JP2015100327A - クリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株の遺伝子を破壊する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]以下の工程を含むことを特徴とする、クリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株のゲノム中の特定の遺伝子を破壊する方法:
(1)前記特定の遺伝子の5′側配列の少なくとも一部と、ウラシル要求性マーカー遺伝子配列と、前記特定の遺伝子の3′側配列の少なくとも一部とをこの順序で含み、さらに、前記特定の遺伝子の5′側配列の少なくとも一部と前記ウラシル要求性マーカー遺伝子配列の間及び/又は前記ウラシル要求性マーカー遺伝子配列と前記特定の遺伝子の3′側配列の少なくとも一部の間に、前記特定の遺伝子の5′側又は3′側配列の別の少なくとも一部が挿入されている遺伝子コンストラクトを作製する工程;
(2)前記ウラシル要求性の菌株を前記遺伝子コンストラクトで形質転換し、ウラシル非含有培地で培養して、前記菌株のゲノム中の前記特定の遺伝子が存在する部位に二重相同組換えによって前記遺伝子コンストラクトが挿入された第1の形質転換体を選抜する工程;及び
(3)5−FOAを含有する培地で前記第1の形質転換体を培養し、相同配列の染色体内部での相同組換えによりウラシル要求性マーカー遺伝子がゲノム中から除去された第2の形質転換体を選抜する工程。
[2]クリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株が、FERM BP−10961として国際寄託されているクリプトコッカスsp.S−2.U5株であることを特徴とする、[1]に記載の方法。
[3]配列番号1で示される塩基配列、又は配列番号1で示される塩基配列に対して90%以上の同一性を有し、かつホスホリボシルアミノイミダゾール−サクシノカルボキシアミド合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなることを特徴とするマーカー遺伝子。
[4]配列番号2で示される塩基配列、又は配列番号2で示される塩基配列に対して90%以上の同一性を有し、かつプロモーター活性を有する塩基配列をプロモーターとしてさらに含むことを特徴とする、[3]に記載のマーカー遺伝子。
[5]相同組換えの頻度が増大されたクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株を取得する方法であって、[1]又は[2]に記載の方法によってクリプトコッカス属の菌株のゲノム中のKu遺伝子を破壊する工程を含むことを特徴とする方法。
[6]クリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株が、FERM BP−10961として国際寄託されているクリプトコッカスsp.S−2.U5株であり、Ku遺伝子が、配列番号3で示される塩基配列、又は配列番号3で示される塩基配列に対して90%以上の同一性を有し、かつKu遺伝子活性を有する塩基配列からなることを特徴とする、[5]に記載の方法。
[7]相同組換えの頻度が増大されたクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株であって、[5]又は[6]に記載の方法により得られることを特徴とする菌株。
クリプトコッカスsp.S−2のAde1遺伝子破壊株を作製するために、Ade1遺伝子のPop−in/Pop−outコンストラクトを作製した。Pop−in/Pop−outコンストラクトの作製には、クリプトコッカスsp.S−2のAde1遺伝子の上流約2kbpと、下流約2kbpを使用した。Ade1遺伝子の上流配列を配列番号4に、Ade1遺伝子の下流配列を配列番号5に示す。
すなわち、配列番号8(pCR−ade1−PT−F)のプライマーと配列番号9(pCR−ade1−PT−R)のプライマーで増幅したPCR産物と、配列番号10(ura5−ade1−F)と配列番号11(ura5−ade1−R)のプライマーで増幅したPCR産物をin−fusion反応させて、Ade1−Upop1000aベクターを作製し、
配列番号15(Ade1−500F)のプライマーと配列番号12(Ura5 708−688R)のプライマーで増幅したPCR産物と、配列番号16(Ade1−1436F)と配列番号17(pCR−ade1−PT−R3)のプライマーで増幅したPCR産物をin−fusion反応させて、Ade1−Upop500aベクターを作製し、
配列番号18(Ade1−1000F)のプライマーと配列番号12(Ura5 708−688R)のプライマーで増幅したPCR産物と、配列番号13(Ade1+936F)と配列番号19(pCR−ade1−PT−R4)のプライマーで増幅したPCR産物をin−fusion反応させて、Ade1−Upop1000bベクターを作製した。
組換え宿主としては、クリプトコッカスsp.S−2.U5株を使用した。本菌株は、FERM BP−10961として国際寄託されている。本菌株は、形質転換体の選択のために、ウラシル要求性となっており、ウラシルマーカーであるURA5遺伝子を含むプラスミドを形質転換することにより、ウラシル要求性の有無を指標として形質転換体を選抜することが可能である。
Ade1遺伝子を実際にマーカー遺伝子として機能させるためには、Ade1遺伝子が発現されてAde1タンパク質が生産されることが必要である。そこで、Ade1遺伝子を発現するために好適なプロモーターの種類を検討した。
まず、上記(A)で作製したクリプトコッカスsp.S−2のAde1遺伝子の上流約2kbpと、ade1遺伝子のORF領域、及びAde1遺伝子の下流約2kbpを含む、pCR−ade1を検討に用いた。配列番号20(Ade1U1KF)と配列番号21(Ade1terR)を用いてPCRを行い、クリプトコッカスsp.S−2のAde1遺伝子の上流1kpと、ade1遺伝子のORF領域、Ade1遺伝子の下流0.3kbpを含む領域を増幅した産物をTarget−clone plus(東洋紡製)にクローニングして、pTAde1+1k−0.3kを作製した。さらに、クリプトコッカスsp.S−2株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号22(CsEF1p_F(Mun))と、配列番号23(EF1pAde1_fR)のプライマーを用いて増幅したクリプトコッカスsp.S−2由来TEF1プロモーター配列のPCR産物と、配列番号24(EF1pAde1_fF)と配列番号21(Ade1terR)のプライマーを用いて増幅した、クリプトコッカスsp.S−2のade1遺伝子のORF領域とade1遺伝子の下流領域0.3kbpを含むPCR産物をFusion−PCRし、得られた産物をTarget−clone plus(東洋紡製)にクローニングして、pTTef1p−Ade1を作製した。上述のようにして作製したコンストラクト(プラスミド)の構造を図7に示す。
非相同末端結合機構に関与するKu70遺伝子の破壊を行うため、非特許文献2に記載の、pCsURA5ベクターをベースとして、Ku70遺伝子のPop−in/Pop−outコンストラクトを作製した。
まず、クリプトコッカスsp.S−2のゲノムDNAを鋳型として、配列番号25(Ku70U2kF(SbfI))のプライマーと配列番号26(Ku70U2kR(SbfI))のプライマーを用いてKu70遺伝子のORFの上流約2kbpを増幅し、Sbf1で制限酵素処理した後、同じくSbf1処理したpCsURA5に挿入して、pCsU−Ku70U2Kを作製した。
Ku70のPop−in/Pop−outを行う組換え宿主としては、クリプトコッカスsp.S−2. D11株を使用した。本菌株は、特許文献5に記載されており且つ、FERM BP−11482として国際寄託された、クリプトコッカスsp.S−2株の細胞外多糖類低生産変異体である。D11株はA1U5株からUV変異によって単離された変異体であり、ウラシル及びアデニン要求性株である。
Ku70遺伝子の破壊が、遺伝子座へのターゲッティング率に影響を与えるかを確認するため、Ku70破壊株であるDK191株にpCR−ade1を形質転換し、ade1遺伝子座への導入効率を検討した。対照として、Ku70が破壊されていないD11株へも同様に形質転換を行った。得られた形質転換体の確認は、配列番号6(Ade1P2k_F)のプライマーと配列番号7(Ade1T2k_R)のプライマーを用いてコロニーPCRを行うことによって確認した。その結果を図10に示す。
上記(F)では、遺伝子座の相同配列部分として上流2kbpと下流2kbpを使用したため、相同配列部分が長く、Ku70遺伝子が機能しているD11株でもターゲッティング率は28%と比較的高い値となった。そこでKu70遺伝子破壊の効果をさらに厳格な条件下で確認するため、相同配列部分が短いコンストラクトを用いて、ターゲティング率の検証を行った。
Claims (7)
- 以下の工程を含むことを特徴とする、クリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株のゲノム中の特定の遺伝子を破壊する方法:
(1)前記特定の遺伝子の5′側配列の少なくとも一部と、ウラシル要求性マーカー遺伝子配列と、前記特定の遺伝子の3′側配列の少なくとも一部とをこの順序で含み、さらに、前記特定の遺伝子の5′側配列の少なくとも一部と前記ウラシル要求性マーカー遺伝子配列の間及び/又は前記ウラシル要求性マーカー遺伝子配列と前記特定の遺伝子の3′側配列の少なくとも一部の間に、前記特定の遺伝子の5′側又は3′側配列の別の少なくとも一部が挿入されている遺伝子コンストラクトを作製する工程;
(2)前記ウラシル要求性の菌株を前記遺伝子コンストラクトで形質転換し、ウラシル非含有培地で培養して、前記菌株のゲノム中の前記特定の遺伝子が存在する部位に二重相同組換えによって前記遺伝子コンストラクトが挿入された第1の形質転換体を選抜する工程;及び
(3)5−FOAを含有する培地で前記第1の形質転換体を培養し、相同配列の染色体内部での相同組換えによりウラシル要求性マーカー遺伝子がゲノム中から除去された第2の形質転換体を選抜する工程。 - クリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株が、FERM BP−10961として国際寄託されているクリプトコッカスsp.S−2.U5株であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 配列番号1で示される塩基配列、又は配列番号1で示される塩基配列に対して90%以上の同一性を有し、かつホスホリボシルアミノイミダゾール−サクシノカルボキシアミド合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなることを特徴とするマーカー遺伝子。
- 配列番号2で示される塩基配列、又は配列番号2で示される塩基配列に対して90%以上の同一性を有し、かつプロモーター活性を有する塩基配列をプロモーターとしてさらに含むことを特徴とする、請求項3に記載のマーカー遺伝子。
- 相同組換えの頻度が増大されたクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株を取得する方法であって、請求項1又は2に記載の方法によってクリプトコッカス属の菌株のゲノム中のKu遺伝子を破壊する工程を含むことを特徴とする方法。
- クリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株が、FERM BP−10961として国際寄託されているクリプトコッカスsp.S−2.U5株であり、Ku遺伝子が、配列番号3で示される塩基配列、又は配列番号3で示される塩基配列に対して90%以上の同一性を有し、かつKu遺伝子活性を有する塩基配列からなることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 相同組換えの頻度が増大されたクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株であって、請求項5又は6に記載の方法により得られることを特徴とする菌株。
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