リンカー配列(GGGG)、フューリンにより認識される切断部位(RKKR)およびフューリンにより認識される切断部位のネイティブ配列(RHRQPRGWEQL)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−LINKER2−FURIN−FURIN.NAT−(配列番号206)−TRANS3
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号158および配列番号183である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号158)を、そのコードDNA配列(配列番号183)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号158)を、そのコードDNA配列(配列番号183)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例70.配列番号159の融合タンパク質
配列番号159のタンパク質は、467アミノ酸の長さおよび50.4kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の279アミノ酸変異欠失変異体(配列番号205)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しに続いてフューリンにより認識される切断部位(RKKR)およびさらなる立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しが組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−LINKER1−FURIN−LINKER1−LINKER1−(配列番号205)−TRANS3
配列番号159のタンパク質は、467アミノ酸の長さおよび50.4kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の279アミノ酸変異欠失変異体(配列番号205)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しに続いてフューリンにより認識される切断部位(RKKR)およびさらなる立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しが組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−LINKER1−FURIN−LINKER1−LINKER1−(配列番号205)−TRANS3
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号159および配列番号184である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号159)を、そのコードDNA配列(配列番号184)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号159)を、そのコードDNA配列(配列番号184)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例71.配列番号160の融合タンパク質
配列番号160のタンパク質は、474アミノ酸の長さおよび51.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の279アミノ酸変異欠失変異体(配列番号205)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しに続いてフューリンにより認識されるネイティブの切断部位配列(RHRQPRGWEQL)およびさらなる立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しが組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
TRAIL121−281−LINKER1−LINKER1−FURIN.NAT−LINKER1−LINKER1−配列番号205−TRANS3
配列番号160のタンパク質は、474アミノ酸の長さおよび51.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の279アミノ酸変異欠失変異体(配列番号205)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しに続いてフューリンにより認識されるネイティブの切断部位配列(RHRQPRGWEQL)およびさらなる立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しが組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
TRAIL121−281−LINKER1−LINKER1−FURIN.NAT−LINKER1−LINKER1−配列番号205−TRANS3
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号160および配列番号185である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号160)を、そのコードDNA配列(配列番号185)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例71a)およびヒスチジンタグなし(例71b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号160)を、そのコードDNA配列(配列番号185)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例71a)およびヒスチジンタグなし(例71b)の両方で発現された。
例72.配列番号161の融合タンパク質
配列番号161のタンパク質は、474アミノ酸の長さおよび51.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の279アミノ酸変異欠失変異体(配列番号205)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しに続いてフューリンにより認識されるネイティブの切断部位配列(RHRQPRGWEQL)およびさらなる立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しが組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−LINKER1−FURIN.NAT−LINKER1−LINKER1−(配列番号205)−TRANS1
配列番号161のタンパク質は、474アミノ酸の長さおよび51.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の279アミノ酸変異欠失変異体(配列番号205)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しに続いてフューリンにより認識されるネイティブの切断部位配列(RHRQPRGWEQL)およびさらなる立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しが組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−LINKER1−FURIN.NAT−LINKER1−LINKER1−(配列番号205)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号161および配列番号186である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号161)を、そのコードDNA配列(配列番号186)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号161)を、そのコードDNA配列(配列番号186)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例73.配列番号162の融合タンパク質
配列番号162のタンパク質は、474アミノ酸の長さおよび51.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の279アミノ酸欠失変異体(配列番号207)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しに続いてフューリンにより認識されるネイティブの切断部位配列(RHRQPRGWEQL)およびさらなる立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しが組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−LINKER1−FURIN.NAT−LINKER1−LINKER1−(配列番号207)−TRANS1
配列番号162のタンパク質は、474アミノ酸の長さおよび51.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の279アミノ酸欠失変異体(配列番号207)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しに続いてフューリンにより認識されるネイティブの切断部位配列(RHRQPRGWEQL)およびさらなる立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しが組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−LINKER1−FURIN.NAT−LINKER1−LINKER1−(配列番号207)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号162および配列番号187である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号162)を、そのコードDNA配列(配列番号187)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号162)を、そのコードDNA配列(配列番号187)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例74.配列番号163の融合タンパク質
配列番号163のタンパク質は、515アミノ酸の長さおよび55.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は変異D218Hを含むTRAIL121−281(配列番号142)であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、3つの点変異R318K、N441Q、およびR601Kを有する342アミノ酸の改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列(配列番号201)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)および(ASGG)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号142)−LINKER4−LINKER3−(配列番号201)−TRANS1
配列番号163のタンパク質は、515アミノ酸の長さおよび55.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は変異D218Hを含むTRAIL121−281(配列番号142)であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、3つの点変異R318K、N441Q、およびR601Kを有する342アミノ酸の改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列(配列番号201)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGS)および(ASGG)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号142)−LINKER4−LINKER3−(配列番号201)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号163および配列番号188である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号163)を、そのコードDNA配列(配列番号188)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号163)を、そのコードDNA配列(配列番号188)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例75.配列番号164の融合タンパク質
配列番号164のタンパク質は、475アミノ酸の長さおよび51.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は変異D218Hを含むTRAIL121−281(配列番号142)であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の279アミノ酸変異欠失変異体(配列番号205)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しに続いてフューリンにより認識されるネイティブの切断部位配列(RHRQPRGWEQL)およびさらなる立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しが組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号142)−LINKER1−LINKER1−FURIN.NAT−LINKER1−LINKER1−(配列番号205)−TRANS1
配列番号164のタンパク質は、475アミノ酸の長さおよび51.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は変異D218Hを含むTRAIL121−281(配列番号142)であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の279アミノ酸変異欠失変異体(配列番号205)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しに続いてフューリンにより認識されるネイティブの切断部位配列(RHRQPRGWEQL)およびさらなる立体リンカー配列(GGGGS)の繰り返しが組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号142)−LINKER1−LINKER1−FURIN.NAT−LINKER1−LINKER1−(配列番号205)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号164および配列番号189である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号164)を、そのコードDNA配列(配列番号189)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号164)を、そのコードDNA配列(配列番号189)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例76.配列番号165の融合タンパク質
配列番号165のタンパク質は、463アミノ酸の長さおよび50.6kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は変異D218Hを含むTRAIL121−281(配列番号142)であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の279アミノ酸欠失変異体(配列番号204)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)に続いてフューリンにより認識される切断部位のネイティブ配列(RHRQPRGWEQL)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号142)−LINKER4−LINKER4−FURIN.NAT−(配列番号204)−TRANS1
配列番号165のタンパク質は、463アミノ酸の長さおよび50.6kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は変異D218Hを含むTRAIL121−281(配列番号142)であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の279アミノ酸欠失変異体(配列番号204)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)に続いてフューリンにより認識される切断部位のネイティブ配列(RHRQPRGWEQL)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号142)−LINKER4−LINKER4−FURIN.NAT−(配列番号204)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号165および配列番号190である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号165)を、そのコードDNA配列(配列番号190)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号165)を、そのコードDNA配列(配列番号190)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例77.配列番号166の融合タンパク質
配列番号166のタンパク質は、475アミノ酸の長さおよび51.4kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は変異Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266R/D269Hを含むTRAIL121−281(配列番号143)であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の279アミノ酸変異欠失変異体(配列番号205)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)に続いてフューリンにより認識される切断部位のネイティブ配列(RHRQPRGWEQL)および2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号143)−LINKER1−LINKER1−FURIN.NAT−LINKER1−LINKER1−(配列番号205)−TRANS1
配列番号166のタンパク質は、475アミノ酸の長さおよび51.4kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)は変異Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266R/D269Hを含むTRAIL121−281(配列番号143)であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の279アミノ酸変異欠失変異体(配列番号205)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)に続いてフューリンにより認識される切断部位のネイティブ配列(RHRQPRGWEQL)および2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KDELが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号143)−LINKER1−LINKER1−FURIN.NAT−LINKER1−LINKER1−(配列番号205)−TRANS1
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号166および配列番号191である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号166)を、そのコードDNA配列(配列番号191)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号166)を、そのコードDNA配列(配列番号191)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例78.配列番号167の融合タンパク質
配列番号167のタンパク質は、474アミノ酸の長さおよび51.24kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素A配列の279アミノ酸欠失変異体(配列番号207)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)に続いてフューリンにより認識される切断部位のネイティブ配列(RHRQPRGWEQL)および2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−LINKER1−FURIN.NAT−LINKER1−LINKER1−(配列番号207)−TRANS3
配列番号167のタンパク質は、474アミノ酸の長さおよび51.24kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素A配列の279アミノ酸欠失変異体(配列番号207)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、2つの立体リンカー配列(GGGGS)に続いてフューリンにより認識される切断部位のネイティブ配列(RHRQPRGWEQL)および2つの立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
さらに、ドメイン(b)のC末端には輸送配列KEDLが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のC末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−LINKER1−FURIN.NAT−LINKER1−LINKER1−(配列番号207)−TRANS3
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号167および配列番号192である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号167)を、そのコードDNA配列(配列番号192)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例78a)およびヒスチジンタグなし(例78b)の両方で発現された。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号167)を、そのコードDNA配列(配列番号192)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例78a)およびヒスチジンタグなし(例78b)の両方で発現された。
例79.配列番号168の融合タンパク質
配列番号168のタンパク質は、232アミノ酸の長さおよび26.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、51アミノ酸のHokタンパク質配列(配列番号208)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)に続いてウロキナーゼにより認識される切断部位の配列(RVVR)およびメタロプロテアーゼMMP(PLGLAG)および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号208)−LINKER1−UROKIN−MMP−LINKER1−(TRAIL121−281)
配列番号168のタンパク質は、232アミノ酸の長さおよび26.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、51アミノ酸のHokタンパク質配列(配列番号208)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー配列(GGGGS)に続いてウロキナーゼにより認識される切断部位の配列(RVVR)およびメタロプロテアーゼMMP(PLGLAG)および立体リンカー配列(GGGGS)が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号208)−LINKER1−UROKIN−MMP−LINKER1−(TRAIL121−281)
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むDNAコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号168および配列番号193である。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号168)を、そのコードDNA配列(配列番号193)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
前記構造のアミノ酸配列(配列番号168)を、そのコードDNA配列(配列番号193)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
例80.融合タンパク質の抗腫瘍活性の試験
融合タンパク質の抗腫瘍活性の試験は、in vitroで腫瘍細胞株に対する細胞毒性アッセイにて、およびin vivoでマウスにおいて実施した。比較として、rhTRAIL114−281タンパク質およびプラセボを使用した。
融合タンパク質の抗腫瘍活性の試験は、in vitroで腫瘍細胞株に対する細胞毒性アッセイにて、およびin vivoでマウスにおいて実施した。比較として、rhTRAIL114−281タンパク質およびプラセボを使用した。
1.円偏光二色性の測定:得られたタンパク質の二次構造組成の決定
融合タンパク質の調製物の性質を、それらの構造の観点から、例2a、例11a、例12a、例13a、例14a、例15a、例18a、例20a、例26a、例29a、例42a、例43a、例44a、例50a、例51a、および例52aの融合タンパク質について、円偏光二色性により決定した。円偏光二色性は、タンパク質の二次構造および立体配座の決定のために使用する。CD法は、タンパク質構造の光学活性を利用し、光の偏光面の回転および楕円偏光の出現を明らかにする。遠紫外(UV)におけるタンパク質のCDスペクトルにより、ポリペプチド主鎖の立体配座に関する正確なデータが得られる。
融合タンパク質の調製物の性質を、それらの構造の観点から、例2a、例11a、例12a、例13a、例14a、例15a、例18a、例20a、例26a、例29a、例42a、例43a、例44a、例50a、例51a、および例52aの融合タンパク質について、円偏光二色性により決定した。円偏光二色性は、タンパク質の二次構造および立体配座の決定のために使用する。CD法は、タンパク質構造の光学活性を利用し、光の偏光面の回転および楕円偏光の出現を明らかにする。遠紫外(UV)におけるタンパク質のCDスペクトルにより、ポリペプチド主鎖の立体配座に関する正確なデータが得られる。
50mMのTris−HCl(pH8.0)、100mMのNaCl、10%のグリセロール、0.1mMのZnCl2、80mMのサッカロース、5mMのDTTからなる緩衝液へ処方した後の、分析されるタンパク質の試料は、12kDaカットオフの透析バッグ(Sigma-Aldrich)中で透析した。透析を、タンパク質調製物について100倍量(v/v)過剰の緩衝液中で4℃で数時間撹拌しながら実施した。透析の完了後、各調製物を遠心分離し(25000rpm、10min、4℃)、上清を回収した。
こうして得られた試料中のタンパク質濃度は、ブラッドフォード法により決定した。
濃度範囲が0.1−2.7mg/mlのタンパク質の円偏光二色性の測定を、光路長0.2mmまたは1mmの石英キュベット中、Jasco J-710分光偏光計で実施した。窒素を7l/minで流しながら測定を行ったため、波長範囲195nmから250nmまでの測定が可能であった。測定のパラメーター:−1nmのスペクトル分解能;光線の半値幅1nm;感度20mdeg、1つの波長での平均時間−8s、スキャン速度10nm/min。
こうして得られた試料中のタンパク質濃度は、ブラッドフォード法により決定した。
濃度範囲が0.1−2.7mg/mlのタンパク質の円偏光二色性の測定を、光路長0.2mmまたは1mmの石英キュベット中、Jasco J-710分光偏光計で実施した。窒素を7l/minで流しながら測定を行ったため、波長範囲195nmから250nmまでの測定が可能であった。測定のパラメーター:−1nmのスペクトル分解能;光線の半値幅1nm;感度20mdeg、1つの波長での平均時間−8s、スキャン速度10nm/min。
得られたスペクトルを、CDProソフトウェアを使用して193−250nmの範囲で数値分析した。光電子倍増管での電圧が700Vを超える点を、この波長範囲でのシグナル対ノイズ比が小さすぎるために除外した。
得られたデータを使用して、分析したタンパク質における特定の二次構造含量を、CDProソフトウェアにより計算した(表1)。
得られたデータを使用して、分析したタンパク質における特定の二次構造含量を、CDProソフトウェアにより計算した(表1)。
**結晶構造1IKQ、1R4Q、1ABR、3PX8に基づいて得られた値
対照分子(rhTRAIL114−281)は、大多数がβシート構造型(波長220nmでの楕円率が明らかに最小となる)であるタンパク質に特有のCDスペクトルを示す。これは二次構造成分の計算と一致しており、αへリックス要素が極めて少ないことを示唆している。
得られた結果はまた、hTRAILタンパク質の結晶構造からのデータとも一致し、本発明の融合タンパク質(例12a、例13a、例14aおよび例29a)に特徴的であり、ここでβ要素は、それらの構造の32−44%を構成する。全ての例において、二色性スペクトルは、波長220nmにおける1つの極小値により特徴付けられる。TRAILに付着する小さいペプチドは、タンパク質の小さな部分を構成するものであって、必ずしも明確な二次構造を生じるものではないため、分析されるタンパク質は、元のタンパク質から顕著に異なるべきではない。
例2a、例11a、例15a、例20a、例26a、例42a、例43、例44a、例50a、例51a、および例52aの構築物の場合には、α/βの二次構造が混在する含量が観察され、これはエフェクターペプチドドメインの既知の結晶構造に基づく予想と一致する。これらの嵩高いドメインの場合の、α構造の50%レベルの含量は、融合タンパク質の構造に大きな影響を有する。
例18aのタンパク質のみは、70%を超えるαへリックス含量と低いβ構造含量を有する。
得られた結果はまた、hTRAILタンパク質の結晶構造からのデータとも一致し、本発明の融合タンパク質(例12a、例13a、例14aおよび例29a)に特徴的であり、ここでβ要素は、それらの構造の32−44%を構成する。全ての例において、二色性スペクトルは、波長220nmにおける1つの極小値により特徴付けられる。TRAILに付着する小さいペプチドは、タンパク質の小さな部分を構成するものであって、必ずしも明確な二次構造を生じるものではないため、分析されるタンパク質は、元のタンパク質から顕著に異なるべきではない。
例2a、例11a、例15a、例20a、例26a、例42a、例43、例44a、例50a、例51a、および例52aの構築物の場合には、α/βの二次構造が混在する含量が観察され、これはエフェクターペプチドドメインの既知の結晶構造に基づく予想と一致する。これらの嵩高いドメインの場合の、α構造の50%レベルの含量は、融合タンパク質の構造に大きな影響を有する。
例18aのタンパク質のみは、70%を超えるαへリックス含量と低いβ構造含量を有する。
2.In vitroにおける細胞株テスト
細胞株
細胞株はATCCとCLSから入手し、その後繁殖させてLaboratory of Biology Adamed’s Cell Line Bankに寄託した。実験の間、細胞は、マイコプラズマの存在についてPCR法によりキットVenorRGeM Mycoplasma PCR Detection Kit(Minerva Biolabs, Berlin, Germany)を用いて日常的にチェックした。培養物は標準条件下で維持した:37℃、5%CO2(DMEMの場合は10%CO2)、および85%の相対湿度。特定の細胞株は、ATCCの推奨に従って適切な培地中で培養した。
細胞株
細胞株はATCCとCLSから入手し、その後繁殖させてLaboratory of Biology Adamed’s Cell Line Bankに寄託した。実験の間、細胞は、マイコプラズマの存在についてPCR法によりキットVenorRGeM Mycoplasma PCR Detection Kit(Minerva Biolabs, Berlin, Germany)を用いて日常的にチェックした。培養物は標準条件下で維持した:37℃、5%CO2(DMEMの場合は10%CO2)、および85%の相対湿度。特定の細胞株は、ATCCの推奨に従って適切な培地中で培養した。
MTT細胞毒性テスト
MTTアッセイは、細胞の増殖、生存率および細胞毒性を測定するために使用される比色アッセイである。これは、ミトコンドリア酵素のスクシナート−テトラゾリウムレダクターゼ1による、黄色のテトラゾリウム塩のMTT(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)の、非水溶性紫染料のホルマザンへの分解にある。MTTの還元は、生細胞にしか生じない。データ分析は、対照細胞と比較して処置された集団の細胞数の50%で還元が生じる濃度である、タンパク質のIC50濃度(単位ng/ml)の決定にある。結果は、GraphPad Prism 5.0ソフトウェアを使用して分析した。テストは、文献の記載(Celis, JE, (1998). Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, LW, Tsai, JH., (2004); Involvement of viral and chemical factors with oral cancer in Taiwan, Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183)に従って実施した。
MTTアッセイは、細胞の増殖、生存率および細胞毒性を測定するために使用される比色アッセイである。これは、ミトコンドリア酵素のスクシナート−テトラゾリウムレダクターゼ1による、黄色のテトラゾリウム塩のMTT(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)の、非水溶性紫染料のホルマザンへの分解にある。MTTの還元は、生細胞にしか生じない。データ分析は、対照細胞と比較して処置された集団の細胞数の50%で還元が生じる濃度である、タンパク質のIC50濃度(単位ng/ml)の決定にある。結果は、GraphPad Prism 5.0ソフトウェアを使用して分析した。テストは、文献の記載(Celis, JE, (1998). Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, LW, Tsai, JH., (2004); Involvement of viral and chemical factors with oral cancer in Taiwan, Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183)に従って実施した。
細胞培養培地を、所定の密度(100μLあたり104−105細胞)に希釈した。その後、適切に希釈された100μlの細胞懸濁液を、96ウェルプレートに3ウェルずつ適用した。このように調製した細胞を、使用した培地に応じて5%または10%のCO2中、37℃で24hインキュベートし、その後、細胞(100μlの培地中)に、様々な濃度のテストされるタンパク質を含む100μlの培地をさらに添加した。3−4回の細胞***に相当する次の72時間にわたって、標的タンパク質と共に細胞をインキュベーションした後、標的タンパク質を有する培地に、20mlのMTT希釈標準溶液[5mg/ml]を添加し、5%CO2中37℃で3hインキュベーションを続けた。その後、MTT溶液を有する培地を除去し、100μlのDMSOを添加してホルマザン結晶を溶解した。撹拌後、570nmでの吸光度を測定した(参照フィルター690nm)。
EZ4U細胞毒性テスト
EZ4U(Biomedica)テストを使用して、非接着性細胞株におけるタンパク質の細胞毒性活性をテストした。このテストは、テトラゾリウム塩の還元で形成されるホルマザンが水に可溶であるように、MTT法を改変したものである。細胞生存率の研究は、タンパク質(タンパク質を7つの濃度で各3ウェルずつ)と共に細胞を連続72時間インキュベーションした後に行った。これに基づいて、GraphPad Prism 5ソフトウェアを使用し、IC50値を(2回の独立した実験の平均値として)決定した。対照細胞は、溶媒のみでインキュベートした。
EZ4U(Biomedica)テストを使用して、非接着性細胞株におけるタンパク質の細胞毒性活性をテストした。このテストは、テトラゾリウム塩の還元で形成されるホルマザンが水に可溶であるように、MTT法を改変したものである。細胞生存率の研究は、タンパク質(タンパク質を7つの濃度で各3ウェルずつ)と共に細胞を連続72時間インキュベーションした後に行った。これに基づいて、GraphPad Prism 5ソフトウェアを使用し、IC50値を(2回の独立した実験の平均値として)決定した。対照細胞は、溶媒のみでインキュベートした。
in vitro細胞毒性テストの結果は、溶媒のみで処置した対照細胞に対して融合タンパク質の細胞毒性効果が50%のレベルで観察されたタンパク質濃度に相当するIC50値(ng/ml)としてまとめて示す。各実験は、3ウェルずつで実施した少なくとも2つの独立した実験の平均値を表す。タンパク質調製物に活性が無いと判断する基準としては、IC50限度値2000ng/mlを採用した。IC50値が2000を超える融合タンパク質は不活性とみなした。
このテストのために選択した細胞は、TRAILタンパク質に対して自然抵抗性のある腫瘍細胞株(TRAILに対する自然抵抗性の基準:TRAILタンパク質のIC50>2000)のみならず、TRAILタンパク質に感受性のある腫瘍細胞株や、従来の抗がん薬剤抵抗性がん株としてドキソルビシンに抵抗性のある株MES−SA/DX5も含んだ。
このテストのために選択した細胞は、TRAILタンパク質に対して自然抵抗性のある腫瘍細胞株(TRAILに対する自然抵抗性の基準:TRAILタンパク質のIC50>2000)のみならず、TRAILタンパク質に感受性のある腫瘍細胞株や、従来の抗がん薬剤抵抗性がん株としてドキソルビシンに抵抗性のある株MES−SA/DX5も含んだ。
未分化HUVEC細胞株を、非がん細胞における融合タンパク質の効果/毒性の査定用の、健常な対照細胞株として使用した。
得られた結果により、本発明の特定の融合タンパク質を、TRAILに自然抵抗性のある細胞に投与することにより、細胞株のTRAILに対する抵抗性を克服できる可能性が確認された。本発明の融合タンパク質を、TRAILに感受性のある細胞に投与した場合、いくつかのケースでは、TRAILのみの場合のIC50値と比べて融合タンパク質のIC50値が減少したことが示され、活性能力の明らかで強い相乗作用が観察された。さらに、標準的な抗がん薬剤のドキソルビシンに抵抗性のある細胞においても、本発明の融合タンパク質の細胞毒性活性が得られており、いくつかのケースでは、TRAILのみの活性よりも高かった。
非がん細胞株で得られた2000を超えるIC50値は、健常細胞に対して、本発明のタンパク質の使用に関連する毒性効果が無いことを示しており、本タンパク質の全身毒性の可能性が低いことを示唆している。
得られた結果により、本発明の特定の融合タンパク質を、TRAILに自然抵抗性のある細胞に投与することにより、細胞株のTRAILに対する抵抗性を克服できる可能性が確認された。本発明の融合タンパク質を、TRAILに感受性のある細胞に投与した場合、いくつかのケースでは、TRAILのみの場合のIC50値と比べて融合タンパク質のIC50値が減少したことが示され、活性能力の明らかで強い相乗作用が観察された。さらに、標準的な抗がん薬剤のドキソルビシンに抵抗性のある細胞においても、本発明の融合タンパク質の細胞毒性活性が得られており、いくつかのケースでは、TRAILのみの活性よりも高かった。
非がん細胞株で得られた2000を超えるIC50値は、健常細胞に対して、本発明のタンパク質の使用に関連する毒性効果が無いことを示しており、本タンパク質の全身毒性の可能性が低いことを示唆している。
広範な腫瘍細胞株の一団に対する、選択されたタンパク質調製物の細胞毒性活性の決定
表4は、広範囲で最も頻度の高いがんに対応する種々の臓器由来の広範な腫瘍細胞の一団に対する、選択された本発明の融合タンパク質のin vitroでの細胞毒性活性テストの結果を表す。
実験結果を、平均値±標準偏差(SD)として表す。全ての計算およびグラフは、GraphPad Prism 5.0ソフトウェアを使用して作成した。
得られたIC50値により、融合タンパク質の高い細胞毒性活性が確認され、したがって、がんの処置における潜在的有用性が確認された。
表4は、広範囲で最も頻度の高いがんに対応する種々の臓器由来の広範な腫瘍細胞の一団に対する、選択された本発明の融合タンパク質のin vitroでの細胞毒性活性テストの結果を表す。
実験結果を、平均値±標準偏差(SD)として表す。全ての計算およびグラフは、GraphPad Prism 5.0ソフトウェアを使用して作成した。
得られたIC50値により、融合タンパク質の高い細胞毒性活性が確認され、したがって、がんの処置における潜在的有用性が確認された。
3.異種移植におけるin vivoの融合タンパク質の抗腫瘍有効性
タンパク質調製物の抗腫瘍活性を、ヒト結腸がんColo205およびHCT−116、SW620、ヒト肺がんA549、ヒト前立腺がんPC−3、ヒト膵臓がんPanc−1、ヒト肝がんPCL/PRF/5、HT−29、HepG2、およびヒト子宮肉腫MES−SA.Dx5のマウスモデルにおいてテストした。
タンパク質調製物の抗腫瘍活性を、ヒト結腸がんColo205およびHCT−116、SW620、ヒト肺がんA549、ヒト前立腺がんPC−3、ヒト膵臓がんPanc−1、ヒト肝がんPCL/PRF/5、HT−29、HepG2、およびヒト子宮肉腫MES−SA.Dx5のマウスモデルにおいてテストした。
細胞
ヒト結腸がんColo205の細胞を、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミンを補充したRPMI1640培地(Hyclone, Logan, UT, USA)(任意にOpto−MEM(Invitrogen, Cat.22600-134)と1:1の比率で混合)中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン(Invitrogen)で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を1300rpm、4℃で8min遠心分離し、HBSS緩衝液(Hanks培地)に懸濁した。
ヒト肺がんA549の細胞を、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミンを補充したRPMI1640培地(Hyclone, Logan, UT, USA)中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン(Invitrogen)で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を1300rpm、4℃で8min遠心分離し、HBSS緩衝液(Hanks培地)に懸濁した。
ヒト結腸がんColo205の細胞を、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミンを補充したRPMI1640培地(Hyclone, Logan, UT, USA)(任意にOpto−MEM(Invitrogen, Cat.22600-134)と1:1の比率で混合)中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン(Invitrogen)で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を1300rpm、4℃で8min遠心分離し、HBSS緩衝液(Hanks培地)に懸濁した。
ヒト肺がんA549の細胞を、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミンを補充したRPMI1640培地(Hyclone, Logan, UT, USA)中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン(Invitrogen)で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を1300rpm、4℃で8min遠心分離し、HBSS緩衝液(Hanks培地)に懸濁した。
ヒト前立腺がんPC3の細胞を、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミンを補充したRPMI1640培地(Hyclone, Logan, UT, USA)中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン(Invitrogen)で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を1300rpm、4℃で8min遠心分離し、HBSS緩衝液(Hanks培地)に懸濁した。
ヒト膵臓がんPANC−1の細胞を、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミンを補充したRPMI1640培地(Hyclone, Logan, UT, USA)中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン(Invitrogen)で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を1300rpm、4℃で8min遠心分離し、HBSS緩衝液(Hanks培地)に懸濁した。
ヒト肝がんPRF/5(CLS)およびヒト結腸がんSW−620の細胞を、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミンを補充したRPMI1640培地(Hyclone, Logan, UT, USA)中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン(Invitrogen)で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を1300rpm、4℃で8min遠心分離し、HBSS緩衝液(Hanks培地)に懸濁した。
ヒト膵臓がんPANC−1の細胞を、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミンを補充したRPMI1640培地(Hyclone, Logan, UT, USA)中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン(Invitrogen)で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を1300rpm、4℃で8min遠心分離し、HBSS緩衝液(Hanks培地)に懸濁した。
ヒト肝がんPRF/5(CLS)およびヒト結腸がんSW−620の細胞を、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミンを補充したRPMI1640培地(Hyclone, Logan, UT, USA)中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン(Invitrogen)で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を1300rpm、4℃で8min遠心分離し、HBSS緩衝液(Hanks培地)に懸濁した。
ヒト結腸がんHCT−116、およびHT−29の細胞を、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミンを補充したMcCoy’s培地(Hyclone, Logan, UT, USA)中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン(Invitrogen)で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を1300rpm、4℃で8min遠心分離し、HBSS緩衝液(Hanks培地)に懸濁した。
ヒト肝がんHepG2の細胞を、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミンを補充したMEM培地(Hyclone, Logan, UT, USA)中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン(Invitrogen)で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を1300rpm、4℃で8min遠心分離し、HBSS緩衝液(Hanks培地)に懸濁した。
多剤耐性のヒト子宮肉腫MES−SA.Dx5の細胞を、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミン、および1μMのドキソルビシン塩酸塩(Sigma, Cat. No. D1515-10MG)を補充したMcCoy’s培地(Hyclone, Logan, UT, USA)中に維持した。細胞移植の3日前に、細胞をドキソルビシンなしの培地中で培養した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン(Invitrogen)で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を1300rpm、4℃で8min遠心分離し、HBSS緩衝液(Hanks培地)に懸濁した。
ヒト肝がんHepG2の細胞を、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミンを補充したMEM培地(Hyclone, Logan, UT, USA)中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン(Invitrogen)で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を1300rpm、4℃で8min遠心分離し、HBSS緩衝液(Hanks培地)に懸濁した。
多剤耐性のヒト子宮肉腫MES−SA.Dx5の細胞を、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミン、および1μMのドキソルビシン塩酸塩(Sigma, Cat. No. D1515-10MG)を補充したMcCoy’s培地(Hyclone, Logan, UT, USA)中に維持した。細胞移植の3日前に、細胞をドキソルビシンなしの培地中で培養した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン(Invitrogen)で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を1300rpm、4℃で8min遠心分離し、HBSS緩衝液(Hanks培地)に懸濁した。
マウス
本発明のタンパク質の抗腫瘍活性の試験は、ビャウィストクのCentrum Medycyny Doswiadczalnejから入手した7−9週齢CDヌードマウス(Crl:CD1-Foxn1nu 1)、Harlan UKから入手した7−8週齢Hsd:Athymic-Nude-Foxn1nuマウス(雌)、Harlan UKから入手した8−10週齢HsdCpb:NMRI-Foxn1nu マウス、ビャウィストクのCentrum Medycyny Doswiadczalnejから入手した8−10週齢の雌Cby.Cg-foxn1(nu)/J マウス、およびCharles River Germanyから入手した4−5週齢の雌Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスを用いて実施した。マウスは、食糧および脱塩水を(適宜)自由摂取として、特定病原体感染防止条件下で保持した。動物を使用した全ての実験は、ガイドライン:New York Academy of Sciences' Ad Hoc Committee on Animal Researchにより発行された「Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing and Education」に従って行い、IV Local Ethics Committee on Animal Experimentation in Warsaw (No. 71/2009)により認可された。
本発明のタンパク質の抗腫瘍活性の試験は、ビャウィストクのCentrum Medycyny Doswiadczalnejから入手した7−9週齢CDヌードマウス(Crl:CD1-Foxn1nu 1)、Harlan UKから入手した7−8週齢Hsd:Athymic-Nude-Foxn1nuマウス(雌)、Harlan UKから入手した8−10週齢HsdCpb:NMRI-Foxn1nu マウス、ビャウィストクのCentrum Medycyny Doswiadczalnejから入手した8−10週齢の雌Cby.Cg-foxn1(nu)/J マウス、およびCharles River Germanyから入手した4−5週齢の雌Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスを用いて実施した。マウスは、食糧および脱塩水を(適宜)自由摂取として、特定病原体感染防止条件下で保持した。動物を使用した全ての実験は、ガイドライン:New York Academy of Sciences' Ad Hoc Committee on Animal Researchにより発行された「Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing and Education」に従って行い、IV Local Ethics Committee on Animal Experimentation in Warsaw (No. 71/2009)により認可された。
実験の過程および評価
腫瘍サイズは電子キャリパーを用いて測定し、腫瘍体積は、式:(a2×b)/2を用いて算出した;式中、a=腫瘍の短い対角線(mm)およびb=腫瘍の長い対角線(mm)である。腫瘍成長阻害は、次の式を用いて算出した:
TGI[%](腫瘍成長阻害)=(WT/WC)×100−100%
式中、WTは、処置群の平均腫瘍体積であり、WCは対照群の平均腫瘍体積である。
実験結果は、平均値±標準偏差(SD)として表す。すべての計算およびグラフは、GraphPad Prism 5.0プログラムを用いて作成した。
腫瘍サイズは電子キャリパーを用いて測定し、腫瘍体積は、式:(a2×b)/2を用いて算出した;式中、a=腫瘍の短い対角線(mm)およびb=腫瘍の長い対角線(mm)である。腫瘍成長阻害は、次の式を用いて算出した:
TGI[%](腫瘍成長阻害)=(WT/WC)×100−100%
式中、WTは、処置群の平均腫瘍体積であり、WCは対照群の平均腫瘍体積である。
実験結果は、平均値±標準偏差(SD)として表す。すべての計算およびグラフは、GraphPad Prism 5.0プログラムを用いて作成した。
ヒト結腸がんモデル
A.Colo205
0日目に、マウスの右側皮下(sc)に、0.15mlのRPMI1640培地に懸濁した5×106のColo205細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。実験10日目、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜100mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18a(3mg/kg)、例25a(3mg/kg)、例37a(5mg/kg)、および例42a(10mg/kg)の本発明の融合タンパク質、比較としてrhTRAIL114−281(10mg/kg)、および対照として注射用水。調製物は1日1回、1日おきに6回静脈内投与(i.v.)した。実験27日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
A.Colo205
0日目に、マウスの右側皮下(sc)に、0.15mlのRPMI1640培地に懸濁した5×106のColo205細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。実験10日目、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜100mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18a(3mg/kg)、例25a(3mg/kg)、例37a(5mg/kg)、および例42a(10mg/kg)の本発明の融合タンパク質、比較としてrhTRAIL114−281(10mg/kg)、および対照として注射用水。調製物は1日1回、1日おきに6回静脈内投与(i.v.)した。実験27日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図1および図2に、腫瘍体積の変化の図(図1)および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)(図2)として示す。
図1および図2に示す実験結果は、例18a、例25a、例37a、および例42aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験27日目において対照と比較して、それぞれTGIが30.5%、37%、29%、および60.2%で、腫瘍Colo205成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較してTGIが12%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
図1および図2に示す実験結果は、例18a、例25a、例37a、および例42aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験27日目において対照と比較して、それぞれTGIが30.5%、37%、29%、および60.2%で、腫瘍Colo205成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較してTGIが12%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
B.HCT−116
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS緩衝液:マトリゲルの3:1の混合物0.1mlに懸濁した5×106のHCT116細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。腫瘍のサイズが71−432mm3になったとき(13日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜180mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18b(3mg/kg)、例2b(5mg/kg)の本発明の融合タンパク質、および、対照としての処方緩衝液(50mMのTrizma Base、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)に対する比較としてrhTRAIL114−281(65mg/kg)。rhTRAIL114−281および例2bは1日おきに6回静脈内投与(i.v.)し、例18bは実験の13、15、21、24日目に静脈内投与(i.v.)した。対照群には処方緩衝液を与えた。実験の24日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS緩衝液:マトリゲルの3:1の混合物0.1mlに懸濁した5×106のHCT116細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。腫瘍のサイズが71−432mm3になったとき(13日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜180mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18b(3mg/kg)、例2b(5mg/kg)の本発明の融合タンパク質、および、対照としての処方緩衝液(50mMのTrizma Base、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)に対する比較としてrhTRAIL114−281(65mg/kg)。rhTRAIL114−281および例2bは1日おきに6回静脈内投与(i.v.)し、例18bは実験の13、15、21、24日目に静脈内投与(i.v.)した。対照群には処方緩衝液を与えた。実験の24日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を、図19に腫瘍体積の変化の図として、および図20に対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)を示す。
図19および20に示す実験結果は、例18bおよび例2bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験24日目において対照と比較して、それぞれTGIが81%および67%で、HCT116腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが38%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
図19および20に示す実験結果は、例18bおよび例2bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験24日目において対照と比較して、それぞれTGIが81%および67%で、HCT116腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが38%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
B1.HCT116
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS緩衝液:マトリゲルの3:1の混合物0.1mlに懸濁した5×106のHCT116細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。腫瘍のサイズが63−370mm3になったとき(17日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜190mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18b(3mg/kg)の本発明の融合タンパク質、および、対照としての処方緩衝液(50mMのTrizma Base、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)に対する比較としてrhTRAIL114−281(70mg/kg)。rhTRAIL114−281は1日おきに6回静脈内投与(i.v.)し、例18bは4日に一度、計6回静脈内投与(i.v.)した。対照群には処方緩衝液を与えた。実験の47日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS緩衝液:マトリゲルの3:1の混合物0.1mlに懸濁した5×106のHCT116細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。腫瘍のサイズが63−370mm3になったとき(17日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜190mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18b(3mg/kg)の本発明の融合タンパク質、および、対照としての処方緩衝液(50mMのTrizma Base、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)に対する比較としてrhTRAIL114−281(70mg/kg)。rhTRAIL114−281は1日おきに6回静脈内投与(i.v.)し、例18bは4日に一度、計6回静脈内投与(i.v.)した。対照群には処方緩衝液を与えた。実験の47日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を、図19aに腫瘍体積の変化の図として、および図20aに対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)を示す。
図19aおよび20aに示す実験結果は、例18bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験47日目において対照と比較して、TGI85%でHCT116腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが37%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
図19aおよび20aに示す実験結果は、例18bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験47日目において対照と比較して、TGI85%でHCT116腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが37%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
C.SW620TAZD
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS緩衝液:マトリゲルの3:1の混合物0.1mlに懸濁した5×106のSW620細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。腫瘍のサイズが92−348mm3になったとき(13日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜207mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例2b(5mg/kg)、例18b(3mg/kg)、および例51b(5mg/kg)の本発明の融合タンパク質、および、対照としての処方緩衝液(50mMのTrizma Base、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)に対する比較としてrhTRAIL114−281(50mg/kg)。調製物は1日おきに6回静脈内投与(i.v.)し、対照群には処方緩衝液[f25]を与えた。
実験の26日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS緩衝液:マトリゲルの3:1の混合物0.1mlに懸濁した5×106のSW620細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。腫瘍のサイズが92−348mm3になったとき(13日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜207mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例2b(5mg/kg)、例18b(3mg/kg)、および例51b(5mg/kg)の本発明の融合タンパク質、および、対照としての処方緩衝液(50mMのTrizma Base、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)に対する比較としてrhTRAIL114−281(50mg/kg)。調製物は1日おきに6回静脈内投与(i.v.)し、対照群には処方緩衝液[f25]を与えた。
実験の26日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を、図21に腫瘍体積の変化の図として、および図22に対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)を示す。
図21および22に示す実験結果は、例18b、例51b、および例2bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験34日目において対照と比較して、それぞれTGI62.6%、39%および54%でSW620腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが23%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
図21および22に示す実験結果は、例18b、例51b、および例2bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験34日目において対照と比較して、それぞれTGI62.6%、39%および54%でSW620腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが23%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
C1.SW620
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS緩衝液:マトリゲルの3:1の混合物0.1mlに懸濁した5×106のSW620細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。腫瘍のサイズが126−300mm3になったとき(11日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜210mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18b(5mg/kg)の本発明の融合タンパク質、および、対照としての処方緩衝液(50mMのTrizma Base、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)に対する比較としてrhTRAIL114−281(50mg/kg)。調製物は、3日に一度、計5回静脈内投与(i.v.)した。対照群には処方緩衝液[f25]を与えた。
実験の31日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS緩衝液:マトリゲルの3:1の混合物0.1mlに懸濁した5×106のSW620細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。腫瘍のサイズが126−300mm3になったとき(11日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜210mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18b(5mg/kg)の本発明の融合タンパク質、および、対照としての処方緩衝液(50mMのTrizma Base、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)に対する比較としてrhTRAIL114−281(50mg/kg)。調製物は、3日に一度、計5回静脈内投与(i.v.)した。対照群には処方緩衝液[f25]を与えた。
実験の31日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を、図21aに腫瘍体積の変化の図として、および図22aに対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)を示す。
図21aおよび22aに示す実験結果は、例18bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験31日目において対照と比較して、TGI73%でSW620腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが27.6%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
図21aおよび22aに示す実験結果は、例18bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験31日目において対照と比較して、TGI73%でSW620腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが27.6%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
D.HT−29
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS緩衝液:マトリゲルの3:1の混合物0.1mlに懸濁した5×106のHT−29細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。腫瘍のサイズが80−348mm3になったとき(12日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜188mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18b(4用量は3mg/kg、残りの2用量は6mg/kg)、および例51b(5mg/kg)の本発明の融合タンパク質、および、処方緩衝液[f25]に対する比較としてrhTRAIL114−281(50mg/kg)。調製物は、1日おきに6回静脈内投与(i.v.)した。対照群には、対照として処方緩衝液(50mMのTrizma Base、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)を与えた。実験の26日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS緩衝液:マトリゲルの3:1の混合物0.1mlに懸濁した5×106のHT−29細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。腫瘍のサイズが80−348mm3になったとき(12日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜188mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18b(4用量は3mg/kg、残りの2用量は6mg/kg)、および例51b(5mg/kg)の本発明の融合タンパク質、および、処方緩衝液[f25]に対する比較としてrhTRAIL114−281(50mg/kg)。調製物は、1日おきに6回静脈内投与(i.v.)した。対照群には、対照として処方緩衝液(50mMのTrizma Base、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)を与えた。実験の26日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を、図23に腫瘍体積の変化の図として、および図24に対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)を示す。
図23および24に示す実験結果は、例18bおよび例51bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験26日目において対照と比較して、それぞれTGI53%および67%でHT−29腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが17.5%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
図23および24に示す実験結果は、例18bおよび例51bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験26日目において対照と比較して、それぞれTGI53%および67%でHT−29腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが17.5%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
肺がんモデル
A.0日目に、Cby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスの右側皮下(sc)に、0.15mlのHBSS培地に懸濁した5×106のA549細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。実験20日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜45mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18a(5mg/kg)および例35a(5mg/kg)の本発明の融合タンパク質、比較としてrhTRAIL114−281(15mg/kg)、および対照として注射用水。調製物は、以下のように静脈内(i.v.)投与した:投与(1日目)、1日休止、3、4、5日目に毎日投与、1日休止、投与(7日目)、1日休止、投与(9日目)。実験38日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
A.0日目に、Cby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスの右側皮下(sc)に、0.15mlのHBSS培地に懸濁した5×106のA549細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。実験20日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜45mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18a(5mg/kg)および例35a(5mg/kg)の本発明の融合タンパク質、比較としてrhTRAIL114−281(15mg/kg)、および対照として注射用水。調製物は、以下のように静脈内(i.v.)投与した:投与(1日目)、1日休止、3、4、5日目に毎日投与、1日休止、投与(7日目)、1日休止、投与(9日目)。実験38日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図3および図4に、腫瘍体積の変化の図(図3)および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)(図4)として示す。
図3および図4に示す実験結果は、例18aおよび例35aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験38日目において対照と比較して、それぞれTGI73.3%および20.7%でA549腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが16%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
図3および図4に示す実験結果は、例18aおよび例35aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験38日目において対照と比較して、それぞれTGI73.3%および20.7%でA549腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが16%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
B.0日目に、Cby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスの右側皮下(sc)に、HBSS培地とマトリゲルの混合物(4:1)0.10mlに懸濁した5×106のA549細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。実験19日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜75mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18a(5mg/kg)および例50a(20mg/kg)の本発明の融合タンパク質、比較としてrhTRAIL114−281(15mg/kg)、および対照として注射用水。調製物は、1日おきに6回静脈内投与(i.v.)した。実験35日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図5および図6に、腫瘍体積の変化の図(図5)および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)(図6)として示す。
実験の結果は、例18aおよび例50aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験35日目において対照と比較して、それぞれTGI26%および45%でA549腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが0%のレベルで、腫瘍細胞成長に対して阻害効果が得られなかった。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
実験の結果は、例18aおよび例50aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験35日目において対照と比較して、それぞれTGI26%および45%でA549腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが0%のレベルで、腫瘍細胞成長に対して阻害効果が得られなかった。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
C.0日目に、マウスの右側皮下(sc)に、HBSS培地とマトリゲルの混合物(3:1)0.10mlに懸濁した5×106個のA549細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。実験17日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜100−120mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例2a(5mg/kg)、例18a(3mg/kg)および例44a(20mg/kg)の本発明の融合タンパク質、比較としてrhTRAIL114−281(20mg/kg)、および対照として処方緩衝液(19mMのNaH2PO4、81mMのNa2HPO4、50mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、pH7.4)。調製物は、1日おきに6回静脈内投与(i.v.)した。実験34日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図7および図8に、腫瘍体積の変化の図(図7)および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)(図8)として示す。
実験の結果は、例2a、例18aおよび例44aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験34日目において対照と比較して、それぞれTGI83.5%、80%および47%でA549腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが21.8%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
実験の結果は、例2a、例18aおよび例44aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験34日目において対照と比較して、それぞれTGI83.5%、80%および47%でA549腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが21.8%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
D.0日目に、マウスの右側皮下(sc)に、HBSS培地とマトリゲルの混合物(3:1)0.10mlに懸濁した7×106のA549細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。実験21日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜160−180mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例20a(15mg/kg)、例26a(6mg/kg)、例43a(10mg/kg)、および例47a(5mg/kg)の本発明の融合タンパク質、比較としてrhTRAIL114−281(40mg/kg)、および対照として処方緩衝液(5mMのNaH2PO4、95mMのNa2HPO4、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH7.4)。調製物は、1日おきに6回静脈内投与(i.v.)した。実験35日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図9および図10に、腫瘍体積の変化の図(図9)および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)(図10)として示す。
実験の結果は、例20a、例26a、例43aおよび例47aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験35日目において対照と比較して、それぞれTGI49.5%、64%、40.2%および49.5%でA549腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが15%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
実験の結果は、例20a、例26a、例43aおよび例47aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験35日目において対照と比較して、それぞれTGI49.5%、64%、40.2%および49.5%でA549腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが15%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
E.A549−腫瘍の再成長
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS緩衝液:マトリゲルの3:1の混合物0.1mlに懸濁した7×106のA549細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。腫瘍のサイズが85−302mm3になったとき(17日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜177mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例2b(5mg/kg)、例18b(3mg/kg)の本発明の融合タンパク質、および、対照としての処方緩衝液(50mMのTrizma Base、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)に対する比較としてrhTRAIL114−281(90mg/kg)。rhTRAIL114−281は1日おきに12回静脈内(i.v.)投与し、例2bは1日おきに7回静脈内(i.v.)投与し、例18bは実験の17、20、25および29日目に静脈内(i.v.)投与した。対照群には、処方緩衝液を与えた。実験の45日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS緩衝液:マトリゲルの3:1の混合物0.1mlに懸濁した7×106のA549細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。腫瘍のサイズが85−302mm3になったとき(17日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜177mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例2b(5mg/kg)、例18b(3mg/kg)の本発明の融合タンパク質、および、対照としての処方緩衝液(50mMのTrizma Base、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)に対する比較としてrhTRAIL114−281(90mg/kg)。rhTRAIL114−281は1日おきに12回静脈内(i.v.)投与し、例2bは1日おきに7回静脈内(i.v.)投与し、例18bは実験の17、20、25および29日目に静脈内(i.v.)投与した。対照群には、処方緩衝液を与えた。実験の45日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を、図27に腫瘍体積の変化の図として、図28に対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)を示す。
図27および図28に示した実験結果は、例18bおよび例2bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験45日目において対照と比較して、それぞれTGI71%および44%でA549腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが10.6%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
図27および図28に示した実験結果は、例18bおよび例2bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験45日目において対照と比較して、それぞれTGI71%および44%でA549腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが10.6%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
膵臓がんモデル
0日目に、マウスの右側皮下(sc)に、HBSS培地とマトリゲル(3:1)の混合物0.10mlに懸濁した7×106のPANC−1細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。実験27日目、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜95mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例20a(5mg/kg)、例51a(10mg/kg)、および例52a(10mg/kg)の本発明の融合タンパク質、比較としてrhTRAIL114−281(20mg/kg)、および対照としての処方緩衝液(5mMのNaH2PO4、95mMのNa2HPO4、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH7.4)。調製物は、1日おきに6回静脈内(i.v.)投与した。実験の40日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
0日目に、マウスの右側皮下(sc)に、HBSS培地とマトリゲル(3:1)の混合物0.10mlに懸濁した7×106のPANC−1細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。実験27日目、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜95mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例20a(5mg/kg)、例51a(10mg/kg)、および例52a(10mg/kg)の本発明の融合タンパク質、比較としてrhTRAIL114−281(20mg/kg)、および対照としての処方緩衝液(5mMのNaH2PO4、95mMのNa2HPO4、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH7.4)。調製物は、1日おきに6回静脈内(i.v.)投与した。実験の40日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図11および図12に、腫瘍体積の変化の図(図11)および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)(図12)として示す。
実験の結果は、例20a、例51a、および例52aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験40日目において対照と比較して、それぞれTGI19%、38%、および34%でPANC−1腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが12%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
実験の結果は、例20a、例51a、および例52aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験40日目において対照と比較して、それぞれTGI19%、38%、および34%でPANC−1腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが12%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
B.0日目に、マウスの右側皮下(sc)に、HBSS培地とマトリゲル(3:1)の混合物0.10mlに懸濁した5×106のPANC−1細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。実験31日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜110mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18a(3mg/kg)、および例44a(20mg/kg)の本発明の融合タンパク質、比較としてrhTRAIL114−281(20mg/kg)、および対照として処方緩衝液(19mMのNaH2PO4、81mMのNa2HPO4、50mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、pH7.4)。調製物は1日おきに6回静脈内(i.v.)投与した。実験の42日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図13および図14に、腫瘍体積の変化の図(図13)および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)(図14)として示す。
実験の結果は、例18aおよび例44aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験42日目において対照と比較して、それぞれTGI56%および43%でPANC−1腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが27.5%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
実験の結果は、例18aおよび例44aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験42日目において対照と比較して、それぞれTGI56%および43%でPANC−1腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが27.5%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
前立腺がんモデル
0日目に、マウスの右側皮下(sc)に、HBSS培地とマトリゲル(9:1)の混合物0.20mlに懸濁した5×106のPC3細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。実験29日目、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜90mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18a(5mg/kg)の本発明の融合タンパク質、および対照として注射用水。調製物は1日おきに6回静脈内(i.v.)投与した。実験の60日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図15および図16に、腫瘍体積の変化の図(図15)および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)(図16)として示す。
実験の結果は、例18aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験60日目において対照と比較して、TGI30.8%でPC3腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
0日目に、マウスの右側皮下(sc)に、HBSS培地とマトリゲル(9:1)の混合物0.20mlに懸濁した5×106のPC3細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。実験29日目、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜90mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18a(5mg/kg)の本発明の融合タンパク質、および対照として注射用水。調製物は1日おきに6回静脈内(i.v.)投与した。実験の60日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図15および図16に、腫瘍体積の変化の図(図15)および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)(図16)として示す。
実験の結果は、例18aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験60日目において対照と比較して、TGI30.8%でPC3腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
肝がんモデル
A.PCL/PRF/5
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS培地とマトリゲル(3:1)の混合物0.10mlに懸濁した7×106のPCL/PRF/5細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。実験31日目、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜200mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例51a(10mg/kg)の本発明の融合タンパク質、比較としてrhTRAIL114−281(30mg/kg)、および対照としての処方緩衝液(5mMのNaH2PO4、95mMのNa2HPO4、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH7.4)。調製物は1日おきに6回静脈内(i.v.)投与した。実験の49日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
A.PCL/PRF/5
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS培地とマトリゲル(3:1)の混合物0.10mlに懸濁した7×106のPCL/PRF/5細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。実験31日目、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜200mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例51a(10mg/kg)の本発明の融合タンパク質、比較としてrhTRAIL114−281(30mg/kg)、および対照としての処方緩衝液(5mMのNaH2PO4、95mMのNa2HPO4、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH7.4)。調製物は1日おきに6回静脈内(i.v.)投与した。実験の49日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図17および図18に、腫瘍体積の変化の図(図17)および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)(図18)として示す。
実験の結果は、例51aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験49日目において対照と比較して、TGI88.5%でPCL/PRF/5腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが18%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
実験の結果は、例51aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験49日目において対照と比較して、TGI88.5%でPCL/PRF/5腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが18%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
B.HepG2
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS緩衝液とマトリゲル(3:1)の混合物0.10mlに懸濁した7×106のHepG2細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。腫瘍のサイズが64−530mm3になったとき(25日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜228mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18b(5mg/kg、10mg/kgのHSAを補充)の本発明の融合タンパク質、および対照としての処方緩衝液(50mMのTrizma Base、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)に対する比較としてrhTRAIL114−281(50mg/kg)、および参照化合物5FU(20mg/kg)。rhTRAIL114−281は1日おきに6回静脈内(i.v.)投与し、例18bは、実験の25、27、29、37および42日目に静脈内(i.v.)投与した。5FU(20mg/kg)は1日おきに6回腹腔内(i.p.)投与した。対照群には処方緩衝液を与えた。実験の49日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS緩衝液とマトリゲル(3:1)の混合物0.10mlに懸濁した7×106のHepG2細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。腫瘍のサイズが64−530mm3になったとき(25日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜228mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18b(5mg/kg、10mg/kgのHSAを補充)の本発明の融合タンパク質、および対照としての処方緩衝液(50mMのTrizma Base、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)に対する比較としてrhTRAIL114−281(50mg/kg)、および参照化合物5FU(20mg/kg)。rhTRAIL114−281は1日おきに6回静脈内(i.v.)投与し、例18bは、実験の25、27、29、37および42日目に静脈内(i.v.)投与した。5FU(20mg/kg)は1日おきに6回腹腔内(i.p.)投与した。対照群には処方緩衝液を与えた。実験の49日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を、図25に腫瘍体積の変化の図として、および図26に対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)の図として示す。
図25および図26に示す実験結果は、例18bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験49日目において対照と比較して、TGI82.5%でHepG2腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281および5FUについては、対照と比較して、TGIがそれぞれ31%および−4.7%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独および標準化学療法と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
図25および図26に示す実験結果は、例18bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験49日目において対照と比較して、TGI82.5%でHepG2腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281および5FUについては、対照と比較して、TGIがそれぞれ31%および−4.7%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独および標準化学療法と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
多剤耐性子宮肉腫モデル
MES−SA.Dx5
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS緩衝液とマトリゲル(3:1)の混合物0.10mlに懸濁した7×106のMES−SA.Dx5細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。腫瘍のサイズが64−323mm3になったとき(13日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜180mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18b(5mg/kg)の本発明の融合タンパク質、および対照としての処方緩衝液(50mMのTrizma Base、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)に対する比較としてrhTRAIL114−281(50mg/kg)、および参照化合物CPT−11(カンプトテシン、Pfeizer)(30mg/kg)。rhTRAIL114−281および例18bは、1日おきに6回静脈内(i.v.)投与した。CPT−11は、1日おきに6回腹腔内(i.p.)投与した。対照群には処方緩衝液を与えた。実験の34日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
MES−SA.Dx5
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS緩衝液とマトリゲル(3:1)の混合物0.10mlに懸濁した7×106のMES−SA.Dx5細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。腫瘍のサイズが64−323mm3になったとき(13日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜180mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例18b(5mg/kg)の本発明の融合タンパク質、および対照としての処方緩衝液(50mMのTrizma Base、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)に対する比較としてrhTRAIL114−281(50mg/kg)、および参照化合物CPT−11(カンプトテシン、Pfeizer)(30mg/kg)。rhTRAIL114−281および例18bは、1日おきに6回静脈内(i.v.)投与した。CPT−11は、1日おきに6回腹腔内(i.p.)投与した。対照群には処方緩衝液を与えた。実験の34日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を、図29に腫瘍体積の変化の図として、および図30に対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)の図として示す。
図29および図30に示す実験結果は、例18bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験34日目において対照と比較して、TGI85%でMES−SA.Dx5腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281およびCPT−11については、対照と比較して、TGIがそれぞれ51%および57%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独および標準化学療法と比較して、より強力な効果を発揮する。
図29および図30に示す実験結果は、例18bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験34日目において対照と比較して、TGI85%でMES−SA.Dx5腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281およびCPT−11については、対照と比較して、TGIがそれぞれ51%および57%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独および標準化学療法と比較して、より強力な効果を発揮する。
MES−SA.Dx5
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS緩衝液とマトリゲル(3:1)の混合物0.10mlに懸濁した7×106のMES−SA.Dx5細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。腫瘍のサイズが26−611mm3になったとき(19日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜180mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例2b(3mg/kg)、例18b(3mg/kg)、および例51b(7.5mg/kg)の本発明の融合タンパク質、および、対照としての処方緩衝液(50mMのTrizma Base、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)に対する比較としてrhTRAIL114−281(60mg/kg)。rhTRAIL114−281、例2bおよび例51bは1日おきに6回静脈内投与(i.v.)し、例18bは1日おきに4回静脈内投与(i.v.)した。対照群には処方緩衝液を与えた。
実験の33日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS緩衝液とマトリゲル(3:1)の混合物0.10mlに懸濁した7×106のMES−SA.Dx5細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)により移植した。腫瘍のサイズが26−611mm3になったとき(19日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜180mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した:例2b(3mg/kg)、例18b(3mg/kg)、および例51b(7.5mg/kg)の本発明の融合タンパク質、および、対照としての処方緩衝液(50mMのTrizma Base、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)に対する比較としてrhTRAIL114−281(60mg/kg)。rhTRAIL114−281、例2bおよび例51bは1日おきに6回静脈内投与(i.v.)し、例18bは1日おきに4回静脈内投与(i.v.)した。対照群には処方緩衝液を与えた。
実験の33日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を、図29aに腫瘍体積の変化の図として、および図30aに対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)の図として示す。
図29aおよび図30aに示す実験結果は、例2b、例18bおよび例51bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験33日目において対照と比較して、それぞれTGI84%、67.5%および58.6%でMES−SA.Dx5腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが25.8%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独と比較して、より強力な効果を発揮する。
図29aおよび図30aに示す実験結果は、例2b、例18bおよび例51bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験33日目において対照と比較して、それぞれTGI84%、67.5%および58.6%でMES−SA.Dx5腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが25.8%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独と比較して、より強力な効果を発揮する。
Claims (41)
- 融合タンパク質であって、
― フラグメントがhTRAIL95より小さくない位置のアミノ酸から始まる、可溶性hTRAILタンパク質配列の機能的フラグメントであるか、または、少なくとも70%の配列同一性、好ましくは85%の同一性を有し、かつアミノ酸hTRAIL281で終わる、前記機能的フラグメントのホモログである、ドメイン(a)、および
― タンパク質合成を阻害するエフェクターペプチドの配列である少なくとも1つのドメイン(b)であって、ここでドメイン(b)の配列が、ドメイン(a)のC末端および/またはN末端に付着されている前記ドメイン(b)、
を含み、ここで融合タンパク質が、細胞表面の炭水化物受容体に結合するドメインを含まない、前記融合タンパク質。 - ドメイン(a)が、hTRAIL95からhTRAIL121までの範囲(両端を含む)のアミノ酸から始まり、アミノ酸281で終わる可溶性hTRAILタンパク質配列のフラグメントを含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- ドメイン(a)が、hTRAIL95−281、hTRAIL114−281、hTRAIL116−281、hTRAIL119−281、hTRAIL120−281、およびhTRAIL121−281からなる群から選択される、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- ドメイン(a)が、DR4および/またはDR5受容体に対して改変された親和性を有するhTRAILの機能的フラグメントのホモログである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ホモログが、配列番号142および配列番号143からなる群から選択される、請求項4に記載の融合タンパク質。
- ドメイン(b)のエフェクターペプチドが、リボソームのレベルで酵素的にタンパク質翻訳を阻害するペプチドである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- エフェクターペプチドが、N−グリコシダーゼの酵素活性を有するペプチドである、請求項6に記載の融合タンパク質。
- エフェクターペプチドが、リボソームを不活性化するタンパク質毒素:1型RIP、およびリボソームを不活性化するタンパク質毒素:2型RIPの触媒サブユニットA、または、元の配列と少なくとも85%の配列同一性の保存されたN−グリコシダーゼ活性を有するそれらの改変、からなる群から選択される、請求項7に記載の融合タンパク質。
- エフェクターペプチドが、ゲロニン(Gelonium multiflorumから)、変異ゲロニン、モモルディン、サポリン、ブリオジンI、ドデカンドリン、ボウガニン(Bougainvillea spectabilisから)、ヤマゴボウPAPタンパク質(Phytolacca Americana)、を含む1型RIP毒素の群から、または、リシン、リシン突然変異体、アブリン(Abbrus precatriusから)、アブリン突然変異体、モデシン(Adenia digitataから)、ビスクミン(Viscum albumからの毒素MLI)、ボルケンシン(Adenia volkensiiから)、志賀毒素(Shigella dysenteriaeから)、トリコサンチン(trichosantin)、トリコサンチン突然変異体、のサブユニットAを含む、2型RIP毒素の触媒サブユニットAの群から、または、元の配列と少なくとも85%の配列同一性の、保存されたN−グリコシダーゼ活性を有するそれらの改変から選択される、請求項8に記載の融合タンパク質。
- エフェクターペプチドが、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号70、配列番号78、配列番号82、配列番号194、配列番号195、配列番号198、配列番号199、および配列番号200からなる群から選択される、請求項7〜9のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- エフェクターペプチドが、リボヌクレアーゼ酵素活性を有するペプチドである、請求項6に記載の融合タンパク質。
- エフェクターペプチドが、タンパク質毒素であるαサクリン(sacrin)、マイトギリン、ヒルステリン(hirsutellin)(Hirsutella thompsoniiから)、レストリクトシン(Aspergillus restrictusから)、および元の配列と少なくとも85%の配列同一性の保存されたリボヌクレアーゼ活性を有するそれらの改変から選択される、請求項11に記載の融合タンパク質。
- エフェクターペプチドが、配列番号71および配列番号72からなる群から選択される、請求項12に記載の融合タンパク質。
- エフェクターペプチドが、ADP−リボシルトランスフェラーゼの酵素活性を有する、請求項6に記載の融合タンパク質。
- エフェクターペプチドが、Pseudomonas aeruginosaの触媒サブユニットA、または、Pseudomonas aeruginosa毒素およびCorynebacterium diphteriaeのジフテリア毒素、またはCorynebacterium diphteriaeの変異ジフテリア毒素の、変異触媒サブユニットA、および元の配列と少なくとも85%の配列同一性の保存されたADP−リボシルトランスフェラーゼ活性を有するそれらの改変、からなる群から選択される、請求項14に記載の融合タンパク質。
- エフェクターペプチドが、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号196、配列番号197、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、および配列番号207からなる群から選択される、請求項15に記載の融合タンパク質。
- ドメイン(b)のエフェクターペプチドが、毒素−抗毒素系に属するタンパク質合成を阻害する毒素である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- エフェクターペプチドが、トポイソメラーゼ活性、mRNAse活性、または細胞膜との結合、を有するペプチドである、請求項17に記載の融合タンパク質。
- エフェクターペプチドが、配列番号74のCcdBタンパク質、配列番号75のCcdBタンパク質、配列番号73のKidタンパク質、配列番号76のRelEタンパク質、配列番号77のStaBタンパク質、および配列番号208のHokタンパク質、ならびに元の配列と少なくとも85%の配列同一性の、保存されたトポイソメラーゼ活性、mRNAse活性または細胞膜との結合活性を有するそれらの改変、からなる群から選択される、請求項18に記載の融合タンパク質。
- ドメイン(a)とドメイン(b)の間、または複数のドメイン(b)の間に、プロテアーゼ切断部位を含むドメイン(c)を含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ドメイン(c)が、腫瘍環境中に存在するプロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ切断部位を含む、請求項20に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜21のいずれか一項に記載の融合タンパク質であって、ドメイン(b)のエフェクターペプチドが、輸送ドメイン(d)にさらに結合されており、該輸送ドメイン(d)が、以下:
―(d1)配列番号139のPseudomonas由来の、細胞膜を通って輸送するドメイン;
―(d2)膜を通り、Lys Asp Glu Leu/KDEL、His Asp Glu Leu/HDEL、Arg Asp Glu Leu/RDEL、Asp Asp Glu Leu/DDEL、Ala Asp Glu Leu/ADEL、Ser Asp Glu Leu/SDEL、およびGlu Asp Leu/KEDLから選択される小胞体に輸送するドメイン;
―(d3)6、7、8、9、10または11個のArg残基からなる、細胞膜を通って輸送するポリアルギニン配列;
およびそれらの組み合わせ、からなる群から選択され、
ここで、輸送ドメイン(d)が、エフェクターペプチドドメイン(b)のC末端および/またはN末端に位置する、前記融合タンパク質。 - 輸送ドメイン(d)が、ドメイン(b)とドメイン(c)の間、またはドメイン(a)とドメイン(c)の間、または2つのドメイン(c)の間に位置する、請求項22に記載の融合タンパク質。
- 配列(d)が、融合タンパク質のC末端に位置する、請求項22に記載の融合タンパク質。
- ドメイン(a)、(b)、(c)、および/または(d)の間に柔軟な立体リンカーをさらに含む、請求項20〜24のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 立体リンカーが、Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGS、Gly Gly Gly Ser/GGGSまたはGly Gly Gly/GGG、Gly Gly Gly Gly/GGGG、Ala Ser Gly Gly/ASGG、Ala Ser Gly/ASG、Gly Gly Gly Ser Gly/GGGSG、Gly Gly Gly/GGG、Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Gly/GGGSASGG、Ser His His Ser/SHHS、CAAACAAC(Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys)、CAACAAAC(Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys)、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項25に記載の融合タンパク質。
- ドメイン(a)、(b)および/または(c)の間に、PEG分子に付着するためのリンカーであるドメイン(e)を、Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu/ASGCGPE、Ala Ala Cys Ala Ala/AACAA、Ser Gly Gly Cys Gly Gly Ser/SGGCGGS、またはSer Gly Cys Gly Ser/SGCGSから選択して含む、請求項20〜26のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ドメイン(b)とドメイン(c)の間に、Asn Gly Arg/NGR、Asp Gly Arg/DGR、またはArg Gly Asp/RGDからなる群から選択されるインテグリンと結合するモチーフをさらに含む、請求項20〜27のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の融合タンパク質:配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;配列番号15;配列番号16;配列番号17;配列番号18;配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;配列番号39;配列番号40;配列番号41;配列番号42;配列番号43;配列番号44;配列番号45;配列番号46;配列番号47;配列番号48;配列番号49;配列番号50;配列番号51;配列番号52;配列番号53;配列番号54;配列番号144;配列番号145;配列番号146;配列番号147;配列番号148;配列番号149;配列番号150;配列番号151;配列番号152;配列番号153;配列番号154;配列番号155;配列番号156;配列番号157;配列番号158;配列番号159;配列番号160;配列番号161;配列番号162;配列番号163;配列番号164;配列番号165;配列番号166;配列番号167;および配列番号168。
- 組み換えタンパク質である、請求項1〜29のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜29のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド配列。
- E. coliにおける遺伝子発現について最適化された、請求項31に記載のポリヌクレオチド配列。
- 以下からなる群から選択される、請求項32に記載の配列:配列番号85;配列番号86;配列番号87;配列番号88;配列番号89;配列番号90;配列番号91;配列番号92;配列番号93;配列番号94;配列番号95;配列番号96;配列番号97;配列番号98;配列番号99;配列番号100;配列番号101;配列番号102;配列番号103;配列番号104;配列番号105;配列番号106;配列番号107;配列番号108;配列番号109;配列番号110;配列番号111;配列番号111;配列番号113;配列番号114;配列番号115;配列番号116;配列番号117;配列番号118;配列番号119;配列番号120;配列番号121;配列番号122;配列番号123;配列番号124;配列番号125;配列番号126;配列番号127;配列番号128;配列番号129;配列番号130;配列番号131;配列番号132;配列番号133;配列番号134;配列番号135;配列番号136;配列番号137;配列番号138;配列番号169;配列番号170;配列番号171;配列番号172;配列番号173;配列番号174;配列番号175;配列番号176;配列番号177;配列番号178;配列番号179;配列番号180;配列番号181;配列番号182;配列番号183;配列番号184;配列番号185;配列番号186;配列番号187;配列番号188;配列番号189;配列番号190;配列番号191;配列番号192;および配列番号193。
- 請求項31〜33のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
- 請求項34に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- E. coli細胞である、請求項35に記載の宿主細胞。
- 活性成分としての請求項1〜30のいずれか一項に記載の融合タンパク質を、薬学的に許容し得る担体と組み合わせて含む、医薬組成物。
- 非経口投与用の形態である、請求項37に記載の医薬組成物。
- ヒトを含む哺乳動物における腫瘍性疾患の処置に用いるための、請求項1〜30のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ヒトを含む哺乳動物におけるがん疾患を処置する方法であって、それが必要な対象に対して、請求項1〜30に記載の融合タンパク質、または請求項37もしくは38に記載の医薬組成物の、抗腫瘍有効量を投与することを含む、前記方法。
- 配列番号200のトリコサンチンの突然変異体、配列番号201のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体、配列番号202のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体、配列番号204のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体、配列番号205のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体、および配列番号207のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットAの突然変異体からなる群から選択される、ペプチド。
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