JP2015123031A - 関節リウマチ患者に対する抗ｉｌ−６受容体抗体治療の有効性予測方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】関節リウマチ患者における抗ＩＬ−６受容体抗体治療の有効性を、該治療を適用する以前に予測するためのバイオマーカーを提供し、該バイオマーカーを使用して、関節リウマチ患者における抗ＩＬ−６受容体抗体治療の有効性を予測する方法を提供すること。【解決手段】関節リウマチに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測するための方法であって、関節リウマチ患者から単離された末梢血単核球試料において、ＭＴ１Ｇ、ＩＦＩ６、ＭＸ２、およびＯＡＳＬからなる薬効マーカー遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること、並びに測定した薬効マーカー遺伝子の発現レベルと、関節リウマチに対する抗ヒトＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性とを相関付けることを含む方法、並びに該方法に使用する診断薬および診断用キットを提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、関節リウマチ患者に対する抗ＩＬ−６受容体抗体治療の有効性予測方法に関する。詳しくは本発明は、４つの遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること、並びに当該測定した遺伝子の発現レベルと、関節リウマチに対する抗ヒトＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性とを相関付けることを含む、関節リウマチ患者に対する抗ＩＬ−６受容体抗体治療の有効性予測方法に関する。
関節リウマチ（以下、ＲＡと略称することがある）は全身性の慢性炎症性疾患であり、関節の腫脹、関節の疼痛、滑膜関節の破壊を特徴とし、障害や早期死亡をもたらす（非特許文献１、２）。ＲＡ患者数は日本全国で約７０万人と推定され、さらに毎年１．５万人が新規に発病している。
ＲＡの病因には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、およびマクロファージなどの免疫細胞やこれら細胞から産生される腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）などの炎症性サイトカインが本質的役割を果たしていることが、それらの証拠の蓄積により証明されてきた（非特許文献３−５）。
近年、これら炎症性サイトカインや細胞間相互作用を標的に多くの生物学的製剤が開発され、その使用により、ＲＡの臨床的、構造的、および機能的な転帰が実質的に改善されている（非特許文献２、４、６）。さらに、ＲＡにおける非可逆的な関節破壊は従来予測されていたより早期から始まることが明らかになり、既存の疾患修飾抗リウマチ薬（Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ Ａｎｔｉ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｒｕｇｓ：ＤＭＡＲＤｓ）より高い関節破壊抑制作用を示す生物学的製剤を早期から積極的に使用することが推奨されている。しかしながら、ＲＡの病因を成す分子・細胞メカニズムが不均一であることを反映して、生物学的製剤治療は全ての患者に普遍的に有効なものではない（非特許文献４、５）。
生物学的製剤は、一方で、薬剤費が高く、無効例も一定の割合で存在し、肺炎や結核などの感染症などの重篤な副作用も比較的高頻度に認められる（非特許文献７）。したがって、この様なリスクを考慮すると、生物学的製剤は、該製剤の有効性を見込める患者に限定して適用すべきであろう。各生物学的製剤の有効性を予測するバイオマーカーの確立とそれを利用したテーラーメイド医療の達成が、非可逆的な関節破壊を最小限にするとともに、無駄な薬剤の使用を抑え、医療経済にも大きく寄与すると期待される。
これまでに、生物学的製剤の効果予測法の開発を目的として、患者背景、臨床所見、血清所見、あるいは遺伝子多型解析を用いた研究が多数行われてきたが、いずれも一致した結果が得られず、実用化されていない。例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニスト治療に対する反応性に関して臨床情報および検査情報の予測値を評価した研究では、一貫性のある結果も臨床応用が可能な方法も得ることはできなかった。また、ＴＮＦアンタゴニスト治療に対する反応性を予測するマーカーとして、いくつかの遺伝的素因が見込みがあると認められた。しかし、最も有望な候補と考えられていた２つの遺伝子マーカーであるＴＮＦ−３０８多型（非特許文献８）または共有エピトープモチーフ（非特許文献９）は、ＴＮＦアンタゴニスト治療に対する反応性との間に何ら関連がないことが、メタ解析および大規模レジストリーからのデータにより示された。これら従来の研究結果は、生物学的製剤治療に対する治療応答を臨床情報および遺伝子マーカーにより正確に予測できないことを示唆する。
近年、ＤＮＡマイクロアレイ解析により末梢血全血の網羅的遺伝子発現を解析することにより効果予測バイオマーカーを同定する手法が注目されている。ＤＮＡマイクロアレイ解析では、標的の細胞や組織における複数遺伝子のｍＲＮＡ発現の評価が可能である。従前の研究では、マイクロアレイ技術を使用して同定された一組の遺伝子のｍＲＮＡ発現解析により、ＲＡにおけるインフリキシマブ（非特許文献１０−１３、特許文献１）またはリツキシマブ（非特許文献１４）に対する治療反応性を予測したことが示されている。抗ヒトＴＮＦ−αモノクローナル抗体製剤であるインフリキシマブについては、その投与１４週後の治療の効果を、マイクロアレイによる遺伝子発現解析を用いて予測する診断支援サービスが自由診療として開始されている。このように、ＤＮＡマイクロアレイは、ある抗リウマチ治療に対するＲＡ患者の臨床応答を予測するバイオマーカーとなる遺伝子を同定するために見込みのある手段である。
ＲＡ治療に生物学的製剤として使用されているトシリズマブ（ＴＣＺ）は、ヒト化抗インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）モノクローナル抗体であり、ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒへの結合を遮断することによりＩＬ−６シグナル伝達を阻害する。ＴＣＺ治療に対するＲＡ患者の全体的な奏功率は高い（非特許文献７、１５−１６）が、関節腫脹などの臨床的兆候の改善効果の発現は、ＴＮＦアンタゴニストで治療した患者と比較するとより遅い。また、ＴＣＺは、発熱を抑制したり、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）などの炎症マーカーの発現を強く抑制するため、肺炎などの重篤な感染症に罹患しても、それに伴う生体変化をマスクしてしまい、感染症の発見が遅れ、重篤化する場合がある。したがって、ＴＣＺで治療した患者で有効性がないことを確認するには何ヶ月もかかり、損傷の進行や副作用に関する不必要なリスク、および不要な費用が患者に生じる可能性がある。このように、ＴＣＺ治療に対する反応性を予測することはＲＡ患者にとって特に有益であり、そのような方法の開発が期待されている。
抗ＩＬ−６受容体阻害抗体であるＴＣＺの治療効果を予測するのに有用なバイオマーカーとして、１９６のマーカー遺伝子を抽出したことが報告されている（特許文献２）。また、抗ヒトＩＬ−６受容体阻害抗体による治療の有効性を予測するための方法であって、対象関節リウマチ患者から単離された末梢血単核球における、８７の薬効マーカー遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することを含む方法が報告されている（特許文献３）。
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従前、ＲＡ患者におけるインフリキシマブまたはリツキシマブへの臨床応答を予測するために、マーカーとなる遺伝子の抽出を、末梢血全血を試料としてＤＮＡマイクロアレイ解析により実施したことが報告されている（非特許文献１０−１４、特許文献１）。しかしながら、自己免疫疾患である関節リウマチのバイオマーカー検索では、リンパ球および単球系細胞、例えば単球やマクロファージなどにおける遺伝子発現が重要であり、全血中に存在する顆粒球が遺伝子発現解析の妨げとなっている可能性がある。
また、抗ＩＬ−６受容体阻害抗体であるＴＣＺの治療効果を予測するのに有用なバイオマーカーとして１９６遺伝子が報告されている（特許文献２）。これら遺伝子の抽出の指標として用いた治療効果判定基準には、血液中の炎症反応に対する治療効果が含まれている。一方、ＴＣＺ投与患者では治療効果の有無に関わらず高率に炎症反応が著明に低下するため、これら１９６遺伝子の中には、ＴＣＺの治療効果を予測するバイオマーカーとして有用でない遺伝子が含まれている可能性がある。
さらに、抗ヒトＩＬ−６受容体阻害抗体による治療の有効性を予測するための方法であって、ＲＡ患者から単離された末梢血単核球における、８７の遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することを含む方法が報告されている（特許文献３）。しかし、これら遺伝子と比較してマーカーとしてより好ましい遺伝子を見出すことにより、より高い感度で抗ＩＬ−６受容体抗体治療の有効性を予測することができる。
本発明の課題は、従来報告されている方法より高い感度で、ＲＡ患者における抗ＩＬ−６受容体抗体治療の有効性を、該治療を開始する前に予測するためのバイオマーカーを提供し、該バイオマーカーを使用して、ＲＡ患者における抗ＩＬ−６受容体抗体治療の有効性を予測する方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行う中で、ＲＡ患者の末梢血単核球の遺伝子発現をＤＮＡマイクロアレイ解析により測定し、ＴＣＺ治療に対する反応例（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）と無反応例（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）との間で遺伝子発現に著しい差異のある４遺伝子を見出した。さらに、これら４遺伝子について、ＴＣＺ治療に対する臨床反応の予測を受信者動作特性（ＲＯＣ）解析により行い、これら遺伝子を用いることによりＴＣＺ治療に対する中等度から良好な反応を予測できることを見出し、本発明を完成した。ここで、反応例とはＴＣＺ治療により有効以上の効果を示した症例であり、無反応例とはＴＣＺ治療により無効または増悪した症例を意味する。
すなわち、本発明は、関節リウマチに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測するための方法であって、（１）関節リウマチ患者から単離された末梢血単核球試料において、ＭＴ１Ｇ、ＩＦＩ６、ＭＸ２、およびＯＡＳＬの薬効マーカー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること、並びに（２）前記（１）において測定した遺伝子の発現レベルと、関節リウマチに対する抗ヒトＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性とを相関付けることを含む、方法に関する。
また本発明は、前記（２）における、測定した遺伝子の発現レベルと関節リウマチに対する抗ヒトＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性とを相関付けることが、測定した遺伝子の発現レベルと該遺伝子の発現レベルのカットオフ値との比較により行われる、前記方法に関する。
さらに本発明は、前記抗ＩＬ−６受容体抗体がトシリズマブである、前記いずれかの方法に関する。
さらにまた本発明は、ＭＴ１Ｇ、ＩＦＩ６、ＭＸ２、およびＯＡＳＬの薬効マーカー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の転写産物またはその相補的核酸を特異的に検出し得る核酸プローブ若しくは核酸プライマー、または、当該薬効マーカー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体を含む、関節リウマチに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測するための診断薬に関する。
また本発明は、前記抗ＩＬ−６受容体抗体がトシリズマブである、前記診断薬に関する。
さらに本発明は、前記いずれかの診断薬に加え、前記核酸プローブ若しくは核酸プライマー、または前記抗体を検出するための試薬をさらに含む、関節リウマチに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測するための診断用試薬キットに関する。
さらにまた本発明は、下記プライマーセットから選択される少なくとも１のプライマーセットを含む、関節リウマチに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測するための診断用試薬キットに関する：
（ｉ）配列番号３１に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号３２に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット、
（ｉｉ）配列番号２５に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号２６に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット、
（ｉｉｉ）配列番号３７に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号３８に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット、並びに
（ｉｖ）配列番号３９に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号４０に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット。
（ｉ）配列番号３１に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号３２に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット、
（ｉｉ）配列番号２５に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号２６に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット、
（ｉｉｉ）配列番号３７に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号３８に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット、並びに
（ｉｖ）配列番号３９に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号４０に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット。
本発明に係る方法を用いれば、従来報告されている方法より高い感度で、ＲＡ患者における抗ＩＬ−６受容体抗体治療の有効性を予測することができ、そのため、該治療の有効性を予め確認した上で該治療を実施することができる。その結果、例えば、当該治療の有効性が見込める患者に対して該治療を適用し、有効性が見込めない患者に対しては治療方針を変更するなど、治療方針の選択判断が可能になる。したがって、本発明に係る方法は、抗ＩＬ−６受容体抗体治療の有効性が見込めない患者にとって、該治療を受けることによる損傷の進行や副作用に関する不必要なリスクを避けることができると共に、不要な費用の発生を防止することができる。さらに、無駄な薬剤の使用を抑え、医療経済にも大きく寄与すると期待される。
本発明は、関節リウマチに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測するための方法に関する。本発明に係る方法は、（１）関節リウマチ患者から単離された末梢血単核球試料において、後述する４つの薬効マーカー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること、並びに（２）前記（１）において測定した遺伝子の発現レベルと、関節リウマチに対する抗ヒトＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性とを相関付けることを含む。
抗ＩＬ−６受容体抗体は、好ましくは抗ＩＬ−６受容体阻害抗体である。抗ＩＬ−６受容体阻害抗体とは、ＩＬ−６受容体の細胞外ドメインに特異的に結合し、ＩＬ−６の当該受容体への結合を阻止することにより、ＩＬ−６刺激による当該受容体を介した生体反応を阻害する抗体をいう。
本明細書において、抗体の抗原への「特異的な結合」とは、抗原抗体反応における、抗体の抗原に対する親和性が、抗原以外の抗原に対する親和性よりも強いことを意味する。
抗ＩＬ−６受容体阻害抗体は、より好ましくは抗ヒトＩＬ−６受容体阻害抗体である。抗ヒトＩＬ−６受容体阻害抗体とは、ヒト−６受容体の細胞外ドメインに特異的に結合し、ＩＬ−６の当該受容体への結合を阻止することにより、ＩＬ−６刺激による当該受容体を介した生体反応を阻害する抗体をいう。
ヒトＩＬ−６受容体は公知の受容体であり、そのアミノ酸配列も公知である。ヒトＩＬ−６受容体の代表的なアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号にＮＰ＿０００５５６．１として登録されている。ヒトＩＬ−６は公知のサイトカインであり、そのアミノ酸配列も公知である。ヒトＩＬ−６の代表的なアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号にＮＰ＿０００５９１．１として登録されている。
本明細書において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体などの天然型抗体、および遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体や一本鎖抗体などが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥなどのいずれのアイソタイプの抗体をも包含する。
抗ＩＬ−６受容体抗体は、最も好ましくはトシリズマブである。トシリズマブは、マウスで作成された抗ヒトＩＬ−６受容体モノクローナル抗体をもとに、遺伝子組換え技術により産生されたヒト化モノクローナル抗体である。
本発明に係る方法の適用対象となるＲＡ患者は、ヒトＲＡ患者である。ＲＡの診断は、１９８７年米国リウマチ学会（ＡＣＲ）分類基準（非特許文献１７）、および２０１０年ＡＣＲ／欧州リウマチ学会（ＥＵＬＡＲ）分類基準（非特許文献１８）に基づき実施することができる。本発明に係る方法は、ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ分類基準を満たし、且つ臨床疾患活動性指標（ＣＤＡＩ、非特許文献１９）が１０以上であるＲＡ患者に好ましく適用することができる。
ＲＡに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性とは、当該治療によるＲＡの寛解の程度または有無をいう。ＲＡの寛解の程度または有無は、骨の変形や破壊、関節の腫脹、疼痛、こわばりなどの症状の改善の程度を、ＥＵＬＡＲ改善基準および／またはＣＤＡＩ、好ましくはＣＤＡＩ、に基づき評価することにより判断することができる。好ましくは、治療の有効性は、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の開始から、遅くとも６ヶ月以内にＲＡが部分的または完全に寛解するか否かで判断される。なお、関節の腫脹、疼痛、こわばりなどの症状の改善を伴わず、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）などの炎症性マーカーの低下のみが認められる症例は、ＲＡの寛解例や改善例には含まない。
本明細書において、抗ＩＬ−６受容体抗体治療により有効以上の効果を示した症例を反応例と称し、抗ＩＬ−６受容体抗体治療により無効または増悪した症例を無反応例と称することがある。
本発明に係る方法においては、ＲＡ患者から単離された末梢血単核球における、４つの薬効マーカー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定する。これらの遺伝子のうちの複数、例えば２以上、好ましく３以上、より好ましくは４遺伝子の発現レベルを測定し、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性と相関付けることにより、より高い精度で、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測することが期待できる。
本明細書において、「薬効マーカー遺伝子」とは、患者から単離された細胞などの試料中に検出される遺伝子であって、その発現や消失、および発現の変化などにより、該患者に投与した薬剤の効果を判定することのできる指標となる遺伝子を意味する。
本発明に係る方法で使用される薬効マーカー遺伝子は、ＭＴ１Ｇ、ＩＦＩ６、ＭＸ２、およびＯＡＳＬの４遺伝子である。
ＭＴ１Ｇは、メタロチオネイン（ＭＴｓ）のアイソタイプの１つであるメタロチオネイン−１のサブタイプであるメタロチオネイン−１Ｇをコードする遺伝子である。ＭＴｓは、金属結合ドメインを有し、それにより毒性金属解毒および酸化ストレスに対する防御を含むさまざまな役割に関与している（非特許文献２０−２２）。ＭＴｓの遺伝子発現はＩＬ−６などの炎症性サイトカインにより上方制御され（非特許文献２２−２４）、そしてＭＴｓはその詳細なメカニズムは不明ではあるが免疫反応および炎症反応に関与することが報告されている（非特許文献２２、２５−２８）。ＭＴ１Ｇの代表的なヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＢＣ０２０７５７．１として登録されている。ＭＴ１Ｇ ｃＤＮＡの代表的なヌクレオチド配列および該ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号１および２に記載する。
ＩＦＩ６は、インターフェロンα−誘導性タンパク質６をコードする遺伝子である。ＩＦＩ６の代表的なヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０１１６０１．２およびＢＣ０１５６０３．２として登録されている。これらアクセッション番号で登録されているＩＦＩ６ ｃＤＮＡの代表的なヌクレオチド配列を配列表の配列番号３および５に記載する。また、これらヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４および６に記載する。
ＭＸ２は、ミクソウイルス耐性２をコードする遺伝子である。ＭＸ２の代表的なヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＢＣ０３５２９３．１として登録されている。ＭＸ２ ｃＤＮＡの代表的なヌクレオチド配列および該ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号７および８に記載する。
ＯＡＳＬは２´−５´−オリゴアデニレートシンテターゼ様遺伝子である。ＯＡＳＬの代表的なヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ１１７４０８．１およびＢＣ１１７４１０．１として登録されている。これらアクセッション番号で登録されているヌクレオチド配列は同一であり、その配列を配列表の配列番号９に記載する。また、このヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号１０に記載する。
ＩＦＩ６、ＭＸ２、およびＯＡＳＬはＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答遺伝子（ＩＲＧｓ）であり、これら遺伝子の発現はＩ型ＩＦＮシグナル伝達により誘導される。Ｉ型ＩＦＮｓは、ＩＦＮαｓとＩＦＮβであり、ウイルスに対する内因性免疫応答の媒介にとって不可欠の機能を有し、リンパ球分化、恒常性維持、寛容性、および記憶などのいくつかの免疫学的過程に決定的な役割をもつ（非特許文献２９）。末梢血液試料中のＩ型ＩＦＮ活性またはＩＲＧｓ発現がＲＡ患者で増加しているという報告がなされている（非特許文献３０−３５）。また、血漿中のＩＦＮｓ活性の増加がＴＮＦアンタゴニストにより治療したＲＡ患者の良好な臨床反応の予測となったこと（非特許文献３１）、そしていくつかのＩＲＧｓの発現もまた、良好な反応を示したＲＡ患者で増加したことが認められたことが報告されている（非特許文献３６）。対照的に、末梢血細胞や関節組織中でのＩＲＧｓおよびＩＦＮαの発現レベルの増加が、Ｂ細胞上に発現したＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体であるリツキシマブに対する治療無反応に関連することが報告されている（非特許文献１４、３２、３７）。これらデータは、Ｉ型ＩＦＮシグネチャーが、ある種の生物学的薬剤の恩恵を優先的に受けるだろう患者の特定に使用できるかもしれないが、有効な抗リウマチ薬に対するＲＡ患者の治療反応を普遍的に予測する予知マーカーではないことを示すものである。
本明細書において、上記４つの遺伝子のヌクレオチド配列および該ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列は、本明細書の配列表に例示されたものに限定されず、例示された配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上、の配列同一性を有しており、且つ当該遺伝子または該遺伝子によりコードされるタンパク質の機能が維持されている限りにおいて、いずれの配列であってもよい。
末梢血からの単核球の単離は、従来公知の単離方法を使用して実施することができる。具体的には、ヘパリンやクエン酸などの抗凝固剤で処理した末梢血を、単核球分離用に適切に比重が調整された分離剤、例えばフィコールやリンホプレップ、に積層するか、または該分離剤と混合し、遠心分離操作を行い、単核球を単核球以外の血球成分から分離することにより実施することができる。
「細胞の単離」とは、目的とする細胞以外の細胞を除去する操作がなされていることを意味する。「単離された単核球」における単核球の純度は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは実質的に１００％である。尚、本発明に係る方法において使用する単核球からは、顆粒球ができる限り除かれていることが好ましい。本発明に係る方法において使用する単離された単核球中に混入する顆粒球の頻度は、通常１％以下、好ましくは０．１％以下、より好ましくは０．０１％以下である。最も好ましくは、単離された単核球は、顆粒球の混入を実質的に含まない。
各薬効マーカー遺伝子の発現レベルの測定は、各薬効マーカー遺伝子の転写産物、すなわち、各遺伝子をコードするｍＲＮＡやその相補的核酸であるｃＲＮＡまたはｃＤＮＡ、を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマーを用いて、自体公知の方法により実施することができる。このような測定方法としては、例えば、ｃＤＮＡアレイ、リアルタイム−ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＲＴ−ＰＣＲと略称することがある）、ノザンブロッティング、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの方法を例示できる。
各遺伝子の転写産物やその相補的核酸を特異的に検出し得る核酸プローブとしては、各遺伝子のｃＤＮＡ配列に含まれる、約１５塩基以上、好ましくは約１８〜約５００塩基、より好ましくは約１８〜約２０塩基、さらに好ましくは約１８〜約５０塩基の連続したヌクレオチド配列またはその相補配列を含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
各薬効マーカー遺伝子の転写産物やその相補的核酸を特異的に検出し得る核酸プライマーは、各薬効マーカー遺伝子のｃＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドの一部または全部の領域を特異的に増幅し得るように設計されたものであればいかなるものであってもよい。例えば、各薬効マーカー遺伝子のｃＤＮＡ配列の相補配列の一部にハイブリダイズする、約１５〜約５０塩基、好ましくは約１８〜約３０塩基のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、このハイブリダイゼーション部位より３´末端側の当該ｃＤＮＡ配列の一部にハイブリダイズする、約１５〜約５０塩基、好ましくは約１８〜約３０塩基のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとの組み合わせであり、それらによって増幅される核酸の断片長が約５０〜約１，０００塩基、好ましくは約５０〜約５００塩基、より好ましくは約５０〜約２００塩基である、一組のポリヌクレオチドが挙げられる。
核酸プローブおよび核酸プライマーは、特異的検出に支障を生じない範囲で付加的配列、すなわち検出対象のポリヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド配列、を含んでいてもよい。
また、核酸プローブおよび核酸プライマーは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなどで標識されていてもよい。好ましい放射性同位元素として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓなどを例示できる。好ましい酵素として、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などを例示できる。好ましい蛍光物質として、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどを例示できる。好ましい発光物質として、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどを例示できる。あるいは、ＦＡＭ商標やＶＩＣ登録商標などのレポーター蛍光色素の近傍に該蛍光色素の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光色素とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
核酸プローブおよび核酸プライマーは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、また、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖の場合は二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのいずれであってもよい。したがって、本明細書においてあるヌクレオチド配列を有する核酸について記載する場合、該記載は、特に断らない限り、該ヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、該ヌクレオチド配列と相補的な配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、それらのハイブリッドである二本鎖ポリヌクレオチドをすべて包含する意味で用いられている。
上記核酸プローブおよび核酸プライマーは、例えば、本明細書に記載されたヌクレオチド配列の情報に基づいて、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。
また、各薬効マーカー遺伝子の発現レベルの測定は、各薬効マーカー遺伝子の翻訳産物、すなわちタンパク質、に特異的に結合する抗体を用いて、免疫学的手法により、該翻訳産物量を定量することにより実施できる。免疫学的手法としては、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ法）、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色などを例示できる。所望の抗体は、各薬効マーカー遺伝子の翻訳産物であるタンパク質、または該タンパク質の抗原性を有する部分ペプチドを免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。あるいは、市販されている所望の抗体を使用することもできる。
各薬効マーカー遺伝子の発現レベルの測定において使用される核酸や抗体は、適切な支持体の上に結合させて核酸アレイや抗体アレイとして提供されたものであってもよい。支持体としては、ポリヌクレオチドを固定できるものであれば特に限定されるものではなく、どのような形状や材質であっても良い。具体的には、ガラス、シリコンウエハウ、ビーズ、樹脂、金属などの無機素材の支持体、またニトロセルロースなどの天然高分子材料やナイロンなどの合成高分子材料の支持体を例示できる。
ＭＴ１Ｇの発現レベルの測定に好ましく使用される核酸プライマーとして、配列番号３１に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号３２に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセットを例示できる。
ＩＦＩ６の発現レベルの測定に好ましく使用される核酸プライマーとして、配列番号２５に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号２６に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセットを例示できる。
ＭＸ２の発現レベルの測定に好ましく使用される核酸プライマーとして、配列番号３７に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号３８に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセットを例示できる。
ＯＡＳＬの発現レベルの測定に好ましく使用される核酸プライマーとして、配列番号３９に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号４０に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセットを例示できる。
各薬効マーカー遺伝子の発現レベルを測定した後に、測定した薬効マーカー遺伝子の発現レベルと、ＲＡに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性とを相関付ける。例えば、測定した薬効マーカー遺伝子の発現レベルを、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が有効であったＲＡ患者の当該治療開始前の末梢血単核球における当該薬効マーカー遺伝子の発現レベル、および抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が無効であったＲＡ患者の当該治療開始前の末梢血単核球における当該薬効マーカー遺伝子の発現レベルと比較する。あるいは、測定した薬効マーカー遺伝子の発現レベルを、あらかじめ求めておいた評価基準と比較してもよい。かかる評価基準として、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が有効であったＲＡ患者の当該治療開始前の末梢血単核球における当該薬効マーカー遺伝子の発現レベルの平均値を例示できる。また、別の評価基準として、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が無効であったＲＡ患者の当該治療開始前の末梢血単核球における当該薬効マーカー遺伝子の発現レベルの平均値を例示できる。あるいは、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が有効／無効であった多数のＲＡ患者の当該治療開始前の末梢血単核球における当該薬効マーカー遺伝子の発現レベルの分布図などと比較することにより、測定した薬効マーカー遺伝子の発現レベルと、ＲＡに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性とを相関付けることができる。遺伝子発現レベルの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
後述する実施例に示すように、抗ヒトＩＬ−６受容体阻害抗体による治療が有効なＲＡ患者においては、本発明に係る４つの薬効マーカー遺伝子、ＭＴ１Ｇ、ＩＦＩ６、ＭＸ２、およびＯＡＳＬの末梢血単核球における発現レベルが、当該治療が無効なＲＡ患者と比較して高かった。したがって、末梢血単核球におけるこれら薬効マーカー遺伝子の発現レベルと、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性との間の正の相関に基づき、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測することができる。例えば、末梢血単核球において、これら薬効マーカー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの薬効マーカー遺伝子の発現レベルが相対的に高いと評価された場合には、当該ＲＡ患者は抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が有効である可能性が高いと判定することができる。さらに、これらの遺伝子のうちの複数、例えば２以上、好ましく３以上、より好ましくは４遺伝子、の発現レベルが相対的に高いと評価された場合には、より高い精度で、当該ＲＡは抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が有効である可能性が高いと判定することができる。
また、末梢血単核球中の各薬効マーカー遺伝子の発現レベルのカットオフ値をあらかじめ設定しておき、ＲＡ患者の末梢血単核球中の測定した各薬効マーカー遺伝子の発現レベルとこのカットオフ値とを比較してもよい。例えば、本発明に係る４つの薬効マーカー遺伝子、ＭＴ１Ｇ、ＩＦＩ６、ＭＸ２、およびＯＡＳＬの末梢血単核球における発現レベルが、前記カットオフ値以上である場合には、当該ＲＡ患者は抗ヒトＩＬ−６受容体阻害性抗体による治療が有効である可能性が高いと判定することができる。
「カットオフ値」とは、閾値ともいい、その値を基準として治療の有効性の判定をした場合に、高い診断感度および高い診断特異度の両方を満足できる値をいう。ここで、感度とは、真の陽性率を意味する。また、特異度とは真の陰性率を意味する。例えば、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が有効であるＲＡ患者で高い陽性率を示し、かつ、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が無効であるＲＡ患者で高い陰性率を示す、末梢血単核球中の薬効マーカー遺伝子の発現レベルをカットオフ値として設定することができる。
カットオフ値の設定は、自体公知の方法により実施できる。例えば、診断検査の有用性を検討する手法として一般的に用いられているＲＯＣ解析（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）により、カットオフ値の設定を行うことができる。ＲＯＣ解析では、閾値を変化させていった場合に、それぞれの閾値における感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を縦軸に、ＦＰＦ（Ｆａｌｓｅ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ、偽陽性率：１−特異度（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ））を横軸にプロットしたＲＯＣ曲線が作成される。ＲＯＣ曲線では、全く診断能のない検査は、対角線上の直線となるが、診断能が向上するほど、対角線が左上方に弧を描くような曲線となり、診断能１００％の検査は、左辺−上辺上を通る曲線となる。カットオフ値の設定としては、例えば、感度と特異度の優れた独立変数のＲＯＣ曲線は、左上隅に近づいていくという事実から、この左上隅との距離が最小となる点をカットオフ値にする方法がある。また、ＲＯＣ曲線における曲線下面積（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣと略称される）が０．５００となる斜点線から最も離れたポイントをカットオフ値にする方法、つまり、（感度＋特異度−１）を計算して、その最大値となるポイントであるヨーデン指標（Ｙｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘ）をカットオフ値に設定することもできる。
具体的には、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が有効であったＲＡ患者、すなわち反応例、および抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が無効であったＲＡ患者、すなわち無反応例の、当該治療開始前に採取した末梢血単核球中の各薬効マーカー遺伝子の発現レベルを測定し、測定された値における診断感度および診断特異度を求め、これらの値に基づき、市販の解析ソフトを使用してＲＯＣ曲線を作成する。そして、診断感度と診断特異度が可能な限り１００％に近いときの値を求めて、その値をカットオフ値とすることができる。また、例えば、検出された値における診断効率、すなわち治療が有効であった患者を「有効」と正しく診断した症例と、治療が無効であった患者を「無効」と正しく診断した症例との合計数の全症例数に対する割合、を求め、最も高い診断効率が算出される値をカットオフ値とすることができる。
本発明はまた、ＭＴ１Ｇ、ＩＦＩ６、ＭＸ２、およびＯＡＳＬからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の転写産物若しくはその相補的核酸を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー、あるいはこれら遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物に特異的に結合し得る抗体を含む、ＲＡに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測するための診断薬に関する。本発明に係る診断薬は、上記本発明に係る方法に使用される。
測定対象の各薬効マーカー遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体や、各薬効マーカー遺伝子の転写産物やその相補的核酸を特異的に検出し得る核酸プローブは、適切な支持体の上に結合して、核酸アレイや、抗体アレイとして提供してもよい。支持体としては、当該分野で通常用いられている支持体であれば特に限定されず、例えば、ナイロン膜などのメンブレン、ビーズ、ガラス、プラスチック、および金属などを挙げることができる。
本発明に係る診断薬は、単核球分離用に適切に比重が調整された分離剤、例えばフィコールやリンホプレップ、をさらに含んでいてもよい。
本発明に係る診断薬に含まれる各構成要素は、各々別個に、あるいは可能であれば混合した状態で、水若しくは適当な緩衝液、例えばＴＥバッファーやリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、中に適当な濃度となるように溶解されるか、または凍結乾燥された状態で、適切な容器中に収容される。
本発明に係る診断薬は、薬効マーカー遺伝子の発現レベルの測定方法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分や試薬をさらに含む診断用試薬キットとして提供することができる。例えば、本発明に係る診断薬が、薬効マーカー遺伝子の転写産物またはその相補的核酸を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマーを含むものであれば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティング、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡアレイなどにより薬効マーカー遺伝子の発現レベルを測定することにより、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測することができる。ＲＴ−ＰＣＲを測定に用いる場合には、本発明に係る診断薬は、ＰＣＲ反応緩衝液、反応に必要な各種塩溶液、ｄＮＴＰｓ水溶液、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素などをさらに含む試薬キットとして提供することができる。ノザンブロッティングや核酸アレイを測定に用いる場合には、本発明に係る診断薬は、ブロッティング緩衝液、標識化試薬、ブロッティング膜などをさらに含むことができる。ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを測定に用いる場合には、本発明に係る診断薬は、標識化試薬、発色基質などをさらに含むことができる。
本発明に係る診断薬が、薬効マーカー遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体を含むものであれば、免疫学的手法により薬効マーカー遺伝子の発現レベルを測定することにより、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測することができる。この場合、本発明に係る診断薬は、標識二次抗体、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液、ＥＬＩＳＡプレート、ブロッティング膜などをさらに含む診断用試薬キットとして提供することができる。
以下、実施例にて、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されない。また、本発明に係る技術的思想を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
ＲＡ患者におけるトシリズマブ（以下、ＴＣＺと略称する）治療への反応性を予測するためのバイオマーカーを、末梢血単核球（以下、ＰＢＭＣｓと略称することがある）における網羅的遺伝子発現解析により同定することを試みた。
具体的には、ＴＣＺ治療を初めて受けるＲＡ患者の末梢血単核球を試料として用い、網羅的遺伝子発現解析を次のよう行った。
１．患者および健常人
２０１０年ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ ＲＡ分類基準（非特許文献１８）を満たし、且つＣＤＡＩ（非特許文献１９）が１０以上であるＲＡ患者であって、ＴＣＺ治療を初めて受ける患者を継続的に募った。４０症例のＲＡ患者を候補遺伝子の同定のためのトレーニングコホートとし、一方、別の２０症例のＲＡ患者をそれら遺伝子の予測値を確認するためのバリデーションコホートとして採用した。患者は、日常的臨床ケアを受け、そして、治療開始前（以下、ベースライン時と称する）、並びにＴＣＺ治療の開始後３ヶ月目および６ヶ月目に臨床的および検査的な評価を受けた。関節炎症状のない健常人を対照として採用した。研究デザインは千葉大学倫理委員会により承認されたものであり、ヘルシンキ宣言に則って解析対象者から書面による同意書を得ている。
２０１０年ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ ＲＡ分類基準（非特許文献１８）を満たし、且つＣＤＡＩ（非特許文献１９）が１０以上であるＲＡ患者であって、ＴＣＺ治療を初めて受ける患者を継続的に募った。４０症例のＲＡ患者を候補遺伝子の同定のためのトレーニングコホートとし、一方、別の２０症例のＲＡ患者をそれら遺伝子の予測値を確認するためのバリデーションコホートとして採用した。患者は、日常的臨床ケアを受け、そして、治療開始前（以下、ベースライン時と称する）、並びにＴＣＺ治療の開始後３ヶ月目および６ヶ月目に臨床的および検査的な評価を受けた。関節炎症状のない健常人を対照として採用した。研究デザインは千葉大学倫理委員会により承認されたものであり、ヘルシンキ宣言に則って解析対象者から書面による同意書を得ている。
２．臨床的および検査的な評価
臨床的および検査的な評価は、２８関節の腫脹関節数および疼痛関節数、医師および患者の総合的評価のための視覚的評価スケール（ＶＡＳ）、健康度評価質問票障害指数（ＨＡＱ−ＤＩ）、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、およびＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）について行った。リウマトイド因子（ＲＦ）および抗環状シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＰＡ）は、ベースライン時にのみ検討した。
臨床的および検査的な評価は、２８関節の腫脹関節数および疼痛関節数、医師および患者の総合的評価のための視覚的評価スケール（ＶＡＳ）、健康度評価質問票障害指数（ＨＡＱ−ＤＩ）、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、およびＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）について行った。リウマトイド因子（ＲＦ）および抗環状シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＰＡ）は、ベースライン時にのみ検討した。
３．ＴＣＺ治療に対する反応の評価
ＴＣＺによるＩＬ−６遮断療法は、治療反応に関わらず、ＥＳＲや血清ＣＲＰなどの急性炎症マーカーを実質的に低減するため、ＡＣＲ反応判定基準やＥＵＬＡＲ反応判定基準などのこれらマーカーを含む反応判定基準は本研究では採用しなかった。その代わりに、ＴＣＺ治療に対する臨床反応は、主として医師の６ヶ月目の総合評価（良好／中等度／無反応）により決定した。この評価の決定は、１１名の医師および２名のリウマチ学者の間で、網羅的臨床情報を概観することにより得られた合意によって行った。６ヶ月目のＣＤＡＩカテゴリー（高度／中等度／低度の疾病活動度または緩解）も、医師の総合評価を補足するために使用した。
ＴＣＺによるＩＬ−６遮断療法は、治療反応に関わらず、ＥＳＲや血清ＣＲＰなどの急性炎症マーカーを実質的に低減するため、ＡＣＲ反応判定基準やＥＵＬＡＲ反応判定基準などのこれらマーカーを含む反応判定基準は本研究では採用しなかった。その代わりに、ＴＣＺ治療に対する臨床反応は、主として医師の６ヶ月目の総合評価（良好／中等度／無反応）により決定した。この評価の決定は、１１名の医師および２名のリウマチ学者の間で、網羅的臨床情報を概観することにより得られた合意によって行った。６ヶ月目のＣＤＡＩカテゴリー（高度／中等度／低度の疾病活動度または緩解）も、医師の総合評価を補足するために使用した。
４．ＤＮＡマイクロアレイ解析
ヘパリン採血試料より末梢血中の単核球を分離し、その遺伝子発現をＤＮＡマイクロアレイを用いて網羅的に解析した。ＤＮＡアレイ解析用試料を採取後、速やかにＴＣＺ８ｍｇ／ｋｇ／４週間の加療を開始し、６ヶ月後に医師総合評価により治療効果判定を行った。
ヘパリン採血試料より末梢血中の単核球を分離し、その遺伝子発現をＤＮＡマイクロアレイを用いて網羅的に解析した。ＤＮＡアレイ解析用試料を採取後、速やかにＴＣＺ８ｍｇ／ｋｇ／４週間の加療を開始し、６ヶ月後に医師総合評価により治療効果判定を行った。
具体的には、ＰＢＭＣｓの分離は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＭＩＵＭ １．０７３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して行った。ＰＢＭＣｓの分離は、ベースライン時には、トレーニングコホートおよびバリデーションコホートの両方、並びに健常対照について実施し、また、３ヶ月目にはトレーニングコホートについて実施した。ＰＢＭＣから細胞総ＲＮＡを、ＩＳＯＧＥＮ溶液（Ｎｉｐｐｏｎ ＧＥＮＥ Ｃｏ．，ＬＴＤ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて抽出した。トレーニングコホートおよび健常対照において、ＤＮＡマイクロアレイ解析を、Ｑｕｉｃｋ Ａｍｐ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）およびＷｈｏｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ４×４４Ｋ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して製造説明書に従って実施した。マイクロアレイデータは、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ１１．５．１ソフトウエア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して分析した。シグナル強度は、各データを７５パーセンタイルベースラインに調整することにより正規化した。
５．リアルタイム定量的ＰＣＲ解析
リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応解析（以下、ｑＰＣＲと略称する）を、ベースライン時に、トレーニングコホートおよびバリデーションコホートの両方について実施した。本解析は、ＴＣＺ治療に対する無反応例と反応例との間で、上記ＤＮＡマイクロアレイ解析における発現レベルに有意な差異が認められた１８遺伝子について実施した。プライマーは、表１に記載のプライマーセットを使用した。抽出ＲＮＡの逆転写はｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して行った。発現レベルはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７３００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により標準手順書を使用して測定した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現レベルを内因性コントロールとして用い、データを正規化した。
リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応解析（以下、ｑＰＣＲと略称する）を、ベースライン時に、トレーニングコホートおよびバリデーションコホートの両方について実施した。本解析は、ＴＣＺ治療に対する無反応例と反応例との間で、上記ＤＮＡマイクロアレイ解析における発現レベルに有意な差異が認められた１８遺伝子について実施した。プライマーは、表１に記載のプライマーセットを使用した。抽出ＲＮＡの逆転写はｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して行った。発現レベルはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７３００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により標準手順書を使用して測定した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現レベルを内因性コントロールとして用い、データを正規化した。
６．統計解析
統計解析は、ＳＰＳＳ バージョン２１．０（ＩＢＭ Ｊａｐａｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して実施した。正規分布の連続型データは平均値および標準偏差（ＳＤｓ）を用いてまとめ、パラメトリック検定、具体的には二標本ｔ検定（２つの変数が等しいと考えられないときはウエルチのｔ検定）または対応のあるｔ検定（ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）を使用して解析した。非正規分布データは中央値および四分位数範囲（ＩＱＲｓ）を用いてまとめ、非パラメトリック検定（マン・ホイットニーのＵ検定）を使用して解析した。多変量解析はロジスティック回帰モデルを使用して実施した。０．０５より小さいＰ値を有意差があると看做した。
統計解析は、ＳＰＳＳ バージョン２１．０（ＩＢＭ Ｊａｐａｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して実施した。正規分布の連続型データは平均値および標準偏差（ＳＤｓ）を用いてまとめ、パラメトリック検定、具体的には二標本ｔ検定（２つの変数が等しいと考えられないときはウエルチのｔ検定）または対応のあるｔ検定（ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）を使用して解析した。非正規分布データは中央値および四分位数範囲（ＩＱＲｓ）を用いてまとめ、非パラメトリック検定（マン・ホイットニーのＵ検定）を使用して解析した。多変量解析はロジスティック回帰モデルを使用して実施した。０．０５より小さいＰ値を有意差があると看做した。
７．結果
７．１ 患者および疾患の特徴
トレーニングコホートおよびバリデーションコホートの患者の特徴および疾患の特徴を表２に示す。患者は全て日本人であり、それぞれ、平均年齢が５８．４歳および６０．９歳、女性が７７．５％および８８．０％、疾患期間の中央値が５７．５ヶ月および４４．５ヶ月である。７２．５％および７５．０％がメトトレキサート（ＭＴＸ）を服用し（投与量中央値は毎週８ｍｇおよび６．７５ｍｇ）、そして５７．５％および５５．０％がコルチコステロイドを服用していた（プレドニソロンの投与量中央値が毎日３．８７５ｍｇおよび１ｍｇ）。ＴＮＦアンタゴニストは患者の３７．５％および３３．３％に投与されていた。トレーニングコホートの患者の１人は、ＴＣＺ治療を開始する以前に、リツキシマブの投与を悪性リンパ腫の治療処方計画の一環として４年前に受けていた。その他の生物学的薬剤は従前には使用されていなかった。
７．１ 患者および疾患の特徴
トレーニングコホートおよびバリデーションコホートの患者の特徴および疾患の特徴を表２に示す。患者は全て日本人であり、それぞれ、平均年齢が５８．４歳および６０．９歳、女性が７７．５％および８８．０％、疾患期間の中央値が５７．５ヶ月および４４．５ヶ月である。７２．５％および７５．０％がメトトレキサート（ＭＴＸ）を服用し（投与量中央値は毎週８ｍｇおよび６．７５ｍｇ）、そして５７．５％および５５．０％がコルチコステロイドを服用していた（プレドニソロンの投与量中央値が毎日３．８７５ｍｇおよび１ｍｇ）。ＴＮＦアンタゴニストは患者の３７．５％および３３．３％に投与されていた。トレーニングコホートの患者の１人は、ＴＣＺ治療を開始する以前に、リツキシマブの投与を悪性リンパ腫の治療処方計画の一環として４年前に受けていた。その他の生物学的薬剤は従前には使用されていなかった。
表２に示すＰ値は、無反応例と反応例との差異を二標本ｔ検定、マン・ホイットニー−Ｕ検定、カイ二乗検定、またはフィッシャーの正確確率検定を使用して算出した。表１中、ＳＤは標準偏差、ＩＱＲは四分位数範囲、ＡＣＰＡは抗シトルリン化タンパク質抗体、ＣＤＡＩは臨床疾患活動度指数、ＥＳＲは赤血球沈降速度、ＣＲＰはＣ反応性タンパク質、ＤＡＳ２８は疾患活動性スコア２８、ＭＭＰ−３はマトリックスメタロプロテイナーゼ−３、ＭＴＸはメトトレキサートを意味する。
本研究に登録された１３人の健常提供者は、年齢の平均±ＳＤが４７．５±８．３歳であり、１０人（７６．９％）が女性であった。
７．２ ＴＣＺ治療に対する反応
トレーニングコホートでは、医師の総合評価に基づくと、２９症例で６ヶ月間のＴＣＺ治療により良好または中等度の反応を認めたが、８症例では反応は認められなかった。１症例が頸椎症の急性増悪により外科手術を要したことから脱落し、２症例がＴＣＺ投与のための来院予定を遵守しなかったことから脱落した。
トレーニングコホートでは、医師の総合評価に基づくと、２９症例で６ヶ月間のＴＣＺ治療により良好または中等度の反応を認めたが、８症例では反応は認められなかった。１症例が頸椎症の急性増悪により外科手術を要したことから脱落し、２症例がＴＣＺ投与のための来院予定を遵守しなかったことから脱落した。
バリデーションコホートでは、全症例について解析適格性を認めた。１５症例で良好または中等度の反応を認めたが、５症例では反応を認めなかった。
医師の総合評価により反応例であると決定された症例では、無反応例と比較して、ＣＤＡＩ測定において顕著または数値的に大きな改善を認めた。その差異はバリデーションコホートにおける有意差よりは小さかったが、これは症例数が少なかったことに起因する（表３）。ＣＤＡＩ分類は、トレーニングコホートの２９症例の反応例のうち２８症例、ならびにバリデーションコホートの１５症例の反応例の全てにおいて改善し、例えば、ＣＤＡＩの中等度から低度への改善が認められた。
表３は、トレーニングコホートおよびバリデーションコホートにおける、ベースラインおよび６ヶ月間のＴＣＺ治療後のＣＤＡＩの変動を示す。変動の値は平均±標準偏差で示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１は、二標本ｔ検定で有意差があることを示す。
７．３ 無反応例と反応例との間の、患者特性および疾患特性の差異
表１に示したように、ベースライン時の患者特性および疾患特性についての、無反応例と反応例との間の差異は、トレーニングコホートでもバリデーションコホートでも認められなかった。
表１に示したように、ベースライン時の患者特性および疾患特性についての、無反応例と反応例との間の差異は、トレーニングコホートでもバリデーションコホートでも認められなかった。
７．４ 候補遺伝子の同定
８症例の無反応例および２９症例の反応例において、１９，４１６遺伝子に対する４１，０００プローブのシグナル強度の値を取得した。まず、全ての検体でバックグランドレベルのシグナル強度（＜１００ 相対蛍光単位）であった５，７５５遺伝子に対する１５，５６４プローブを除外した。次に、次の２条件を満たす４０９プローブを同定した：正規化されたシグナル強度の、無反応例と反応例との間の差異に関する二標本ｔ検定のＰ値が０．０５より小さい（＜０．０５）；正規化されたシグナル強度の、無反応例と反応例との間の差異が１．５倍より大きい（＞１．５倍）。
８症例の無反応例および２９症例の反応例において、１９，４１６遺伝子に対する４１，０００プローブのシグナル強度の値を取得した。まず、全ての検体でバックグランドレベルのシグナル強度（＜１００ 相対蛍光単位）であった５，７５５遺伝子に対する１５，５６４プローブを除外した。次に、次の２条件を満たす４０９プローブを同定した：正規化されたシグナル強度の、無反応例と反応例との間の差異に関する二標本ｔ検定のＰ値が０．０５より小さい（＜０．０５）；正規化されたシグナル強度の、無反応例と反応例との間の差異が１．５倍より大きい（＞１．５倍）。
図１は、これら４０９プローブの正規化されたシグナル強度のヒートマップおよび階層的クラスター解析を示す。無反応例の遺伝子発現パターンが同じブランチにクラスター化されたことから、これら一組の遺伝子は、ＴＣＺ治療により改善すると予想されない患者を同定するための高感度のバイオマーカーになり得ることが示唆される。
次に、候補遺伝子を、次の３条件を適用することにより、６８プローブに絞った：ＣＤＡＩ分類の変化により測定された、無反応例と反応例との間の差異に関する二標本ｔ検定のＰ値が０．０５より小さい（＜０．０５）；ＣＤＡＩ分類の変化により測定された、無反応例と反応例との間の差異が１．５倍より大きい（＞１．５倍）；正規化されたシグナル強度の平均（ｌｏｇ２スケール）が無反応例と反応例のどちらかで０より大きい（＞０）。
続いて、１９遺伝子を代表する２３プローブを選択した（表４）。これら遺伝子は、次のいずれかの判定基準により選択した：複数プローブが確認された遺伝子、例えば、ＲＡＢＧＥＦ１；同じファミリーに属する複数遺伝子、例えば、ＭＴ１Ｇ、ＭＴ１Ｌ、およびＭＴ１Ａ；免疫／炎症反応に直接的に関与する遺伝子、例えば、ＩＬ−２７。
表４は、トレーニングコホートにおける無反応例と反応例の比較により同定された候補ＤＮＡマイクロアレイプローブを示す。候補遺伝子はアルファベット順に列記した。†は二標本ｔ検定を、‡はピアソンの相関計数を示し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１は、有意差があることを示す。ＳＤは標準偏差、ｑＰＣＲはリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応、ＮＤは未測定、Ｕｐは上方制御、Ｄｏｗｎは下方制御を意味する。
７．５ ＤＮＡマイクロアレイシグナル強度とｑＰＣＲ解析により測定された相対的発現との相関
１９遺伝子の相対的発現を、ランダムに選択した１０検体のｃＤＮＡ試料を使用して、ｑＰＣＲ解析により評価し、そしてＤＮＡマイクロアレイシグナル強度と比較した。ＭＴ１Ｂについては、いかなる別個のプライマーセットを使用しても、意味のある増幅曲線は得られなかった。残りの１８遺伝子のうち、ＤＮＡマイクロアレイシグナル強度とｑＰＣＲ解析により測定された相対的発現との間で統計的有意差異のある相関が確認されたのは１５遺伝子であった（表２、右の２列）。
１９遺伝子の相対的発現を、ランダムに選択した１０検体のｃＤＮＡ試料を使用して、ｑＰＣＲ解析により評価し、そしてＤＮＡマイクロアレイシグナル強度と比較した。ＭＴ１Ｂについては、いかなる別個のプライマーセットを使用しても、意味のある増幅曲線は得られなかった。残りの１８遺伝子のうち、ＤＮＡマイクロアレイシグナル強度とｑＰＣＲ解析により測定された相対的発現との間で統計的有意差異のある相関が確認されたのは１５遺伝子であった（表２、右の２列）。
７．６ 独立のコホートにおける無反応例と反応例との間で差異のある遺伝子発現の検証
これら遺伝子のＰＢＭＣｓでの発現レベルの差異を、バリデーションコホートにおける無反応例と反応例との間で比較した。図２は、相対的発現レベルのヒートマップとそれらパターンの階層化を示している。無反応例の遺伝子発現パターンが同じブランチにクラスター化されたことから、これら遺伝子がＴＣＺ治療により改善すると予想されない患者を同定するための高感度のバイオマーカーになり得ることが再度示唆される。これら１５遺伝子のうち、バリデーションコホートの反応例において顕著に高い発現レベルが再現されたのは次の４遺伝子であった：ＩＦＩ６、ＭＴ１Ｇ、ＭＸ２、およびＯＡＳＬ（表５）。
これら遺伝子のＰＢＭＣｓでの発現レベルの差異を、バリデーションコホートにおける無反応例と反応例との間で比較した。図２は、相対的発現レベルのヒートマップとそれらパターンの階層化を示している。無反応例の遺伝子発現パターンが同じブランチにクラスター化されたことから、これら遺伝子がＴＣＺ治療により改善すると予想されない患者を同定するための高感度のバイオマーカーになり得ることが再度示唆される。これら１５遺伝子のうち、バリデーションコホートの反応例において顕著に高い発現レベルが再現されたのは次の４遺伝子であった：ＩＦＩ６、ＭＴ１Ｇ、ＭＸ２、およびＯＡＳＬ（表５）。
表５は、バリデーションコホートにおける無反応例と反応例の間の、候補遺伝子のベースライン時の相対発現の差異を示す。候補遺伝子はアルファベット順に列記した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１は、有意差があることを示す。ＳＤは標準偏差を意味する。
７．７ 健常対照とＲＡ患者との間、および、ＴＣＺ治療の前後での比較
同定された４遺伝子の正規化ＤＮＡマイクロアレイシグナル強度は、ＴＣＺ治療に対して反応したＲＡ患者で健常患者と比較して顕著に高かった（図３）。さらに、正規化シグナル強度は、反応例において３ヶ月間のＴＣＺ治療後に減少する傾向が認められたが、無反応例では認められなかった（図３）。これらデータは、これら遺伝子のＰＢＭＣｓでの発現がＴＣＺ治療に反応すると予想されるＲＡ患者で概ね増加していることを示すものである。
同定された４遺伝子の正規化ＤＮＡマイクロアレイシグナル強度は、ＴＣＺ治療に対して反応したＲＡ患者で健常患者と比較して顕著に高かった（図３）。さらに、正規化シグナル強度は、反応例において３ヶ月間のＴＣＺ治療後に減少する傾向が認められたが、無反応例では認められなかった（図３）。これらデータは、これら遺伝子のＰＢＭＣｓでの発現がＴＣＺ治療に反応すると予想されるＲＡ患者で概ね増加していることを示すものである。
７．８ ＴＣＺ治療に対する臨床反応の予測モデル
予測値の評価および最適カットオフレベルの設定を行うために、ＲＯＣ解析を、同定した４遺伝子のそれぞれについて実施した。バリデーションコホートにおいてＴＣＺ治療に中等度から良好な反応を予測するためのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣｓ）は、それぞれ、ＩＦＩ６については０．６９３、ＭＴ１Ｇについては０．９２０、ＭＸ２については０．８１３、そしてＯＡＳＬについては０．６２７であった（表６）。
予測値の評価および最適カットオフレベルの設定を行うために、ＲＯＣ解析を、同定した４遺伝子のそれぞれについて実施した。バリデーションコホートにおいてＴＣＺ治療に中等度から良好な反応を予測するためのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣｓ）は、それぞれ、ＩＦＩ６については０．６９３、ＭＴ１Ｇについては０．９２０、ＭＸ２については０．８１３、そしてＯＡＳＬについては０．６２７であった（表６）。
表６は、バリデーションコホートにおいてＴＣＺ治療に中等度から良好な反応を予測するための、各遺伝子および合計スコアに関するＲＯＣ解析および診断値を示す。†ＲＯＣ解析は各遺伝子の相対発現レベルについて実施した。‡ＲＯＣ解析は含まれる遺伝子の合計スコアについて実施した。ＲＯＣは反応受信者動作特性、ＡＵＣは曲線下面積、ＰＰＶは陽性予測値、ＮＰＶは陰性予測値を意味する。
次に、バリデーションコホートにおけるＴＣＺ治療に対する中等度から良好な反応について、同定した遺伝子の独立の予測値を設定するために、多変量ロジスティック回帰解析を実施した。しかしながら、連続変数も二分変数も、おそらく試料数が少ないことに起因して、有意な予測変数として確認されなかった。
そこで、それぞれの遺伝子に対して、カットオフ値より上の高い相対的発現を示した場合に１ポイントを等しく割り当て、これらポイントを合計することにより総合スコアを算出した。４遺伝子の可能性ある組み合わせの全てについての総合スコアの予測値を表４に示す。ＭＴ１ＧおよびＭＴＸ２を含む総合スコアまたはＭＴ１Ｇ、ＭＸ２およびＯＡＳＬを含む総合スコアが、最も大きいＡＵＣ０．９４７を、２以上のカットオフ値で与えた。バリデーションコホートにおけるＴＣＺ治療への中等度から良好な反応について、これらモデルの陽性予測値および陰性予測値はそれぞれ１００％および５５．６％であった。
本発明に係る方法を用いれば、ＲＡ患者における抗ＩＬ−６受容体抗体治療の有効性をその開始前に確認した上で、該治療を実施することができる。その結果、例えば、当該治療の有効性が見込める患者に対しては、該治療を適用し、有効性が見込めない患者に対しては治療方針を変更するなど、治療方針の選択判断が可能となる。したがって、本発明に係る方法は、当該治療の有効性が見込めない患者にとって、該治療を受けることによる損傷の進行や副作用に関する不必要なリスクを避けることができると共に、不要な費用の発生を防止することができる。さらに、無駄な薬剤の使用を抑え、医療経済にも大きく貢献する。
配列番号１：メタロチオネイン １Ｇ（ＭＴ１Ｇ）遺伝子
配列番号３：インターフェロンα−誘導性タンパク質６（ＩＦＩ６）遺伝子
配列番号５：インターフェロンα−誘導性タンパク質６（ＩＦＩ６）遺伝子
配列番号７：ミクソウイルス耐性２（ＭＸ２）遺伝子
配列番号９：２´−５´−オリゴアデニレートシンテターゼ様（ＯＡＳｌ）遺伝子
配列番号１１：ＣＣＬ３Ｌ３遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１２：ＣＣＬ３Ｌ３遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１３：ＣＣＬ４遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１４：ＣＣＬ４遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１５：ＣＤ８３遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１６：ＣＤ８３遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１７：ＣＸＣＲ４遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１８：ＣＸＣＲ４遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１９：ＦＯＳＬ２遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２０：ＦＯＳＬ２遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２１：ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２２：ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２３：ＨＰＲ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２４：ＨＰＲ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２５：ＩＦＩ６遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２６：ＩＦＩ６遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２７：ＩＬ２７遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２８：ＩＬ２７遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２９：ＬＹ６Ｅ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３０：ＬＹ６Ｅ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３１：ＭＴ１Ｇ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３２：ＭＴ１Ｇ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３３：ＭＴ１Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３４：ＭＴ１Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３５：ＭＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３６：ＭＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３７：ＭＸ２遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３８：ＭＸ２遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３９：ＯＡＳＬ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４０：ＯＡＳＬ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４１：ＲＡＢＧＥＦ１遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４２：ＲＡＢＧＥＦ１遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４３：ＴＨＢＳ１遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４４：ＴＨＢＳ１遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４５：ＷＡＲＳ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４６：ＷＡＲＳ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３：インターフェロンα−誘導性タンパク質６（ＩＦＩ６）遺伝子
配列番号５：インターフェロンα−誘導性タンパク質６（ＩＦＩ６）遺伝子
配列番号７：ミクソウイルス耐性２（ＭＸ２）遺伝子
配列番号９：２´−５´−オリゴアデニレートシンテターゼ様（ＯＡＳｌ）遺伝子
配列番号１１：ＣＣＬ３Ｌ３遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１２：ＣＣＬ３Ｌ３遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１３：ＣＣＬ４遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１４：ＣＣＬ４遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１５：ＣＤ８３遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１６：ＣＤ８３遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１７：ＣＸＣＲ４遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１８：ＣＸＣＲ４遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１９：ＦＯＳＬ２遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２０：ＦＯＳＬ２遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２１：ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２２：ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２３：ＨＰＲ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２４：ＨＰＲ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２５：ＩＦＩ６遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２６：ＩＦＩ６遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２７：ＩＬ２７遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２８：ＩＬ２７遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２９：ＬＹ６Ｅ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３０：ＬＹ６Ｅ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３１：ＭＴ１Ｇ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３２：ＭＴ１Ｇ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３３：ＭＴ１Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３４：ＭＴ１Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３５：ＭＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３６：ＭＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３７：ＭＸ２遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３８：ＭＸ２遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３９：ＯＡＳＬ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４０：ＯＡＳＬ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４１：ＲＡＢＧＥＦ１遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４２：ＲＡＢＧＥＦ１遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４３：ＴＨＢＳ１遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４４：ＴＨＢＳ１遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４５：ＷＡＲＳ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４６：ＷＡＲＳ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
Claims (7)
- 関節リウマチに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測するための方法であって、（１）関節リウマチ患者から単離された末梢血単核球試料において、ＭＴ１Ｇ、ＩＦＩ６、ＭＸ２、およびＯＡＳＬの薬効マーカー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること、並びに（２）前記（１）において測定した遺伝子の発現レベルと、関節リウマチに対する抗ヒトＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性とを相関付けることを含む、方法。
- 前記（２）における、測定した遺伝子の発現レベルと関節リウマチに対する抗ヒトＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性とを相関付けることが、測定した遺伝子の発現レベルと該遺伝子の発現レベルのカットオフ値との比較により行われる、請求項１に記載の方法。
- 前記抗ＩＬ−６受容体抗体がトシリズマブである、請求項１または請求項２に記載の関節リウマチに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測するための方法。
- ＭＴ１Ｇ、ＩＦＩ６、ＭＸ２、およびＯＡＳＬの薬効マーカー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の転写産物またはその相補的核酸を特異的に検出し得る核酸プローブ若しくは核酸プライマー、または、当該薬効マーカー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体を含む、関節リウマチに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測するための診断薬。
- 前記抗ＩＬ−６受容体抗体がトシリズマブである、請求項４に記載の診断薬。
- 請求項４または請求項５に記載の診断薬に加え、前記核酸プローブ若しくは核酸プライマー、または前記抗体を検出するための試薬をさらに含む、関節リウマチに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測するための診断用試薬キット。
- 下記プライマーセットから選択される少なくとも１のプライマーセットを含む、関節リウマチに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測するための診断用試薬キット：
（ｉ）配列番号３１に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号３２に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット、
（ｉｉ）配列番号２５に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号２６に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット、
（ｉｉｉ）配列番号３７に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号３８に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット、並びに
（ｉｖ）配列番号３９に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号４０に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット。
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