JP2015127738A - 顕微鏡システムおよびその制御方法 - Google Patents

Abstract

【課題】性能に優れる顕微鏡システムを提供する。
【解決手段】この顕微鏡システムは、蛍光物質により染色された生体試料の蛍光物質を発光させる第１の励起光を発する光源と、生体試料に第１の励起光を集光させる対物レンズと、対物レンズによって集光させた前記第１の励起光が前記生体試料を走査するように前記光源からの前記第１の励起光の向きを変更する走査機構と、生体試料に第１の励起光を集光させることによって生体試料から発生した第１の蛍光を導入し、電気信号に変換する光検出器と、生体試料に第２の励起光を照射し、生体試料から発生した第２の蛍光をマクロ撮像するマクロ撮像部とを具備する
【選択図】図１

Description

本技術は、レーザー光で試料を走査して試料の画像を取得するレーザー顕微鏡などを用いた顕微鏡システムおよびその処理方法に関する。

レーザー顕微鏡として、次のようなものが知られている。
蛍光標識された試料に、光源からレーザー光が励起光として対物レンズを通して集光される。その際、光源から出射された励起光の向きがガルバノミラーによって変更されることによって、励起光の照射位置が試料上で移動され、試料が走査される。励起光によって試料の蛍光体が蛍光発光する。蛍光は、共焦点絞りに形成されたピンホール、バリアフィルタなどを通過して、光検出器に導入される。光検出器は、検出した蛍光を電気信号に変換して、制御装置へ送信する。制御装置は、光検出器からの電気信号から試料の画像を生成し、表示装置に表示する。

特開２０１３−００３３３８号公報

レーザー顕微鏡における対物レンズの視野は、例えば４倍率のような低倍率のものであっても約３−４ｍｍ程度である。これに対し、試料に一般的に用いられるスライドガラスの長辺は８０ｍｍであり、培養細胞の観察のための容器として用いられるガラスボトムディッシュの観察窓の径サイズは２７ｍｍである。このため、対物レンズを介して観察される像から、観察対象である細胞の位置を捉えるためには、試料を載せたステージを、対物レンズの光軸に対して直交する面内で繰り返し移動させて対物レンズの視野をシフトさせる必要がある。このため時間がかかる。

これは本技術が解決しようとする課題の一部である。レーザー顕微鏡などの顕微鏡システムでは、その他、様々な点で性能を向上させるための技術が求められている。

以上のような事情に鑑み、本技術の目的は、性能に優れる顕微鏡システムを提供することにある。

上記の課題を解決するために、本技術に係る顕微鏡システムは、
蛍光物質により染色された生体試料の前記蛍光物質を発光させる第１の励起光を発する光源と、
前記生体試料に前記第１の励起光を集光させる対物レンズと、
前記対物レンズによって集光させた前記第１の励起光が前記生体試料を走査するように前記光源からの前記第１の励起光の向きを変更する走査機構と、
前記生体試料に前記第１の励起光を集光させることによって前記生体試料から発生した第１の蛍光を導入し、電気信号に変換する光検出器と、
前記生体試料に第２の励起光を照射し、前記生体試料から発生した第２の蛍光をマクロ撮像するマクロ撮像部とを具備する。

前記生体試料が、培養細胞とこの培養細胞を収容した容器とを有し、
前記顕微鏡システムは、
マクロ撮像された画像から１以上の前記培養細胞の位置を算出し、
前記１以上の培養細胞のなかから前記対物レンズを用いた観察対象として選定された培養細胞が、前記対物レンズを用いた観察時に前記対物レンズの視野に入るように前記生体試料と前記対物レンズとの相対的な位置関係を制御する制御部
をさらに具備するものであってよい。

前記制御部は、前記マクロ撮像された画像をディストーション補正し、このディストーション補正がされた画像から１以上の前記培養細胞の位置を算出するようにしてもよい。

前記マクロ撮像部は、前記生体試料の全体の蛍光画像を撮像するものであってよい。

前記マクロ撮像部は、撮像素子と、この撮像素子に前記生体試料の全体の蛍光画像を結像するマクロレンズとを有し、
前記マクロレンズは、少なくとも前記対物レンズの焦点深度よりも深い焦点深度を有するものであってよい。

前記生体試料が、生体組織片とこの生体組織片を収容した容器とを有し、
本技術に係る顕微鏡システムは、
前記マクロ撮像された画像から１以上の前記生体組織片の位置を算出し、
前記１以上の生体組織片において前記対物レンズを用いた観察対象として選定された注目部位が、前記対物レンズを用いた観察時に前記対物レンズの視野に入るように前記生体試料と前記対物レンズとの相対的な位置関係を制御する制御部をさらに具備するものであってよい。

本技術の別の側面である顕微鏡システムの制御方法は、
前記蛍光物質により染色された生体試料の蛍光像を観察するレーザー顕微鏡に、前記生体試料の蛍光マクロ画像を撮像するマクロ撮像部を設け、
制御部は、
前記マクロ撮像部にてマクロ撮像された画像から１以上の前記培養細胞の位置を算出し、
前記１以上の培養細胞のなかから前記対物レンズを用いた観察対象として選定された培養細胞が、前記対物レンズを用いた観察時に前記対物レンズの視野に入るように前記生体試料と前記対物レンズとの相対的な位置関係を制御するものであってよい。

以上のように、本技術によれば、性能に優れる顕微鏡システムを提供することができる。

本技術に係る第１の実施形態の顕微鏡システムの構成を示す図である。 典型的な顕微鏡システムでの試料のセットから細胞の観察までの動作のフローチャートである。 ガラスボトムディッシュを用いて細胞を２次元的に培養する環境を示す図である。 ガラスボトムディッシュを用いて細胞を３次元的に培養する環境を示す図である。 本実施形態の顕微鏡システムでの培養細胞の試料のセットから注目細胞の観察までの動作のフローチャートである。 マクロ撮像部によって撮影されたディストーション補正後の試料の蛍光マクロ画像の概念図である。 注目細胞と対物レンズの視野との位置関係を示す図である。 本実施形態の顕微鏡システムでの生体細胞片の試料のセットから注目部位の観察までの動作のフローチャートである。 第１の変形例である蛍光励起用照明の構成を示す図である。 第２の変形例である蛍光励起用照明の構成を示す図である。 試料ホルダにおける複数の生体組織と対物レンズの視野との位置関係を示す図である。

以下、本技術に係る実施形態を、図面を参照しながら説明する。
＜第１の実施形態＞
図１は、本技術に係る第１の実施形態の顕微鏡システム１００の構成を示す図である。

本実施形態は、レーザー顕微鏡を用いた顕微鏡システム１００である。
同図に示すように、この顕微鏡システム１００は、レーザー光源１０、第１のダイクロイックミラー２１、ガルバノミラー２２、第２のダイクロイックミラー２３、対物レンズ２４、ステージ２５、１光子励起撮像部３０、２光子励起撮像部４０、マクロ撮像部５０、システムコントロールＰＣ（Personal Computer）６０、スキャナーコントローラ６２および顕微鏡コントローラ６４を備える。

レーザー光源１０（光源）は、試料ＳＰＬの蛍光物質を励起するためのレーザー光（以下「励起光」と呼ぶ。）を出射する。レーザー光源１０は、互いに波長の異なる１光子用の励起光および２光子用の励起光を選択的に発生させることが可能である。１光子用の励起光および２光子用の励起光を総称して「励起光」と呼ぶ。

レーザー光源１０より出射された励起光は、コリメートレンズ１１によって平行光とされ、第１のダイクロイックミラー２１に導入される。

第１のダイクロイックミラー２１は、コリメートレンズ１１によって導入された励起光を反射してガルバノミラー２２に導入する。

ガルバノミラー２２（走査機構）は、各々独立して駆動される１以上のミラーで構成される。ガルバノミラー２２は、励起光の焦点がステージ２５上に置かれた試料ＳＰＬを二次元走査するように、コリメートレンズ１１より導入された励起光の向きを変更する。

ガルバノミラー２２を出た励起光は第２のダイクロイックミラー２３に導入される。

第２のダイクロイックミラー２３は、ガルバノミラー２２より導入された励起光（１光子励起光または２光子励起光）を反射して対物レンズ２４に導入する。

対物レンズ２４は、第２のダイクロイックミラー２３より導入された励起光（１光子励起光または２光子励起光）をステージ２５上の試料ＳＰＬに集光させる。励起光を受けることによって試料ＳＰＬの蛍光体から発せられた１光子励起による蛍光または２光子励起による蛍光は、対物レンズ２４を通過して第２のダイクロイックミラー２３に導入される。

対物レンズ２４は、ステージ２５の下方に配置される。ステージ２５の試料ＳＰＬが載せられる部位には、光を通過させるための開口部２５ａが設けられている。すなわち、対物レンズ２４からの励起光はステージ２５の開口部２５ａを通して試料ＳＰＬに照射され、励起光を受けることによって試料ＳＰＬの蛍光物質より発生した蛍光もステージ２５の開口部２５ａを通して対物レンズ２４に導入される。

第２のダイクロイックミラー２３は、対物レンズ２４を通過して導入された蛍光が２光子励起による蛍光であるとき、この２光子励起による蛍光成分を透過して２光子励起撮像部４０に導入する。

また、第２のダイクロイックミラー２３は、対物レンズ２４を通過して導入された蛍光が１光子励起による蛍光である場合、この１光子励起による蛍光の波長成分を反射してガルバノミラー２２に導入する。

ガルバノミラー２２は、第２のダイクロイックミラー２３から導入された１光子励起による蛍光を第１のダイクロイックミラー２１に導入する。

第１のダイクロイックミラー２１は、ガルバノミラー２２から導入された１光子励起による蛍光を通過させて１光子励起撮像部３０に導入する。

１光子励起撮像部３０は、第１の集光レンズ３１、ピンホール３２および第１の光検出器３３を有する。

第１の集光レンズ３１は、第１のダイクロイックミラー２１より導入された１光子励起による蛍光を集光させ、ピンホール３２に導入する。

ピンホール３２は、対物レンズ２４の焦点位置と共役な位置（像位置）に円形の開口部３２ａを有する。ピンホール３２は、第１の集光レンズ３１から導入された１光子励起による蛍光から開口部３２ａを通過する蛍光のみを第１の光検出器３３の受光面に到達させる。

第１の光検出器３３（光検出器）は、ピンホール３２を通して導入された蛍光を光の強度に対応する電気信号に変換する。第１の光検出器３３は、例えばＰＭＴ（Photo Multiplier Tube、光電子増倍管）などで構成される。

２光子励起撮像部４０は、第２の集光レンズ４１および第２の光検出器４２を有する。

第２の集光レンズ４１は、第２のダイクロイックミラー２３より導入された２光子励起による蛍光を集光させて第２の光検出器４２の受光面に導入する。２光子励起光による蛍光体の励起は焦点付近のみで起こることから、１光子励起撮像部３０のようにピンホールは不要である。

第２の光検出器４２（光検出器）は、第２の集光レンズ４１をより通して照射された２光子励起による蛍光を、蛍光の強度に対応する電気信号に変換する。第２の光検出器４２は第１の光検出器３３と同様、例えばＰＭＴ（Photo Multiplier Tube、光電子増倍管）などで構成される。

ステージ２５は、対物レンズ２４の光軸に対して直交するＸＹ方向と、光軸に沿ったＺ方向に、移動可能なように構成される。ステージ２５の上には試料ＳＰＬが載せられる。試料ＳＰＬは、例えば、培養細胞を収容する容器であるガラスボトムディッシュ、生体組織片をスライドガラスとカバーガラスとの間に保持するプレパラートなどである。試料ＳＰＬ内の培養細胞や生体組織片は、蛍光性を有する物質により染色されたものである。このような試料ＳＰＬは蛍光標本とも呼ばれる。

［マクロ撮像部５０の構成］
マクロ撮像部５０は、試料ＳＰＬの全体的な蛍光像を撮像するための系である。
このマクロ撮像部５０は、ステージ２５の上方に配置される。すなわち、マクロ撮像部５０は、ステージ２５の試料ＳＰＬの搭載されている面に対向する側に配置されている。

マクロ撮像部５０は、撮像素子５１、マクロレンズ５２、複数の蛍光励起用照明５３および蛍光フィルター５４を有する。

撮像素子５１は、マクロ撮影のための比較的大型の撮像素子である。例えば、ＡＰＳ（Advanced Photo System）サイズ、フルサイズなどの撮像素子である。撮像素子５１は、例えばＣＣＤ（Charge Coupled Device）やＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサ等が用いられる。撮像素子５１は、ＲＧＢ(Red、Green、Blue)の色別に光を受けて電気信号に変換する光電変換素子を有し、入射光からカラー画像を得るカラーイメージャである。

マクロレンズ５２は、マクロ撮影のための光学レンズである。本実施形態では、焦点深度の深いマクロレンズ５２が採用される。

蛍光励起用照明５３は、試料ＳＰＬの蛍光物質を励起するための光を試料ＳＰＬに全面的に照射する。蛍光励起用照明５３は、試料ＳＰＬを全域的に均一に照明するために、例えば、４方向から試料ＳＰＬに励起光を照明できるように配置される。より具体的には、４つの照明で構成されてもよい。

蛍光励起用照明５３は、例えば、励起光源５３１、集光レンズ５３２および励起フィルター５３３などで構成される。励起光源５３１としては、例えば、波長３６５ｎｍのＬＥＤ（Light Emitting Diode）などを用いることができる。

蛍光フィルター５４は、マクロレンズ５２とステージ２５上の試料ＳＰＬとの間に配置される。蛍光フィルター５４は、励起光がマクロレンズ５２に混入するのを防止するものである。すなわち、蛍光フィルター５４は、励起光を受けることによって試料ＳＰＬの蛍光物質から発せられる蛍光を選択的にマクロレンズ５２に導入するための手段である。
以上がマクロ撮像部５０の説明である。

顕微鏡コントローラ６４は、システムコントロールＰＣ６０からの指令をもとにステージ２５をＸＹＺの３軸方向に移動させるステージ駆動部３４を制御する。ここで、Ｚ軸方向は対物レンズ２４の光軸に沿った方向であり、Ｘ軸およびＹ軸の各方向は、Ｚ軸に対して直交し、かつ互いに直交する方向である。

スキャナーコントローラ６２は、ガルバノミラー２２の制御、光検出器３３、４２の制御、レーザー光源１０の制御などを行う。

スキャナーコントローラ６２は、１光子励起撮像部３０の第１の光検出器３３および２光子励起撮像部４０の第２の光検出器４２から出力された信号のＡ／Ｄ変換、Ａ／Ｄ変換されたデジタル信号から試料ＳＰＬ毎の画像データを生成する処理などを行う。

システムコントロールＰＣ６０（制御部）は、典型的なコンピュータのハードウェア構成を有する。すなわち、システムコントロールＰＣ６０は、メモリ、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、データ記憶装置およびシステムバスなどを有する。

データ記憶装置には、ＯＳ（Operating System）、顕微鏡システム１００を制御するためのアプリケーションプログラム、および画像処理のためのアプリケーションプログラムなどが格納される。また、データ記憶装置には、スキャナーコントローラ６２より転送された画像データや、このシステムコントロールＰＣ６０のＣＰＵによって実行された画像処理の結果などが保存される。

データ記憶装置としては、主にＨＤＤ（Hard Disk Drive）が用いられるが、光ディスクドライブ、ＳＳＤ（Solid State Drive）、その他の種類のストレージであってもよい。

ＣＰＵは、メモリに記憶されたＯＳおよびアプリケーションプログラムに従って顕微鏡システム１００を制御する。例えば、ＣＰＵは、顕微鏡コントローラ６４に対してステージ２５の移動に関する情報を供給する。

［典型的な顕微鏡システムの動作］
次に、本実施形態の顕微鏡システム１００と比較される典型的な顕微鏡システムでの試料のセットから細胞の観察までの動作について説明する。

図２は、かかる典型的な顕微鏡システムでの試料のセットから注目細胞の観察までの動作のフローチャートである。
ここで、「注目細胞」とは、視聴中の観察対象である細胞のことを言う。

典型的な顕微鏡システムでは、まず、対物レンズを用いた観察光学系により試料の蛍光マクロ画像を、例えば次のように取得する。

１．試料がステージ上にセットされる（ステップＳ１０１）。

２．対物レンズが低倍率のものに切り替えられる（ステップＳ１０２）。

３．ここで、対物レンズを用いて観察できる視野の大きさは、倍率が１．２５倍の対物レンズを用いた場合において直径１７ｍｍ程度である。これに対し、例えば、培養細胞の観察に一般的に用いられるガラスボトムディッシュのホール径は２７ｍｍである。したがって、この条件では、ガラスボトムディッシュのホール内の試料の全景を１回で撮影することができない。このため、ステージを動かして対物レンズの視野を移動させながら撮影が繰り返される（ステップＳ１０３）。

４．対物レンズの焦点を試料に合わせるためにオートフォーカスが実行される（ステップＳ１０４）。

５．撮影が実行され、試料において対物レンズの視野に対応する領域（以下、「小領域」と呼ぶ。）の画像データが取得される（ステップＳ１０５）。
ステップＳ１０３のステージの移動からステップＳ１０５の小領域の画像データの取得までのループは、試料の、例えば全域に対応する複数の画像データが取得されるまで繰り返される。

６．試料の例えば全域に対応する複数の画像データが取得されたところで、各小領域の画像データを二次元的に繋ぎ合わせて試料単位の画像データを作成するスティッチング処理が行われる（ステップＳ１０６）。

７．スティッチング処理により得られた試料単位の画像データについて注目細胞を選定する処理が行われる（ステップＳ１０７）。

８．選定された注目細胞の位置が、当該注目細胞を含む小領域を撮影した際のステージの移動に関する情報をもとに算出される。この注目細胞の位置情報をもとに、当該注目細胞が、対物レンズによる観察領域に入るようにステージが移動される（ステップＳ１０８）。

９．対物レンズが、蛍光マクロ撮影用の低倍率のものから観察用の高倍率のものに切り替えられる（ステップＳ１０９）。

１０．高倍率の対物レンズの焦点を注目細胞に合わせるためにオートフォーカスが実行される（ステップＳ１１０）。なお、対物レンズの焦点位置を所定の距離ずつ移動させてその都度撮影することによって、焦点位置の異なる複数の像を撮影するｚスタック撮影を行う場合には、当該ステップＳ１１０のオートフォーカスはスキップされる。

１１．顕微鏡観察あるいは顕微鏡撮影が行われる（ステップＳ１１１）。

以上が、典型的な顕微鏡システムでの試料のセットから注目細胞の観察までの動作の説明である。

上記の典型的な顕微鏡システムでは、試料のセットから注目細胞の観察が可能な画像データが得られるまでに多くのステップを要する。すなわち、対物レンズを用いて撮影できる範囲のサイズは、４倍の対物レンズであっても３?４ｍｍ程度しかない。試料ＳＰＬに用いられるスライドガラスは長辺が８０ｍｍであり、培養細胞の観察に用いられる容器であるガラスボトムディッシュの観察窓の径サイズは２７ｍｍである。このため、対物レンズを介して観察される像から、観察対象である細胞の位置を捉えるためには、試料を載せたステージを、対物レンズの光軸に対して直交する面内で繰り返し移動させて対物レンズの視野をシフトさせる必要がある。このため時間がかかる。

また、生体組織片のように観察対象がある程度大きい場合、生体組織片の外形をなぞるようにステージを移動させながら観察することが行われる。しかし、例えば、図１１に示すように、試料ホルダ８０において複数の生体組織８１ａ，８１ｂが、対物レンズの光軸に対して直交する面内で離れて存在するような場合で、さらに、複数の生体組織８１ａ，８１ｂの間隔が対物レンズの視野８２よりも大きい場合、一方の生体組織８１ａの観察中に他方の生体組織８１ｂが視野８２に現れにくい。このため、他方の生体組織８１ｂの見逃してしまう可能性がある。また、他方の生体組織８１ｂが存在することが既知であったとしても、対物レンズの視野８２が小さいために、他方の生体組織８１ｂの発見までに長い時間がかかってしまう。

また、対物レンズを用いて撮影された複数の小領域の画像データを二次元的に繋ぎ合わせるスティッチング処理のための演算にも時間がかかる。

さらに、上記の典型的な顕微鏡システムでは、ガラスボトムディッシュを用いて細胞を３次元的に培養する環境において、細胞のマクロ画像を良好に得ることが困難である。その理由を以下に説明する。

図３は、ガラスボトムディッシュを用いて細胞７１を２次元的に培養する環境Ａを示す図である。
同図に示すように、ガラスボトムディッシュ１を用いて細胞７１を２次元的に培養する環境Ａにおいては、ほとんどの細胞７１はガラスボトムディッシュ１の底面１ａに接した状態で存在する。このため、ガラスボトムディッシュ１の底面１ａの付近に低倍率の対物レンズの焦点位置を合せた状態で撮影された各画像をスティッチングにより繋ぎ合わせた画像は、細胞７１の位置を特定するには十分である。

しかし、図４に示すように、ガラスボトムディッシュ１を用いて細胞７１を３次元的に培養する環境Ｂにおいては、培養された細胞７１はガラスボトムディッシュ１の底面１ａの付近に存在するとは限らず、底面１ａから様々な高さ位置に存在する可能性がある。

このため、焦点ずれによって細胞７１がボケた状態で撮影される部分が発生し、細胞７１の位置を良好に特定できない。具体的には、倍率が１．２５倍、開口数ＮＡが０．０４の対物レンズを用いた場合の焦点深度は約３００μｍ程度である。ガラスボトムディッシュ１において細胞７１を培養する空間の厚さは１０００μｍ程度であるから、上記の対物レンズの焦点深度では不足している。

さらには、このような３次元培養環境の１つとして、文献（Moya et al. Stem Cell Research & Therapy 2013, 4(Suppl 1):N http://stemcellres.com/content/4/S1/N 、およびHsu, Y.-H#, M. Moya#, C.C.W. Hughes, S.C. George*, A.P. Lee*. A microfluidic platform for generating large-scale nearly identical human microphysiological system arrays. Lab Chip, 13 (15), 2990 - 2998, 2013. ）に示されるように、比較的スライドガラスに近い大きさのチップと、このチップに形成された複数の培養チャンバーとで構成されるものがある。このような３次元培養環境に対して、上記の典型的な顕微鏡システムによる方法を採用すると、無視できない程度に長い撮影時間がかかってしまう。

［本実施形態の顕微鏡システム１００の動作］
次に、本実施形態の顕微鏡システム１００での試料のセットから注目細胞の観察までの動作について説明する。

図５は、かかる本実施形態の顕微鏡システム１００での試料のセットから注目細胞の観察までの動作のフローチャートである。

１．試料ＳＰＬがステージ２５上にセットされる（ステップＳ２０１）。

２．マクロ撮像部５０にて、試料ＳＰＬの全域に蛍光励起用照明５３から励起光を照射することによって、試料ＳＰＬから発せられる蛍光を蛍光フィルター５４およびマクロレンズ５２を介して撮像素子５１が撮影する（ステップＳ２０２）。すなわち、一回の撮像で試料ＳＰＬの全域の蛍光マクロ画像が取得される。したがって、ステージ２５の移動に関しては、撮影前、例えば、試料ＳＰＬのＸＹ平面上の中心をマクロ撮像部５０の光軸に一致させるように移動させるだけでよい。

マクロ撮像部５０は、撮像素子５１の出力をＡ／Ｄ変換し、画像化して、画像データをシステムコントロールＰＣ６０に供給する。

３．一般的にマクロレンズにより撮影した画像は多少ゆがんだ画像（ディストーションがある画像）となっている。そこで、システムコントロールＰＣ６０において、ＣＰＵがアプリケーションプログラムに従って蛍光マクロ画像に対するディストーション補正を行う（ステップＳ２０３）。

ディストーション補正は、次のように行われる。
予め、マクロ撮像部５０により格子状のパターンが撮影される。システムコントロールＰＣ６０において、ＣＰＵは、マクロ撮像部５０より供給された格子状のパターンの画像データをもとにゆがみを評価し、このゆがみを打ち消すためのディストーション補正値を算出する。そしてＣＰＵは、マクロ撮像部５０を用いて撮影された試料ＳＰＬの蛍光マクロ画像を上記のディストーション補正値を用いて補正する。

図６はマクロ撮像部５０によって撮影された試料ＳＰＬの蛍光マクロ画像７０の概念図である。この蛍光マクロ画像７０には、複数の細胞の蛍光像７１ａ，７１ｂ，７１ｃ，７１ｄ，７１ｅ，７１ｆが含まれる。

４．次に、システムコントロールＰＣ６０において、ＣＰＵは、ディストーション補正後の蛍光マクロ画像に含まれる１以上の細胞各々の蛍光像の位置を算出し、その位置情報をメモリあるいはデータ記憶装置に保存する（ステップＳ２０４）。

５．システムコントロールＰＣ６０において、ＣＰＵまたは観察者は、蛍光マクロ画像に含まれる１以上の細胞各々の蛍光像の中から注目細胞の蛍光像を選定する（ステップＳ２０５）。
例えば、図６の蛍光マクロ画像７０において７１ｄの細胞の蛍光像が注目細胞として選定されたものとする。

６．システムコントロールＰＣ６０において、ＣＰＵは、選定された注目細胞の位置情報をメモリまたはデータ記憶装置から参照する。そして、ＣＰＵは、例えば、図７に示すように、この位置情報をもとに、注目細胞の蛍光像７１ｄに対応する細胞が対物レンズ２４の視野２４ｂに入るようにステージ２５を移動させるための指令を顕微鏡コントローラ６４に出力する（ステップＳ２０６）。

７．次に、システムコントロールＰＣ６０において、ＣＰＵは、対物レンズ２４の焦点を、選定された注目細胞に合わせるためにオートフォーカスを実行する（ステップＳ２０７）。なお、対物レンズ２４の焦点位置を所定の距離ずつ移動させてその都度撮影することによって、焦点位置の異なる複数の像を撮影するｚスタック撮影を行う場合には、当該ステップＳ２０７のオートフォーカスはスキップされる。

オートフォーカス方法としては、
ａ．例えば焦点深度よりも小さい間隔で焦点位置を変えてその都度画像を撮影し、各撮影画像を分析することで焦点位置を探し出す方法。
ｂ．対物レンズの焦点位置を対物レンズの光軸方向およびこの光軸に直交する方向に移動させる一方で、撮像素子を連続的に露光させて領域の長時間露光像を生成し、この長時間露光像の周波数解析を行い、この解析結果を用いて蛍光標識の焦点位置を算出する方法。
などが挙げられる。

８．この後、顕微鏡観察あるいは顕微鏡撮影が行われる（ステップＳ２０８）。

以上は、システムコントロールＰＣ６０のＣＰＵが、マクロ撮像部５０からの蛍光マクロ画像を受けて処理を行うものとしたが、システムコントロールＰＣ６０のＣＰＵに代えて、スキャナーコントローラ６２あるいは顕微鏡コントローラ６４において、これらの処理制御を行うように構成されてもよい。

以上の動作の説明から分かるように、本実施形態の顕微鏡システム１００によれば、試料単位の蛍光マクロ画像を一回の撮影で得ることができる。

例えば、マクロ撮像部５０は、撮像素子５１として、ＡＰＳ（Advanced Photo System）サイズ、フルサイズなど、短辺で１８００ピクセル以上の撮像素子を用いた場合、１ピクセルあたり１５μｍ以下の解像度で、ガラスボトムディッシュの観察窓の径のサイズである径２７ｍｍの範囲を撮影することができる。この程度の解像度があれば、細胞１つ１つを認識することが十分可能な蛍光マクロ画像が得られる。

長辺が８０ｍｍのスライドガラスの全景をマクロ撮像部５０で撮影する場合には、例えば、１ピクセルが６μｍ角で２４メガピクセル（４０００×６０００）のフルサイズ（２４ｍｍ×３６ｍｍ）の撮像素子を用いて撮影することによって、細胞１つ１つの認識が可能な蛍光マクロ画像が得られる。

また、本実施形態の顕微鏡システム１００によれば、ステージ２５を繰り返し移動させる必要も、スティッチング処理も必要ない。このため、試料ＳＰＬのステージ２５へのセットから注目細胞の観察までの時間を大幅に短縮できる。

さらに、本実施形態の顕微鏡システム１００によれば、マクロ撮像部５０のマクロレンズ５２として焦点深度の深いものが選定されていることで、ガラスボトムディッシュ１を用いて細胞を３次元的に培養する環境（図４の環境Ｂ）内の細胞１つ１つの認識が可能な蛍光マクロ画像が得られる。したがって、注目細胞の見落としを低減できる。なお、マクロレンズ５２の焦点深度は、少なくとも、対物レンズ２４のそれよりも深いことは必須である。

さらに、本実施形態の顕微鏡システム１００は、試料単位の蛍光マクロ画像を高速に撮影できるので、例えば、長時間の培養による細胞の挙動（細胞の数、密度など）を観察したい場合など、高い解像度の画像データを必要としない目的において有効である。

以上は、観察対象が一つ一つの細胞である場合を想定した動作の説明である。

観察対象が生体組織片である場合の動作は以下の通りである。
蛍光マクロ画像に広い範囲を占める生体組織片などの蛍光像が含まれている場合、システムコントロールＰＣ６０において、ＣＰＵは、例えば、図８に示すように、蛍光マクロ画像において生体組織片が存在する範囲を検出し、その範囲の位置情報をメモリやデータ記憶装置に保存する（ステップＳ３０４）。

続いて、システムコントロールＰＣ６０において、ＣＰＵあるいは観察者は、生体組織片の像の中で注目部位を選定する（ステップＳ３０５）。ＣＰＵは、選定された注目部位の位置情報をもとに、注目部位が対物レンズ２４の視野２４ｂに入るようにステージ２５を移動させるための指令を顕微鏡コントローラ６４に出力する（ステップＳ３０６）。

なお、上記の動作の前後の動作は、図５のフローチャートのステップＳ２０１、ステップＳ２０２、ステップＳ２０３、ステップＳ２０７、ステップＳ２０８と同じであるため、重複する説明は省略する。

＜変形例１＞
次に、マクロ撮像部５０の蛍光励起用照明５３の変形例を説明する。

図９は、第１の変形例である蛍光励起用照明５３Ａの構成を示す図である。
この蛍光励起用照明５３Ａは、励起光源５３１、集光レンズ５３２、励起フィルター５３３および光導波路５３４を有する。

光導波路５３４は集光レンズ５３２によって集光され、励起フィルター５３３を通過した励起光を一端面より導入し、他端面より導出する。光導波路５３４の他端面はガラスボトムディッシュ１の底板部分１ｂの高さ位置にあたる側面に、例えばコンタクトグリースなどの接合剤５３５により接合される。この蛍光励起用照明５３Ａにより、特に、ガラスボトムディッシュ１の底面１ａに接した状態で存在する細胞７１の蛍光体は、きわめて効果的に励起される。したがって、ガラスボトムディッシュ１を用いて細胞７１を２次元的に培養する環境（図３に示す環境Ａ）に対して有効な蛍光励起用照明と言える。

＜変形例２＞
図１０は、第２の変形例である蛍光励起用照明５３Ｂの構成を示す図である。
この蛍光励起用照明５３Ｂは、マクロ撮影のための励起光を試料ＳＰＬの背面から、つまりガラスボトムディッシュ１の底板面の側から、ステージ２５の開口部２５ａを通して照明するものである。この蛍光励起用照明５３Ｂは、ガラスボトムディッシュ１を用いて細胞７１を３次元的に培養する環境（図４の環境Ｂ）において好適である。

なお、本技術は以下のような構成もとることができる。
（１） 蛍光物質により染色された生体試料の前記蛍光物質を発光させる第１の励起光を発する光源と、
前記生体試料に前記第１の励起光を集光させる対物レンズと、
前記対物レンズによって集光させた前記第１の励起光が前記生体試料を走査するように前記光源からの前記第１の励起光の向きを変更する走査機構と、
前記生体試料に前記第１の励起光を集光させることによって前記生体試料から発生した第１の蛍光を導入し、電気信号に変換する光検出器と、
前記生体試料に第２の励起光を照射し、前記生体試料から発生した第２の蛍光をマクロ撮像するマクロ撮像部と
を具備する顕微鏡システム。

（２）前記（１）に記載の顕微鏡システムであって、
前記生体試料が、培養細胞とこの培養細胞を収容した容器とを有し、
前記マクロ撮像された画像から１以上の前記培養細胞の位置を算出し、
前記１以上の培養細胞のなかから前記対物レンズを用いた観察対象として選定された培養細胞が、前記対物レンズを用いた観察時に前記対物レンズの視野に入るように前記生体試料と前記対物レンズとの相対的な位置関係を制御する制御部
をさらに具備する顕微鏡システム。

（３）前記（１）から（２）のうちいずれか１つに記載の顕微鏡システムであって、
前記制御部は、前記マクロ撮像された画像をディストーション補正し、このディストーション補正がされた画像から１以上の前記培養細胞の位置を算出する
顕微鏡システム。

（４）前記（１）から（３）のうちいずれか１つに記載の顕微鏡システムであって、
前記マクロ撮像部は、前記生体試料の全体の蛍光画像を撮像する
顕微鏡システム。

（５）前記（１）から（４）のうちいずれか１つに記載の顕微鏡システムであって、
前記マクロ撮像部は、撮像素子と、この撮像素子に前記生体試料の全体の蛍光画像を結像するマクロレンズとを有し、
前記マクロレンズは、少なくとも前記対物レンズの焦点深度よりも深い焦点深度を有する前記マクロレンズの焦点深度が、少なくとも前記対物レンズの焦点深度よりも深い
顕微鏡システム。

（６）前記（１）から（５）のうちいずれか１つに記載の顕微鏡システムであって、
前記生体試料が、生体組織片とこの生体組織片を収容した容器とを有し、
前記マクロ撮像された画像から１以上の前記生体組織片の位置を算出し、
前記１以上の生体組織片において前記対物レンズを用いた観察対象として選定された注目部位が、前記対物レンズを用いた観察時に前記対物レンズの視野に入るように前記生体試料と前記対物レンズとの相対的な位置関係を制御する制御部
をさらに具備する顕微鏡システム。

１０…レーザー光源
１１…コリメートレンズ
２１…第１のダイクロイックミラー
２２…ガルバノミラー
２３…第２のダイクロイックミラー
２４…対物レンズ
２５…ステージ
３０…１光子励起撮像部
３１…第１の集光レンズ
３２…ピンホール
３３…第１の光検出器
３４…ステージ駆動部
４０…２光子励起撮像部
４１…第２の集光レンズ
４２…第２の光検出器
５０…マクロ撮像部
５１…撮像素子
５２…マクロレンズ
５３…蛍光励起用照明
５４…蛍光フィルター
６０…システムコントロールＰＣ
６２…スキャナーコントローラ
６４…顕微鏡コントローラ
５３１…励起光源
５３２…集光レンズ
５３３…励起フィルター
ＳＰＬ…試料

Claims (7)

1. 蛍光物質により染色された生体試料の前記蛍光物質を発光させる第１の励起光を発する光源と、
   前記生体試料に前記第１の励起光を集光させる対物レンズと、
   前記対物レンズによって集光させた前記第１の励起光が前記生体試料を走査するように前記光源からの前記第１の励起光の向きを変更する走査機構と、
   前記生体試料に前記第１の励起光を集光させることによって前記生体試料から発生した第１の蛍光を導入し、電気信号に変換する光検出器と、
   前記生体試料に第２の励起光を照射し、前記生体試料から発生した第２の蛍光をマクロ撮像するマクロ撮像部と
   を具備する顕微鏡システム。
2. 請求項１に記載の顕微鏡システムであって、
   前記生体試料が、培養細胞とこの培養細胞を収容した容器とを有し、
   前記マクロ撮像された画像から１以上の前記培養細胞の位置を算出し、
   前記１以上の培養細胞のなかから前記対物レンズを用いた観察対象として選定された培養細胞が、前記対物レンズを用いた観察時に前記対物レンズの視野に入るように前記生体試料と前記対物レンズとの相対的な位置関係を制御する制御部
   をさらに具備する顕微鏡システム。
3. 請求項２に記載の顕微鏡システムであって、
   前記制御部は、前記マクロ撮像された画像をディストーション補正し、このディストーション補正がされた画像から１以上の前記培養細胞の位置を算出する
   顕微鏡システム。
4. 請求項１に記載の顕微鏡システムであって、
   前記マクロ撮像部は、前記生体試料の全体の蛍光画像を撮像する
   顕微鏡システム。
5. 請求項４に記載の顕微鏡システムであって、
   前記マクロ撮像部は、撮像素子と、この撮像素子に前記生体試料の全体の蛍光画像を結像するマクロレンズとを有し、
   前記マクロレンズは、少なくとも前記対物レンズの焦点深度よりも深い焦点深度を有する前記マクロレンズの焦点深度が、少なくとも前記対物レンズの焦点深度よりも深い
   顕微鏡システム。
6. 請求項１に記載の顕微鏡システムであって、
   前記生体試料が、生体組織片とこの生体組織片を収容した容器とを有し、
   前記マクロ撮像された画像から１以上の前記生体組織片の位置を算出し、
   前記１以上の生体組織片において前記対物レンズを用いた観察対象として選定された注目部位が、前記対物レンズを用いた観察時に前記対物レンズの視野に入るように前記生体試料と前記対物レンズとの相対的な位置関係を制御する制御部
   をさらに具備する顕微鏡システム。
7. 蛍光物質により染色された生体試料の蛍光像を観察するレーザー顕微鏡に、前記生体試料の蛍光マクロ画像を撮像するマクロ撮像部を設け、
   前記マクロ撮像部にてマクロ撮像された画像から１以上の前記培養細胞の位置を算出し、
   前記１以上の培養細胞のなかから前記対物レンズを用いた観察対象として選定された培養細胞が、前記対物レンズを用いた観察時に前記対物レンズの視野に入るように前記生体試料と前記対物レンズとの相対的な位置関係を制御する
   顕微鏡システムの制御方法。

Images