JP2015154787A - キメラdnaポリメラーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
およびそれらの組合せ
からなる群から選択されるコンセンサス配列を有する第1のドメイン;ならびに
およびそれらの組合せ
からなる群から選択されるコンセンサス配列を有する第2のドメイン
を含み、
このキメラポリメラーゼは忠実度が高く、プロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、TMAC許容性もしくは他のPCRエンハンサー許容性または熱安定性が高い特徴を有する。
によって定義される。
アミノ酸:本明細書で使用する、「アミノ酸」という用語は、その広義では、ポリペプチド鎖に取り込むことができる任意の化合物および/または物質を指す。一部の実施形態では、アミノ酸は、一般構造H2N−C(H)(R)−COOHを有する。一部の実施形態では、アミノ酸は天然に存在するアミノ酸である。一部の実施形態では、アミノ酸は合成アミノ酸であり;一部の実施形態では、アミノ酸はD−アミノ酸であり;一部の実施形態では、アミノ酸はL−アミノ酸である。「標準的なアミノ酸」は、天然に存在するペプチドに一般に見られる20種の標準的なL−アミノ酸のいずれかを指す。「非標準的なアミノ酸」は、それが合成によって調製されるものであるか天然源から得られるものであるかに関わらず、標準的なアミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書で使用する、「合成アミノ酸」は、塩、アミノ酸誘導体(アミドなど)、および/またはアミノ酸置換を含むがこれらに限定されない、化学修飾されたアミノ酸を包含する。ペプチド中のカルボキシ末端のアミノ酸および/またはアミノ末端のアミノ酸を含めたアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、および/または他の化学基での置換によって修飾することができる。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与し得る。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸および/またはペプチドのアミノ酸残基を指し得る。用語が遊離アミノ酸を指しているか、ペプチドの残基を指しているかは、この用語が使用されている文脈から明らかになる。本明細書において、全てのアミノ酸残基配列は、左右の方向づけが、アミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向になっている式で表されていることに注意されたい。
:841〜848頁のアッセイに基づいて)、二本鎖核酸(S.solfataricusのlacS遺伝子からの452−bpのHindIII−EcoRV断片)を、少なくとも約2.5×107cpm/μg(または少なくとも約4000cpm/fmol)の比活性まで、標準的な方法を使用して32Pで標識する。例えば、Sambrookら、(2001年)、MolecularCloning:ALaboratory Manual(第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY)の9.63〜9.75(核酸の末端標識について記載している)を参照されたい。反応混合物を、少なくとも約0.5μgのポリペプチドを結合バッファー(50mMのリン酸ナトリウムバッファー(pH8.0)、10%のグリセロール、25mMのKCl、25mMのMgCl2)約10μl中に含有させて調製する。反応混合物を10分間、37℃まで加熱する。標識された二本鎖核酸約1×104〜5×104cpm(または約0.5〜2ng)を反応混合物に加え、さらに10分間インキュベートする。反応混合物を、0.5×Tris−ホウ酸バッファー中ネイティブポリアクリルアミドゲルにローディングする。反応混合物を、室温で電気泳動に供する。ゲルを乾燥させ、標準的な方法を使用したオートラジオグラフィーに供する。標識された二本鎖核酸の移動度の任意の検出可能な低下により、ポリペプチドと二本鎖核酸の間に結合性複合体が形成されたことが示される。そのような核酸結合活性は、最初の反応混合物における放射活性の総量と比較して、結合性複合体における放射活性の量を測定するための標準的なデンシトメトリー法を使用して定量化することができる。DNA結合親和性を測定する他の方法は、当技術分野で公知である(例えば、Kongら、(1993年)、J.Biol.Chem.、268巻(3
号):1965〜1975頁を参照されたい)。
ングアッセイにおいて決定する。エラー率は、複製当たり1bp当たりの変異の頻度(MF/bp/d)として表され、ここでbpはlacI遺伝子配列(349)において検出可能な部位の数であり、dは、有効な標的倍加の数である。上記と同様に、lacIOlacZα標的遺伝子を含有する任意のプラスミドを、PCR用の鋳型として使用することができる。PCR産物は、青色/白色着色スクリーニングを可能にする、ラムダGTとは異なるベクター(例えば、プラスミド)にクローニングすることができる。
を参照されたい)。
本発明は、とりわけ、少なくとも1つの明確な機能的特性(例えば、延長速度、プロセシビティー、エラー率または忠実度、塩許容性または塩抵抗性)を有する少なくとも2つのDNAポリメラーゼに由来する配列を有する異種ドメインを含有するキメラDNAポリメラーゼならびにその作製方法および使用方法を提供する。
本発明によるキメラDNAポリメラーゼは、任意のDNAポリメラーゼ、特に、熱安定性のポリメラーゼから設計製作することができる。一般には、DNAポリメラーゼは、6つのファミリー:A、B、C、D、XおよびYにグループ分けされる。ファミリーA、B、Cは、それぞれ、それらのアミノ酸配列の、E.coliポリメラーゼI、II、およびIIIに対する相同性に基づいてグループ分けされる。ファミリーXは、相同性のE.coliポリメラーゼを有さない。一部の実施形態では、本発明に適したDNAポリメラーゼは、ファミリーBのDNAポリメラーゼである。ファミリーBのポリメラーゼとして、E.coli pol II、古細菌のポリメラーゼ、PRD1、phi29、M2、T4バクテリオファージDNAポリメラーゼ、真核生物のポリメラーゼα、Δ、ε、および多くのウイルスのポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本発明に適したDNAポリメラーゼは、古細菌のポリメラーゼ(例えば、ユーリ古細菌の(euryarchaeal)ポリメラーゼ)である。
sp.KOD株(Pfx、GenBank:AAE68738))、Thermococcus gorgonarius(Tgo、Pdb:4699806)、Sulfolobus solataricus(GenBank:NC002754、P26811)、Aeropyrum pernix(GenBank:BAA81109)、Archaeglobus fulgidus(GenBank:O29753)、Pyrobaculum aerophilum(GenBank:AAL63952)、Pyrodictium occultum(GenBank:BAA07579、BAA07580)、Thermococcus 9° Nm(GenBank:AAA88769、Q56366)、Thermococcus fumicolans(GenBank:CAA93738、P74918)、Thermococcus hydrothermalis(GenBank:CAC18555)、Thermococcus sp.GE8(GenBank:CAC12850)、Thermococcus sp.JDF−3(GenBank:AX135456;WO0132887)、Thermococcus sp.TY(GenBank:CAA73475)、Pyrococcus abyssi(GenBank:P77916)、Pyrococcus glycovorans(GenBank:CAC12849)、Pyrococcus horikoshii(GenBank:NP143776)、Pyrococcus sp.GE23(GenBank:CAA90887)、Pyrococcus sp.ST700(GenBank:CAC12847)、Thermococcus pacificus(GenBank:AX411312.1)、Thermococcus zilligii(GenBank:DQ3366890)、Thermococcus aggregans、Thermococcus barossii、Thermococcus celer(GenBank:DD259850.1)、Thermococcus profundus(GenBank:E14137)、Thermococcus siculi(GenBank:DD259857.1)、Thermococcus thioreducens、Thermococcus onnurineus NA1、Sulfolobus acidocaldarium、Sulfolobus tokodaii、Pyrobaculum calidifontis、Pyrobaculum islandicum(GenBank:AAF27815)、Methanococcus jannaschii(GenBank:Q58295)、Desulforococcus species TOK、Desulfurococcus、Pyrolobus、Pyrodictium、Staphylothermus、Vulcanisaetta、Methanococcus(GenBank:P52025)およびGenBank AAC62712、P956901、BAAA07579などの他の古細菌のBポリメラーゼ))が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる代表的な温度安定性のファミリーAおよびファミリーBのポリメラーゼとして、例えば、好熱性細菌Thermus種(例えば、flavus、ruber、thermophilus、lacteus、rubens、aquaticus)、Bacillus stearothermophilus、Thermotoga maritima、Methanothermus fervidusから抽出されたポリメラーゼが挙げられる。
)。Sso7dは、Sulfolobus solfataricusにおける、DNAの安定性および/またはDNAのパッキングを確実にすることに関与する配列非特異的なdsDNA結合性タンパク質である。Sso7dのTaqおよびPfuの双方への融合によって、ポリメラーゼの塩抵抗性およびプロセシビティーが増加した。
一般には、古細菌のDNAポリメラーゼは、少なくとも以下のドメインを含む:N末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメイン(例えば、3’→5’エキソヌクレアーゼドメイン)、掌、指および親指ドメイン(図1を参照されたい)。ドメインの構造、機能および共調(coordination)の知識は、主に結晶構造の研究および種々のDNAポリメラーゼ、特に、古細菌のDNAポリメラーゼの部位特異的変異誘発に基づいている。例えば、ファミリーBのDNAポリメラーゼの第1の結晶構造の中で得られたのはバクテリオファージRB69 DNAポリメラーゼのものである(Wangら(1997年)、Cell、89巻:1087〜1099頁、参照により本明細書に組み込まれている)。古細菌のDNAポリメラーゼの第1の結晶構造の中で、Tgo DNAポリメラーゼが解明された(参照により本明細書に組み込まれている、Hopfnerら、1999年、Proc.Natl.Acad. Sci.、96巻(7号)、3600〜3605頁を参照されたい)。最近、以下の古細菌のファミリーBのDNAポリメラーゼの結晶構造が報告されている:Thermococcus sp.9oN−7からのDNAポリメラーゼ(Rodriguezら(2000年)、J.Mol. Biol.、299巻:447〜462頁、参照により本明細書に組み込まれている)、KOD1 DNAポリメラーゼ(Hashimotoら、2001年、J.Mol.Biol.、306巻(3
号)、469〜477頁、参照により本明細書に組み込まれている)、Pfu DNAポリメラーゼ(その全てが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第5,948,663号;同第5,866,395号;同第5,545,552号;同第5,556,772号およびKimら(2008年)、Int.J.Biol. Macromol.、42巻(4号)、35
6〜61頁を参照されたい)。
/指ドメインにおける変異誘発が、ヌクレオチドの選択性および親和性に影響を及ぼし得、また親指ドメインにおける変異誘発がdsDNAに対する結合親和性に影響を及ぼし得ることが報告された。掌ドメイン、指ドメインおよび親指ドメイン内の重要なアミノ酸は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第20060281109号に記載されている。
されたい。
本発明によれば、異なるDNAポリメラーゼ(例えば、少なくとも1つの明確な機能的特性を持つポリメラーゼ)からの異種ドメインを組み合わせてキメラポリメラーゼを形成することができる。適切なドメインとして、種々のDNAポリメラーゼに見られる、天然に存在するN末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメイン、掌ドメイン、指ドメイン、および/または親指ドメインが挙げられる。種々のDNAポリメラーゼの、天然に存在するN末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメイン、掌ドメイン、指ドメイン、および/または親指ドメインは良く定義されている。例えば、N末端ドメインは、KODポリメラーゼ(配列番号11)のアミノ酸残基26〜105に対応する配列を含み得る。エキソヌクレアーゼドメインは、KODポリメラーゼ(配列番号11)のアミノ酸残基156〜301に対応する領域を含み得る。親指ドメインは、KODポリメラーゼ(配列番号11)のアミノ酸残基612〜749に対応する領域を含み得る。掌および指ドメインは、Pfuポリメラーゼ(配列番号9)のアミノ酸残基394〜563に対応する領域を含み得る。
とんどはデフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは、以下の値に従って設定される:オーバーラップスパン(overlap span)=1、オーバーラップフラクション(overlap fraction)=0.125、ワード閾値(word threshold)(T)=11。HSPスコア(S)およびHSP S2パラメータは動的な値であり、プログラム自体によって確立されるが、特定の配列の組成によって、最小値は調整することができ、上記の通り設定される。アライメントの例を図1に示す。
ポジティブコンセンサス配列1(N末端ドメインを規定している)
ポジティブコンセンサス配列2(エキソヌクレアーゼドメインを規定している)
ポジティブコンセンサス配列3(親指ドメインを規定している)
それに加えてまたはその代わりに、プロセシビティー、延長速度、熱安定性、TMAC許容性および/または塩抵抗性が高いことと相関関係にある(1つまたは複数の)ドメインは、以下のネガティブコンセンサス配列の1つまたは複数によって規定することができる。
ネガティブコンセンサス配列2(エキソヌクレアーゼドメインを規定している)
ネガティブコンセンサス配列3(親指ドメインを規定している)
一部の実施形態では、忠実度が高いことと相関関係にあるドメインは、以下のポジティブコンセンサス配列(掌および指ドメインを規定している)によって規定することができる:
によって規定される。
によって規定される。
標準的な組換えDNAの技法(例えば、制限酵素による消化、ライゲーション、PCR)を使用して、本発明によるキメラDNAポリメラーゼを設計製作することができる。当技術分野で周知の方法を適用してキメラDNAポリメラーゼを発現させ、単離することができる。多くの細菌性発現ベクターは、外来配列によってコードされるタンパク質を高レベルで誘導性発現させることができる配列要素または配列要素の組合せを含有する。発現ベクターは、例えば、Novagen(http://www.emdbiosciences.com/html/NVG/AllTables.html#)から市販されている。
8巻:1965頁、参照により本明細書に組み込まれている)を用いることができる。
本発明のキメラDNAポリメラーゼは、ポリヌクレオチドの合成を伴う任意の方法に使用することができる。ポリヌクレオチドの合成方法は、当業者に周知であり、例えば、MolecularCloning、第2版、Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ColdSpring Harbor、N.Y.(1989年)において見ることができる。 例えば、本発明のキメ
ラDNAポリメラーゼは、これらに限定されないが、ニックトランスレーションによるDNAの標識、cDNAクローニングにおける第2鎖cDNA合成、DNAの配列決定、およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用した核酸配列の増幅、検出、および/またはクローニングを含めた組換えDNA技術における種々の使用を有する。
、IRL Press(1991年)、InnisらによるPCR Protocols: AGuide to Methods and Applications、AcademicPress(1990年)、およびPCR Technology:Principals and Applications for DNAAmplification、H. A. Erlich、Stockton Press(1989年)を含
めた多数の出版物に記載されている。PCRは、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている米国特許第4,683,195号;同第4,683,202号;同第4,800,159号;同第4,965,188号;同第4,889,818号;同第5,075,216号;同第5,079,352号;同第5,104,792号;同第5,023,171号;同第5,091,310号;および同第5,066,584号を含めた多くの米国特許にも記載されている。
16〜21頁;Triglia、2000年、Methods Mol. Biol.、130巻:79〜83頁; MaClellandら、1994年、PCRMethodsAppl.、4巻:S66〜81; AbramsonおよびMyers
、1993年、Current Opinion in Biotechnology、4巻:41〜47頁を参照されたい
)。
本発明は、本発明のキメラDNAポリメラーゼおよびその組成物を含有する1つまたは複数の容器を有するパッケージユニットを含むキット形式も企図している。一部の実施形態では、本発明は、PCRにおける合成を含めた、ポリヌクレオチドを合成するために使用する種々の試薬の容器をさらに含むキットを提供する。
KOD DNAポリメラーゼおよびPfu DNAポリメラーゼのキメラの設計
本発明者らが本実験に含めるために選出した2つの酵素は、Pyroccocus furiosusのDNAポリメラーゼ(Pfu)およびThermococcus Kodarensis(KOD)のDNAポリメラーゼであった。2つの酵素は類似のドメイン構造を有し、blastPアライメント用いたアミノ酸レベルで79%の同一性を有する(表2を参照されたい)。PfuおよびKODのドメイン構造を図1に示す。
Pyrococcus furiosusおよびThermococcus kodakarensisのDNAポリメラーゼのコドン最適化および合成
Pyrococcus furiosusのポリメラーゼI(配列番号1)およびThermococcus kodakarensisのポリメラーゼI(配列番号2)についての天然のDNA配列を、Genbankから検索した。これらの2つのDNA配列は、E.Coliにおいて発現させるために、in silicoにおいて、Codon Devices(Cambridge、Massachusetts)によってコドン最適化し、その結果、PfuポリメラーゼIのコドン最適化された遺伝子DNA配列に対して配列番号3、KODポリメラーゼIのコドン最適化された遺伝子DNA配列に対して配列番号4がもたらされた。2つのコドン最適化された遺伝子を化学合成し、Codon Devices(Cambridge、Massachusetts)によってpUC19にクローニングし、その結果、PfuポリメラーゼIに対して配列番号7、KODポリメラーゼIに対して配列番号8がもたらされた。
コドン最適化されたKODポリメラーゼIおよびPfuポリメラーゼIの配列の発現ベクターpKBexpへのクローニング
KODポリメラーゼのコドン最適化されたpUC19構築物(配列番号8)およびPfuポリメラーゼのコドン最適化されたpUC19構築物(配列番号7)を、下記の通りpKBexpベクターにクローニングした:
pKBexpベクターは、非相補的な突出を持つ2つのEco31I部位を含有し、単一の制限酵素を使用した、挿入物の定方向クローニングを可能にする。KODポリメラーゼ遺伝子およびPfuポリメラーゼ遺伝子を、pKBexpへの定方向かつインフレームのクローニングを可能にする2つの隣接Eco31I部位を用いて設計した。
KODポリメラーゼI遺伝子およびPfuポリメラーゼI遺伝子からのDNA配列のドメイン交換
KODポリメラーゼI遺伝子(配列番号5)およびPfuポリメラーゼI遺伝子(配列番号3)のコドン最適化された配列を、KODポリメラーゼおよびPfuポリメラーゼの指ドメインおよび掌ドメインにほぼ隣接する制限酵素部位を用いて設計した。KODのコドン最適化された配列は、PvuII制限酵素部位およびEcoRI制限酵素部位を含有する。Pfuのコドン最適化された配列は、PvuII制限酵素部位およびEcoRI制限酵素部位を含有する。
KOD、Pfu、KofuおよびPodの熱安定性
各酵素10ngを、20mMのTris−HCl、pH8.0、2mMのMgCl2、6mMの(NH4)2SO4、25mMまたは50mMのKCl(PfuおよびPodに対して25mM、KODおよびKofuに対して50mM)を含有する10μlの体積中、98℃で240分、120分、60分、30分、15分、8分、4分、2分、1分または0分インキュベートした。加熱インキュベートした後、プライマー/鋳型混合物10μlを各チューブに加えた。プライマー鋳型混合物は、20mMのTris−HCl、pH8.0、2mMのMgCl2、6mMの(NH4)2SO4、0.6mMのdNTP、0.6μMのそれぞれのプライマー、HPRT1−F1(5’−tttggaaacatctggagtcct−3’(配列番号40))およびHPRT1−R1(5’−gcccaaagggaactgatagtc−3’(配列番号:41))、1μl当たり2ngのヒトゲノムDNA、および25mMまたは50mMのKCl(PfuおよびPodに対して25mM、KODおよびKofuに対して50mM)を含有した。増幅を以下のサイクルプロトコールを用いて行った:95℃で3分、35×(98℃で20秒、60℃で20秒、72℃で20秒)、72℃で20秒。PCR産物をアガロースゲルにおいて分析した(図3を参照されたい)。図3に示したように、98℃で4時間、酵素をプレインキュベートした後、Pfuについて増幅は観察されなかった。対照的に、KOD、KofuおよびPodでは、試験した全ての時点でPCR産物を増幅することができた。
忠実度アッセイ
酵素の忠実度を、Clineらおよびその中の参照文献(Nucl.Acids Res.、1996年、24巻(18号):3546〜3551頁)に記載の方法と同様の方法によって決定した。LacIをE.coliからPCR増幅し、pUC19にクローニングしてプラスミドpKB−LacIQZアルファ(配列番号17)を変性させた(degenerate)。pKB−LacIQZアルファは、忠実度アッセイにおいてLacIをPCR増幅するための鋳型としての役割、および青色/白色コロニースクリーニングを行うための、増幅LacIをその中にクローニングするベクターとしての役割の両方を果たした。
プロセシビティーアッセイ
プロセシビティーは、(Wangら、Nucl. Acids Res、2004年、32巻(3号):1197〜1207頁;およびVon Hippelら、NYAcadSci、1994年;726巻:118〜131頁)に記載のアッセイを使用して決定し、算出することができる。簡単に述べると、0.8pモルの5’FAM標識したプライマー(−40M13LFF、5’FAM−GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCC−3’(配列番号44))を、体積16μL中、20mMのTris−HCl、pH8.0、25mMのKCl、2.5mMのMgCl2、0.3mMのdNTPの存在下で1.6pモルのssM13mp18 DNAに加える。プライマーを、サーモサイクラーにおいて95℃で2分間加熱した後、0.1℃/秒の速度で72℃までゆっくり冷却し、72℃で10分間インキュベートし、0.1℃/秒で4℃までさらに冷却することによって、鋳型にアニーリングする。ポリメラーゼを20mMのTris−HCl、pH8.0、25mMのKClに希釈する。刺激された(primed)鋳型および希釈されたポリメラーゼを72℃まで加熱し、希釈されたポリメラーゼ4μlを刺激された鋳型16μlに加えることによって反応を開始させる。ポリメラーゼを希釈して、ポリメラーゼ:鋳型の比を1:10〜1:10000にする。それぞれ異なる時点の後に、EDTAを最終濃度が10mMになるように加えることによって反応を終了させる。
に従ってプロセシビティーを算出する。バックグラウンドレベルを有意に超える蛍光レベルを持つ各ピーク(I)を積分してそのピークの蛍光強度(ni)をもたらす。総蛍光強度(nT)は、全てのピークの蛍光の和である。積分データをlog(ni/nT)対n−1(ここで、nは取り込まれたヌクレオチドの数である)としてプロットする。データを以下の方程式:log(ni/nT)=(n−1)logPi+log(1−Pi)に適合させる。Pi、顕微鏡的プロセシビティー係数(microscopic processivity factor)を、i位において伸長が終了しない確率として定義する。平均のプライマー伸長長を1/(1−Pi)から決定する。
KOD、Pfu、KofuおよびPodの塩抵抗性
以前の研究(Pavlovら(2002年)、ProcNatl Acad Sci.、99巻(21号)、13510〜13515頁;Wangら(2004年)、NuclAcids Res.、32巻(3号)、1
197〜1207頁)により、ポリメラーゼの塩に対する許容性の増加とポリメラーゼのプロセシビティーの間に直接的な相関があることが示されている。試験した全てのポリメラーゼ(ファミリーAまたはファミリーBからのもの)について、塩許容性が増加したポリメラーゼは、プロセシビティーも増加したことが分かった。したがって、本発明者らは、プロセシビティーの代用として、キメラの塩許容性と親ポリメラーゼの塩許容性を比較した。
KOD、Pfu、KofuおよびPodのTMAC許容性
Kovarovaら(Kovarova,M.およびDraber, P.;Nucl. Acids Res.(2000年)、28
巻(13号)、e70−)によって示されているように、テトラメチルアンモニウムを含有する塩により、PCR反応が増強される。そのような塩の1つはテトラメチルアンモニウムクロリド(TMAC)である。したがって、本発明者らは、本発明者らのキメラのTMAC許容性と親ポリメラーゼのTMAC許容性を比較した。
HRMリアルタイムサーモサイクラー(Corbett Life Science、Sidney、Australia)において、以下のサイクルプロトコールを用いて行った:95℃で3分、(95℃で10秒、50℃で20秒、72℃で20秒、データ収集)を40サイクル、その後、1℃のステップで72℃から95℃まで勾配させ、各ステップの終わりにデータ収集する前に5秒待つ、融解曲線分析のステップ。各試料8μlを1.5%アガロースゲルで分析した。Fermentas GeneRuler(商標)Mix、カタログ番号SM0333(Fermentas、Vilnius、Lithuania)5μlをDNAマーカーとしてゲルにローディングした。代表的な結果を図5に示す。
KODポリメラーゼおよびPfuポリメラーゼのさらなるキメラ
本実施例は、ドメイン間の交換を行う位置を変更することができることを示すために設計している。
T.litoralisのポリメラーゼと9°N−7のポリメラーゼのキメラ
キメラ9NliおよびキメラLi9Nを、図1のアライメントに基づいて設計する。これらは、T.litoralisのDNAポリメラーゼとThermococcus種9°N−7のDNAポリメラーゼの間で掌および指ドメインを交換することによって作製する。これら2つのポリメラーゼの間の全体的な配列同一性は、アミノ酸レベルで77%である。
T.gorgonariusのB型DNAポリメラーゼとT.zilligiiのB型DNAポリメラーゼのキメラ
キメラGoZiおよびキメラZiGoを、図1のアライメントに基づいて設計する。これらは、T.gorgonariusのDNAポリメラーゼとT.zilligiiのDNAポリメラーゼの間で、掌および指ドメインを交換することによって作製する。これら2つのポリメラーゼの間の全体的な配列同一性はアミノ酸レベルで94%である。
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識する、または、常用の実験法だけを使用して確認することができる。本発明の範囲は上記の説明に限定されないものとするが、添付の特許請求の範囲に示す通りである。本明細書および特許請求の範囲において使用する「a(1つの)」、「an(1つの)」および「the(この)」という冠詞は、それに反することが明確に示されていない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。あるグループの1つまたは複数のメンバーの間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は、それに反することが示されていない、または他に文脈から明らかでない限り、そのグループのメンバーの1つ、2つ以上または全部が、所与の産物またはプロセスに存在する、利用される、そうでなければ関連する場合に満たされるとみなされる。本発明は、まさに1つのグループメンバーが、所与の産物またはプロセスに存在する、利用される、そうでなければ関連する実施形態を含む。本発明は、そのグループのメンバーの2つ以上または全部が、所与の産物またはプロセスに存在する、利用される、そうでなければ関連する実施形態も含む。さらに、本発明は、特に指示のない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、請求項の1つまたは複数からの1つまたは複数の限定、要素、条項、説明的な用語などが、同じ基になる請求項に従属している別の請求項(または、関連した、任意の他の請求項)に導入されている、変形、組合せ、および並び替えを包含することが理解されよう。要素がリストとして、例えば、マルクーシェグループまたは類似の形式で提示されている場合、要素の各サブグループも開示され、任意の(1つまたは複数の)要素をそのグループから取り出すことができることが理解されよう。一般に、本発明または本発明の態様が、特定の要素、特徴などを含むと称される場合、本発明の特定の実施形態または本発明の態様は、そのような要素、特徴などからなる、または本質的になることが理解されよう。単純にする目的で、それらの実施形態は、本明細書において全ての場合を具体的に示していない。本発明の任意の実施形態、例えば、従来技術中に見られる任意の実施形態を、特定の除外について本明細書において列挙したかに関わらず、特許請求の範囲から除外することができることが理解されよう。
本明細書において引用した全ての出版物および特許文献は、各出版物または特許文献のそれぞれの内容が本明細書に組み込まれたのと同じようにその全体が参照により組み込まれている。本発明は以下をも提供する。
(1) プロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはTMAC許容性が高い特徴を有する第1のDNAポリメラーゼに見られるアミノ酸配列と少なくとも80%同一である配列を有する第1のドメイン;および
忠実度が高い特徴を有する第2のDNAポリメラーゼに見られるアミノ酸配列と少なくとも80%同一である配列を有する第2のドメイン
を含み、
忠実度が高く、プロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはTMAC許容性が高い特徴を有する、キメラポリメラーゼ。
(2) 前記第1のDNAポリメラーゼが、KODポリメラーゼまたはTNA1ポリメラーゼ、Thermococcus sp.9°N−7、T4、T7、またはphi29から選択される、項目1に記載のキメラポリメラーゼ。
(3) 前記第1のDNAポリメラーゼがKODポリメラーゼである、項目2に記載のキメラポリメラーゼ。
(4) 前記第2のDNAポリメラーゼが、Pyrococcus furiosus、P.abyssi、T.gorgonarius、T.litoralis、T.zilligii、T.sp.GT、またはP.sp.GB−Dから単離されたポリメラーゼから選択される、項目1に記載のキメラポリメラーゼ。
(5) 前記第2のDNAポリメラーゼがPfuポリメラーゼである、項目4に記載のキメラポリメラーゼ。
(6) 前記第1のDNAポリメラーゼがKODポリメラーゼであり、前記第2のDNAポリメラーゼがPfuポリメラーゼである、項目1に記載のキメラポリメラーゼ。
(7) 前記第1のドメインが、エキソヌクレアーゼドメイン、N末端ドメイン、親指ドメインおよびそれらの組合せからなる群から選択される、項目1から6のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼ。
(8) 前記第2のドメインが掌および/または指ドメインである、項目1から7のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼ。
(9) 前記第1のDNAポリメラーゼに見られる前記アミノ酸配列が、KODポリメラーゼ(配列番号11)のアミノ酸残基156〜301に対応する、項目1から8のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼ。
(10) KODポリメラーゼ(配列番号11)のアミノ酸残基26〜105に対応するアミノ酸配列と少なくとも80%同一である配列を有する第3のドメインをさらに含む、項目9に記載のキメラポリメラーゼ。
(11) KODポリメラーゼ(配列番号11)のアミノ酸残基612〜749に対応するアミノ酸配列と少なくとも80%同一である配列を有する第4のドメインをさらに含む、項目10に記載のキメラポリメラーゼ。
(12) 前記第1のDNAポリメラーゼに見られる前記アミノ酸配列が、KODポリメラーゼ(配列番号11)のアミノ酸残基26〜105に対応する、項目1から8のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼ。
(13) KODポリメラーゼ(配列番号11)のアミノ酸残基612〜749に対応するアミノ酸配列と少なくとも80%同一である配列を有する第3のドメインをさらに含む、項目12に記載のキメラポリメラーゼ。
(14) 前記第1のDNAポリメラーゼに見られる前記アミノ酸配列が、KODポリメラーゼ(配列番号11)のアミノ酸残基612〜749に対応する、項目1から8のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼ。
(15) KODポリメラーゼ(配列番号11)のアミノ酸残基156〜301に対応するアミノ酸配列と少なくとも80%同一である配列を有する第3のドメインをさらに含む、項目14に記載のキメラポリメラーゼ。
(16) 前記第2のDNAポリメラーゼに見られる前記アミノ酸配列が、Pfuポリメラーゼ(配列番号9)のアミノ酸残基394〜563に対応する、項目1から15のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼ。
(17)(1)
(2)
、(ここで、Xは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。)
(3)
、(ここで、Xは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。)
(4)
、(ここでX1はKではなく、X2はHではなく、X3はRではなく、X4はIではなく、X5はRではなく、X6はKではなく、X7はGではなく、X8はKではなく、X9はIではなく、X10はRではなく、X11はIではなく、X12はVではなく、X13はDではなく、X14はEではなく、X15はKではなく、X16はIではなく、X17はTではなく、X18はLではなく、X19はEではなく、X20はTではなく、X21はEではなく、X22はVではない。)
(5)
、(ここでX1はIではなく、X2はNではなく、X3はEではなく、X4はKではなく、X5はIではなく、X6はEではなく、X7はSではなく、X8はIではなく、X9はIではなく、X10はRではなく、X11はIではなく、X12はIではなく、X13はVではなく、X14はSではなく、X15はPではなく、X16はAではなく、X17はAではなく、X18はKではなく、X19はLではなく、X20はTではなく、X21はIではなく、X22はMではなく、X23はIではなく、X24はMではなく、X25はTではなく、X26はHではなく、X27はTではなく、X28はIではなく、X29はKではなく、X30はDではなく、X31はAではなく、X32はKではなく、X33はSではない。)
(6)
、(ここでX1はTではなく、X2はIではなく、X3はHではなく、X4はEではなく、X5はIではなく、X6はQではなく、X7はAではなく、X8はNではなく、X9はIではなく、X10はAではなく、X11はYではなく、X12はPではなく、X13はHではなく、X14はEではなく、X15はIではなく、X16はKではなく、X17はKではなく、X18はKではなく、X19はMではなく、X20はGではなく、X21はRではなく、X22はDではなく、X23はPではなく、X24はSではなく、X25はNではなく、X26はLではなく、X27はAではなく、X28はEではなく、X29はYではなく、X30はKではなく、X31はLではなく、X32はEではなく、X33はGではない。)
およびそれらの組合せ
からなる群から選択されるコンセンサス配列を有する第1のドメイン、ならびに
(1)
、(ここで、Xは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。)
(2)
およびそれらの組合せ
からなる群から選択されるコンセンサス配列を有する第2のドメイン
を含み、
忠実度が高く、プロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはTMAC許容性が高い特徴を有する、キメラポリメラーゼ。
(18) 配列番号16(Kofuのアミノ酸配列)と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、キメラポリメラーゼ。
(19) 前記アミノ酸配列が、
のコンセンサス配列を含む、項目18に記載のキメラDNAポリメラーゼ。
(20) 前記アミノ酸配列が配列番号16(Kofuのアミノ酸配列)と同一である、項目18に記載のキメラポリメラーゼ。
(21)
(ここで、Xは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。)
のアミノ酸コンセンサス配列を含み、
KODの忠実度よりも高い忠実度を有し、Pfuのプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはTMAC許容性よりも高いプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはTMAC許容性を有する、キメラポリメラーゼ。
(22) 前記アミノ酸コンセンサス配列が、
である、項目21に記載の方法。
(23) 第1のDNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼドメイン、N末端ドメイン、および/または親指ドメインに見られるアミノ酸配列と少なくとも80%同一である配列を有する第1のドメイン;および
第2のDNAポリメラーゼの掌および/または指ドメインに見られるアミノ酸配列と少なくとも80%同一である配列を有する第2のドメイン
を含み、
前記第2のDNAポリメラーゼのプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはTMAC許容性よりも高いプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはTMAC許容性を有し、前記第1のDNAポリメラーゼの忠実度よりも高い忠実度を有する、キメラポリメラーゼ。
(24) 前記第1のDNAポリメラーゼが、KODポリメラーゼ、TNA1ポリメラーゼ、Thermococcus sp.9°N−7、T4、T7、またはphi29から選択される、項目23に記載のキメラポリメラーゼ。
(25) 前記第1のDNAポリメラーゼがKODポリメラーゼである、項目23に記載のキメラポリメラーゼ。
(26) 前記第2のDNAポリメラーゼが、Pyrococcus furiosus、P.abyssi、T.gorgonarius、T.litoralis、T.zilligii、またはP.sp.GB−Dから単離されたポリメラーゼから選択される、項目23に記載のキメラポリメラーゼ。
(27) 前記第2のDNAポリメラーゼがPfuポリメラーゼである、項目26に記載のキメラポリメラーゼ。
(28) 前記第1のDNAポリメラーゼがKODポリメラーゼであり、前記第2のDNAポリメラーゼがPfuポリメラーゼである、項目23に記載のキメラポリメラーゼ。
(29) 前記第1のDNAポリメラーゼがPfuポリメラーゼであり、前記第2のDNAポリメラーゼがKODポリメラーゼである、項目23に記載のキメラポリメラーゼ。
(30) 配列番号15(Podのアミノ酸配列)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、キメラポリメラーゼ。
(31) 項目1から30のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列。
(32) 項目31に記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
(33) 項目31に記載のヌクレオチド配列を含む細胞。
(34) 項目1から30のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼを含むキット。
(35) 項目1から30のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼを使用してDNAを合成する方法。
(36) 項目1から30のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼを使用してDNA断片を増幅する方法。
(37) キメラポリメラーゼを設計製作する方法であって、
(a)第1のDNAポリメラーゼに基づくN末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメイン、および/または親指ドメインを提供する工程;
(b)第2のDNAポリメラーゼに基づく掌および/または指ドメインを提供する工程;(c)工程(a)および工程(b)からのドメインを組み合わせて、キメラポリメラーゼを形成する工程、を含み、
前記キメラポリメラーゼが、前記第2のDNAポリメラーゼのプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはTMAC許容性よりも高いプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはTMAC許容性を有し、前記第1のDNAポリメラーゼの忠実度よりも高い忠実度を有する、方法。
(38) 前記第1のDNAポリメラーゼが、KODポリメラーゼ、またはTNA1ポリメラーゼ、Thermococcus sp.9°N−7、T4、T7、またはphi29から選択される、項目37に記載の方法。
(39) 前記第1のDNAポリメラーゼがKODポリメラーゼである、項目38に記載の方法。
(40) 前記第2のDNAポリメラーゼが、Pyrococcus furiosus、P.abyssi、T.gorgonarius、T.litoralis、T.zilligii、T.sp.GT、またはP.sp.GB−Dから単離されたポリメラーゼから選択される、項目38に記載の方法。
(41) 前記第2のDNAポリメラーゼがPfuポリメラーゼである、項目40に記載の方法。
(42) 前記第1のDNAポリメラーゼがKODポリメラーゼであり、前記第2のDNAポリメラーゼがPfuポリメラーゼである、項目37に記載の方法。
(43) 項目35から42のいずれか一項に記載の方法を用いて設計製作したキメラポリメラーゼ。
(44) DNAポリメラーゼの忠実度を改善する方法であって、対象のDNAポリメラーゼの掌および/または指ドメイン内の配列を、前記対象のDNAポリメラーゼと比較して、忠実度がより高い特徴を有する異なるDNAポリメラーゼからの対応する配列で置き換える工程を含む方法。
(45) DNAポリメラーゼのプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはTMAC許容性を改善する方法であって、対象のDNAポリメラーゼのN末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメインおよび/または親指ドメイン内の配列を、前記対象のDNAポリメラーゼと比較して、プロセシビティー、延長速度、塩抵抗性またはPCRエンハンサー抵抗性が高い特徴を有する異なるDNAポリメラーゼからの対応する配列で置き換える工程を含む方法。
(46) 項目44または45に記載の方法によって改善されたDNAポリメラーゼ。
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- 本明細書に記載の発明。
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