JP2015203727A - 撮像装置および撮像方法 - Google Patents

Abstract

【課題】広い視野において被写体に合焦した状態で高解像度撮像を行えるようにする。【解決手段】撮像装置は、被写体をその表面側から撮像する。撮像装置は、撮像光学系３０４と、該撮像光学系の中間結像領域に配置された可変形状ミラー３０４２と、被写体を複数の被写体領域に分割し、被写体の表面形状を示す形状データを用いて各被写体領域の表面形状を近似する近似面を求め、可変形状ミラーを近似面に対応する形状に変形させて撮像を行う制御手段４００とを有する。【選択図】図１

Description

本発明は、標本等の被写体を撮像する顕微鏡等の撮像装置に関する。

人体の組織片等の標本を撮像してデジタル画像を取得する顕微鏡では、標本の微細な構造を判別するために、撮像光学系の高解像度化が進められている。ただし、一般に、撮像光学系の高解像度化が進むと、焦点深度が浅くなる。

一方、標本の表面形状は必ずしも平坦とは限らず、凹凸を有することが多い。また、プレパラートにおいて標本を挟んだカバーガラスの厚さにむらがあると、標本の表面形状に大きなうねりが生ずる。さらに、標本付近の温度が変動することで撮像光学系のピント状態が変化する可能性もある。

従来の顕微鏡では、特許文献１にて開示されているように、標本のうち小領域のみを撮像可能な視野を有する撮像光学系を標本に対して移動させるとともに該小領域ごとに撮像光学系のフォーカス調整をしながら標本全体を撮像する方法が採られている。このため、撮像時間が長くなるという欠点がある。

これに対して、特許文献２には、撮像光学系を広視野化するとともに複数の撮像素子を用いて標本の複数の小領域を一括して撮像することで、標本全体の高速撮像を可能とする方法が開示されている。

特開２００６−３４３５７３号公報 特開２００９−３０１６号公報

しかしながら、撮像光学系を広視野化しつつ高解像度化すると、前述したように撮像光学系の焦点深度が浅くなるため、凹凸やうねりを含む表面形状を有する標本に対して視野全域において合焦した状態を得ることが難しくなる。

本発明は、広い視野において標本（被写体）に合焦した状態で高解像度撮像を行えるようにする撮像装置および撮像方法を提供する。

本発明の一側面としての撮像装置は、被写体をその表面側から撮像する。撮像装置は、撮像光学系と、該撮像光学系の中間結像領域に配置された可変形状ミラーと、被写体を複数の被写体領域に分割し、被写体の表面形状を示す形状データを用いて各被写体領域の表面形状を近似する近似面を求め、可変形状ミラーを近似面に対応する形状に変形させて撮像を行う制御手段とを有することを特徴とする。

また、本発明の他の一側面としての撮像方法は、被写体をその表面側から撮像光学系を通して撮像する撮像方法である。該撮像方法は、被写体の表面形状を示す形状データを用意し、被写体を複数の被写体領域に分割し、上記形状データを用いて各被写体領域の表面形状を近似する近似面を求める。そして、撮像光学系の中間結像領域に配置した可変形状ミラーを近似面に対応する形状に変形させて撮像を行うことを特徴とする。

本発明によれば、被写体の表面形状に近い形状を有する可変形状ミラーを介して撮像を行うことで、広い視野において被写体に合焦した状態で高解像度撮像を行うことができる。

本発明の実施例１である顕微鏡を含む顕微鏡システムの構成を示す図。 上記顕微鏡システムにおいて標本の画像データを取得する手順を示すフローチャート。 上記顕微鏡システムの撮像光学系の構成を示す図。 上記撮像光学系に含まれる可変形状ミラーの構成を示す図。 うねりを有する標本の近似２次曲面の例を示す図。 実施例１によるシミュレーション結果を示す表図。 本発明の実施例２によるシミュレーション結果を示す表図。 上記顕微鏡システムによる撮像方法を示す図。 上記顕微鏡システムにおけるフォーカス位置計測方法の例を示す図。

以下、本発明の実施例について図面を参照して説明する。

図１には、本発明の実施例１である撮像装置としての顕微鏡を含む顕微鏡システムの構成例を示す。顕微鏡システムは、標本の表面形状や後述するスライドガラスの厚さ等を計測する計測システム１００と、標本を撮像する顕微鏡３００とにより構成されている。

計測システム１００は、計測用照明部１０１と、計測用ステージ１０２と、計測用光学系１０４と、計測部１０５とにより構成されている。

計測用照明部１０１は、計測用ステージ１０２上に設置されたプレパラート１０３内の被写体としての標本に不図示の光源からの光を導く照明光学系を有する。プレパラート１０３は、スライドガラスと、該スライドガラス上に載置された観察対象物である組織片等の標本と、標本を覆う（保護する）ようにスライドガラスに重ねられたカバーガラスとによって構成されている。計測用ステージ１０２は、プレパラート１０３を保持するとともに、計測光学系１０４に対するプレパラート１０３（標本）の位置を調整するよう駆動される。計測部１０５は、計測用照明部１０１から射出してプレパラート１０３にて透過または反射した光を計測用光学系１０４を通して受光することにより、標本の大きさや表面形状およびカバーガラスの厚さ等を計測する。

計測用光学系１０４は、標本全体をカバーする広視野を有することが望ましく、解像力は低くてもよい。標本の大きさは、計測用光学系１０４により形成される標本像の輝度分布を二値化したり標本像の輪郭検出を行ったりする等の一般的な手法によって計測することができる。また、標本の表面形状は、標本での反射光を用いて計測したり干渉計を用いて計測したりしてもよい。例えば、三角測量法を利用する方法（特開平６−０１１３４１号公報参照）や、共焦点光学系を用いてガラス境界面で反射するレーザ光の距離の差を測定する方法（特開２００５−９８８３３号公報参照）を用いてもよい。また、カバーガラスの厚さは、レーザ干渉計等を用いて計測することができる。計測部１０５は、これらの計測結果を示すデータを制御部４００に伝送する。

これら計測の終了後、計測用ステージ１０２上に設置されていたプレパラート１０３は、不図示の標本搬送装置による吸着や把持等によって撮像用ステージ３０２上に搬送される（以下、プレパラートの符号を３０３とする）。なお、計測用ステージ１０２自体が移動して撮像用ステージ３０２として用いられる構成を採用してもよい。

撮像用ステージ３０２は、撮像光軸（図１中に示すＸ，ＹおよびＺ軸方向のうちＺ軸方向）に直交するＸ軸方向とＹ軸方向に平行移動したりＸ軸回りやＹ軸周りで傾動したりすることができる。

顕微鏡３００は、プレパラート１０３内の標本をその表面側から撮像する。顕微鏡３００は、撮像用照明部３０１と、上述した撮像用ステージ３０２と、撮像光学系３０４と、撮像部３０５と、制御部４００とにより構成されている。顕微鏡３００は、温度センサ３０８およびフォーカス計測部（フォーカス計測手段）３０９の少なくとも一方を有する。

撮像用照明部３０１は、光源２０１と、該光源２０１から発せられた光を撮像用ステージ３０２上に設置されたプレパラート３０３に導く照明光学系２０２とを有する。光源２０１としては、ハロゲンランプ、キセノンランプ、ＬＥＤ等を用いることができる。撮像用ステージ３０２は、プレパラート３０３を保持するとともに、撮像光学系３０４に対するプレパラート３０３の位置を調整するよう駆動される。

撮像用ステージ３０２上（または撮像用ステージ３０２の付近でもよい）には、温度センサ３０８が設置されている。温度センサ３０８は、プレパラート３０３の近傍の温度を計測する。なお、温度センサを、プレパラート３０３におけるカバーガラスとスライドガラスの間に設置したり撮像光学系３０４の内部に設置したりしてもよい。また、複数の温度センサを上述した複数の箇所に設置してもよい。

フォーカス計測部３０９は、撮像光学系３０４の光軸方向におけるプレパラート３０３の位置を計測する。具体的には、フォーカス計測部３０９は、プレパラート３０３において任意に設定された特定の１点ないし複数点（特定点）の光軸方向での位置をモニタリングする。これにより、特定点の光軸方向での位置が顕微鏡３００のフォーカス基準位置（例えば、撮像光学系３０４のベストフォーカス面）からどの程度ずれているかを（温度変化によるずれを含めて）検出することができる。そして、計測システム１００によって計測された標本の表面形状やカバーガラスの厚みのデータと該ずれ量から、プレパラート３０３全体のフォーカス位置の変化（以下、フォーカスシフトという）の量を得ることができる。

なお、本実施例では、フォーカス計測部３０９を撮像光学系３０４の外部に配置しているが、撮像光学系３０４の内部に組み込んでもよい。

撮像光学系３０４は、撮像用ステージ３０２上の面（被撮像面）Ａにおいて照明された標本の光学像を、高解像度で撮像面Ｂに結像させる。また、撮像光学系３０４は、後述する可変形状ミラー（デフォーマブルミラー）を内部に含んでいる。

制御部４００は、計測システム１００による計測で得られた標本の表面形状やカバーガラスの厚みのデータと温度センサ３０８により計測された温度の変化を示すデータを用いてフォーカスシフト量を計算する。そして、該フォーカスシフト量に基づいて、可変形状ミラーの反射面の形状を変形させることによって、フォーカスシフトを補正する。

撮像部３０５は、プレパラート３０３内の標本において透過または反射した光が撮像光学系３０４を通過することで撮像面Ｂに形成された標本像（光学像）を受光する。撮像部３０５は、ＣＣＤセンサやＣＭＯＳセンサ等の撮像素子３０６とこれを駆動する電気回路とを有し、撮像素子３０６は標本像を光電変換する。撮像素子３０６からの出力される電気信号（撮像信号）を処理することで、標本の画像データを得ることできる。この顕微鏡３００では、標本を複数の領域（被写体領域：以下、分割標本領域という）に分割し、該複数の分割標本領域のうち一部の分割標本領域に対応する撮像素子３０６が撮像面Ｂに沿って配置されている。

反射面の変形だけでは補正しきれないフォーカスシフトは、撮像光学系３０４の光軸方向に対して可変形状ミラーの位置や撮像素子３０６の位置を単独または同時に変更（調整）することで補正することが可能である。このときの可変形状ミラーおよび撮像素子３０６の光軸方向での位置調整量をフォーカスオフセット量という。

次に、標本の画像データを取得する手順（撮像方法）について、図２（Ａ）に示すフローチャートを用いて説明する。まずステップＳ１０１では、計測用ステージ１０２上にプレパラート１０３を設置し、計測用照明部１０１により計測用ステージ１０２上に設置されたプレパラート１０３内の標本を照明する。

次に、ステップＳ１０２において、計測部１０５は、標本からの透過光（または反射光）を計測用光学系１０４を通して計測部１０５により受光し、該透過光（または反射光）の強度と標本の厚さ方向での位置（座標）とを計測する。

そして、ステップＳ１０３において、計測部１０５は、計測結果を示すデータ（形状データ）を制御部４００に伝送する。

次に、ステップＳ１０４において、制御部４００は、計測部１０５から伝送されてきた形状データを用いて、標本の表面形状を近似する近似面としての近似曲面（を示す式）を算出する。この近似曲面を算出する間に、ステップＳ１０５にて、プレパラート１０３は標本搬送部を介して計測用ステージ１０２から撮像用ステージ３０２へと搬送される。撮像用ステージ３０２は、標本をｘ軸およびｙ軸方向における撮像位置にセットする。

次に、ステップＳ１０６において、温度センサ３０８は、プレパラート３０３の近傍（または撮像光学系３０４の近傍）の温度を計測する。この温度の計測に代えてまたは加えて、フォーカス計測部３０９がプレパラート３０３の特定点の光軸方向での位置（フォーカス位置）を計測してもよい。そして、ステップＳ１０７において、温度センサ３０８または（および）フォーカス計測部３０９は、計測した温度または（および）フォーカス位置のデータを制御部４００に伝送する。

次に、ステップＳ１０８において、制御部４００は、温度センサ３０８により計測された温度をプレパラート３０３全体のフォーカスシフト量に換算する。また、フォーカス計測部３０９で特定点のフォーカス位置が計測された場合は、該計測されたフォーカス位置をプレパラート３０３全体のフォーカスシフト量に換算する。これらのフォーカスシフト量はＸ軸およびＹ軸方向での位置（ＸＹ座標）によらず一様な値であってもよいし、ＸＹ座標の２次関数で表現される値であってもよい。

次に、同ステップにおいて、制御部４００は、ステップＳ１０４で算出した近似曲面の式の係数にフォーカスシフト量を加え、新たな近似曲面を得る。さらに、制御部４００は、新たな近似曲面から可変形状ミラーの反射面の変形量（以下、ミラー補正量いう）とフォーカスオフセット量とを計算する。

そして、ステップＳ１０９において、制御部４００は、ミラー補正量に応じて可変形状ミラーを変形させる。また、制御部４００は、フォーカスオフセット量に応じて、撮像素子３０６および可変形状ミラーのうち少なくとも一方の光軸方向での位置を調整する。

次に、ステップＳ１１０において、撮像用照明部３０１は撮像用ステージ３０２上のプレパラート３０３（標本）に対して照明光を照射する。そして、各撮像部３０５の撮像素子３０６は、標本全体のうち該撮像部３０５に対応する分割標本領域を撮像する。撮像部３０５は、撮像素子３０６から出力された撮像信号を不図示の画像処理部に伝送する。画像処理部は撮像信号を処理して画像データを生成する。画像データは、顕微鏡３００の内部または外部の記憶部に伝送されて記憶される。

次に、ステップＳ１１１では、制御部４００は、複数の分割標本領域のすべてを撮像したか否かを判定する。このとき、複数の分割標本領域のすべてを撮像するための撮像回数を予め設定しておき、実際の撮像回数がその設定された撮像回数に達したか否かを判定してもよい。まだ複数の分割標本領域のすべてを撮像していない場合は、制御部４００は、まだ撮像していない分割標本領域を撮像するために撮像用ステージ３０２をＸ軸およびＹ軸方向の少なくとも一方に移動させ、ステップＳ１０６からステップＳ１１０の処理を繰り返す。すなわち、制御部４００は、計測部１０５から伝送された標本全体の大きさの情報に基づいて、該標本全体の画像データが得られるように、撮像する分割標本領域を変えながら撮像を繰り返す。

これについて、図８を用いて説明する。図８には、複数の撮像素子３０６として４つの撮像素子が互いにＸ軸およびＹ軸方向に１つの撮像素子（または分割標本領域）分の間隔をあけて配置されている場合を示している。被撮像面Ａ上における標本全体の領域を点線で囲んで示し、４つの撮像素子３０６のそれぞれによって撮像される分割標本領域をハッチング領域として示している。撮像光学系３０４の視野は円により囲まれた領域であり、１回の撮像により撮像されるのは、この円に内接する１点鎖線で囲まれた９つの分割標本領域のうちのハッチング領域の部分である。

この図の例では、撮像する４つの分割標本領域（つまりは撮像光学系３０４の視野の中心）を変えながら４回の撮像を行うことで標本全体（１６の分割標本領域）を撮像することができる。１回目の撮像における撮像光学系３０４の視野の中心を１として示している。同様に、２回目以後の撮像光学系３０４の視野の中心を２，３，４として示している。

このようにして複数の分割標本領域のすべての撮像が終了した場合は、ステップＳ１１２において、制御部４００は、画像処理部にすべての分割標本領域の画像データを合成して標本全体の画像データを生成させる。画像処理部は、合成した画像データに対して、ガンマ補正、ノイズ除去、圧縮等の画像処理も行う。

そして、ステップＳ１１３において、制御部４００は、画像処理部において生成された標本全体の画像データを前述した記憶部に記憶させる。

次に、撮像光学系３０４のより具体的な構成について、図３（Ａ）を用いて説明する。撮像光学系３０４は、被撮像面Ａ側（被写体側）から撮像面Ｂ側に順に、第１の結像光学系（第１の光学系部分）３０４１、複数の可変形状ミラー３０４２と、複数の第２の結像光学系（第２の光学系部分）３０４３とにより構成されている。ここでは、図８を用いて説明したように複数（９つ）の標本分割領域をカバーできる広い視野と高解像度を有する撮像光学系３０４について説明する。

撮像光学系３０４は、第１の結像光学系３０４１の結像面（中間結像面）Ｃを９つの領域に分割する。そして、これら９つの領域のうち１つの領域の像（中間像）を第２の結像光学系３０４３によって撮像面Ｂに再結像させる。つまり、被撮像面Ａと撮像面Ｂと中間結像面Ｃとは互いに共役な関係になっている。なお、中間結像面Ｃよりも被撮像面Ａ側に他の中間結像面が存在してもよい。

中間結像面Ｃおよびその近傍を含む中間結像領域には、撮像素子３０６の数と同じ数の可変形状ミラー（以下、単にミラーともいう）３０４２が配置されている。図８に示したように４つの撮像素子３０６が設けられている場合は、４つのミラー３０４２が配置されている。そして、複数のミラー３０４２のそれぞれに対して第２の結像光学系３０４３が設けられている。このように、複数の撮像素子３０６のそれぞれに対して、共通の第１の結像光学系３０４１と、専用のミラー３０４２および第２の結像光学系３０４３とが設けられている。なお、図３（Ａ）では、複数（４つ）のミラー３０４２および第２の結像光学系３０４３のうち２つのみを示している。

第１の結像光学系３０４１の中間結像面Ｃでの視野（イメージサークル）を、図３（Ｂ）に大きな円で示す。この視野に内接する小さな円で示す４つの領域は、第２の結像光学系３０４３の中間結像面Ｃでの視野に相当する。各小円領域は、ハッチング領域として示すある連続した領域、すなわち１つの分割標本領域の中間像が形成される領域をカバーするように設定されている。そして、各小円領域内の光は、４つのミラー３０４２で反射され、第２の結像光学系３０４３によって最終結像面である撮像面Ｂ上にて結像するとともに撮像素子３０６に入射する。

図３（Ａ）において、被撮像面Ａにおける任意の点Ａ１からの光は第１の結像光学系３０４１を通過して第１結像点（中間結像点）Ｃ１に結像する。そして、この光は、第１結像点Ｃ１およびその近傍を含む中間結像領域に配置されたミラー３０４２によって反射される。第１結像点Ｃ１の近傍とは、第１結像点Ｃ１にミラー３０４２上の１点が配置されていたとしても、その１点から離れた像高ではミラー３０４２が第１結像点Ｃ１から光軸方向にずれていること意味する。

ミラー３０４２で反射した光は、第２の結像光学系３０４３を通過して撮像面Ｂ上の第２結像点Ｂ１に結像して撮像素子３０６に入射する。

同様に、被撮像面Ａ上の点Ａ２，Ａ３，Ａ４からの光は、第１結像点Ｃ２，Ｃ３，Ｃ４に結像し、さらに第２結像点Ｂ２，Ｂ３，Ｂ４に結像する（ただし、Ａ３，Ａ４，Ｂ３，Ｂ４は図示していない）。

また、図３（Ｂ）には、フォーカス計測部３０９によるフォーカス位置の計測を、第１の結像光学系３０４１の視野内のうち複数の小円領域、つまりは中間像が撮像される領域に含まれない部分（非撮像領域）に設定したフォーカス計測領域で行う場合を示している。

フォーカス計測部３０９がフォーカス位置計測に用いるフォーカス状態の検出方法の例として、図９には、ＴＴＬ方式でのフォーカス状態検出方法を示している。ここでは、被写体に光を照射し、該被写体からの反射光を受光素子で受光することで得られる反射光の状態からフォーカス状態を検出する方法（米国特許４,７９８,９４８号参照）を示している。

光源３０９１から発せられた光はコリメートレンズ３０９２により平行光束に変換される。そして、該平行光束のうち半分が遮光板３０９３によって遮光され、残りがハーフミラー３０９４に入射する。ハーフミラー３０９４に入射した光は第１の結像光学系３０４１を通過して被撮像面Ａに集光される。この光は被撮像面Ａにて反射し、入射時の光路とは光軸を挟んで反対側（図中の上側）の光路を通ってハーフミラー３０９４に入射し、反射する。反射した光は結像レンズ３０９５により集光され、受光素子３０９６上に点像を形成する。受光素子３０９６の出力信号は反射光の状態を示しており、該出力信号に基づいてフォーカス状態を検出することができる。そして、検出されたフォーカス状態が合焦状態になる被撮像面Ａの位置が第１の結像光学系３０４１（つまりは撮像光学系３０４）のフォーカス位置に相当する。

このような方法を用いてフォーカス位置計測を行う場合において、前述したように第１の結像光学系３０４１の視野内のうち非撮像領域をフォーカス位置計測用の領域として用いると特によい。これにより、フォーカス位置計測用の光源３０９１、光学系（コリメータレンズ３０９２、ハーフミラー３０９４および結像レンズ３０９５）および受光素子３０９６の配置が容易になるためである。

図４（Ａ），（Ｂ）には、可変形状ミラー３０４２の構成例を示している。ミラー３０４２は、アルミニウム等の金属の薄膜によって所望の反射特性が得られるように形成されている。また、ミラー３０４２は、図３（Ａ）に示したように中間結像領域に配置されるため、中間像の情報を欠落させないように連続した反射面を有する。反射面の形状は、図４（Ａ）に示すように圧電素子等のアクチュエータの伸縮により薄膜の形状を変えたり、図４（Ｂ）に示すように薄膜と複数の電極との間に電圧を印加することで発生する静電引力により薄膜の形状を変えたりすることで変形させることができる。また、図示はしないが、ミラーを保持する部材（枠）を変形させる等、図４（Ａ），（Ｂ）に示した方法以外の方法によって反射面を変形させてもよい。なお、ミラー３０４２の反射面の初期形状は、平面であってもよいし曲面や球面であってもよい。さらに、ミラー３０４２の反射面の変形量をモニタするための構成を備えていてもよい。

このように構成されたミラー３０４２の反射面の形状を制御するため、前述したように制御部４００は、計測部１０５からの形状データを用いて標本の表面形状（うねり形状）を近似する近似曲面を算出する。ここでは、近似曲面としての２次曲面を、以下の式（１）のように算出する。
ｚ＝Ｂ_１ｘ^２+Ｂ_２ｘｙ＋Ｂ_３ｙ^２+Ｂ_４ｘ＋Ｂ_５ｙ＋Ｂ_６ …（１）
実際の標本の表面形状に３次以上の高次のうねり成分が含まれる場合もあるが、３次以上のうねり成分の量は小さいので無視してもよい。また、温度の変化に起因するフォーカスシフトは２次以下の低次のうねり成分を近似するだけで十分である。さらに、標本の表面形状を２次曲面で近似することにより、ミラー３０４２の反射面の変形制御が容易になるとともに、反射面を変形させるためのアクチュエータ（図４（Ａ））や電極（図４（Ｂ））の数を少なくすることができる。また、反射面の変形量をモニタする場合にも、反射面のうち代表する数点をモニタすれば十分である。

制御部４００は、このように算出した標本の表面形状を近似する近似曲面に応じてミラー３０４２の反射面を変形させる。言い換えれば、ミラー３０４２の反射面を近似曲面に対応する形状に変形させる。さらに、制御部４００は、フォーカスシフトを補正するために撮像素子３０６またはミラー３０４２の光軸方向での位置を調整する。

図２（Ａ）に示したフローチャートのうちステップＳ１０４で行われる近似曲面の算出処理について、図２（Ｂ）のフローチャートを用いて説明する。ここでは、図５（Ａ）に示すように標本の表面形状の凹凸を示すデータである表面形状マップが、計測部１０５によって前述した形状データとして用意（生成）された場合について説明する。表面形状マップの横軸および縦軸はそれぞれ、Ｘ軸方向およびＹ軸方向での原点からの距離、つまりは位置（座標）を示しており、単位はｍｍである。また、図５（Ａ）中のスケールバーは、Ｚ軸方向である光軸方向での高さ位置（座標）を示しており、単位はｍｍである。この表面形状マップから分かるように、標本の表面形状の凹凸は±６μｍ以上ある。一方、撮像光学系３０４の焦点深度はおおよそ１μｍ以下であるので、焦点深度に対して凹凸が非常に大きい。

ステップＳ２０１では、制御部４００は、計測部１０５によって各ＸＹ座標での高さ位置（Ｚ位置）を（Ｘ，Ｙ，Ｚ）の形で表した表面形状マップを取得する。

次に、ステップＳ２０２では、制御部４００は、図５（Ｂ）に示すように、取得した表面形状マップを先に説明した複数の分割標本領域の数と同じ数に、かつ相似な形状（つまりは撮像素子３０６と相似な形状）を有するように複数に分割する。図５（Ｂ）中の格子状の白線が分割線であり、表面形状マップの１つの分割領域を、以下の説明において分割マップ領域という。

標本上での各分割標本領域の大きさは、撮像素子３０６の大きさを撮像光学系３０４の倍率で除したものとなる。例として、第１の結像光学系の倍率ｍ_１を５倍とし、第２の結像光学系の倍率ｍ_２を２倍とすると、撮像光学系３０４全体の倍率は１０倍である。そして、撮像素子３０６がその一辺が３２．５ｍｍの正方形であるとすると、標本上における各分割標本領域の一辺の長さは３２．５ｍｍ／１０倍＝３．２５ｍｍとなる。また、第１の結像光学系３０４１の被撮像面Ａ側の視野は直径１４．１ｍｍの円形であり、この視野に内接する正方形の一辺の長さは１０ｍｍである。一方、第２の結像光学系３０４３の被撮像面Ａ側の視野は直径４．６ｍｍの円形であり、この視野に内接する正方形の一辺の長さは３．２５ｍｍである。

各分割マップ領域内のＸＹ座標（ｘ_ｊ，ｙ_j）でのＺ位置を（ｘ_ｊ，ｙ_j，ｚ_j）とする。ステップＳ２０３では、制御部４００は、標本の表面形状を近似する２次曲面を求める。この際、分割標本領域（領域番号をｉとする）ごとの表面形状を近似する以下の式（１′）で示される２次曲面をその分割標本領域に対応する分割マップ領域のＺ位置データを用いて最小二乗法により求める。
ｚ＝Ｂ_１(i)ｘ^２+Ｂ_２(i)ｘｙ＋Ｂ_３(i)ｙ^２+Ｂ_４(i)ｘ＋Ｂ_５(i)ｙ＋Ｂ_６(i) …（１′）
ただし、i＝１，２，３、・・・，ｉ_ｎとする。

係数Ｂ_１(i)，Ｂ_２(i)，、・・・，Ｂ_６(i)はすべての分割標本領域に対して分割標本領域ごとに求められる。

図５（Ｃ）には、ある分割標本領域のうねりがある表面形状Ｓと、これを近似する２次曲面Ｓ′であって上記のように最小二乗法によって求めたものとを３次元的に示している。

次に、図２（Ａ）に示したフローチャートのうちステップＳ１０８にて行われるミラー補正量およびフォーカスオフセット量を決定する処理についてより詳しく説明する。

まず、制御部４００は、前述したように、ステップＳ１０７で入力された温度を標本全体のフォーカスシフト量に換算する。もしくは、制御部４００は、フォーカス計測部３０９で計測された標本の特定点のフォーカス位置を、標本全体のフォーカスシフト量に換算する。これらのフォーカスシフト量はＸＹ座標によらず一様な値であってもよいし、ＸＹ座標の２次関数で表現される値であってもよい。

そして、制御部４００は、ステップＳ１０４で得られた近似曲面の係数にこれらを加え、新たな近似曲面を求める。フォーカスシフト量がＸＹ座標によらず一様な値であればこれを近似曲面の定数項にのみ加えればよい。また、フォーカスシフト量がＸＹ座標の２次関数で表現される値であれば、近似曲面（２次曲面）の対応する項の係数にそれぞれを加えればよい。

そして、制御部４００は、新たに得られた近似曲面の式からミラー補正量とフォーカスオフセット量を計算する。具体的には、以下のように、ミラー補正量を近似曲面の式の定数項以外の項から求め、フォーカスオフセット量を定数項から求める。

ミラー補正量は、Ｂ_１(i)ｘ^２+Ｂ_２(i)ｘｙ＋Ｂ_３(i)ｙ^２+Ｂ_４(i)ｘ＋Ｂ_５(i)ｙの１／２である。実際のミラー３０４２の反射面の変形量（実ミラー変形量）としては、第１の結像光学系３０４１の倍率ｍ_１から得られる縦倍率ｍ_１ ^２を考慮した量となる。すなわち、分割標本領域ｉ内の標本点ｊ＝１，…，ｎ_ｊでの実ミラー変形量ｚｍ_ｊは、近似２次曲面から次の式（２）ように求められる。
ｚｍ_ｊ＝{Ｂ_１(i)ｘ_ｊ ^２+Ｂ_２(i)ｘ_ｊｙ_ｊ＋Ｂ_３(i)ｙ_ｊ ^２+Ｂ_４(i)ｘ_ｊ＋Ｂ_５(i)ｙ_ｊ}・ｍ_１ ^２/２ …（２）
次に、制御部４００は、分割標本領域ｉに対するフォーカスオフセット量を求める。

フォーカスオフセット量は式（１）により求められたＢ_６（ｉ）により求められる。撮像素子３０６のみを光軸方向に移動させる場合の該撮像素子３０６のフォーカスオフセット量ｆｓ（ｉ）は、以下のように求められる。撮像面Ｂ上では、第１の結像光学系３０４１の倍率ｍ_１と第２の結像光学系３０４３の倍率ｍ_２から撮像光学系３０４全体の倍率は（ｍ_１ｍ_２）となる。被撮像面Ａ上でのフォーカス位置の変化量は、撮像面Ｂ上においては光軸と直交する方向では撮像光学系３０４の横倍率を乗じた量さとなるが、光軸と平行な方向では撮像光学系３０４の縦倍率、すなわち倍率の２乗を乗じた量となる。したがって、光軸方向には、次式（３）に示すように、Ｂ_６（ｉ）に（ｍ_１ｍ_２）^２を乗じた量が撮像素子３０６のフォーカスオフセット量ｆｓ（ｉ）となる。
ｆｓ（ｉ）＝Ｂ_６（ｉ）・（ｍ_１ｍ_２）^２ …（３）
一方、ミラー３０４２のみを光軸方向に移動させる場合の該ミラー３０４２のフォーカスオフセット量ｆｍ（ｉ）は、
ｆｍ（ｉ）＝Ｂ_６（ｉ）・ｍ_１ ^２/２ …（４）
となる。

撮像素子３０６とミラー３０４２のフォーカスオフセット量を独立して制御できるようにして撮像素子３０６とミラー３０４２の双方を光軸方向に移動させる場合は、次式（５）を満足するようにこれらのフォーカスオフセット量ｆｓ（ｉ），ｆｍ（ｉ）を決めればよい。
Ｂ_６（ｉ）＝ｆｓ（ｉ）／（ｍ_１ｍ_２）^２＋２ｆｍ（ｉ）／ｍ_１ ^２ …（５）
また、ミラー３０４２の移動に伴って、第２の結像光学系３０４３を、この第２の結像光学系３０４３の光軸に直交する方向に移動させる構成を備えてもよい。

ここで、標本の表面形状に図５（Ａ）に示すようなうねりがある場合において、分割標本領域ｉに対する近似２次曲面を求めたときの係数を図６（Ａ）に示す。係数Ｂ_６は被撮像面Ａ上でのフォーカスオフセット量（ｍｍ）を示している。

また、分割標本領域ｉに対して撮像素子３０６の撮像面Ｂでのフォーカスオフセット量ｆｓ（ｉ）とミラー３０４２の中心位置(ｘ_ｏ（ｉ），ｙ_ｏ（ｉ）)での実ミラー変形量ｚｍを求めた結果を図６（Ｂ）に示す。実際には、実ミラー変形量はミラー３０４２の中心位置に対してのみではなく、ミラー３０４２を変形させるアクチュエータまたは電極が配置されたすべての位置に対して求める。図６（Ｂ）における諸量の単位はｍｍである。

さらに、各分割標本領域において、補正残差Ｚｅｒｒｏｒの平均値Ｚｅｒｒｏｒ＿ｍｅａｎと標準偏差σとを求めた結果を図６（Ｃ）に示す。図６（Ｃ）における諸量の単位はμｍである。
各分割マップ領域内のＸＹ座標（ｘ_ｊ，ｙ_j）においての補正残差Ｚｅｒｒｏｒは、実ミラー変形量ｚｍ_ｊとフォーカスオフセット量ｆｓ（ｉ）,ｆｍ（ｉ）を用いて以下の式（６）により求められる。この補正残差は、標本（被撮像面Ａ）上の量に換算されている。
Ｚｅｒｒｏｒ＝({ｚ_ｊ−［２（ｚｍ_ｊ＋ｆｍ（ｉ））／ｍ_１ ^２＋ｆｓ（ｉ）／（ｍ_１ｍ_２）^２]}^２)^１／２ …（６）
なお、図６（Ｃ）に示す結果を求める際の第１および第２の結像光学系３０４１，３０４３の倍率はそれぞれ、ｍ_１＝５，ｍ_２＝２とした。また、撮像光学系３０４のＮＡ（開口数）を０．７とし、焦点深度を約±０．５μｍとした。

補正残差の平均値や標準偏差σの３σの値は非常に小さい量となっており、焦点深度内に抑えられている。

本実施例によれば、標本の表面形状（うねり形状）を近似した近似曲面に基づいて可変形状ミラー３０４２の反射面を変形させることにより、標本の表面上の全点が撮像光学系３０４の焦点深度内に入った状態で撮像を行うことができる。

次に、本発明の実施例２として、標本の表面形状を近似する近似面としての平面を用いる場合について説明する。実施例１で説明した式（１）において、Ｂ１＝Ｂ２＝Ｂ３＝０とすれば、平面で近似したことになる。

平面で近似した場合、実ミラー変形量ｚｍ_ｊは、式（２）により平面の傾きを調整する量となる。ミラー３０４２上での傾きは標本の傾きに（第１の結像光学系３０４１の縦倍率）／（横倍率）を乗じた量となるから、（ｍ_１）^２／ｍ_１＝ｍ_１倍となる。ミラー３０４２の実際の傾き量はその１／２になる。フォーカスオフセット量は、実施例１で説明した式（３）〜（５）を用いて求められる。

実施例１と同様な条件のもと、標本の表面形状に図５（Ａ）に示すうねりがある場合において、分割標本領域ｉに対して近似平面を求め、該近似平面の係数を求めた結果を図７（Ａ）に示す。傾きが小さいので、係数Ｂ_４，Ｂ_５はそれぞれ、Ｘ軸方向での傾き（ｒａｄ)とＹ軸方向での傾き（ｒａｄ)と考えてよい。係数Ｂ_６は、被撮像面Ａ上でのフォーカスオフセット量ｆ（ｍｍ）を示している。

分割標本領域ｉに対して撮像素子３０６の撮像面Ｂでのフォーカスオフセット量ｆｓ（ｉ）とミラー３０４２の中心位置(ｘ_ｏ（ｉ），ｙ_ｏ（ｉ）)での実ミラー変形量ｚｍを求めた結果を図７（Ｂ）に示す。実際には、実ミラー変形量はミラー３０４２の中心位置に対してのみではなく、ミラー３０４２を変形させるアクチュエータまたは電極が配置されたすべての位置に対して求める。図７（Ｂ）における諸量の単位はｍｍである。

さらに、補正残差Ｚｅｒｒｏｒの平均値Ｚｅｒｒｏｒ＿ｍｅａｎと標準偏差σとを求めた結果を図７（Ｃ）に示す。図７（Ｃ）における諸量の単位はμｍである。

なお、図７（Ｃ）に示す結果を求める際の第１および第２の結像光学系３０４１，３０４３の倍率はそれぞれ、ｍ_１＝５，ｍ_２＝２とし、撮像光学系３０４のＮＡ（開口数）を０．７とし、焦点深度を約±０．５μｍとした。

図７（Ｃ）に示した補正残差の平均値や標準偏差σの３σの値は、実施例１（図６（Ｃ））に示した２次曲面で近似を行った場合より大きな値となっているが、標本の表面上の全点が撮像光学系３０４の焦点深度内におおむね入っている。標本の表面のうねりが大きくない場合には、本実施例のように平面近似で十分な場合が多い。

以上説明した各実施例は代表的な例にすぎず、本発明の実施に際しては、各実施例に対して種々の変形や変更が可能である。

３０４ 撮像光学系
３０４２ 可変形状ミラー
Ｃ 中間結像面

Claims (8)

1. 被写体をその表面側から撮像する撮像装置であって、
   撮像光学系と、
   該撮像光学系の中間結像領域に配置された可変形状ミラーと、
   前記被写体を複数の被写体領域に分割し、前記被写体の表面形状を示す形状データを用いて各被写体領域の前記表面形状を近似する近似面を求め、前記可変形状ミラーを前記近似面に対応する形状に変形させて撮像を行う制御手段とを有することを特徴とする撮像装置。
2. 前記近似面は２次曲面であることを特徴とする請求項１に記載の撮像装置。
3. 前記近似面は平面であることを特徴とする請求項１に記載の撮像装置。
4. 前記撮像光学系の最終結像面に撮像素子が配置され、
   前記制御手段は、前記撮像素子を前記撮像光学系の光軸方向に移動させてフォーカスオフセットを補正することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の撮像装置。
5. 前記制御手段は、前記可変形状ミラーを、前記撮像光学系の光軸方向に移動させてフォーカスオフセットを補正することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の撮像装置。
6. 前記制御手段は、前記撮像光学系のうち前記可変形状ミラーよりも撮像面の側に配置された第２の光学系部分を前記撮像光学系の光軸に直交する方向に移動させてフォーカスオフセットを補正することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の撮像装置。
7. 前記撮像光学系のうち前記可変形状ミラーよりも前記被写体の側に配置された第１の光学系部分の視野のうち非撮像領域において前記被写体のフォーカス位置の計測を行うフォーカス計測手段を有することを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の撮像装置。
8. 被写体をその表面側から撮像光学系を通して撮像する撮像方法であって、
   前記被写体の表面形状を示す形状データを用意し、
   前記被写体を複数の被写体領域に分割し、前記形状データを用いて各被写体領域の前記表面形状を近似する近似面を求め、
   前記撮像光学系の中間結像領域に配置した可変形状ミラーを前記近似面に対応する形状に変形させて撮像を行うことを特徴とする撮像方法。