JP2014533521A - 浸透圧調節物質を使用する、種子からのdna抽出 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、合衆国法典第35巻第119条に基づき、2011年11月28日提出の米国仮特許出願第61/564,138号明細書および2012年7月31日提出の米国仮特許出願第61/677,514号明細書(共に、本明細書と矛盾しない範囲まで、参照により本明細書に援用する)に利益を要求する。
a.前記種子を:
i.前記種子を軟化させるのに十分な濃度のアルカリ;および
ii.前記種子をアルカリで前処理することを含むプロセスと比較して前記DNAの収率を高めるのに十分な濃度の浸透圧調節物質;
を含む、前処理溶液に浸漬することにより、前記種子を前処理すること;
b.前記種子を破砕すること;および
c.前記破砕された種子から前記DNAを抽出すること;
を含む。
水平プレートは、プレートが容易に保存され積み重ねられるような、複数のウェルを支持するための基部として機能する。プレートは、手作業で動かすことができてもよく、輸送システムの一部であってもよい。可動性のプレートは、種子を装填するシステムによって輸送されることが可能であり、プレートまたはウェルまたは種子を同定して、必要な情報を検索可能な形で記録する。位置または順序または配置の記録は、種子の同一性およびウェル内でのその位置等の必要な情報の検索を可能にする方法で行われる。ウェルのプレートは、ウェル内で種子を破砕するのに必要な圧力に耐えられる任意の材料で作られていてもよい。種子は、2,000〜7,000ポンド/平方インチ(140,648〜492,240g/cm2)の圧力で押し込むことが可能である。プラスチックは、一般にプレートが形成されるものであるが、金属または、破砕力で破壊したり圧力骨折したりしない他の材料をプレートに使用することができる。
ウェルの機能は、種子を保持するための容器を提供することである。図4に示すウェルは、ウェル閉端25およびウェル開口端27を有する。ウェル開口端は、破砕する予定の種子または種子の一部を受け取るのに合わせて作られる。他端は、図3Bに表示されている、ピン50の破砕チップ46の形に非常によく似た形状で設計される。種子がウェル開口端27に装填されるとき、種子はウェル閉端25付近に来る。プレート当たりのウェル数は、ウェルプレートに装填される種子の大きさによって変化してもよい。一般に、図中のウェルは、8行6列で配向された48ウェルプレートである。ウェル閉端25は、多くの異なる形をとることができる。ピンチップ46は、好ましくはウェル閉端25の輪郭に適合する。ウェル末端25として、一点の代わりに扁平な底部を有する四辺形の逆ピラミッドを使用することにより、破砕力を種子に集中させる小さい扁平な破砕チップを有するピンチップ46が可能になる。ウェルは、材料の組成物、多くの場合、クラッキングや小さい圧力骨折を形成せずに、種子に印加される圧力に耐えることができる高密度プラスチックから選択される。ウェルは、プロセスの後期段階で液体を保持するために使用され、それゆえ、種子が破砕された後のウェルの完全性の保持が重要である。
ダイプレートの機能は、圧縮力、または粉砕力を種子材料に提供することである。ピストン、スクリュー、レバー、水圧等が、この力を推進できる。ダイプレートは、ウェルのそれぞれに対するピンを有し、この力を種子材料に移行させる。ダイプレート上のピンは、プレートにおけるウェルの位置と一致し、ダイプレートからの圧力は、ピンを介してウェル20内の種子材料に移行する。ピンは、プレートのウェルの中に装填された種子を係合して破砕する。
1.縮小要素で粉砕されたピンで破砕された予浸種子
溶液(この実験では、種子上のあらゆる種子処理剤を洗い落すドデシル硫酸ナトリウム(SDS))に浸漬されたトウモロコシ種子を使用した。抽出バッファーは、Tris、HClおよびEDTAも含有する。SDSは、水よりも効率よく種子を軟化させる。種子材料を軟化させるのであれば、H2Oをはじめとする、破砕された種子材料の下流アプリケーションを妨げない任意の浸漬液を使用することができる。浸漬時間は、穀粒の耐久性によって異なる。この実験では、種子材料を65℃で24時間浸漬した。温度はより高くてもより低くてもよく、室温でさえ使用できるが、一部の実験では、種子はこの温度で効率よく軟化されなかった。
2.アルカリに浸漬することにより軟化され、スチールビーズで破砕された種子
この実験では、ピン破砕機装置は使用されない。代わりに、NaOHまたはKOH等を使用して種子を軟化した。この全種子NAOH前処理は、全種子からDNAを抽出するためではなく、代わりに断片化用に種子を軟化するためである。NaOHを用いたDNA抽出は、破壊された材料(葉、種子チップ)からDNAを抽出するための周知の手順であるが、前処理ステップで種子を軟化するためではない。
3.ウェル内の中で溶液により粉状にした、予浸した種子
1.実施例1に従って種子を軟化させるために種子を溶液中で一晩予浸した。
2.予浸した種子をウェル内に置くか、または種子をウェル内で浸漬することができ、浸漬液を捨てることができる。数個のスチールビーズを加え(無溶液)、水平のシェーカーで振盪し(種子は破壊される)、ウェル/ブロックを開ける前に残屑を回収するために簡単に遠心分離した。
3.液体(たとえば、DNA抽出バッファー)を加え、水平のシェーカーで再度振盪し、種子を完全に破砕した。
4.上述の通り、テストが続行された。
ウェルプレート中で、3M NaClおよび0.2M NaOHを含有する溶液に、35℃で21時間、種子を浸漬した。浸漬液を除去し、改良されたDellaportaDNA抽出バッファー(Dellaporta et al.Plant Mol.Biol.Rep.1:19,1983)の中で、種子を破砕した。図は、遠心分離後、抽出バッファーの中に破砕された種子が入っているウェルプレートを表す。各ウェルの底部の種子残渣と一緒に、スチールボールの形の縮小要素が各ウェルに見られる。各ウェル内の残渣の上に、抽出バッファー中にDNAを含む上澄が見られる。
この実験は、22℃におけるDNA収率に対するNaOH濃度の影響を示す:図6は、抽出されたDNAに関するDNAプロフィールを表す:下段:種子を改良されたDellaporta抽出バッファー(pH8.2)に浸漬し、48ピン破砕機で破砕し、スチールビーズで完全に断片化した。中段:種子を1M NaCl/0.1M NaOHに浸漬し、浸漬液を廃棄し、改良されたDellaporta抽出バッファーを加え、ペイントシェーカーで、種子をスチールビーズと一緒に振盪し、改良されたDellaportaプロトコールを使用してDNAを抽出した。上段:種子を、1M NaCl/0.2M NaOHに浸漬し、浸漬液を廃棄し、改良されたDellaporta抽出バッファーを加え、ペイントシェーカーで、種子をスチールビーズと一緒に振盪し、改良されたDellaportaプロトコールを使用してDNAを抽出した。
この実験は、40℃におけるDNA収率に対するNaOH濃度の影響を示す:改良されたDellaportaプロトコールを使用して、全ての種子試料からDNAを抽出した:図7は、抽出されたDNAに関するDNAプロフィールを表す:下段:種子を改良されたDellaporta抽出バッファー(pH8.2)に浸漬し、48ピン破砕機で破砕し、スチールビーズで完全に断片化した。中段:種子を1M NaCl/0.1M NaOHに浸漬し、浸漬液を廃棄し、改良されたDellaporta抽出バッファーを加え、ペイントシェーカーで、種子をスチールビーズと一緒に振盪し、改良されたDellaportaプロトコールを使用してDNAを抽出した。上段:種子を、1M NaCl/0.2M NaOHに浸漬し、浸漬液を廃棄し、改良されたDellaporta抽出バッファーを加え、ペイントシェーカーで、種子をスチールビーズと一緒に振盪し、改良されたDellaportaプロトコールを使用してDNAを抽出した。
この実験は、この方法を使用した対立遺伝子の識別の結果を例示する。さまざまな種子ロット由来の種子を、35℃で、3M NaCl/0.2M NaOHに浸漬した。浸漬液を廃棄し、改良されたDellaporta抽出バッファーを加え、ペイントシェーカーで種子をスチールビーズと一緒に振盪した。改良されたDellaportaプロトコールを使用してDNAを抽出した。抽出されたDNAを、Taqman分析用の鋳型として使用した。図8は、プロットの左下コーナーに示されている小さい未確定の遺伝子型と共に、3つのクラスターが明らかに同定された結果を示す。
本実験は、さまざまな最少浸漬量の使用からの、DNA収率の差を例示する。最少浸漬は、コーンの軟化のためである。最少浸漬を使用するとき、種子は液体でかろうじてカバーされるか丁度カバーされる。こうした最少浸漬プロトコールは、流体を使用してウェル内の種子をカバーするかカバーするよりも僅かに少ないとき、200μl〜800μlの流体範囲を有し、ピラミッド形の底部を有する48ウェルブロック内に入っているコーン種子を使用するとき、流体の好ましい範囲は400μl〜600μlである。対照的に、同サイズのウェルの中で、非最少浸漬流体量で浸透圧調節物質を使用するとき、種子は、1500μlの前処理流体に浸かっていた。
Claims (22)
- 種子からDNAを抽出する方法であって、
a.前記種子を:
i.前記種子を軟化させるのに十分な濃度のアルカリおよび任意選択的に
ii.アルカリのみで前記種子を前処理することを含むプロセスと比較して前記DNAの収率を高めるのに十分な濃度の浸透圧調節物質
を含む、前処理溶液に浸漬することにより前記種子を前処理すること;
b.前記種子を破砕すること;
c.前記破砕された種子から前記DNAを抽出すること;
を含む、前記方法。 - 前記アルカリが水酸化ナトリウムかまたは水酸化カリウムである、請求項1に記載の方法。
- 前記アルカリが約0.1M〜約1Mの濃度で存在する、請求項2に記載の方法。
- 前記浸透圧調節物質が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ポリエチレングリコール(PEG)、マンニトール、糖アルコール類、およびスクロースからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記浸透圧調節物質が約1M〜約5Mの濃度で存在する、請求項4に記載の方法。
- 前記種子が、トウモロコシ、大麦、ソバ、イネ科植物、モロコシ、花、コメ、小麦、ブルグア、ミレット、ライムギ、ダイズおよび他の豆類、メロン、ザクロ、ヒマワリ、トルティカーレ、大麦、キャノーラ、ワタ、ベニバナ、ヨード化ケシ、ゴマ、カルダモン、セロリ、ディル、ウイキョウ、ナツメグ、およびプランテーンの種子からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記浸漬が、前記種子を軟化させるのに十分な期間続けられる、請求項1に記載の方法。
- 前記浸漬が、約22℃〜約65℃の温度で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記破砕が、前記種子を閉鎖空間の中に置くことおよび前記種子をサイズ縮小要素と一緒に振盪することを含む方法で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記サイズ縮小要素が、前記種子を粉砕するのに十分な硬度を有する物体である、請求項9に記載の方法。
- ウェルの中で植物材料を溶液で前処理するステップ;前記前処理した種子を、リデューサー要素を用いて、力強い振盪または衝突力で粉砕し、結果的に断片化された種子材料を生じるステップ;を含む、植物材料を断片化する方法。
- 前記前処理した種子を粉砕する前に、前記前処理溶液が前記植物材料から分離されない、請求項11に記載の方法。
- 前記種子と接触している前記前処理溶液が、DNA抽出バッファーと取り替えられる、請求項11に記載の方法。
- 前記粉砕ステップが自動化されている、請求項11に記載の方法。
- (a)ウェル底部を有する少なくとも1つのウェルが付いたウェルプレートであって、前記ウェルが植物組織材料を受けるのに適しているウェルプレート;(b)前記ウェルの中に入るための、少なくとも1つのピンを収容するのに適しているダイプレート;および(d)前記ピンが前記受けた種子材料を破砕する、前記ダイプレートを前記ウェルプレートと湊合するためのプレス;を含む、種子断片化のための種子破砕機装置。
- 前記ウェルプレートが任意選択的に固定されているかまたは可動性であり、前記ダイプレートが任意選択的に固定されているかまたは可動性である、請求項15に記載の種子破砕機。
- 前記ウェルプレートが、ウェル内に置かれた1つまたは複数の縮小要素を有する、請求項15に記載の種子破砕機。
- 前記ウェル内の前記縮小要素を振盪する、回転させる、または振動させるプラットホームを含む、請求項3に記載の種子破砕機。
- 種子断片化から抽出媒体を回収する方法であって:(a)ウェルの中の少なくとも1つの種子を、前記種子断片化用の縮小要素と一緒に振盪するステップ;(b)前記媒体が種子構成成分を溶解できる、抽出媒体を各ウェルの中に送達するステップ;および(c)前記抽出媒体を回収するステップを含む、前記方法。
- 前記ウェルの中の前記抽出媒体を送達した後で、ウェルプレートが振盪される、請求項19に記載の方法。
- 前記種子がアルカリ溶液中で前処理され、前記種子の硬さが減少している、請求項19に記載の方法。
- ウェルの中の種子材料を前処理するステップ;各ウェルの中に入って前記種子を破砕するのに適している少なくとも1つの垂直のピンが付いた水平のダイプレートを含む自動化システムで前記前処理した種子材料を破砕し、前記ウェルから分析用の種子構成成分を抽出するステップ;を含む、種子構成成分を破砕された種子材料から抽出するプロセス。
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