JP2015169616A - Silicone surface-treated protein and peptide support medium - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、タンパク質又はペプチドを担持しうるシリコーン表面処理支持体や、該タンパク質又はペプチドを担持しうるシリコーン表面処理支持体に抗原等のタンパク質又はペプチドが担持された表面担持基板等に関する。 The present invention relates to a silicone surface treatment support capable of supporting a protein or peptide, a surface support substrate in which a protein or peptide such as an antigen is supported on the silicone surface treatment support capable of supporting the protein or peptide.
アレルギーの原因には、食物を原因とする食物アレルギー、ごみ・埃を原因とする塵アレルギー、家ダニ、花粉を原因とする吸入アレルギー、花粉症、接触性皮膚炎、金属アレルギー、薬物アレルギー、アトピーなど様々なアレルギーが知られている。これらの中でも、食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質（以下、食物アレルゲンという）の摂取が引き起こす有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こし、このような食物アレルギーの患者が増加していることから、食品成分から抽出したアレルゲンを付着させた基板をアレルギー疾患患者から得た検体と反応させることによって、特定アレルゲンにより起こされるアレルギー反応に関連する抗体の種類を検出することができるアレルギー診断法の開発がすすめられている。また居住環境からのアレルゲンを原因とする吸入アレルギーも年々増加しており、環境変化に対応したアレルギー診断法の開発が求められている。一方、加工食品中のアレルゲン含量を測定して、国民に食の安全と安心を提供する必要性から、アレルゲンを特異的に認識する抗体を固定化した基板を用いたアレルゲン含量測定方法の開発もすすめられている。 Causes of allergies include food allergies caused by food, dust allergies caused by garbage and dust, house mites, inhalation allergies caused by pollen, hay fever, contact dermatitis, metal allergies, drug allergies, atopy Various allergies are known. Among these, food allergies are harmful immune reactions caused by ingestion of allergens (hereinafter referred to as food allergens) contained in foods, causing dermatitis, asthma, gastrointestinal disorders, anaphylactic shock, etc. Since the number of patients with food allergies is increasing, antibodies related to allergic reactions caused by specific allergens by reacting a substrate with allergens extracted from food ingredients with a sample obtained from patients with allergic diseases The development of an allergy diagnostic method that can detect the type of the disease has been promoted. Inhalation allergies caused by allergens from the living environment are also increasing year by year, and there is a need for the development of allergy diagnostic methods that respond to environmental changes. On the other hand, because of the need to measure the allergen content in processed foods and provide food safety and security to the public, we have also developed a method for measuring allergen content using a substrate on which an antibody that specifically recognizes allergens is immobilized. It is recommended.
本発明者らは、化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣ（Diamond-like Carbon）基板を活性化試薬により活性化した後、蛋白質／ペプチドを前記基板上にスポッティングしてカップリング反応を行う、基板上に蛋白質／ペプチドを固定する方法であって、スポッティング添加剤としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる蛋白質／ペプチドの固定化方法（例えば、特許文献１参照）や、化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣ基板を活性化試薬により活性化した後、アレルゲンのアレルゲンエピトープ又はアレルゲンエピトープを含むペプチドのカップリング反応を行い、次いで未反応活性基のブロッキング操作を行ったアレルゲンエピトープ判定基板に、検体を接触させ、アレルゲンエピトープ判定基板に捕捉された検体中のアレルゲン認識抗体をイムノアッセイにより検出し、アレルゲンの拡大／縮小パターン及び／又はアレルゲンエピトープの拡大／縮小パターンを判定するアレルギー疾患の判定方法（例えば、特許文献２参照）を提案してきた。 The present inventors activate a chemically modified diamond / DLC (Diamond-like Carbon) substrate with an activating reagent, and then perform a coupling reaction by spotting the protein / peptide on the substrate. / Peptide immobilization method, protein / peptide immobilization method using dimethyl sulfoxide (DMSO) or polyethylene glycol (PEG) as a spotting additive (see, for example, Patent Document 1), chemically modified diamond / DLC After activating the substrate with an activating reagent, the allergen epitope of the allergen or a peptide containing the allergen epitope is subjected to a coupling reaction, and then the specimen is brought into contact with the allergen epitope determination substrate subjected to the blocking operation of the unreacted active group, Captured on allergen epitope determination board We have proposed a method for determining allergic diseases by detecting allergen-recognizing antibodies in captured samples by immunoassay and determining the allergen expansion / reduction pattern and / or allergen epitope expansion / reduction pattern (see, for example, Patent Document 2). It was.
生体分子を検出する装置としては、基板上に、生体分子を静電的に引き寄せるための静電層を有する固体支持体（例えば、特許文献３参照）や、基板と、前記基板上に形成された、核酸分子を静電的に引き寄せる静電層と、前記静電層上に形成された核酸分子と共有結合しうる官能基とを有する固体支持体（例えば、特許文献４参照）や、シリコン（Ｓｉ）基体上に、ＳｉＯ２層及び生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体（例えば、特許文献５参照）等が提案されている。これらの基板は、ＤＮＡ等の核酸分子を固定化し、ハイブリダイゼーション等の反応を行うためには有利な基板であった。 As an apparatus for detecting a biomolecule, a solid support (for example, see Patent Document 3) having an electrostatic layer for electrostatically attracting a biomolecule on a substrate, a substrate, and a substrate are formed on the substrate. In addition, a solid support (for example, see Patent Document 4) having an electrostatic layer that electrostatically attracts nucleic acid molecules, and a functional group that can be covalently bonded to the nucleic acid molecules formed on the electrostatic layer, silicon A carrier having a functional group that can be covalently bonded to a SiO 2 layer and a biomolecule on a (Si) substrate has been proposed (for example, see Patent Document 5). These substrates are advantageous substrates for immobilizing nucleic acid molecules such as DNA and performing reactions such as hybridization.
本発明の課題は、タンパク質やペプチド、とりわけ親水性に富むタンパク質／ペプチドを基板上にスポッティングする際に、滲むことなく固定化することができるより安価な支持体や、該支持体にタンパク質／ペプチドが担持された基板を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a cheaper support that can be immobilized without bleeding when spotting a protein or peptide, particularly a protein / peptide rich in hydrophilicity, on a substrate, and a protein / peptide on the support. Is to provide a substrate on which is supported.
上記課題を解決するために、本発明者らは、前記特許文献３や４記載のＤＮＡ等の核酸分子の固定化用支持体に、タンパク質やペプチド抗原のスポッティングによる固定化を試みたところ、殆どの基板において、タンパク質／ペプチド抗原の滲み現象が観察された。この結果は、かかる基板に固定化したタンパク質やペプチド抗原と試料中の抗体との抗原抗体反応検査を行う上で正確性に問題があるということを意味する。すなわち、カチオンやアニオンの層を有する固体支持体は表面が親水性に富むため、支持体に固定化するタンパク質／ペプチドの親水性が高い場合、タンパク質／ペプチドのスポッティング後に基板表面で滲みが生じ、解析が困難であった。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors tried to immobilize a protein or peptide antigen by spotting on a support for immobilizing a nucleic acid molecule such as DNA described in Patent Documents 3 and 4. In this substrate, the bleeding phenomenon of protein / peptide antigen was observed. This result means that there is a problem in accuracy in performing an antigen-antibody reaction test between the protein or peptide antigen immobilized on the substrate and the antibody in the sample. That is, since the surface of a solid support having a cation or anion layer is highly hydrophilic, if the protein / peptide immobilized on the support is highly hydrophilic, bleeding occurs on the substrate surface after spotting the protein / peptide, Analysis was difficult.
本発明者らは、かかる課題を解決するために、検量用の内部標準としても使用しているがスポッティング後の基板上において滲みが特に生じていた、ヒト非特異的ＩｇＥ抗体や、同様にスポッティング時に滲みが特に生じていた牛アルブミン抗原とを用いて検討を続けてきたが、シリコーン溶液を用いて基板の表面処理を行った場合に、滲みを防止することができ、基板表面上のカルボキシル基を損なわずに固定化することができることを見いだした。さらに、タンパク質／ペプチドの基板上への固定化がより効率よく行われる詳細な条件についても確認し、本発明を完成するに至った。 In order to solve such problems, the present inventors have used human non-specific IgE antibodies, which are also used as internal standards for calibration, but have had bleeding on the substrate after spotting, and similarly spotting. Although we have continued to study using bovine albumin antigen, which has been particularly oozing at times, when surface treatment of the substrate is carried out using a silicone solution, bleed can be prevented and carboxyl groups on the substrate surface can be prevented. It has been found that it can be immobilized without impairing. Further, the present inventors have completed the present invention by confirming detailed conditions for more efficiently immobilizing proteins / peptides on a substrate.
すなわち、本発明を以下に示す。
（１）正又は負の電荷を帯びる官能基を有する基板に、シリコーン表面処理を施したことを特徴とする表面処理支持体；
（２）正の電荷を帯びる官能基がアミノ基であることを特徴とする上記（１）記載の表面処理支持体；
（３）負の電荷を帯びる官能基がカルボキシル基であることを特徴とする上記（１）記載の表面処理支持体；
（４）正又は負の電荷を帯びる官能基を有する基板が、さらに化学架橋剤により活性化されたことを特徴とする上記（１）〜（３）いずれか記載の表面処理支持体；
（５）シリコーン表面処理後に、さらに、乾燥処理が行われていることを特徴とする上記（１）〜（４）いずれか記載の表面処理支持体；
（６）上記（１）〜（５）いずれか記載の表面処理支持体に、タンパク質又はペプチドの固定化を行い、次いでブロッキング処理が行われていることを特徴とする表面担持基板；
（７）タンパク質又はペプチドが、タンパク質又はペプチド抗原、若しくは抗体であることを特徴とする上記（６）記載の表面担持基板；
（８）ブロッキング処理を、プロテインフリーバッファー、あるいは検出に障害を及ぼすことなくブロッキングに有効な生体成分を含有するバッファーで行ったことを特徴とする上記（６）又は（７）記載の表面担持基板；
（９）上記（７）又は（８）記載の表面担持基板と、抗体を含む試料とを接触させて抗原抗体反応を行うことを特徴とする抗体の検出方法；
（１０）上記（７）又は（８）記載の表面担持基板と、抗原を含む試料とを接触させて抗原抗体反応を行うことを特徴とする抗原の検出方法；
That is, the present invention is shown below.
(1) A surface treatment support characterized in that a silicone surface treatment is applied to a substrate having a functional group having a positive or negative charge;
(2) The surface-treated support according to the above (1), wherein the positively charged functional group is an amino group;
(3) The surface treatment support according to the above (1), wherein the negatively charged functional group is a carboxyl group;
(4) The surface treatment support according to any one of (1) to (3) above, wherein the substrate having a functional group having a positive or negative charge is further activated by a chemical crosslinking agent;
(5) The surface treatment support according to any one of the above (1) to (4), wherein a drying treatment is further performed after the silicone surface treatment;
(6) A surface-supporting substrate, wherein a protein or peptide is immobilized on the surface-treated support according to any one of (1) to (5) above, and then a blocking treatment is performed;
(7) The surface-supporting substrate according to (6) above, wherein the protein or peptide is a protein or peptide antigen or antibody;
(8) The surface-supporting substrate as described in (6) or (7) above, wherein the blocking treatment is performed with a protein-free buffer or a buffer containing a biological component effective for blocking without affecting detection. ;
(9) An antibody detection method comprising performing an antigen-antibody reaction by bringing the surface-supporting substrate according to (7) or (8) above into contact with a sample containing an antibody;
(10) An antigen detection method comprising performing an antigen-antibody reaction by contacting the surface-supporting substrate according to (7) or (8) above and a sample containing the antigen;
本発明のシリコーン表面処理支持体を用いることにより、微量のタンパク質／ペプチドを、そのコンフォメーションが維持されて、活性が損なわれないまま支持体に滲むことなく固定化することができ、例えば、アレルゲン候補となる様々なタンパク質／ペプチド抗原をシリコーン表面処理支持体に固定した表面担持基板とアレルギー疾患患者から得た検体とを反応させることによって、各種アレルゲンに対する抗体の種類とその存在量を特定することができる。また、特定アレルゲンに反応する抗体を固定化した本発明の基板と食品試料とを接触させることにより、食品中のアレルゲンを検出、定量することができる。 By using the silicone surface-treated support of the present invention, a trace amount of protein / peptide can be immobilized on the support without losing its activity while maintaining its conformation, for example, allergen Identifying the types and abundance of antibodies against various allergens by reacting a surface-supported substrate with various candidate protein / peptide antigens immobilized on a silicone surface-treated support and a sample obtained from an allergic disease patient Can do. Moreover, the allergen in a foodstuff can be detected and quantified by making the board | substrate of this invention which fix | immobilized the antibody reacting with a specific allergen and a food sample contact.
また本発明によると、スポッティングされるタンパク質／ペプチドに対して基板表面の親和性が高い場合に発生する滲み現象を抑制・防止することができるので、固定化されたタンパク質／ペプチドと反応する抗体／抗原を画像情報として取得する際の、画像情報の境界の不明瞭さを解消することができる。 Further, according to the present invention, since the bleeding phenomenon that occurs when the affinity of the substrate surface for the spotted protein / peptide is high can be suppressed / prevented, the antibody / reactant reacting with the immobilized protein / peptide / When the antigen is acquired as image information, the ambiguity of the boundary of the image information can be eliminated.
本発明の表面処理支持体としては、正又は負の電荷を帯びる官能基を有する基板に、シリコーン表面処理を施したシリコーン表面処理支持体であれば特に限定されず、上記基板の材質としては、シリコン；ガラス；シリカガラス；ステンレス；セラミックス；ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等のプラスチック；を例示することができる。また、かかる基板の表面がダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質又は炭化物から選ばれる１又は２以上により表面処理されているものや、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属粉末、セラミック粉末等に、前記樹脂がバインダーとして混合されている態様のものも基板として用いることができる。上記シリカガラスとしては、ガラス表面にＳｉＯ４四面体がランダム結合している、Ｎａ+、Ｃｌ−、（Ｂ３）３ −等のイオンが共存するガラス基板を挙げることができるが、かかるシリカガラスも本発明の基板を調製する方法に従うことにより、本発明の基板として利用可能である。 The surface treatment support of the present invention is not particularly limited as long as it is a silicone surface treatment support obtained by performing a silicone surface treatment on a substrate having a functional group having a positive or negative charge. Silicone; glass; silica glass; stainless steel; ceramics; polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin, nylon, acrylic resin, fluorine resin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, Examples thereof include plastics such as vinyl chloride resin. In addition, the surface of the substrate is surface-treated with one or more selected from diamond, soft diamond, carbon-based material or carbide, metal powder such as gold, silver, copper, aluminum, tungsten, molybdenum, ceramic An embodiment in which the resin is mixed with powder as a binder can also be used as the substrate. Examples of the silica glass include glass substrates in which ions such as Na + , Cl − , and (B 3 ) 3 − coexist with SiO 4 tetrahedrons randomly on the glass surface. Can also be used as the substrate of the present invention by following the method for preparing the substrate of the present invention.
上記正又は負の電荷を帯びる官能基を有する基板としては、正又は負の電荷を帯びる官能基が結合した基板や、正又は負の電荷を帯びる官能基を自由端に有する分子種が結合した基板を挙げることができる。 As the substrate having a functional group having a positive or negative charge, a substrate to which a functional group having a positive or negative charge is bonded or a molecular species having a functional group having a positive or negative charge at the free end is bonded. A substrate can be mentioned.
上記正の電荷を帯びる官能基を有する基板を調製するために用いることができる化合物としては、ＮＨ３、及び、非置換のアミノ基（−ＮＨ２）又は炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物を挙げることができ、具体的には、ＮＨ３；エチレンジアミン；ヘキサメチレンジアミン；ｎ−プロピルアミン；モノメチルアミン；ジメチルアミン；モノエチルアミン；ジエチルアミン；アリルアミン；アミノアゾベンゼン；エタノールアミン等のアミノアルコール；アクリノール；アミノ安息香酸；アミノアントラキノン；グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン等のアミノ酸；アニリン；又はこれらの重合体としてのポリアリルアミン、ポリリシンや、４,４’,４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどの多価アミン；を挙げることができ、ポリアリルアミン、ポリリシン、４,４',４”−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを好適に例示することができる。必要に応じてこれらの２種以上を用いることもできる。 Examples of the compound that can be used for preparing the substrate having a positively charged functional group include NH 3 , an unsubstituted amino group (—NH 2 ), and an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. A compound having a monosubstituted amino group (—NHR; R is a substituent) can be mentioned, and specifically, NH 3 ; ethylenediamine; hexamethylenediamine; n-propylamine; monomethylamine; dimethylamine; Ethylamine; diethylamine; allylamine; aminoazobenzene; amino alcohols such as ethanolamine; acrinol; aminobenzoic acid; aminoanthraquinone; The Amino acids such as Tamamic acid, Aspartic acid, Glutamine, Asparagine, Lysine, Arginine, Histidine; Aniline; or polyallylamine, polylysine, or 4,4 ′, 4 ″ -triaminotriphenylmethane, triamterene as a polymer thereof, Polyamines such as spermidine, spermine, and putrescine; and polyamines such as polyallylamine, polylysine, 4,4 ′, 4 ″ -triaminotriphenylmethane, and triamterene can be preferably exemplified. . Two or more of these may be used as necessary.
上記負の電荷を帯びる官能基が結合した基板を調製するために用いることができる化合物としては、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基を有する化合物を挙げることができ、必要に応じてこれらの２種以上を用いることもできる。 Examples of the compound that can be used for preparing the substrate to which the negatively charged functional group is bonded include compounds having a carboxyl group, a sulfonic acid group, and a phosphoric acid group. Two or more kinds can also be used.
上記正又は負の電荷を帯びる官能基を有する基板は、常法により調製することができ、例えば、上記アミノ基を有する化合物と上記基板とを共有結合させて調製する場合には、塩素ガス中で基板に紫外線を照射することにより基板表面を塩素化し、次いで、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４,４',４”−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させることにより基板と結合していない側の自由端にアミノ基を導入する方法や、基板表面を塩素化した後、ＮＨ３ガス中でＵＶ照射することにより、アミノ基を導入する方法を挙げることができる。 The substrate having a functional group having a positive or negative charge can be prepared by a conventional method. For example, in the case where the compound having an amino group and the substrate are covalently bonded, The substrate surface is chlorinated by irradiating the substrate with ultraviolet rays, and then the substrate is reacted with a polyvalent amine such as polyallylamine, polylysine, 4,4 ′, 4 ″ -triaminotriphenylmethane, triamterene, etc. Examples include a method of introducing an amino group into the free end on the side not bonded to the substrate, and a method of introducing an amino group by irradiating with UV in NH 3 gas after chlorination of the substrate surface.
前記アミノ基を有する化合物と基板とを共有結合以外の態様にて結合させる方法としては、前記ＮＨ３と基板とを製膜装置内に導入する方法を好適に例示することができる。 As a method for bonding the compound having an amino group and the substrate in a mode other than the covalent bond, a method of introducing the NH 3 and the substrate into a film forming apparatus can be preferably exemplified.
上記正の電荷を帯びる官能基を自由端に有する分子種が結合した基板の一態様として、上記正又は負の電荷を帯びる官能基が結合した基板を、それぞれ正の電荷を帯びる官能基を有する分子によって修飾した基板を挙げることができ、同様に、上記負の電荷を帯びる官能基を自由端に有する分子種が結合した基板の一態様として、上記正又は負の電荷を帯びる官能基が結合した基板を、それぞれ負の電荷を帯びる官能基を有する分子によって修飾した基板を挙げることができるが、中でも上記正の電荷を帯びる官能基が結合した基板が、さらにカルボキシル基を有する分子によって修飾されている、負の電荷を帯びる官能基を自由端に有する分子種が結合した基板を好適に挙げることができる。 As an embodiment of the substrate to which the molecular species having a positively charged functional group at the free end is bonded, the substrate to which the positively or negatively charged functional group is bonded has a positively charged functional group. Examples of the substrate modified by molecules include the negatively charged functional group bonded to the positive or negative charged functional group as one embodiment of the substrate to which the molecular species having a negatively charged functional group is bonded at the free end. Examples of the substrate may be a substrate obtained by modifying each substrate with a molecule having a negatively charged functional group, but the substrate having the positively charged functional group bonded thereto is further modified by a molecule having a carboxyl group. A substrate having a molecular group having a negatively charged functional group at the free end bonded thereto can be preferably used.
上記カルボキシル基を有する分子によって修飾されている基板を調製するために用いられる化合物としては、式：Ｘ−Ｒ1−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ1は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示される、クロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、３−クロロアクリル酸、４−クロロ安息香酸等のハロカルボン酸；式：ＨＯＯＣ−Ｒ２−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ2は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示される、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等のジカルボン酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸等の多価カルボン酸；式：Ｒ３−ＣＯ−Ｒ４−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、Ｒ4は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるケト酸又はアルデヒド酸；式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ５−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ５は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示される、コハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド等のジカルボン酸のモノハライド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸等の酸無水物を例示することができるが、中でもジカルボン酸や多価カルボン酸を好適に例示することができる。 The compound used for preparing the substrate modified with the molecule having a carboxyl group is represented by the formula: X—R 1 —COOH (wherein X is a halogen atom, R 1 is 2 having 1 to 12 carbon atoms). Chloroacetic acid, fluoroacetic acid, bromoacetic acid, iodoacetic acid, 2-chloropropionic acid, 3-chloropropionic acid, 3-chloroacrylic acid, 4-chlorobenzoic acid, etc. Oxalic acid, malonic acid, succinic acid represented by the formula: HOOC-R 2 —COOH (wherein R 2 represents a single bond or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms) Dicarboxylic acids such as maleic acid, fumaric acid and phthalic acid; polycarboxylic acids such as polyacrylic acid, polymethacrylic acid, trimellitic acid and butanetetracarboxylic acid; formula: R 3 —CO—R 4 —C Keto acid or aldehyde represented by OOH (wherein R 3 represents a hydrogen atom or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms, and R 4 represents a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms). Acid: monosuccinic acid represented by the formula: X—OC—R 5 —COOH (wherein X represents a halogen atom, R 5 represents a single bond or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms) Monohalides of dicarboxylic acids such as chloride and malonic acid monochloride; acid anhydrides such as phthalic anhydride, succinic anhydride, oxalic anhydride, maleic anhydride, and butanetetracarboxylic acid can be exemplified. Preferred examples include acids and polycarboxylic acids.
上記正又は負の電荷を帯びる官能基が結合した基板が、それぞれ負又は正の電荷を帯びる官能基を有する分子によって修飾されている基板を調製する方法としては、例えば、アミノ基を有する基板におけるアミノ基と上記ジカルボン酸や多価カルボン酸のカルボキシル基が脱水縮合してアミド結合を形成する反応により調製する公知の方法を挙げることができ、また、市販の「ジーンスライド（登録商標）」（東洋鋼鈑社製）を利用することもできる。 As a method of preparing a substrate in which the substrate to which the functional group having a positive or negative charge is bonded is modified with a molecule having a functional group having a negative or positive charge, respectively, for example, in a substrate having an amino group Examples of the known method include a method in which an amino group and a carboxyl group of the above dicarboxylic acid or polyvalent carboxylic acid are dehydrated and condensed to form an amide bond, and a commercially available “Gene Slide (registered trademark)” ( Toyo Kohan Co., Ltd.) can also be used.
正又は負の電荷を帯びる官能基を有する基板は、化学架橋剤により活性化することが好ましい。かかる活性化された基板としては、上記負の電荷を帯びる官能基が結合した基板や、上記負の電荷を帯びる官能基を自由端に有する分子種が結合した基板を、化学架橋剤中で振盪する活性化処理が施された基板を挙げることができ、かかる活性化処理は、遮光した状態で行うことがより好ましい。上記化学架橋剤としては、脱水縮合剤とエステル化剤と緩衝液とを含む溶液を挙げることができる。 The substrate having a functional group having a positive or negative charge is preferably activated by a chemical crosslinking agent. As the activated substrate, the substrate having the negatively charged functional group bonded thereto or the substrate having the negatively charged functional group bonded to the molecular species having a free end bonded thereto is shaken in a chemical crosslinking agent. The substrate that has been subjected to the activation treatment can be given, and the activation treatment is more preferably performed in a light-shielded state. Examples of the chemical crosslinking agent include a solution containing a dehydration condensation agent, an esterifying agent, and a buffer solution.
上記脱水縮合剤としては、例えば、カルボン酸を活性化する脱水縮合剤として、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジ−ｐ−トルオイルカルボジイミド、ベンジルジメチルアミノプロピルカルボジイミド(ＢＤＣ)、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）、１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドヨージド（ＥＡＣ）等のカルボジイミド誘導体や、Ｎ−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホネート等のイソキサゾリウム誘導体や、１，１'−カルボン−イルジイミダゾール等のカルボニルジイミダゾールや、ｎ−(エトキシカルボニル)−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＱＤ)、ｎ−(イソブトキシカルボニル)−２−イソブトキシ−１，２−ジヒドロキノリン(ＩＩＤＱ)等のｎ−カルバルコキシジヒドロキノリンを例示することができる。 Examples of the dehydrating condensing agent include dicyclohexylcarbodiimide, di-p-toluoylcarbodiimide, benzyldimethylaminopropylcarbodiimide (BDC), 1-ethyl-3- (3-dimethyl) as a dehydrating condensing agent for activating carboxylic acid. Carbodiimide derivatives such as aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (WSC), 1-ethyl-3- (4-azonia-4,4-dimethylpentyl) carbodiimide iodide (EAC), and N-ethyl-5-phenylisoxazo Isoxazolium derivatives such as lithium-3′-sulfonate, carbonyldiimidazole such as 1,1′-carboxylic-yldiimidazole, n- (ethoxycarbonyl) -2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline (EEQD), n -(Isobutoxycarbonyl) -2-isobutoxy The n- carbalkoxy dihydroquinoline, such as 1,2-dihydroquinoline (IIDQ) can be exemplified.
上記エステル化剤としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ；N-Hydroxy-succinimide）、ｐ−ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン等を例示することができる。 Examples of the esterifying agent include N-hydroxysuccinimide (NHS), p-nitrophenol, pentafluorophenol, 1-hydroxybenzotriazole, 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro- Examples thereof include 1,2,3-benzotriazine.
上記緩衝液としては、アミノ基を含まないｐＨ３.０〜８．０の緩衝液が好ましく、具体的にはｐＨ３.０〜８．０のリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、フタル酸緩衝液、ジメチールグルタル酸緩衝液、こはく酸緩衝液、カコジル酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリメチルピリジン緩衝液、モルフォリンプロパンスルフォン酸緩衝液、ジエチールバルビタール酸緩衝液、エチールモルフォリン緩衝液、水酸化エチレンピペラジン、エタンスルフォン酸緩衝液、水酸化エチレンピペラジン、プロパンスルフォン酸緩衝液を例示することができる。 As the above-mentioned buffer solution, a buffer solution having a pH of 3.0 to 8.0 that does not contain an amino group is preferable. Specifically, a phosphate buffer solution, an acetate buffer solution, a citrate buffer solution having a pH of 3.0 to 8.0, Tartaric acid buffer, phthalic acid buffer, dimethyl methylglutarate buffer, succinic acid buffer, cacodylic acid buffer, maleic acid buffer, carbonic acid buffer, trimethylpyridine buffer, morpholine propane sulfonic acid buffer, diethyl Examples thereof include barbital acid buffer solution, ethyl morpholine buffer solution, ethylene piperazine hydroxide, ethane sulfonate buffer solution, ethylene piperazine hydroxide, and propane sulfonate buffer solution.
上記活性化処理によって、例えば、図１に示すとおり、ＮＨＳがカルボン酸と脱水縮合し、不安定なエステル結合であるＮＨＳ体が活性エステルとして形成されることにより、活性化された基板が調製される。 By the above activation treatment, for example, as shown in FIG. 1, NHS is dehydrated and condensed with carboxylic acid, and an NHS body that is an unstable ester bond is formed as an active ester, whereby an activated substrate is prepared. The
アミノ基を有する基板にさらにカルボキシル基を有する分子によって修飾されている、カルボキシル基を自由端に有する分子種が結合した基板を活性化する別法としては、上記ジカルボン酸又は多価カルボン酸等を予め上記脱水縮合剤やエステル化剤を用いて活性化させた後、水、Ｎ−メチルピロリドン又はエタノールの溶液中において、上記アミノ基を有する基板を化学修飾する方法（別法１）や、アミノ基を有する基板にカルボキシル基を有する分子を修飾する反応を上記脱水縮合剤やエステル化剤の存在下に行う方法（別法２）を挙げることができる。活性化された基板としては、市販の「ジーンスライド（登録商標）（活性化済）」（東洋鋼鈑社製）も利用することができる。 As another method for activating a substrate in which a molecular species having a carboxyl group at its free end is bonded to a substrate having an amino group, which is further modified with a molecule having a carboxyl group, the above dicarboxylic acid or polyvalent carboxylic acid can be used. A method in which the substrate having an amino group is chemically modified in a solution of water, N-methylpyrrolidone or ethanol (Alternative Method 1) after being activated in advance using the dehydration condensation agent or esterification agent, A method of performing a reaction for modifying a molecule having a carboxyl group on a substrate having a group in the presence of the dehydration condensing agent or esterifying agent (Alternative Method 2) can be mentioned. Commercially available “Gene Slide (registered trademark) (activated)” (manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.) can also be used as the activated substrate.
本発明におけるシリコーン表面処理は、（１）正又は負の電荷を帯びる官能基が結合した基板；（２）正又は負の電荷を帯びる官能基を自由端に有する分子種が結合した基板；（３）上記（１）又は（２）の基板がさらに活性化された基板；（これら３種の基板を総称して「表面処理基板類」ということもある）において、表面処理基板類表面の官能基とタンパク質／ペプチドの官能基との反応性が損なわれない程度に、表面処理基板類表面に疎水性のシリコーン表面膜を形成するもので、本発明の表面処理支持体の調製における必須の構成である。 Silicone surface treatment in the present invention includes (1) a substrate to which a positive or negative charge functional group is bonded; (2) a substrate to which a molecular species having a positive or negative charge functional group at the free end; 3) A substrate on which the substrate of (1) or (2) is further activated; these three types of substrates may be collectively referred to as “surface-treated substrates”. A hydrophobic silicone surface film is formed on the surface of the surface-treated substrates to the extent that the reactivity between the group and the functional group of the protein / peptide is not impaired, and is an essential component in the preparation of the surface-treated support of the present invention It is.
上記シリコーン表面膜を表面処理基板類表面に形成するためのシリコーン表面処理の方法としては、上記表面処理基板類をシリコーン水溶液中に浸漬する方法を挙げることができ、表面処理基板類表面においてより均一にシリコーン表面処理を行うために、ソニケーター等による超音波処理を併用することが好ましい。上記シリコーンの水溶液の濃度としては、０．０００２％〜０．１％ｖ／ｖが好ましく、０．０００５％〜０．０５％ｖ／ｖがより好ましく、０．００１〜０．０２％ｖ／ｖがさらに好ましく、０．００５〜０．０１５％ｖ／ｖが特に好ましい。 Examples of the silicone surface treatment method for forming the silicone surface film on the surface of the surface-treated substrate include a method of immersing the surface-treated substrate in an aqueous silicone solution, and is more uniform on the surface of the surface-treated substrate. In order to perform silicone surface treatment, it is preferable to use ultrasonic treatment with a sonicator or the like. The concentration of the aqueous silicone solution is preferably 0.0002% to 0.1% v / v, more preferably 0.0005% to 0.05% v / v, and 0.001 to 0.02% v / v. v is more preferable, and 0.005 to 0.015% v / v is particularly preferable.
上記シリコーン表面処理の工程における、シリコーン水溶液中の浸漬処理時間としては、１０秒〜１時間、好ましくは１〜４５分間、より好ましくは２〜３０分間、さらに好ましくは３〜２０分間、特に好ましくは５〜１５分間を挙げることができる。上記シリコーン水溶液浸漬後の表面処理基板類は、余分なシリコーンのゲル化を防ぐため、ＭｉｌｌｉＱ水等で１回又は２回以上洗浄することが好ましい。 The immersion treatment time in the silicone aqueous solution in the silicone surface treatment step is 10 seconds to 1 hour, preferably 1 to 45 minutes, more preferably 2 to 30 minutes, still more preferably 3 to 20 minutes, particularly preferably. 5-15 minutes can be mentioned. The surface-treated substrates after immersion in the aqueous silicone solution are preferably washed once or twice with MilliQ water or the like in order to prevent excessive silicone from gelling.
上記シリコーンとしては、表面処理基板類表面に、タンパク質／ペプチドが滲むことなく固定化される程度に、表面処理基板類に疎水性を付加することができるシリコーンであれば特に制限されず、ヘキサメチルシクロトリシロキサン，オクタメチルシクロテトラシロキサン，デカメチルシクロペンタシロキサン，ドデカメチルシクロヘキサシロキサンなどの環状体シリコーンオイル、ポリジメチルシロキサンのメチル基の一部又は全部がフェニル基、水素原子、炭素数２以上のアルキル基、ハロゲン化フェニル基、フルオロエステル基で置換されたシリコーンオイルを挙げることができ、具体的には、ポリジメチルシロキサン、分子鎖両末端トリメチルシロキシ基封鎖ジメチルポリシロキサン等のポリアルキルシロキサン、分子鎖両末端トリメチルシロキシ基封鎖ジメチルシロキサン・メチルフェニルシロキサン共重合体，分子鎖両末端トリメチルシロキシ基封鎖ジメチルシロキサン・メチル（３,３,３−トリフルオロプロピル）シロキサン共重合体等の直鎖状の非反応性シリコーンオイル等を挙げることができ、中でもポリアルキル（Ｃ１〜２０）シロキサン(ＣＡＳ ６３１４８−６２−９)を好適に挙げることができる。これらは１種類又は２種類以上併用することもできる。 The silicone is not particularly limited as long as it is a silicone that can add hydrophobicity to the surface-treated substrates to such an extent that the protein / peptide is immobilized on the surface-treated substrates without bleeding. Cyclic silicone oil such as cyclotrisiloxane, octamethylcyclotetrasiloxane, decamethylcyclopentasiloxane, dodecamethylcyclohexasiloxane, etc., or some or all of the methyl groups of polydimethylsiloxane are phenyl groups, hydrogen atoms, 2 or more carbon atoms Silicone oil substituted with an alkyl group, a halogenated phenyl group, or a fluoroester group. Specifically, polyalkylsiloxanes such as polydimethylsiloxane, trimethylsiloxy group-blocked dimethylpolysiloxane at both molecular chains, Molecular chain both ends Linear non-reactive such as methylsiloxy group-blocked dimethylsiloxane / methylphenylsiloxane copolymer, molecular chain both ends trimethylsiloxy group-blocked dimethylsiloxane / methyl (3,3,3-trifluoropropyl) siloxane copolymer A silicone oil etc. can be mentioned, Especially, a polyalkyl (C1-20) siloxane (CAS 63148-62-9) can be mentioned suitably. These can be used alone or in combination of two or more.
シリコーン表面処理後に、乾燥処理を行うことが好ましい。かかる乾燥処理は、本発明のシリコーン表面処理支持体の調製工程において、タンパク質／ペプチドの固定化の前処理として、タンパク質／ペプチドの固定化量の均一性を維持するために実施することが好ましい。かかる乾燥処理としては、ドライオーブン、真空デシケーター及び／又は乾燥剤を用いて行う処理を挙げることができ、乾燥処理温度としては、３０〜１７８℃、好ましくは３７〜１７５℃、より好ましくは８０〜１７０℃、さらに好ましくは１２０〜１６０℃、特に好ましくは１４０〜１５５℃を挙げることができ、１８０℃以上になるとバックグラウンドが上昇するおそれがある。乾燥処理時間としては、３０分〜１２時間、好ましくは１〜６時間、より好ましくは２〜４時間、特に好ましくは２．５〜３．５時間を挙げることができる。 It is preferable to perform a drying treatment after the silicone surface treatment. Such a drying treatment is preferably carried out as a pretreatment for protein / peptide immobilization in the step of preparing the silicone surface-treated support of the present invention in order to maintain the uniformity of the protein / peptide immobilization amount. Examples of the drying treatment include a treatment performed using a dry oven, a vacuum desiccator and / or a desiccant, and the drying treatment temperature is 30 to 178 ° C., preferably 37 to 175 ° C., more preferably 80 to 170 degreeC, More preferably, 120-160 degreeC, Especially preferably, 140-155 degreeC can be mentioned, and when it becomes 180 degreeC or more, there exists a possibility that a background may rise. Examples of the drying treatment time include 30 minutes to 12 hours, preferably 1 to 6 hours, more preferably 2 to 4 hours, and particularly preferably 2.5 to 3.5 hours.
本発明のシリコーン表面処理支持体に、周知のスポッティング用器材を用いて、タンパク質又はペプチド等を基板表面に固定化することができる。タンパク質／ペプチドの固定化の態様としては、アミド結合反応を好適に挙げることができ、具体的には、加熱により、又は、上記活性化した基板における活性エステルを介するカップリング反応させることにより、タンパク質／ペプチドにおけるアミンと基板上のカルボキシル基とのアミド結合を形成する反応を挙げることができる。また、スポッティング後２０〜４２℃で１〜５時間、好ましくは２５℃で３時間インキュベーションすることにより固定化することが好ましい。 Proteins or peptides can be immobilized on the substrate surface using a well-known spotting device on the silicone surface-treated support of the present invention. As an aspect of protein / peptide immobilization, an amide bond reaction can be preferably mentioned. Specifically, a protein can be obtained by heating or by a coupling reaction via an active ester on the activated substrate. / The reaction which forms the amide bond of the amine in a peptide and the carboxyl group on a board | substrate can be mentioned. Further, after spotting, it is preferably immobilized by incubation at 20 to 42 ° C. for 1 to 5 hours, preferably at 25 ° C. for 3 hours.
上記タンパク質／ペプチドのスポッティングの際には、タンパク質／ペプチドの機能を維持するため、及び／又は、タンパク質／ペプチドの基板への結合量を増加させるために、ＰＥＧ；ＤＭＳＯ；グリシン；ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）；グリセロール、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、イノシトール、ソルビトール、トレハロース、又はシクロデキストリン等の溶解液；から選ばれる１又は２以上をスポッティング添加剤として混合してスポッティングすることが好ましい。これらのスポッティング添加剤は、N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid（ＣＡＰＳ）緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液に溶解して用いることもできる。 In the spotting of the protein / peptide, in order to maintain the function of the protein / peptide and / or to increase the binding amount of the protein / peptide to the substrate, PEG; DMSO; glycine; PBS (phosphate Buffered saline); one or more selected from glycerol, glucose, fructose, mannose, galactose, xylose, inositol, sorbitol, trehalose, cyclodextrin, etc .; It is preferable. These spotting additives can also be used by dissolving in a buffer solution such as N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid (CAPS) buffer solution or phosphate buffer solution.
本発明の表面処理支持体に、タンパク質／ペプチドの固定化を行い、次いでブロッキング処理を行うことが好ましい。かかるブロッキング処理は、残存する正又は負の電荷を帯びる官能基を不活化するためにブロッキング剤を用いて行う処理であり、バックグラウンドを低下させると同時に、相対的に蛍光強度や発色強度を上昇させ、測定感度を向上させることができる。上記ブロッキング剤としては、生体成分を含まないブロッキング剤を用いることが好ましい。生体成分を含まない成分を使用することにより、牛血清アルブミン等の生体成分を含むブロッキング剤を用いた場合と比べ、動物性アレルゲンとの交叉反応を減少させ、バックグラウンドノイズやシグナル減退を防止できる。具体的には、サーモフィッシャー社、Ｂｌｏｋ−ＦＬ社、ミリポア社、Ｐｒｏ−Ｂｌｏｃｋ社、ＳｃｙＴｅｃ社、Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ社、ＪＳＲ社製等のプロテインフリー・ブロッキングバッファーを挙げることができる。これらのブロッキング剤を希釈せずに添加後、一晩ブロッキング反応を行った後、ブロッキング剤を洗浄し、水分を除去することが好ましい。なお、目的物の検出に障害を及ぼすことなくブロッキングに有効な生体成分の場合は、生体成分であってもブロッキング剤としてバッファー中に含有することもある。 It is preferable that the surface treatment support of the present invention is subjected to protein / peptide immobilization and then subjected to blocking treatment. This blocking process is a process that uses a blocking agent to inactivate the remaining positively or negatively charged functional groups, lowering the background and at the same time increasing the fluorescence intensity and color intensity. Measurement sensitivity can be improved. As said blocking agent, it is preferable to use the blocking agent which does not contain a biological component. By using components that do not contain biological components, compared to the use of blocking agents containing biological components such as bovine serum albumin, cross-reaction with animal allergens can be reduced and background noise and signal decline can be prevented. . Specific examples include protein-free blocking buffers such as those manufactured by Thermo Fisher, Block-FL, Millipore, Pro-Block, ScyTec, Blockmaster, and JSR. After adding these blocking agents without diluting, it is preferable to carry out a blocking reaction overnight and then wash the blocking agent to remove moisture. In the case of a biological component that is effective for blocking without affecting the detection of the target substance, even a biological component may be contained in the buffer as a blocking agent.
本発明の表面処理支持体に固定化するタンパク質／ペプチドとしては、抗原タンパク質／抗原ペプチド、又は抗体タンパク質／抗体ペプチドを好適に例示することができる。抗原タンパク質／抗原ペプチドとしては、アレルゲン、各種ガン抗原、サイトカイン等を例示することができる。上記アレルゲンとしては、免疫原性を有するものであれば特に制限されず、卵類、牛乳類、肉類、魚類、甲殻類及び軟体動物類、穀類、豆類及びナッツ類、果実類、野菜類、ビール酵母、ゼラチンなどの食物アレルゲンとハウスダスト、ダニ類、花粉類、動物皮屑類、真菌類等の吸入アレルゲンを好適に例示することができ、中でも乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１−カゼイン、αｓ２−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、α−ラクトアルブミンや、β−ラクトグロブリン、卵白アレルゲンの主要成分としてのオボムコイド、オボアルブミン、コンアルブミンや、小麦アレルゲンの主要成分としてのグルテンやグリアジンや、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質や、落花生の主要タンパク質であるＡｒａ ｈ１等のアレルギーを引き起こす原因物質を具体的に例示することができる。抗タンパク質抗体／抗ペプチド抗体としては、ＩｇＧ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＡ抗体を挙げることができ、具体的には、抗オボムコイド−ＩｇＧ抗体、抗オボアルブミン−ＩｇＧ抗体、抗α−カゼイン−ＩｇＧ抗体、抗β−カゼイン−ＩｇＧ抗体、抗β−ラクトグロブリン−ＩｇＧ抗体、抗グルテン−ＩｇＧ抗体、抗グリアジン−ＩｇＧ抗体、抗ミオグロビン−ＩｇＧ抗体や、抗オボムコイド−ＩｇＥ抗体、抗オボアルブミン−ＩｇＥ抗体、抗α−カゼイン−ＩｇＥ抗体、抗β−カゼイン−ＩｇＥ抗体、抗β−ラクトグロブリン−ＩｇＥ抗体、抗グルテン−ＩｇＥ抗体、抗グリアジン−ＩｇＥ抗体、抗ミオグロビン−ＩｇＥ抗体や、抗オボムコイド−ＩｇＡ抗体、抗オボアルブミン−ＩｇＡ抗体、抗α−カゼイン−ＩｇＡ抗体、抗β−カゼイン−ＩｇＡ抗体、抗β−ラクトグロブリン−ＩｇＡ抗体、抗グルテン−ＩｇＡ抗体、抗グリアジン−ＩｇＡ抗体、抗ミオグロビン−ＩｇＡ抗体、さらにこれらのタンパク質のフラグメント認識抗体を例示することができる。 Preferred examples of the protein / peptide immobilized on the surface treatment support of the present invention include antigen protein / antigen peptide or antibody protein / antibody peptide. Examples of the antigen protein / antigen peptide include allergens, various cancer antigens, cytokines and the like. The allergen is not particularly limited as long as it has immunogenicity, and eggs, milk, meat, fish, crustaceans and mollusks, cereals, beans and nuts, fruits, vegetables, beer Preferred examples include food allergens such as yeast and gelatin, and inhaled allergens such as house dust, mites, pollen, animal debris and fungi, among which αs1-casein and αs2 as main components of milk allergens -Casein, β-casein, κ-casein, α-lactalbumin, β-lactoglobulin, ovomucoid as a major component of egg white allergen, ovalbumin, conalbumin, gluten or gliadin as a major component of wheat allergen, It is a major protein of buckwheat, with molecular weights of 24 kDa and 76 kDa Causative substance causing allergies such as Ara h1 can be specifically exemplified. Examples of the anti-protein antibody / anti-peptide antibody include IgG antibody, IgE antibody, and IgA antibody. Specifically, anti-ovomucoid-IgG antibody, anti-ovalbumin-IgG antibody, anti-α-casein-IgG antibody, Anti-β-casein-IgG antibody, anti-β-lactoglobulin-IgG antibody, anti-gluten-IgG antibody, anti-gliadin-IgG antibody, anti-myoglobin-IgG antibody, anti-ovomucoid-IgE antibody, anti-ovalbumin-IgE antibody, anti-antibody α-casein-IgE antibody, anti-β-casein-IgE antibody, anti-β-lactoglobulin-IgE antibody, anti-gluten-IgE antibody, anti-gliadin-IgE antibody, anti-myoglobin-IgE antibody, anti-ovomucoid-IgA antibody, anti-antibody Ovalbumin-IgA antibody, anti-α-casein-IgA antibody, anti-β-casein-I Examples include gA antibody, anti-β-lactoglobulin-IgA antibody, anti-gluten-IgA antibody, anti-gliadin-IgA antibody, anti-myoglobin-IgA antibody, and fragment recognition antibodies for these proteins.
上記抗原ペプチドとしては、糖鎖修飾ペプチド、リン酸化ペプチド、アシール化ペプチド、アセチル化ペプチド、メチル化ペプチド、ユビキチン化ペプチド等の化学修飾ペプチドを用いることもでき、かかる化学修飾ペプチドは、天然の化学修飾ペプチドであっても、人為的な化学修飾ペプチドであってもよい。さらに、アレルゲンエピトープを含むペプチドとして、ＭＨＣクラスII分子に結合する７〜１５アミノ酸サイズ等のペプチド部分のＮ末端側及び／又はＣ末端側に少なくとも２個以上のアミノ酸が付加されたエピトープ含有ペプチドを用いると、患者抗体と数倍から数十倍高感度に反応する点で好ましい。かかるＭＨＣクラスII分子に結合するペプチド部分のＮ末端側及び／又はＣ末端側に少なくとも２個以上のアミノ酸が付加されたエピトープ含有ペプチド等のアレルゲンエピトープを含むペプチドは、ペプチド合成により作製することもできるが、アレルゲンのエピトープを含むプロテアーゼ分解ペプチドとして作製することもできる。かかるプロテアーゼとしては、トリプシン、キモトリプシン、カテプシン、リジルエンドペプチダーゼを挙げることができる。特に、アレルゲンが食物アレルゲンのとき、トリプシン分解ペプチドをプロテアーゼ分解ペプチドとして好適に例示することができる。 As the above-mentioned antigen peptide, a chemically modified peptide such as a sugar chain-modified peptide, a phosphorylated peptide, an asylated peptide, an acetylated peptide, a methylated peptide, or a ubiquitinated peptide can be used. It may be a modified peptide or an artificially chemically modified peptide. Furthermore, as a peptide containing an allergen epitope, an epitope-containing peptide in which at least two or more amino acids are added to the N-terminal side and / or the C-terminal side of a peptide portion such as a 7-15 amino acid size that binds to an MHC class II molecule When used, it is preferable in that it reacts with a patient antibody several times to several tens of times with high sensitivity. A peptide containing an allergen epitope such as an epitope-containing peptide in which at least two or more amino acids are added to the N-terminal side and / or the C-terminal side of the peptide part that binds to such MHC class II molecule may be prepared by peptide synthesis. However, it can also be produced as a protease-degrading peptide containing an allergen epitope. Examples of such proteases include trypsin, chymotrypsin, cathepsin, and lysyl endopeptidase. In particular, when the allergen is a food allergen, a trypsin-degrading peptide can be preferably exemplified as a protease-degrading peptide.
本発明の表面処理支持体に、タンパク質又はペプチドの固定化を行い、次いでブロッキング処理が行われている本発明の表面担持基板を用いると、例えば、イムノアッセイにより有利にアレルゲンエピトープの判定を行うことができる。かかるイムノアッセイとしては、本発明の表面担持基板に捕捉された検体中のアレルゲン認識抗体を検出することができる公知のイムノアッセイを用いることができ、標識二次抗体を用いるＥＬＩＳＡが好ましい。標識二次抗体としては、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５，Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ローダミン等の蛍光標識二次抗体、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素標識二次抗体、磁気ビーズ標識二次抗体、赤外標識二次抗体、標識抗ヒトＩｇＥ抗体、標識抗ヒトＩｇＧ抗体、標識抗ヒトＩｇＡ抗体、標識抗ヒトＩｇＭ抗体や、標識抗アレルゲン抗体を好適に挙げることができる。上記二次抗体としては、抗体のＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片等も使用することができ、Ｆａｂ断片は抗体をパパイン等で処理することにより、Ｆ（ａｂ’）２断片はペプシン等で処理することにより調製することができる。 When the surface-supported substrate of the present invention in which a protein or peptide is immobilized on the surface-treated support of the present invention and then subjected to blocking treatment is used, for example, allergen epitopes can be advantageously determined by immunoassay. it can. As such an immunoassay, a known immunoassay capable of detecting an allergen-recognizing antibody in a sample captured on the surface-supporting substrate of the present invention can be used, and an ELISA using a labeled secondary antibody is preferable. As the labeled secondary antibody, fluorescently labeled secondary antibodies such as Cy3, Alexa Fluor 555, Cy5, FITC, rhodamine, enzyme-labeled secondary antibodies such as peroxidase, alkaline phosphatase, magnetic bead-labeled secondary antibody, infrared-labeled secondary antibody Preferred examples include antibodies, labeled anti-human IgE antibodies, labeled anti-human IgG antibodies, labeled anti-human IgA antibodies, labeled anti-human IgM antibodies, and labeled anti-allergen antibodies. As the secondary antibody, Fab fragment or F (ab ') antibody 2 fragments and the like can also be used, by Fab fragments treating antibody with papain or the like, F (ab') 2 fragments such as pepsin It can prepare by processing with.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.
（１）基板の活性化処理
シリカガラスを公知の方法（例えば特許文献３等）にしたがって、ガラス表面にポリアクリル酸による負の電荷を帯びるカルボキシル基を導入した上記表面担持基板、あるいは市販品では例えば東洋鋼鈑株式会社より購入した基板（ジーンスライド（登録商標））は、活性エステル化したカルボキシル基が導入されており、かかる基板を化学架橋剤（１００ｍＭ ＷＳＣ・ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮＨＳ、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０））中で、遮光した状態で室温にて３０分間振盪しながら再活性化処理を行った。反応後の化学架橋剤を廃棄後、基板をＭｉｌｌｉＱ水で振盪しながら１分間の洗浄を２回行った後、直ちに卓上遠心機（ＡｌｌｅｇｒａＴＭ Ｘ−２２Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｒ， Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて水分を除去し、活性化基板１を調製した。
(1) Substrate activation treatment In the above-mentioned surface-supported substrate in which silica glass is introduced into the glass surface according to a known method (for example, Patent Document 3), a carboxyl group having a negative charge due to polyacrylic acid is introduced, or a commercial product. For example, a substrate (Gene Slide (registered trademark)) purchased from Toyo Kohan Co., Ltd. has an active esterified carboxyl group introduced, and this substrate is treated with a chemical crosslinking agent (100 mM WSC · HCl, 100 mM NHS, 0.1M). In potassium phosphate buffer (pH 6.0), reactivation treatment was performed while shaking for 30 minutes at room temperature in a light-shielded state. After discarding the chemical cross-linking agent after the reaction, the substrate was washed twice for 1 minute while shaking with MilliQ water, and then immediately using a desktop centrifuge (Allegra ™ X-22R Centrifuger, manufactured by Beckman Coulter) Then, the activated substrate 1 was prepared.
（２）シリコーン表面処理
シリコーンポリアルキル：（Ｃ１〜２０）シロキサン(ＣＡＳ ６３１４８−６２−９)（Ａ１２７２８ １００％、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ社製）をＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、０．０００１％、０．００１％、０．０１％及び０．１％のシリコーン水溶液を作製した。上記活性化基板１を上記各濃度のシリコーン水溶液に入れ、ソニケーター（ＵＳ−２：エスエヌディ社製）を用いて超音波処理を行いながら、１０分間シリコーン表面処理を行った。シリコーン表面処理後の基板をＭｉｌｌｉＱ水で振盪しながら１分間の洗浄を２回行った後、直ちに卓上遠心機を用いて水分を除去し、濃度の異なるシリコーン水溶液にて表面処理された各基板を、表面処理支持体シリーズ１として調製した。なお、上記Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ社製シリコーンの原液の吸光度は、１１００ｎｍ＝０．２９５、２１５ｎｍ＝０．８４７であった。
(2) Silicone surface treatment Silicone polyalkyl: (C1-20) siloxane (CAS 63148-62-9) (A12728 100%, manufactured by Alfa Aesar) dissolved in MilliQ water, 0.0001%, 0.001% 0.01% and 0.1% aqueous silicone solutions were prepared. The activated substrate 1 was placed in the aqueous silicone solution of each concentration described above, and a silicone surface treatment was performed for 10 minutes while performing ultrasonic treatment using a sonicator (US-2: manufactured by SND). The substrate after the silicone surface treatment was washed twice for 1 minute while shaking with MilliQ water, and then immediately removed moisture using a tabletop centrifuge, and each substrate surface-treated with a different aqueous silicone solution was removed. The surface treatment support series 1 was prepared. The absorbance of the Alfa Aesar silicone stock solution was 1100 nm = 0.295 and 215 nm = 0.847.
（３）乾燥処理
上記表面処理支持体シリーズ１の各基板について、ドライオーブンを用い１２０℃にて３時間乾燥させることにより、表面処理支持体乾燥シリーズ１として作製した。
(3) Drying treatment Each substrate of the surface treatment support series 1 was produced as a surface treatment support dry series 1 by drying at 120 ° C. for 3 hours using a dry oven.
（４）固定化処理
上記表面処理支持体乾燥シリーズ１の各支持体に、スポッティングレイアウト用のシール（スワショーテクノ社製）を貼り、それぞれのスポッティング領域枠を設定した。それぞれの支持体に５０、１００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００及び２００００ＩＵ／ｍＬの各非特異的ヒトＩｇＥ（カタログ番号２５０２０５、Ａｂｂｉｏｔｅｃ社製）を１スポット当たり４．４ｎＬをマイクロアレイ用スポッター（OmniGrid Accent：ＤＩＧＩＬＡＢ社製）を使用してスポッティングし、スポッティング後２５℃にて３時間インキュベーションしてＩｇＥ固定化基板を調製した。スポッティング溶液には、最終濃度０．１Ｍ N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid（ＣＡＰＳ）ｐＨ１０．０の緩衝液と、１０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をスポッティング溶液添加剤として加えた。また、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）標識牛アルブミン（ＢＳＡ）抗原（２．５μｇ/ｍＬ）４．４ｎＬについても、１０％ＰＥＧと０．１ＭＣＡＰＳを加え、上記同様マイクロアレイ用スポッターを使用して、上記ＩｇＥ固定化基板上の図２の（ｅ）に示される標識牛アルブミンのスポッティング箇所（ＢＳＡ）にスポッティングを行い、スポッティング後２５℃にて３時間インキュベーションした。なお、標識牛アルブミンのスポッティングは、以下の実施例２〜４においても同様に行った。
(4) Immobilization treatment A sticker for spotting layout (manufactured by Swatho Techno Co., Ltd.) was applied to each support of the surface treatment support drying series 1 to set each spotting area frame. On each support, 50, 100, 500, 1000, 2000, 5000, 10000 and 20000 IU / mL of non-specific human IgE (catalog number 250205, manufactured by Abbiotec), 4.4 nL per spot, spotter for microarray (EmniGrid Accent: manufactured by DIGILAB) was used for spotting, and after spotting, incubation was performed at 25 ° C. for 3 hours to prepare an IgE-immobilized substrate. To the spotting solution, a buffer solution having a final concentration of 0.1M N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid (CAPS) pH 10.0 and 10% polyethylene glycol (PEG) were added as a spotting solution additive. In addition, 4.4% of Alexa Fluor 555 (Life Technologies) -labeled bovine albumin (BSA) antigen (2.5 μg / mL) was added with 10% PEG and 0.1 MCAPS, and using the same microarray spotter as above. The spotted portion (BSA) of the labeled bovine albumin shown in FIG. 2 (e) on the IgE-immobilized substrate was spotted, and incubated at 25 ° C. for 3 hours after spotting. In addition, spotting of labeled bovine albumin was similarly performed in the following Examples 2 to 4.
上記ＩｇＥ固定化基板における残存する活性基を不活化するため、Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ（ＪＳＲ社製）を希釈せずに添加してブロッキング処理を行った。４℃にて一晩ブロッキング反応を行った後、ＭｉｌｌｉＱ水で１分間の洗浄を振盪しながら２回行うことによりブロッキング剤を洗浄後、上記卓上遠心機を用いて水分を除去し、表面担持基板シリーズ１として作製した。 In order to inactivate the remaining active groups in the IgE-immobilized substrate, Blockmaster (manufactured by JSR) was added without dilution to perform blocking treatment. After performing a blocking reaction overnight at 4 ° C., the blocking agent is washed by shaking twice for 1 minute with MilliQ water, and then the moisture is removed using the tabletop centrifuge. Produced as Series 1.
（５）二次抗体との反応処理
上記表面担持基板シリーズ１の各基板に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５で蛍光標識した１０μｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＥ抗体（ＨｙＴｅｓｔ社製）を二次抗体として２０μＬ添加し、３７℃にて標識二次抗体との反応を２時間行った。標識二次抗体との反応後、０．５ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、０.１５Ｍの塩化ナトリウム、０．０５％（ｖ/ｖ） Ｔｗｅｅｎ−２０:ＴＴＢＳ ｐＨ７．５の混合液を用いて５分間の洗浄を２回行い、次いでＭｉｌｌｉＱ水を用いて、振盪しながら１分間の洗浄を３回行って標識二次抗体を洗浄後、卓上遠心機を用いて水分を除去した。なお、上記「（２）シリコーン表面処理」を行わなかった他は、実施例１の各工程に従い作製された基板をコントロール基板とした。蛍光スキャナー３Ｄ−Ｇｅｎｅ（東レ株式会社製）を用いて各々の蛍光画像を取得した結果を図２に示す。また、１５０個のスポッティングが可能なウェルが１２個設定されたスライドにおいて、１以上のスポットに滲みが生じていたウェルを１スポット形成不良ウェルとした場合の、スポット形成不良数を示したグラフを図３に示す。
(5) Reaction treatment with secondary antibody 20 μL of 10 μg / mL anti-human IgE antibody (manufactured by HyTest) labeled with Alexa Fluor 555 as a secondary antibody was added to each substrate of the above surface-supported substrate series 1; The reaction with the labeled secondary antibody was performed at 37 ° C. for 2 hours. After reaction with labeled secondary antibody, wash for 5 minutes with a mixture of 0.5 M Tris HCl, 0.15 M sodium chloride, 0.05% (v / v) Tween-20: TTBS pH 7.5 Then, using MilliQ water, washing for 1 minute with shaking was performed 3 times to wash the labeled secondary antibody, and then water was removed using a tabletop centrifuge. In addition, the board | substrate produced according to each process of Example 1 was made into the control board | substrate except not having performed said "(2) silicone surface treatment." The result of having acquired each fluorescence image using fluorescence scanner 3D-Gene (made by Toray Industries, Inc.) is shown in FIG. In addition, a graph showing the number of spot formation defects when a well in which one or more spots are blotted is a one-spot formation failure well in a slide in which 150 wells capable of spotting are set to 12 is provided. As shown in FIG.
（結果）
図２から明らかなとおり、シリコーン表面処理が施されていないコントロール基板では、標識二次抗体を介して蛍光画像を取得したＩｇＥ抗体のスポットの形状が崩れ、スポット形状をまったく維持することができなかった。０．０００１％のシリコーン溶液にて処理を行った表面処理支持体においては、滲むことなく、スポットの形状がおおむね良好に維持されたが、スポット形状が一部くずれたところがあった。一方、０．００１％及び０．０１％の濃度のシリコーン溶液にて処理を行った表面処理支持体にスポッティングを行った場合には、スポット形状を明確に維持することができた。かかる結果は、蛍光標識したＢＳＡの蛍光画像についても同様であった。また０．１％と０．１％を超えるシリコーン溶液にて処理を行った表面処理支持体では、スライド上にスポッティングレイアウト用シールを貼りにくい場合があった（データ示さず）。
(result)
As is clear from FIG. 2, in the control substrate not subjected to the silicone surface treatment, the spot shape of the IgE antibody obtained from the fluorescent image via the labeled secondary antibody collapses, and the spot shape cannot be maintained at all. It was. In the surface-treated support treated with a 0.0001% silicone solution, the spot shape was generally maintained well without bleeding, but the spot shape was partly broken. On the other hand, when spotting was performed on the surface-treated support treated with the 0.001% and 0.01% concentrations of the silicone solution, the spot shape could be clearly maintained. This result was the same for the fluorescent images of fluorescently labeled BSA. Further, in the case of a surface-treated support treated with a silicone solution exceeding 0.1% and 0.1%, it was difficult to attach a spotting layout seal on the slide (data not shown).
図３から明らかなとおり、シリコーン表面処理が施されていないコントロール基板と比較した場合、スポット形成不良率は、シリコーン濃度０．００１％において２０％未満となり、０．０１％においてスポット形成不良数がゼロとなる良好な結果が得られた。 As is apparent from FIG. 3, when compared with a control substrate not subjected to silicone surface treatment, the spot formation failure rate is less than 20% at a silicone concentration of 0.001%, and the number of spot formation failures is 0.01%. Good results were obtained that were zero.
なお、ＩｇＥは、５０、１００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００及び２００００ＩＵ／μＬと異なる濃度のＩｇＥ溶液をスポッティングしたが、いずれのスポッティング濃度においても検出可能で蛍光強度は定量的に変化した。 In addition, although IgE spotted an IgE solution having a concentration different from 50, 100, 500, 1000, 2000, 5000, 10000 and 20000 IU / μL, it was detectable at any spotting concentration and the fluorescence intensity changed quantitatively. .
（活性化処理における条件の検討）
（１）基板の活性化処理
市販のジーンスライド（登録商標）の再活性化において、化学架橋剤に含まれる緩衝液の適用可能なｐＨの範囲を検討した。検討に用いたアミノ基を含まない８種類の緩衝液は以下のとおりである。
１）０．１Ｍの酢酸緩衝液ｐＨ３．０
２）０．１Ｍの酢酸緩衝液ｐＨ４．０
３）０．１Ｍの酢酸緩衝液ｐＨ５．０
４）０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０
５）０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
６）０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８．０
７）０．１Ｍの炭酸緩衝液ｐＨ９．０
８）０．１Ｍの炭酸緩衝液ｐＨ１０．０
上記８種類の緩衝液を各化学架橋剤に用いたほかは、実施例１の「（１）基板の活性化処理」と同様の処理を行うことにより、上記８種類の緩衝液を用いた各基板を活性化基板シリーズ２として調製した。
(Examination of conditions for activation treatment)
(1) Substrate activation treatment In the reactivation of a commercially available Gene Slide (registered trademark), the applicable pH range of the buffer contained in the chemical crosslinking agent was examined. The eight types of buffer solutions that do not contain amino groups used in the study are as follows.
1) 0.1 M acetate buffer pH 3.0
2) 0.1 M acetate buffer pH 4.0
3) 0.1 M acetate buffer pH 5.0
4) 0.1M potassium phosphate buffer pH 6.0
5) 0.1M potassium phosphate buffer pH 7.0
6) 0.1M potassium phosphate buffer pH 8.0
7) 0.1M carbonate buffer pH 9.0
8) 0.1M carbonate buffer pH 10.0
Except for using the above 8 types of buffer solutions for each chemical cross-linking agent, each of the above 8 types of buffer solutions was used by performing the same process as “(1) Substrate activation process” in Example 1. The substrate was prepared as activated substrate series 2.
（２）シリコーン表面処理
上記８種類の活性化基板シリーズ２について、０．０１％のシリコーン水溶液のみを用いて、シリコーン表面処理を行ったほかは、実施例１の「（２）シリコーン表面処理」と同様の処理を行うことにより、各活性化基板を表面処理支持体シリーズ２として調製した。
(2) Silicone surface treatment “(2) Silicone surface treatment” in Example 1 except that the above-mentioned eight types of activated substrate series 2 were subjected to silicone surface treatment using only 0.01% silicone aqueous solution. Each activated substrate was prepared as a surface-treated support series 2 by performing the same treatment as described above.
（３）乾燥処理
上記表面処理支持体シリーズ２の各支持体について、実施例１の「（３）乾燥処理」と同様の処理を行うことにより、各支持体を表面処理支持体乾燥シリーズ２として調製した。
(3) Drying treatment Each support in the surface treatment support series 2 is subjected to the same treatment as “(3) Drying treatment” in Example 1 to make each support a surface treatment support drying series 2. Prepared.
（４）固定化処理
上記表面処理支持体乾燥シリーズ２の各支持体について、ヒトＩｇＥ１００００ＩＵ／ｍＬをスポッティングしたほかは、実施例１の「（４）スポッティング処理」と同様の処理を行うことにより、各支持体を表面担持基板シリーズ２として作製した。
(4) Immobilization treatment For each support of the above-mentioned surface treatment support dry series 2, by performing the same treatment as “(4) Spotting treatment” in Example 1, except that human IgE10000IU / mL was spotted, Each support was produced as a surface-supporting substrate series 2.
（５）二次抗体との反応処理
上記表面担持基板シリーズ２の各基板について、実施例１の「（５）二次抗体との反応処理」と同様の処理を行い、蛍光画像を取得し蛍光強度を測定した。結果を図４のグラフに示す。
(5) Reaction treatment with secondary antibody Each substrate of the surface-supported substrate series 2 is subjected to the same treatment as “(5) Reaction treatment with secondary antibody” in Example 1 to obtain a fluorescence image and obtain fluorescence. The strength was measured. The results are shown in the graph of FIG.
（結果）
図４から明らかなとおり、０．１Ｍの酢酸緩衝液（図４ａ）（ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ５．０）、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（図４ｂ）（ｐＨ６．０、ｐＨ７．０とｐＨ８．０）における蛍光強度の相違は特になかった。しかし、０．１Ｍの炭酸緩衝液（図４ｃ）（ｐＨ９．０、ｐＨ１０．０）では蛍光強度が減少する傾向を示した。以上から、化学架橋剤における緩衝液の種類は特に限定されず、ｐＨ３．０〜ｐＨ８．０の範囲であれば使用可能であると判断した。
(result)
As is clear from FIG. 4, 0.1M acetate buffer (FIG. 4a) (pH 3.0, pH 4.0, pH 5.0), 0.1M potassium phosphate buffer (FIG. 4b) (pH 6.0, There was no particular difference in fluorescence intensity between pH 7.0 and pH 8.0). However, the fluorescence intensity decreased with 0.1 M carbonate buffer (FIG. 4c) (pH 9.0, pH 10.0). From the above, the type of the buffer solution in the chemical crosslinking agent is not particularly limited, and it was determined that the buffer solution can be used in the range of pH 3.0 to pH 8.0.
（乾燥処理条件の検討）
（１）基板の活性化処理
実施例１の「（１）基板の活性化処理」と同様の処理を行うことにより、活性化基板シリーズ３として調製した。
(Examination of drying treatment conditions)
(1) Substrate Activation Process By performing the same process as “(1) Substrate activation process” in Example 1, an activated substrate series 3 was prepared.
（２）シリコーン表面処理
上記活性化基板シリーズ３について、０．０１％のシリコーン水溶液を用いて、シリコーン表面処理を行ったほかは、実施例１の「（２）シリコーン表面処理」と同様の処理を行うことにより、表面処理支持体シリーズ３を調製した。
(2) Silicone surface treatment The same treatment as that of "(2) Silicone surface treatment" in Example 1 except that the activated substrate series 3 was subjected to a silicone surface treatment using a 0.01% aqueous silicone solution. The surface treatment support series 3 was prepared by carrying out
（３）乾燥処理
上記表面処理支持体シリーズ３について、ドライオーブンを用いて３７℃、１２０℃、１５０℃又は１８０℃にて３時間乾燥させることにより、乾燥処理温度の異なる４種類の支持体を表面処理支持体乾燥シリーズ３として調製した。
(3) Drying treatment For the surface treatment support series 3 described above, four types of supports having different drying treatment temperatures were obtained by drying at 37 ° C., 120 ° C., 150 ° C. or 180 ° C. for 3 hours using a dry oven. It was prepared as surface treatment support dry series 3.
（４）固定化処理
上記表面処理支持体乾燥シリーズ３の各支持体について、実施例１の「（４）固定化処理」と同様の処理を行うことにより、各支持体を表面担持基板シリーズ３として作製した。
(4) Immobilization treatment Each support in the above-mentioned surface treatment support drying series 3 is subjected to the same treatment as “(4) immobilization treatment” in Example 1 to thereby convert each support into the surface-supporting substrate series 3. As produced.
（５）二次抗体との反応処理
上記表面担持基板シリーズ３の各基板について、実施例１の「（５）二次抗体との反応処理」と同様の処理を行い、蛍光画像を取得した。結果を図５及び図６に示す。
(5) Reaction treatment with secondary antibody Each substrate of the surface-supported substrate series 3 was subjected to the same treatment as “(5) Reaction treatment with secondary antibody” in Example 1 to obtain a fluorescence image. The results are shown in FIGS.
（結果）
図５及び図６から明らかなとおり、表面処理支持体シリーズ３の調製工程において、１８０℃にて乾燥を行った支持体は、全般的に蛍光強度が低下する傾向を示す一方、スポッティングしていない部分が示すバックグラウンド蛍光強度値が高くなり、スポットを明確に読み取ることが困難となった。１５０℃にて乾燥を行った支持体は調べた条件下においては最も顕著にスポットの蛍光強度が強くなった。３７℃〜１２０℃にて乾燥を行った場合は、バックグラウンド蛍光強度値は乾燥温度の変更による変化は特になかった。またＩｇＥ抗体と蛍光標識牛アルブミン（ＢＳＡ）抗原の蛍光強度は、３７℃〜１５０℃の条件下で大きな変化はなかった。
(result)
As is apparent from FIGS. 5 and 6, the support dried at 180 ° C. in the preparation process of the surface treatment support series 3 generally shows a tendency that the fluorescence intensity decreases, but is not spotted. The background fluorescence intensity value indicated by the portion was increased, making it difficult to read the spot clearly. The support dried at 150 ° C. showed the most remarkable increase in spot fluorescence intensity under the conditions examined. When drying was performed at 37 ° C. to 120 ° C., the background fluorescence intensity value was not particularly changed by changing the drying temperature. Further, the fluorescence intensity of the IgE antibody and the fluorescently labeled bovine albumin (BSA) antigen was not significantly changed under the conditions of 37 ° C to 150 ° C.
（再活性化処理効果の検討）
市販の活性化されたジーンスライド（東洋鋼鈑社製）を購入した場合に、再活性化した基板と再活性化しない基板について、基板へのＩｇＥ抗体(５０〜２０，０００ＩＵ／ｍＬ)の結合量を検討した。
(Examination of reactivation treatment effect)
Binding of IgE antibody (50 to 20,000 IU / mL) to the substrate when the activated gene slide (manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.) is purchased and the substrate is reactivated and not reactivated. The amount was examined.
［市販の活性化静電層基板を再活性化したシリコーン表面処理支持体の作製］
市販の活性化ジーンスライド（東洋鋼鈑社製）は、実施例１の「（１）基板の活性化処理」と同様の処理を行うことにより再活性化した。その後、実施例１に記載されている「（２）シリコーン表面処理」において、０．０１％のシリコーン水溶液を用いてシリコーン表面処理を行い、引き続いて「（３）乾燥処理」、「（４）固定化処理」に供されることにより、再活性化基表面処理支持体（支持体Ａ）が作製された。
[Production of Silicone Surface Treatment Support Reactivated Commercially Available Activated Electrostatic Layer Substrate]
A commercial activated gene slide (manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.) was reactivated by performing the same treatment as “(1) substrate activation treatment” in Example 1. Thereafter, in “(2) Silicone surface treatment” described in Example 1, a silicone surface treatment was performed using a 0.01% silicone aqueous solution, followed by “(3) Drying treatment”, “(4) By being subjected to “immobilization treatment”, a reactivation group surface treatment support (support A) was produced.
［市販の活性化静電層基板を再活性化しないシリコーン表面処理支持体の作製］
市販の活性化ジーンスライドを、実施例１の「（１）静電層基板の活性化処理」を行うことなしに「（２）シリコーン表面処理」において、０．０１％のシリコーン水溶液を用いてシリコーン表面処理を行い、引き続いて実施例１に記載されている「（３）乾燥処理」及び「（４）固定化処理」に供されることにより、非再活性化表面処理支持体（支持体Ｂ）が作製された。
[Production of Silicone Surface Treatment Support that Does Not Reactivate Commercially Activated Electrostatic Layer Substrate]
A commercially available activated gene slide was subjected to “(2) silicone surface treatment” in Example 1 without performing “(1) activation treatment of electrostatic layer substrate” in Example 1 using a 0.01% silicone aqueous solution. Non-reactivatable surface treatment support (support) by performing silicone surface treatment and subsequently subjecting to “(3) drying treatment” and “(4) immobilization treatment” described in Example 1 B) was produced.
シリカガラスを公知の方法（例えば特許文献３等）にしたがって、ガラス表面にポリアクリル酸による負の電荷を帯びるカルボキシル基を導入した上記表面担持基板を、シリーズ１のうち「（２）シリコーン表面処理」において、０．０１％のシリコーン水溶液を用いてシリコーン表面処理を行った支持体をコントロール支持体とした。 According to a known method (for example, Patent Document 3), the above-mentioned surface-supported substrate in which a carboxyl group having a negative charge due to polyacrylic acid is introduced into the glass surface is used as the “(2) silicone surface treatment in series 1”. In Example 1, a support having been subjected to silicone surface treatment using a 0.01% aqueous silicone solution was used as a control support.
上記支持体ＡとＢ及びコントロール支持体について実施例１の「（５）二次抗体との反応処理」と同様の処理を行った。５０、１００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００及び２００００ＩＵ／ｍＬの非特異的ヒトＩｇＥをスポッティングした場合の各表面担持基板の蛍光値を図７のグラフに示す。 The support A and B and the control support were subjected to the same treatment as “(5) Reaction treatment with secondary antibody” in Example 1. The fluorescence value of each surface-supported substrate when spotting 50, 100, 500, 1000, 2000, 5000, 10000 and 20000 IU / mL non-specific human IgE is shown in the graph of FIG.
（結果）
図７より明らかなとおり、市販の活性化処理済み静電層基板を再活性化処理した支持体Ａは、スポットされた各濃度のＩｇＥに応じて、コントロール支持体と同程度のＩｇＥ抗体の結合量（蛍光量）を示したが、市販の活性化処理済み静電層基板を再活性化せずに、シリコーン表面処理を行った支持体Ｂは、ＩｇＥ抗体の基板への結合量が顕著に減少していた。なおスポットされた各濃度のＩｇＥは定量的に固定化されていた。
(result)
As is clear from FIG. 7, the support A obtained by reactivating the commercially available electrostatic layer substrate having been subjected to the activation treatment binds IgE antibodies to the same degree as the control support according to the spotted concentrations of IgE. Although the amount of the fluorescence (amount of fluorescence) was shown, the support B that had been subjected to silicone surface treatment without reactivating the commercially available activated electrostatic layer substrate had a significant amount of IgE antibody bound to the substrate. It was decreasing. The spotted IgE at each concentration was quantitatively immobilized.
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