JP2017083461A - Conjugation reactions - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method of producing a reagent for use in conjugation reactions between a reactant containing a carboxyl group or phosphate group (particularly a phosphate (V) group) and a reactant containing an amine group.SOLUTION: A method comprises a) forming a solution or suspension of i) a carboxyl-activating or phosphate-activating non-enzymatic substance capable of acting on a carboxyl group- or phosphate group-containing moiety to facilitate the formation of an amide bond between a carboxyl group and an amine group or a phosphoramidate bond between a phosphate group and an amine group, and ii) a first reactant or a second reactant; and b) drying the solution or suspension.SELECTED DRAWING: None

Description

発明の分野
この発明は、カルボキシル基またはリン酸基（特にリン酸（Ｖ）基）を含む反応物と、アミン基を含む反応物との間の共役反応に関し、このような反応において用いられる試薬に関する。 FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a conjugation reaction between a reactant containing a carboxyl group or a phosphate group (particularly a phosphate (V) group) and a reactant containing an amine group, and a reagent used in such a reaction. About.

発明の背景
ゼロ長架橋剤として作用するカルボジイミド（Ｒ_１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ_２）のようなカルボキシル基活性化試薬を用いて、カルボキシル基を含む反応物とアミン基を含む反応物とを共役させる方法が公知である。 BACKGROUND OF THE INVENTION A carboxyl group-activating reagent such as a carbodiimide (R ₁ N═C═NR ₂ ) that acts as a zero-length crosslinker is used to conjugate a reactant containing a carboxyl group with a reactant containing an amine group. Methods are known.

カルボキシル基とのカルボジイミドの反応は最も重要なものの１つである。この反応は、親和性クロマトグラフィーのための保持体を含むさまざまな表面への分子または生体分子の結合に用いられ、側方流動試験または凝集分析に用いられるラテックス微粒子を変性するために用いられ、かつ表面プラズモン共鳴を用いて分子の相互作用を観察するためにチップ表面を変性するために用いられる。カルボジイミドはさらに、タンパク質中のカルボキシルを定量化するよう用いられており、抗原／検体を担体タンパク質に共有結合により結合させて免疫原性を高めるために用いられる。   The reaction of carbodiimide with a carboxyl group is one of the most important. This reaction is used to bind molecules or biomolecules to various surfaces, including a support for affinity chromatography, and is used to denature latex microparticles used for lateral flow testing or agglutination analysis, It is also used to modify the chip surface to observe molecular interactions using surface plasmon resonance. Carbodiimides are further used to quantify carboxyls in proteins and are used to enhance the immunogenicity by covalently binding an antigen / analyte to a carrier protein.

カルボキシル基とのカルボジイミドの反応は、アミンとさらに反応してアミドを形成し得る非常に不安定なｏ−アシルイソ尿素を生成する。アミノ基が存在しない状態では、ｏ−アシルイソ尿素は、他の酸分子と反応して無水物を形成するか、または分子内でのＯからＮへのアシル再配列が行われて安定したＮ−アシル尿素を形成するかのいずれかである。水溶液（有機溶媒中ではない）において、ｏ−アシルイソ尿素は水によって急速に加水分解され（〜５５Ｍの濃度）、オリジナルのカルボキシル基を再生し、カルボジイミドを反応性の低い置換された尿素に変換する。水分子との競合により、アミンの前駆物質が高濃度で存在しなければ、アミンがアミドを形成するよう反応するのは難しくなり得る。最終的には、カルボキシル基が存在しない状態では、カルボジイミドはアミンと反応してグアニジンを形成し得る。   Reaction of the carbodiimide with a carboxyl group produces a very unstable o-acylisourea that can be further reacted with an amine to form an amide. In the absence of an amino group, o-acylisourea reacts with other acid molecules to form anhydrides, or an intramolecular O to N acyl rearrangement occurs to stabilize the N- Either form an acylurea. In aqueous solution (not in organic solvent), o-acylisourea is rapidly hydrolyzed by water (concentration ˜55M) to regenerate the original carboxyl group and convert carbodiimide to less reactive substituted urea. . Competition with water molecules can make it difficult for amines to react to form amides if amine precursors are not present in high concentrations. Ultimately, in the absence of a carboxyl group, carbodiimide can react with an amine to form guanidine.

カルボジイミドの主な適用の１つとしてはバイオコンジュゲーションの分野がある。バイオコンジュゲーションによって、１つの実体（たとえばタンパク質、微粒子、またはチップ表面）上のカルボキシル官能基が活性化され、次いでしばしばタンパク質もしくはペプチドまたは検体である別の実体上のアミン基と反応して、アミド結合された複合体を形成する。典型的には、このような反応において、カルボン酸の実体は、ｐＨ４〜ｐＨ６の緩衝液において、アミノ化した分子と接触し、共役反応を開始するよう水溶性カルボジイミドが加えられる。   One of the main applications of carbodiimide is in the field of bioconjugation. Bioconjugation activates the carboxyl functionality on one entity (eg, a protein, microparticle, or chip surface) and then reacts with an amine group on another entity, often a protein or peptide or analyte, to form an amide Form a bound complex. Typically, in such a reaction, the carboxylic acid entity is contacted with the aminated molecule in a pH 4-6 buffer and a water soluble carbodiimide is added to initiate the coupling reaction.

有機溶媒において行われる反応（たとえばペプチドの合成）は通常、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはΝ，Ν´−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）といった疎水性のカルボジイミドを用いる。しかしながら、生体分子を伴う反応は通常、水性条件または実質的に水溶液を必要とする。これらの状況において、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ；ＥＤＡＣともいう）またはＮ−シクロヘキシル−Ｎ´−（β−［Ｎ−メチルモルホリノ］エチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）といった水溶性カルボジイミドが好ましい。   Reactions carried out in organic solvents (for example, peptide synthesis) usually use hydrophobic carbodiimides such as dicyclohexylcarbodiimide (DCC) or Ν, Ν′-diisopropylcarbodiimide (DIC). However, reactions involving biomolecules usually require aqueous conditions or substantially aqueous solutions. In these situations, such as 1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide (EDC; also referred to as EDAC) or N-cyclohexyl-N ′-(β- [N-methylmorpholino] ethyl) carbodiimide (CMC) Water-soluble carbodiimide is preferred.

（たとえば可溶性の限界または高コストにより）十分に高濃度のアミンを達成することが可能でない場合、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を加えて上記の非常に不安定なｏ−アシルイソ尿素中間体を、アミンと反応しやすいより安定したスクシンイミジル（または「ＮＨＳ」）エステルに変換することにより、共役反応の効率を増加させることが可能であり得る（Staros et. al., Anal. Biochem., 156, 220-222, 1986）。ＮＨＳは、非常に反応を加速し得るとともに、いくつかの生体分子の制御されない架橋を引き起こすので、ＮＨＳについての必要性は、ケースバイケースの態様で判断されなければならない。   If it is not possible to achieve a sufficiently high concentration of amine (eg due to solubility limitations or high cost), N-hydroxysuccinimide (NHS) can be added to replace the very unstable o-acylisourea intermediate described above. It may be possible to increase the efficiency of the conjugation reaction by converting to a more stable succinimidyl (or “NHS”) ester that is reactive with amines (Staros et. Al., Anal. Biochem., 156, 220 -222, 1986). Since NHS can greatly accelerate the reaction and cause uncontrolled cross-linking of some biomolecules, the need for NHS must be judged on a case-by-case basis.

カルボキシル基とのＥＤＣの反応は、ｐＨ３．５〜４．５で最も効果的である（Nakajima and Ikada, Bonconjugate Chem. 6, p123-130, 1995）。ＥＤＣが媒介するアミド結合の形成のためのｐＨ最適値は、しばしばそれよりも若干高く、通常ｐＨ４とｐＨ６との間である。この最適値は、ｏ−アシルイソ尿素の形成および加水分解速度と、アミン求核剤のｐＫａとを含む多くの要因のバランスを反映しており、ｏ−アシルイソ尿素中間体が優先的に形成されるｐＨよりも実質的に上であり得る。   The reaction of EDC with a carboxyl group is most effective at pH 3.5-4.5 (Nakajima and Ikada, Bonconjugate Chem. 6, p123-130, 1995). The pH optimum for amide bond formation mediated by EDC is often slightly higher, usually between pH 4 and pH 6. This optimal value reflects the balance of many factors including the formation and hydrolysis rate of o-acylisourea and the pKa of the amine nucleophile, with the o-acylisourea intermediate being preferentially formed. It can be substantially above the pH.

カルボキシル基の存在しない状態でのＥＤＣとのアミンの起こり得る反応に鑑みて、アミド結合を形成することを目的にした場合、アミンは、カルボキシル化された種の添加の前にＥＤＣと通常は接触されない。しかしながら、新たに調製されたＥＤＣを、アミン基含有物質およびカルボキシル基含有物質の両方を含む溶液に加えることは一般的である。このような反応混合物は、カルボジイミドまたはｏ−アシルイソ尿素中間体と反応し得る官能基を有する他の成分が存在しないのが理想的である。   In view of the possible reaction of amines with EDC in the absence of carboxyl groups, amines are usually contacted with EDC prior to the addition of carboxylated species when aimed at forming amide bonds. Not. However, it is common to add freshly prepared EDC to a solution containing both an amine group containing material and a carboxyl group containing material. Ideally, such reaction mixtures are free of other components having functional groups that can react with the carbodiimide or o-acylisourea intermediate.

リン酸基とアミンとの間のカルボジイミドを媒介とする縮合反応における反応効率を増加させる類似したアプローチとしては、メチルイミダゾールを安定剤として用いることである。   A similar approach to increase the reaction efficiency in a carbodiimide-mediated condensation reaction between a phosphate group and an amine is to use methylimidazole as a stabilizer.

カルボジイミドは一般的に水溶液において不安定であると考えられる。
たとえば、ＥＤＣは非常に変化しやすい分子として広く特徴付けられており、新たに調製されたＥＤＣの溶液をバイオコンジュゲーション反応において用いることの必要性について多くの警告的な注意が先行技術において存在する。 Carbodiimides are generally considered unstable in aqueous solutions.
For example, EDC is widely characterized as a highly variable molecule, and there is much warning in the prior art about the need to use freshly prepared solutions of EDC in bioconjugation reactions .

たとえば、Bioconjugate Techniques (GT Hermanson 1996; ISBN 0-12-342335-x; p170)には、「…活性の大規模な損失を防止するために、ストック溶液は迅速に溶解されかつ直ちに用いられるべきである」と述べられている。   For example, Bioconjugate Techniques (GT Hermanson 1996; ISBN 0-12-342335-x; p170) states that “… stock solutions should be rapidly dissolved and used immediately to prevent extensive loss of activity. There is.

より最近の版のBioconjugate Techniques (2008)には、「ＥＤＣは、水の環境では不安定であり、溶液が作られた後すぐに用いられるべきである(GT Hermanson 2008; ISBN 978-0-12-370501-3, p688)」と述べられている。   A more recent version of Bioconjugate Techniques (2008) states that “EDC is unstable in a water environment and should be used immediately after the solution is made (GT Hermanson 2008; ISBN 978-0-12). -370501-3, p688) ”.

カルボキシルＳｉＭＡＧ磁気微粒子の共役のための手順において、製造者のChemicell GmbHは、手順書Ａ１において、「新たに調製されたＥＤＣのみを粒子に添加する…（下線を引いた文言は、オリジナルの手順書では太字で示された部分）」とアドバイスしている。 In the procedure for conjugation of carboxyl SiMAG magnetic fine particles, the manufacturer Chemicell GmbH stated in the procedure manual A1 that “only newly prepared EDC is added to the particle ... (the underlined wording is the original procedure manual). Then, the part shown in bold)).

Carboxylink gel（Pierce社；製品コード２０２６６）の手順書には、「注意：ＥＤＣは、水分に敏感であり、水性緩衝液に溶解されると迅速に加水分解し…使用の前に必要な量の試薬を迅速かつ直ちに溶解し、使用されない溶液は破棄すること。」と述べられている。   The procedure for Carboxylink gel (Pierce; product code 20266) states: “Caution: EDC is sensitive to moisture and hydrolyzes quickly when dissolved in aqueous buffer… in the required amount before use. Dissolve the reagents quickly and immediately, and discard unused solutions. "

Sigma-Aldrich社の製品情報（ＥＤＣ；製品コードＥ７７５０）では、「この製品は水溶性であるが、安定ではない。使用の直前に新たな溶液を調整することが推奨される。」と述べられている。   Sigma-Aldrich product information (EDC; product code E7750) states that "This product is water soluble but not stable. It is recommended to prepare a fresh solution just before use." ing.

Nanopartz GmbHは、カルボキシルポリマー球状金ナノ粒子コンジュゲーションキットの正しい使用の説明において、「必要な量のＥＤＣのみを用いること。ひとたび水に溶解されると、ＥＤＣの寿命は１時間未満である。」と述べている。   Nanopartz GmbH explained in the correct use of the carboxyl polymer spherical gold nanoparticle conjugation kit: “Use only the required amount of EDC. Once dissolved in water, the lifetime of EDC is less than 1 hour.” It has said.

微粒子の別のサプライヤ（Seradyn社）は、「推奨される吸着および共有結合の手順」（１９９９）において、「なおＥＤＡＣは水分に非常に敏感であり、水溶液において迅速に加水分解する。」と述べている。   Another supplier of microparticles (Seradyn) stated in the “Recommended Adsorption and Covalent Procedure” (1999) that “EDAC is very sensitive to moisture and hydrolyzes quickly in aqueous solutions”. ing.

ＥＤＣは、典型的に塩酸塩として商業サプライヤから得られ、慣例的に、通常−２０℃でガラス瓶内に粉末状で格納される。乾燥剤とともに格納し、かつ瓶内での結露を回避するよう開封前にストック瓶を室温と平衡させることは通常の慣例である。   EDC is typically obtained from commercial suppliers as the hydrochloride salt and is usually stored in powder form in a glass bottle, usually at -20 ° C. It is normal practice to store with a desiccant and equilibrate the stock bottle to room temperature before opening to avoid condensation in the bottle.

水環境におけるＥＤＣの安定性についてのいくつかの研究が存在する（Gilles et al., Anal. Biochem. 184, p244-248, [1990]; Nakajima and Ikada, Bioconjugate chemistry, 6, 123-130 [1995]; Williams and Ibrahim; J. Am. Chem. Soc. 103, 7090-7095 [1981]; Lei et al., Anal Biochem. 310, 122-124 [2002]）。これらの異なる実験設定は、データの直接的な比較を妨げているが、主な知見は以下のように要約され得る。   There are several studies on the stability of EDC in water environments (Gilles et al., Anal. Biochem. 184, p244-248, [1990]; Nakajima and Ikada, Bioconjugate chemistry, 6, 123-130 [1995] Williams and Ibrahim; J. Am. Chem. Soc. 103, 7090-7095 [1981]; Lei et al., Anal Biochem. 310, 122-124 [2002]). Although these different experimental settings prevent direct comparison of the data, the main findings can be summarized as follows.

ｐＨ７からｏ−アシルイソ尿素中間体の効率的な形成が行われる値（すなわち約ｐＨ４）までｐＨが減少すると、ＥＤＣの分解が増加する（Lei et al., Anal Biochem. 310, 122-124 [2002]）。酸が触媒する、対応する尿素へのＥＤＣの加水分解は、酸性媒質における損失についての主な経路である。確かに、ＥＤＣを伴う反応はＨＣｌで失活される場合がある。アルカリ性緩衝液においてＥＤＣの分解速度が低いことが観察された（Nakajima and Ikada; Bonconjugate Chem. 6, p123-130, 1995)が、Williams and Ibrahim (J. Am. Chem. Soc. 103, 7090-7095, 1981）では、水酸化ナトリウムが存在した状態では高速度の加水分解を記録した。   Decreasing the pH from pH 7 to a value at which efficient formation of an o-acylisourea intermediate occurs (ie, about pH 4) increases EDC degradation (Lei et al., Anal Biochem. 310, 122-124 [2002] ]). Acid catalyzed hydrolysis of EDC to the corresponding urea is the main pathway for loss in acidic media. Certainly, reactions involving EDC may be quenched with HCl. A low degradation rate of EDC in alkaline buffer was observed (Nakajima and Ikada; Bonconjugate Chem. 6, p123-130, 1995), but Williams and Ibrahim (J. Am. Chem. Soc. 103, 7090-7095). 1981) recorded a high rate of hydrolysis in the presence of sodium hydroxide.

Methods in Molecular Biology volume 394のサルモネラ法および手順書（SA Dunbar & J W Jacobsen; p15）では、「ＥＤＣは、水の存在する状態では変化しやすい。この活性種はわずか数秒の速度定数で水溶液において加水分解されるので、空気および水分へ晒すことを最小限にするよう注意が必要である。」という助言が与えられた。   According to the Salmonella Method and Procedures in Methods in Molecular Biology volume 394 (SA Dunbar & JW Jacobsen; p15), “EDC is prone to change in the presence of water. This active species is hydrolyzed in aqueous solution with a rate constant of only a few seconds. Care should be taken to minimize exposure to air and moisture as it will decompose, "advice was given.

水溶液におけるＥＤＣの加水分解は、カルボキシル基の存在によって非常に加速されることが知られている。カルボキシル基は、非常に不安定なｏ−アシルイソ尿素中間体の繰り返される形成および加水分解を伴うサイクリング反応を触媒する。トリカルボン酸（クエン酸）の存在下においてＥＤＣの損失の速度の１０００倍の増加がｐＨ４にて観察された（Wrobel et. al., Anal. Biochem. 305, 135-138 [2002]）。これらの著者はさらに、モノカルボン酸（酢酸塩）およびリン酸塩によってｐＨ４での著しい加速を示した。Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、およびＨＥＰＥＳを含むさまざまな緩衝液の触媒効果がさらに言及されている。しかしながら、これらの場合の触媒メカニズムは不明であった。   It is known that the hydrolysis of EDC in aqueous solution is greatly accelerated by the presence of carboxyl groups. The carboxyl group catalyzes a cycling reaction involving repeated formation and hydrolysis of a very labile o-acylisourea intermediate. A 1000-fold increase in the rate of EDC loss in the presence of tricarboxylic acid (citric acid) was observed at pH 4 (Wrobel et. Al., Anal. Biochem. 305, 135-138 [2002]). These authors also showed significant acceleration at pH 4 with monocarboxylic acids (acetates) and phosphates. Further mention is made of the catalytic effects of various buffers including Tris, MOPS, and HEPES. However, the catalyst mechanism in these cases was unknown.

不安定なｏ−リン酸イソ尿素（o-phosphoisourea)誘導体(Gilles et al., Anal. Biochem. 184, p244-248, [1990]）を介して発生すると考えられる無機リン酸塩を用いた場合およびアデノシン三リン酸を用いた場合でも、加速された分解が観察される。   When using inorganic phosphates that are thought to be generated via unstable o-phosphoisourea derivatives (Gilles et al., Anal. Biochem. 184, p244-248, [1990]) Even with adenosine triphosphate, accelerated degradation is observed.

（アミンをカルボン酸保持体またはポリマーに導入するよう、ＥＤＣが媒介する反応において広く用いられる）エチレンジアミンと、カルボキシルをブロック／定量するよう用いられるグリシンメチルエステルであるモノアミンとも、ＥＤＣの分解を加速させ得る（Gilles et al., Anal. Biochem. 184, p244-248, [1990]）。   Both ethylenediamine (which is widely used in EDC-mediated reactions to introduce amines into carboxylic acid supports or polymers) and monoamine, a glycine methyl ester used to block / quantify carboxyls, accelerate the degradation of EDC. (Gilles et al., Anal. Biochem. 184, p244-248, [1990]).

カルボジイミドの加水分解は、ＥＤＣに特有のものではない。たとえば、さまざまな添加物が存在する状態では、１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド（ＥＡＣ）は、ＥＤＣよりも急速なオーダで分解された（Gilles et al., Anal. Biochem. 184, 244-248, [1990]）。   The hydrolysis of carbodiimide is not unique to EDC. For example, in the presence of various additives, 1-ethyl-3- (4-azonia-4,4-dimethylpentyl) carbodiimide (EAC) was degraded on a more rapid order than EDC (Gilles et al , Anal. Biochem. 184, 244-248, [1990]).

ＥＤＣの安定性が欠如していること、ｏ−アシルイソ尿素中間体が加水分解に対して非常に敏感であること、バイオコンジュゲーション反応において一般的に用いられる物質（たとえばカルボキシル基）が存在した状態で分解が非常に加速することについての先行技術におけるさまざまな言及が、現代のＥＤＣコンジュゲーション手順書において暗黙的または明示的に認められる。   Lack of stability of EDC, o-acylisourea intermediate is very sensitive to hydrolysis, and the presence of substances commonly used in bioconjugation reactions (eg carboxyl groups) Various references in the prior art about the very rapid degradation in the process are found implicitly or explicitly in modern EDC conjugation procedures.

報告されたＥＤＣの不安定性および多カルボン酸による分解の加速は、たとえば相変化による反応物の時間間隔を用いる方法といったような、ＥＤＣを含有する乾燥混合物を作り出すためのいくつかの非常に細密な処置を形作ったことは確かである（米国特許第６，８０９，１８６号）。このアプローチにおいて、これらの反応物は、溶液を瞬間冷凍し、次いで、結果得られた層状の構造を凍結乾燥して乾燥製品を得ることにより順次組み合わさる。このアプローチは、複数の反応パラメータを最適化しようとする場合に非常に時間がかかるとともに、任意の商業用途に拡大するのは難しい。米国特許第６，８０９，１８６号の著者はさらに、「ほぼ中性のｐＨでのＥＤＡＣの短寿命…」に言及している。（第８欄の４７行目）。   The reported instability of EDC and acceleration of degradation by polycarboxylic acids has led to some very fine details for creating dry mixtures containing EDC, such as, for example, methods using reactant time intervals due to phase change. Certainly shaped the treatment (US Pat. No. 6,809,186). In this approach, these reactants are combined sequentially by flash freezing the solution and then lyophilizing the resulting layered structure to obtain a dry product. This approach is very time consuming when trying to optimize multiple reaction parameters and is difficult to scale to any commercial application. The author of US Pat. No. 6,809,186 further mentions “short life of EDAC at about neutral pH…”. (Line 47, line 47).

本発明者らは驚くべきことに、カルボジイミドのようなカルボキシル基活性化物質が、上記文献において繰り返し言及されるようには実際は不安定ではないといことを発見し、この発見を利用して、ＥＤＣのようなカルボキシル基活性化物質がカルボキシル基含有物質またはアミン基含有物質（たとえばタンパク質、小分子、微粒子）と容易に組み合わされて、さまざまな成分の有意な分解なしに凍結乾燥され得るとともにバイオコンジュゲーション反応において首尾よく用いられ得る均質溶液または懸濁液を形成する方法を開発した。   The present inventors have surprisingly discovered that carboxyl group activators such as carbodiimides are not actually unstable as repeatedly mentioned in the above literature, and using this finding, EDC Carboxyl group activators such as can be easily combined with carboxyl group containing substances or amine group containing substances (eg proteins, small molecules, microparticles) and lyophilized without significant degradation of various components and bioconjugates A method has been developed to form homogeneous solutions or suspensions that can be used successfully in gating reactions.

発明の概要 Summary of the Invention

一局面では、 本発明は、カルボキシル基またはリン酸基を含む第１の反応物と、アミン基を含む第２の反応物との間の共役反応での使用のための試薬を製造する方法を提供する。当該方法は、
ａ）ｉ）カルボキシル基含有部分またはリン酸基含有部分上に作用して、カルボキシル基とアミン基との間のアミド結合の形成を促進するか、またはリン酸基とアミン基との間のホスホロアミド酸結合の形成を促進することが可能なカルボキシル基活性化またはリン酸基活性化非酵素物質と、
ｉｉ）第１の反応物または第２の反応物との溶液または懸濁液を形成するステップと、 ｂ）上記溶液または上記懸濁液を乾燥するステップとを含む。 In one aspect, the present invention provides a method for producing a reagent for use in a conjugation reaction between a first reactant comprising a carboxyl group or a phosphate group and a second reactant comprising an amine group. provide. The method is
a) i) acts on a carboxyl group-containing moiety or a phosphate group-containing moiety to promote the formation of an amide bond between the carboxyl group and the amine group, or a phosphoramide between the phosphate group and the amine group A carboxyl group-activated or phosphate group-activated non-enzymatic substance capable of promoting the formation of acid bonds;
ii) forming a solution or suspension with the first or second reactant, and b) drying the solution or suspension.

カルボキシル基およびリン酸基への参照は、解離された形態または解離されていない形態のいずれかのこのような基をカバーする。当業者ならば一般的に、リン酸基は解離された形態にあると理解する一方、カルボキシル基の解離の状態または他の状態はｐＨによって変動すると理解するであろう。   References to carboxyl and phosphate groups cover such groups in either dissociated or non-dissociated form. One skilled in the art will generally understand that the phosphate group is in a dissociated form, while the dissociation state or other state of the carboxyl group will vary with pH.

以下により詳細に論じられるように、結果得られる試薬は、共役反応において有用であり、特にたとえば微粒子へタンパク質のような分子を結合するとともに免疫原の調製に用いられる生体分子との共役（バイオコンジュゲーション反応）に有用である。当該試薬は、溶液または懸濁液へと戻されることにより用いられ、第２の反応物または第１の反応物のいずれかと接触される（いずれも試薬中には存在しない）。第２もしくは第１の反応物の溶液を加えることによりこれは単一ステップで行われてもよいし、または複数のステップで行われてもよい（ステップの順番は一般的に重要ではない）。たとえば温度、ｐＨ（ｐＨは好ましくは８未満、７未満、または６未満）といった好適な反応条件が共役反応を発生させることが可能なように与えられ、第１の反応物および第２の反応物はともにアミド結合を介して結合される。典型的に、共役反応は、たとえば好適な失活剤試薬を加えることにより、好適な反応時間の後、停止されることになる。   As discussed in more detail below, the resulting reagents are useful in conjugation reactions, particularly conjugates with biomolecules that bind molecules such as proteins to microparticles and are used to prepare immunogens (bioconjugates). It is useful for (gation reaction). The reagent is used by returning it to a solution or suspension and is contacted with either the second reactant or the first reactant (neither is present in the reagent). By adding a solution of the second or first reactant, this may be done in a single step or in multiple steps (the order of the steps is generally not important). For example, suitable reaction conditions such as temperature, pH (preferably less than 8, less than 7, or less than 6) are provided so that a conjugation reaction can occur, the first reactant and the second reactant. Are linked via an amide bond. Typically, the coupling reaction will be stopped after a suitable reaction time, for example by adding a suitable quencher reagent.

ステップｂ）は好ましくはステップａ）の直後、たとえば約１時間以内、に適切に行われるが、これは必ずしも重要ではない。   Step b) is suitably performed immediately after step a), for example within about 1 hour, although this is not necessarily important.

カルボキシル基活性化物質またはリン酸基活性化物質（簡潔さのため、「活性化物質」と称することとする）と、第１または第２の反応物とは、溶液、好ましくは水溶液の形態で混合されるのが好ましい。   The carboxyl group activator or phosphate group activator (referred to as “activator” for brevity) and the first or second reactant are in the form of a solution, preferably an aqueous solution. It is preferable that they are mixed.

上記溶液または懸濁液は好ましくは均質である。
活性化物質は、当該技術において公知であり、カルボジイミド、ウッドワード試薬Ｋ（ＷＲＫ）、およびさまざまな他の材料を含む。 The solution or suspension is preferably homogeneous.
Activators are known in the art and include carbodiimide, Woodward reagent K (WRK), and various other materials.

活性化物質の選択は、反応混合物中の溶媒のタイプを考慮すべきである。水性条件または実質的に水性条件での反応の場合、水に少なくとも部分的に溶解可能な活性化物質が好ましい。   The choice of activator should take into account the type of solvent in the reaction mixture. For reactions in aqueous conditions or substantially aqueous conditions, activators that are at least partially soluble in water are preferred.

本発明での使用に好適な特に好ましい活性化物質は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド．ＨＣｌ（ＥＤＣ；ＥＤＡＣとも称される）である。他の好ましい活性化試薬はたとえば、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３´−スルホナート（ウッドワード試薬Ｋ）、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ´−（β−［Ｎ−メチルモルホリノ］エチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）、４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド（ＥＡＣ）、２，２−ジクロロ−５−（２−フェニルエチル）−４−トリメチルシリル）−３−フラノン（ＤＰＴＦ）［Murakama et al., Tetrahedrom Letters 37, 7541-7544 (1996)］、および４−（４−６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）［Kuniishima et al., Tetrahedron 57, 1551-1558 (2001)］である。   A particularly preferred activator suitable for use in the present invention is 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide. HCl (EDC; also referred to as EDAC). Other preferred activating reagents are, for example, N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3′-sulfonate (Woodward reagent K), N-cyclohexyl-N ′-(β- [N-methylmorpholino] ethyl) Carbodiimide (CMC), 4-azonia-4,4-dimethylpentyl) carbodiimide (EAC), 2,2-dichloro-5- (2-phenylethyl) -4-trimethylsilyl) -3-furanone (DPTF) [Murakama et al., Tetrahedrom Letters 37, 7541-7544 (1996)], and 4- (4-6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM). [Kuniishima et al., Tetrahedron 57, 1551-1558 (2001)].

他の活性化物質の例は、Ｎ，Ｎ´−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびΝ，Ν´−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、シアナミド、１，１´カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ν，Ν´−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）、１，２−ベンズイソオキサゾール−３−イル−ジフェニルホスフェート（ＢＤＰ）、および２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）を含む。Montalbetti and Falque [Tetrahedron 61, 10827-10852, (2005)］もこれらの試薬のいくつかを記載し、カルボキシル基含有物質およびアミン基含有物質からアミド結合の形成を促進するよう用いられ得る他の試薬を記載する。   Examples of other activators are N, N′-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and Ν, Ν′-diisopropylcarbodiimide (DIC), cyanamide, 1,1′carbonyldiimidazole (CDI), Ν, Ν′-disc. Cinnimidyl carbonate (DSC), 1,2-benzisoxazol-3-yl-diphenyl phosphate (BDP), and 2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline (EEDQ). Montalbetti and Falque [Tetrahedron 61, 10827-10852, (2005)] also describes some of these reagents and other reagents that can be used to promote the formation of amide bonds from carboxyl group-containing and amine group-containing substances. Is described.

ステップｂ）は好ましくは凍結乾燥を含む。好適な手順書は当該技術において周知である。他の可能な乾燥技術は、噴霧乾燥、超臨界乾燥、および回転蒸発を含む。   Step b) preferably comprises lyophilization. Suitable procedures are well known in the art. Other possible drying techniques include spray drying, supercritical drying, and rotary evaporation.

上記の方法は好ましくは、タンパク質といったアミンを含む第２の反応物との共役反応、たとえばバイオコンジュゲーション反応において用いられる第１の反応物、すなわちカルボキシル基を含む反応物を用いて行われる。当該反応物は１つ以上のカルボキシル基を含んでもよい。   The above method is preferably performed using a first reactant used in a conjugation reaction with an amine-containing second reactant such as a protein, for example a bioconjugation reaction, ie a reactant containing a carboxyl group. The reactant may contain one or more carboxyl groups.

上記の方法において用いられる第１または第２の反応物は共通して、可測性を提供する標識を含むが、そうである必要はない。好適な標識は周知であり、特に、たとえば、着色または蛍光微粒子、磁気微粒子またはビード、量子ドット（Ｑドット）、金粒子、蛍光染料、蛍光タンパク質、および酵素を含む。第１または第２の反応物は、たとえば結果得られる複合体が抗体の生産のための免疫原として用いられることになる場合、必ずしも標識として機能する必要はない。他の好適な反応物は、核酸およびオリゴヌクレオチド、カルボキシル化またはアミノ化されたデキストラン、アガロースおよびガラスを含む好適に官能基化されたビード、抗体、抗体フラグメントを含むタンパク質、糖タンパク質、代謝物質、検体、ペプチド、および他の物質、またはカルボキシル基、アミン基、もしくはリン酸基もしくはこれらの基の組合せを有する表面を含む。   The first or second reactant used in the above method commonly includes a label that provides measurable, but need not be. Suitable labels are well known and include, for example, colored or fluorescent microparticles, magnetic microparticles or beads, quantum dots (Q dots), gold particles, fluorescent dyes, fluorescent proteins, and enzymes. The first or second reactant need not necessarily function as a label, for example when the resulting complex is to be used as an immunogen for the production of antibodies. Other suitable reactants include nucleic acids and oligonucleotides, carboxylated or aminated dextran, suitably functionalized beads including agarose and glass, antibodies, proteins including antibody fragments, glycoproteins, metabolites, Includes analytes, peptides, and other materials, or surfaces having carboxyl groups, amine groups, or phosphate groups or combinations of these groups.

微粒子は好ましくは、粒子の凝集の可能性を低減するよう保護コーティングを有する。当該コーティングは有利なことに、たとえばデキストランのようなシュガーポリマーを含む。好適なコーティング材料および技術は周知である。   The microparticles preferably have a protective coating to reduce the possibility of particle aggregation. The coating advantageously comprises a sugar polymer such as dextran. Suitable coating materials and techniques are well known.

溶液または懸濁液は望ましくはさらにたとえば糖のようなポリヒドロキシ材料を含み、トレハロースが現在好ましい材料である。この材料は、特に凍結乾燥プロセスにおいて安定剤として作用し得、さらに使用時において、得られた乾燥品のその後の溶解を補助し得る。   The solution or suspension desirably further comprises a polyhydroxy material, such as sugar, with trehalose being the currently preferred material. This material can act as a stabilizer, especially in the lyophilization process, and can further assist in subsequent dissolution of the resulting dry product in use.

上記溶液または懸濁液は典型的に緩衝液を含む。これは必須ではないが、緩衝液は冷凍乾燥プロセスの間の安定化を補助し得るとともに、さらに結果得られる乾燥品の使用において安定性の利点をもたらし得る。好適な緩衝液は、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＥＰＰＳ（またはＨＥＰＰＳ）、およびＣＨＥＳを含む。緩衝液は、存在する場合、好ましくは１Ｍ以下、より好ましくは１００ｍＭ以下、さらに好ましくは１０ｍＭ以下であり、たとえば１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲の相対的に低い濃度で好適に用いられる。   The solution or suspension typically includes a buffer. While this is not essential, the buffer can help stabilize during the freeze-drying process and can also provide stability advantages in the use of the resulting dried product. Suitable buffers include MES, HEPES, MOPS, EPPS (or HEPPS), and CHES. When present, the buffer is preferably 1 M or less, more preferably 100 mM or less, even more preferably 10 mM or less, and is suitably used at a relatively low concentration, for example, in the range of 1 mM to 10 mM.

懸濁液の溶液のｐＨは典型的には４以上であり、好ましくは６以上であり、より好ましくは７以上または８以上であり、さらに、好ましくは１４以下であり、より好ましくは１２以下であり、もっとも好ましくは１１以下である。   The pH of the solution of the suspension is typically 4 or more, preferably 6 or more, more preferably 7 or more, or 8 or more, further preferably 14 or less, more preferably 12 or less. Yes, most preferably 11 or less.

当該溶液または懸濁液は、随意であるが必要な場合は、共役反応効率を増強するようＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含む。   The solution or suspension optionally includes N-hydroxysuccinimide (NHS) to enhance the coupling reaction efficiency, if necessary.

当該溶液または懸濁液は、随意であるが、得られる乾燥品の使用時に起こり得る非特異性または他の望ましくない結合相互作用を除去するために洗浄剤を含む。   The solution or suspension optionally includes a detergent to remove non-specific or other undesired binding interactions that may occur during use of the resulting dry product.

さらなる局面では本発明は、本発明の方法によって製造される試薬を提供する。   In a further aspect, the present invention provides a reagent produced by the method of the present invention.

本発明はさらに、カルボキシル基またはリン酸基を含む第１の反応物とアミン基を含む第２の反応物との間の共役反応での使用のための乾燥された試薬を提供する。当該試薬は、ｉ）カルボキシル基含有部分またはリン酸基含有部分上に作用して、カルボキシル基とアミン基との間のアミド結合の形成を促進するか、またはリン酸基とアミン基との間のホスホロアミド酸結合の形成を促進することが可能なカルボキシル基活性化またはリン酸基活性化非酵素物質と、ｉｉ）第１の反応物または第２の反応物との均質な混合物を含む。   The invention further provides a dried reagent for use in a conjugation reaction between a first reactant containing a carboxyl group or a phosphate group and a second reactant containing an amine group. The reagent acts on the carboxyl group-containing moiety or the phosphate group-containing moiety to promote the formation of an amide bond between the carboxyl group and the amine group, or between the phosphate group and the amine group. And ii) a homogeneous mixture of the first reactant or the second reactant with a carboxyl group activated or phosphate group activated non-enzymatic material capable of promoting the formation of phosphoramidate bonds.

当該試薬は好ましくはＮＨＳを含まない。
他の好ましくかつ随意の特徴は上記に記載している。 The reagent is preferably free of NHS.
Other preferred and optional features are described above.

本発明の試薬は好都合なことに、特に生体分子との共役反応における使用に好適な質で好ましくはバイアルのような容器に入れられる。当該試薬はたとえば、標識付けされることになる１００ｕｇの抗体のサンプルとともに用いられる。典型的に、１０ｕｌ、４０ｕｌ、４００ｕｌ、または１ｍｌの溶液または懸濁液でガラスバイアルにおいて調製された凍結乾燥された混合物はそれぞれ、約２−２０ｕｇ、約７．７−７７ｕｇ、約７７−７７０ｕｇ、および約１９２−１９２０ｕｇの量のＥＤＣを含む（ＥＤＣ．ＨＣｌについて１９１．７のモル重量に基づく）。   The reagents of the present invention are conveniently placed in a container, such as a vial, preferably of a quality suitable for use in conjugation reactions with biomolecules. The reagent is used, for example, with a 100 ug antibody sample to be labeled. Typically, the lyophilized mixtures prepared in glass vials with 10 ul, 40 ul, 400 ul, or 1 ml of solution or suspension are about 2-20 ug, about 7.7-77 ug, about 77-770 ug, respectively. And about 192-1920 ug of EDC (based on a molar weight of 191.7 for EDC.HCl).

試薬は好ましくは、本発明の方法によって容器においてその場で乾燥されることにより作られるが、代替的にはバルクで作られ、たとえばバイアルといった容器へ供給されてもよい。   The reagent is preferably made by in situ drying in a container by the method of the present invention, but alternatively it may be made in bulk and fed into a container such as a vial.

本発明はさらに、本発明に従った試薬の供給と使用のための指示とを含むコンジュゲーションキットを提供する。
このキットは、たとえばベータ−メルカプトエタノールといった失活剤試薬の供給を随意で含む。 The present invention further provides a conjugation kit comprising a reagent supply and instructions for use according to the present invention.
The kit optionally includes a supply of a quencher reagent, such as beta-mercaptoethanol.

このキットは、たとえばｐＨ５またはｐＨ６であるＭＥＳといった緩衝液の供給を随意で含む。使用時には、緩衝液は好ましくは、たとえば抗体といった共役されるべき反応物に加えられ、次いで、本発明の試薬に加えられる。   The kit optionally includes a supply of buffer, such as MES at pH 5 or pH 6, for example. In use, a buffer is preferably added to the reactant to be conjugated, eg, an antibody, and then added to the reagent of the present invention.

本発明はさらに、共役反応、特にバイオコンジュゲーションを行う方法を提供する。当該方法は、上記に規定されたように本発明に従って、上記試薬の使用または上記コンジュゲーションキットの使用を含む。共役反応方法のこれらのステップは典型的には、乾燥された試薬を好適な液体（好ましくは蒸留水のような水もしくは水性緩衝液、または随意では無菌液）で戻すステップと、当該戻された試薬を（たとえば抗体などの）共役されるべき分子に接触させるステップとを含む。   The present invention further provides a method for conducting a conjugation reaction, particularly bioconjugation. The method comprises the use of the reagent or the conjugation kit according to the invention as defined above. These steps of the conjugation reaction method typically involve returning the dried reagent with a suitable liquid (preferably water or an aqueous buffer, such as distilled water, or optionally a sterile solution) Contacting a reagent with a molecule to be conjugated (eg, an antibody).

したがって、本発明は、（ｉ）多くのバイオコンジュゲーション処置を単純化でき、（ｉｉ）実験のたびにカルボジイミドの新鮮な溶液を調製する必要があるという時間がかかり無駄の多い実践を省略でき、さらに（ｉｉｉ）反応物の時間的／空間的分離を伴う方法に対する明瞭な技術的な進歩を提供する。   Thus, the present invention can (i) simplify many bioconjugation procedures, (ii) eliminate the time consuming and wasteful practice of having to prepare a fresh solution of carbodiimide for each experiment, Furthermore (iii) it provides a clear technical advance over methods involving temporal / spatial separation of reactants.

本発明は、幅広いさまざまな条件下で溶液中のＥＤＣの安定性を再検査した実績に基づくとともに、ＥＤＣのようなカルボキシル基活性化物質を含む複数成分の均質な凍結乾燥混合物の製造のための有用な起点の発展へとつながった。   The present invention is based on a track record of retesting the stability of EDC in solution under a wide variety of conditions and for the production of a multi-component homogeneous lyophilized mixture containing a carboxyl group activator such as EDC. It led to the development of a useful starting point.

ＥＤＣはさまざまな処理に晒され、残存活性が、濃縮タンパク質溶液のゲル化を伴うタンパク質共役分析において測定されるか、またはより直接的に、芳香族アミン（アニリン）との反応により測定可能なグアニジン化合物を形成することにより測定された。これらの実験から、ＥＤＣが加水分解に対して驚くべきことに安定する多くの条件を特定することができた。同様に水性の環境では不安定であると報告されている他のカルボキシル反応分子であるウッドワード試薬Ｋ（ＷＲＫ）も、本発明の方法を用いて配合することに成功した。   EDC is exposed to various treatments and the residual activity is measured in protein-coupled analysis with gelation of concentrated protein solution or more directly can be measured by reaction with aromatic amines (aniline) Measured by forming a compound. From these experiments, it was possible to identify a number of conditions under which EDC was surprisingly stable against hydrolysis. Similarly, Woodward Reagent K (WRK), another carboxyl reactive molecule that has been reported to be unstable in aqueous environments, has also been successfully formulated using the method of the present invention.

実験室において、数ヶ月の期間に亘って、ＥＤＣの扱いに関連して受け入れられているガイドラインを順守して、カルボジイミドを用いて水性媒質において多くの反応を行った。慣例的に冷凍機に−２０℃で格納されるストック瓶の開閉を繰り返すことにより悪化し得る粉末状のＥＤＣストックの起こり得る劣化に関する懸念により、ＥＤＣ溶液の完全性を確認するようＢＳＡゲル化分析（実施例１）を開発することが促された。しかしながら、古いかまたは繰り返し使用の間に湿ったように思われる（すなわち最初の開封時には明らかであった微粉ではなく塊の兆候を示す）、瓶から取り出されたＥＤＣ粉末は、ＢＳＡゲル化分析において著しく劣った溶液を水において産出しなかった。これにより、数時間にわたって溶液を「エージング」した後、ＥＤＣを検査することが促された。その結果は、加水分解の迅速な速度と明らかに一貫していなかった。したがって、ＥＤＣの安定性に関する先行技術の提示のいくつかの有効性が疑問視された。   In the laboratory, over a period of several months, many reactions were performed in aqueous media using carbodiimide, in compliance with accepted guidelines related to the handling of EDC. BSA gelation analysis to confirm the integrity of EDC solutions due to concerns about possible degradation of powdered EDC stock, which can be exacerbated by repeated opening and closing of stock bottles conventionally stored in a refrigerator at -20 ° C It was prompted to develop (Example 1). However, EDC powder removed from the bottle that appears old or moist during repeated use (ie shows signs of lumps rather than fines that were evident at the time of first opening) is No significantly inferior solution was produced in water. This prompted the EDC to be examined after “aging” the solution for several hours. The results were clearly inconsistent with the rapid rate of hydrolysis. Therefore, the effectiveness of some of the prior art presentations regarding the stability of EDC was questioned.

ＥＤＣが明らかに劇的な活性の損失なしでかなりの期間の間、水の中にとどまったという発見により、ＥＤＣをカルボキシル基含有物質と組み合せて、他の好適に官能基化された分子との反応を行う前に少なくとも短期間の間、当該混合物を格納することも可能であるかどうかという疑問が生まれた。本発明者らは、凍結乾燥された混合物の調製によって、数日間、数週間、数ヶ月間、またはさらには数年間、共役反応が行われることが可能になるかもしれないと考えた。ＥＤＣおよびカルボキシル基含有物質またはアミン基含有物質を含む均質な複数成分混合物の凍結乾燥、ならびに他の分子との共役反応におけるこのような材料の使用の報告がないことは分かっている。   The discovery that EDC remained in water for a significant period of time without apparently dramatic loss of activity, combined with EDC in combination with carboxyl group-containing materials, and other suitably functionalized molecules. The question was raised whether it was possible to store the mixture for at least a short period of time before carrying out the reaction. We thought that the preparation of the lyophilized mixture may allow the coupling reaction to take place for days, weeks, months, or even years. It has been found that there is no report of the use of such materials in lyophilization of homogeneous multi-component mixtures containing EDC and carboxyl group-containing substances or amine group-containing substances, as well as in conjugation reactions with other molecules.

まず、広い範囲のｐＨ値に亘って生物学的緩衝液または他の試薬と組み合わせるとともに、さらにＥＤＣの分解を加速すると報告される官能基（たとえばカルボキシル基）の存在下でＥＤＣの安定性を調査した。水性アルカリ緩衝液における、ＥＤＣと他の分子との反応に関する文献には不十分な情報しかない。５分または２４時間のいずれかの各条件でのＥＤＣのプレインキュベーションの後、各ＥＤＣ／緩衝混合液は、ｐＨ６のＭＥＳ緩衝液中のＢＳＡの濃縮溶液に加えられ、ゲルが形成するのに必要な時間が判定された（実施例１）。   First, investigate the stability of EDC in the presence of functional groups (eg, carboxyl groups) that are reported to accelerate EDC degradation in combination with biological buffers or other reagents over a wide range of pH values did. There is insufficient information in the literature on the reaction of EDC with other molecules in aqueous alkaline buffer. After pre-incubation of EDC at each condition for either 5 minutes or 24 hours, each EDC / buffer mixture is added to a concentrated solution of BSA in pH 6 MES buffer and required for gel formation. A reasonable time was determined (Example 1).

この検査では、ＥＤＣの迅速な加水分解（すなわち水との反応）またはＥＤＣと上記混合物中の他の成分との間の高速反応によって、短期間のプレインキュベーションの後のゲル化時間の増加を引き起こすことができた。プレインキュベーション段階でＥＤＣの損失がなくても、混合物中の成分はそれでも、ＢＳＡ分析の第２の（ゲル化）段階において干渉を引き起こし得た。この干渉は、たとえば、具体的にはゲル化反応において用いられるｐＨにてＥＤＣを攻撃することによるか、またはｏ−アシルイソ尿素基の形成、もしくは他のＢＳＡ分子上でのリジン残基とのそれらの基の、分子間架橋およびゲル化に必要な反応に他の何らかの態様で干渉することにより行われる。如何なる干渉の実際のメカニズムにかかわらず、ＢＳＡゲル化分析は、ＥＤＣが媒介するバイオコンジュゲーション反応の例であり、したがって、凍結乾燥されることが意図されるとともにＥＤＣが媒介する生体分子の共役のために用いられることが意図される混合物から除外することが望まれ得る物質を特定可能である。   In this test, rapid hydrolysis of EDC (ie reaction with water) or fast reaction between EDC and other components in the mixture causes an increase in gel time after a short pre-incubation. I was able to. Even if there was no loss of EDC in the preincubation step, the components in the mixture could still cause interference in the second (gelation) step of BSA analysis. This interference may be due to, for example, attacking EDC, specifically at the pH used in the gelling reaction, or formation of o-acylisourea groups, or those with lysine residues on other BSA molecules. By interfering in some other manner with the reactions required for intermolecular cross-linking and gelation. Regardless of the actual mechanism of any interference, BSA gelation analysis is an example of an EDC-mediated bioconjugation reaction and is therefore intended to be lyophilized and coupled to EDC-mediated biomolecule conjugation. Substances that may be desired to be excluded from the mixture intended to be used for the purpose.

プレインキュベーション段階でのｐＨとゲル化時間との単純な関係性は存在しないことが分かった。これはおそらく多くの要因がバイオコンジュゲーション分析において結果に影響を与えるよう作用するからである。   It has been found that there is no simple relationship between pH and gelation time during the preincubation stage. This is probably because many factors act to influence results in bioconjugation analysis.

２４時間のプレインキュベーションの後、ＥＤＣ／ＨＣｌ混合物は、酸におけるＥＤＣの不安定さの報告に基づく予測と合致してゲル化を引き起こすことはなかった。興味深いことに、５分のプレインキュベーションの後、ＥＤＣ／１００ｍＭのＨＣｌ混合物は、一貫してもっとも短いゲル化時間を示した。この観察をさらに調査しなかったが、これは、より反応性のある互変異性体へのＥＤＣの変換によって説明され得る。   After 24 hours of preincubation, the EDC / HCl mixture did not cause gelation consistent with predictions based on reports of EDC instability in acid. Interestingly, after 5 minutes preincubation, the EDC / 100 mM HCl mixture consistently showed the shortest gel time. This observation was not further investigated, but this can be explained by the conversion of EDC to a more reactive tautomer.

２４時間のプレインキュベーションの後でもＥＤＣ活性が緩やかにしか影響を受けなかったいくつかの緩衝液条件が特定された。驚くべきことに、ｐＨ５の０．１Ｍの酢酸ナトリウム／０．１ＭのＥＤＣの混合物におけるＥＤＣの半減期はちょうど２分であるという以前の報告（Jacobson and Fairman, Anal. Biochem. 106, 114-117 [1980]）にもかかわらず、この群は数回反復された結果であるｐＨ５のＥＤＣ／酢酸塩混合物を含んでいた。あまり驚くことではないが、ポリカルボン酸（たとえばクエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ）の場合はプレインキュベーション時間にかかわらず、厳しい干渉が確認された。リン酸塩、炭酸塩、およびホウ酸塩を含む多くの他の緩衝液も、著しい干渉を引き起こした。   Several buffer conditions were identified in which EDC activity was only moderately affected after 24 hours of preincubation. Surprisingly, a previous report that the half-life of EDC in a 0.1 M sodium acetate / 0.1 M EDC mixture at pH 5 is just 2 minutes (Jacobson and Fairman, Anal. Biochem. 106, 114-117 [1980]), however, this group contained a pH 5 EDC / acetate mixture, which was the result of several iterations. Not surprisingly, severe interference was observed for polycarboxylic acids (eg, sodium citrate, EDTA) regardless of preincubation time. Many other buffers, including phosphate, carbonate, and borate also caused significant interference.

６日間の２５℃でのプレインキュベーション後でもＢＳＡのゲル化を引き起こす十分なＥＤＣ活性を含んでいる混合物もいくつかあった。   Some mixtures contained sufficient EDC activity to cause BSA gelation even after 6 days of pre-incubation at 25 ° C.

フェニルグアニジンへのアニリンの変換を伴うＥＤＣ活性のより直接的な検査を用いて、本質的にWilliamsらの方法を用いて多くの有望な条件をさらに評価した（Anal. Biochem. 114, 173-176 [1981]）（実施例２）。この分析により、ＥＤＣの濃度が、ＢＳＡのゲル化を引き起こすしきい値（〜２０ｍＭ）を下回っても測定することが可能となり、かつ（加水分解または他の反応のいずれかに対する）ＥＤＣの安定性を、活性化されたカルボキシル基への要求なしで測定することが可能になる。   Many more promising conditions were further evaluated using essentially the method of Williams et al. (Anal. Biochem. 114, 173-176) using a more direct examination of EDC activity with conversion of aniline to phenylguanidine. [1981]) (Example 2). This analysis makes it possible to measure even if the concentration of EDC is below the threshold (˜20 mM) that causes gelation of BSA, and the stability of EDC (to either hydrolysis or other reactions) Can be measured without the need for activated carboxyl groups.

多くの緩衝液の配合物が、プレインキュベーションおよび／または凍結乾燥の後のＥＤＣに影響が少ないアニリン分析において特定された。さらに、ＥＤＣの大規模な触媒性の破壊の形跡なしで、ＥＤＣが三価または四価のカルボン酸物質（ＥＤＴＡ、クエン酸塩）と組み合わせられ得る条件を特定した。   A number of buffer formulations have been identified in aniline assays that have less effect on EDC after preincubation and / or lyophilization. In addition, conditions were identified where EDC could be combined with trivalent or tetravalent carboxylic acid materials (EDTA, citrate) without evidence of extensive catalytic destruction of EDC.

ＥＤＣの安定性に対する全体の我々の発見は、先行技術の言明のいくつかを確証するものであったが、その他のものとは矛盾するものである。我々のデータは明らかに、ＥＤＣが一般的に認識されているよりはるかに安定であることを示し、さらに重要なことに、ＥＤＣの実質的な損失なしで、溶液中のＥＤＣを低分子量のポリカルボン酸物質と組み合わせることが可能であることを示している。したがって、アミノ化された分子とのバイオコンジュゲーション反応での使用の前に、他の多価のカルボン酸物質（たとえば微粒子）が、ＥＤＣと組み合され、凍結乾燥され得るかどうかを確認することとした。   Our overall discovery of EDC stability confirmed some of the statements of the prior art, but is inconsistent with others. Our data clearly shows that EDC is much more stable than is commonly recognized, and more importantly, EDC in solution can be reduced to low molecular weight poly without substantial loss of EDC. It shows that it can be combined with carboxylic acid substances. Thus, prior to use in a bioconjugation reaction with an aminated molecule, verify whether other multivalent carboxylic acid substances (eg microparticles) can be combined with EDC and lyophilized. It was.

生命科学において、血液または尿といった流体における検体を検出するための診断分析（たとえば側方流動免疫クロマトグラフィーのストリップ試験および凝集分析）での用途で、微粒子は幅広く活用されている。蛍光性微粒子および量子ドットは、特定の抗原を発現している細胞群を検出するようフローサイトメトリーにおいて用いられる。磁気微粒子には、研究所および診断装置において様々な用途がある。たとえば、さまざまな材料から構成される多くの他のタイプの微粒子も存在し、異なる大きさ、色、および表面官能性などといった各タイプの複数の変形例が通常存在する。   In life sciences, microparticles are widely used in diagnostic analysis to detect analytes in fluids such as blood or urine (eg, lateral flow immunochromatographic strip testing and agglutination analysis). Fluorescent microparticles and quantum dots are used in flow cytometry to detect cell populations that express specific antigens. Magnetic fine particles have a variety of uses in laboratories and diagnostic devices. For example, there are many other types of microparticles composed of different materials, and there are typically multiple variations of each type, such as different sizes, colors, and surface functionality.

生物分析での用途のために、微粒子は、他の生体分子または検体と相互作用し得る物質でコーティングされなければならない。この物質は概して、広範囲の分子が非共有結合または共有結合の手段のいずれかにより微粒子の表面に付着され得るが、抗原または抗体である。抗体の固定化を伴う大多数の診断用途では、コーティングに対して受動的な非共有結合アプローチが用いられる。共有結合は小分子または検体とともにより一般的に用いられ、さまざまな表面機能を有する微粒子が利用可能である（たとえばカルボキシル、アミン、アルデヒド）。カルボキシル化された表面またはアミン表面は、カルボジイミドまたは他の機能的に等価な活性化物質を用いて、抗体または検体と共有結合され得る。   For bioanalytical applications, the microparticles must be coated with a substance that can interact with other biomolecules or analytes. This material is generally an antigen or antibody, although a wide range of molecules can be attached to the surface of the microparticle by either non-covalent or covalent means. In most diagnostic applications involving antibody immobilization, a passive non-covalent approach to coating is used. Covalent bonds are more commonly used with small molecules or analytes, and microparticles with various surface functions are available (eg, carboxyls, amines, aldehydes). The carboxylated surface or amine surface can be covalently attached to the antibody or analyte using carbodiimide or other functionally equivalent activator.

ラテックス微粒子は疎水性であり、悪評高いほど凝集し易い。受動的なコーティングのために、全表面が覆われるように過剰な結合実体（たとえば抗体）が用いられ、これにより、疎水性表面同士の間の接触の危険性または抗体が凝集を引き起こす粒子同士の間のブリッジとして作用する危険性を低減する。   Latex microparticles are hydrophobic, and the higher the reputation, the easier it is to aggregate. For passive coating, an excess of binding entity (eg, antibody) is used so that the entire surface is covered, so that there is a risk of contact between hydrophobic surfaces or between particles that cause aggregation of the antibody. Reduce the risk of acting as a bridge between.

いくつかの場合では、抗体は、粒子の表面に現れた抗体の量を制御または調節するためのメカニズムを提供するとともにコロイド安定性を維持するのを補助する他のタンパク質（たとえばＢＳＡ）と混合され得る。   In some cases, the antibody is mixed with other proteins (eg, BSA) that provide a mechanism to control or regulate the amount of antibody appearing on the surface of the particle and help maintain colloidal stability. obtain.

微粒子の懸濁液から過剰な試薬を取り除くよう遠心分離洗浄ステップが必要とされる場合、当該遠心分離ステップは、粒子を小さくし、凝集を促進する傾向にある。ひとたび形成された凝集物は、砕くのが非常に困難であり、音波処理が必要な場合もある。   If a centrifugation wash step is required to remove excess reagent from the microparticle suspension, the centrifugation step tends to reduce the particles and promote aggregation. Once formed, the agglomerates are very difficult to break and may require sonication.

受動的なコーティングは通常、コーティング物質の等電点に近いｐＨで行われる。したがって、抗体、特にモノクローン種の抗体の場合、コーティングプロセスは、各抗体試薬ごとに最適化される必要があり得る。   Passive coating is usually performed at a pH close to the isoelectric point of the coating material. Thus, for antibodies, particularly monoclonal antibodies, the coating process may need to be optimized for each antibody reagent.

共有結合の方策には、多くの利点がある。すなわち、微粒子への結合実体の確実な付着により、より大きな安定性、長い保存期間、分析の展開の際のより少ない制約が潜在的に可能になる。たとえば、免疫分析において非特異的結合を低減するようしばしば用いられる洗浄剤は受動的に吸着された抗体を微粒子から取り除き、免疫診断分析において干渉し得る。   There are many advantages to the covalent binding strategy. That is, the reliable attachment of the binding entity to the microparticles potentially allows greater stability, longer shelf life, and fewer constraints when developing the analysis. For example, detergents often used to reduce non-specific binding in immunoassays can remove passively adsorbed antibodies from microparticles and interfere with immunodiagnostic analyses.

カルボキシル粒子の場合、抗体上のアミノ基が、安定したアミド結合を形成するよう反応する。アミノ化された粒子の場合、連結するアミド結合が反対になるが、そうでなければ等価である。   In the case of carboxyl particles, the amino group on the antibody reacts to form a stable amide bond. In the case of aminated particles, the connecting amide bond is reversed, but otherwise equivalent.

検体が結合に利用可能なカルボキシル基のみ有している場合か、または対象の抗体が抗原結合領域において臨界的なリジン残基を含んでいる場合、アミンがコーティングされた粒子の使用が望ましくあり得る。しかしながら抗体は、特に高濃度で存在する場合、重合し得、上記の臨界的なリジンは、他の抗体分子との重合反応に関係し得る。   If the analyte has only carboxyl groups available for binding, or if the antibody of interest contains critical lysine residues in the antigen binding region, the use of amine-coated particles may be desirable. . However, antibodies can polymerize, especially when present at high concentrations, and the above critical lysine can be involved in polymerization reactions with other antibody molecules.

共有結合の共役の多くの利点にかかわらず、このような反応を行う処置には時間がかかり、凝集の危険性が残存する。   Despite the many advantages of covalent conjugation, the procedure to perform such a reaction is time consuming and the risk of aggregation remains.

さらに微粒子は、凍結されると凝集すると報告されている（たとえばPolysciences technical datasheet 238; rev #010, active; ２００９年２月１８日）。これにより、微粒子とＥＤＣとの凍結乾燥された混合物の開発がさらに困難になる。   In addition, microparticles have been reported to aggregate when frozen (eg, Polysciences technical datasheet 238; rev # 010, active; February 18, 2009). This makes it more difficult to develop a lyophilized mixture of microparticles and EDC.

本発明での使用のために、カルボキシル化された微粒子が、ＥＤＣの存在下または遠心分離の後で凝集する傾向があるので、まず、保護用のデキストランコートを有する微粒子を用いた。デキストランは、より親水性の表面を与えるよう微粒子をコーティングするよう他者により用いられている。   For use in the present invention, carboxylated microparticles tend to aggregate in the presence of EDC or after centrifugation, so microparticles with a protective dextran coat were used first. Dextran has been used by others to coat microparticles to give a more hydrophilic surface.

デキストランは、化学的に修正され、官能基を導入して、コア微粒子への共有結合を可能とするとともに、他の分子との共役反応に関与することが可能な表面官能基を提供する。   Dextran is chemically modified to introduce a functional group to allow covalent binding to the core microparticles and provide surface functional groups that can participate in conjugation reactions with other molecules.

官能基は、対象の特定の微粒子の化学的性質に適合するようデキストランになるように操作され得る。たとえば、カルボキシメチル（ＣＭ）基は、当該技術において周知の方法を用いて、ブロモ酢酸またはクロロ酢酸を用いるデキストラン中に導入され得る。カルボジイミドが媒介する反応において、デキストランのこのような誘導体がアミノ化された微粒子に共有結合され得る。   The functional group can be engineered to be dextran to match the chemistry of the particular microparticle of interest. For example, a carboxymethyl (CM) group can be introduced into dextran using bromoacetic acid or chloroacetic acid using methods well known in the art. In a carbodiimide mediated reaction, such derivatives of dextran can be covalently bound to aminated microparticles.

ＣＭ−デキストラン誘導体は、エチレンジアミンのような過剰の低分子量のジアミンとさらに反応し得、これによりアミノ化されたデキストラン（ＡＭ−デキストラン）分子を生成する。この分子は次いで、カルボキシル化された微粒子に結合され得る。   CM-dextran derivatives can be further reacted with an excess of low molecular weight diamines such as ethylenediamine, thereby producing aminated dextran (AM-dextran) molecules. This molecule can then be bound to the carboxylated microparticles.

デキストラン分子の表面上でのカルボキシル基またはアミン基の密度は、初期のカルボキシル化反応において用いられるハロゲン化酢酸の量を変動させること、および／またはその後のアミノ化反応の効率を制御することにより制御され得る。   The density of carboxyl or amine groups on the surface of the dextran molecule is controlled by varying the amount of halogenated acetic acid used in the initial carboxylation reaction and / or controlling the efficiency of the subsequent amination reaction. Can be done.

アルデヒド基を作り出すシスジオールの結合を切る過ヨウ素酸塩での処理の後、アミンがさらにデキストランに導入され得る。当該アルデヒド基はさらに、ジアミンと反応され得、これにより当該技術において周知の方法を用いて安定化され得るシッフ塩基を作り出す。   After treatment with periodate, which cleaves the cis diol that creates the aldehyde group, an amine can be further introduced into the dextran. The aldehyde group can be further reacted with a diamine, thereby creating a Schiff base that can be stabilized using methods well known in the art.

本発明では、アミノ化されたデキストランは、カルボジイミドを用いてカルボキシル化された微粒子に共有結合される。好ましい実施の形態では、デキストランコート上のアミンは次いで、無水コハク酸と反応され、これによりカルボキシル化された表面を与える。   In the present invention, aminated dextran is covalently bound to carboxylated microparticles using carbodiimide. In a preferred embodiment, the amine on the dextran coat is then reacted with succinic anhydride, thereby giving a carboxylated surface.

微粒子の効率的なコーティングに必要とされるデキストランアミンの数が、他の分子とのその後の共役反応について必要または望ましい数よりも大きい場合、利用可能なアミンの数は、無水コハク酸との処理の前にブロック剤との不完全な反応により低減され得る。たとえば、スルフォ−ＮＨＳ酢酸塩（Bioconjugate Techniques. GT Hermanson 1996; ISBN 0-12-342335-x; pl27)を用いてアミンをブロックし得る。   If the number of dextran amines required for efficient coating of microparticles is greater than the number required or desired for subsequent conjugation reactions with other molecules, the number of available amines will be treated with succinic anhydride. Can be reduced by incomplete reaction with the blocking agent prior to For example, sulfo-NHS acetate (Bioconjugate Techniques. GT Hermanson 1996; ISBN 0-12-342335-x; pl27) can be used to block the amine.

他方では、コーティングステップまたはその後の共役反応のために不十分なアミンしか利用可能でない場合、ＣＭ−デキストランは、ジアミンとは反応されず、その代わりに低分子量のトリアミンまたはポリアミンと反応されて付加的なアミン官能性を提供する。   On the other hand, if insufficient amine is available for the coating step or subsequent conjugation reaction, CM-dextran is not reacted with diamine, but instead is reacted with low molecular weight triamine or polyamine to add Provides a unique amine functionality.

本発明の方法は、任意の特定のコーティング方法に限定されず、デキストランコート有または無で微粒子に適用されてもよい。さらに、微粒子は、１層または複数層のデキストランでコーティングされてもよい。   The method of the present invention is not limited to any particular coating method and may be applied to the microparticles with or without dextran coating. Furthermore, the microparticles may be coated with one or more layers of dextran.

デキストランコートの第一の目的は、粒子の凝集を防止することであり、この点において、高平均の分子の大きさを有するデキストランが好ましい。なぜならば、大きな大きさは、概してコロイド安定性を維持するのにさらに有効であるように思われるからである。   The primary purpose of the dextran coat is to prevent particle agglomeration, and in this respect dextran having a high average molecular size is preferred. This is because large sizes generally appear to be more effective in maintaining colloidal stability.

本発明の好ましい実施の形態では、ＥＤＣまたは他のカルボキシル基活性化物質はラテックス粒子と組み合され、好ましくはデキストランのような保護ポリマーでコーティングされる。この保護層は、複数のアミン基またはカルボキシル基を有し、微粒子は、好適な緩衝液において、他の添加物とともにＥＤＣまたは他の好適なカルボジイミドと組み合されてもよい。結果得られる均質の混合物を小さなバイアルに供給し、凍結乾燥および共役反応におけるその後の適用の前に凍結される。   In a preferred embodiment of the present invention, EDC or other carboxyl group activator is combined with latex particles and is preferably coated with a protective polymer such as dextran. This protective layer has a plurality of amine groups or carboxyl groups, and the microparticles may be combined with EDC or other suitable carbodiimides with other additives in a suitable buffer. The resulting homogeneous mixture is fed into small vials and frozen prior to subsequent application in lyophilization and coupling reactions.

このように製造されるバイアルは、簡便なワンステップのコンジュゲーションキットの形態で組み付けられ得る。当該バイアルにおいて、対象の生体分子と微粒子との間の反応は上記の凍結乾燥された混合物を生体分子の溶液で戻すことにより簡易に開始され得る。   Vials produced in this way can be assembled in the form of a convenient one-step conjugation kit. In the vial, the reaction between the biomolecule of interest and the microparticles can be easily initiated by returning the lyophilized mixture with the biomolecule solution.

バイオコンジュゲーション反応へのこのようなキットの適用においては、絶対的な意味で、かつ混合物における他の実体に対して、さらには、その後導入され得る他の実体（たとえば溶液の形態で加えられる求核剤）に対して、凍結乾燥された混合物におけるカルボジイミドの量を熟慮する必要がある。最終反応混合物における各成分の濃度を予想するために、導入される液体の体積が、ＥＤＣ包含溶液の元々の体積（すなわち凍結乾燥の前の堆積）よりも多いまたは少ないかどうかを考える必要がある。   In the application of such kits to bioconjugation reactions, in an absolute sense and to other entities in the mixture, and further to other entities that can be subsequently introduced (eg in the form of solutions). For the nucleating agent, it is necessary to consider the amount of carbodiimide in the lyophilized mixture. In order to predict the concentration of each component in the final reaction mixture, it is necessary to consider whether the volume of liquid introduced is greater or less than the original volume of the EDC-containing solution (ie deposition prior to lyophilization) .

さらに、ＥＤＣまたは他のカルボキシル基活性化物質が媒介する反応の効率または速度を変更し得る成分が凍結乾燥された混合物の溶解に用いられる上記実体中に存在する可能性を考慮しなければならない。たとえば、多くの研究所は、抗体をカルボン酸表面または他のカルボキシル基含有生体分子に結合するよう共役反応を行う。商業的に利用可能な抗体はしばしばカルボジイミドの活性に干渉すると報告される物質（たとえばｔｒｉｓ、リン酸緩衝液）を含む。これらの潜在的な困難さは、いくつかの方法のうちの１つで対処され得る。   In addition, consideration must be given to the possibility that components that can alter the efficiency or rate of the reaction mediated by EDC or other carboxyl group activator are present in the entity used to dissolve the lyophilized mixture. For example, many laboratories perform conjugation reactions to bind antibodies to carboxylic acid surfaces or other carboxyl group-containing biomolecules. Commercially available antibodies often contain substances that are reported to interfere with the activity of carbodiimide (eg tris, phosphate buffer). These potential difficulties can be addressed in one of several ways.

第１に、より好ましい緩衝液配合物を提供するよう、抗体は脱塩または透析され得る。このような操作は、約０．１ｍｌ以上の体積で一般的に用いられる。さらに多くの体積の場合、クロスフロー濾過のような他の技術が用いられてもよい。粒子掃去材料を用いていくつかの望まれない物質を除去することが可能であり得る。たとえば、望まれないイオン成分をタンパク質溶液から除去するよう、混床式イオン交換器が用いられている。   First, the antibody can be desalted or dialyzed to provide a more preferred buffer formulation. Such an operation is generally used in a volume of about 0.1 ml or more. For even larger volumes, other techniques such as cross flow filtration may be used. It may be possible to remove some undesired material using a particle scavenging material. For example, mixed bed ion exchangers are used to remove unwanted ion components from protein solutions.

第２に、凍結乾燥された組成物の連なりが、共役反応において直面し得る抗体（または他の実体）のさまざまな配合物に対応するよう作り出され得た。たとえば、好ましい緩衝液配合を有する抗体は、共役を行うのに相対的に少ない量のＥＤＣなどしか必要としない場合がある。対照的に、ＥＤＣなどの分解を加速させることが知られる物質（たとえばリン酸塩）を用いて配合された抗体は、カルボジイミドが高い含有量で凍結乾燥された多カルボン酸物質（たとえばラテックスビード）に加えられ得る。   Second, a series of lyophilized compositions could be created to correspond to various formulations of antibodies (or other entities) that may be encountered in the coupling reaction. For example, an antibody with a preferred buffer formulation may require a relatively small amount of EDC, etc. to effect conjugation. In contrast, antibodies formulated with substances known to accelerate degradation, such as EDC (eg, phosphates), are polycarboxylic acid substances (eg, latex beads) that have been lyophilized with a high carbodiimide content. Can be added to.

第３に、相対的に高い量のＥＤＣなどを有する単一の凍結乾燥された配合物が製造され得る。このような混合物は、望ましくない配合物を有する抗体と接触しても、反応を妥当な期間で完了させることが可能である。どのような期間が妥当であるかについての意見は、研究所の操作者の間で様々であり得るが、１時間の反応時間は異常ではないであろう。同じ抗体が好ましい緩衝液配合物において存在する場合、反応はより早くなる可能性があり、数分足らずで必要とされる終末点まで進行する場合がある。その場合、ＥＤＣなどへの過剰な露出による損傷の可能性を制限するために、反応は好適な方法を用いて失活される。   Third, a single lyophilized formulation with relatively high amounts of EDC and the like can be produced. Such a mixture is capable of completing the reaction in a reasonable time even when contacted with an antibody having an undesirable formulation. Opinions about what period is reasonable can vary among laboratory operators, but a 1 hour reaction time will not be unusual. If the same antibody is present in the preferred buffer formulation, the reaction may be faster and may proceed to the required endpoint in less than a few minutes. In that case, the reaction is quenched using a suitable method to limit the possibility of damage due to overexposure to EDC and the like.

第４に、最終の反応ｐＨを増加または減少させるよう、「ｐＨ調節剤」が凍結乾燥された混合物に接触される前に抗体に加えられてもよい。これにより、カルボジイミドが媒介する反応の速度を変更する。ｐＨに対する、観察下の特定の抗体または生体分子の感受性が、ｐＨが有用に変動され得る範囲に制限を課すことになる。このアプローチでは、適度の量の調節剤の添加のみでｐＨの調節を促進するように、凍結乾燥された混合物の緩衝容量は相対的に低いのが理想的である。相対的に小さい容量の緩衝作用系で始める場合、たとえば失活処置の一部として後で必要になるかもしれないｐＨのさらなる変更も容易に達成される。   Fourth, a “pH modifier” may be added to the antibody before it is contacted with the lyophilized mixture to increase or decrease the final reaction pH. This alters the rate of reaction mediated by the carbodiimide. The sensitivity of a particular antibody or biomolecule under observation to pH will limit the extent to which the pH can be usefully varied. In this approach, the buffer capacity of the lyophilized mixture is ideally relatively low so that the addition of a modest amount of regulator only facilitates pH adjustment. When starting with a relatively small volume buffer system, further changes in pH that may later be required, for example, as part of a deactivation procedure, are readily achieved.

さらに、ｐＫａを変化させるアミンの反応の程度を最適化するよう、調節剤が活用されてもよい。カルボジイミドおよびポリカルボン酸物質を含む凍結乾燥された混合物の場合、新たに調製された溶液を用いる従来のＥＤＣコンジュゲーション方法と同様に、アミンとの２ステップおよび１ステップの反応の両方が可能である。たとえば、２ステップのアプローチでは、凍結乾燥された混合物のｐＨは、低ｐＨの緩衝液の添加を介してまず低減され得、ｏ−アシルイソ尿素の形成を支援する。好適な期間の後、アミノ化された分子が高いｐＨの緩衝液中にまたは当該緩衝液とともに導入され反応ｐＨを上方へシフトする。これにより、より反応性のあるプロトン化されていない状態においてアミンの割合を増加し、したがってアミド結合形成を促進する。   In addition, regulators may be utilized to optimize the degree of amine reaction that changes the pKa. In the case of lyophilized mixtures containing carbodiimide and polycarboxylic acid materials, both two-step and one-step reactions with amines are possible, as is the case with conventional EDC conjugation methods using freshly prepared solutions. . For example, in a two-step approach, the pH of the lyophilized mixture can first be reduced through the addition of a low pH buffer to assist in the formation of o-acylisourea. After a suitable period, the aminated molecule is introduced into or with the high pH buffer to shift the reaction pH upward. This increases the proportion of amine in the more reactive unprotonated state and thus promotes amide bond formation.

多くのアミンの場合、特にリシル残留物が存在する微環境の影響によるｐＫａ値の範囲を有する（主としてリジン側鎖からの）複数のアミン官能基を有する生体分子（たとえばタンパク質）の場合、もっとも単純なアプローチは、凍結乾燥されたカルボン酸物質／ＥＤＣ混合物がアミン基含有生体分子の緩衝液で戻される１ステップ反応である。   In the case of many amines, the simplest in the case of biomolecules (eg proteins) with multiple amine functional groups (eg mainly from lysine side chains) with a range of pKa values due to the influence of the microenvironment where lysyl residues are present One approach is a one-step reaction in which the lyophilized carboxylic acid material / EDC mixture is returned with an amine group-containing biomolecule buffer.

随意であるが、凍結乾燥の前に、または凍結乾燥された混合物の溶解のために用いられる溶液とともに、反応混合物にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）が加えられてもよい。ＮＨＳは、加えられなければ効率が低すぎる場合には、有用であり得る。同様に、リン酸塩のような干渉を引き起こす物質が意図的に導入され、導入されなければ早すぎた反応を減速してもよいという状況が考えられ得る。   Optionally, N-hydroxysuccinimide (NHS) may be added to the reaction mixture prior to lyophilization or together with the solution used to dissolve the lyophilized mixture. NHS may be useful if the efficiency is too low if not added. Similarly, a situation can be envisaged in which substances causing interference, such as phosphates, are intentionally introduced and if not introduced, premature reactions may be slowed down.

反応の速度または効率はさらに、反応物の濃度を変更することにより変動されてもよい。たとえば、２つの体積「ｘ」および「５ｘ」で与えられる固定量の抗体により、凍結乾燥された混合物の再構成は、微粒子、ＥＤＣなど、抗体、および任意の他の成分の濃度における差が５倍になる。反応体積「ｘ」の場合、反応速度は、体積「５ｘ」についての反応速度よりもはるかに速くなり得る。したがって、相対的に少ない体積における溶解を計画している場合、凍結乾燥された混合物において、より少ないＥＤＣなどを用いることが可能または望ましくあり得る。   The rate or efficiency of the reaction may be further varied by changing the concentration of the reactants. For example, with a fixed amount of antibody given in two volumes “x” and “5x”, reconstitution of a lyophilized mixture will result in a difference in concentration of microparticles, EDC, etc., antibodies, and any other components of 5 Double. For reaction volume “x”, the reaction rate can be much faster than the reaction rate for volume “5x”. Thus, it may be possible or desirable to use less EDC or the like in a lyophilized mixture if lysis in a relatively small volume is planned.

固定成分の凍結乾燥された混合物を用いたとしても、共役反応の効率を変動させるための非常に簡素な方策が存在するということが上記の議論から明らかとなるであろう。   It will be clear from the above discussion that there is a very simple strategy to vary the efficiency of the conjugation reaction, even with a lyophilized mixture of stationary components.

本発明の方法により、単純にさまざまな成分の溶液を異なる割合で混合することによって、ほぼ無限の数の凍結乾燥された配合物を迅速かつ容易に調製することが可能になるということは上記の議論から明らかであろう。   The fact that the method of the present invention makes it possible to quickly and easily prepare an almost infinite number of lyophilized formulations by simply mixing solutions of various ingredients in different proportions. It will be clear from the discussion.

本発明の好ましい実施の形態では、凍結乾燥の前の成分の最終混合物のｐＨは、ｐＨ１からｐＨ１４の範囲内である。   In a preferred embodiment of the invention, the pH of the final mixture of ingredients prior to lyophilization is in the range of pH 1 to pH 14.

ＥＤＣを安定化するための好ましい緩衝液は、ｐＨ６．０のＭＥＳと、ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳと、ｐＨ７．５のＭＯＰＳと、ｐＨ８．５のＥＰＰＳと、ｐＨ９．０のＥＰＰＳと、ｐＨ９．２のＣＨＥＳとである。   Preferred buffers for stabilizing EDC are pH 6.0 MES, pH 7.5 HEPES, pH 7.5 MOPS, pH 8.5 EPPS, pH 9.0 EPPS, and pH 9.2. And CHES.

ｐＨ５、ｐＨ６のＭＥＳ緩衝液およびｐＨ８．５のＥＰＰＳといった調査した緩衝液のすべてにおいてＷＲＫが安定化していた。しかしながら、共役反応については、ＷＲＫはもっとも高い効率をｐＨ５にて示した。   WRK was stabilized in all of the investigated buffers such as pH 5, pH 6 MES buffer and pH 8.5 EPPS. However, for the conjugation reaction, WRK showed the highest efficiency at pH 5.

好ましくは緩衝液のｐＨが、ｐＨを維持するのに用いられる任意の緩衝物質のｐＫａの５ｐＨ単位内、より好ましくは、２．０ｐＨ単位内、さらに好ましくは１ｐＨ単位内である。   Preferably, the pH of the buffer is within 5 pH units of the pKa of any buffer substance used to maintain the pH, more preferably within 2.0 pH units, and even more preferably within 1 pH unit.

凍結乾燥プロセスにおいて、緩衝液および塩の濃度は可能な限り低くあるべきであることは一般的に受け入れられており、ＥＤＣが水においてもっとも安定していることは注目すべきことである（実施例１）。   It is generally accepted that in the lyophilization process the buffer and salt concentrations should be as low as possible, and it should be noted that EDC is most stable in water (Examples). 1).

混合物における如何なる緩衝液も単純に、複数成分の混合物の調製および凍結乾燥の間のｐＨの有効な制御を達成するものであり、上記の成分は、溶液中または凍結乾燥プロセス自体の間に、あまり望ましくないｐＨ、すなわち望まれない反応が発生するｐＨにｐＨを移す傾向を有し得る。   Any buffer in the mixture simply achieves effective control of the pH during the preparation of the multi-component mixture and lyophilization, and the above components are not so much in solution or during the lyophilization process itself. It may have a tendency to shift the pH to an undesired pH, that is, a pH at which an unwanted reaction occurs.

好ましくは、用いられる緩衝物質は、相対的に低い濃度で、好ましくは１Ｍ以下、より好ましくは１００ｍＭ以下、さらに好ましくは１０ｍＭ以下で存在する。   Preferably, the buffer substance used is present at a relatively low concentration, preferably 1 M or less, more preferably 100 mM or less, even more preferably 10 mM or less.

本発明において、ｐＨ値が上記ｐＨと若干異なる同じ緩衝液を用いることが可能であり得、または本質的に同じ緩衝機能を有する他の緩衝液を用いることが可能であり得るということは明らかであろう。   Obviously, in the present invention, it may be possible to use the same buffer whose pH value is slightly different from the above pH, or it may be possible to use other buffers having essentially the same buffer function. I will.

本発明において、１０ｘ、５０ｘ、または１００ｘの緩衝濃縮液を用いて、凍結乾燥される混合物に緩衝液を加えることは簡便である。濃縮されたストックの希釈は、ｐＨの有意な変化につながり得るということに気づくべきである。したがって、特定の最終ｐＨを達成することが必要な場合、希釈効果から予測される如何なる変化および混合物における他の成分の影響も考慮するべきである。   In the present invention, it is convenient to add a buffer to the lyophilized mixture using a 10x, 50x, or 100x buffer concentrate. It should be noted that dilution of the concentrated stock can lead to significant changes in pH. Thus, if it is necessary to achieve a specific final pH, any change expected from the dilution effect and the influence of other components in the mixture should be considered.

微粒子とカルボキシル基活性化物質との混合物は、ポリヒドロキシ物質を随意で含む。当該ヒドロキシ物質は好ましくは、糖であり、その多くの例が先行技術において公知である。多くの糖は、凍結乾燥プロセスにおいて安定剤として用いられている。   The mixture of microparticles and carboxyl group activating material optionally includes a polyhydroxy material. The hydroxy material is preferably a sugar, many examples of which are known in the prior art. Many sugars are used as stabilizers in lyophilization processes.

特に好ましい実施の形態では、上記糖はトレハロースである。
抗体のようなタンパク質は多量のアミンおよび多量のカルボキシル基を含むが、ＥＤＣはこのような分子を粒子または他の表面に結合させるように広く用いられる。このような状況では明らかに、抗体の生物活性を変更および／または損ない得る自己重合の危険性が存在する。この危険性は抗体またはＥＤＣの濃度の増加に従って増加する。 In a particularly preferred embodiment, the sugar is trehalose.
While proteins such as antibodies contain large amounts of amines and large amounts of carboxyl groups, EDC is widely used to bind such molecules to particles or other surfaces. Clearly in such situations there is a risk of self-polymerization that can alter and / or impair the biological activity of the antibody. This risk increases with increasing antibody or EDC concentration.

共役効率を増強するためにのみ用いられ得る可能性のある１つの戦略は、低濃度の抗体を用い、カルボジイミドの添加の前に抗体を標的分子（たとえば粒子、表面）の近傍に引き込むことである。   One strategy that could only be used to enhance conjugation efficiency is to use a low concentration of antibody and draw the antibody close to the target molecule (eg, particle, surface) prior to the addition of carbodiimide .

本発明の好ましい実施の形態では、デキストランがコーティングされた粒子と実体との間の共役反応において用いられる緩衝液のイオン強度が相対的に低い。これにより、共役されるべき分子の初期の非共有結合の静電的相互作用を促進する。微粒子上のカルボキシルへの抗体上のプロトン化されるアミンの近接により、相対的に低濃度のＥＤＣでの効率的な反応が可能になる。さらに、低濃度のＥＤＣの使用により、反応を停止するのに必要な失活剤の量が低減される。   In a preferred embodiment of the invention, the ionic strength of the buffer used in the conjugation reaction between the dextran-coated particles and the entity is relatively low. This facilitates the initial non-covalent electrostatic interaction of the molecules to be conjugated. The proximity of the protonated amine on the antibody to the carboxyl on the microparticle allows an efficient reaction with relatively low concentrations of EDC. In addition, the use of low concentrations of EDC reduces the amount of quenching agent required to stop the reaction.

低いイオン強度の溶液が容易に用いられ得ない場合、たとえばＥＤＣといったカルボキシル基をより活性化する物質を用いるか、または（可能性としてＥＤＣの反応性を増加させる）７〜４の範囲の低いｐＨを用い、かつマイナスに帯電した表面との非共有結合相互作用を促進し得る抗体上の陽電荷を増加させることにより、反応効率は増加され得る。   If a solution with low ionic strength cannot be used easily, use a substance that activates more carboxyl groups, such as EDC, or a low pH in the range of 7-4 (possibly increasing the reactivity of EDC) By increasing the positive charge on the antibody, which can promote non-covalent interactions with negatively charged surfaces, the reaction efficiency can be increased.

微粒子は共役反応の後で、意図する用途での必要に応じて緩衝液の配合物を変更し、かつ過剰反応物質または副産物を取り除くよう、当該技術において周知の方法を用いてさらに処理されてもよい。微粒子の特性および大きさに依存するとともに、取り除かれる分子の大きさに依存して、脱塩、透析、または遠心分離／洗浄といった処理が用いられ得る。脱塩は、少ない分子が取り除かれる場合にのみ十分である。透析は、適切な分画分子量を有する透析膜の選択に従って、広い範囲の大きさの分子に適用され得る。   The microparticles may be further processed after the conjugation reaction using methods well known in the art to alter the buffer formulation as needed for the intended application and to remove excess reactants or byproducts. Good. Depending on the nature and size of the microparticles, and depending on the size of the molecule being removed, processes such as desalting, dialysis, or centrifugation / washing can be used. Desalting is sufficient only if few molecules are removed. Dialysis can be applied to a wide range of molecules according to the selection of dialysis membranes with the appropriate fractional molecular weight.

共役反応自体および／または過剰な反応物質を粒子から洗い流すのに用いられる緩衝液は、非特異性または他の望ましくない結合相互作用を除去するような洗浄剤を含んでもよい。たとえば、微粒子と非共有結合で関連付けられる抗体を取り除くか、または共役した微粒子と、側方流動装置において用いられる材料との相互作用を低減する洗浄剤を含んでもよい。   The buffer used to wash out the coupling reaction itself and / or excess reactants from the particles may include detergents that remove non-specific or other undesired binding interactions. For example, an antibody associated with the microparticles that is non-covalently associated may be removed or a detergent may be included that reduces the interaction of the conjugated microparticles with the materials used in the lateral flow device.

簡便なことに、この洗浄剤は、粒子の乾燥たとえば凍結乾燥の前にカルボキシル基活性化物質とともに導入されてもよい。代替的には、凍結乾燥された混合物の溶解に用いられる抗体とともに導入されてもよい。代替的には、共役反応が終了したか、もしくは失活剤の添加により終了させられた後に導入されてもよい。抗体と一緒または共役の後の洗浄剤の導入は、反応混合物の組成物または最終複合体の組成物が各実験の目的に合うように任意に変動され得るので、最も高い柔軟性が提供される。   Conveniently, the detergent may be introduced with the carboxyl group activating substance prior to drying of the particles, such as lyophilization. Alternatively, it may be introduced with the antibody used to dissolve the lyophilized mixture. Alternatively, it may be introduced after the conjugation reaction has ended or has been terminated by the addition of a quencher. The introduction of a detergent together with or after conjugation with the antibody provides the greatest flexibility as the composition of the reaction mixture or the composition of the final complex can be varied arbitrarily to suit the purpose of each experiment. .

コーティングされていない粒子がカルボキシル基活性化物質と組み合された場合、好ましくは、物質との反応を許可しない条件が用いられる。なぜならばこれは、凍結乾燥の前に粒子の凝集を促進し得るからである。これらの条件は、凍結乾燥の後で、好適な緩衝液に求核剤を加えることにより調節されてもよく、これにより活性化物質が媒介する反応について適切な条件を提供する。   When uncoated particles are combined with a carboxyl group-activating substance, conditions are preferably used that do not allow reaction with the substance. This is because it can promote particle aggregation prior to lyophilization. These conditions may be adjusted after lyophilization by adding a nucleophile to a suitable buffer, thereby providing appropriate conditions for the activator-mediated reaction.

本発明の方法は光顕微鏡検査、透過型電子顕微鏡検査、走査電子顕微鏡検査、ウェスタンブロッティング、および側方流動における用途を有する金粒子とともに用いられ得る。金粒子は広範囲の大きさで商業的に利用可能である。生物学的な用途では、もっとも一般な球状の粒子が用いられる。用途ごとに最良の直径は変動する。   The methods of the invention can be used with gold particles having applications in light microscopy, transmission electron microscopy, scanning electron microscopy, western blotting, and lateral flow. Gold particles are commercially available in a wide range of sizes. For biological applications, the most common spherical particles are used. The best diameter will vary from application to application.

ラテックス微粒子と同様に、金粒子も容易に凝集する。抗体を結合するのに用いられる方法は面倒であり、安定した共役を達成するタンパク質濃度およびｐＨ値の範囲にわたる広範囲な試行をしばしば必要とする。結合のメカニズムは完全には分かっていないが、ｐＨがコーティングされるタンパク質のｐＨよりも若干高い値に調節される場合は、成功した結果がより得られやすい。金は、（システインおよびメチオニン残基において見られる）タンパク質中の硫黄原子と、供与結合により相互作用し得る。   Like latex particulates, gold particles also aggregate easily. The method used to bind the antibody is cumbersome and often requires extensive trials over a range of protein concentrations and pH values to achieve stable conjugation. The mechanism of binding is not completely understood, but successful results are more likely to be obtained if the pH is adjusted to a value slightly higher than the pH of the protein being coated. Gold can interact with the sulfur atom in the protein (as found in cysteine and methionine residues) via a donor bond.

本発明では、金粒子は好ましくはアミノおよびチオール官能基の両方を有するデキストランでコーティングされる。これにより、コーティング物質の複数点での結合が与えられる。このコーティングされた粒子は次いで、無水コハク酸で処理され、これによりその後の共役反応において用いられるカルボキシル化された表面が与えられる。   In the present invention, the gold particles are preferably coated with dextran having both amino and thiol functional groups. This provides a bond at multiple points of the coating material. The coated particles are then treated with succinic anhydride, which provides a carboxylated surface that is used in subsequent conjugation reactions.

チオレート化されたデキストランは、当該技術において周知であるいくつかの方法の１つを用いて調製されてもよい。好ましい実施の形態では、ＣＭデキストランは、ＥＤＣが存在した状態で、２つのジアミン、エチレンジアミン、およびシスタミンの混合物と反応される。この修正されたデキストランが次いでＤＴＴで還元され、超過した還元剤を取り除くよう脱塩される。デキストランの表面上のアミン：チオールの比率は、上記２つのジアミンの比率を変動させることにより調節され得る。好ましくは、エチレンジアミン：シスタミンについてモル比は８０：２０である。これは必ずしも、アミン：チオール官能基の比率が同じになるわけではない。典型的に、これらの官能基の比率は約９０：１０である。   Thiolated dextran may be prepared using one of several methods well known in the art. In a preferred embodiment, CM dextran is reacted with a mixture of two diamines, ethylenediamine, and cystamine in the presence of EDC. This modified dextran is then reduced with DTT and desalted to remove excess reducing agent. The amine: thiol ratio on the surface of dextran can be adjusted by varying the ratio of the two diamines. Preferably, the molar ratio for ethylenediamine: cystamine is 80:20. This does not necessarily mean that the ratio of amine: thiol functionality is the same. Typically, the ratio of these functional groups is about 90:10.

チオール基はさらに、当該技術において周知の方法を用いてアミン官能基の割合を変換することにより、アミノ−デキストランのようなアミノ化された分子中に導入されてもよい。   Thiol groups may further be introduced into aminated molecules such as amino-dextran by converting the proportion of amine functional groups using methods well known in the art.

チオール化されたデキストランは、金粒子とともにインキュベートされ、これにより、コーティングがチオール基との供与結合の形成を介して結合することを可能にする。他のモードの相互作用も発生し得るが、これらの相互作用の詳細な知識は、本発明の方法を適用するのに必要ではない。相対的に大きな大きさのデキストランで、コロイド安定性が最も大きくなったことが分かった。４０ｋＤａの大きさ以下のアミノ化されたデキストランで、凝集が明白であった。   Thiolated dextran is incubated with gold particles, thereby allowing the coating to bind via formation of a donor bond with the thiol group. Although other modes of interaction may occur, detailed knowledge of these interactions is not necessary to apply the method of the present invention. It was found that colloidal stability was greatest with relatively large dextran. Aggregation was evident with aminated dextran below 40 kDa in size.

好ましい実施の形態では、約１５０ｋＤａ−５００ｋＤａのチオール化されたデキストランは、４０ｎｍの金粒子のコーティングについて好ましい。   In a preferred embodiment, about 150 kDa-500 kDa thiolated dextran is preferred for coating 40 nm gold particles.

コーティングの後、金粒子は好ましくは、過剰の無水コハク酸で処理され、これにより、高いコロイド安定性を有するコーティングされた粒子を与える。当該粒子は、ＥＤＣと接触され得るとともに、本発明の方法を用いて凍結冷凍され得る。   After coating, the gold particles are preferably treated with excess succinic anhydride, thereby providing coated particles with high colloidal stability. The particles can be contacted with EDC and can be frozen frozen using the method of the present invention.

好ましい実施の形態では、ｐＨ７．２のＭＯＰＳ緩衝液中のコーティングされた金粒子が、凍結乾燥の前にトレハロースおよびＥＤＣと混合される。   In a preferred embodiment, the coated gold particles in pH 7.2 MOPS buffer are mixed with trehalose and EDC prior to lyophilization.

量子ドット（Ｑドット）も、本発明の方法を用いて他の分子に共役され得る。Ｑドットは、細胞および組織画像診断のための有機染料および蛍光タンパク質に対して多くの利点を有する明るい蛍光性無機半導体ナノ粒子である。Ｑドットのコアは典型的に、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）からなり、光化学漂白を低減し、量子収量を増加させるようセレン化亜鉛でコーティングされる。Ｑドットの発光特性はしばしば、粒子の大きさに依存し、したがってＱドットは、製造プロセスの間に大きさの注意深い制御によりスペクトルの特定の部分へと調整され得るが、他のタイプのＱドットでは、蛍光特性は、固定された大きさを維持しつつ組成を変更することにより変化され得る。   Quantum dots (Q dots) can also be conjugated to other molecules using the method of the present invention. Qdots are bright fluorescent inorganic semiconductor nanoparticles that have many advantages over organic dyes and fluorescent proteins for cell and tissue imaging. The core of the Q dot typically consists of cadmium selenide (CdSe) and is coated with zinc selenide to reduce photochemical bleaching and increase quantum yield. The emission characteristics of Qdots often depend on the size of the particles, so the Qdots can be tuned to specific parts of the spectrum with careful control of the size during the manufacturing process, but other types of Qdots Now, the fluorescence properties can be changed by changing the composition while maintaining a fixed size.

Ｑドットは通常非常に疎水性であるが、たとえば両親媒性ポリマー中への封入により生物学的な用途に対応され得る。他のタイプの粒子と同様に、Ｑドットはさまざまな官能基を有する商業的源から得られ得る。   Qdots are usually very hydrophobic, but can be addressed for biological applications, for example by encapsulation in an amphiphilic polymer. Like other types of particles, Qdots can be obtained from commercial sources with various functional groups.

Ｑドットは、両親媒性ポリマー表面でも凝集する傾向を有しており、本発明では、カルボキシル化されたＱドットは好ましくはアミノ化されたデキストランでコーティングされ、これによりコロイド安定性を増強するということが分かった。安定化効果は主として相対的に大きい大きさのデキストランを用いると見られ、当該デキストランは好ましくは４０ｋＤａより大きく、好ましくは１５０ｋＤａ以上である。   Qdots have a tendency to agglomerate even on amphiphilic polymer surfaces, and in the present invention carboxylated Qdots are preferably coated with aminated dextran, thereby enhancing colloidal stability. I understood that. The stabilizing effect is seen mainly with the use of relatively large dextrans, which are preferably greater than 40 kDa, preferably greater than 150 kDa.

特に好ましい実施の形態では、ＥＤＣが媒介するコーティング反応は、ｐＨ７．２のＭＯＰＳ緩衝液中の１５０ｋＤａのＡＭ−デキストランを用いて行われた。   In a particularly preferred embodiment, the EDC mediated coating reaction was performed using 150 kDa AM-dextran in a MOPS buffer at pH 7.2.

スクシニル化の後、好適な緩衝液中におけるコーティングされたＱドットはトレハロースおよびＥＤＣと混合され、凍結乾燥された。   After succinylation, the coated Qdots in a suitable buffer were mixed with trehalose and EDC and lyophilized.

微粒子への分子の結合における使用とは別に、カルボジイミドも免疫原の調製において用いられる。たとえば、ＥＤＣは、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシニアン）またはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）のような「担体」タンパク質へのアミン基含有またはカルボキシル基含有検体の架橋を媒介するよう用いられ得る。担体タンパク質はしばしば、カルボキシル基活性化物質の存在した状態で、単独重合へとつながり得るカルボキシルおよびアミン官能基を有するが、重合は必ずしも有害なものではなく、共役が宿主動物における抗体の形成を誘発する目的で用いられることになる場合、有益であり得る。しかしながら、当該担体にはその表面上に検体分子が施されるように担体タンパク質への検体の十分な共役が存在しなければならない。   Apart from its use in binding molecules to microparticles, carbodiimides are also used in the preparation of immunogens. For example, EDC can be used to mediate cross-linking of amine- or carboxyl-containing analytes to “carrier” proteins such as KLH (keyhole limpet hemocyanin) or BSA (bovine serum albumin). Carrier proteins often have carboxyl and amine functionalities that can lead to homopolymerization in the presence of carboxyl group activators, but polymerization is not necessarily detrimental and conjugation induces the formation of antibodies in the host animal Can be beneficial if it is to be used for that purpose. However, the carrier must have sufficient conjugate of the analyte to the carrier protein so that the analyte molecules are applied on the surface.

陽イオン化された担体タンパク質はしばしば、強い免疫反応を誘発するので、免疫原の生産を主導する。この状況において、凍結乾燥の間の単独重合の可能性が低減されるが、検体はカルボキシル官能基を含まなければならない。グアニジンを生成する、ＥＤＣのようなカルボキシル活性化物質とのアミンの直接反応は、この状況において望まれない副反応であり得る。   Cationized carrier proteins often elicit a strong immune response and thus lead to the production of immunogens. In this situation, the potential for homopolymerization during lyophilization is reduced, but the analyte must contain carboxyl functionality. The direct reaction of the amine with a carboxyl activating material such as EDC to produce guanidine can be an unwanted side reaction in this situation.

ＢＳＡは、エチレンジアミンで陽イオン化され、アルカリ性緩衝液においてＥＤＣがある状態またはない状態で凍結乾燥された。当該凍結乾燥された材料は、カルボキシフルオレスセインと反応され、カルボキシル官能基が、凍結乾燥サイクルの前および間にＥＤＣへの陽イオン化されたＢＳＡの露出の後で、アミノ化されたＢＳＡと反応し得るかどうか確認された。ＥＤＣが欠如しておらず存在する状態では、著しい反応が観察された。   BSA was cationized with ethylenediamine and lyophilized with or without EDC in alkaline buffer. The lyophilized material is reacted with carboxyfluorescein and the carboxyl functional group reacts with aminated BSA before and during the lyophilization cycle and after exposure of cationized BSA to EDC. It was confirmed whether it could be done. In the state where EDC was not absent and was present, a significant response was observed.

本発明の好ましい実施の形態では、担体タンパク質は、陽イオン化され、弱アルカリ性の緩衝液中にＥＤＣが存在する状態で凍結乾燥された。   In a preferred embodiment of the invention, the carrier protein is cationized and lyophilized in the presence of EDC in a weakly alkaline buffer.

本発明の方法はさらに、カルボキシル基活性化物質と接触および乾燥され得る低分子量分子とともに用いられ得る。好適に官能基化された分子との当該混合物のその後の溶解が、共役反応を開始するよう用いられ得る。   The method of the invention can further be used with low molecular weight molecules that can be contacted and dried with a carboxyl group activating substance. Subsequent dissolution of the mixture with suitably functionalized molecules can be used to initiate the coupling reaction.

たとえば、カルボキシフルオレスセインは、アルカリ性ｐＨで糖およびＥＤＣと接触され、凍結乾燥され得る。この材料は、好適なｐＨにて、アミノ化された分子で戻され得る。   For example, carboxyfluorescein can be contacted with sugar and EDC at alkaline pH and lyophilized. This material can be returned with the aminated molecule at a suitable pH.

凍結乾燥の後、カルボン酸物質に共役され得るアミン基またはヒドラジド基を保持する小分子を用いて、同様のアプローチが用いられ得る。   A similar approach can be used with small molecules that retain amine or hydrazide groups that can be conjugated to the carboxylic acid material after lyophilization.

アミン官能基およびカルボキシル官能基の両方を含む物質（たとえばタンパク質）の自己重合を最小化する条件を決定するために、二量体、三量体およびそれより高いポリマーの存在を検出するようＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用い得る。この初期の選別において特定される緩衝液のサブセットは次いで、凍結乾燥の条件下で検査され得る。   In order to determine the conditions that minimize the self-polymerization of substances containing both amine and carboxyl functions (eg proteins), SDS- is used to detect the presence of dimers, trimers and higher polymers. PAGE analysis may be used. The subset of buffers identified in this initial screen can then be examined under lyophilized conditions.

本発明では、ＥＤＣと修正されていないＢＳＡとをさまざまな緩衝液において用いると、ｐＨ８．５のＥＰＰＳおよびｐＨ９．３のＣＨＥＳの緩衝液では反応が最小であることが分かった。ＨＥＰＥＳおよびＭＯＰＳを用いる低いｐＨ値での重合は、検出可能であり、大規模な架橋が、ｐＨ５またはｐＨ６のＭＥＳ緩衝液で発生した。   In the present invention, it was found that when EDC and unmodified BSA were used in various buffers, the reaction was minimal in pH 8.5 EPPS and pH 9.3 CHES buffers. Polymerization at low pH values using HEPES and MOPS was detectable and extensive cross-linking occurred with pH 5 or pH 6 MES buffer.

したがって、本発明の好ましい実施の形態においては、カルボキシル基およびアミン基の両方を含むタンパク質分子が、＞ｐＨ７好ましくは＞ｐＨ８の緩衝液中においてＥＤＣと接触および凍結乾燥され得る。酸性の緩衝液におけるアミン基含有またはカルボキシル基含有の小分子とのその後の反応が行われ得る。   Thus, in a preferred embodiment of the present invention, protein molecules containing both carboxyl and amine groups can be contacted and lyophilized with EDC in a buffer of> pH 7, preferably> pH 8. Subsequent reaction with a small molecule containing an amine group or carboxyl group in an acidic buffer can be performed.

好ましくは、当該小分子は、タンパク質の自己重合を防止または最小化するよう超過量存在する。   Preferably, the small molecule is present in excess to prevent or minimize protein self-polymerization.

観察中の特定のＥＤＣが媒介する反応にかかわらず、如何なるバイオコンジュゲーション実験でも、当該反応を終結する方法が確立されなければならない。本発明における反応を停止するのに利用可能な方法は、他のＥＤＣコンジュゲーション処置のための方法と同一である。   Regardless of the reaction mediated by the particular EDC being observed, a method must be established for any bioconjugation experiment to terminate the reaction. The methods available to stop the reaction in the present invention are the same as other methods for EDC conjugation treatment.

本発明の方法に従って行われる反応は、反応混合物の希釈、ＥＤＣを非活性化することが可能な物質の添加、他の態様で共役反応に干渉することが可能な物質の添加、またはこれらのアプローチの組合せにより失活され得る。   The reaction carried out according to the method of the present invention may involve dilution of the reaction mixture, addition of a substance capable of deactivating EDC, addition of a substance that may otherwise interfere with the coupling reaction, or these approaches Can be deactivated by a combination of

過剰なＥＤＣおよび副産物の物理的分離は、特に共役反応の産物が脱塩クロマトグラフィマトリックスの孔よりも直径が大きな大きい分子である場合、脱塩により迅速および容易に達成され得る。   Physical separation of excess EDC and by-products can be accomplished quickly and easily by desalting, especially when the product of the coupling reaction is a large molecule that is larger in diameter than the pores of the desalting chromatography matrix.

カルボジイミド反応において干渉する物質も公知である。たとえば、チオールは、カルボジイミドを非活性化し、反応混合における生体分子と対応可能な濃度で用いられ得る。非常に高濃度のチオールは、適切な構造および生体機能を維持するためにその完全性が必要とされ得るジスルフィド架橋を有する抗体分子または他の分子の場合、禁忌であり得る。   Substances that interfere in the carbodiimide reaction are also known. For example, thiols can be used at concentrations that deactivate carbodiimide and are compatible with biomolecules in the reaction mixture. Very high concentrations of thiols can be contraindicated in the case of antibody molecules or other molecules with disulfide bridges whose integrity may be required to maintain proper structure and biological function.

カルボキシルは、ｏ−アシルイソ尿素中間体を介してカルボジイミドの加水分解を加速することが知られており、過剰量で存在する場合、制限された量のカルボジイミドのための共役反応における任意の生体分子上のカルボキシルと競合し得る。このアプローチの場合、失活剤から生成されるｏ−アシルイソ尿素誘導体がさらに、コンジュゲーション混合物において生体分子に結合されたアミンと反応し得る可能性を考えるべきである。この態様でのアミンのキャッピングはすべての状態において好適となり得ない。   Carboxyl is known to accelerate the hydrolysis of carbodiimide via an o-acylisourea intermediate and, when present in excess, on any biomolecule in a conjugation reaction for a limited amount of carbodiimide. Can compete with other carboxyls. In the case of this approach, it should be considered that the o-acylisourea derivative generated from the quenching agent may further react with the amine bound to the biomolecule in the conjugation mixture. Amine capping in this manner may not be suitable in all situations.

同様に、十分に高濃度のアミンは、ＥＤＣを攻撃するよう用いられ得るが、複合体上に生成されるｏ−アシルイソ尿素部分へ失活剤分子が結合する可能性も考慮される必要がある。   Similarly, a sufficiently high concentration of amine can be used to attack EDC, but the possibility of quencher molecules binding to the o-acylisourea moiety produced on the complex also needs to be considered. .

ヒドロキシルアミンもＥＤＣが仲介する反応に干渉すると報告されており、失活剤としても用いられ得る。   Hydroxylamine has also been reported to interfere with EDC-mediated reactions and can also be used as a quencher.

リン酸緩衝液における反応ではしばしば、ＥＤＣを用いることが推奨されるが、リン酸塩が反応効率を低減するという困惑させる証拠が存在する。特に他のタイプの失活剤が禁忌である場合に、リン酸緩衝液を共役反応の終わりに添加することが望ましくあり得る。   Although it is often recommended to use EDC in reactions in phosphate buffer, there is confounding evidence that phosphate reduces reaction efficiency. It may be desirable to add a phosphate buffer at the end of the coupling reaction, particularly when other types of quenching agents are contraindicated.

どのようなタイプの失活剤が用いられても、もっとも望ましい濃度は、ＥＤＣの初期濃度、失活ステップについて許可される時間、複合体の意図する用途、および共役反応において伴われる分子のタイプの考慮から決定されることになる。   Whatever type of quenching agent is used, the most desirable concentration is that of the initial concentration of EDC, the time allowed for the quenching step, the intended use of the complex, and the type of molecule involved in the conjugation reaction. Will be determined from consideration.

過剰なＥＤＣが複合体から物理的に分離されない１ステップの方法の場合、ＥＤＣの直接的な非活性化が、最適な方法である。特に好ましい実施の形態では、ベータメルカプトエタノールが失活剤であり、ｐＨ＞７、好ましくは約ｐＨ８の緩衝液に導入される。緩衝液は、たとえばＴＢＳまたはＰＢＳであってもよい。   For one-step methods where excess EDC is not physically separated from the complex, direct deactivation of EDC is the optimal method. In a particularly preferred embodiment, beta mercaptoethanol is the quenching agent and is introduced into a buffer at pH> 7, preferably about pH 8. The buffer may be TBS or PBS, for example.

最後に、本発明の方法は、ラテックス微粒子、金微粒子、およびＱドットを含む異なるタイプのコーティングされた微粒子に適用されている。生体分子および小さな有機分子もＥＤＣとともに凍結乾燥され、共役反応に用いられている。当該方法はさらに、代替的なカルボキシル活性化剤であるＷＲＫに適用されてもよい。各タイプの粒子をコーティングするのに必要とされるデキストランの最小の大きさは変動し得るが、本願明細書において記載される方法から、デキストランの大きさの範囲は、任意の新しいタイプの粒子を用いる第１のステップとして評価されるべきであるのは明らかである。さらに、以下により詳細に例示される本発明の精神および範囲から逸脱することがなければ、凍結乾燥された混合物の組成において多くの変形例が存在し得ることは明らかである。   Finally, the method of the present invention has been applied to different types of coated particulates including latex particulates, gold particulates, and Qdots. Biomolecules and small organic molecules are also lyophilized with EDC and used for conjugation reactions. The method may further be applied to WRK, which is an alternative carboxyl activator. While the minimum size of dextran required to coat each type of particle can vary, from the methods described herein, the range of dextran sizes can be any new type of particle. Obviously it should be evaluated as the first step to use. Furthermore, it will be apparent that there can be many variations in the composition of a lyophilized mixture without departing from the spirit and scope of the invention, illustrated in greater detail below.

本発明を、以下の実施例における例示により、添付の図面を参照して詳細に記載する。   The invention will now be described in detail by way of illustration in the following examples with reference to the accompanying drawings.

さまざまな緩衝液条件で、５分（Ａ）または２４時間（Ｂ）（実施例１）のいずれかのＥＤＣのプレインキュベーションの後、バイオコンジュゲーション分析（ＢＳＡゲル化）において測定されたＥＤＣの安定性を示す図である。EDC stability measured in bioconjugation analysis (BSA gelation) after preincubation of EDC for either 5 minutes (A) or 24 hours (B) (Example 1) at various buffer conditions It is a figure which shows sex. さまざまな緩衝液でのインキュベーションの後のアニリンとの反応により測定されるＥＤＣの安定性を示す図であり、Ｆｄは、サンプルが当該分析における試験の前に凍結乾燥されたことを意味し、（−）は、サンプルが凍結乾燥されなかったことを意味し、（ｂ）は分析ブランク（５サンプルの平均）（実施例２）を意味する図である。FIG. 5 shows the stability of EDC as measured by reaction with aniline after incubation with various buffers, Fd means that the sample was lyophilized prior to testing in the analysis; -) Means that the sample was not lyophilized, and (b) means the analysis blank (average of 5 samples) (Example 2). さまざまなカルボキシル化された分子の存在した状態で、ｐＨ６のＭＥＳ緩衝液またはｐＨ８．５のＥＰＰＳ緩衝液のいずれかにおけるインキュベーションの後でアニリンとの反応により測定されるＥＤＣの安定性を示す図であり、Ａｃは酢酸ナトリウム、Ｃｉｔはクエン酸三ナトリウム、ＥｄはＥＤＴＡ、ｂは分析ブランク（実施例２）を示す図である。Figure 2 shows the stability of EDC as measured by reaction with aniline after incubation in either pH 6 MES buffer or pH 8.5 EPPS buffer in the presence of various carboxylated molecules. In the figure, Ac is sodium acetate, Cit is trisodium citrate, Ed is EDTA, and b is an analysis blank (Example 2). ＥＤＣが存在する状態（Ａ）または存在しない状態（Ｂ）で凍結乾燥され、rabbit IgGが配置されたストリップ上での試験の前にgoat anti rabbit IgGで反応された、サクシニル化デキストランがコーティングされた微粒子を用いた典型的な側方流動試験を示す図である（実施例８）。Lyophilized in the presence (A) or absence (B) of EDC and coated with succinylated dextran reacted with goat anti rabbit IgG prior to testing on strips with rabbit IgG (Example 8) which is a figure which shows the typical side flow test using microparticles | fine-particles. goat anti-rabbit IgGのＱドット複合体とともに伴行する、rabbit IgGが配置された側方流動ストリップについての蛍光読取値を示す図であって、複合体が、goat anti-rabbit IgGの溶液を凍結乾燥された、サクシニル化デキストランがコーティングされたＱドット／ＥＤＣ混合物に添加することにより調製される（実施例１０）図である。Figure 5 shows fluorescence readings for lateral flow strips with rabbit IgG that accompany the goat anti-rabbit IgG Q-dot complex, where the complex freezes the goat anti-rabbit IgG solution. (Example 10) prepared by adding to a dried, succinylated dextran coated Qdot / EDC mixture. rabbit IgGが配置されたストリップ上での試験の前に、ウッドワード試薬Ｋおよびgoat anti-rabbit IgGの濃度を変動させて反応された、サクシニル化デキストランがコーティングされた微粒子を用いる側方流動試験を示す図であり、Ａは１００ｍＭのＷＲＫ、Ｂは１０ｍＭのＷＲＫ、Ｃは１ｍＭのＷＰｖＫ（実施例１１）である図である。Prior to testing on strips with rabbit IgG, a lateral flow test using microparticles coated with succinylated dextran reacted with varying concentrations of Woodward reagent K and goat anti-rabbit IgG FIG. 4 is a diagram showing A, 100 mM WRK, B, 10 mM WRK, and C, 1 mM WPvK (Example 11). rabbit IgGが配置されたストリップ上での試験の前に、異なる緩衝液において１０ｍＭのウッドワード試薬Ｋおよびgoat anti rabbit IgGと反応された、サクシニル化デキストランがコーティングされた微粒子を用いる側方流動試験を示す図であって、ＡはｐＨ６のＭＥＳ緩衝液でありＢは、ｐＨ７．０のＭＯＰＳ緩衝液であり、ｐＨ５のＭＥＳ緩衝液である（実施例１２）図である。Prior to testing on strips on which rabbit IgG was placed, a lateral flow test using microparticles coated with succinylated dextran reacted with 10 mM Woodward reagent K and goat anti rabbit IgG in different buffers was performed. FIG. 4 is a diagram showing a MES buffer solution at pH 6 and B is a MOPS buffer solution at pH 7.0 and a MES buffer solution at pH 5 (Example 12).

実施例１ ＢＳＡコンジュゲーション分析
ｐＨ６．０の０．５ＭのＭＥＳにおいて、ＢＳＡが１００ｍｇ／ｍｌの濃度で調整された。水中のＥＤＣのサンプル（Fluka社；製品コード０３４４９）（１Ｍ）が１：１の比率でさまざまな試験緩衝液または溶液（各１００ｍＭ）と混合された。ＥＤＣ／緩衝混合液は、２５℃でプレインキュベートされ、１００ｕｌのアリコートが、異なる時点で採取され、０．４ｍｌのＢＳＡ溶液に加えられる。これにより、１００ｍＭの最終ＥＤＣ濃度（インキュベート段階の間に分解はないとする）が与えられた。約１０秒ごとにチューブを反転させ、各々の場合においてゲルが形成される時間（すなわち反転の際に流体の動きがない時点）を判定した。 Example 1 BSA Conjugation Analysis In 0.5 M MES at pH 6.0, BSA was adjusted at a concentration of 100 mg / ml. Samples of EDC in water (Fluka; product code 03449) (1M) were mixed with various test buffers or solutions (100 mM each) in a 1: 1 ratio. The EDC / buffer mixture is preincubated at 25 ° C. and 100 ul aliquots are taken at different time points and added to 0.4 ml of BSA solution. This gave a final EDC concentration of 100 mM (assuming no degradation during the incubation step). The tube was inverted approximately every 10 seconds and in each case the time for the gel to form (i.e., when there was no fluid movement during the inversion) was determined.

それらの結果が、５分のプレインキュベート時間後の図１Ａと、２４時間後の図１Ｂに示される。なお、最短のゲル化タイムがもっとも高い高さを有するバーに対応するように、逆数の値がプロットされている。ｐＨ８のＥＤＴＡ、ｐＨ４の酢酸ナトリウム、またはクエン酸三ナトリウムの場合、５分のプレインキュベーションの後、ゲル化は見られなかった。リン酸緩衝液（アルカリ性のｐＨ）、ホウ酸塩、および炭酸ナトリウムの場合、プレインキュベーションの後、ゲル化の著しい遅延が見られた。５分間のＨＣｌを用いたプレインキュベーションでは、ゲル化反応が最も早かったが、当該サンプルは２４時間のプレインキュベーションの後ではゲル化を起こさなかった。６日のプレインキュベーション（データは示さず）の後でも、６つのサンプル（水、ＭＯＰＳ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉ、Ｈｅｐｅｓ、ＮａＯＨ）はまだ、ＢＳＡのゲル化を引き起こすことができた。   The results are shown in FIG. 1A after a 5 minute preincubation time and FIG. 1B after 24 hours. The reciprocal values are plotted so that the shortest gelation time corresponds to the bar having the highest height. In the case of pH 8 EDTA, pH 4 sodium acetate, or trisodium citrate, no gelation was seen after 5 minutes preincubation. In the case of phosphate buffer (alkaline pH), borate, and sodium carbonate, a significant delay in gelation was seen after preincubation. Preincubation with HCl for 5 minutes gave the fastest gelation reaction, but the sample did not gel after 24 hours preincubation. Even after 6 days of preincubation (data not shown), 6 samples (water, MOPS, EPPS, Tri, Hepes, NaOH) could still cause BSA gelation.

ゲル化時間と新たに調製されたＥＤＣの濃度との間の関係を以下のように調べた（濃度、ゲル化の時間［分．秒）。すなわち、１００ｍＭ、６．５９；９０ｍＭ、８．１２；８０ｍＭ、９．１８；７０ｍＭ、１１．２０；６０ｍＭ、１３．２１；５０ｍＭ、１６．１２；４０ｍＭ、２２．４７；３０ｍＭ、５０．１４；２０ｍＭおよび１０ｍＭ；ゲル化なし、であった。したがって、６日間のプレインキュベーションの後でも、いくつかのＥＤＣ混合物は、８０％未満の分解を示す。最良の場合（水／ＥＤＣ）では、＜２０分である観察されたゲル化時間は、６０％未満の分解のレベルに対応する。   The relationship between gelation time and freshly prepared EDC concentration was examined as follows (concentration, gelation time [minutes.seconds]). That is, 100 mM, 6.59; 90 mM, 8.12; 80 mM, 9.18; 70 mM, 11.20; 60 mM, 13.21; 50 mM, 16.12; 40 mM, 22.47; 30 mM, 50.14; 20 mM and 10 mM; no gelation. Thus, even after 6 days of pre-incubation, some EDC mixtures show less than 80% degradation. In the best case (water / EDC), an observed gel time of <20 minutes corresponds to a level of degradation of less than 60%.

実施例２ アニリン分析
軽微な修正をしてWilliamsら（Anal. Biochem. 114, 173-176 [1981]）によって本質的に説明されたようにアニリン分析を行った。ＥＤＣ（１００ｕｌ）を含有するサンプルを１００ｕｌのアニリン塩酸塩（１Ｍ）に加え、１分間２５℃でインキュベートした。当該混合物の５０ｕｌのアリコートを１．２０ｍｌの２ＭのＨＣｌを加え、（ＥＤＣのない）コントロールに対して吸収度を読み取ると２３０ｎｍであった。 Example 2 Aniline Analysis Aniline analysis was performed essentially as described by Williams et al. (Anal. Biochem. 114, 173-176 [1981]) with minor modifications. Samples containing EDC (100 ul) were added to 100 ul aniline hydrochloride (1M) and incubated for 1 minute at 25 ° C. A 50 ul aliquot of the mixture was added with 1.20 ml of 2M HCl and the absorbance read on a control (without EDC) was 230 nm.

選択された緩衝液（ｐＨ７．２の１ＭのＭＯＰＳ；ｐＨ７．５の１ＭのＨｅｐｅｓ；ｐＨの８．５の０．５ＭのＥＰＰＳ；ｐＨ６の０．５ＭのＭＥＳ；ｐＨ９．３の０．５ＭのＣＨＥＳといったストックから調整された１０ｍＭの最終物）において、ＥＤＣの安定性（１０ｍＭの最終物）を調べた。３時間のインキュベーションの後、活性の損失がほとんどないか全くないことが観察された（データは示さず）。ＥＤＣを用いる凍結乾燥について、これらの緩衝液の好適性が調べられた。実施例６に記載されるような凍結乾燥された材料が、水で戻され、アニリン分析において検査された。ＣＨＥＳ／ＥＤＣ混合物では、活性の大幅な損失が見られたが、他の混合物は、低い活性損失を示した（図２）。   Selected buffer (1M MOPS at pH 7.2; 1M Hepes at pH 7.5; 0.5M EPPS at pH 8.5; 0.5M MES at pH 6; 0.5M at pH 9.3; The stability of EDC (10 mM final) was examined in a 10 mM final prepared from a stock such as CHES. After 3 hours of incubation, little or no loss of activity was observed (data not shown). The suitability of these buffers was examined for lyophilization using EDC. Lyophilized material as described in Example 6 was reconstituted with water and examined in aniline analysis. There was a significant loss of activity in the CHES / EDC mixture, while the other mixtures showed a low loss of activity (Figure 2).

ＥＤＣの分解を触媒すると報告されるいくつかの物質（酢酸塩、クエン酸塩、ＥＤＴＡ）の効果は、ｐＨ６の１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液と、ｐＨ８．５の１００ｍＭのＥＰＰＳにおいて調べられた。緩衝液／触媒混合物を調製し、ＥＤＣの添加の前にｐＨ値を示した値に調整した。酢酸塩（モノカルボン酸）、クエン酸塩（トリカルボン酸）またはＥＤＴＡ（テトラカルボン酸）の場合、３時間のインキュベーションの後、ＭＥＳ緩衝液において何らかの活性の損失が見られた。当該損失の程度は、ポリカルボン酸触媒の場合よりもはるかに大きかった。ＥＰＰＳ緩衝液では、活性の損失は、はるかに顕著でない（図３）。   The effects of several substances reported to catalyze the degradation of EDC (acetate, citrate, EDTA) were investigated in 100 mM MES buffer at pH 6 and 100 mM EPPS at pH 8.5. A buffer / catalyst mixture was prepared and the pH value was adjusted to the indicated value prior to the addition of EDC. In the case of acetate (monocarboxylic acid), citrate (tricarboxylic acid) or EDTA (tetracarboxylic acid), some activity loss was seen in the MES buffer after 3 hours incubation. The extent of the loss was much greater than with the polycarboxylic acid catalyst. In EPPS buffer, the loss of activity is much less pronounced (Figure 3).

実施例３ ＡＭ−デキストランの調製
デキストラン（最終濃度１００ｍｇ／ｍｌ）が、２ＭのＮａＯＨにおける１Ｍのブロモ酢酸との反応によりＣＭ（カルボキシメチル）デキストランに変換された。２５℃で４８時間後、濃縮したＨＣｌの小さいアリコートを注意深く添加することにより、当該溶液はｐＨ〜７．５に中和された。ｐＨ６．０の５０ｍＭのＭＥＳと平衡するSephadex G25（ＰＤ１０カラム；GE Biosciences社）上で１．５ｍｌだけ脱塩することにより過剰な反応物質および副産物からＣＭ−デキストランが分離された。ＣＭ−デキストランは２ｍｌの量で溶離され、ｐＨ６．０の０．５ＭのＭＥＳにおいて、エチレンジアミンの２Ｍのストックが４００ｕｌ、添加された。１Ｍのストックから１００ｍＭの最終濃度までＥＤＣが添加され、当該混合物が２５℃にて一晩インキュベートされた。１００ｍＭの濃度までＥＤＣをさらに添加し、上記のようにインキュベーションを繰り返した。Sephadex G25上にて、ＡＭ−デキストラン混合物が１ｍｌだけ脱塩され、ｐＨ６．０の５０ｍＭのＭＥＳとなった。これにより、最終濃度が〜２５ｍｇ／ｍｌとなった。この処置は、平均サイズが５００ｋＤａ、１５０ｋＤａ、４０ｋＤａ（Pharmacosmos社；製品コード５５１０ ０５００ ４００６、５５１０ ０１５０ ４００６、５５１０ ００４０ ４００６）であるデキストランポリマーとともに用いられた。 Example 3 Preparation of AM-dextran Dextran (final concentration 100 mg / ml) was converted to CM (carboxymethyl) dextran by reaction with 1 M bromoacetic acid in 2 M NaOH. After 48 hours at 25 ° C., the solution was neutralized to pH˜7.5 by careful addition of a small aliquot of concentrated HCl. CM-dextran was separated from excess reactants and by-products by desalting only 1.5 ml on Sephadex G25 (PD10 column; GE Biosciences) equilibrated with 50 mM MES at pH 6.0. CM-dextran was eluted in a volume of 2 ml and 400 ul of a 2M stock of ethylenediamine was added in 0.5M MES at pH 6.0. EDC was added from a 1M stock to a final concentration of 100 mM and the mixture was incubated at 25 ° C. overnight. Additional EDC was added to a concentration of 100 mM and incubation was repeated as described above. On Sephadex G25, only 1 ml of the AM-dextran mixture was desalted to 50 mM MES at pH 6.0. This resulted in a final concentration of ˜25 mg / ml. This treatment was used with dextran polymers having an average size of 500 kDa, 150 kDa, 40 kDa (Pharmacosmos; product code 5510 0500 4006, 5510 0150 4006, 5510 0040 4006).

実施例４ ＡＭ−デキストランでのラテックス粒子のコーティング
ブルーラテックスミクロスフィア（２７０ｎｍ直径；パーキングエリア（parking area）６１、Seradyn社、製品コード８３１００６７００２０３５０）（１ｍｌ）が４ｍｌの１５０ｋＤａのＡＭ−デキストラン（実施例３）への希釈によりコーティングされた。２５℃で３０分間インキュベートした後、ＥＤＣが１００ｍＭの最終濃度まで添加され、微粒子が２５℃で２４時間穏やかに撹拌された。 Example 4 Coating Latex Particles with AM-Dextran Blue Latex Microspheres (270 nm Diameter; Parking Area 61, Seradyn, Product Code 83100670020350) (1 ml) 4 ml of 150 kDa AM-Dextran (Example 3) ). After incubating at 25 ° C. for 30 minutes, EDC was added to a final concentration of 100 mM and the microparticles were gently agitated at 25 ° C. for 24 hours.

実施例５ サクシニル化微粒子の製造
実施例４に記載されるように製造されたデキストランコーティング粒子に、２ＭのストックからｐＨ７．５にて４００ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液が加えられ、１００ｍＭの最終濃度まで無水コハク酸（ＤＭＳＯにおいて１Ｍ）が添加された。当該反応混合物は穏やかに撹拌され、５ＭのＮａＯＨの少ないアリコートの周期的な追加によりｐＨ６とｐＨ７との間で保持された。ひとたびｐＨが安定化すると（通常約１０分後）、当該懸濁液はセルロースエステル透析バッグ（１００万ダルトンカットオフ；Spectrum社、製品コード１３１４８６）に運ばれ、ｐＨ６．０の２５ｍＭのＭＥＳに対して広く透析された。各バッチの希釈は、側方流動分析において調整され、バルク材料は２５ｍＭのＭＥＳ緩衝液で好適な作用濃度に希釈された。 Example 5 Preparation of succinylated microparticles To dextran coated particles prepared as described in Example 4, 400 mM Hepes buffer is added at pH 7.5 from a 2M stock to a final concentration of 100 mM anhydrous succinate. Acid (1M in DMSO) was added. The reaction mixture was gently stirred and held between pH 6 and pH 7 by periodic addition of small aliquots of 5M NaOH. Once the pH has stabilized (usually after about 10 minutes), the suspension is transferred to a cellulose ester dialysis bag (1 million dalton cut-off; Spectrum, product code 131486) against 25 mM MES at pH 6.0. Was widely dialyzed. The dilution of each batch was adjusted in the lateral flow analysis and the bulk material was diluted to a suitable working concentration with 25 mM MES buffer.

実施例６ デキストランがコーティングされたラテックス微粒子の凍結乾燥
実施例４および５に記載されるように調製されるさまざまなデキストランコーティングラテックス微粒子により、同じ基本的な処置が用いられた。当該微粒子はまず、１−１０ｍＭの濃度の緩衝液へと脱塩または透析のいずれかを行うことにより、緩衝液交換された。代替的には、緩衝濃縮液（少なくとも０．５Ｍ）が、水に懸濁された微粒子に添加され、必要な最終緩衝液濃度が与えられる。用いられる緩衝液タイプには、ｐＨ９のＥＰＰＳ、ｐＨ８．５のＥＰＰＳ、ｐＨ７．２のＭＯＰＳ、ｐＨ７のＭＯＰＳ、ｐＨ７．０のＨｅｐｅｓ、ｐＨ６のＭＥＳ、およびｐＨ５のＭＥＳが含まれる。緩衝されたコーティング微粒子溶液の０．８ｍｌに、１００ｕｌのトレハロースストック（１ｇが２ｍｌの水に溶解される）と、１００ｕｌのＥＤＣストック（必要な最終濃度に依存して０〜１００ｍＭの範囲）とが加えられる。多くの場合、最終濃度は１．５ｍＭまたは１０ｍＭであった。必要に応じて、体積を増加または減少させて、凍結乾燥に必要な量の材料を提供する。微粒子を５０ｕｌまたは１００ｕｌだけ混合および供給し、液体窒素中で凍結し、Virtis Advantage凍結乾燥器において以下のプログラムに従って凍結乾燥された。すなわち、ステップ１：温度−４０℃、継続時間１３２０分；ステップ２：温度−１０℃、継続時間６０分；ステップ３：温度＋２０℃、継続時間６０分である。これらのチューブは、１回または２回の側方流動試験を行うのに十分な材料を提供した。増加は、より多くの体積を凍結乾燥するか、またはさらに濃縮した微粒子（実施例２０）を用いることにより達成された。 Example 6 Lyophilization of dextran-coated latex microparticles The same basic procedure was used with various dextran-coated latex microparticles prepared as described in Examples 4 and 5. The microparticles were first buffer exchanged by either desalting or dialysis into a 1-10 mM concentration buffer. Alternatively, buffer concentrate (at least 0.5M) is added to the microparticles suspended in water to give the required final buffer concentration. Buffer types used include pH 9 EPPS, pH 8.5 EPPS, pH 7.2 MOPS, pH 7 MOPS, pH 7.0 Hepes, pH 6 MES, and pH 5 MES. 0.8 ml of the buffered coating microparticle solution contains 100 ul trehalose stock (1 g dissolved in 2 ml water) and 100 ul EDC stock (range 0-100 mM depending on the final concentration required). Added. In many cases, the final concentration was 1.5 mM or 10 mM. If necessary, the volume is increased or decreased to provide the amount of material required for lyophilization. Microparticles were mixed and fed in 50 ul or 100 ul, frozen in liquid nitrogen and lyophilized according to the following program in a Virtis Advantage lyophilizer. Step 1: Temperature −40 ° C., duration 1320 minutes; Step 2: Temperature −10 ° C., duration 60 minutes; Step 3: Temperature + 20 ° C., duration 60 minutes. These tubes provided enough material to perform one or two lateral flow tests. The increase was achieved by lyophilizing a larger volume or using more concentrated microparticles (Example 20).

実施例７ 側方流動ストリップの製造および使用
ニトロセルロース膜（約４ｃｍ×０．４ｃｍ）を、１５０ｍＭのＮａＣｌに５％メタノールを加えたものの中に０．５ｕｌの精製されたrabbit IgG（２ｍｇ／ｍｌ）を有するストリップに沿った約１／３の距離に配置した。ストリップは室温で、通常は２〜２４時間であるが少なくとも６０分間乾かされ、次いで、ｐＨ８のＴＢＳ中またはｐＨ７．２の５０ｍＭのリン酸ナトリウム中の０．１％ＢＳＡで３０分間ブロックされた。ストリップを水の中で０．５％のトレハロースで洗浄し、大気乾燥した。goat anti-rabbit IgGでコーティングされた微粒子を検査するために、配置されたrabbit IgGの位置にもっとも近い当該ストリップの端部を５０ｕｌの微粒子懸濁液に浸し、他方の端部には吸湿紙のパッドを適用した。当該ストリップは、サンプル全体がニトロセルロース膜の中へ入るまで通す。いくつかの場合、ストリップを５０ｕｌの緩衝液にさらに４〜５分移すことにより、バックグラウンドをクリアにした。他の場合では、緩衝液は、変動され得るとともに、特定の緩衝液条件が与えられる。 Example 7 Production and Use of Lateral Flow Strips A nitrocellulose membrane (approximately 4 cm × 0.4 cm) was prepared by adding 0.5 ul of purified rabbit IgG (2 mg / ml) in 150 mM NaCl plus 5% methanol. ) At a distance of about 1/3 along the strip. The strips were allowed to dry at room temperature, usually 2-24 hours, but at least 60 minutes, then blocked with 0.1% BSA in pH 8 TBS or pH 7.2 50 mM sodium phosphate for 30 minutes. The strip was washed with 0.5% trehalose in water and air dried. To inspect the particles coated with goat anti-rabbit IgG, the end of the strip closest to the position of the placed rabbit IgG is immersed in a 50 ul microparticle suspension, and the other end is made of hygroscopic paper. A pad was applied. The strip is passed until the entire sample has entered the nitrocellulose membrane. In some cases, the background was cleared by transferring the strip to 50 ul of buffer for an additional 4-5 minutes. In other cases, the buffer can be varied and given specific buffer conditions.

実施例８ 抗体との、凍結乾燥された微粒子の反応
凍結乾燥された微粒子は、ｐＨ６のＭＥＳ緩衝液(５０−２００ｍＭ)において最終体積５０ｕｌで、goat anti-rabbit IgG（１−５０ｕｇ）を含む溶液により戻された。好適な期間（２．５分〜１時間）の間インキュベートした後、サンプルをｐＨ８．０の１ｍｌのＴＢＳでの希釈により失活した。当該サンプルを１５分間１８０００ｘｇで遠心分離した。上澄みを注意深く廃棄し、そのペレットは、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む５０ｕｌのＴＢＳ中に再懸濁された。図４は、ブルーラテックスの２７０ｎｍのデキストランコーティングされたサクシニル化微粒子を、１０ｍＭのＥＤＣが存在する状態または存在しない状態で、ｐＨ８．５の１０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液を凍結乾燥して得られた典型例を示す図である。 Example 8 Reaction of Lyophilized Microparticles with Antibody Lyophilized microparticles are solutions containing goat anti-rabbit IgG (1-50 ug) in a final volume of 50 ul in pH 6 MES buffer (50-200 mM). Returned by. After incubation for a suitable period (2.5 minutes to 1 hour), the samples were inactivated by dilution with 1 ml TBS at pH 8.0. The sample was centrifuged at 18000 xg for 15 minutes. The supernatant was carefully discarded and the pellet was resuspended in 50 ul TBS containing 0.1% Tween20. FIG. 4 shows a typical example obtained by lyophilizing 270 nm dextran-coated succinylated microparticles of blue latex in the presence or absence of 10 mM EDC in 10 mM EPPS buffer at pH 8.5. FIG.

実施例９ Ｑドット共役反応
Ｑドット（Crystalplex社、２０ｎｍ、製品コードＮＣＣ−６６５、カルボキシル化ナノクラスタ、発光最大６６５ｎｍ；２８ｍｇ／ｍｌ）をｐＨ７．０の５０ｍＭのＭＯＰＳにおいて１／１０に希釈し、ｐＨ７．０の５０ｍＭのＭＯＰＳにおいて１００ｕｌの懸濁液を４００ｕｌの１５０ｋＤａのＡＭ−デキストラン（実施例３）と組み合わせ、Spiramix上にて３０分間２５℃でインキュベートした。ＥＤＣ（２６ｕｌ）を２Ｍのストックから添加して１００ｍＭの最終濃度を与えた。５〜１６時間のインキュベートの後、ｐＨ７．５の１６０ｕｌの２ＭのＨＥＰＥＳ／１０ｍＭのＥＤＴＡ、およびｐＨ７．０の４０ｕｌの５０ｍＭのＭＯＰＳとともに、ＤＭＳＯ中の８０ｕｌの１Ｍの無水コハク酸が懸濁液に添加された。Spiramix上での３０分のインキュベーションの後、当該サンプルは、水で平衡化されたＰＤ１０カラム上で脱塩された。サクシニル化されたナノクラスタは、微量遠心管において１５分間１２０００ｒｐｍでスピンされ、ペレットが４００ｕｌの水に再懸濁された。 Example 9 Q Dot Conjugation Reaction Qdot (Crystalplex, 20 nm, product code NCC-665, carboxylated nanocluster, emission maximum 665 nm; 28 mg / ml) was diluted 1/10 in 50 mM MOPS at pH 7.0, 100 ul suspension in 50 mM MOPS at pH 7.0 was combined with 400 ul 150 kDa AM-dextran (Example 3) and incubated on Spiramix for 30 minutes at 25 ° C. EDC (26 ul) was added from a 2M stock to give a final concentration of 100 mM. After 5-16 hours of incubation, 80 ul of 1M succinic anhydride in DMSO is added to the suspension along with 160 ul of 2M HEPES / 10 mM EDTA at pH 7.5 and 40 ul of 50 mM MOPS at pH 7.0. Added. After 30 minutes incubation on Spiramix, the sample was desalted on a PD10 column equilibrated with water. Succinylated nanoclusters were spun at 12000 rpm for 15 minutes in a microcentrifuge tube and the pellet was resuspended in 400 ul of water.

実施例１０ ＥＤＣが存在する状態で凍結乾燥されたＱドットの反応
実施例９に記載されるように調製されたＱドット懸濁液の一部（５０ｕｌ）を５ｕｌのトレハロースストック（１ｇ＋２ｍｌの水）と、ｐＨ８．５の２．５ｕｌの２００ｍＭのＥＰＰＳと、３ｕｌの１００ｍＭのＥＤＣ（最終濃度５ｍＭ）または水と混合した。サンプルは、実施例６に概説された手順書を用いて凍結および凍結乾燥され、次いで−２０℃で２日間格納された。goat anti-rabbit IgG（２．３ｍｇ／ｍｌのうち１３ｕｌ）と、ｐＨ７．０の６０ｕｌの０．５ＭのＭＯＰＳと、７７ｕｌの水とを含む混合物を調整した。その５０ｕｌ（１０ｕｇの抗体）を、凍結乾燥されたＱドットの各チューブに加えた。実施例８に記載されるように共役および洗浄を行った。側方流動試験を実施例７に記載されるように行った。５０ｕｌの緩衝液がストリップを通過することによりバックグラウンドをクリアにし、５０ｕｌのＴＢＳにおいてblack 96-well plateで、固定化されたrabbit IgGの領域に対応するエリアを切り取り、読み取った（励起３５０ｎｍ／発光６６５ｎｍ）。ＥＤＣを用いるまたは用いないで調製される複合体に対して、図５に示されるように、蛍光読取値はそれぞれ４３５５２および５０３４であった。 Example 10 Reaction of Q Dots Lyophilized in the Presence of EDC A portion (50 ul) of a Q dot suspension prepared as described in Example 9 was added to a 5 ul trehalose stock (1 g + 2 ml water). And 2.5 ul of 200 mM EPPS at pH 8.5 and 3 ul of 100 mM EDC (final concentration 5 mM) or water. Samples were frozen and lyophilized using the protocol outlined in Example 6 and then stored at −20 ° C. for 2 days. A mixture containing goat anti-rabbit IgG (13 ul out of 2.3 mg / ml), 60 ul 0.5 M MOPS at pH 7.0, and 77 ul water was prepared. 50 ul (10 ug antibody) was added to each tube of lyophilized Qdots. Conjugation and washing were performed as described in Example 8. Lateral flow tests were performed as described in Example 7. The background was cleared by passing 50 ul of buffer through the strip, and the area corresponding to the region of immobilized rabbit IgG was cut out and read with a black 96-well plate in 50 ul TBS (excitation 350 nm / emission). 665 nm). For complexes prepared with or without EDC, the fluorescence readings were 43552 and 5034, respectively, as shown in FIG.

実施例１１ ウッドワード試薬Ｋの濃度の最適化
（実施例４に記載されるように調製される）デキストランコーティングされた微粒子（２００ｕｌ）を、ＮＡＰ−５カラムを用いて３５０ｕｌの水へと脱塩した。ウッドワード試薬Ｋ（ＷＲＫ）のストックを水において１Ｍ、１００ｍＭ、および１０ｍＭ調製した。４０ｕｌの微粒子を、３ｕｌの１ｍｇ／ｍｌのgoat anti-rabbit IgG（３ｕｇ）と、１０ｕｌの水と、６ｕｌのＷＲＫストックと混合し、１００ｍＭ、１０ｍＭ、および１ｍＭの最終濃度を与えた。２５℃で３０分間保った後、９５０ｕｌのＴＢＳを加え、サンプルを微量遠心機で１５分間スピンした。ペレットを６０ｕｌのＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０中に再懸濁し、サンプルを側方流動試験（実施例７）において試験した。視覚的な評価により、１００ｍＭのＷＲＫを有するサンプルは、遠心分離の前には明らかに凝集物を含んでいた。これは、図６に示されるように、側方流動ストリップの底部での材料の堆積によって確認された。 Example 11 Optimization of Woodward Reagent K concentration (prepared as described in Example 4) Dextran coated microparticles (200 ul) were desalted into 350 ul water using a NAP-5 column. did. Woodward Reagent K (WRK) stocks were prepared in water at 1 M, 100 mM, and 10 mM. 40 ul microparticles were mixed with 3 ul 1 mg / ml goat anti-rabbit IgG (3 ug), 10 ul water and 6 ul WRK stock to give final concentrations of 100 mM, 10 mM and 1 mM. After holding at 25 ° C. for 30 minutes, 950 ul of TBS was added and the sample was spun for 15 minutes in a microcentrifuge. The pellet was resuspended in 60 ul TBS / 0.1% Tween 20 and the sample was tested in the lateral flow test (Example 7). By visual assessment, the sample with 100 mM WRK clearly contained aggregates prior to centrifugation. This was confirmed by the deposition of material at the bottom of the lateral flow strip, as shown in FIG.

実施例１２ ウッドワード試薬Ｋとの反応のための緩衝液の最適化
水中における４０ｕｌのサクシニル化された２７０ｎｍのブルーラテックス微粒子（実施例５に記載されるように調製された）を３ｕｌの１ｍｇ／ｍｌのgoat anti-rabbit IgG（３ｕｇ）と、６ｕｌの１００ｍＭのＷＲＫ（１０ｍＭの最終濃度）と混合し、ｐＨ６．０の１ＭのＭＥＳと、ｐＨ７．０の１ＭのＭＯＰＳと、ｐＨ５．０の１ＭのＭＥＳとから１０ｕｌの緩衝液を選択した。３０分間の共役、ＴＢＳでの洗浄、および遠心分離の後、各ペレットは６０ｕｌのＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０中に再懸濁された。サンプルを側方流動試験において試験した（実施例７）。結果を図７に示す。もっとも大きなスポット強度は、ｐＨ５．０での反応の後、見られた。 Example 12 Optimization of Buffer for Reaction with Woodward Reagent K 40ul of succinylated 270nm blue latex microparticles (prepared as described in Example 5) in water 3ul of 1mg / Mixed with ml goat anti-rabbit IgG (3 ug) and 6 ul 100 mM WRK (10 mM final concentration), pH 6.0 1 M MES, pH 7.0 1 M MOPS, pH 5.0 1 M 10 ul of buffer was selected from the MES. After 30 minutes of conjugation, washing with TBS, and centrifugation, each pellet was resuspended in 60 ul TBS / 0.1% Tween20. Samples were tested in the lateral flow test (Example 7). The results are shown in FIG. The greatest spot intensity was seen after reaction at pH 5.0.

実施例１３ ウッドワード試薬Ｋを用いるラテックス微粒子の凍結乾燥
実施例４に記載されるように調製された２００ｕｌのサクシニル化された２７０ｎｍのブルーのデキストランコーティングされた微粒子を、４００ｕｌのｐＨ５の２５ｍＭのＭＥＳへと脱塩する。脱塩された微粒子の４０ｕｌを、５ｕｌのトレハロースストック（２ｍｌの水において１ｇ）および５ｕｌの１００ｍＭのＷＲＫと混合し、液体窒素で凍結した。冷凍乾燥は、実施例６におけるプログラムに従って行われた。 Example 13 Lyophilization of Latex Microparticles Using Woodward Reagent K 200 ul of succinylated 270 nm blue dextran coated microparticles prepared as described in Example 4 was added to 400 ul of 25 mM MES at pH 5. Demineralize. 40 ul of desalted microparticles was mixed with 5 ul trehalose stock (1 g in 2 ml water) and 5 ul 100 mM WRK and frozen in liquid nitrogen. Freeze drying was performed according to the program in Example 6.

実施例１４ 少量の有機染料を用いるＥＤＣの凍結乾燥
カルボキシフルオレスセイン（Sigma C7153）をｐＨ９．０の２５ｍＭのＥｐｐｓに溶解し、ｐＨが〜４．０である１０ｍＭのストックを与えた。０．５ｍｌのサンプルを希釈し、０．５ｍｌのｐＨ９．０の１００ｍＭのＥＰＰＳと１００ｕｌのトレハロースストック（１ｇプラス２ｍｌの水）とを加えた。ｐＨは７．７１であると計測された。ＥＤＣ（１１ｕｌの１Ｍのストック）を１０ｍＭの最終濃度まで加え、１００ｕｌのアリコートを実施例６に記載されるように凍結乾燥した。凍結乾燥されたサンプル（２つのチューブ；両者ともポジティブコントロール）を（実施例３に記載されるように調製された）ｐＨ６．０の５０ｍＭのＭＥＳにおいて１時間、１００ｕｌの５００ｋＤａのＡＭ−デキストランと反応させ、その後、１００ｕｌの１４．３ｍＭのメルカプトエタノールを加え、さらに１時間、反応を継続させた。上記の反応と並行して、乾燥したカルボキシフルオレスセイン／ＥＤＣ混合物の２つのチューブ（両者ともネガティブコントロール）の各々を１００ｕｌの失活剤（１４．３ｍＭのメルカプトエタノール）で戻した。１時間後、ｐＨ５．０の５０ｍＭのＭＥＳ中の１００ｕｌの５００ｋＤａのＡＭ−デキストランを加え、さらに１時間、インキュベーションを継続させた。ポジティブおよびネガティブコントロールのチューブの内容物を貯留し、別個のＮＡＰ−５カラム上で脱塩することにより５００ｕｌのＴＢＳへと交換した。１／１００希釈されたポジティブコントロールおよびネガティブコントロールについての蛍光値（励起４９０ｎｍ／発光５３５）はそれぞれ、４４１２９および２２９（平均値、ｎ＝３）であった。 Example 14 EDC lyophilized carboxyfluorescein (Sigma C7153) with a small amount of organic dye was dissolved in 25 mM Epps at pH 9.0 to give a 10 mM stock with a pH of ~ 4.0. 0.5 ml sample was diluted and 0.5 ml 100 mM EPPS pH 9.0 and 100 ul trehalose stock (1 g plus 2 ml water) were added. The pH was measured to be 7.71. EDC (11 ul of 1M stock) was added to a final concentration of 10 mM and 100 ul aliquots were lyophilized as described in Example 6. Lyophilized samples (2 tubes; both positive controls) were reacted with 100 ul of 500 kDa AM-dextran in 50 mM MES at pH 6.0 (prepared as described in Example 3) for 1 hour. Then, 100 ul of 14.3 mM mercaptoethanol was added and the reaction was continued for another hour. In parallel with the above reaction, each of two tubes (both negative controls) of the dried carboxyfluorescein / EDC mixture was returned with 100 ul of quenching agent (14.3 mM mercaptoethanol). After 1 hour, 100 ul of 500 kDa AM-dextran in 50 mM MES at pH 5.0 was added and incubation continued for an additional hour. The contents of the positive and negative control tubes were pooled and exchanged for 500 ul TBS by desalting on separate NAP-5 columns. The fluorescence values (excitation 490 nm / emission 535) for the positive and negative controls diluted 1/100 were 44129 and 229 (average, n = 3), respectively.

実施例１５ タンパク質分子を用いるＥＤＣの凍結乾燥
２５℃で４時間、９ｍｌのｐＨ６の０．５ＭのＭＥＳ／２Ｍのエチレンジアミンと、１ｍｌのＥＤＣ（１Ｍ）とによる反応によりＢＳＡ（１ｍｌの１０％溶液）を陽イオン化させた。１ｍｌの反応混合をＰＤ１０カラム上でｐＨ８．５の１．２５ｍｌの１０ｍＭのＥＰＰＳに脱塩し、それに１２５ｕｌのトレハロースストック（２ｍｌの水において１ｇ）を加えた。２つの６００ｕｌのアリコートを別個のチューブに供給した。一方のチューブ（タイプＡ）には６ｕｌの１ＭのＥＤＣが補充され、他方のチューブ（タイプＢ）には６ｕｌの水が補充された。各タイプから１００ｕｌのアリコートを実施例６におけるプログラムに従って凍結乾燥した。カルボキシフルオレスセインを１００ｍＭのｐＨ６のＭＥＳに取り込み、１００ｕｌのアリコートを各タイプのチューブの１つに加えた。３０分後、等しい体積の１０Ｘ ＴＢＳを加え、当該チューブを一晩放置した。サンプルは、ＮＡＰ−５カラム上でＴＢＳに脱塩された。実施例１４でのように計測された、タイプＡおよびタイプＢの１／１００希釈されたサンプルの蛍光値はそれぞれ３３２００および１０３蛍光単位であった。 Example 15 Lyophilization of EDC with protein molecules BSA (1 ml of a 10% solution) by reaction with 9 ml of 0.5 M MES / 2M ethylenediamine, pH 6 and 1 ml EDC (1 M) at 25 ° C. for 4 hours Was cationized. 1 ml of the reaction mixture was desalted on a PD10 column to 1.25 ml of 10 mM EPPS, pH 8.5, to which 125 ul trehalose stock (1 g in 2 ml water) was added. Two 600 ul aliquots were fed into separate tubes. One tube (type A) was replenished with 6 ul of 1M EDC and the other tube (type B) was replenished with 6 ul of water. 100 ul aliquots from each type were lyophilized according to the program in Example 6. Carboxyfluorescein was incorporated into 100 mM pH 6 MES and a 100 ul aliquot was added to one of each type of tube. After 30 minutes, an equal volume of 10X TBS was added and the tube was left overnight. The sample was desalted to TBS on a NAP-5 column. The fluorescence values of Type A and Type B diluted 1/100 samples measured as in Example 14 were 33200 and 103 fluorescence units, respectively.

実施例１６ ＢＳＡでの金粒子のコーティング
金粒子（２００ｕｌの１５ ＯＤ材料；２０ｎｍまたは４０ｎｍのネイキッドゴールド；Bioassay Works社）を、水中において１ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡに加えた。２０℃での一晩のインキュベーションの後、チュービングにおいて（Spectrum社、製品コード１３１４８６）サンプルを１Ｌの水の２回交換に対して透析した（透析一回当たり３ｈ）。透析された金は、ｐＨ９の１００ｍＭのストックの追加により、１０ｍＭのＥＰＰＳにされる。１０ｍＭのストックからＥＤＣが１ｍＭまで加えられる。最後に、トレハロースが３．３３％ｗ／ｖまで加えられる。サンプルは、実施例６におけるプログラムに従って液体窒素で凍結され、凍結乾燥された。 Example 16 Coating Gold Particles with BSA Gold particles (200 ul of 15 OD material; 20 nm or 40 nm naked gold; Bioassay Works) were added to 1 ml of 10 mg / ml BSA in water. After overnight incubation at 20 ° C., the samples were dialyzed against 2 changes of 1 L of water (3 h per dialysis) in tubing (Spectrum, product code 131486). Dialyzed gold is brought to 10 mM EPPS by addition of a 100 mM stock at pH 9. EDC is added to 1 mM from a 10 mM stock. Finally, trehalose is added to 3.33% w / v. Samples were frozen in liquid nitrogen and lyophilized according to the program in Example 6.

実施例１７ チオール／アミノデキストランの製造
ＣＭ−デキストラン（５００ｋＤａ）１ｍｌを、ｐＨ６．０の０．５ＭのＭＥＳ中の２ＭのシスタミンとｐＨ６の０．５ＭのＭＥＳ中の２Ｍのエチレンジアミンの溶液とを２０：８０の体積比で組み合せることにより調製された２００ｕｌの混合ジアミン溶液およびＥＤＣを１Ｍストックから１００ｍＭの最終濃度になるまで混合した。２５℃での一晩のインキュベーションの後、サンプルはｐＨ８．０の０．１Ｍのリン酸緩衝液へと脱塩され、２００ｍＭのストックから２０ｍＭの最終濃度までＤＴＴが加えられた。２５℃で１時間のインキュベーションの後、サンプルをｐＨ６の１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液に脱塩し、実施例１８に記載されるように、金粒子のコーティングのために直ちに用いた。 Example 17 Preparation of Thiol / Aminodextran 1 ml of CM-dextran (500 kDa) was added to 2 M cystamine in 0.5 M MES pH 6.0 and a solution of 2 M ethylenediamine in 0.5 M MES pH 6 A 200 ul mixed diamine solution prepared by combining in a volume ratio of 80 and EDC was mixed from a 1M stock to a final concentration of 100 mM. After overnight incubation at 25 ° C., the samples were desalted into 0.1 M phosphate buffer at pH 8.0 and DTT was added from a 200 mM stock to a final concentration of 20 mM. After 1 hour incubation at 25 ° C., the sample was desalted in 100 mM MES buffer at pH 6 and used immediately for coating of gold particles as described in Example 18.

実施例１８ チオール化デキストランでの金粒子のコーティング
金粒子（１５ ＯＤ）は、実施例１７に記載されるように調製されたチオール／アミノデキストランで１／１０に希釈され、２５℃で一晩インキュベートされた。粒子１ｍｌにつき、１００ｕｌの２ＭのＨｅｐｅｓが加えられ、その後、無水コハク酸が（ＤＭＳＯ中の１Ｍストックから）１００ｍＭの最終濃度まで加えられた。３０分後、当該材料は、遠心分離と、ｐＨ７．２の２０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液での洗浄との２サイクルで洗浄された。粒子１ｍｌにつき、１００ｕｌのトレハロースストック（２ｍｌの水中１ｇ）を加え、その後、ＥＤＣを（水中の１Ｍストックから）１０ｍＭの濃度まで加えた。これらのサンプルを実施例６に記載されるプログラムに従って凍結乾燥した。 Example 18 Coating Gold Particles with Thiolated Dextran Gold particles (15 OD) were diluted 1/10 with thiol / aminodextran prepared as described in Example 17 and incubated overnight at 25 ° C. It was done. For each ml of particles, 100 ul of 2M Hepes was added, followed by succinic anhydride (from a 1M stock in DMSO) to a final concentration of 100 mM. After 30 minutes, the material was washed in two cycles of centrifugation and washing with 20 mM MOPS buffer at pH 7.2. For each ml of particles, 100 ul trehalose stock (1 g in 2 ml water) was added followed by EDC (from a 1M stock in water) to a concentration of 10 mM. These samples were lyophilized according to the program described in Example 6.

実施例１９ 緩衝液濃縮物から調製された溶液のｐＨ制御
８．５の０．５ＭのＥＰＰＳと、ｐＨ７．２の１ＭのＭＯＰＳと、ｐＨ７．５の１ＭのＨｅｐｅｓと、ｐＨ６の１ＭのＭＥＳと、ｐＨ９．３の０．５ＭのＣＨＥＳといった緩衝液濃縮物が調製された。１ＭのＥＤＣを水に調製した。さまざまな緩衝液／ＥＤＣ混合物をストック物質の適切な希釈により調製し、１０ｍＭの緩衝液中に０ｍＭ、１ｍＭ、または１０ｍＭのＥＤＣを与えた。これらのさまざまな溶液のｐＨ値は以下のとおりである（緩衝液；０ｍＭのＥＤＣの場合のｐＨ；１ｍＭのＥＤＣの場合のｐＨ；１０ｍＭのＥＤＣの場合のｐＨ）。すなわち、ＥＰＰＳ、７．５９、７．６７、７．７３；ＭＯＰＳ、６．１８、６．２５、６．３４；Ｈｅｐｅｓ、６．５８、６．６４、６．７３；ＭＥＳ、５．２２、５．２９、５．３５；ＣＨＥＳ、８．６４、８．７４、８．８２である。これらのデータから、ｐＨ７とｐＨ８との間のｐＫａ値を有するＥＰＰＳ以外の緩衝液（たとえばＭＯＰＳ、Ｈｅｐｅｓ）は、ｐＨ８〜ｐＨ８．５の範囲の濃縮物としても調製され得、これによりｐＨ７とｐＨ８との間の最終ｐＨ値を達成するということが分かり得る。 Example 19 pH Control of a Solution Prepared from Buffer Concentrate 8.5 M EPPS at 8.5, 1 M MOPS at pH 7.2, 1 M Hepes at pH 7.5, 1 M MES at pH 6 A buffer concentrate such as 0.5 M CHES, pH 9.3 was prepared. 1M EDC was prepared in water. Various buffer / EDC mixtures were prepared by appropriate dilution of stock material to give 0 mM, 1 mM, or 10 mM EDC in 10 mM buffer. The pH values of these various solutions are as follows (buffer; pH for 0 mM EDC; pH for 1 mM EDC; pH for 10 mM EDC). EPPS, 7.59, 7.67, 7.73; MOPS, 6.18, 6.25, 6.34; Hepes, 6.58, 6.64, 6.73; MES, 5.22, 5.29, 5.35; CHES, 8.64, 8.74, 8.82. From these data, buffers other than EPPS (eg, MOPS, Hepes) with pKa values between pH 7 and pH 8 can also be prepared as concentrates in the range of pH 8 to pH 8.5, whereby pH 7 and pH 8 It can be seen that a final pH value between is achieved.

実施例２０ 濃縮ラテックス微粒子の調製
１５０ｋＤａのＡＭデキストラン（実施例３）の１ｍｌを０．１１ｍｌのトレハロース（２ｍｌの水において１ｇ）に混合し、液体窒素で凍結し、実施例６において与えられたプログラムを用いて凍結乾燥した。乾燥粉末は、１ｍｌのストックブルー２７０ｎｍカルボキシル化ラテックス粒子（Seradyn社、製品コード８３１００６７００２０３５０）で戻され、１００ｕｌの１ＭのＥＤＣを加える前に室温で２４時間インキュベートされた。１８時間のインキュベーションの後、２ＭのＨｅｐｅｓ／１０ｍＭのＥＤＴＡを２００ｕｌ添加し、その後ＤＭＳＯ中の１００ｕｌの無水コハク酸（１Ｍ）を添加した。２５℃で３０分放置した後、当該材料を１ＬのｐＨ６．０の２５ｍＭのＭＥＳ緩衝液の３回の交換に対して透析した。次いで、１ｍｌの透析されたサンプルを、ＰＤ１０カラムを用いて１．５ｍｌの１０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液に緩衝液交換した。ＥＰＰＳ緩衝液中の微粒子１ｍｌにつき、１００ｕｌのトレハロースを加え、その後、ＥＤＣを１Ｍストックから１０ｍＭの最終濃度を与えるよう加えた。サンプルは、適切なサイズのガラスバイアルを用いて、さまざまなサイズのアリコートにおいて凍結乾燥された。たとえば、１０ｕｌのサンプルをＸ−バイアル（Cronus社、VZM-0309CF-100）に供給し、４０ｕｌのサンプルをガラスシャンペンバイアル（Cronus社、VZM-1509CC-100）に供給し、０．４ｍｌの体積を２ｍｌの血清バイアル（Voigt社7010.90.0540）において凍結乾燥し、１ｍｌの体積を１０ｍｌの血清バイアルへ供給した（Wheaton社、２２３６８６）。 Example 20 Preparation of Concentrated Latex Microparticles 1 ml of 150 kDa AM dextran (Example 3) is mixed with 0.11 ml trehalose (1 g in 2 ml water), frozen in liquid nitrogen and the program given in Example 6 Was lyophilized using The dry powder was returned with 1 ml of stock blue 270 nm carboxylated latex particles (Seradyn, product code 83100670020350) and incubated for 24 hours at room temperature before adding 100 ul of 1M EDC. After 18 hours of incubation, 200ul of 2M Hepes / 10mM EDTA was added followed by 100ul of succinic anhydride (1M) in DMSO. After standing at 25 ° C. for 30 minutes, the material was dialyzed against 3 changes of 1 L of 25 mM MES buffer, pH 6.0. The 1 ml dialyzed sample was then buffer exchanged into 1.5 ml 10 mM EPPS buffer using a PD10 column. For each ml of microparticles in EPPS buffer, 100 ul of trehalose was added followed by EDC to give a final concentration of 10 mM from a 1M stock. Samples were lyophilized in various sized aliquots using appropriately sized glass vials. For example, a 10 ul sample is fed into an X-vial (Cronus, VZM-0309CF-100), a 40 ul sample is fed into a glass champagne vial (Cronus, VZM-1509CC-100), and a volume of 0.4 ml is added. Lyophilized in a 2 ml serum vial (Voigt 7010.90.0540) and fed a 1 ml volume into a 10 ml serum vial (Wheaton, 223686).

実施例２１ 凍結乾燥されたＡＤＰ／ＥＤＣ混合物との共役
５００ｕｌの２０ｍＭのＡＤＰ一カリウム塩（Fluka社；製品コード０１８９９）を、２００ｕｌのｐＨ８．５の０．５ＭのＥＰＰＳと、１００ｕｌのトレハロース（２ｍｌの水において１ｇ）と、２００ｕｌの水と、５ｕｌの２ＭのＥＤＣ（最終濃度１０ｍＭ）または水と混合した。１００ｕｌのアリコートを、実施例６で与えられた乾燥プログラムを用いて凍結乾燥した。２つのタイプの乾燥粉末（すなわちＥＤＣを有するものと有さないもの）を、実施例１５に記載されるように調製された（が、ＥＰＰＳ緩衝液の代わりに水に脱塩された）１００ｕｌの陽イオン化ＢＳＡと１００ｕｌのｐＨ６．２の０．５ＭのＭＥＳとで戻した。２５℃で１８時間の反応の後、０．１５ＭのＮａＣｌで平衡化されたＮＡＰ−５カラム（GE Healthcare社）上で脱塩することにより、遊離したＡＤＰが取り除かれた。タンパク質を含む留分を貯蔵し（０．３ｍｌ）、１００℃で５分間、無機リン酸塩のための７５ｕｌのPiColorlock Gold比色検出試薬（Innova Biosciences社、製品コード３０３−００３０）を用いて酸水解を行った。ＥＤＣを用いてまたは用いずに調製された加水分解されたＢＳＡ−ＡＤＰ複合体の２００ｕｌのサンプルについての、ブランクを差し引いた吸収値（Ａ_６５０）はそれぞれ１．２２および０．０８であった。 Example 21 Conjugation with lyophilized ADP / EDC mixture 500 ul of 20 mM ADP monopotassium salt (Fluka; product code 01899), 200 ul of 0.5M EPPS at pH 8.5 and 100 ul of trehalose (2 ml) 1 g), 200 ul of water and 5 ul of 2M EDC (final concentration 10 mM) or water. A 100 ul aliquot was lyophilized using the drying program given in Example 6. Two types of dry powder (ie with and without EDC) were prepared as described in Example 15 (but desalted in water instead of EPPS buffer) Reconstituted with cationized BSA and 100 ul of 0.5 M MES at pH 6.2. After 18 hours of reaction at 25 ° C., free ADP was removed by desalting on a NAP-5 column (GE Healthcare) equilibrated with 0.15 M NaCl. The fraction containing the protein is stored (0.3 ml) and acidified using 75 ul PiColorlock Gold colorimetric detection reagent (Innova Biosciences, product code 303-0030) for inorganic phosphate for 5 minutes at 100 ° C. The water was dissolved. Absorption values (A ₆₅₀ ) minus the blank for 200 ul samples of hydrolyzed BSA-ADP conjugate prepared with or without EDC were 1.22 and 0.08, respectively.

Claims (20)

カルボキシル基またはリン酸基を含む第１の反応物と、アミン基を含む第２の反応物との間の共役反応での使用のための試薬を製造する方法であって、
ａ）ｉ）カルボキシル基含有部分またはリン酸基含有部分上に作用して、カルボキシル基とアミン基との間のアミド結合の形成を促進するか、またはリン酸基とアミン基との間のホスホロアミド酸結合の形成を促進することが可能なカルボキシル基活性化またはリン酸基活性化非酵素物質と、ｉｉ）第１の反応物または第２の反応物との溶液または懸濁液を形成するステップと、
ｂ）前記溶液または前記懸濁液を乾燥するステップとを含む、方法。 A method for producing a reagent for use in a conjugation reaction between a first reactant comprising a carboxyl group or a phosphate group and a second reactant comprising an amine group comprising:
a) i) acts on a carboxyl group-containing moiety or a phosphate group-containing moiety to promote the formation of an amide bond between the carboxyl group and the amine group, or a phosphoramide between the phosphate group and the amine group Forming a solution or suspension of a carboxyl group activated or phosphate group activated non-enzymatic substance capable of promoting acid bond formation and ii) a first reactant or a second reactant. When,
b) drying the solution or the suspension. 前記カルボキシル基活性化またはリン酸基活性化物質および前記第１または第２の反応物は溶液の形態、好ましくは水溶液の形態で混合される、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, wherein the carboxyl group activating or phosphate group activating substance and the first or second reactant are mixed in the form of a solution, preferably in the form of an aqueous solution. 前記カルボキシル基活性化またはリン酸基活性化物質はカルボジイミドまたはウッドワード試薬Ｋ（ＷＲＫ）を含む、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, wherein the carboxyl group activating or phosphate group activating substance comprises carbodiimide or Woodward reagent K (WRK). 前記カルボキシル基活性化またはリン酸基活性化物質はＥＤＣまたはＣＭＣを含む、請求項３に記載の方法。   4. The method of claim 3, wherein the carboxyl group activating or phosphate group activating substance comprises EDC or CMC. ステップｂ）は凍結乾燥を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。   A method according to any one of the preceding claims, wherein step b) comprises lyophilization. 前記溶液または懸濁液は、カルボキシル基またはリン酸基を含む第１の反応物を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of the preceding claims, wherein the solution or suspension comprises a first reactant comprising a carboxyl group or a phosphate group. 前記溶液または懸濁液における第１または第２の反応物は、着色、蛍光、酵素、磁気、または粒子標識を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。   A method according to any one of the preceding claims, wherein the first or second reactant in the solution or suspension comprises a color, fluorescence, enzyme, magnetism or particle label. 前記溶液または懸濁液における第１または第２の反応物は粒子を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of the preceding claims, wherein the first or second reactant in the solution or suspension comprises particles. 前記粒子はポリマーコーティングを有する、請求項８に記載の方法。   The method of claim 8, wherein the particles have a polymer coating. 前記溶液または懸濁液はポリヒドロキシ材料を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of the preceding claims, wherein the solution or suspension comprises a polyhydroxy material. 前記溶液または懸濁液は緩衝液を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of the preceding claims, wherein the solution or suspension comprises a buffer. 前記溶液または懸濁液のｐＨは４より大きいか、好ましくは６より大きいか、７より大きいか、または８より大きい、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of the preceding claims, wherein the pH of the solution or suspension is greater than 4, preferably greater than 6, greater than 7, or greater than 8. 先行する請求項のいずれか１項に記載の方法により製造される、試薬。   A reagent produced by the method according to any one of the preceding claims. カルボキシル基またはリン酸基を含む第１の反応物とアミン基を含む第２の反応物との間の共役反応での使用のための乾燥された試薬であって、ｉ）カルボキシル基含有部分またはリン酸基含有部分上に作用して、カルボキシル基とアミン基との間のアミド結合の形成を促進するか、またはリン酸基とアミン基との間のホスホロアミド酸結合の形成を促進することが可能なカルボキシル基活性化またはリン酸基活性化非酵素物質と、ｉｉ）第１の反応物または第２の反応物との均質な混合物を含む、乾燥された試薬。   A dried reagent for use in a conjugation reaction between a first reactant comprising a carboxyl group or a phosphate group and a second reactant comprising an amine group, comprising i) a carboxyl group-containing moiety or Acting on the phosphate group-containing moiety to promote the formation of an amide bond between the carboxyl group and the amine group, or to promote the formation of a phosphoramidate bond between the phosphate group and the amine group A dried reagent comprising a homogeneous mixture of a possible carboxyl group activated or phosphate group activated non-enzymatic material and ii) a first reactant or a second reactant. 容器中にある、請求項１３または１４に記載の試薬。   The reagent according to claim 13 or 14, which is in a container. 請求項１３、１４、または１５に記載の試薬の供給と、使用のための指示とを含む、コンジュゲーションキット。   A conjugation kit comprising a supply of the reagent of claim 13, 14, or 15 and instructions for use. 共役反応を行う方法であって、前記方法は、請求項１３、１４、もしくは１５のいずれか１項に記載の試薬の使用、または請求項１６に記載のコンジュゲーションキットの使用を含む、方法。   17. A method for performing a conjugation reaction, the method comprising the use of a reagent according to any one of claims 13, 14, or 15 or a conjugation kit according to claim 16. 実質的に上述した試薬を製造する、方法。   A method of producing a reagent substantially as described above. 実質的に上述した共役反応のための試薬。   Reagent for the coupling reaction substantially as described above. 実質的に上述した共役反応を行うためのキット。   A kit for performing the coupling reaction substantially as described above.