JP2015203654A - Biomolecule count measurement device and biomolecule count measurement method - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a biomolecule count measurement device and biomolecule count measurement method capable of measuring a count of biomolecules in sample solution accurately.SOLUTION: A biomolecule count measurement device is provided that has a light irradiation unit for irradiating a biomolecule as a measuring object with excitation light, a first detector and a second detector for detecting a single photon emitted from a single biomolecule irradiated with the excitation light, and a detection unit that includes a half mirror that makes the light emitted from the biomolecule irradiated with the excitation light branch and enter one or both of the first detector or the second detector.

Description

本技術は、分子数測定装置及び分子数測定方法に関する。より詳しくは、試料溶液に含まれる生体分子の数を光学的に測定する技術に関する。   The present technology relates to a molecular number measuring apparatus and a molecular number measuring method. More specifically, the present invention relates to a technique for optically measuring the number of biomolecules contained in a sample solution.

試料溶液に含まれる生体分子の濃度を測定する方法としては、例えば、基板にマトリクス状に微細な孔を形成し、その孔で測定対象の生体分子を捕獲して検出する方法がある（特許文献１参照）。また、本発明者は、ラマン分光法を用いて、血液中の成分の濃度を測定する方法を提案している（特許文献２参照）。   As a method for measuring the concentration of a biomolecule contained in a sample solution, for example, there is a method in which fine holes are formed in a matrix on a substrate, and the biomolecule to be measured is captured and detected through the holes (Patent Document). 1). The inventor has also proposed a method for measuring the concentration of a component in blood using Raman spectroscopy (see Patent Document 2).

特表２０１３−５２１５００号公報Special table 2013-521500 gazette 特開２０１４−１８５９９号公報JP 2014-18599 A

しかしながら、特許文献１に記載の方法は、基板に微細な孔を形成する加工が必要であり、また、孔の数で感度が決まるため、例えば希薄溶液を測定する場合は、非常に多くの孔を形成する必要があるという問題がある。また、試料溶液の測定単位空間（２次元も含む）に存在する生体分子の数は、下記数式１で示されるポアソン分布に従うため、試料溶液の平均濃度が高くなると、測定単位空間に２つ以上の生体分子が存在する確率が大きくなる。なお、下記数式１におけるλは測定単位空間平均分子数であり、ｎは測定分子数である。   However, the method described in Patent Document 1 requires processing to form fine holes in the substrate, and the sensitivity is determined by the number of holes. For example, when measuring a dilute solution, a very large number of holes are required. There is a problem that it is necessary to form. In addition, since the number of biomolecules existing in the measurement unit space (including two dimensions) of the sample solution follows the Poisson distribution represented by the following formula 1, when the average concentration of the sample solution increases, two or more in the measurement unit space The probability that a biomolecule exists is increased. In Equation 1 below, λ is the number of measurement unit space average molecules, and n is the number of measured molecules.

一方、従来の測定方法では、測定単位空間に存在する分子は、０個か１個と仮定しているため、特許文献１に記載されているような従来の生体分子濃度測定方法は、試料溶液が高濃度の場合は、測定誤差が大きくなるという問題もある。   On the other hand, in the conventional measurement method, it is assumed that the number of molecules existing in the measurement unit space is 0 or 1. Therefore, the conventional biomolecule concentration measurement method described in Patent Document 1 is a sample solution. In the case of a high concentration, there is a problem that a measurement error becomes large.

そこで、本開示は、試料溶液に含まれる生体分子の数を精度よく計測することが可能な分子数測定装置及び分子数測定方法を提供することを主目的とする。   Therefore, the main object of the present disclosure is to provide a molecular number measurement apparatus and a molecular number measurement method that can accurately measure the number of biomolecules contained in a sample solution.

本開示に係る分子数測定装置は、測定対象の生体分子に励起光を照射する光照射部と、前記励起光が照射された単一生体分子から発せられた単一光子を検出する第１検出器及び第２検出器、並びに前記励起光が照射された生体分子から発せられた光を分岐させて、前記第１検出器若しくは前記第２検出器又はその両方に入射させるハーフミラーを備える検出部と、を有する。
本開示の分子数測定装置は、前記第１検出器と前記第２検出器とは、前記ハーフミラーからの光路長が同じになる位置に配置されており、前記第１検出器から出力された検出信号と、前記第２検出器から出力された検出信号とを比較することにより、前記ハーフミラーに入射した光が単一光子か否かを判定する判定部を有していてもよい。
その場合、前記判定部は、例えば、前記第１検出器が光子を検出したときに前記第２検出器も光子を検出していた場合は、前記ハーフミラーに入射した光は複数の生体分子から発せられた複数個の光子を含むと判定し、前記第１検出器及び前記第２検出器のいずれか一方のみが光子を検出していた場合は、前記ハーフミラーに入射した光が、前記単一生体分子から発せられた単一光子であると判定する。
また、前記光照射部は、単一測定点に対して励起光を複数回照射し、前記判定部は、複数回の励起に伴う複数の検出結果に基づいて、単一光子であるか否かを判定することもできる。
本開示の分子数測定装置は、前記光照射部は二次元に走査しながら前記励起光を照射し、前記判定部における判定結果に基づいて単位体積あたりの生体分子数を算出する解析部をしていてもよい。
また、前記光照射部は、前記励起光をパルス照射してもよい。
その場合、前記励起光のパルス幅を、測定対象の生体分子の励起緩和過程の緩和時間以下とすることができる。 The molecular number measurement apparatus according to the present disclosure includes a light irradiation unit that irradiates a biomolecule to be measured with excitation light, and a first detection that detects a single photon emitted from the single biomolecule irradiated with the excitation light. Detector and second detector, and a detector having a half mirror that diverges light emitted from the biomolecule irradiated with the excitation light and makes it incident on the first detector or the second detector or both And having.
In the molecular number measurement apparatus of the present disclosure, the first detector and the second detector are arranged at positions where the optical path lengths from the half mirror are the same, and are output from the first detector. You may have the determination part which determines whether the light which injected into the said half mirror is a single photon by comparing a detection signal and the detection signal output from the said 2nd detector.
In that case, for example, when the first detector detects photons when the first detector detects photons, the light incident on the half mirror is derived from a plurality of biomolecules. When it is determined that a plurality of emitted photons are included and only one of the first detector and the second detector detects a photon, the light incident on the half mirror is A single photon emitted from one biomolecule is determined.
In addition, the light irradiation unit irradiates a single measurement point with excitation light a plurality of times, and the determination unit determines whether or not it is a single photon based on a plurality of detection results associated with a plurality of excitations. Can also be determined.
The molecular number measurement apparatus according to the present disclosure includes an analysis unit that irradiates the excitation light while the light irradiation unit scans two-dimensionally and calculates the number of biomolecules per unit volume based on a determination result in the determination unit. It may be.
Further, the light irradiation unit may perform pulse irradiation of the excitation light.
In that case, the pulse width of the excitation light can be made equal to or less than the relaxation time of the excitation relaxation process of the biomolecule to be measured.

本開示に係る分子数測定方法は、測定対象の生体分子に励起光を照射する光照射工程と、前記励起光が照射された生体分子から発せられた光をハーフミラーにより分岐し、単一光子を検出可能な第１検出器及び第２検出器のいずれか一方又は両方に入射させる検出工程と、を有する。   The number-of-molecules measurement method according to the present disclosure includes a light irradiation step of irradiating a biomolecule to be measured with excitation light, a light emitted from the biomolecule irradiated with the excitation light by a half mirror, and a single photon And a detection step of making the light incident on one or both of the first detector and the second detector capable of detecting the first detector.

本開示によれば、試料溶液に含まれる生体分子の数を精度よく計測することができる。なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載されたいずれかの効果であってもよい。   According to the present disclosure, the number of biomolecules contained in the sample solution can be accurately measured. Note that the effects described here are not necessarily limited, and may be any of the effects described in the present disclosure.

本開示の第１の実施形態の分子数測定装置の構成例を示す図である。It is a figure showing an example of composition of a molecule number measuring device of a 1st embodiment of this indication. 図１に示す検出部２０の構成を示す拡大図である。It is an enlarged view which shows the structure of the detection part 20 shown in FIG. 検出部２０での検出結果を示す図である。It is a figure which shows the detection result in the detection part. 試料溶液の濃度と、複数分子を検出する確率との関係を示す図である。It is a figure which shows the relationship between the density | concentration of a sample solution, and the probability of detecting multiple molecules. 本開示の第２の実施形態の分子数測定装置の構成例を示す図である。It is a figure which shows the structural example of the molecular number measuring apparatus of 2nd Embodiment of this indication.

以下、本開示を実施するための形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本開示は、以下に示す各実施形態に限定されるものではない。また、説明は、以下の順序で行う。

１．第１の実施の形態
（基板裏面側から励起光を照射する分子数測定装置の例）
２．第２の実施の形態
（基板表面側から励起光を照射する分子数測定装置の例）
Hereinafter, modes for carrying out the present disclosure will be described in detail with reference to the accompanying drawings. In addition, this indication is not limited to each embodiment shown below. The description will be given in the following order.

1. First Embodiment (Example of a molecular number measuring apparatus that irradiates excitation light from the back side of a substrate)
2. Second Embodiment (Example of a molecular number measuring apparatus that irradiates excitation light from the substrate surface side)

（１．第１の実施の形態）
先ず、本開示の第１の実施形態に係る分子数測定装置について説明する。 (1. First embodiment)
First, the molecular number measurement apparatus according to the first embodiment of the present disclosure will be described.

従来、測定像の輝点を数える濃度測定方法では、単一の輝点が単一分子に起因するものとは限らなかった。そこで、本実施形態の分子数測定装置では、単一の輝点が単一分子に起因するものであることを補償する。単一の発光中心を有する蛍光分子や励起子発光する量子ドットは、１回の励起緩和過程で単一の光子を放出することが知られている。以下、この現象を「単一光子発光」という。そこで、本実施形態では、このような単一の蛍光分子や量子ドットで標識された単一の分子が、単一光子発光していることを確認することで、測定像の単一の輝点に単一の分子が存在することを補償する。   Conventionally, in a concentration measurement method for counting the bright spots of a measurement image, a single bright spot is not always caused by a single molecule. Therefore, in the molecular number measurement apparatus of this embodiment, it is compensated that a single bright spot is caused by a single molecule. It is known that fluorescent molecules having a single emission center and quantum dots emitting excitons emit a single photon in one excitation relaxation process. Hereinafter, this phenomenon is referred to as “single photon emission”. Therefore, in this embodiment, by confirming that such a single fluorescent molecule or a single molecule labeled with a quantum dot emits a single photon, a single bright spot of the measurement image is obtained. To compensate for the presence of a single molecule.

図１は本実施形態の分子数測定装置の構成例を示す図であり、図２はその検出部２０の構成を示す拡大図である。本実施形態の分子数測定装置１は、測定対象の生体分子に励起光を照射する光照射部１０と、励起光が照射された単一生体分子から発せられた単一光子を検出する検出部２０とを備える。また、本実施形態の分子数測定装置１には、必要に応じて、判定部３０、解析部４０及びフォーカス調整部５０などが設けられる。   FIG. 1 is a diagram illustrating a configuration example of a molecular number measurement apparatus according to the present embodiment, and FIG. 2 is an enlarged view illustrating a configuration of the detection unit 20. The molecular number measurement apparatus 1 of the present embodiment includes a light irradiation unit 10 that irradiates a biomolecule to be measured with excitation light, and a detection unit that detects a single photon emitted from a single biomolecule irradiated with the excitation light. 20. In addition, the molecular number measurement apparatus 1 of the present embodiment is provided with a determination unit 30, an analysis unit 40, a focus adjustment unit 50, and the like as necessary.

［光照射部１０］
光照射部１０は、例えば基板２などに保持された生体分子を含む試料溶液に、励起光３を照射するものである。そして、この光照射部１０は、例えば、光源１１、アイソレータ１２、アナモルフィックプリズム１３、光増幅器１４、音響光学変調素子１５、ミラー１６などを備えている。 [Light irradiation unit 10]
The light irradiation unit 10 irradiates, for example, the excitation light 3 onto a sample solution containing a biomolecule held on the substrate 2 or the like. And this light irradiation part 10 is provided with the light source 11, the isolator 12, the anamorphic prism 13, the optical amplifier 14, the acousto-optic modulation element 15, the mirror 16, etc., for example.

（光源１１）
光源１１は、励起光３の波長に応じて適宜選択することができるが、例えばモードロック半導体レーザ、モードロックチタンサファイアレーザ、自励発振半導体レーザ、パルス駆動の半導体レーザ、Ｑスイッチレーザなどを使用することができる。単一光子発光を得るため、光源１１から出射される励起光３は、パルス光であることが好ましい。その際、励起光３のパルス幅が、測定対象の生体分子の励起緩和過程の緩和時間以下とすることが好ましい。これにより、精度よく単一光子発光を得ることができる。 (Light source 11)
The light source 11 can be appropriately selected according to the wavelength of the excitation light 3. For example, a mode-locked semiconductor laser, a mode-locked titanium sapphire laser, a self-excited oscillation semiconductor laser, a pulse-driven semiconductor laser, a Q-switch laser, or the like is used. can do. In order to obtain single photon emission, the excitation light 3 emitted from the light source 11 is preferably pulsed light. In that case, it is preferable that the pulse width of the excitation light 3 is equal to or less than the relaxation time of the excitation relaxation process of the biomolecule to be measured. Thereby, single photon emission can be obtained with high accuracy.

（アイソレータ１２）
アイソレータ１２は、各光学部品の表面で生じた反射光が、光源１１を構成するレーザに戻ることを防止するものである。このような戻り光がレーザに入射すると、レーザ発振が不安定になり、出力変動が起こるが、戻り光の進行方向において光源１１の直前に、アイソレータ１２を配置することにより、レーザの発振を安定化することができる。 (Isolator 12)
The isolator 12 prevents reflected light generated on the surface of each optical component from returning to the laser constituting the light source 11. When such return light is incident on the laser, laser oscillation becomes unstable and output fluctuation occurs. However, by placing an isolator 12 immediately in front of the light source 11 in the traveling direction of the return light, the laser oscillation is stabilized. Can be

（アナモルフィックプリズム１３）
アナモルフィックプリズム１３は、楕円形のビームを成形し、円形状にするものである。 (Anamorphic prism 13)
The anamorphic prism 13 forms an elliptical beam into a circular shape.

（光増幅器１４）
光増幅器１４は、入射したレーザの強弱に応じて、波長をほとんど変えずに入射光を増幅して出力するものである。 (Optical amplifier 14)
The optical amplifier 14 amplifies and outputs incident light with almost no change in wavelength according to the strength of the incident laser.

（音響光学変調素子１５）
音響光学変調素子１５は、超音波による光の一次屈折光を利用した光変調素子である。 (Acousto-optic modulation element 15)
The acousto-optic modulation element 15 is a light modulation element that uses primary refracted light from ultrasonic waves.

（ミラー１６）
ミラー１６は、励起光３を基板２などに保持された生体分子を含む試料溶液に向けて反射するものである。 (Mirror 16)
The mirror 16 reflects the excitation light 3 toward a sample solution containing biomolecules held on the substrate 2 or the like.

［検出部２０］
検出部２０は、励起光が照射された単一生体分子から発せられた単一光子を検出するものであり、単一光子を検出する２つの検出器（第１検出器２１ａ、第２検出器２１ｂ）と、ハーフミラー２２とを備えている。また、検出部２０には、必要に応じて、対物レンズ２３、ダイクロックミラー２４、バンドパスフィルター２５、レンズ２６ａ，２６ｂ、ピンホール２７などの各種光学部品が設けられていてもよい。 [Detection unit 20]
The detection unit 20 detects a single photon emitted from a single biomolecule irradiated with excitation light, and includes two detectors (a first detector 21a and a second detector) that detect the single photon. 21b) and a half mirror 22. In addition, the detection unit 20 may be provided with various optical components such as an objective lens 23, a dichroic mirror 24, a band pass filter 25, lenses 26a and 26b, and a pinhole 27 as necessary.

（検出器２１ａ,２１ｂ）
第１検出器２１ａと第２検出器２１ｂは、励起光３が照射された単一生体分子から発せられた単一光子を検出可能なものであればよく、例えばハーフミラー２２からの光路長が同じになる位置に配置される。なお、第１検出器２１ａ及び第２検出器２１ｂとして、アバランシェ増幅を行う検出器を使用する場合は、増幅されたキャリアが十分に消滅した後、次の光子を検出するようにタイミングを設定する。 (Detectors 21a and 21b)
The first detector 21a and the second detector 21b only need to be able to detect a single photon emitted from a single biomolecule irradiated with the excitation light 3. For example, the optical path length from the half mirror 22 is long. Arranged at the same position. When a detector that performs avalanche amplification is used as the first detector 21a and the second detector 21b, the timing is set so that the next photon is detected after the amplified carrier has sufficiently disappeared. .

（ハーフミラー２２）
ハーフミラー２２は、励起光３が照射された生体分子から発せられた光を分岐させて、第１検出器２１ａ若しくは第２検出器２１ｂ又はその両方に入射させるものであり、透過率と反射率がそれぞれ５０％となっている。 (Half mirror 22)
The half mirror 22 divides the light emitted from the biomolecule irradiated with the excitation light 3 and makes it incident on the first detector 21a and / or the second detector 21b, and the transmittance and reflectance. Are 50% each.

（対物レンズ２３）
対物レンズ２３は、生体分子から発せられた光などを集光するものである。また、対物レンズ２３には、油浸レンズや水浸レンズを使用することもできる。 (Objective lens 23)
The objective lens 23 collects light emitted from biomolecules. The objective lens 23 can be an oil immersion lens or a water immersion lens.

（ダイクロックミラー２４）
ダイクロックミラー２４は、波長特定の波長の光を反射し、その他の波長の光を透過するものであり、本実施形態の分子数測定装置１の場合、生体分子から発せられた光を反射し、その他の光を透過するものを使用する。即ち、本実施形態の分子数測定装置１においては、ダイクロックミラー２４により、励起光３と、生体分子から発せられた蛍光と、後述するフォーカス調整部５０において使用するフォーカスサーボ光（近赤外光４）とを分離する。 (Dylock mirror 24)
The dichroic mirror 24 reflects light of a specific wavelength and transmits light of other wavelengths. In the case of the molecular number measuring apparatus 1 of the present embodiment, the dichroic mirror 24 reflects light emitted from a biomolecule. Use other materials that transmit light. That is, in the molecular number measurement apparatus 1 of the present embodiment, the dichroic mirror 24 causes the excitation light 3, the fluorescence emitted from the biomolecule, and the focus servo light (near infrared) used in the focus adjustment unit 50 described later. Separated from light 4).

（バンドパスフィルター２５）
バンドパスフィルター２５は、特定波長の光のみを透過するフィルターであり、本実施形態の分子数測定装置１の場合、生体分子から発せられた蛍光を透過し、その他の光を減衰させるものを使用する。即ち、本実施形態の分子数測定装置１においては、バンドパスフィルター２５により、励起光３及びフォーカスサーボ光（近赤外光４）を除去し、生体分子から発せられた蛍光のみを抽出する。 (Band pass filter 25)
The band pass filter 25 is a filter that transmits only light of a specific wavelength, and in the case of the molecular number measuring apparatus 1 of the present embodiment, a filter that transmits fluorescence emitted from a biomolecule and attenuates other light is used. To do. That is, in the molecular number measurement apparatus 1 of this embodiment, the excitation light 3 and the focus servo light (near infrared light 4) are removed by the bandpass filter 25, and only the fluorescence emitted from the biomolecule is extracted.

（レンズ２６ａ，２６ｂ）
レンズ２６ａ，２６ｂは、試料の共役像を形成し、その後方でビームを平行にするものである。 (Lens 26a, 26b)
The lenses 26a and 26b form a conjugate image of the sample and collimate the beam behind it.

（ピンホール２７）
ピンホール２７は、入射した光を空間的にフィルタリングするものであり、迷光を除去してＳ／Ｎ比（信号雑音比）を向上させるために配置している。 (Pinhole 27)
The pinhole 27 spatially filters incident light, and is arranged to remove stray light and improve the S / N ratio (signal noise ratio).

［判定部３０］
判定部３０は、第１検出器２１ａから出力された検出信号と、第２検出器２１ｂから出力された検出信号とを比較することにより、ハーフミラー２２に入射した光が単一光子か否かを判定する。例えば、第１検出２１ａが光子を検出したときに第２検出器２１ｂも光子を検出していた場合は、ハーフミラー２２に入射した光は複数の生体分子から発せられた複数個の光子を含むと判定する。一方、第１検出器２１ａ及び第２検出器２１ｂのいずれか一方のみが光子を検出していた場合は、ハーフミラー２２に入射した光が、単一生体分子から発せられた単一光子であると判定する。 [Determining unit 30]
The determination unit 30 compares the detection signal output from the first detector 21a with the detection signal output from the second detector 21b to determine whether the light incident on the half mirror 22 is a single photon. Determine. For example, when the second detector 21b also detects a photon when the first detection 21a detects a photon, the light incident on the half mirror 22 includes a plurality of photons emitted from a plurality of biomolecules. Is determined. On the other hand, when only one of the first detector 21a and the second detector 21b detects a photon, the light incident on the half mirror 22 is a single photon emitted from a single biomolecule. Is determined.

また、単一光子であるか否かの判定は、光照射部１０により単一測定点に対して励起光３を複数回照射し、複数回の励起に伴う複数の検出結果に基づいて行うことが好ましい。これにより、検出精度を更に向上させることができる。   In addition, whether or not the photon is a single photon is determined based on a plurality of detection results associated with a plurality of excitations by irradiating the single measurement point with the excitation light 3 a plurality of times by the light irradiation unit 10. Is preferred. Thereby, detection accuracy can be further improved.

［解析部４０］
本実施形態の分子数測定装置は、光照射部１０により励起光３を二次元に走査しながら照射し、解析部４０により、判定部３０における判定結果に基づいて単位体積あたりの生体分子数（生体分子濃度）を算出することもできる。 [Analysis unit 40]
In the molecular number measurement apparatus of this embodiment, the light irradiation unit 10 irradiates the excitation light 3 while scanning in two dimensions, and the analysis unit 40 determines the number of biomolecules per unit volume based on the determination result in the determination unit 30 ( Biomolecule concentration) can also be calculated.

［フォーカス調整部５０］
本実施形態の分子数測定装置は、更に、対物レンズ２３に対する基板２の位置を調整するフォーカス調整部５０を備えていてもよい。このフォーカス調整部５０は、例えば近赤外半導体レーザ５１、偏光ビームスプリッター５２、１／４波長板５３、レンズ５４、円筒レンズ５５、４分割ディテクタ５６などで構成することができる。また、フォーカスサーボ方式には、例えば非点収差法を用いることができる。 [Focus adjustment unit 50]
The molecular number measurement apparatus of this embodiment may further include a focus adjustment unit 50 that adjusts the position of the substrate 2 with respect to the objective lens 23. The focus adjustment unit 50 can be constituted by, for example, a near-infrared semiconductor laser 51, a polarization beam splitter 52, a quarter wavelength plate 53, a lens 54, a cylindrical lens 55, a quadrant detector 56, and the like. As the focus servo system, for example, an astigmatism method can be used.

［分子数測定方法］
次に、本実施形態の分子数測定装置１を用いて、生体分子の数を測定する方法について、生体分子が心筋炎症マーカーであるトロポニンを蛍光標識したものである場合を例にして説明する。本実施形態の分子数測定方法では、測定対象の生体分子に励起光３を照射する光照射工程と、励起光３が照射された生体分子から発せられた光をハーフミラー２２により分岐し、第１検出器２１ａ及び第２検出器２１ｂのいずれか一方又は両方に入射させる検出工程とを行う。 [Method for measuring the number of molecules]
Next, a method for measuring the number of biomolecules using the molecular number measurement apparatus 1 of the present embodiment will be described taking as an example the case where the biomolecule is a fluorescently labeled troponin that is a myocardial inflammation marker. In the method for measuring the number of molecules according to the present embodiment, the light irradiation step of irradiating the biomolecule to be measured with the excitation light 3, the light emitted from the biomolecule irradiated with the excitation light 3 is branched by the half mirror 22, A detection step of entering one or both of the first detector 21a and the second detector 21b is performed.

光照射工程では、例えば、測定対象の生体分子を基板２上に分散し、この分散されている面を基板２の表面としたとき、基板２の裏面から全反射条件で励起光３を照射する。ここで、励起光３としては、例えば、Applied Physics Express 5 (2012) 022702に記載されている方法で生成される波長４０５ｎｍ、パルスエネルギー５００ｐＪ、パルス幅２ｐｓ、繰り返し周波数１ＧＨｚのパルスレーザを用いることができる。そして、この励起光３を、音響光学変調素子１５を用いて１０ＭＨｚに周波数を下げた後、基板２の裏面に照射する。   In the light irradiation step, for example, when the biomolecule to be measured is dispersed on the substrate 2 and this dispersed surface is the surface of the substrate 2, the excitation light 3 is irradiated from the back surface of the substrate 2 under total reflection conditions. . Here, as the excitation light 3, for example, a pulse laser having a wavelength of 405 nm, a pulse energy of 500 pJ, a pulse width of 2 ps, and a repetition frequency of 1 GHz generated by the method described in Applied Physics Express 5 (2012) 022702 is used. it can. Then, the excitation light 3 is irradiated on the back surface of the substrate 2 after the frequency is lowered to 10 MHz using the acoustooptic modulator 15.

このとき、測定対象のトロポニンの励起緩和時間は、概ね１ｎｓであるため、１パルス照射時間中に２回以上の励起緩和過程を繰り返すことはなく、１パルスに対し単一分子からの蛍光は１光子の放出に限定される。このように、励起光３をパルス光とし、更に、パルス幅を、測定対象の生体分子の励起緩和過程の緩和時間以下にすることにより、単一分子から複数の光子が放出されることを抑制できる。   At this time, since the excitation relaxation time of the troponin to be measured is approximately 1 ns, the excitation relaxation process is not repeated twice or more during one pulse irradiation time, and the fluorescence from a single molecule is 1 for one pulse. Limited to photon emission. In this way, by using the excitation light 3 as pulse light and further setting the pulse width to be equal to or less than the relaxation time of the excitation relaxation process of the biomolecule to be measured, it is possible to suppress the emission of a plurality of photons from a single molecule. it can.

一方、検出工程では、先ず、測定対象の生体分子分散面（基板２の表面）側に配置された例えば開口数（ＮＡ）０．９の対物レンズ２３で、生体分子から放出された光子を捕獲する。次に、対物レンズ２３で捕獲した光子を、例えばカットオフ波長が５１０ｎｍｍ，７００ｎｍのダイクロイックミラー２４ａ，２４ｂと、例えばピーク値が５３５ｎｍ、バンド幅５０ｎｍのバンドパスフィルター２５により励起光３を除去する。その後、結像レンズ２６ａにより、像面に対し１０倍になるように像を形成する。   On the other hand, in the detection step, first, photons emitted from the biomolecules are captured by the objective lens 23 having a numerical aperture (NA) of 0.9, for example, arranged on the biomolecule dispersion surface (surface of the substrate 2) to be measured. To do. Next, the excitation light 3 is removed from the photons captured by the objective lens 23 using, for example, dichroic mirrors 24a and 24b having cutoff wavelengths of 510 nm and 700 nm and a bandpass filter 25 having a peak value of 535 nm and a bandwidth of 50 nm, for example. Thereafter, an image is formed by the imaging lens 26a so as to be 10 times the image plane.

像の位置には、例えば開口が１０μｍ径のピンホール２７を配置し、これにより生体分子分散面で１μｍ径の範囲からの光子を捕獲するようにする。そして、再度、レンズ２６ｂにより光線を平行光とし、図２に示すHanbury Brown Twiss干渉系に導入し、第１検出器２１ａ及び第２検出器２１ｂで検出する。   For example, a pinhole 27 having an opening having a diameter of 10 μm is arranged at the position of the image so that photons from a range of 1 μm diameter can be captured on the biomolecule dispersion surface. Then, the light is again converted into parallel light by the lens 26b, introduced into the Hanbury Brown Twiss interference system shown in FIG. 2, and detected by the first detector 21a and the second detector 21b.

R. Hanbury Brown and R. Q. Twiss (1958). "Interferometry of the intensity fluctuations in light. II. An experimental test of the theory for partially coherent light". Proceedings of the Royal Society A 243 (1234): 291-319）によれば、素粒子である光子はハーフミラーでは２つに分けることはできない。本実施形態の分子数測定装置では、検出部にHanbury Brown Twissの干渉系を作製し、単一光子の強度でも十分信号が得られる光検出器を設置しているため、検出された光が単一光子か否かを精度よく判定することができる。   R. Hanbury Brown and RQ Twiss (1958). "Interferometry of the intensity fluctuations in light. II. An experimental test of the theory for partially coherent light". Proceedings of the Royal Society A 243 (1234): 291-319) According to this, photons that are elementary particles cannot be divided into two by a half mirror. In the molecular number measurement apparatus of the present embodiment, a Hanbury Brown Twiss interference system is prepared in the detection unit, and a photodetector that can obtain a sufficient signal even with the intensity of a single photon is installed. It is possible to accurately determine whether or not the photon is one photon.

ここで、対物レンズ２３に対する基板２の位置は、フォーカス調整部５０により、励起光３や生体分子から発せられる蛍光とは別に、近赤外波長のレーザ光４による非点収差法を用いてフォーカスサーボを行うことができる。その場合、対物レンズ２３は、フォーカスサーボに使用する光の波長に対して、色収差補正がなされているものを使用することが好ましい。   Here, the position of the substrate 2 with respect to the objective lens 23 is focused by the focus adjustment unit 50 using an astigmatism method using the laser light 4 of the near infrared wavelength separately from the excitation light 3 and the fluorescence emitted from the biomolecule. Servo can be performed. In this case, it is preferable to use an objective lens 23 that has been subjected to chromatic aberration correction with respect to the wavelength of light used for focus servo.

更に、本実施形態の分子数測定方法では、パルスレーザ光の繰り返しと同期させて、検出部２０の検出結果を判定部４０に入力し、自己相関を求めてもよい。図３は検出部２０での検出結果を示す図である。図３に示すように、相関時間０では自己相関はショットノイズレベルとなっている場合、単一光子発光であることが確認でき、観測中の輝点が単一分子によるものであることが確認できる。   Furthermore, in the method for measuring the number of molecules of the present embodiment, the detection result of the detection unit 20 may be input to the determination unit 40 in synchronization with the repetition of the pulsed laser beam to obtain the autocorrelation. FIG. 3 is a diagram illustrating a detection result in the detection unit 20. As shown in FIG. 3, when the autocorrelation is shot noise level at correlation time 0, it can be confirmed that the photon emission is single photon, and the bright spot under observation is due to a single molecule. it can.

このような測定を、基板２上の生体分子が分散されている領域について全て観測することで、基板２上に結合された被測定分子数を数えることができる。即ち、光照射部１０により基板２の分散領域を二次元に走査しながら前記励起光を照射し、判定部４０における判定結果に基づいて単位体積あたりの生体分子数を算出することにより、試料溶液の濃度を算出することもできる。その場合、単一光子発光と確認できなかった輝点については、例えば２分子による発光として数えることができる。   By observing all of the measurements in the region where the biomolecules on the substrate 2 are dispersed, the number of molecules to be measured bonded to the substrate 2 can be counted. That is, the sample solution is obtained by irradiating the excitation light while two-dimensionally scanning the dispersion region of the substrate 2 by the light irradiation unit 10 and calculating the number of biomolecules per unit volume based on the determination result in the determination unit 40. The concentration of can also be calculated. In that case, a bright spot that could not be confirmed as single photon emission can be counted as, for example, emission by two molecules.

以上詳述したように、本実施形態の分子数測定装置は、光照射部１０により、単一測定点に対して励起光３を複数回照射し、判定部４０において、この複数回の励起に伴う複数の検出結果に基づいて、単一光子であるか否かを判定することもできる。これにより、検出感度を向上させ、誤差を低減することができる。   As described above in detail, in the molecular number measurement apparatus of the present embodiment, the light irradiation unit 10 irradiates the single measurement point with the excitation light 3 a plurality of times, and the determination unit 40 performs the excitation for the plurality of times. It can also be determined whether or not it is a single photon based on a plurality of detection results. Thereby, detection sensitivity can be improved and an error can be reduced.

図４は試料溶液の濃度と、複数分子を検出する確率との関係を示す図である。従来の測定方法で分子数を測定した場合、図４に示す分子数０〜１の範囲で検出することになるが、本実施形態の分子数測定方法では、図４に示す分子数０〜２の範囲で検出することが可能となる。図４に示すように、平均分子数（濃度）が増加するに従い、２分子の観測確率が高くなるが、本実施形態の分子数測定方法は、従来の測定方法に比べて、高濃度側測定限界を大きくすることができるため、高濃度試料溶液における検出精度を向上させることができる。   FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the concentration of the sample solution and the probability of detecting a plurality of molecules. When the number of molecules is measured by the conventional measuring method, detection is performed in the range of the number of molecules 0 to 1 shown in FIG. 4, but in the method of measuring the number of molecules of the present embodiment, the number of molecules 0 to 2 shown in FIG. It is possible to detect within the range. As shown in FIG. 4, as the average number of molecules (concentration) increases, the observation probability of two molecules increases. However, the molecular number measurement method of this embodiment has a higher concentration side measurement than the conventional measurement method. Since the limit can be increased, the detection accuracy in a high concentration sample solution can be improved.

このように、本実施形態の分子数測定装置は、励起光が照射された単一生体分子から発せられた単一光子を検出しているため、試料溶液に含まれる生体分子の数を精度よく計測することができる。また、本実施形態の分子数測定装置は、生体分子の数や濃度を測定するにあたり、従来よりも測定限界をより高濃度側にすることが可能である。   As described above, since the molecular number measurement apparatus of the present embodiment detects single photons emitted from a single biomolecule irradiated with excitation light, the number of biomolecules contained in the sample solution is accurately determined. It can be measured. In addition, the molecular number measurement apparatus of the present embodiment can make the measurement limit higher than in the prior art when measuring the number and concentration of biomolecules.

（２．第２の実施の形態）
次に、本開示の第２の実施形態に係る分子数測定装置について説明する。図５は本開示の第２の実施形態の分子数測定装置の構成例を示す図である。なお、図５においては、図１に示す第１の実施形態の分子数測定装置の構成要素と同じものには同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。 (2. Second Embodiment)
Next, a molecular number measurement apparatus according to the second embodiment of the present disclosure will be described. FIG. 5 is a diagram illustrating a configuration example of a molecular number measurement apparatus according to the second embodiment of the present disclosure. In FIG. 5, the same components as those of the molecular number measuring apparatus according to the first embodiment shown in FIG. 1 are denoted by the same reference numerals, and detailed description thereof is omitted.

［装置構成］
図５に示すように、本実施形態の分子数測定装置１００では、基板２０の表面側から励起光３を照射する構成となっている以外は、前述した第１の実施形態の分子数測定装置と同様である。このように、励起光３を基板２０の表面側から照射する構成とすると、光学系を簡素化することができるため、装置をよりコンパクトにすることができる。 [Device configuration]
As shown in FIG. 5, the molecular number measurement apparatus 100 according to the present embodiment is configured to irradiate the excitation light 3 from the surface side of the substrate 20, except for the molecular number measurement apparatus according to the first embodiment described above. It is the same. Thus, when it is set as the structure which irradiates the excitation light 3 from the surface side of the board | substrate 20, since an optical system can be simplified, an apparatus can be made more compact.

［分子数測定方法］
次に、本実施形態の分子数測定装置１００を用いて、生体分子の数を測定する方法について、生体分子が癌マーカー分子である場合を例にして説明する。本実施形態の分子数測定装置１００では、光源１１に例えばパルスレーザを用い、偏光は紙面に平行な方向の直線偏光とすることができる。 [Method for measuring the number of molecules]
Next, a method for measuring the number of biomolecules using the molecular number measurement apparatus 100 of the present embodiment will be described by taking the case where the biomolecule is a cancer marker molecule as an example. In the molecular number measurement apparatus 100 of the present embodiment, for example, a pulse laser is used as the light source 11, and the polarization can be linearly polarized in a direction parallel to the paper surface.

光源１１から出射された励起光３は対物レンズ２３の手前に配置されたダイクロイックミラー２４を透過し、対物レンズ２３の焦点位置に焦点を結ぶ。即ち、分子数測定装置１００では、光照射装置１０の光学系が、第１検出器２１ａ及び第２検出器２１ｂの位置と共焦点の関係になる配置となっている。そして、偏光ビームスプリッター５２を透過した励起光３は、１／４波長板５３によって、測定対象の生体試料がある位置では円偏光にされ、戻り光路の偏光ビームスプリッター５２の位置では紙面に垂直方向の偏光とされる。   The excitation light 3 emitted from the light source 11 passes through the dichroic mirror 24 arranged in front of the objective lens 23 and focuses on the focal position of the objective lens 23. That is, in the molecular number measurement apparatus 100, the optical system of the light irradiation apparatus 10 is arranged in a confocal relationship with the positions of the first detector 21a and the second detector 21b. The excitation light 3 transmitted through the polarizing beam splitter 52 is circularly polarized by the quarter wavelength plate 53 at a position where the biological sample to be measured is present, and is perpendicular to the paper surface at the position of the polarizing beam splitter 52 in the return optical path. The polarized light.

これにより、光源１１への戻り光を減少することができると共に、偏光ビームスプリッター５２で反射する戻り光をフォーカスサーボに利用することができる。そして、第１の実施形態と同様の方法でフォーカスサーボを行い、基板２０と対物レンズ２３の距離を一定に保ちながら、ダイクロイックミラー２４及びバンドパスフィルター２５を用い、生体分子から放出された光子をHanbury Brown Twiss干渉系に導き、第１検出器２１ａ及び第２検出器２１ｂで検出する。また、判定部４０により、２つの検出器２１ａ，２１ｂからの信号の自己相関を比較し、ハーフミラー２２に入射した光が単一光子か否かを判定する。   Thereby, the return light to the light source 11 can be reduced, and the return light reflected by the polarization beam splitter 52 can be used for the focus servo. Then, focus servo is performed in the same manner as in the first embodiment, and the photons emitted from the biomolecules are detected using the dichroic mirror 24 and the bandpass filter 25 while keeping the distance between the substrate 20 and the objective lens 23 constant. It is guided to the Hanbury Brown Twiss interference system and detected by the first detector 21a and the second detector 21b. Further, the determination unit 40 compares the autocorrelation of the signals from the two detectors 21a and 21b, and determines whether or not the light incident on the half mirror 22 is a single photon.

本実施形態の分子数測定装置も、励起光が照射された単一生体分子から発せられた単一光子を検出しているため、試料溶液に含まれる生体分子の数を精度よく計測することができる。   Since the molecular number measurement apparatus of the present embodiment also detects single photons emitted from a single biomolecule irradiated with excitation light, it can accurately measure the number of biomolecules contained in the sample solution. it can.

また、本開示は、以下のような構成をとることもできる。
（１）
測定対象の生体分子に励起光を照射する光照射部と、
前記励起光が照射された単一生体分子から発せられた単一光子を検出する第１検出器及び第２検出器、並びに前記励起光が照射された生体分子から発せられた光を分岐させて、前記第１検出器若しくは前記第２検出器又はその両方に入射させるハーフミラーを備える検出部と、
を有する分子数測定装置。
（２）
前記第１検出器と前記第２検出器とは、前記ハーフミラーからの光路長が同じになる位置に配置されており、
前記第１検出器から出力された検出信号と、前記第２検出器から出力された検出信号とを比較することにより、前記ハーフミラーに入射した光が単一光子か否かを判定する判定部を有する（１）に記載の分子数測定装置。
（３）
前記判定部は、前記第１検出器が光子を検出したときに前記第２検出器も光子を検出していた場合は、前記ハーフミラーに入射した光は複数の生体分子から発せられた複数個の光子を含むと判定し、前記第１検出器及び前記第２検出器のいずれか一方のみが光子を検出していた場合は、前記ハーフミラーに入射した光が、前記単一生体分子から発せられた単一光子であると判定する（２）に記載の分子数測定装置。
（４）
前記光照射部は、単一測定点に対して励起光を複数回照射し、
前記判定部は、複数回の励起に伴う複数の検出結果に基づいて、単一光子であるか否かを判定する（２）又は（３）に記載の分子数測定装置。
（５）
前記光照射部は二次元に走査しながら前記励起光を照射し、
前記判定部における判定結果に基づいて単位体積あたりの生体分子数を算出する解析部を有する（２）〜（４）のいずれかに記載の分子数測定装置。
（６）
前記光照射部は、前記励起光をパルス照射する（１）〜（５）のいずれかに記載の分子数測定装置。
（７）
前記励起光のパルス幅が、測定対象の生体分子の励起緩和過程の緩和時間以下である（６）に記載の分子数測定装置。
（８）
測定対象の生体分子に励起光を照射する光照射工程と、
前記励起光が照射された生体分子から発せられた光をハーフミラーにより分岐し、単一光子を検出可能な第１検出器及び第２検出器のいずれか一方又は両方に入射させる検出工程と、
を有する分子数測定方法。 In addition, the present disclosure can take the following configurations.
(1)
A light irradiation unit for irradiating the biomolecule to be measured with excitation light;
A first detector and a second detector for detecting a single photon emitted from a single biomolecule irradiated with the excitation light, and a light emitted from the biomolecule irradiated with the excitation light; A detector comprising a half mirror that is incident on the first detector or the second detector or both;
A molecular number measuring apparatus having
(2)
The first detector and the second detector are arranged at positions where the optical path lengths from the half mirror are the same,
A determination unit that determines whether the light incident on the half mirror is a single photon by comparing the detection signal output from the first detector with the detection signal output from the second detector. The number-of-molecules measurement apparatus according to (1), comprising:
(3)
In the case where the second detector also detects photons when the first detector detects photons, the determination unit includes a plurality of light incident on the half mirror emitted from a plurality of biomolecules. If only one of the first detector and the second detector detects a photon, light incident on the half mirror is emitted from the single biomolecule. The number-of-molecules measuring apparatus according to (2), wherein the molecule number is determined to be a single photon.
(4)
The light irradiation unit irradiates excitation light multiple times to a single measurement point,
The said determination part is a molecular number measuring apparatus as described in (2) or (3) which determines whether it is a single photon based on the several detection result accompanying multiple times of excitation.
(5)
The light irradiation unit irradiates the excitation light while scanning in two dimensions,
The molecular number measurement apparatus according to any one of (2) to (4), further including an analysis unit that calculates the number of biomolecules per unit volume based on a determination result in the determination unit.
(6)
The said light irradiation part is a molecular number measuring apparatus in any one of (1)-(5) which irradiates the said excitation light with a pulse.
(7)
The number-of-molecules measuring apparatus according to (6), wherein a pulse width of the excitation light is equal to or less than a relaxation time of an excitation relaxation process of a biomolecule to be measured.
(8)
A light irradiation step of irradiating the biomolecule to be measured with excitation light;
A detection step in which light emitted from the biomolecule irradiated with the excitation light is split by a half mirror and is incident on one or both of the first detector and the second detector capable of detecting a single photon;
A method for measuring the number of molecules.

なお、本明細書に記載された効果はあくまでも例示であって限定されるものではなく、また他の効果があってもよい。   Note that the effects described in the present specification are merely examples and are not limited, and other effects may be obtained.

１、１００ 分子数測定装置
２ 基板
３ 励起光
４ 近赤外光
１０ 光照射部
２０ 検出部
３０ 判定部
４０ 解析部
５０ フォーカス調整部 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1,100 Molecular number measuring apparatus 2 Substrate 3 Excitation light 4 Near infrared light 10 Light irradiation part 20 Detection part 30 Judgment part 40 Analysis part 50 Focus adjustment part

Claims (8)

測定対象の生体分子に励起光を照射する光照射部と、
前記励起光が照射された単一生体分子から発せられた単一光子を検出する第１検出器及び第２検出器、並びに前記励起光が照射された生体分子から発せられた光を分岐させて、前記第１検出器若しくは前記第２検出器又はその両方に入射させるハーフミラーを備える検出部と、
を有する分子数測定装置。 A light irradiation unit for irradiating the biomolecule to be measured with excitation light;
A first detector and a second detector for detecting a single photon emitted from a single biomolecule irradiated with the excitation light, and a light emitted from the biomolecule irradiated with the excitation light; A detector comprising a half mirror that is incident on the first detector or the second detector or both;
A molecular number measuring apparatus having 前記第１検出器と前記第２検出器とは、前記ハーフミラーからの光路長が同じになる位置に配置されており、
前記第１検出器から出力された検出信号と、前記第２検出器から出力された検出信号とを比較することにより、前記ハーフミラーに入射した光が単一光子か否かを判定する判定部を有する請求項１に記載の分子数測定装置。 The first detector and the second detector are arranged at positions where the optical path lengths from the half mirror are the same,
A determination unit that determines whether the light incident on the half mirror is a single photon by comparing the detection signal output from the first detector and the detection signal output from the second detector. The molecular number measuring apparatus according to claim 1, comprising: 前記判定部は、前記第１検出器が光子を検出したときに前記第２検出器も光子を検出していた場合は、前記ハーフミラーに入射した光は複数の生体分子から発せられた複数個の光子を含むと判定し、前記第１検出器及び前記第２検出器のいずれか一方のみが光子を検出していた場合は、前記ハーフミラーに入射した光が、前記単一生体分子から発せられた単一光子であると判定する請求項２に記載の分子数測定装置。   In the case where the second detector also detects photons when the first detector detects photons, the determination unit includes a plurality of light incident on the half mirror emitted from a plurality of biomolecules. If only one of the first detector and the second detector detects a photon, light incident on the half mirror is emitted from the single biomolecule. The molecular number measuring apparatus according to claim 2, wherein the molecular number measuring apparatus is determined to be a single photon. 前記光照射部は、単一測定点に対して励起光を複数回照射し、
前記判定部は、複数回の励起に伴う複数の検出結果に基づいて、単一光子であるか否かを判定する請求項３に記載の分子数測定装置。 The light irradiation unit irradiates excitation light multiple times to a single measurement point,
The molecular number measuring apparatus according to claim 3, wherein the determination unit determines whether or not the photon is a single photon based on a plurality of detection results accompanying a plurality of excitations. 前記光照射部は二次元に走査しながら前記励起光を照射し、
前記判定部における判定結果に基づいて単位体積あたりの生体分子数を算出する解析部を有する請求項２に記載の分子数測定装置。 The light irradiation unit irradiates the excitation light while scanning in two dimensions,
The molecular number measurement apparatus according to claim 2, further comprising an analysis unit that calculates the number of biomolecules per unit volume based on a determination result in the determination unit. 前記光照射部は、前記励起光をパルス照射する請求項１に記載の分子数測定装置。   The molecular number measurement apparatus according to claim 1, wherein the light irradiation unit performs pulse irradiation of the excitation light. 前記励起光のパルス幅が、測定対象の生体分子の励起緩和過程の緩和時間以下である請求項６に記載の分子数測定装置。   The molecular number measurement apparatus according to claim 6, wherein a pulse width of the excitation light is equal to or less than a relaxation time of an excitation relaxation process of a biomolecule to be measured. 測定対象の生体分子に励起光を照射する光照射工程と、
前記励起光が照射された生体分子から発せられた光をハーフミラーにより分岐し、単一光子を検出可能な第１検出器及び第２検出器のいずれか一方又は両方に入射させる検出工程と、
を有する分子数測定方法。 A light irradiation step of irradiating the biomolecule to be measured with excitation light;
A detection step in which light emitted from the biomolecule irradiated with the excitation light is split by a half mirror and is incident on one or both of the first detector and the second detector capable of detecting a single photon;
A method for measuring the number of molecules.

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