JP2014521967A - 粒子の光学的な検出および解析 - Google Patents
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Abstract
Description
光子相関分光法(PCS)などの動的光散乱技術は、何千もの粒子の大きな集合体を解析し、これらの粒子から、z−平均粒径、すなわち強度で重み付けされた平均粒径のみが、粒径分布の幅を示す多分散性指数とともに得られる(Pecora,R.,(Ed)(1985)Dynamic Light Scattering,Applications of Photon Correlation Spectroscopy,Plenum Press,New York)。この技術は、典型的に、好適に集束された(focussed)コヒーレントな、直径約100μmの単色レーザービームによって照射される、液体中のナノ粒子の懸濁液を含むサンプルにおいて実施され、このレーザービームからの散乱光が、光子計数光電子増倍管(photon counting photomultiplier)によって検出される。検出器は、サンプルによって遠視野に散乱される光からの1つのみのコヒーレンス領域またはスペックルを観察するために、ピンホールとスリットの組合せまたはシングルモード光ファイバーによって構成される。コヒーレンス領域内の光の強度は、ナノ粒子のランダムなブラウン運動の結果としての干渉効果によって変動し、強度の変動の特性時間スケールが、デジタル相関器によって解析される。強度の変動の変化の平均速度は、粒子拡散係数(Dt)として表すことができ、粒子拡散係数(Dt)から、レーザービームの経路における粒子の球相当流体力学直径が推定され得る。2〜3nm程度の小ささの粒子の最大寸法、例えば直径は、このように決定され得る。しかしながら、全ての粒子がDLSで同時に測定されると、比較的少ない数の高度に散乱するより大きい粒子(例えば、汚染物質または凝集体)が、信号を支配し、存在し得るより小さい粒子の大部分の存在を事実上覆い隠し得ることが多い。ある限られた状況では、様々なデコンボリューションアルゴリズムの適用によって、得られた結果から粒径分布構造(例えば二峰性分布)を得ることが可能であるが、この手法は、2つの集団が、それ自体、過度に多分散性でなく、またはサイズが互いに過度に近似していない場合にのみ確実である。実際には、3未満の比率だけ直径が異なる粒子は、通常、分析することができない。これは、粒径分布についての正確な情報が必要とされる用途において厳しい制限であるが、サンプルは、より大きい粒子(例えば、汚染物質または凝集体)を含有し、より大きい粒子は、結果を著しく偏らせ、部分的にまたは完全により小さい粒子の存在を覆い隠すことがある。同様に、広範囲の粒径を含む本質的に複雑な、多分散性でかつ不均質なサンプルは、多くの場合、存在するより大きい粒径にひどく偏った(badly skewed)分布を生じる。最終的に、アンサンブル法(ensemble technique)であるため、特定の粒径またはサイズクラスの数に関する直接の情報をDLSから何ら得ることはできない。
ナノ粒子追跡解析は、液体中のナノ粒子の直接およびリアルタイムの可視化および解析のための最近開発された方法である。例えば、国際公開第03/093801号パンフレットを参照されたい。レーザー照射される顕微鏡的技術に基づいて、ナノ粒子のブラウン運動が、電荷結合素子(CCD)カメラによってリアルタイムで解析され、各粒子は、同時であるが別々に可視化され、専用の粒子追跡画像解析プログラムによって追跡される。各粒子が、別々に可視化され、解析されるため、粒径および粒径分布の得られる推定値には、このサイズ領域の粒径測定の従来のアンサンブル法、例えば、上述される動的光散乱(DLS)において通常である、強度で重み付けされたz−平均分布であるという制限はない。粒径および粒子の散乱強度を同時に測定するNTAの能力により、不均質粒子混合物を分析することができ、重要なことには、粒子の濃度を直接推定することができ、NTAによって得られる粒径分布プロファイルは、直接の数/頻度分布である。
DLSによって得られる第2の情報は、z−平均粒径の形態の平均粒径についての情報を含み、任意に、粒径分布についての情報も含む。
バックグラウンド粒子は、DLSの一形態におけるレーザードップラー速度計測によって解析可能な運動で運動させられ得る。
例えばゲル化または溶融に起因するか、あるいは化学的電荷(chemically charge)(例えばpH)に起因するPCSで測定可能なバックグラウンドの、レオロジー的性質の変化は、より大きいNTAで検出可能な粒子の挙動を変更させ得る。NTAで検出可能な粒子の変化を監視することによって、バックグラウンド粒子の変化が監視され得る。
サンプルを照射するために好適に集束された放射線ビームを生成するための光源手段と;
NTAを用いて、粒子についての第1の情報を得るための第1の検出システムと;
動的光散乱を用いて、粒子についての第2の情報を得るための第2の検出システムと;
第1の情報から第3の情報を決定するようにプログラムされたデータ処理手段と
を含む装置を提供する。
(a)空間的に共通(spatially common)かつ時間的に共通(temporally common)である(すなわち、第1および第2の検出システムが、照射されたサンプルの実質的に同じ部分を、実質的に同時にインターロゲートする(interrogate)のに使用される);
(b)空間的に共通であるが、時間的に異なる(すなわち、第1および第2の検出システムが、照射されたサンプルの実質的に同じ部分を、ただし実質的に異なる時間に、例えば連続してインターロゲートするのに使用される);および
(c)空間的に異なるが、時間的に共通である(すなわち、第1および第2の検出システムが、照射されたサンプルの異なる部分を、実質的に同時にインターロゲートするのに使用される)。
(e)両方の検出システムが互いに対して角度を付けられて、それらが、照射されたサンプルの同じ部分を、異なる角度からでもインターロゲートすることを可能にする(これは、角度が第2の検出システムについて知られている限り、困難でない);または
(f)サンプルからの光路が分割され、1つの部分が、NTAのためにCCDなどへ通っており、他方の部分が、DLSのためにAPDなどへ通っている。この実施形態において、両方の検出システムの光路が、少なくとも最初は共通であることが暗示されている。例えば、光路は、共通の顕微鏡対物レンズの下流に位置するビームスプリッタによって分割され得る。分割は、2つの検出システム間で50:50であってもよいが、これは必須ではない。
典型的な実施形態において、DLSによって検出できない統計的に有意な数のより大きい粒子(例えば汚染物質または凝集体)を含有するサンプル、例えばタンパク質材料(比較的小さいDLSで検出可能な粒子である)が、サンプルセルを通過するレーザービームの経路に導入される。
NTAによって検出され、サイズ決定される各個々の粒子については、サイズを得た温度、Tおよび粒子をその温度で解析した溶媒の粘度、ηを認識していれば、DLS解析で、各粒子半径、rhから生じた理論的な二次自己相関曲線、g2(τ)を生成することが可能である。
g2(τ)=Ae−2Гτ
(式中、Г=q2Dtであり、
標準的なDLSと比較した粒径分布プロファイルの正確な推定値を得るためのNIWDLSおよびNTAの使用の実施例
それぞれ40nmおよび120nmの直径の2つの粒子集団(それぞれが、粒径分布における10%の標準偏差を示す)を含むシミュレートされたサンプルを、1000:1の数の比率で一緒に加えた。図4は、粒径分布(粒径(nm)に対する信号強度(任意単位))を示すグラフである。「実際の分布」は、図4において、一点鎖線(dash/dot/dash)プロットによって表される。
Claims (22)
- サブミクロン粒子を含むサンプルを解析する方法であって、ナノ粒子追跡解析によって、前記サンプル中の粒子のサイズおよび粒子の数についての第1の情報を決定する工程と;動的光散乱によって、前記サンプル中の粒子の平均粒径についての第2の情報を決定する工程と;動的光散乱によって得られる結果に対する前記検出された粒子の理論的影響を表す第3の情報を、前記第1の情報から決定する工程と;前記第3の情報を用いて前記第2の情報を調整して、平均粒径についての調整された情報を表す第4の情報を生成する工程とを含む方法。
- 前記第1および第2の情報が、同じサンプルから同時に得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルが、液体中の固体粒子の懸濁液または他の分散体を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記サンプルが、好適に集束された放射線ビーム、典型的にレーザービームによって照射される、請求項1、2または3に記載の方法。
- 前記第1の情報が、粒子の輝度/スペクトル特性についての情報をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の情報が、粒径分布についての情報もさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の情報および前記第2の情報が、それぞれの検出システムを用いて得られる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の情報が、前記検出された粒径の1つ以上についての理論的相関曲線または関数を生成するのに使用される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記相関関数が、サイズで重み付けされ、より大きい粒子には、より大きい重みが与えられる、請求項8に記載の方法。
- 異なる粒径についての前記相関関数が合計される、請求項8または9に記載の方法。
- 前記第1の情報が、各検出された粒子によって散乱される光の相対量についての情報を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが、タンパク質を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが、蛍光性の粒子を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子が、ユーザが印加した外部電場および/または磁場に曝されながら、前記第1および/または第2の情報が得られる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法を行うように適合され、構成された装置であって:
前記サンプルを照射するために好適に集束された放射線ビームを生成するための光源手段と;
NTAを用いて、前記第1の情報を得るための第1の検出システムと;
動的光散乱を用いて、前記第2の情報を得るための第2の検出システムと;
前記第1の情報から前記第3の情報を決定するようにプログラムされたデータ処理手段と
を含む装置。 - 前記データ処理手段が、前記第3の情報を用いて前記第2の情報を調整して、第4の情報を生成するようにさらにプログラムされる、請求項15に記載の装置。
- 前記第1および第2の検出システムが、空間的に共通であり、かつ時間的に共通である、請求項15または16に記載の装置。
- 前記第1および第2の検出システムが、空間的に共通であるが、時間的に異なる、請求項15または16に記載の装置。
- 前記第1および第2の検出システムが、空間的に異なるが、時間的に共通である、請求項15または16に記載の装置。
- 前記第1および第2の検出システムに共通の1つ以上の構成要素が存在する、請求項15〜18のいずれか一項に記載の装置。
- 実質的に上述されるとおりである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 実質的に上述されるとおりである、請求項15〜20のいずれか一項に記載の装置。
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