JP2014521492A - Injection filler (filler) {INJECTABLEFILLER} - Google Patents

Abstract

システム及び方法は、下記の目的で公開される。
・ヘテロ多糖類を架橋して単一架橋材料を形成することで、相互貫通高分子網目（ＩＰＮ）を有する生体適合性の架橋高分子を形成する
・単一架橋材料に加えて追加の架橋を行って多重架橋材料を形成する。その中に、多重架橋材料は、単一架橋材料より、人体内で生分解に耐える１つ以上のＩＰＮ領域を有し、１つ以上の単一架橋拡張がＩＰＮから広がる。また、ＩＰＮと拡張の組合せは、生分解耐性、柔らかな肌触り、体内に導入する容易さを提供する。
【選択図】図１The system and method are published for the following purposes.
• Crosslink heteropolysaccharides to form a single cross-linked material to form a biocompatible cross-linked polymer with an interpenetrating polymer network (IPN) • Additional cross-links in addition to the single cross-linked material To form a multiple cross-linked material. Among them, multiple cross-linked materials have one or more IPN regions that resist biodegradation in the human body than single cross-linked materials, and one or more single cross-linked extensions extend from the IPN. The combination of IPN and expansion also provides biodegradation resistance, soft touch and ease of introduction into the body.
[Selection] Figure 1

Description

本出願は、２０１１年１１月１１日に出願された仮出願第６１／５５８６６９号、２０１１年１１月２２に出願された実用出願第１３３０１７８５号に基づく優先度を主張し、当該出願に記載された全ての記載内容を援用するものである。     This application claims priority based on provisional application No. 61/558669 filed on November 11, 2011 and utility application No. 13301785 filed on November 22, 2011, and was described in that application. All the descriptions are incorporated.

本発明は、生体適合性粘弾性ポリマーゲルスラリー、それらの調製法及びそれらを含有する製剤に関する。   The present invention relates to biocompatible viscoelastic polymer gel slurries, methods for their preparation and formulations containing them.

人の年齢としては、顔面脂肪の損失と肌の弾力性の低下に応じて、顔のしわや折り目が発展していく。医師たちは、長年にわたって、顔の軟部組織の顔のボリュームの損失を戦うために、様々な方法および材料を試してきた。最も一般的な方法の一つは自家脂肪転送というものである。この外科手技を用いて、人自身の脂肪は腹部など身体の別の部分から採取された後、その脂肪が処理され、しわや折り目を減らしてより若々しい外見を遂げるようにボリュームの復元を要求している顔の皮膚及び軟部組織領域に注射するために用意される。自家脂肪転送は良好且つ望ましい結果をもたらすが、病人にとって高価で、痛みを伴う、時間が係る、回復時間も長い、いずれの外科手術に伴う合併症と関連している手術法である。   As the age of a person, wrinkles and creases in the face develop according to the loss of facial fat and the decrease in skin elasticity. For many years, doctors have tried various methods and materials to combat the loss of facial volume of facial soft tissue. One of the most common methods is autologous fat transfer. Using this surgical technique, the person's own fat is collected from other parts of the body, such as the abdomen, and then processed to restore the volume so that it has a more youthful appearance by reducing wrinkles and folds. Prepared for injection into the requested facial skin and soft tissue areas. Autologous fat transfer provides good and desirable results, but is a surgical procedure that is expensive for the sick, painful, time consuming, has a long recovery time and is associated with complications associated with any surgical procedure.

本発明は、従来のこのような問題点を解決する装置を提供することを目的とする。   An object of the present invention is to provide a conventional apparatus for solving such problems.

以下はいくつかの詳細な態様である。   The following are some detailed aspects.

Ｉ ． 連続架橋結合
ＩＩ． ＨＡ 分子量マニピュレーション
ＩＩＩ． 遊離基捕捉剤：ビタミン、酵素やその類
ＩＶ． 抗ヒアルロニダーゼと抗エラスターゼ
連続架橋結合
一態様において、各システムと各方法は、下記向けに最適化された架橋結合ＨＡを使って、軟部組織の美容増強のために開示される。 I. Continuous cross-linking II. HA molecular weight manipulation III. Free radical scavengers: vitamins, enzymes and the like
IV. Anti-hyaluronidase and anti-elastase
Continuous cross-linking
In one aspect, each system and method is disclosed for soft tissue cosmetic enhancement using cross-linked HA optimized for:

１． 商品配送の安易さ
２． 局部組織準拠
３． インプラント素材の移動を制御するためのより大きな凝集性
４． 生物分解プロファイル
独特な架橋ＨＡ、およびそれらの更なる架橋による架橋ＨＡの相互貫通網目（ＩＰＮ）の領域を形成することによる架橋の使用。ＩＰＮ構造は、この架橋結合ＨＡに対し、この美容増強出願のみに向けのこれらのユーティリティを提供する。ＩＰＮコア（タピオカボールと想像）は人間の体内では、同じ架橋結合レベルのために正常化される単一架橋結合素材よりも生分解への抵抗が強い。その上、連続的にコアから放射に変化させるさまざまな物理的性質はポリマーを丈夫にし、より良い組織・デバイスの生体適合性のために同時に局部組織に準拠し、手触りがより自然に感じられる。 1. Easy product delivery 2. Local organization compliance Greater cohesion to control the movement of implant material
4). Biodegradation profile
Use of cross-links by forming unique cross-linked HAs and regions of cross-linked HA (IPN) of cross-linked HA by their further cross-linking. The IPN structure provides these utilities for this cross-linking HA only for this cosmetic enhancement application. The IPN core (imagined as tapioca balls) is more resistant to biodegradation in the human body than a single cross-linked material that is normalized for the same level of cross-linking. In addition, the various physical properties that continuously change from core to radiation make the polymer rugged and conform to local tissue at the same time for better tissue and device biocompatibility, making the hand feel more natural.

上記のＨＡ架橋結合方法は、ポリマーへの局部組織の反応を調整するには医薬物質を制御する必要がある特定の場合に、美容増強のために最適化された。医薬成分は多相混合物を他の相と一緒に調合して架橋結合ＨＡポリマーを形成する。   The HA cross-linking method described above has been optimized for cosmetic enhancement in certain cases where the drug substance needs to be controlled to tailor the local tissue response to the polymer. The pharmaceutical ingredient is compounded with the other phases to form a cross-linked HA polymer.

上記態様の実施は以下の一つ以上を含むであろう。システムは生体適合性があり、規制医薬品が主要整理学的事象と同時に戦略的タイミングに解放されるようにする。例えば、遅滞なく速やかな薬物放出プロファイルは、外科手術と関連する患者が経験する激しい痛みを緩和するように、リドカイン等のような麻酔薬の制御放出に適しているだろう。システムは、生理学的炎症性異物反応と同時に起きるために、デキサメタゾン又はトリアムシノロン等、コルチコステロイド又はステロイドの媒体放出プロファイル及び媒体遅延でもある。システムは、コントロール不良 治癒及びパクリタキセル、シロリムス、５−フルオロウラシル等のような抗増殖剤の放出を開始する前に放出プロファイル及びより長い遅延を遅らせる媒体を持つようにカスタマイズされ、醜い瘢痕形成又はカプセル形成を引き起こすコントロール不良治癒と過剰リモデリングを停止する。   Implementations of the above aspects will include one or more of the following. The system is biocompatible and ensures that regulated medicines are released at strategic timing simultaneously with major organizational events. For example, a rapid drug release profile without delay may be suitable for controlled release of anesthetics such as lidocaine so as to relieve severe pain experienced by patients associated with surgery. The system is also a media release profile and media delay for corticosteroids or steroids, such as dexamethasone or triamcinolone, to coincide with a physiological inflammatory foreign body reaction. The system is customized to have an uncontrolled healing and media to delay the release profile and longer delay before initiating the release of antiproliferative agents such as paclitaxel, sirolimus, 5-fluorouracil, etc. Stop poor control healing and excessive remodeling.

１． 分子量マニピュレーション
本発明の別の態様は、生分解プロファイルの最適化及び様々な種類の分子量のマニピュレーションを貫くインプラント材料の移動制御のための方法が含まれる。システムは生分解プロファイルを最適化し、インプラント材料の移動を制御する。システムは、生分解プロファイルをｈｙｐｅｒｖｏｌｕｍｉｃ からｉｓｏｖｏｌｕｍｉｃ（等容性） そしてｈｙｐｏｖｏｌｕｍｉｃ に最適化するように、Ｍｎ、Ｍｗ、Ｍｚ等のような分子量の様々な種類とその---多分散性指数（ＰＤＩ）の周りに公式化することができる。 1. Molecular weight manipulation
Another aspect of the present invention includes a method for optimizing biodegradation profiles and controlling the movement of implant materials through various types of molecular weight manipulations. The system optimizes the biodegradation profile and controls the movement of the implant material. The system optimizes the biodegradation profile from hypervolume to isovolumetric and isovolumetric, and various types of molecular weights such as Mn, Mw, Mz etc. and their polydispersity index (PDI) Can be formulated around.

２． フリーラジカル捕捉剤のビタミンや酵素
体内のＨＡは酸化と加水分解という２つの主な機構によって生分解される。これらの機構は、哺乳類の細胞内では、ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｓｅ）、ＢＤ−グルクロニダーゼ、β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼという３つの酵素によるの酵素加水分解であり、細胞外では、酸素由来のフリーラジカル（時には活性酸素種（ＲＯＳ）とも呼ばれる）によるの酸化である。これらは、電子の奇数（不対原子）の原子又は原子のグループであり、酸素が特定の分子と相互作用することにより形成され得る。 2. Free radical scavenger vitamins and enzymes
HA in the body is biodegraded by two main mechanisms: oxidation and hydrolysis. These mechanisms are enzymatic hydrolysis by three enzymes, namely hyaluronidase (hyase), BD-glucuronidase, and β-N-acetyl-hexosaminidase, in mammalian cells. Oxidation by radicals (sometimes also called reactive oxygen species (ROS)). These are an odd number of electrons (unpaired atoms) or a group of atoms, which can be formed by the interaction of oxygen with specific molecules.

ＲＯＳは細胞代謝の正常な生成物として生成される。特に、酸化的障害に繋がる主な要因の１つは、ミトコンドリアから漏れた超酸化物から変換された過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）である。カタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼは、これらの合成物を良性の分子とした酸素と水に変換することで、過酸化水素とスーパーオキシドの損傷効果をこれらの化合物に変換することによって良性分子を過酸化水素とスーパーオキシドの障害効果を向上させる。しかし、この変換は効率１００％とならなく、残留過酸化物が細胞内で保持される。ＲＯＳは、正常な細胞機能の生産物として生産されているが、過剰な量は、有害な影響を引き起こす可能性がある。記憶力は、酸化的損傷の蓄積を伴ったアルツハイマー病などのような人間変性疾患で明らに見えるように、加齢とともに低下していく。酸化的損傷が老化の一員であるため、ＲＯＳの蓄積が生物の適応度を低下する可能性があることは現在の研究で証明されている。特に、年取ったネズミがミトコンドリアの代謝産物そして認知テストを与えられた研究で実証されたように、 酸化的損傷の蓄積が認知機能障害につながる可能性がある。その結果によると、代謝産物を受けた後のネズミの行動がより良くなるようにでき、代謝産物が酸化的損傷を低下し、ミトコンドリア機能を向上させたことを示唆している。酸化的損傷の蓄積はその後ミトコンドリアの効果に影響を与え、さらにＲＯＳ生産の割合を亢進することができる。酸化的損傷の蓄積と、老化に対するその影響は、損傷が発生した特定の組織型によって異なる／次第です。更なる実験の結果は、酸化的損傷が脳機能における加齢に伴う低下に関与することを示唆している。年取ったスナネズミは、子スナネズミと比べれば酸化タンパク質がより高いレベルを持っていることが分かった。スピントラッピング化合物で年取ったスナネズミと子スナネズミに対する治療の結果、年取ったスナネズミには、酸化タンパク質のレベルを減少したが、子スナネズミには効果がなかった。その上、年取ったスナネズミは治療中は認知タスクに対する能力が向上してきたが、治療を中止すると、機能的能力もなくなってしまった。 ROS is produced as a normal product of cellular metabolism. In particular, one of the main factors leading to oxidative damage is hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) converted from superoxide leaking from mitochondria. Catalase and superoxide dismutase convert these compounds to oxygen and water, which are benign molecules, and convert the benign molecules to hydrogen peroxide by converting the damage effect of hydrogen peroxide and superoxide into these compounds. And improve the superoxide's obstacle effect. However, this conversion is not 100% efficient and residual peroxide is retained in the cell. ROS is produced as a product of normal cell function, but excessive amounts can cause deleterious effects. Memory power decreases with age, as is apparent in human degenerative diseases such as Alzheimer's disease with accumulating oxidative damage. Since oxidative damage is a member of aging, current studies have shown that ROS accumulation can reduce the fitness of an organism. In particular, the accumulation of oxidative damage can lead to cognitive impairment, as demonstrated in studies where older mice were given mitochondrial metabolites and cognitive tests. The results suggest that mice can behave better after receiving metabolites, suggesting that metabolites have reduced oxidative damage and improved mitochondrial function. The accumulation of oxidative damage can subsequently affect mitochondrial effects and further increase the rate of ROS production. The accumulation of oxidative damage and its effect on aging depends / depends on the specific tissue type in which the damage occurred. Results from further experiments suggest that oxidative damage is involved in aging-related declines in brain function. Older gerbils were found to have higher levels of oxidized protein compared to gerbils. Treatment of gerbils and gerbils aged with spin trapping compounds resulted in decreased levels of oxidized protein in older gerbils, but no effect on gerbils. Moreover, older gerbils have improved their ability to cognitive tasks during treatment, but when they stopped treatment they lost their functional ability.

さらに、一旦これらの反応性の高いラジカルが形成されたら連鎖反応を開始することができる。
ＤＮＡや細胞膜などのような重要な細胞成分と反応したときに発生させる損傷はそれらの主な危険につながる。これが発生した場合、細胞が不十分に働きたり、死んだりするかもしれない。体は、フリーラジカル損傷を防止するために、抗酸化物質の防御体制を有している。フリーラジカルと抗酸化物質は早速且つ簡単に反応する。 Furthermore, once these highly reactive radicals are formed, the chain reaction can be initiated.
Damage caused when reacting with important cellular components such as DNA and cell membranes leads to their main danger. If this happens, the cells may work poorly or die. The body has an antioxidant defense system to prevent free radical damage. Free radicals and antioxidants react quickly and easily.

ＨＡの酸素由来のフリーラジカルによる分解反応は、滑液中のＨＡを用いた研究の結果であった。ＨＡはスーパーオキシドのフリーラジカルによって安易に分解されたことを示している。この反応は第２級フリーラジカルの場合には最も好ましい。好中球（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ−多形核白血球）が酸素由来のフリーラジカルの種類を生産し、ＨＡ分子を摂取できるようにする。これらのＷＢＣｓ（白血球）は、酸素由来のフリーラジカルの機構での、はるかにＨＡの排他的破壊者である。従って、本発明の１つの態様は、フリーラジカルが抗酸化ビタミン等のようなフリーラジカル捕捉剤を用いてＨＡを分解する前に、フリーラジカルの効果を抑制する。   The decomposition reaction of HA with oxygen-derived free radicals was the result of studies using HA in synovial fluid. HA indicates that it was easily decomposed by free radicals of superoxide. This reaction is most preferred in the case of secondary free radicals. Neutrophils (polymorphonuclear leukocytes) produce oxygen-derived free radical species that can ingest HA molecules. These WBCs (leukocytes) are far more exclusive destroyers of HA, with the mechanism of oxygen-derived free radicals. Thus, one aspect of the present invention suppresses the effects of free radicals before the free radicals decompose HA using free radical scavengers such as antioxidant vitamins.

抗酸化剤は、癌や老化や種々の疾患につながる共通経路とする細胞損傷の防止に密接に関連している。抗酸化物質は、安全にフリーラジカルと相互作用し、重要な分子が損傷される前に連鎖反応を終了させることができる分子である。体内にフリーラジカルを捕捉するいくつかの酵素系があるにもかかわらず、微量栄養素（ビタミン）の抗酸化物質がビタミンＥ、ベータカロチンであり、ＨＡの場合、ビタミンＣであるという原理は例外とされる。さらに、身体の抗酸化酵素システムの一つの適切な機能に必要な微量金属というセレンは、時にはこのカテゴリに含まれる。身体自身は微量栄養素を製造できないため、食事に供給されなければならない。   Antioxidants are closely related to the prevention of cell damage as a common pathway leading to cancer, aging and various diseases. Antioxidants are molecules that can interact safely with free radicals and terminate chain reactions before important molecules are damaged. Despite the presence of several enzyme systems that trap free radicals in the body, the principle that the antioxidants of micronutrients (vitamins) are vitamin E, beta carotene, and HA is vitamin C is an exception. Is done. In addition, selenium, a trace metal required for one proper function of the body's antioxidant enzyme system, is sometimes included in this category. Because the body itself cannot produce micronutrients, it must be supplied to the diet.

以下は、例の抗酸化ビタミン、それぞれの役割及び１日当たりの推奨投与量である。   The following are example antioxidant vitamins, their roles and recommended daily doses.

ビタミンＥ：ｄ−アルファトコフェロールはナッツ、種子、植物油、魚油全、全粒穀物（特に小麦胚芽）、強化穀物、アプリコットの中に存在する脂溶性ビタミンである。一日の推奨摂取量（ＲＤＡ）は、男性は１５ＩＵで、女性は１２ＩＵである。   Vitamin E: d-alpha tocopherol is a fat-soluble vitamin present in nuts, seeds, vegetable oils, whole fish oil, whole grains (especially wheat germ), fortified grains and apricots. Recommended daily intake (RDA) is 15 IU for men and 12 IU for women.

ビタミンＣ：ＨＡの長寿に有害である場合以外では、ビタミンＣはアスコルビン酸で、かんきつ類とそのジュース、ピーマン、キャベツ、ほうれん草、ブロッコリー、ケール、マスクメロン、キウイ、イチゴの中に存在する水溶性ビタミンである。ＲＤＡは、一日あたり６０ミリグラムである。 ２０００ｍｇより上の摂取量は人によっていくつかの副作用を伴う可能性がある。   Vitamin C: Except when harmful to the longevity of HA, vitamin C is ascorbic acid, a water-soluble vitamin present in citrus and its juices, peppers, cabbage, spinach, broccoli, kale, muskmelon, kiwi and strawberries It is. RDA is 60 milligrams per day. Ingestion above 2000 mg may have some side effects depending on the person.

ビタミンＡ：ベータカロチンは、ビタミンＡの前駆体（レチノール）で、肝臓、卵黄、牛乳、バター、ほうれん草、ニンジン、カボチャ、ブロッコリー、山芋、トマト、カンタループ、桃、穀物の中に存在する。ベータカロチンは体内でビタミンＡに変換されるので特に要件がないである。代わりに、ＲＤＡは、関係を明確にするために、レチノール当量（ＲＥ）として表される。（注：ビタミンＡは抗酸化特性を有しなく、過剰に服用するとかなり有毒になることがある）
グルタチオン：（ＧＳＨ）は、グリシンに垂直なペプチド結合によって結合されているシステインのアミン基とグルタミン酸側鎖のカルボキシル基との間のガンマペプチド結合を有するペプチドである。これは、フリーラジカルや過酸化物などの活性酸素種により引き起こされる重要な細胞成分の損傷を防止する抗酸化剤である。チオール基は、動物細胞では約５ｍＭの濃度で存在する還元剤である。グルタチオンは電子供与体として機能することでシステインに細胞質タンパク質内に形成されたジスルフィド結合を還元する。このプロセスでは、グルタチオンは、Ｌ（−）−Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ （Ｌ（−）−グルタチオン）とも呼ばれるグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）というその酸化型に変換される。 Vitamin A: Beta carotene is a precursor of vitamin A (retinol) and is present in liver, egg yolk, milk, butter, spinach, carrot, pumpkin, broccoli, yam, tomato, cantaloupe, peach, and cereal. Beta carotene is not particularly required because it is converted to vitamin A in the body. Instead, RDA is expressed as retinol equivalent (RE) to clarify the relationship. (Note: Vitamin A has no antioxidant properties and can be quite toxic if taken excessively)
Glutathione: (GSH) is a peptide having a gamma peptide bond between the amine group of cysteine and the carboxyl group of the glutamic acid side chain that are linked by a peptide bond perpendicular to glycine. This is an antioxidant that prevents damage to important cellular components caused by reactive oxygen species such as free radicals and peroxides. Thiol groups are reducing agents that are present in animal cells at a concentration of about 5 mM. Glutathione functions as an electron donor to reduce the disulfide bond formed in the cytoplasmic protein to cysteine. In this process, glutathione is converted to its oxidized form, glutathione disulfide (GSSG), also called L (-)-Glutathione (L (-)-glutathione).

一旦酸化されたグルタチオンは、ＮＡＤＰＨを電子供与体として使用して、グルタチオン還元酵素によって再び還元される可能性がある。細胞内の酸化型グルタチオンの還元グルタチオンの比率は、しばしば細胞毒性の測定として使用される。   Once oxidized, glutathione may be reduced again by glutathione reductase using NADPH as an electron donor. The ratio of reduced glutathione to oxidized glutathione in the cell is often used as a measure of cytotoxicity.

尿酸：これは、人間における最も重要な血漿抗酸化物質、および化学式Ｃ５Ｈ４Ｎ４Ｏ３という炭素・窒素・酸素・水素の複素環化合物である。尿酸は、酸性尿酸アンモニウムなどのように尿酸塩と尿酸一ナトリウムとして知られているイオンと塩を形成する。尿酸はプリンヌクレオチドの代謝分解の生成物である。血液中の尿酸の高濃度は痛風として知られている、関節炎の一種に繋がることができる。化学物質は、糖尿病や酸性尿酸アンモニウムの腎臓結石の形成を含む他の医学的疾患と関連している。   Uric acid: This is the most important plasma antioxidant in humans and a carbon, nitrogen, oxygen, hydrogen heterocyclic compound of the formula C5H4N4O3. Uric acid forms a salt with ions known as urate and monosodium urate, such as acidic ammonium urate. Uric acid is a product of metabolic degradation of purine nucleotides. High concentrations of uric acid in the blood can lead to a type of arthritis known as gout. Chemicals are associated with other medical illnesses including diabetes and the formation of kidney stones of ammonium acid urate.

本発明の別の態様は、ＨＡの寿命を保護するための、抗酸化酵素の使用である。これらの酵素は、フリーラジカルを減少させ、ＲＯＳから防御することができます。それらは：α−１−ミクログロブリン、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ペルオキシレドキシンである。   Another aspect of the present invention is the use of antioxidant enzymes to protect the lifetime of HA. These enzymes can reduce free radicals and protect against ROS. They are: α-1-microglobulin, superoxide dismutase, catalase, lactoperoxidase, glutathione peroxidase, peroxiredoxin.

３． 抗ヒアルロニダーゼおよび抗エラスターゼ
架橋結合ＨＡを使用して老化皮膚に若々しさを取り戻すための美容増強の分野に関して、本発明の態様の一つは、ヒアルロニダーゼ阻害剤（抗ＨＡ）を使用して特にヒアルロニダーゼでＨＡの解重合を防止し、そしてＨＡの長寿を維持する。ＨＡの長寿の維持は望ましくないしわのできることと老化の兆候と直接に関連するため重要である。 3. Anti-hyaluronidase and anti-elastase
With respect to the field of cosmetic enhancement to rejuvenate aging skin using cross-linked HA, one aspect of the present invention is the depolymerization of HA with hyaluronidase inhibitors (anti-HA), particularly with hyaluronidase. And maintain the longevity of the HA. The maintenance of HA's longevity is important because it is directly related to wrinkling and signs of aging.

この地球に住んでいるすべてのものにとって、ＨＡは重要な分子である。この点で、それは、動物界中、特に軟部結合組織の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の中で発見される多機能の分解高分子量多糖類である。ＨＡは、多くの生物学的過程に関与し、そのレベルは、胚形成、細胞遊走、創傷治癒、悪性転換、組織代謝回転の間に著しく上昇すると考えられている。ＨＡ、ヒアルロニダーゼ（ＨＡａｓｅｓ）を分解する酵素は原核生物と真核生物の両方で表現されている。これらの酵素は、受精から老化まで、生理学的および病理学的過程に関わることが知られている。ＨＡのヒアルロニダーゼ媒介性分解は、結合組織の浸透性を増加させ、体液の粘度を低下させ、また細菌性病因、毒素・毒液の広がり、先体反応／卵子受精、癌の進行に関与している。さらに、これらの酵素は、病原体と宿主細胞表面との間の直接的な接触を促進することができる。 またＨＡの解重合はＥＣＭの役割に悪影響を及ぼし、シグナル伝達に関与する成長因子、サイトカイン、種々の酵素の保有宿主としての活動を弱める。従って、ＨＡ分解の阻害は、疾患（の）進行と毒素・毒液、細菌性病因の広がりを抑えるのに重要なこともしれない。ヒアルロニダーゼ阻害剤は、ＨＡの同化と異化のバランスを維持することに関与している強力で普遍的な調整液である。ヒアルロニダーゼ阻害剤は避妊薬と抗腫瘍剤として機能し、抗菌活性・抗毒液活性・抗毒素活性を及ぼす可能性があります。さらに、これらの分子はＨＡとヒアルロニダーゼの生理学的および病態生理学的役割を研究する薬理学的ツールとして使用することができる。   HA is an important molecule for everything living on this planet. In this regard, it is a multifunctional degrading high molecular weight polysaccharide found throughout the animal kingdom, particularly in the extracellular matrix (ECM) of soft connective tissue. HA is involved in many biological processes, and its levels are thought to rise significantly during embryogenesis, cell migration, wound healing, malignant transformation, and tissue turnover. The enzyme that degrades HA, hyaluronidase (HAases) is expressed in both prokaryotes and eukaryotes. These enzymes are known to be involved in physiological and pathological processes from fertilization to aging. Hyaluronidase-mediated degradation of HA increases connective tissue permeability, decreases fluid viscosity, and is involved in bacterial pathogenesis, toxin / venom spread, acrosome reaction / egg fertilization, cancer progression . In addition, these enzymes can facilitate direct contact between the pathogen and the host cell surface. Moreover, the depolymerization of HA adversely affects the role of ECM and weakens the activity as a host of growth factors, cytokines and various enzymes involved in signal transduction. Therefore, inhibition of HA degradation may be important in reducing disease progression and the spread of toxins / venoms and bacterial pathogenesis. Hyaluronidase inhibitors are powerful and universal regulators involved in maintaining the balance of HA assimilation and catabolism. Hyaluronidase inhibitors function as contraceptives and antitumor agents, and may have antibacterial, antitoxin and antitoxin activities. In addition, these molecules can be used as pharmacological tools to study the physiological and pathophysiological roles of HA and hyaluronidase.

ＨＡ分解におけるヒアルロニダーゼの機構は、一般的に下記５つステップに従う。   The mechanism of hyaluronidase in HA degradation generally follows the following five steps.

以下の表は、ヒアルロニダーゼ阻害剤の例を示す。 The following table shows examples of hyaluronidase inhibitors.

多重架橋ＨＡを直列に製造する模範的なシステムを示す。1 illustrates an exemplary system for producing multiple cross-linked HA in series. 多重架橋ＨＡを直列に製造する別の模範的なシステムを示す。Figure 3 shows another exemplary system for producing multiple cross-linked HA in series. 結果として得られる多重架橋ＨＡの模範的な図を示す。An exemplary diagram of the resulting multi-crosslinked HA is shown.

まず、ヒアルロン酸の準備が相談され、そして、皮膚又は皮下の使用のためのヒアルロン酸の使用を高める追加化学物質の追加が相談される。   First, the preparation of hyaluronic acid is consulted, and the addition of additional chemicals that enhance the use of hyaluronic acid for skin or subcutaneous use is consulted.

組換えバチルス細胞のヒアルロン酸が培地に直接表現されるので、簡単な処理は、培地からヒアルロン酸を単離するために使用することができる。まず、バチルス細胞及び細胞残屑は物理的に培地から除去される。必要に応じて媒体の粘度を低減するために、培地が最初に希釈されることもある。例えば、遠心分離または精密濾過等のように、培地から細胞を除去する多くの方法は、当業者によく知られている。必要に応じて、残りの上清は、ヒアルロン酸から小分子汚染物質を濃縮して除去するために、例えば、限外濾過などによって濾過される可能性がある。細胞と細胞残屑の除去に続いて、培地からのヒアルロン酸の簡単な沈殿は既知の機構によって実行される。塩、アルコール、又はその塩とアルコールの組み合わせは、濾液からヒアルロン酸を沈殿させるために使用することができる。一度沈殿物に還元されたら、ヒアルロン酸は容易に物理的手段により溶液から単離される可能性がある。ヒアルロン酸は、例えば凍結乾燥または噴霧乾燥などの当業者にはよく知られている蒸発技術を用いて、濾液溶液から乾燥又は濃縮させられることができる。
分子量
ヒアルロン酸の含有量は、修正カルバゾール法に従って決定されることができる（Ｂｉｔｔｅｒ と Ｍｕｉｒ， １９６２， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４： ３３０−３３４）。そのうえ、ヒアルロン酸の数平均分子量は、例えば、上野ら、１９８８、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ ． ３６， ４９７１−４９７５； Ｗｙａｔｔ， １９９３， Ａｎａｌ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ２７２： １−４０； Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， １９９９， “Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＤＡＷＮ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ” ａｎｄ “ＤＡＷＮ ＥＯＳ Ｍａｎｕａｌ” Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ， Ｃａｌｉｆなどによって記述されたように、当該技術分野において標準方法を用いて決定することができる。
一実施形態では、１つの実施形態のヒアルロン酸またはその塩は、約１０，０００〜約１０，０００，０００ Ｄａの分子量を有する。より好ましい実施形態では、約２５，０００〜約５，０００，０００Ｄａの分子量を有する。最も好ましい実施形態では、ヒアルロン酸は、約５０，０００〜約３，０００，０００ Ｄａの分子量を有する。 A simple treatment can be used to isolate the hyaluronic acid from the medium since the hyaluronic acid of the recombinant Bacillus cells is expressed directly in the medium. First, Bacillus cells and cell debris are physically removed from the medium. The medium may be diluted first to reduce the viscosity of the medium as needed. Many methods for removing cells from the culture medium, such as centrifugation or microfiltration, are well known to those skilled in the art. If necessary, the remaining supernatant may be filtered, such as by ultrafiltration, to concentrate and remove small molecule contaminants from hyaluronic acid. Following removal of cells and cell debris, simple precipitation of hyaluronic acid from the medium is performed by known mechanisms. A salt, alcohol, or a combination of the salt and alcohol can be used to precipitate hyaluronic acid from the filtrate. Once reduced to a precipitate, hyaluronic acid can be easily isolated from solution by physical means. Hyaluronic acid can be dried or concentrated from the filtrate solution using evaporation techniques well known to those skilled in the art, such as freeze drying or spray drying.
Molecular weight The content of hyaluronic acid can be determined according to a modified carbazole method (Bitter and Muir, 1962, Anal Biochem. 4: 330-334). Moreover, the number average molecular weight of hyaluronic acid is described in, for example, Ueno et al., 1988, Chem. Pharm. Bull. 36, 4971-4975; Wyatt, 1993, Anal. Chim. Acta 272: 1-40; Wyatt Technologies, 1999, “Light Scattering Universities”, “Methods such as“ DAWN EOS Manual ”,“ Wayt Technologies ”, and“ DAWN EOS Manual ”. Can be determined.
In one embodiment, the hyaluronic acid or salt thereof of one embodiment has a molecular weight of about 10,000 to about 10,000,000 Da. In a more preferred embodiment, it has a molecular weight of about 25,000 to about 5,000,000 Da. In the most preferred embodiment, the hyaluronic acid has a molecular weight of about 50,000 to about 3,000,000 Da.

他の実施形態では、ヒアルロン酸またはその塩は、３００，０００〜３，０００，０００の範囲内での分子量を有する。好ましいのは４００，０００〜２，５００，０００の範囲内であり、より好ましいのは５００，０００〜２，０００，０００の範囲であり、最も好ましいのは６００，０００〜１，８００，０００の範囲内である。   In other embodiments, the hyaluronic acid or salt thereof has a molecular weight within the range of 300,000 to 3,000,000. Preferred is in the range of 400,000 to 2,500,000, more preferred is in the range of 500,000 to 2,000,000, and most preferred is in the range of 600,000 to 1,800,000. Within range.

さらに別の実施形態において、ヒアルロン酸又はその塩は、１０，０００〜８００，０００ Ｄａの範囲の低い数平均分子量を有する。好ましいのは２０，０００〜６００，０００ Ｄａの範囲であり、より好ましいのは３０，０００ 〜５００，０００ Ｄａの範囲内であり、さらにより好ましいのは４０，０００〜４００，０００万Ｄａの範囲内であり、最も好ましいのは５０，０００〜３００，０００ Ｄａの範囲内である。   In yet another embodiment, hyaluronic acid or a salt thereof has a low number average molecular weight in the range of 10,000 to 800,000 Da. Preferred is in the range of 20,000 to 600,000 Da, more preferred is in the range of 30,000 to 500,000 Da, and even more preferred is in the range of 40,000 to 400,000 million Da. And most preferred is in the range of 50,000 to 300,000 Da.

実例
例１・エマルジョンにおけるＤＶＳ架橋結合微粒子の調製
この例では、ＤＶＳ架橋結合微粒子の調製を例示する。ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ、５８０ ｋＤａ １．９０ ｇ）は、室温で３時間、均質な溶液が得られるまで強く撹拌され、ＮａＯＨ水溶液（水酸化ナトリウム）（０．２ Ｍ、３７．５ｍＬ）で溶解させられた。塩化ナトリウム（０．２９ｇ）添加されて短い時間で混ぜられた。鉱油（１０．０ｇ）及びＡＢＩＬ（登録商標） ＥＭ ９０界面活性剤（Ｃｅｔｙｌ ＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ Ｄｉｍｅｔｈｉｃｏｎｅ， １．０ ｇ）は撹拌によって混合された。 Illustration
Example 1 Preparation of DVS cross-linked fine particles in emulsion
This example illustrates the preparation of DVS crosslinked fine particles. Sodium hyaluronate (HA, 580 kDa 1.90 g) was stirred vigorously at room temperature for 3 hours until a homogeneous solution was obtained and dissolved in aqueous NaOH (sodium hydroxide) (0.2 M, 37.5 mL) I was allowed to. Sodium chloride (0.29 g) was added and mixed in a short time. Mineral oil (10.0 g) and ABIL® EM 90 surfactant (Cetyl PEG / PPG-10 / 1 Dimethicone, 1.0 g) were mixed by stirring.

ジビニルスルホン（ＤＶＳ、３２０マイクロリットル）は、水性アルカリＨＡ溶液に添加され、液相で均一な分布を得るように１分間で混合された。次いで、水相は、低速で機械的に撹拌されることで油相に２分以内に添加された。エマルジョンは直ちに形成され、撹拌は室温で３０分間で継続された。エマルジョンは室温で夜通しで放置された。エマルジョンは、水溶液ＨＣｌ（４ Ｍ， 約２．０ｍＬ）を添加することによってｐＨ７．０に中和され、約４０分間撹拌された。   Divinyl sulfone (DVS, 320 microliters) was added to the aqueous alkaline HA solution and mixed for 1 minute to obtain a uniform distribution in the liquid phase. The aqueous phase was then added to the oil phase within 2 minutes by mechanical stirring at low speed. An emulsion formed immediately and stirring was continued for 30 minutes at room temperature. The emulsion was left overnight at room temperature. The emulsion was neutralized to pH 7.0 by adding aqueous HCl (4 M, about 2.0 mL) and stirred for about 40 minutes.

例２・ｐＨ指示薬使用の中和されたエマルジョンにおけるＤＶＳ架橋結合微粒子の調製
この例では、ｐＨ指示薬を用いた中和法でＤＶＳ−架橋結合微粒子の調製を例示する。ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ、５８０ ｋＤａ １．８８ ｇ）は、室温で２時間、均質な溶液が得られるまで強く撹拌され、ＮａＯＨ水溶液（水酸化ナトリウム）（０．２ Ｍ、３７．５ｍＬ）で溶解させられた。ブロモチモールブルーのｐＨ指示薬（６．６−６．８のｐＨ範囲相当）は添加された（１５滴、溶液中の青色）。塩化ナトリウム（０．２５ ｇ）が添加して短い時間で混ぜられた。 Example 2 Preparation of DVS cross-linked microparticles in a neutralized emulsion using a pH indicator
This example illustrates the preparation of DVS-crosslinked fine particles by a neutralization method using a pH indicator. Sodium hyaluronate (HA, 580 kDa 1.88 g) was stirred vigorously at room temperature for 2 hours until a homogeneous solution was obtained and dissolved in aqueous NaOH (sodium hydroxide) (0.2 M, 37.5 mL) I was allowed to. Bromothymol blue pH indicator (corresponding to a pH range of 6.6-6.8) was added (15 drops, blue in solution). Sodium chloride (0.25 g) was added and mixed briefly.

鉱油（１０．０ ｇ）およびＡＢＩＬ （登録商標） ＥＭ９０界面活性剤（セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン、１．０ｇ）は撹拌で混合された。   Mineral oil (10.0 g) and ABIL® EM90 surfactant (cetyl PEG / PPG-10 / 1 dimethicone, 1.0 g) were mixed with stirring.

ジビニルスルホン（ＤＶＳ、３２０マイクロリットル）は水性アルカリＨＡ溶液に添加され、液相で均一な分布を得るように３０〜６０秒間で非常に強く混合された。その後、水相は、機械的に４００ ＲＰＭで撹拌されることで、３０秒以内油相に添加された。エマルジョンは直ちに形成され、撹拌は室温で３０分間で継続された。中和は水溶液ＨＣＩ（４ Ｍ、１．６ｍｌ）を添加することにより行われ、エマルジョンは４時間の磁気撹拌で室温で放置した。ゲル粒子の中に含まれるｐＨ指示薬の色が緑に変わた。エマルションのｐＨは３−４のｐＨスティックで測定された。エマルションは夜通しで冷蔵庫に残された。ゲル粒子中に含まれるｐＨ指示薬は黄色に変わった。   Divinyl sulfone (DVS, 320 microliters) was added to the aqueous alkaline HA solution and mixed very vigorously in 30-60 seconds to obtain a uniform distribution in the liquid phase. The aqueous phase was then mechanically stirred at 400 RPM and added to the oil phase within 30 seconds. An emulsion formed immediately and stirring was continued for 30 minutes at room temperature. Neutralization was performed by adding aqueous HCI (4 M, 1.6 ml) and the emulsion was left at room temperature with magnetic stirring for 4 hours. The color of the pH indicator contained in the gel particles changed to green. The pH of the emulsion was measured with a 3-4 pH stick. The emulsion was left in the refrigerator overnight. The pH indicator contained in the gel particles turned yellow.

例３・エマルジョンの相分離及び微粒子の膨潤・単離
この例では、Ｗ／Ｏエマルション（油中水滴型エマルション）の切断、そして相分離と透析について例示する。架橋結合ＨＡ微粒子は有機溶媒抽出によってＷ／Ｏエマルションから分離された。Ｗ／Ｏエマルション（５ ｇ）はｎ−ブタノール／クロロホルムの混合物（１／１ ｖ％ ４．５ｍＬ）と共に、室温で試験管の中での旋回混合によって強く混合された。余分なＭＱ−水（２０ｍｌ）を添加されて相分離を得た。試験管が遠心分離され、有機相の下相、ゲル粒子の中相、透明な水溶液の上相という３つの相が得られた。上相と下相は廃棄され、ゲル粒子の中相は透析管（ＭＷＣＯ１２−１４，０００、直径２９ｍｍ、体積／長さ６．４ｍｌ／ｃｍ）の中に移した。試料はＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水で室温で夜通しで透析された。透析液はさらに２回変更され、夜通しで放置された。得られたゲルは厚くて粘性で、０．００４ ｇ ＨＡ／ｃｍ^３相当約５０ｍの体積に膨潤されていた。 Example 3 Phase separation of emulsion and swelling / isolation of fine particles
This example illustrates the cutting of W / O emulsion (water-in-oil emulsion) and the phase separation and dialysis. Cross-linked HA microparticles were separated from the W / O emulsion by organic solvent extraction. The W / O emulsion (5 g) was mixed vigorously with a mixture of n-butanol / chloroform (1/1 v% 4.5 mL) by swirling in a test tube at room temperature. Extra MQ-water (20 ml) was added to obtain phase separation. The test tube was centrifuged to obtain three phases: the lower phase of the organic phase, the middle phase of the gel particles, and the upper phase of the clear aqueous solution. The upper and lower phases were discarded and the middle phase of the gel particles was transferred into a dialysis tube (MWCO 12-14,000, diameter 29 mm, volume / length 6.4 ml / cm). Samples were dialyzed overnight at room temperature with MilliQ® water. The dialysate was changed two more times and left overnight. The resulting gel was thick and viscous and swollen to a volume of about 50 m, equivalent to 0.004 g HA / cm ³ .

例４・エマルジョン内のＤＶＳ架橋結合の調製及び微粒子の分離
この例では、ＤＶＳ架橋結合ＨＡ微粒子の調製を例示する。ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ、５８０ ｋＤａ、１．８９ ｇ）はＮａＯＨ水溶液（０．２ Ｍ３７．５ｍＬ）で溶解させられた。塩化ナトリウム（０．２５ ｇ）が添加され、均質な溶液が得られるまでその溶液を室温で１時間で磁気撹拌した。ＴＥＧＯＳＯＦＴ（登録商標） Ｍ（１０．０ ｇ）油及びＡＢＩＬ（登録商標） ＥＭ ９０界面活性剤（セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン、１．０ｇ）は撹拌で混合された。 Example 4 Preparation of DVS crosslinks in emulsion and separation of microparticles
This example illustrates the preparation of DVS cross-linked HA microparticles. Sodium hyaluronate (HA, 580 kDa, 1.89 g) was dissolved in aqueous NaOH (0.2 M 37.5 mL). Sodium chloride (0.25 g) was added and the solution was magnetically stirred at room temperature for 1 hour until a homogeneous solution was obtained. TEGOSOFT® M (10.0 g) oil and ABIL® EM 90 surfactant (cetyl PEG / PPG-10 / 1 dimethicone, 1.0 g) were mixed with stirring.

ジビニルスルホン（ＤＶＳ、３２０マイクロリットル）はで水性アルカリＨＡ溶液に添加され、液相で均一な配布を得るように１分間で混合された。次いで、水相は、機械的に撹拌される（３００ ＲＰＭ）ことで油相に２分以内に添加された。エマルジョンが直ちに形成され、撹拌は室温で３０分間で継続された。   Divinyl sulfone (DVS, 320 microliters) was added to the aqueous alkaline HA solution and mixed for 1 minute to obtain a uniform distribution in the liquid phase. The aqueous phase was then added to the oil phase within 2 minutes by mechanical stirring (300 RPM). An emulsion formed immediately and stirring was continued for 30 minutes at room temperature.

エマルジョンは、当量のＨＣＩ（４ Ｍ、１．８ｍＬ）を添加して約４０分間で撹拌することで中和された。エマルジョンは、ｎ−ブタノール／クロロホルムの混合物（１／１ ｖ％ ９０ｍＬ）及び余分のＭｉｌｌｉＱ（登録商標）−水 （１００ｍＬ）を添加してから磁気撹拌することによって壊された。上相は約１７５ｍｌの体積に分離れた。有機相は最終洗浄としてｍＱ水（３０ｍｌ）と一緒に混合された。結合の水／ゲル相（２０５ｍＬ）を透析管（ＭＷＣＯ１２−１４，０００、直径２９ ｍｍ、体積／長さ６．４ｍＬ／ｃｍ）に移され、室温でＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水に対して夜通しで透析された。導電率は、水の後の変更（３回）及び夜通しの透析（２夜）の後、０．６７ ｍｉｃｒｏ−Ｓｉｅｖｅｒｔ／ｃｍに減少した。微粒子は顕微鏡法（ＤＩＣ ２００倍）により評価された。図１を参照してください。１つの微粒子の断面が“２１，５８７．９２ｎｍ“として示され、標識された。   The emulsion was neutralized by adding an equivalent amount of HCI (4 M, 1.8 mL) and stirring for about 40 minutes. The emulsion was broken by adding n-butanol / chloroform mixture (1/1 v% 90 mL) and extra MilliQ®-water (100 mL), followed by magnetic stirring. The upper phase was separated into a volume of about 175 ml. The organic phase was mixed with mQ water (30 ml) as a final wash. The combined water / gel phase (205 mL) was transferred to a dialysis tube (MWCO 12-14,000, 29 mm diameter, volume / length 6.4 mL / cm) and overnight against MilliQ® water at room temperature. Dialyzed. The conductivity decreased to 0.67 micro-Sievert / cm after subsequent changes in water (3 times) and overnight dialysis (2 nights). The microparticles were evaluated by microscopy (DIC 200x). Refer to Figure 1. The cross section of one microparticle was shown and labeled as “21,587.92 nm”.

例５・エマルションの相分離及び微粒子の単離
この例では、Ｗ／Ｏエマルション（油中水滴型エマルション）の破損及びゲル微粒子の単離を例示する。ゲル微粒子を有機溶媒抽出法によってＷ／Ｏエマルションから分離された。この抽出に使用した有機溶媒の例は、それぞれ７５：２０ 〜２０．８０の体積比（ｖ％）でのブタノール／クロロホルムの混合物である。Ｗ／Ｏエマルションと有機溶媒との重量比（ｗ％）は約１：１となる。
小規模での分離：Ｗ／Ｏエマルション（５ｇ）はを遠心分離管（５０ｍＬ）で秤量された。ブタノール／クロロホルムの混合物が調製され（１：１ ｖ％）、この中から４．５ｍＬ（５ｇ相当）の混合物を試験管に添加された。エマルション全体が溶解されたことを確保するために試験管が慎重に混合された。試験管が旋回混合により混合され、相分離のために室温で放置された。水相の上相、エマルション相の中相、有機相の下相のある相分離はしばしば観察された。より多くの水相と有機相の添加は分離を向上させる。水相は上澄みの液を静かに移すことで分離され、更に精製され、又は特徴付けられた。 Example 5 Phase separation of emulsion and isolation of fine particles
This example illustrates the failure of a W / O emulsion (water-in-oil emulsion) and the isolation of gel particles. Gel particles were separated from the W / O emulsion by organic solvent extraction. An example of an organic solvent used for this extraction is a butanol / chloroform mixture in a volume ratio (v%) of 75:20 to 20.80, respectively. The weight ratio (w%) between the W / O emulsion and the organic solvent is about 1: 1.
Small scale separation: The W / O emulsion (5 g) was weighed in a centrifuge tube (50 mL). A butanol / chloroform mixture was prepared (1: 1 v%), from which 4.5 mL (5 g equivalent) of the mixture was added to the test tube. The test tube was carefully mixed to ensure that the entire emulsion was dissolved. The test tube was mixed by swirl mixing and left at room temperature for phase separation. Phase separation with an upper phase of the aqueous phase, a middle phase of the emulsion phase, and a lower phase of the organic phase was often observed. The addition of more aqueous and organic phases improves the separation. The aqueous phase was separated by decanting the supernatant and further purified or characterized.

例６・Ｗ／Ｏエマルション（油中水滴型エマルション）の調製
この例ではＨＡ微粒子が形成された組成物を例示する。 Example 6 Preparation of W / O emulsion (water-in-oil emulsion)
In this example, a composition in which HA fine particles are formed is illustrated.

熱油相の中に冷たい水相Ｂを取り込んむ冷温手順は使用でき、製造時間が短くなります。公式化の非限定例は、次のとおりである。   A cold temperature procedure that incorporates the cold aqueous phase B into the hot oil phase can be used, reducing manufacturing time. Non-limiting examples of formulation are as follows:

Ａ相：
２．０％ ＡＢＩＬ（登録商標） ＥＭ ９０ （セチル ＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコーン）
２０．０％ 鉱油 （又は ＴＥＧＯＳＯＦＴ（登録商標） Ｍ）
Ｂ相：
０．５％塩化ナトリウム
３．８％ヒアルロン酸
０．２ Ｍ ＮａＯＨ （水溶液） 最大１００％まで
Ｃ相：
約 ０．６％ジビニルスルホン
調製：
１ ． Ａ相を室温で混合する。 Phase A:
2.0% ABIL® EM 90 (cetyl PEG / PPG-10 / 1 dimethicone)
20.0% mineral oil (or TEGOSOFT (registered trademark) M)
Phase B:
0.5% sodium chloride
3.8% hyaluronic acid
0.2 M NaOH (aqueous solution) up to 100%
Phase C:
About 0.6% divinyl sulfone
Preparation:
1. Mix Phase A at room temperature.

２ ． Ｂ相：ヒアルロン酸（Ｈｙａｃａｒｅ（登録商標））をＮａＯＨ水溶液の中で撹拌で可溶化し、ＮａＣｌを添加して撹拌する。   2. Phase B: Hyaluronic acid (Hyacare®) is solubilized in aqueous NaOH with stirring, NaCl is added and stirred.

３ ．相ＢにＤＶＳを添加して１分間で撹拌する。   3. Add DVS to Phase B and stir for 1 minute.

４ ．相Ｂをゆっくりと相Ａに添加しながら撹拌する。   4. Stir while slowly adding Phase B to Phase A.

５ ．短時間で均質にする、或いは撹拌してから反応させるためにそのまま放置する。   5. Homogenize in a short time, or leave as it is to stir and react.

６ ．撹拌と膨潤。   6. Agitation and swelling.

７ ． ３０℃ 未満の状態で撹拌を続ける。   7. Continue stirring at a temperature below 30 ° C.

８ ．中和する。   8. Neutralize.

例７・ＤＶＳ架橋結合微粒子の調製及び分離
ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ、５８０ ｋＤａ、１．８８ ｇ）はＮａＯＨ水溶液（０．２ Ｍ、３７．５ｍＬ）の中で溶解させられた。塩化ナトリウム（０．２５ ｇ）が添加され、均質な溶液が得られるまでその溶液を室温で１時間で磁気撹拌した。ＴＥＧＯＳＯＦＴ（登録商標） Ｍ （１０．０ ｇ）の油及びＡＢＩＬ（登録商標） ＥＭ ９０ （セチル ＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコーン、１．０ ｇ）の界面活性剤は撹拌で混合された。ジビニルスルホン（ＤＶＳ， ３２０ ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）は水性アルカリＨＡ溶液に添加され、液相で均一な分布を得るように１分間で混合された。次いで、水相は、機械的に撹拌される（３００ ＲＭＰ）ことで油相に２分以内に添加された。エマルジョンは直ちに形成され、撹拌は室温で３０分間で継続された。 Example 7 Preparation and separation of DVS cross-linked fine particles
Sodium hyaluronate (HA, 580 kDa, 1.88 g) was dissolved in aqueous NaOH (0.2 M, 37.5 mL). Sodium chloride (0.25 g) was added and the solution was magnetically stirred at room temperature for 1 hour until a homogeneous solution was obtained. The TEGOSOFT® M (10.0 g) oil and ABIL® EM 90 (cetyl PEG / PPG-10 / 1 dimethicone, 1.0 g) surfactant were mixed with stirring. Divinyl sulfone (DVS, 320 microliter) was added to the aqueous alkaline HA solution and mixed for 1 minute to obtain a uniform distribution in the liquid phase. The aqueous phase was then added to the oil phase within 2 minutes by mechanical stirring (300 RMP). An emulsion formed immediately and stirring was continued for 30 minutes at room temperature.

エマルジョンは、当量のＨＣＩ（４ Ｍ、１．８ｍＬ）を添加して約４０分間で撹拌することで中和された。エマルジョンは、分液漏斗に移され、ｎ−ブタノール／クロロホルム混合物（１：１ ｖ％， ９０ｍＬ）及び余分のＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水（１００ｍＬ ）を添付してから強く振り混ぜることによって壊された。上相は約１７５ｍｌの体積に分離れた。有機相はｍｉｌｌｌｉＱ（商標）水（１００ｍｌ）と一緒に混合されて洗浄された。結合の水／ゲル相を透析管（ＭＷＣＯ１２−１４，０００、直径２９ ｍｍ、体積／長さ６．４ｍＬ／ｃｍ）に移され、室温でＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水に対して夜通しで透析された。導電率は、水の後の変更（３回）及び夜通しの透析（２夜）の後、１０ ｍｉｃｒｏ−Ｓｉｅｖｅｒｔ／ｃｍに減少した。   The emulsion was neutralized by adding an equivalent amount of HCI (4 M, 1.8 mL) and stirring for about 40 minutes. The emulsion was transferred to a separatory funnel and broken by attaching n-butanol / chloroform mixture (1: 1 v%, 90 mL) and extra MilliQ® water (100 mL) and then shaking vigorously. . The upper phase was separated into a volume of about 175 ml. The organic phase was mixed and washed with milliQ ™ water (100 ml). The bound water / gel phase was transferred to a dialysis tube (MWCO 12-14,000, diameter 29 mm, volume / length 6.4 mL / cm) and dialyzed overnight against MilliQ® water at room temperature. . The conductivity decreased to 10 micro-Sievert / cm after subsequent changes in water (3 times) and overnight dialysis (2 nights).

例８・微粒子精製用の洗浄法
この例では微粒子の最終単離及び精製を例示する。 Example 8 Cleaning method for fine particle purification
This example illustrates the final isolation and purification of microparticles.

以前に分離された１００ｍＬの粒子がＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液（０．１５ Ｍ、４００ｍＬ）の中に再懸濁され、０．５時間でゆっくり撹拌された。懸濁液は５℃の状態で２時間で放置され、固まった油が除去された。次いで、溶液がメッシュを通して濾過され、緩衝液の２ｘ５０ｍＬでさらに洗浄された。粒子は、特性化の前に、ドリップドライすることができた。   Previously isolated 100 mL particles were resuspended in Na2HPO4 / NaH2PO4 buffer (0.15 M, 400 mL) and stirred slowly for 0.5 h. The suspension was left at 5 ° C. for 2 hours to remove the solid oil. The solution was then filtered through a mesh and further washed with 2 × 50 mL of buffer. The particles could be drip dried before characterization.

例９・微粒子のレオロジー特性の調査
この例では粒子に関するレオロジー的な研究の実施を例示する。粒子試料は、５０ ｍｍ ２°のコーンプレート形状を用いて、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒレオメータ（アントンパール有限責任会社、グラーツ・オーストリア、Ｐｈｙｓｉｃａ ＭＣＲ ３０１、ソフトウェア：Ｒｈｅｏｐｌｕｓ）で分析される。まずは、素材の粘弾性模型Ｇ’（貯蔵弾性率）とＧ”（損失弾性率）の線形範囲が可変歪みγで振幅掃引によって決定される。次は、調波数掃引が行われ、粘弾性模型値及びＧ’とＧ“の値に基づいて、タンジェントδが強い・弱いゲル挙動の値として算出されることができる。 Example 9: Investigation of rheological properties of fine particles
This example illustrates conducting a rheological study on particles. The particle sample is analyzed on an Anton Paar rheometer (Anton Paar Limited, Graz Austria, Physica MCR 301, software: Rheoplus) using a 50 mm 2 ° cone plate shape. First, the linear range of the material viscoelastic model G ′ (storage elastic modulus) and G ″ (loss elastic modulus) is determined by an amplitude sweep with a variable strain γ. Next, the harmonic sweep is performed, and the viscoelastic model Based on the value and the values of G ′ and G ″, the tangent δ can be calculated as a strong / weak gel behavior value.

例１０・テクスチャ解析での注射器能力実験の調査
この例では、試料の均質性の機能として、一定の速度で注入するために加えられた力の調査 を実施することを例示する。粒子試料は、２７Ｇ×１／２ ”又は３０Ｇ×１／２ ”の針を付けた注射器に移され、テクスチャ解析装置（ステイブル、マイクロシステムズＳｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓｕｒｒｅｙ， ＵＫ， ＴＡ．ＸＴ Ｐｌｕｓ， ＳｏｆｔＷａｒｅ： Ｔｅｘｔｕｒｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ３２）で試料の用具の中に置かれる。実験は、一定の距離で１２．５ｍｍ／分の射出速度で行われる。 Example 10: Investigation of syringe capability experiment in texture analysis
This example illustrates conducting a study of the force applied to inject at a constant rate as a function of sample homogeneity. The particle sample is transferred to a syringe with a 27G × 1/2 ″ or 30G × 1/2 ″ needle and a texture analyzer (Stable, Microsystems Stable Micro Systems, Surrey, UK, TA. XT Plus, SoftWare: It is placed in the sample tool at Texture Component 32). The experiment is performed at an injection speed of 12.5 mm / min at a constant distance.

例１１・ＤＶＳ架橋結合ＨＡヒドロゲルの調製
この例では、同時膨潤及びｐＨ調整でＤＶＳ架橋結合ＨＡヒドロゲルを調製することを例示する。 Example 11 Preparation of DVS Cross-linked HA Hydrogel
This example illustrates the preparation of a DVS cross-linked HA hydrogel with simultaneous swelling and pH adjustment.

ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ、７７０ ｋＤａ、１ｇ）は、０．２Ｍ ＮａＯＨで溶解させられて、１時間で約２０℃の室温で撹拌された ４％（体重／体積）の溶液を得た。３つの反復が調製された。次いで、それぞれ１０：１、７：１、５：１ のＨＡ／ＤＶＳ の重量比を得られるように、十分な量のジビニルスルホン（ＤＶＳ）がＨＡ溶液に添加され。これらの混合物は５分間で室温で撹拌された後、１時間で室温で放置された。次いで、ゲルは表１に示すように、１６０ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ４．５又は６．５）の中で２４時間で膨潤された。   Sodium hyaluronate (HA, 770 kDa, 1 g) was dissolved in 0.2 M NaOH to give a 4% (weight / volume) solution that was stirred at room temperature for about 1 hour at about 20 ° C. Three replicates were prepared. A sufficient amount of divinyl sulfone (DVS) was then added to the HA solution to obtain a weight ratio of 10: 1, 7: 1, 5: 1 HA / DVS, respectively. These mixtures were stirred at room temperature for 5 minutes and then allowed to stand at room temperature for 1 hour. The gel was then swelled in 160 mL of phosphate buffer (pH 4.5 or 6.5) as shown in Table 1 in 24 hours.

ゲルのｐＨは、膨潤工程中に安定化させていた。膨潤された後、余分な緩衝液は濾過により除去され、ヒドロゲルはＩＫＡ（登録商標） ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ（登録商標） Ｔ２５ホモジナイザー（Ｉｋａ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ， ＤＥ）を用いて簡単に均質化された。ゲルの体積とｐＨは測定された。（表２参照） The pH of the gel was stabilized during the swelling process. After swelling, excess buffer was removed by filtration and the hydrogel was easily homogenized using an IKA® ULTRA-TURRAX® T25 homogenizer (Ika Labortechnik, DE). Gel volume and pH were measured. (See Table 2)

ヒドロゲルのｐＨは、７．１から７．６の範囲にあった（表２）。これは、膨潤工程がこのプロセスでのｐＨを調整するために使用できることを確認しました。全てのヒドロゲルは、ＨＡ濃度の約１．４％（重量／体積（ｗ／ｖ））に相当する７０ｍＬの体積を占めていた。これらは透明で均質で粘着性があった。柔らかさは、架橋度の減少と共に増加した（表２参照）。 The pH of the hydrogel was in the range of 7.1 to 7.6 (Table 2). This confirmed that the swelling step can be used to adjust the pH in this process. All hydrogels occupied a volume of 70 mL corresponding to about 1.4% of HA concentration (weight / volume (w / v)). These were transparent, homogeneous and sticky. Softness increased with decreasing degree of crosslinking (see Table 2).

例１２・均質ＤＶＳ架橋結合ＨＡヒドロゲルの調製
この例では、非常に均質なＤＶＳ架橋結合ＨＡヒドロゲルの調製を例示する。 Example 12 Preparation of a homogeneous DVS cross-linked HA hydrogel
This example illustrates the preparation of a very homogeneous DVS cross-linked HA hydrogel.

ヒアルロン酸ナトリウム（７７０ ｋＤａ、２ｇ）は約１時間で室温で０．２ＭのＮａＯＨに溶解されて８％（体重／体積）の溶液を得た。ＨＡ／ＤＶＳの重量比が７：１になるように、ＤＶＳが添加された。５分間で室温で撹拌された後、試料の１つは、２時間で５０℃で撹拌なしで熱処理され、夜通しで室温で放置された。出来上がった架橋結合ゲルは、４２又は５５時間で３７℃ で２００ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ ５．５）に膨潤されてから、最終的に廃棄された１００ｍｌの水で２回洗浄された。また、その体積、ｐＨ、及び２７Ｇ＊１／２の注入針を通して注入するために必要な圧力は測定された。（表３参照）
この例に従って調製された架橋結合ＨＡヒドロゲルは、熱処理されていない対照ヒドロゲルに比べてより高い膨潤比及び増加した柔らかさを得たことを示した（表３）。２７Ｇ＊１／２の針を通しての注入中に加えた圧力は後者の試料のそれよりも安定であり、架橋結合ＨＡヒドロゲルがより均質であることを示す。 Sodium hyaluronate (770 kDa, 2 g) was dissolved in 0.2 M NaOH at room temperature in about 1 hour to give an 8% (body weight / volume) solution. DVS was added so that the HA / DVS weight ratio was 7: 1. After stirring at room temperature for 5 minutes, one of the samples was heat treated at 50 ° C. for 2 hours without stirring and left overnight at room temperature. The resulting cross-linked gel was swollen in 200 ml phosphate buffer (pH 5.5) at 37 ° C. for 42 or 55 hours and then washed twice with 100 ml of water finally discarded. The volume, pH, and pressure required to inject through a 27G * 1/2 injection needle were also measured. (See Table 3)
The cross-linked HA hydrogel prepared according to this example showed a higher swelling ratio and increased softness compared to the non-heat treated control hydrogel (Table 3). The pressure applied during injection through the 27G * 1/2 needle is more stable than that of the latter sample, indicating that the crosslinked HA hydrogel is more homogeneous.

ＤＶＳ−ＨＡヒドロゲルの特徴   Features of DVS-HA hydrogel

例１３・ＤＶＳ架橋結合ＨＡヒドロゲルの生物学的安定性
この例では、酵素分解を用いたＤＶＳ架橋結合ＨＡヒドロゲルのインビトロ生物学的安定性を例示する。 EXAMPLE 13 Biological stability of DVS cross-linked HA hydrogel
This example illustrates the in vitro biological stability of a DVS cross-linked HA hydrogel using enzymatic degradation.

ウシ睾丸ヒアルロニダーゼ（ＨＡａｓｅ）溶液（１００Ｕ／ｍＬ）が３０ｍＭのクエン酸、１５０ｍＭのＮａ_２ ＨＰＯ_４、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．３）で調製された。ＤＶＳ−ＨＡ架橋結合ヒドロゲルの試料（約１ｍＬ）は安全ロックのガラスバイアルに入れられ、凍結乾燥され、秤量された（（Ｗ_０；公式１）。酵素溶液（４ｍＬ、４００Ｕ）は各資料毎に添加され、バイアルは軽く揺することで（１００−２００ｒｐｍ）３７℃で培養された。一定時間ごとに、上清は除去され、そして試料は残留塩を除去するように蒸留水で完全に洗浄された。その後凍結乾燥され、そして最後に秤量された（Ｗｔ、公式１）。 Bovine testicular hyaluronidase (HAase) solution (100 U / mL) was prepared with 30 mM citric acid, 150 mM Na ₂ HPO _4, 150 mM NaCl (pH 6.3). A sample of DVS-HA cross-linked hydrogel (approximately 1 mL) was placed in a safety lock glass vial, lyophilized, and weighed ((W ₀ ; formula 1). Enzyme solution (4 mL, 400 U) was used for each sample. Added and the vials were incubated by shaking gently (100-200 rpm) at 37 ° C. At regular intervals, the supernatant was removed and the sample was washed thoroughly with distilled water to remove residual salts. It was then lyophilized and finally weighed (Wt, formula 1).

生分解は、試料の重量損失と初期重量との比率として表される（公式１）。重量損失は酵素分解テストの前後の各試料毎の重量の減少から算出された。生分解実験はそれぞれ３回繰り返された。例２で述べたように調製されたＤＶＳ−ＨＡヒドロゲル（‘熱処理有り’）は、熱処理されていないＤＶＳ−ＨＡヒドロゲル（‘処理熱無し’）と比較された。ゲルの両方のタイプは、分解が最初の４時間の間に速かったが、その後２４時間で完了するまでだんだん遅くなってきた。重要なことには、例２で述べたように熱処理工程を用いて調製されたヒドロゲルと比較して、熱処理されていない試料の重量損失の著しい変動があった。これは非常に均質なＤＶＳ架橋結合ヒドロゲルが例２で述べた方法を持ち言えて得られることを明らかに示している。   Biodegradation is expressed as the ratio of sample weight loss to initial weight (Formula 1). Weight loss was calculated from the weight loss for each sample before and after the enzymatic degradation test. Each biodegradation experiment was repeated three times. A DVS-HA hydrogel prepared as described in Example 2 ('with heat treatment') was compared to a non-heat treated DVS-HA hydrogel ('without heat of treatment'). Both types of gels degraded faster during the first 4 hours, but gradually slowed down to completion in the next 24 hours. Importantly, there was a significant variation in the weight loss of the unheated sample compared to the hydrogel prepared using the heat treatment process as described in Example 2. This clearly shows that a very homogeneous DVS cross-linked hydrogel can be obtained with the method described in Example 2.

例１４・化粧品用Ｗ／Ｏエマルション（油中水滴型エマルション）の調製
この形態及び以下の例では、ＤＶＳ架橋結合ＨＡヒドロゲルは、肌にのばすと肌の湿潤性と弾力性を増加させるクリームと血清の中に配合された、即時の老化防止効果及び塗膜形成効果をもとらす。 Example 14 Preparation of Cosmetic W / O Emulsion (Water-in-oil Emulsion) In this form and in the following examples, DVS cross-linked HA hydrogels are creams and serums that increase skin wetness and elasticity when extended to the skin. The immediate anti-aging effect and the film formation effect which were mix | blended in are obtained.

Ｗ／Ｏエマルションの典型的な製剤は、２％のＤＶＳ架橋ＨＡを含む。各相（Ａ〜Ｅ）は、それぞれ確定した成分を混合することによって別々に調整された（表４参照）。次いで、相Ｂは相Ａに添加され、４０℃未満で機械力で推進する撹拌装置で撹拌された。相Ｃ、そして相Ｄと相Ｅは添加され、撹拌された。ＨＡヒドロゲルの濃度がそれぞれ４％、６％、８％の製剤もＷ／Ｏ製剤の範囲を与えるように相Ｄで作製された。   A typical formulation of a W / O emulsion contains 2% DVS cross-linked HA. Each phase (A to E) was adjusted separately by mixing each determined component (see Table 4). Phase B was then added to Phase A and stirred with a stirrer propelled by mechanical force below 40 ° C. Phase C, and Phase D and Phase E were added and stirred. Formulations with HA hydrogel concentrations of 4%, 6%, and 8%, respectively, were also made in Phase D to give a range of W / O formulations.

２％のＤＶＳ架橋ＨＡを含む、Ｗ／Ｏエマルションの別の典型的な製剤は、表５に示される。表５での各相（Ａ〜Ｆ）はそれぞれ確定した成分を混合することによって別々に調整された。相Ｂは相Ａと一緒に混合され、その得られた油相は７５℃で加熱された。相Ｃも７５℃まで加熱された。油相は７５℃で相Ｃに添加されて機械力で推進する撹拌装置で撹拌された。次いで、このエマルジョンは４０℃未満に冷却された。相Ｄ、そして相Ｅと相Ｆは添加され、撹拌された。ＨＡヒドロゲルの濃度がそれぞれ４％、６％、８％の製剤もＷ／Ｏ製剤の範囲を与えるように相Ｅで作製された。 Another exemplary formulation of a W / O emulsion containing 2% DVS cross-linked HA is shown in Table 5. Each phase (A to F) in Table 5 was adjusted separately by mixing the determined components. Phase B was mixed with Phase A and the resulting oil phase was heated at 75 ° C. Phase C was also heated to 75 ° C. The oil phase was added to phase C at 75 ° C. and stirred with a mechanical stirrer propelled by mechanical force. The emulsion was then cooled to below 40 ° C. Phase D, and Phase E and Phase F were added and stirred. Formulations with HA hydrogel concentrations of 4%, 6% and 8%, respectively, were also made in Phase E to give a range of W / O formulations.

例１５・シリコン血清の調製
表６に示されるように、２％のＤＶＳ架橋ＨＡを含むシリコン血清の典型的な製剤は調製された。全ての成分は、４０℃未満で高速撹拌で同時に混合された（表６参照）。ＨＡヒドロゲルの濃度がそれぞれ４％、６％、８％の製剤も血清の範囲を与えるように相Ｅで作製された。 Example 15 Preparation of Silicone Serum As shown in Table 6, a typical formulation of silicone serum containing 2% DVS cross-linked HA was prepared. All ingredients were mixed simultaneously with high speed stirring below 40 ° C. (see Table 6). Formulations with HA hydrogel concentrations of 4%, 6%, and 8%, respectively, were also made in Phase E to give a range of serum.

例１６・膨潤中のｐＨ平衡；速度論研究
速度論研究は、中性ｐＨのＤＶＳ架橋結合ＨＡヒドロゲルが架橋度に応じて、８〜１４時間でリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）での膨潤後得られることを示した。ＤＶＳ架橋結合ＨＡヒドロゲルのセットは、上記で説明したように、４％〜８％のＨＡ溶液及びＤＶＳ架橋剤の種々の量を用いて調整され、表７に示される。 Example 16 pH equilibrium during swelling; kinetic study
Kinetic studies have shown that neutral pH DVS cross-linked HA hydrogels are obtained after swelling with phosphate buffer (pH 7.0) in 8-14 hours, depending on the degree of cross-linking. A set of DVS cross-linked HA hydrogels, prepared as described above, was prepared using 4% to 8% HA solution and various amounts of DVS crosslinker and is shown in Table 7.

定期的に（２時間毎）、ヒドロゲルは、熱処理中に除去されて上澄みの液を静かに移され、そしてｐＨは測定された（図２参照）。新鮮膨潤緩衝液は毎回の測定後に使用された。結果として、全てのヒドロゲルのｐＨは、膨潤の２時間後の場合は１１〜１２の間であり、その後は徐々に７．２〜７．５に低下してきた。 Periodically (every 2 hours), the hydrogel was removed during the heat treatment, the supernatant liquid was gently transferred, and the pH was measured (see FIG. 2). Fresh swelling buffer was used after each measurement. As a result, the pH of all hydrogels was between 11-12 for 2 hours after swelling and then gradually decreased to 7.2-7.5.

ヒドロゲルの架橋結合は緩ければ緩いほど、言い換えれば、ＨＡ／ＤＶＳの比率が高ければ高いほど、その低下が早いであった。ＨＡ ６％の溶液の場合及び、ＨＡ・ＤＶＳの２つの異なる比率の場合のｐＨの低下は、図２のように示されている。その中で、ＨＡ／ＤＶＳ比率が１０：１の場合は三角で標識され、ＨＡ／ＤＶＳ比率が１５：１の場合は四角で標識される。これらの２つ場合では、ｐＨは８時間内で中和された。それに対して、中性ｐＨには、より高いＨＡ濃度（例えば８％）又はより高い架橋度（例えば２．５のＨＡ／ＤＶＳ比率）のヒドロゲルの膨潤の１４時間後達成できた。これらの観察は、低い架橋結合ヒドロゲルでのＨＡ分子がより大きな自由度と柔軟性を示し、十分な水分補給とそれによってより高速なｐＨ平衡をもたらすことができる。   The slower the hydrogel cross-linking, in other words, the higher the HA / DVS ratio, the faster it decreased. The pH drop for the 6% HA solution and for the two different ratios of HA and DVS is shown in FIG. Among them, when the HA / DVS ratio is 10: 1, it is labeled with a triangle, and when the HA / DVS ratio is 15: 1, it is labeled with a square. In these two cases, the pH was neutralized within 8 hours. In contrast, neutral pH could be achieved 14 hours after swelling of hydrogels with higher HA concentration (eg 8%) or higher degree of crosslinking (eg HA / DVS ratio of 2.5). These observations indicate that HA molecules with low cross-linked hydrogels exhibit greater freedom and flexibility, resulting in sufficient hydration and thereby faster pH equilibration.

例１７・ＤＶＳ架橋結合ＨＡに基づくヒドロゲルの粘弾性模型の属性
レオロジー測定は、ある一定の温度下でプレートプレート形状を用いてＰｈｙｓｉｃａ ＭＣＲレオメータ（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ、オストフィルデルン、ドイツ）で行われた。試料の粘弾性挙動は、素材が正弦波せん断歪みを受けた、動的振幅せん断振動のテストで調査された。まず、歪み・振幅掃引の実験は、線形粘弾性が有効の変形の領域を評価するために実施された。歪みの典型的な範囲は０．０１ 〜 ２００％であり、周波数は１ Ｈｚに設定された。次に、線形粘弾性の領域において、せん断貯蔵（弾性）率（又は弾性率Ｇ’）及びせん断損失弾性率（又は粘性率Ｇ”）の値は、一定せん断歪み（１０％）と０．１〜１０ Ｈｚの間の周波数として、周波数掃引の実験から記録された。形状、ＮＦ、ギャップはそれぞれＰＰ２５、２、１ｍｍであった。 Example 17 Attributes of viscoelastic model of hydrogel based on DVS cross-linked HA
Rheological measurements were performed on a Physica MCR rheometer (Anton Paar, Ostfildern, Germany) using plate plate geometry at a certain temperature. The viscoelastic behavior of the sample was investigated in a dynamic amplitude shear vibration test where the material was subjected to sinusoidal shear strain. First, strain / amplitude sweep experiments were performed to evaluate the region of deformation where linear viscoelasticity was effective. The typical range of distortion was 0.01-200% and the frequency was set to 1 Hz. Next, in the region of linear viscoelasticity, the values of shear storage (elasticity) modulus (or elastic modulus G ′) and shear loss elastic modulus (or viscosity modulus G ″) are constant shear strain (10%) and 0.1. Recorded from frequency sweep experiments as frequencies between -10 Hz, shape, NF, and gap were PP25, 2, 1 mm, respectively.

Ｇ’は、変形中の素材に蓄えられた弾力性又はエネルギーに関する情報を提供するのに対し、Ｇ”は、粘性特徴又は熱として消費したエネルギーについて説明する。特に、弾性率は、試料が荷重を持続して負担ストレス又は変形の後、初期構成に戻すその能力についての情報を提供する。全ての実験では、各資料は少なくとも３回測定された。   G ′ provides information about the elasticity or energy stored in the material being deformed, while G ″ describes the energy consumed as a viscous feature or heat. Provides information about its ability to sustain and return to its initial configuration after strain stress or deformation.In all experiments, each material was measured at least three times.

より高い架橋度のあるヒドロゲル（即ちより低いＨＡ／ＤＶＳ比：１０／１）の場合、Ｇ’がＧ”より１桁高いである。これは、この試料が強いゲル素材として挙動することを示す。簡単に言えば、全体的なレオロジー応答は、物理架橋と化学架橋の貢献、及び高分子間の位相的な相互作用によるものです。チェインの間での相互作用は、ストレスを解消できないその固有移動度の還元をもたらし、その結果、素材は、負荷ストレスの適応（調節）の基本モードがネットワークの変形によって行われる３次元ネットワークとして挙動する。更に、このヒドロゲルは、より低い架橋度のあるヒドロゲル（即ちより高いＨＡ／ＤＶＳ比：１５：１）よりも弾力性がある。実際に、永久的な共有結合性の架橋結合の数及びエンタングルメントの数が高ければ高いほど、ヒドロゲルの弾性応答も高いである。   For a hydrogel with a higher degree of cross-linking (ie lower HA / DVS ratio: 10/1), G ′ is an order of magnitude higher than G ″. This indicates that this sample behaves as a strong gel material. Simply put, the overall rheological response is due to the contribution of physical and chemical cross-links and topological interactions between macromolecules, which are inherent in their ability to relieve stress. This results in a reduction in mobility, so that the material behaves as a three-dimensional network in which the fundamental mode of load stress adaptation (regulation) is performed by deformation of the network. (Ie higher HA / DVS ratio: 15: 1) In fact, the number of permanent covalent crosslinks and the number of entanglements The higher the Kere, elastic response of the hydrogel is also high.

例１８・防腐剤での架橋結合ＨＡ／ＤＶＳヒドロゲル
ＤＶＳ架橋結合ＨＡヒドロゲルは、６％（ｗ／ｖ）の溶液を得るように、０．２ Ｍ ＮａＯＨの中の１．５ｇのナトリウムＨＡを用いて調製された。 ＨＡ／ＤＶＳ重量比は、１０：１であった。ヒドロゲルは、例２に記載された手順の膨潤ステップまで、３つの反復で調製された。その後、次のように処理された。２時間で５０℃のオーブンでの定温放置の後、ヒドロゲルは防腐剤（２−ｐｈｅｎｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ／３［（２−ｅｔｈｙｌｈｅｘｙｌ）ｏｘｙ］１，２−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ）が入っているＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液（１Ｌ，５０ｍＭ，ｐＨ７．０）に浸漬された。 Example 18 Crosslinked HA / DVS Hydrogel with Preservative DVS Crosslinked HA Hydrogel uses 1.5 g sodium HA in 0.2 M NaOH to obtain a 6% (w / v) solution. Prepared. The HA / DVS weight ratio was 10: 1. The hydrogel was prepared in 3 iterations until the swelling step of the procedure described in Example 2. Then, it processed as follows. After incubating in an oven at 50 ° C. for 2 hours, the hydrogel is Na2HPO4 / NaH2PO4 buffer (1 L, containing preservative (2-phenoxyethanol / 3 [(2-ethylhexyl) oxy] 1,2-propandiol)). 50 mM, pH 7.0).

防腐剤の濃度は１０ｍＬ／ｍＬであって、膨潤されたヒドロゲル中に１％ （ｖ／ｖ）の最終濃度を対象とする。防腐剤が定温放置中に、ヒドロゲルの中に拡散することが予想され、同時に、緩衝液内の微生物汚染を防止することができる。
容器はパラフィルムで覆われて、３７℃のオーブンで入れられた。１時間後、膨潤浴は除去され、ヒドロゲルは、６〜７時間で１０ｍＬ／ｍＬの防腐剤が入っている新鮮リン酸緩衝液で膨潤された。この工程は、膨潤時間が１２時間になるまで繰り返され、６−７時間で１０ｍＬ／ｍＬの防腐剤を含有する新鮮なリン酸緩衝液中で膨潤された。膨潤時間が１２時間になるまでこの工程を繰り返し、その後ｐＨが測定された。膨潤は、中性のｐＨに達するようにさらに２．５時間続けた。 The concentration of the preservative is 10 mL / mL and targets a final concentration of 1% (v / v) in the swollen hydrogel. It is expected that the preservative will diffuse into the hydrogel during incubation, while at the same time preventing microbial contamination in the buffer.
The container was covered with parafilm and placed in an oven at 37 ° C. After 1 hour, the swelling bath was removed and the hydrogel was swollen with fresh phosphate buffer containing 10 mL / mL preservative in 6-7 hours. This process was repeated until the swelling time was 12 hours and swollen in fresh phosphate buffer containing 10 mL / mL preservative for 6-7 hours. This process was repeated until the swelling time was 12 hours, after which the pH was measured. Swelling was continued for another 2.5 hours to reach a neutral pH.

ヒドロゲルに組み込まれた防腐剤の量は、ＵＶ−分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ， Ｎｉｃｏｌｅｔ， Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ９００， ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ ｎｒ． ２４６−９０）により決定された。リン酸緩衝液中の防腐剤のＡ１％ （ｖ／ｖ）の溶液はまず、分析されて波長を選択した。約５ｍＬのヒドロゲルをピペットを用いて採取された。試料は通常、膨潤された丸いヒドロゲルの中心及び、丸いゲルの北、東、南、西の「側」に採取される。   The amount of preservative incorporated into the hydrogel was determined by a UV-spectrophotometer (Thermo Electron, Nicolet, Evolution 900, equipment nr. 246-90). A solution of A1% (v / v) of preservative in phosphate buffer was first analyzed to select the wavelength. About 5 mL of hydrogel was collected using a pipette. Samples are usually taken at the center of the swollen round hydrogel and at the “side” of the north, east, south and west of the round gel.

次いで、試料はキュベットに移され、吸光度は２９２ｎｍで読み取られた。各試料はそれぞれ３回読み取られ、吸光度は、防腐剤を含まないブランクＤＶＳ架橋結合ＨＡヒドロゲルに対してゼロにした。   The sample was then transferred to a cuvette and the absorbance was read at 292 nm. Each sample was read three times and the absorbance was zeroed against a blank DVS cross-linked HA hydrogel without preservatives.

その結果、ＤＶＳ−ＨＡヒドロゲルに組み込まれた防腐剤の量が０．９１％〜１．０２％の間の範囲であったことを示した（表１０参照）。複製の間に非常に良好な再現性があった。重要なのは、同じヒドロゲルからの試料の間の有意差が観察されなく、ヒドロゲル中に防腐剤の均一な拡散を示している。   The results showed that the amount of preservative incorporated into the DVS-HA hydrogel ranged between 0.91% and 1.02% (see Table 10). There was very good reproducibility during replication. Importantly, no significant difference between samples from the same hydrogel is observed, indicating uniform diffusion of the preservative in the hydrogel.

例１９・生分解性の高分子の選択肢
分解時間は下記の表１中での高分子混合物に基づいて調整することができる。以下の例１及び例２は、薬物のリリースを制御するための生分解性高分子への、薬物又は薬物のマトリックス組み込みの例である。 Example 19-Biodegradable polymer options
The decomposition time can be adjusted based on the polymer mixture in Table 1 below. Examples 1 and 2 below are examples of drug or drug matrix incorporation into biodegradable polymers to control drug release.

表１：生分解の時間と成分
高分子分解時間
（ｍｏｓ）
５０：５０ ＤＬ−ＰＬＧ１ − ２
６５：３５ ＤＬ−ＰＬＧ ３ − ４
７５：２５ ＤＬ−ＰＬＧ４ − ５
８５：１５ ＤＬ−ＰＬＧ ５ − ６
ＤＬ−ＰＬＡ １２ − １６
Ｌ−ＰＬＡ ＞２４
ＰＧＡ ６ − １２
ＰＣＬ ＞２４
生分解性の高分子の様々な種類は、分解時間の制御及び／又は分解副産物の制御のために使用することができる。以下は幾つかの生分解高分子である。 Table 1: Biodegradation time and components Polymer degradation time (mos)
50:50 DL-PLG1-2
65:35 DL-PLG 3-4
75:25 DL-PLG4-5
85:15 DL-PLG 5-6
DL-PLA 12-16
L-PLA> 24
PGA 6-12
PCL> 24
Various types of biodegradable polymers can be used to control degradation time and / or degradation by-products. The following are some biodegradable polymers.

・ ＰＧＡ、ＰＬＡとそれらの共重合体は、基本ＰＬＡ／ＰＧＡテーマ内の高分子の組成物を変更することによって調整できるそれらの属性のため、程度最もよく利用される生分解性の高分子素材である。   PGA, PLA and their copolymers are the most commonly used biodegradable polymer materials due to their attributes that can be adjusted by changing the polymer composition within the basic PLA / PGA theme It is.

ｏ ポリグリコール酸（Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ−ＰＧＡ）は加水分解が起こりやすい
ｏ ポリ乳酸（Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ−ＰＬＡ）は、加水分解度を制限する混合物中にある時に形成する結晶領域様のための々な生分解タイミングでのこれらの結果のＤ及び／又はＬ光学異性体の混合物に存在する。 o Polyglycolic acid (PGA) is prone to hydrolysis o Polylactic acid (PLA) is a biodegradation due to the crystalline regions that form when in a mixture that limits the degree of hydrolysis These results in timing are present in a mixture of D and / or L enantiomers.

・ Ｐｏｌｙｄｉｏｘａｎｏｎｅ （ＰＤＳ） ポリジオキサノン（ＰＤＳ）
・ Ｐｏｌｙ（ε−ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ） ポリ（ε−カプロラクトン）
・ Ｐｏｌｙ（ＤＬ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ε−ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ） ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ− ε−カプロラクトン）
界面活性剤選択肢：
マイクロカプセルの粒径は有機相と水相の界面化学によって直接に制御される。界面活性剤はしばしば、油性物質と水性環境との間の界面化学を仲介するために使用される。界面活性剤は水溶液の中にある洗剤である。界面活性剤は、極性と無極性の両方の末端を持つ巨大分子である。分子の極性末端、また極性分子は水にくっつく。分子の無極性末端はＮＡＰＬ（非水相の液体）合成物を引き付ける。 ・ Polydioxanone (PDS) Polydioxanone (PDS)
Poly (ε-caprolactone) poly (ε-caprolactone)
Poly (DL-lactide-co-ε-caprolactone) Poly (DL-lactide-co-ε-caprolactone)
Surfactant options:
The microcapsule particle size is directly controlled by the interfacial chemistry of the organic and aqueous phases. Surfactants are often used to mediate surface chemistry between oily substances and aqueous environments. A surfactant is a detergent that is in an aqueous solution. Surfactants are macromolecules with both polar and nonpolar ends. Polar ends of molecules and polar molecules stick to water. The nonpolar ends of the molecule attract NAPL (non-aqueous phase liquid) composites.

可溶化に使用される界面活性剤の例は下記のとおりである。   Examples of surfactants used for solubilization are as follows.

１． Ｓｉｏｐｏｎｉｃ ２５−９：直鎖アルコールであり、２．７５ｇ／ｇの可溶化のある直鎖アルコール
２． Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ：１．２１ｇ／ｇ の可溶化のあるエチレンオキシド／酸化プロピレン
３． Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＸＬ−８０Ｎ：第一級アルコールの、１．０２２ｇ／ｇの可溶化のあるエチレンオキシド／酸化プロピレンアルコキシレート
４． Ｔｅｒｇｉｔｏｌ Ｎ−１０ ：０．９６４ｇ／ｇ の可溶化のあるトリメチルｎｏｎａｌエトキシレート
５． Ｒｅｘｏｐｈｏｓ ２５／９７：０．９５１ｇ／ｇ の可溶化のあるリン酸化ノニルフェノールエトキシレート
例２０・抗炎症性且つ副腎皮質ステロイドを含む生分解性微粒子
ａ． ３０日遅延
ｂ． １２０日リリース制御
有機相：
・塩化メチレンで２０％ＤＬＰＬＧポリマーを作る
・ＤＬＰＬＡポリマーは、６５％ＤＬと３５％ＰＬＧを含む
・０．０２ｇのトリアムシノロンを秤量してガラスバイアルに入れる
・トリアムシノロンを含むバイアルに２０％ＤＬＰＬＧポリマー溶液の２ｍＬを分注する
・軌道混合器を使用して完全に薬物を溶解させる
水相：
・ＤＩ水中で、０．１モル濃度のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の１００ｍＬを作る
・薬物／ポリマー溶液中にＳＤＳ ０．１モルの溶液の８ｍＬを分注する
溶媒蒸発：
・羽根車混合器の下で、反応混合物を含むガラスバイアルを置く
・１２００ ＲＰＭまで混合器立ち上げる
・望ましい粒子サイズを製造するために必要な速度が知られている限り、ゆっくり開始して望ましい粒径サイズを製造できるような羽根車の速度を徐々に上げていく
・望ましい粒径サイズを製造するための速度に達したら、８０℃の水浴中で容器を連続して混合しながら加熱し始める
・有機相の全べての塩化メチレンがボイルオフされたら、加熱を停止する。（この場合の時間は４５分）
・混合し続け、反応を室温へゆっくり冷却する
・冷却と混合の率は粒子間の相互の凝集をもたらす
・ＳＤＳは、ＤＩ水と混合物溶液を連続的に交換することによって洗浄することができる。 1. Sioponic 25-9: linear alcohol with a solubilization of 2.75 g / g 2. Tergitol: ethylene oxide / propylene oxide with solubilization of 1.21 g / g Tergitol XL-80N: primary alcohol, ethylene oxide / propylene oxide alkoxylate with a solubilization of 1.022 g / g
4). 4. Tergitol N-10: trimethyl nonal ethoxylate with a solubilization of 0.964 g / g Rexophos 25/97: Phosphorylated nonylphenol ethoxylate with a solubilization of 0.951 g / g
Example 20: Biodegradable microparticles containing anti-inflammatory and corticosteroids
a. 30 days delay b. 120-day release control Organic phase:
Make 20% DLPLG polymer with methylene chloride. DLPLA polymer contains 65% DL and 35% PLG. Weigh 0.02 g of triamcinolone into a glass vial. Add 20% DLPLG polymer solution to a vial containing triamcinolone. Dispense 2 mL ・ Use orbital mixer to completely dissolve the drug Aqueous phase:
Make 100 mL of 0.1 molar SDS (sodium dodecyl sulfate) in DI water. Dispense 8 mL of 0.1 molar SDS solution into drug / polymer solution. Solvent evaporation:
Place a glass vial containing the reaction mixture under the impeller mixer. Launch the mixer to 1200 RPM. Start slowly as long as the speed required to produce the desired particle size is known. Gradually increase the speed of the impeller so that it can produce the diameter size. Once the speed to produce the desired particle size is reached, start heating the container with continuous mixing in an 80 ° C water bath. When all the methylene chloride in the organic phase has been boiled off, the heating is stopped. (The time in this case is 45 minutes)
Continue mixing and slowly cool the reaction to room temperature Cooling and mixing rates result in mutual agglomeration between particles SDS can be washed by continuously exchanging DI water and mixture solution.

・濾過により粒子を収集する
・真空オーブン中８０℃で粒子を乾燥させる
流動床のカプセル化
・３％および５％の、ＰＬ：ＰＬＧ ５０：５０の高分子組成物を塩化メチレン中に作る
・乾燥粒子を含む薬物を流動床に入れる
・５％ポリマー溶液を用いて粒子を含む薬物へ、ポリマーの均一層を堆積させる。最適化された粒子床を取得するように、溶射速度と空気の流れを調整する。 Collect particles by filtration Dry particles in a vacuum oven at 80 ° C. Fluid bed encapsulation Make 3% and 5% PL: PLG 50:50 polymer composition in methylene chloride Dry Place the drug containing the particles into the fluidized bed-Deposit a uniform layer of polymer onto the drug containing the particles using a 5% polymer solution. Adjust spray rate and air flow to get an optimized particle bed.

・３％のポリマー溶液を使用して、薬物の望ましくない早めのリリースを引き起こすピン穴がないことを最終的な原因は不要な早期解放へのピンホールがないことを確保するプロセスを終了させる。   • Use a 3% polymer solution to end the process of ensuring that there are no pinholes to unwanted early release, with the ultimate cause being no pinholes causing undesired early release of the drug.

例２１・抗増殖性の薬剤を含む生分解性微粒子
ａ． ６０日遅延
ｂ． ３６５日リリース制御
有機相：
・塩化メチレンで２０％ＤＬＰＬＧポリマーを作る
・ＤＬＰＬＡポリマーは、１００％ＰＬＡを含む
・０．０２ｇのシロリムスを秤量してガラスバイアルに入れる
・トリアムシノロンを含むバイアルに２０％ＤＬＰＬＧポリマー溶液の２ｍＬを分注する
・軌道混合器を使用して完全に薬物を溶解させる
水相：
・ＤＩ水中で、０．１モル濃度のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の１００ｍＬを作る
・薬物／ポリマー溶液中にＳＤＳ ０．１モルの溶液の８ｍＬを分注する
溶媒蒸発：
・羽根車混合器の下で、反応混合物を含むガラスバイアルを置く。 Example 21 Biodegradable microparticles containing an antiproliferative drug
a. 60 days delay b. 365 days release control Organic phase:
Make 20% DLPLG polymer with methylene chloride. DLPLA polymer contains 100% PLA. Weigh 0.02 g of sirolimus into a glass vial. Dispense 2 mL of 20% DLPLG polymer solution into a vial containing triamcinolone.・ Use an orbital mixer to completely dissolve the drug Aqueous phase:
Make 100 mL of 0.1 molar SDS (sodium dodecyl sulfate) in DI water. Dispense 8 mL of 0.1 molar SDS solution into drug / polymer solution. Solvent evaporation:
Place a glass vial containing the reaction mixture under the impeller mixer.

・１２００ ＲＰＭまで混合器立ち上げる。   • Bring up the mixer to 1200 RPM.

・望ましい粒子サイズを製造するために必要な速度が知られている限り、ゆっくり開始して望ましい粒径サイズを製造できるような羽根車の速度を徐々に上げていく。   As long as the speed required to produce the desired particle size is known, start slowly and gradually increase the speed of the impeller to produce the desired particle size.

・望ましい粒径サイズを製造するための速度に達したら、８０℃の水浴中で容器を連続して混合しながら加熱し始める。   When the speed to produce the desired particle size is reached, begin heating the container in a 80 ° C. water bath with continuous mixing.

・有機相の全べての塩化メチレンがボイルオフされたら、加熱を停止する。（この場合の時間は４５分）
・混合し続け、反応を室温へゆっくり冷却する。 • When all the methylene chloride in the organic phase has been boiled off, stop heating. (The time in this case is 45 minutes)
Continue mixing and slowly cool the reaction to room temperature.

・冷却と混合の率は粒子間の相互の凝集をもたらす。   • The rate of cooling and mixing results in mutual aggregation between the particles.

・ＳＤＳは、ＤＩ水と混合物溶液を連続的に交換することによって洗浄することができる。   The SDS can be cleaned by continuously exchanging the DI water and the mixture solution.

・濾過により粒子を収集する
・真空オーブン中８０℃で粒子を乾燥させる
流動床のカプセル化
・３％および５％の、ＰＬ：ＰＬＧ ６５：３５の高分子組成物を塩化メチレン中に作る
・乾燥粒子を含む薬物を流動床に入れる
・５％ポリマー溶液を用いて粒子を含む薬物へ、ポリマーの均一層を堆積させる。最適化された粒子床を取得するように、溶射速度と空気の流れを調整する。 Collect particles by filtration Dry particles in a vacuum oven at 80 ° C. Fluid bed encapsulation Make 3% and 5% PL: PLG 65:35 polymer composition in methylene chloride Dry Place the drug containing the particles into the fluidized bed-Deposit a uniform layer of polymer onto the drug containing the particles using a 5% polymer solution. Adjust spray rate and air flow to get an optimized particle bed.

・３％のポリマー溶液を使用して、薬物の望ましくない早めのリリースを引き起こすピン穴がないことを最終的な原因は不要な早期解放へのピンホールがないことを確保するプロセスを終了させる。   • Use a 3% polymer solution to end the process of ensuring that there are no pinholes to unwanted early release, with the ultimate cause being no pinholes causing undesired early release of the drug.

例２２・麻酔薬、副腎皮質ステロイド及び抗増殖性の薬剤を含む皮膚充填剤組成物
ａ． ３０日遅延、１２０日リリース制御の、副腎皮質ステロイドを含む生分解性のマイクロカプセル
ｂ． ６０日遅延、３６５日リリース制御の、抗増殖性の薬剤を含む生分解性のマイクロカプセル
組成の混合物（乾燥）
・ヒアルロン酸、架橋結合 ６０％ − ９５％
・微粒子を含む抗炎症性 ５％ − ２０％
・微粒子を含む抗増殖剤 ５％ − ２０％
・麻酔薬（塩酸リドカイン） ０．１％ − ５％
０．０２４ｇ／ｍＬの濃度のリン酸緩衝生理食塩水の中で再構成する。 Example 22. Skin filler composition containing anesthetic, corticosteroid and antiproliferative agent
a. Biodegradable microcapsules containing corticosteroids with 30 day delay and 120 day release control b. 60-day delayed, 365-day release controlled, biodegradable microcapsule composition mixture (dry) with anti-proliferative drug
・ Hyaluronic acid, cross-linking 60% -95%
・ Anti-inflammatory including microparticles 5% -20%
・ Antiproliferative agent containing fine particles 5% -20%
・ Anesthetic (lidocaine hydrochloride) 0.1% -5%
Reconstitute in phosphate buffered saline at a concentration of 0.024 g / mL.

例２３・抗増殖剤、生分解性アクリル酸共重合体のカプセル化
卵殻形成相
有機相を構成するように、下記を溶解させる。 Example 23: Encapsulation of antiproliferative agent, biodegradable acrylic acid copolymer
Eggshell-forming phase Dissolve the following to constitute the organic phase.

・生分解性のアクリル酸共重合体の０．２５ｇ
・シロリムスの０．７５ｇ
・塩化メチレンの２ｍＬ
・エタノールの０．１ｍＬ
水相
・室温で維持した０．５％ポリビニルアルコール溶液の７５ｍＬ
１２００ｒｐｍ又は望ましい粒子サイズを得られる適切な速度で機械的混合機を使用して２相を分散させる
アミンの適切な量を追加する（この場合はトリエチルアミン）
８０℃の水浴中での反応槽で２時間で混合し続ける
ジェファーミン（Ｔ−４０３）の０．１ｍＬを追加してカプセル表面を硬化する
混合し続け、反応を室温へゆっくり冷却する
冷却と混合の率は粒子間の相互の凝集をもたらす
ポリビニルアルコールは、新鮮なＤＩ水と混合物溶液を連続的に交換することによって洗浄することができる。 ・ 0.25 g of biodegradable acrylic acid copolymer
・ 0.75g of sirolimus
・ 2 mL of methylene chloride
・ 0.1 mL of ethanol
Aqueous phase 75 mL of 0.5% polyvinyl alcohol solution maintained at room temperature
Disperse the two phases using a mechanical mixer at an appropriate speed to obtain 1200 rpm or the desired particle size Add the appropriate amount of amine (in this case triethylamine)
Continue mixing in a reaction bath in an 80 ° C. water bath for 2 hours Add 0.1 mL of Jeffamine (T-403) to harden the capsule surface Continue mixing and cool the reaction slowly to room temperature Cooling and mixing This rate results in mutual aggregation between the particles. Polyvinyl alcohol can be washed by continuously exchanging the mixture solution with fresh DI water.

濾過により粒子を収集する
真空オーブン中８０℃で粒子を乾燥させる
流動床のカプセル化
・３％および５％の、ＰＬ：ＰＬＧ ６５：３５の高分子組成物を塩化メチレン中に作る。 Collect the particles by filtration Dry the particles at 80 ° C. in a vacuum oven Fluid bed encapsulation Make 3% and 5% PL: PLG 65:35 polymer composition in methylene chloride.

・乾燥粒子を含む薬物を流動床に入れる。   Place drug containing dry particles in fluidized bed.

・５％ポリマー溶液を用いて粒子を含む薬物へ、ポリマーの均一層を堆積させる。最適化された粒子床を取得するように、溶射速度と空気の流れを調整する。   Deposit a uniform layer of polymer on the drug containing particles using a 5% polymer solution. Adjust spray rate and air flow to get an optimized particle bed.

・３％のポリマー溶液を使用して、薬物の望ましくない早めのリリースを引き起こすピン穴がないことを最終的な原因は不要な早期解放へのピンホールがないことを確保するプロセスを終了させる。   • Use a 3% polymer solution to end the process of ensuring that there are no pinholes to unwanted early release, with the ultimate cause being no pinholes causing undesired early release of the drug.

生体適合性に加えて、様々な医療分野においてゲルスラリーの有用性を決定する一実施形態に係るゲルスラリーの他の重要な特徴は、それらのレオロジー属性の複雑な組み合わせである。これらの属性には、粘度とそのせん断率の依存、動的モードでの弾性と粘性の特性間の比、緩和挙動及び以下に詳細に記述される幾つかの要素が含まれている。一般的に、一実施形態の生産物のレオロジーは、基本的に、２つの方法によって、非常に広い範囲にわたって制御されることができる。第一の方法では、粘弾性ゲルスラリーを形成する２つの相のそれぞれのレオロジー特性は、最終生産物の望ましいレオロジーを与えるように制御される。ゲルスラリーのレオロジーを制御するという第二の方法は、２つの相の適切な比率の選択から成る。しかし、これらのパラメータ、すなわちは、２つの相のレオロジーとその比率は、一実施形態の生産物のいくつかの他の重要な特性を決定するため、レオロジーを制御する最良の方法はそれぞれの特定の場合に応じてその場しのぎで選択すべきである。   In addition to biocompatibility, another important feature of gel slurries according to one embodiment that determines the usefulness of gel slurries in various medical fields is a complex combination of their rheological attributes. These attributes include viscosity and its shear modulus dependence, the ratio between elastic and viscous properties in dynamic mode, relaxation behavior and several factors described in detail below. In general, the rheology of an embodiment product can be controlled over a very wide range basically by two methods. In the first method, the rheological properties of each of the two phases forming the viscoelastic gel slurry are controlled to give the desired rheology of the final product. The second method of controlling the rheology of the gel slurry consists of selecting the appropriate ratio of the two phases. However, because these parameters, ie the rheology of the two phases and their ratio, determine some other important properties of the product of an embodiment, the best way to control the rheology is Depending on the case, it should be chosen on the fly.

一実施形態に従って製品に用いるのに適したゲルは、硬くて割れやすいゲルから流体のように非常に柔らかくて変形可能なゲルまで変化する、レオロジー体の様々な異なる種類を表すことができる。通常、架橋反応なしで形成されたゲル、例えば従来型のゼラチンの場合は、硬度と弾性が高分子の密度の増加と共に増加する。架橋ゲルのレオロジー特性は、通常、ゲル中の架橋密度、高分子濃度、架橋高分子が膨潤される溶媒の組成物などのようないくつかのパラメータの関数である。ヒアルロン酸とｈｙｌａｎに基づいた異なるレオロジー特性を有するゲルは上述した米国特許第４，６０５，６９１号、第４，５８２，８６５号、第４，７１３，４４８号に記載されている。これらの特許によれば、ゲルのレオロジー特性は主に、最初の反応混合物中の高分子濃度、高分子とビニルスルホンの架橋剤の比率を変更することによって制御できる。これら２つのパラメータは、得られたゲルの平衡膨潤の比率を決定し、従って、最終生成物中の高分子濃度とそのレオロジー特性も決定する。   Gels suitable for use in products according to one embodiment can represent a variety of different types of rheological bodies that vary from hard and fragile gels to very soft and deformable gels such as fluids. Usually, in the case of gels formed without a cross-linking reaction, such as conventional gelatin, the hardness and elasticity increase with increasing polymer density. The rheological properties of the crosslinked gel are usually a function of several parameters such as the crosslinking density in the gel, the polymer concentration, the composition of the solvent in which the crosslinked polymer is swollen, and the like. Gels with different rheological properties based on hyaluronic acid and hylan are described in the aforementioned US Pat. Nos. 4,605,691, 4,582,865, and 4,713,448. According to these patents, the rheological properties of the gel can be controlled primarily by changing the polymer concentration in the initial reaction mixture and the ratio of polymer to vinyl sulfone crosslinker. These two parameters determine the ratio of equilibrium swelling of the resulting gel and thus also determine the polymer concentration in the final product and its rheological properties.

溶媒の実質的な量は、ゲルの機械的圧縮で、予め平衡膨潤状態に達するようになったゲルから除去することができる。圧縮は、溶媒を通すがゲルを通さないスクリーンのある密閉容器の中でのゲルに圧力を加えることで得られる。圧力は、いずれかの適切な装置で、又はガス層或いは空気を通って便利に、直接にゲルに加えられる。ゲルを圧縮するには、下部に上述した半透膜がある容器内のゲルに遠心力を加えることによる方法もある。高分子ゲルスラリーの圧縮率は、ゲルの化学性質、ゲル粒子のサイズ、高分子濃度およびゲルスラリー中の自由溶媒の存在等、多くの要因によって決まる。一般に、ゲルスラリーは、スラリー中の自由溶媒の除去が迅速に進行するように圧力を受けるときに、ゲル粒子からの溶媒のずっと遅い除去が続く。ゲルスラリーからの溶媒除去の速度論は、圧力、温度、装置の構成、ゲル粒子の大きさ、およびゲルの最初の高分子濃度などのパラメータによって決まる。通常、圧力、温度、および濾過表面積の増加およびゲル粒子サイズ、最初の高分子濃度の減少は溶媒除去速度の増大につながる。   A substantial amount of the solvent can be removed from the gel that has previously reached an equilibrium swelling state by mechanical compression of the gel. Compression is obtained by applying pressure to the gel in a closed container with a screen that allows solvent to pass but not gel. The pressure is conveniently applied directly to the gel with any suitable device or through a gas layer or air. In order to compress the gel, there is a method in which centrifugal force is applied to the gel in the container having the above-described semipermeable membrane. The compressibility of the polymer gel slurry depends on many factors, such as gel chemistry, gel particle size, polymer concentration, and the presence of free solvent in the gel slurry. In general, a gel slurry is followed by a much slower removal of solvent from the gel particles when subjected to pressure such that the removal of free solvent in the slurry proceeds rapidly. The kinetics of solvent removal from the gel slurry depends on parameters such as pressure, temperature, equipment configuration, gel particle size, and the initial polymer concentration of the gel. Typically, increasing pressure, temperature, and filtration surface area and decreasing gel particle size, initial polymer concentration, lead to increased solvent removal rates.

ゲルスラリーからの溶媒の部分的な除去は、スラリーの粘着性をより高くするようにし、スラリーのレオロジー特性を実質的に変更する。変化の大きさは、以下スラリーの最初の体積と圧縮された材料の体積の比率と定義される圧縮の程度に依存する。               Partial removal of the solvent from the gel slurry makes the slurry more tacky and substantially changes the rheological properties of the slurry. The magnitude of the change depends on the degree of compression, defined below as the ratio of the initial volume of the slurry to the volume of the compressed material.

圧縮の達成可能な程度、即ちゲルスラリーの圧縮は、ゲルによって異なる。例えば、生理食塩水でのｈｙｌａｎゲルスラリーは、２０以上の圧縮比に達することが容易である。   The achievable degree of compression, ie the compression of the gel slurry, varies from gel to gel. For example, a hylan gel slurry in saline is easy to reach a compression ratio of 20 or higher.

最初の高分子濃度と同じ溶媒での圧縮されたゲルの再構成は、元のものと同一のゲルを生成する。これは、レオロジー特性を測定することと、ゲルから遠心分離による溶媒除去の速度論で証明されている。   Reconstitution of the compressed gel with the same solvent as the initial polymer concentration produces a gel identical to the original. This is evidenced by measuring rheological properties and the kinetics of solvent removal from the gel by centrifugation.

なお、一実施形態に係る粘弾性混合物のゲル相中の高分子濃度は、順番に混合物の最終用途によって決定される混合物の望ましい特性により広範囲にわたって変化することができると解すべきである。しかし、一般に、ゲル相中の高分子濃度は、０．０１から２０％、できれば０．０５から２０％とすることができる。ｈｙｌａｎとヒアルロン酸の純粋または混合ゲルの場合には、ゲル中の高分子濃度は、０．１〜１０％の範囲であることが好ましいである。また、さらに好ましいのは、膨潤溶媒が生理食塩溶液（０．１５Ｍ含水塩化ナトリウム）の場合０．１５から５％である。   It should be understood that the polymer concentration in the gel phase of a viscoelastic mixture according to one embodiment can vary over a wide range depending on the desired properties of the mixture, which in turn is determined by the end use of the mixture. However, in general, the polymer concentration in the gel phase can be 0.01 to 20%, preferably 0.05 to 20%. In the case of a hylan and hyaluronic acid pure or mixed gel, the polymer concentration in the gel is preferably in the range of 0.1 to 10%. More preferably, it is 0.15 to 5% when the swelling solvent is a physiological saline solution (0.15 M aqueous sodium chloride).

上述したように、一実施形態による粘弾性ゲルスラリーの第２相のための可溶性高分子の選択は、生産物の最終用途で決定される多くの考察によって支配される。可溶性高分子の相の中の高分子濃度は、最終混合物の好ましい特性およびゲル相の特性次第で広い範囲を超えて変化する場合がある。粘弾性ゲルスラリーのレオロジー特性が最大関心事に属する場合、可溶性高分子濃度は、それ相応に高分子の化学的性質とその分子量に十分に配慮することで選択することができる。一般に、可溶性相中の高分子濃度は０．０１％〜７０％の間である。また、好ましくは０．０２％〜４０％である。ｈｙｌａｎまたはヒアルロン酸は可溶性高分子として使用される場合には、その濃度は０．０１〜１０％の範囲内であり、好ましくは０．０２〜５％の範囲内である。コンドロイチン硫酸やデルマタン硫酸等のような他のグリコサミノグリカンが可溶性高分子として使用される場合では、はるかに低い分子量を有するため、その濃度は大幅に高くなる場合もある。   As noted above, the selection of soluble polymer for the second phase of the viscoelastic gel slurry according to one embodiment is governed by a number of considerations that are determined by the end use of the product. The polymer concentration in the soluble polymer phase may vary over a wide range depending on the preferred properties of the final mixture and the properties of the gel phase. If the rheological properties of the viscoelastic gel slurry are of greatest concern, the soluble polymer concentration can be selected accordingly with due consideration of the polymer chemistry and its molecular weight. In general, the polymer concentration in the soluble phase is between 0.01% and 70%. Moreover, Preferably it is 0.02%-40%. When hylan or hyaluronic acid is used as a soluble polymer, its concentration is in the range of 0.01 to 10%, preferably in the range of 0.02 to 5%. When other glycosaminoglycans such as chondroitin sulfate or dermatan sulfate are used as soluble polymers, they have a much lower molecular weight, so the concentration may be significantly higher.

一実施形態による粘弾性ゲルスラリーを形成する２つの相は、撹拌器や混合器のようないかなるの従来の方法で混合されることがある。ポリマー溶液の中のゲル相の一様分布を達成するために、混合は十分な時間で続くべきである。上述したように、ゲル相は既に、ゲルをメッシュ又は開口部のあるプレートで押す、又は適当な撹拌器で高速で撹拌するといういかなるの従来方法で崩壊させて取得するスラリーになっている可能性がある。その他にも、粘弾性の混合ゲルスラリーは、ポリマー溶液で大きなゲルを混合し、その後、上述のいかなるの従来の方法による粘弾性スラリーの形成との混合物で崩壊させることによって調製することができる。一実施形態によって混合ゲルスラリーを調製される前者のケースでは、ゲルスラリー相は平衡膨潤のゲルで作成され、この場合、ゲル粒子間の自由溶媒がないか又はいくつかの自由溶媒がある。後者のケースでは、この自由溶媒は、第二相として使用されるポリマー溶液の濃度を希釈する。混合物中のゲル相として使用されるゲルスラリー第三のタイプは、特性が上述された圧縮ゲルである。圧縮ゲルがポリマー溶液と混合されたとき、各成分とそれらの混合物の熱力学によって、溶液相からの溶媒がゲル相に入いってゲル相を平衡へさらに膨潤させる場合がある。   The two phases forming the viscoelastic gel slurry according to one embodiment may be mixed in any conventional manner, such as a stirrer or a mixer. In order to achieve a uniform distribution of the gel phase in the polymer solution, the mixing should continue for a sufficient time. As mentioned above, the gel phase may already be a slurry obtained by collapsing the gel with any conventional method of pushing the gel with a mesh or plate with openings or stirring at high speed with a suitable stirrer. There is. Alternatively, a viscoelastic mixed gel slurry can be prepared by mixing a large gel with a polymer solution and then disintegrating with a mixture with the formation of a viscoelastic slurry by any conventional method described above. In the former case where a mixed gel slurry is prepared according to one embodiment, the gel slurry phase is made of an equilibrium swollen gel where there is no free solvent between the gel particles or some free solvent. In the latter case, this free solvent dilutes the concentration of the polymer solution used as the second phase. The third type of gel slurry used as the gel phase in the mixture is a compressed gel whose properties are described above. When a compressed gel is mixed with a polymer solution, the thermodynamics of each component and their mixture may cause solvent from the solution phase to enter the gel phase and further swell the gel phase to equilibrium.

一実施形態による粘弾性混合ゲルスラリーの組成物は広い範囲内で変化することができる。混合物中で、ポリマー溶液は０．１〜９９．５％、好ましくは０．５〜９９％、さらに好ましくは１〜９５％を占め、残りはゲル相となる。混合物の適切な組成物の選択は、２つの成分の特性とその組成物に依存し、スラリーの望ましい特性とその最終用途によって支配される。   The composition of the viscoelastic mixed gel slurry according to one embodiment can vary within wide limits. In the mixture, the polymer solution accounts for 0.1 to 99.5%, preferably 0.5 to 99%, more preferably 1 to 95%, and the rest is the gel phase. The selection of an appropriate composition for the mixture depends on the properties of the two components and the composition, and is governed by the desired properties of the slurry and its end use.

ポリマーゲルスラリー及びポリマー溶液の２つの主要成分に加えて、一実施形態による粘弾性ゲル混合物は、２つの主要コンポーネントに加えて、生産物の最終用途に応じて、微結晶性セルロース、金属粉末、無機塩類、不溶性無機塩類、染料、界面活性物質、油、粘度調整剤、安定剤等のような薬剤、充填剤を含む様々な生理活性物質など多くの他の成分が含まれる可能性がある。   In addition to the two main components of the polymer gel slurry and polymer solution, the viscoelastic gel mixture according to one embodiment is in addition to the two main components, depending on the end use of the product, microcrystalline cellulose, metal powder, Many other ingredients may be included such as inorganic salts, insoluble inorganic salts, dyes, surfactants, agents such as oils, viscosity modifiers, stabilizers, various physiologically active substances including fillers.

一実施形態による粘弾性ゲルスラリーは、本質的に、規則形状又は不規則形状の個別粘弾性ゲル粒子が均一に分布されて流体として流動額的に作用する連続的ポリマー溶液マトリックスを表す。言い換えれば、それらの粘弾性ゲルスラリーは特定の粘度、弾性、可塑性を示す。スラリーの組成パラメータ、即ち、ゲル相と溶液相中の高分子濃度及び２つの相間の比率を変化させることで、定常流での粘度、動的モードでの弾性、緩和特性、粘性挙動と弾性挙動の比率など、スラリーのレオロジー特性を制御することができる。   A viscoelastic gel slurry according to one embodiment essentially represents a continuous polymer solution matrix in which regular or irregularly shaped individual viscoelastic gel particles are uniformly distributed and act as a fluid flow as a fluid. In other words, these viscoelastic gel slurries exhibit a specific viscosity, elasticity, and plasticity. By changing the composition parameters of the slurry, ie the polymer concentration in the gel phase and the solution phase and the ratio between the two phases, the viscosity in steady flow, elasticity in dynamic mode, relaxation properties, viscous behavior and elastic behavior The rheological properties of the slurry, such as the ratio, can be controlled.

一実施形態による粘弾性ゲルスラリーの組成パラメータにの影響を強く受ける他の特性のグループは、スラリー中へ及びスラリから周辺環境への様々な物質の拡散に関連する。拡散過程は、より詳細に後述するように、組織と薬物送達間の癒着形成の防止などのように医療分野では、粘弾性ゲルスラリーのいくつかの特定応用に極めて重要である。   Another group of properties that are strongly influenced by the composition parameters of the viscoelastic gel slurry according to one embodiment relate to the diffusion of various materials into the slurry and from the slurry to the surrounding environment. The diffusion process is extremely important for some specific applications of viscoelastic gel slurries in the medical field, such as prevention of adhesion formation between tissue and drug delivery, as described in more detail below.

組織間の癒着形成は、全ての手術の後のもっとも一般的且つ非常に望ましくない合併症の一つであることがよく知られている。癒着形成の機構は、通常分離されるべき２つの異なる組織を結合する瘢痕組織に最終的に変形するフィブリン血栓の形成を含む。癒着は不快感や痛みのような多数の望ましくない症状を引き起こし、特定の場合には生命を脅かす状況をもたらす。たとえ再手術後の癒着形成に対する保証がないとしても、癒着形成は、単に癒着を除去するために別の手術をかなり頻繁に必要とする。癒着を除去する手段の一つは、組織間の間隔へのフィブリノゲンの拡散を防止するいくつかの材料で手術中に影響を受けた組織を分離してその間隔での連続フィブリン塊の形成を除去することである。しかし、プレインゲルスラリーの場合の低分子量及び分子量物質 は、特にスラリーが体液と混合してゲル粒子が相互に分離されたときにゲル粒子間に容易に現れる。一方、一実施形態による粘弾性混合ゲルスラリーは体内に注入された（埋め込まれた）とき、ゲル粒子間に位置する高分子溶液相は体液での希釈後でも拡散を制限し続けて癒着を防止する。さらに、この効果は、高分子溶液相の高分子濃度の増加に伴ってより顕著になる。   It is well known that adhesion formation between tissues is one of the most common and highly undesirable complications after all surgeries. The mechanism of adhesion formation involves the formation of a fibrin thrombus that ultimately transforms into scar tissue that joins two different tissues to be separated. Adhesions cause a number of undesirable symptoms such as discomfort and pain, and in certain cases lead to life-threatening situations. Even if there is no guarantee for adhesion formation after re-operation, adhesion formation simply requires another surgery to simply remove the adhesion. One means of removing adhesions is to isolate the affected tissue during surgery with some material that prevents the diffusion of fibrinogen into the space between tissues and eliminate the formation of continuous fibrin clots at that interval It is to be. However, low molecular weight and molecular weight materials in the case of plain gel slurries readily appear between the gel particles, especially when the slurry is mixed with body fluid and the gel particles are separated from each other. On the other hand, when the viscoelastic mixed gel slurry according to one embodiment is injected (embedded) into the body, the polymer solution phase located between the gel particles continues to limit diffusion and prevent adhesion even after dilution with the body fluid. . Furthermore, this effect becomes more remarkable as the polymer concentration in the polymer solution phase increases.

一実施形態による粘弾性混合ゲルスラリーが薬物送達ビヒクルとして使用される場合も同様である。スラリーの各相または両方の相は、体内へ注入した後の粘弾性スラリーからゆっくり拡散する生理作用を持つ薬剤又は任意の他の物質で負荷できる。拡散率は、スラリの組成パラメータの変更で便利に制御することができる。   The same is true when a viscoelastic mixed gel slurry according to one embodiment is used as a drug delivery vehicle. Each or both phases of the slurry can be loaded with a physiologically active agent or any other substance that slowly diffuses from the viscoelastic slurry after it has been injected into the body. The diffusion rate can be conveniently controlled by changing the composition parameter of the slurry.

一実施形態による粘弾性混合ゲルスラリーの成分は、培地を通る生細胞の移動速度を落とし、様々の表面へのそれらの癒着を防止することで生細胞の挙動に影響を及ぼす。これらの効果の表明の程度は、混合物の２つの成分の組成物とそれらの比率、表面の性質と粘弾性ゲルスラリーとの相互作用、細胞型などのような要素に強く依存する。しかし、どんな場合でも、粘弾性ゲルスラリーのこの特性は、癌の増殖と転移などのような場合に細胞移動と細胞接着の調節が最も重要である医学障害の治療に使用することができる。   The components of the viscoelastic mixed gel slurry according to one embodiment affect the behavior of living cells by slowing the rate of movement of living cells through the medium and preventing their adhesion to various surfaces. The degree of manifestation of these effects is highly dependent on factors such as the composition of the two components of the mixture and their ratio, the nature of the surface and the interaction with the viscoelastic gel slurry, the cell type and the like. However, in any case, this property of the viscoelastic gel slurry can be used to treat medical disorders where the regulation of cell migration and cell adhesion is most important in cases such as cancer growth and metastasis.

一実施形態による生体適合性の粘弾性ゲルスラリーの上記の二つの応用に加えて、他の可能な応用は、軟部組織増強、眼科や耳鼻咽喉科などの分野における粘性手術用具としての材料の使用、創傷管理、整形外科における変形性関節症の治療等となる。これらの応用の全てにおいては、混合ゲルスラリーの次の基本的な特性が利用される：生体適合性、制御粘弾性と拡散特性、注入部位での容易な制御滞留時間、認めた材料の容易な取り扱い（例えば小径針を通すその注入）。以下の方法は、一実施形態によって得られる生産物の特徴づけのために使用された。溶液中のｈｙｌａｎ又はヒアルロン酸の濃度は、自動化されたカルバゾール法（Ｅ． Ａ． Ｂａｌａｚｓ， ｅｔ ａｌ， Ａｎａｌｙｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １２， ５４７−５５８， １９６５）を使用してヘキスロン酸分析試験によって決定された。ゲル相でのｈｙｌａｎ又はヒアルロン酸の濃度は、米国特許第４，５８２，８６５号の実施例１に記載したように、修飾ヘキスロン酸分析試験によって決定された。   In addition to the above two applications of the biocompatible viscoelastic gel slurry according to one embodiment, other possible applications include the use of materials as a viscous surgical tool in areas such as soft tissue augmentation, ophthalmology and otolaryngology, Wound management, treatment of osteoarthritis in orthopedics, etc. In all of these applications, the following basic properties of the mixed gel slurry are utilized: biocompatibility, controlled viscoelastic and diffusion properties, easy controlled residence time at the injection site, and easy handling of recognized materials. (For example, injection through a small diameter needle). The following method was used to characterize the product obtained by one embodiment. The concentration of hylan or hyaluronic acid in the solution was determined by hexuronic acid analysis test using an automated carbazole method (EA Balazs, et al, Analyt. Biochem. 12, 547-558, 1965). . The concentration of hylan or hyaluronic acid in the gel phase was determined by a modified hexuronic acid assay as described in Example 1 of US Pat. No. 4,582,865.

粘度測定、振動とリラクゼーション：レオロジー特性は、制御されたせん断速度と３つのモードで動作することができますと、コンピュータ化レオですボーリンレオメータシステムで評価した。レオロジー特性は、制御せん断率のコンピュータ化レオメータであり、粘度測定、振動、緩和の３つのモードで動作することができるＢｏｈｌｉｎレオメータシステムで評価された。低・高せん断率（速度）での剪断粘度の測定は、粘弾性ゲルスラリー及び、生産物の多くの応用にとって重要であるそれらの擬似塑性（異なるせん断率での粘度の比）を特徴づける。様々な周波数での粘弾性特性の測定は、弾性（貯蔵弾性率Ｇ’）の特性と粘性（損失弾性率Ｇ”）の特性間のバランスを特徴づけた。緩和特徴は、時間に対するせん断弾性率Ｇの変化として評価され、異なる緩和時間での２つの弾性率の値の比率として表された。   Viscosity measurement, vibration and relaxation: The rheological properties can be operated in a controlled shear rate and three modes, computerized rheo, and evaluated with a Borin rheometer system. Rheological properties were evaluated with a Bohlin rheometer system that is a computerized rheometer with controlled shear rate and can operate in three modes: viscosity measurement, vibration, and relaxation. The measurement of shear viscosity at low and high shear rates (velocities) characterizes viscoelastic gel slurries and their pseudoplasticity (ratio of viscosity at different shear rates) which is important for many product applications. The measurement of viscoelastic properties at various frequencies characterized the balance between the properties of elasticity (storage modulus G ′) and viscosity (loss modulus G ″). The relaxation feature is the shear modulus over time. It was evaluated as the change in G and expressed as the ratio of the two elastic modulus values at different relaxation times.

次に、様々なＨＡの架橋のアプローチについて説明される。以下の反応は主に、ヒドロキシル基及びカルボキシル基という最も反応性のある２つの官能基に重点を置く。   Next, various HA cross-linking approaches are described. The following reaction mainly focuses on the two most reactive functional groups, the hydroxyl group and the carboxyl group.

１． ビスエポキシド、（Ｂｉｓｅｐｏｘｉｄｅ）
エチレングリコールジグリシジルエーテル（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）
１，４ブタンジオールジグリシジルエーテル（ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）
この方法は、もともとアガロースを架橋結合するために開発された。現在、ＨＡを架橋結合するために、反応がｂｉｓｅｐｏｘｙｂｕｔａｎｅと水素化ホウ素ナトリウムを用いた希釈なＮａＯＨ中である。 ６０℃のエタノール０．１ Ｎ ＮａＯＨ中エチレングリコールジグリシジルエーテルとヒアルロン酸との反応ももヒドロゲルが得られた。その結果生まれるゲルは、含水率が高く（＞９５％）、炎症（刺激）・注射方薬物送達のための応答性分解可能なマトリックスとしての使用のために調査された。 1. Bisepoxide, (Bisepoxide)
Ethylene glycol diglycidyl ether (Ethyleneglycol ether)
1,4 butanediol diglycidyl ether (butanediol diglycidyl ether)
This method was originally developed to crosslink agarose. Currently, to crosslink HA, the reaction is in dilute NaOH using biseoxybutane and sodium borohydride. A hydrogel was also obtained from the reaction of ethylene glycol diglycidyl ether and hyaluronic acid in ethanol 0.1 N NaOH at 60 ° C. The resulting gel was high in water content (> 95%) and was investigated for use as a responsive degradable matrix for inflammation (stimulation) and injectable drug delivery.

ヒアルロン酸とアルカリ性の１，４ − ブタンジオールジグリシジルエーテルから調製されたヒドロゲルは高度に多孔質であった。そして、この材料はｐｅｒｉｏｘｉｄａｔｅで活性化された後、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ （ＲＧＤ）という細胞接着ドメインを含む１８アミノ酸ペプチドで修飾されてヒドロゲルとの細胞接着を高める。アルカリ性媒体中で、ジビニルスルホンも、多分ヒドロキシル基との反応を経由してヒアルロン酸と架橋結合する。   Hydrogels prepared from hyaluronic acid and alkaline 1,4-butanediol diglycidyl ether were highly porous. This material is activated with periodoxide and then modified with an 18 amino acid peptide containing a cell adhesion domain called Arg-Gly-Asp (RGD) to enhance cell adhesion with the hydrogel. In an alkaline medium, divinyl sulfone also crosslinks with hyaluronic acid, possibly via reaction with hydroxyl groups.

２． ジビニルスルホン（ＤＶＳ）
アルカリ性媒体中で、多分ジビニルスルホンも、ヒドロキシル基との反応を経由してヒアルロン酸と架橋結合する。． 2. Divinyl sulfone (DVS)
In an alkaline medium, perhaps divinyl sulfone also crosslinks with hyaluronic acid via reaction with hydroxyl groups. .

３． Ｉｎｔｅｒｎ内部エステル化
自動架橋（ＡＣＰ（商標）， Ｆｉｄｉａ）は、ヒアルロン酸のヒドロキシル基とカルボキシル基の間にある分子間・分子内の両方の結合の、ヒアルロン酸の内部エステル化誘導体である。ＡＣＰ（商標）は、白い粉に凍結乾燥させ、透明ゲルに水和させことができる。この新しい種類の生体材料は術後の。。。を減少させる障壁として使用されている。 3. Internal Internal Esterification Autocrosslinking (ACP ™, Fidia) is an internal esterified derivative of hyaluronic acid, both intermolecular and intramolecular bonds between the hydroxyl and carboxyl groups of hyaluronic acid. ACP ™ can be lyophilized to a white powder and hydrated to a clear gel. This new kind of biomaterial is post-operative. . . It is used as a barrier to reduce.

４． 光架橋
ヒアルロン酸のメタクリル酸誘導体は、ヒアルロン酸ブチラートの上述のように、過剰のメタクリル酸無水物での水酸基のエステル化により合成された。この誘導体は、５１４ｎｍのアルゴンイオンレーザ照射下での開始剤として、１−ビニル−２−ピロリドン及びトリエタノールアミンの中のエチルエオシンを使用して安定ヒドロゲルを形成するために、光架橋結合された。障害組織を囲む粘着ゲルの形成をもたらすヒアルロン酸誘導体のその場光重合の使用は、周囲の器官からの分離を提供して癒着の形成を防止することができる。予備細胞カプセル試験は、ランゲルハンス島を用いて順調に行ってインスリンのバイオ人工の源を開発する。 4). Photocrosslinking The methacrylic acid derivative of hyaluronic acid was synthesized by esterification of the hydroxyl group with excess methacrylic anhydride as described above for hyaluronic acid butyrate. This derivative was photocrosslinked to form a stable hydrogel using 1-vinyl-2-pyrrolidone and ethyl eosin in triethanolamine as an initiator under 514 nm argon ion laser irradiation. . The use of in situ photopolymerization of a hyaluronic acid derivative that results in the formation of an adhesive gel that surrounds the damaged tissue can provide separation from the surrounding organs to prevent the formation of adhesions. Preliminary cell capsule testing will be performed successfully using the islets of Langerhans to develop a bioartificial source of insulin.

５． グルタルアルデヒド架橋
このプロセスの化学的性質が確認されなかったが、陽イオン交換ヒアルロン酸ナトリウム（１．６ＭＤａ）から押し出されたヒアルロン酸ストランドは、グルタルアルデヒド水溶液中で架橋された。次にストランドの表面は、ポリ−Ｄ−リジンとポリ−Ｌ−リジンの付着で再構築された。ポリペプチド再浮上のヒアルロン酸ストランドは良好な生体適合性を示し、細胞接着を促進した。 5. Glutaraldehyde cross-linking Although the chemistry of this process was not confirmed, hyaluronic acid strands extruded from cation-exchanged sodium hyaluronate (1.6 MDa) were cross-linked in aqueous glutaraldehyde solution. The strand surface was then reconstructed with poly-D-lysine and poly-L-lysine attachment. The hyaluronic acid strands that floated on the polypeptide showed good biocompatibility and promoted cell adhesion.

６． 金属陽オン媒介架橋
Ｉｎｔｅｒｇｅｌ（登録商標）（ＦｅＨＡ、ＬｉｆｅＣｏｒｅ）は水酸化第二鉄とのキレート化によって形成されたヒアルロン酸のヒドロゲル製剤である。ヒアルロン酸の同様の架橋は、銅、亜鉛、カルシウム、バリウム、およびその他のキレート化金属を使用する製剤の基礎となっている。赤みがかったＦｅＨＡゲルは手術後の癒着を防止するための開発中です。 6). Metal cation mediated crosslinking Intergel® (FeHA, LifeCore) is a hydrogel formulation of hyaluronic acid formed by chelation with ferric hydroxide. Similar cross-linking of hyaluronic acid is the basis for formulations using copper, zinc, calcium, barium, and other chelating metals. Reddish FeHA gel is under development to prevent post-surgical adhesions.

７． カルボジイミド架橋
Ｉｎｃｅｒｔ（登録商標）は、含水イソプロパノール中でビスカルボジイミドとヒアルロン酸を架橋することにより調製された生体吸収性スポンジ（Ａｎｉｋａ治療法）である。この方法は、ヒアルロン酸と反応してＮ−アシル尿素（Ｎ−ａｃｙｌｕｒｅａｓ）を形成するために、カルボジイミドの望ましくない傾向を利用する。この応用では、２つのＮ−アシル尿素結合の形成は、化学的な安定性及び副産物のない架橋を提供する。疎水性ビスカルボジイミドが使用されため、Ｉｎｃｅｒｔ（登録商標）は、血液の存在でさえその効き目を縫合・保持する必要なく組織に付着する。最近では、ウサギ糞便摩耗の研究で術後癒着を防止するのに有効であることが分かった。 7). Carbodiimide cross-linking Incert® is a bioabsorbable sponge (Anika treatment) prepared by cross-linking biscarbodiimide and hyaluronic acid in hydrous isopropanol. This method takes advantage of the undesirable tendency of carbodiimides to react with hyaluronic acid to form N-acylureas. In this application, the formation of two N-acyl urea bonds provides chemical stability and cross-linking without byproducts. Because hydrophobic biscarbodiimide is used, Incert® adheres to tissue without the need to sew and retain its effectiveness even in the presence of blood. Recently, studies on rabbit fecal wear have proved effective in preventing postoperative adhesions.

低含水ヒアルロン酸ヒドロゲル膜は、水溶性カルボジイミドと一緒にヒアルロン酸（１．６ＭＤａ）膜をヒアルロン酸の水混和性非溶媒を含む水性混合物中のカップリング剤として架橋する。低含水ヒドロゲル酸が得られた最も高い架橋度は８０％エタノールの中で得られた。含水率６０％のこの膜は、緩衝液への浸漬後２週間わたって安定した状態を保つ。Ｌ−リジンメチルエステルの存在下で、水溶性カルボジイミドとヒアルロン酸膜との架橋は、さらにヒアルロン酸膜の生体内分解を延長させた。   A low water content hyaluronic acid hydrogel membrane crosslinks a hyaluronic acid (1.6 MDa) membrane together with a water soluble carbodiimide as a coupling agent in an aqueous mixture containing a water miscible non-solvent of hyaluronic acid. The highest degree of cross-linking that resulted in low hydrous hydrogel acid was obtained in 80% ethanol. This membrane with a moisture content of 60% remains stable for 2 weeks after immersion in the buffer. In the presence of L-lysine methyl ester, the cross-linking of the water-soluble carbodiimide and the hyaluronic acid membrane further extended the biodegradation of the hyaluronic acid membrane.

８． ヒドラジド架橋
上述したヒドラジド化学を使用することで、ヒドロゲルは、ビスヒドラジド（ｂｉｓｈｙｄｒａｚｉｄｅ）、トリスヒドラジド（ｔｒｉｓｈｙｄｒａｚｉｄｅ）、多価ヒドラジド化合物を用いて調製されている。試薬の反応条件及びモル比を調整することで、軟質且つ注入可能なゲルから機械的硬質且つ砕けやすいゲルまでの範囲の、物理化学的特徴のあるゲルを得ることができる。ＨＡ−ＡＤＨは、販売の小分子ホモバイファンクショナル架橋剤を用いて架橋結合することができる。 8). Hydrazide Crosslinking Using the hydrazide chemistry described above, hydrogels have been prepared using bishydrazide, trishydrazide, and polyhydric hydrazide compounds. By adjusting the reaction conditions and molar ratios of the reagents, gels with physicochemical characteristics ranging from soft and injectable gels to mechanically hard and friable gels can be obtained. HA-ADH can be cross-linked using commercially available small molecule homobifunctional cross-linkers.

最近になって、その場重合技術は、生理学的条件下でＰＥＧ−ジアルデヒドの高分子架橋剤を用いてＨＡ−ＡＤＨを架橋結合することで開発された。明確に定義された機械的強度を持つ、生態適合性且つ生分解性のヒアルロン酸ヒドロゲル膜は、溶媒の蒸発後得られた。高分子薬物はこれらのヒアルロン酸ハイドロゲル膜からゆっくり放出され、これらの新しい材料は創傷治癒中に再上皮化を促進した。   More recently, in situ polymerization techniques have been developed by cross-linking HA-ADH with a PEG-dialdehyde polymeric crosslinker under physiological conditions. Biocompatible and biodegradable hyaluronic acid hydrogel membranes with well-defined mechanical strength were obtained after evaporation of the solvent. Macromolecular drugs were slowly released from these hyaluronic acid hydrogel membranes, and these new materials promoted re-epithelialization during wound healing.

１． 残余蛋白質での架橋
これの例はＨｙｌａｎ （生物基質）である。これらは、塩基性溶液中でホルムアルデヒドとヒアルロン酸含有の残余蛋白質を架橋することで形成されたヒドロゲル又はヒドロゾルである。１３可溶性ｈｙｌａｎは、ヒアルロン酸と比較してより強化レオロジー特性を示すヒアルロン酸の高分子量型（８ − ２３ＭＤａ）である。Ｈｙｌａｎゲルは、可溶性ｈｙｌａｎ材料より弾性と粘性が高いし、自然ヒアルロン酸の高い生体適合性を維持できる。Ｈｙｌａｎは数多くの医学的応用において研究されている。 1. Cross-linking with residual protein An example of this is Hylan (biological substrate). These are hydrogels or hydrosols formed by crosslinking formaldehyde and residual protein containing hyaluronic acid in a basic solution. 13 soluble hylan is a high molecular weight form (8-23MDa) of hyaluronic acid that exhibits enhanced rheological properties compared to hyaluronic acid. Hylan gel is more elastic and viscous than soluble hylan material and can maintain high biocompatibility of natural hyaluronic acid. Hylan has been studied in numerous medical applications.

２． 多成分反応
（１）パセリーニ 反応及び（２）ウギ反応として知られている３〜４成分反応がある。 2. Multicomponent reactions There are 3-4 component reactions known as (1) Parsellini reaction and (2) Ugi reaction.

パセリーニ 反応では、ヒアルロン酸の水溶液が含水グルタルアルデヒド（又は他の水溶性ジアルデヒド）と混合され、反応性の高いイソシアン化物、例えば、シクロヘキシルイソシアニドの既知量に添加される。   In the Parsellini reaction, an aqueous solution of hyaluronic acid is mixed with hydrous glutaraldehyde (or other water-soluble dialdehyde) and added to a known amount of a highly reactive isocyanate, such as cyclohexyl isocyanide.

４成分反応のウギ反応では、ジアミンがこの３成分混合物に添加される。   In the four-component eel reaction, diamine is added to the ternary mixture.

架橋度は、アルデヒドとジアミンの量によって制御される。   The degree of crosslinking is controlled by the amount of aldehyde and diamine.

３． 表面修飾
一例では、高分子表面を発散するようにアルゴンガスとアンモニアガスプラズマで活性化されたポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）の表面で行うべきである。次に、表面のペンダントカルボン酸官能基を得るために、発散された表面は無水コハク酸で修飾された。その後、このペンダントカルボン酸官能基は、カルボジイミドの存在したでＨＡ−ＡＤＨと一緒に凝縮されて、親水性、非粘着性且つ滑らかなプラスチック表面を得た。金属表面とガラス表面は、表面活性化、その後適切なヒアルロン酸誘導体の共有結合性科学的付着によって修飾することができる。 3. Surface Modification In one example, it should be performed on the surface of polypropylene (PP), polystyrene (PS) activated with argon gas and ammonia gas plasma to diverge the polymer surface. The emitted surface was then modified with succinic anhydride to obtain surface pendant carboxylic acid functionality. This pendant carboxylic acid functional group was then condensed with HA-ADH in the presence of carbodiimide to obtain a hydrophilic, non-tacky and smooth plastic surface. Metal and glass surfaces can be modified by surface activation followed by covalent chemical attachment of an appropriate hyaluronic acid derivative.

２． 以下に示すように、ＨＡの４つの異なる治療的修飾のオプションがある。   2. As shown below, there are four different therapeutic modification options for HA.

１． Ａ： ＨＡは、（１）ヒドロキシル基の位置と（２）カルボキシル基の位置の２つの箇所で架橋することができる。               1. A: HA can be crosslinked at two locations: (1) the position of the hydroxyl group and (2) the position of the carboxyl group.

２． Ｂ：ヒドロキシル基及び／又はカルボキシル基と反応しやすい官能基を持つ薬剤はＨＡ分子上に結合され、ＨＡ分子は薬剤の担体として作用することができる。               2. B: A drug having a functional group that easily reacts with a hydroxyl group and / or a carboxyl group is bound on the HA molecule, and the HA molecule can act as a carrier for the drug.

３． Ｃ：個別ＨＡ分子は、ヒドロキシル基及び／又はカルボキシル基と反応しやすいペンダント官能基を有するポリマー鎖に移植又は共有結合することができる。               3. C: Individual HA molecules can be grafted or covalently attached to polymer chains with pendant functional groups that are susceptible to reaction with hydroxyl and / or carboxyl groups.

４． Ｄ：ＨＡ分子は、それらの官能基が反応しやすい提供されたリポソームに移植することができる。               4). D: HA molecules can be implanted into provided liposomes where their functional groups are susceptible to reaction.

ＨＡ治療修飾のオプションは、架橋ＨＡヒドロゲル、ＨＡ薬剤バイオコンジュゲート（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、ＨＡ移植共重合体、ＨＡリポソームを含む。   Options for HA therapeutic modification include cross-linked HA hydrogels, HA drug bioconjugates, HA graft copolymers, HA liposomes.

ＨＡ反応部位               HA reaction site

５． カルボキシル基化学反応
１． エステル化 5. Carboxyl group chemical reaction Esterification

エステル化ヒアルロン酸の生体材料は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中でハロゲン化アルキルとヒアルロン酸のテトラ（ｎ−ブチル）アンモニウム塩とのアルキル化によって調製されている。これらのヒアルロン酸エステルは、膜および繊維生成するために押し出したり、スポンジを得るために凍結乾燥したり、微小球を生産するために噴霧乾燥・抽出・蒸発で処理したりすることができる。これらの高分子は、乾燥時は優れた機械的強度を示すが、水和したものはそれほど丈夫ではない。エステル化度は、酵素分解に対して剛性と安定性がより高く感受性がより低いポリマー鎖ネットワークを生成する疎水性パッチのサイズに影響を与える。   Esterified hyaluronic acid biomaterials are prepared by alkylation of alkyl halides with tetra (n-butyl) ammonium salt of hyaluronic acid in dimethylformamide (DMF) solution. These hyaluronic acid esters can be extruded to produce membranes and fibers, lyophilized to obtain sponges, or processed by spray drying, extraction, and evaporation to produce microspheres. These polymers exhibit excellent mechanical strength when dried, but are not very strong when hydrated. The degree of esterification affects the size of the hydrophobic patch that produces a polymer chain network that is more rigid and stable and less sensitive to enzymatic degradation.

２． カルボジイミド媒介反応   2. Carbodiimide mediated reaction

３． カルボジイミド化合物によるのヒアルロン酸のカルボキシル官能基の化学的修飾は一般的にｐＨ ４．７５で水中で行われる。 3. Chemical modification of the carboxyl function of hyaluronic acid with a carbodiimide compound is generally performed in water at pH 4.75.

６． ヒドロキシル基化学反応
ｉ． 硫酸化
ＤＭＦ中で、ピリジン − 三酸化硫黄 コンプレックスとのヒアルロン酸の硫酸化は、ＨｙａｌＳｘという異なる程度の硫酸化を生産する（二糖当たりにｘ ＝ １ - ４）。次に、硫酸化ヒアルロン酸ＨｙａｌＳ３．５は、ジアミンポリエチレングリコール誘導体及び水溶性カルボジイミドを用いてプラズマ処理ポリエチレン（ＰＥ）上に固定された。トロンビン時間試験及び血小板粘着の挙動は、この方法で血液適合性且つ抗血栓のＰＥ表面の調製が期待できることを示された。また、ＨｙａｌＳｘは、光解離性アジドフェニルアミノ誘導体に変換され、テレフタル酸ポリエチレン（ＰＥＴ）膜上に光固定化された。硫酸化ヒアルロン酸でコーティングされた９表面は、コーティングされていない表面と比較して、細胞付着、汚染、細菌増殖の顕著な減少を示す。コーティングはコンドロイチナーゼとヒアルロニダーゼによる分解に対して安定であった。 6). Hydroxyl group chemical reaction i. Sulfation Hydration of hyaluronic acid with pyridine-sulfur trioxide complex in DMF produces a different degree of sulfation, HyalSx (x = 1-4 per disaccharide). Next, sulfated hyaluronic acid HyalS3.5 was immobilized on plasma treated polyethylene (PE) using a diamine polyethylene glycol derivative and a water soluble carbodiimide. The behavior of the thrombin time test and platelet adhesion showed that preparation of hemocompatible and antithrombotic PE surfaces could be expected with this method. HyalSx was converted to a photolabile azidophenylamino derivative and photofixed on a polyethylene terephthalate (PET) film. Nine surfaces coated with sulfated hyaluronic acid show a marked decrease in cell attachment, contamination, and bacterial growth compared to uncoated surfaces. The coating was stable against degradation by chondroitinase and hyaluronidase.

ヒアルロン酸ブチレートは、特に、腫瘍細胞への標的薬剤送達システムとして用いられる。酪酸は、細胞の分化を誘導し、ＤＭＦ含有ジメチルアミノピリジン中での、無水酪酸と低分子量ヒアルロン酸のｓｙｍ−ｃｏｌｌｉｄｉｎｉｕｍ塩との反応を介して、ヒアルロン酸と共役させられたヒト腫瘍の種々の増殖を阻害することが知られている。   Hyaluronic acid butyrate is used in particular as a targeted drug delivery system to tumor cells. Butyric acid induces cell differentiation, and various types of human tumors conjugated to hyaluronic acid through the reaction of butyric anhydride with sym-collidinium salt of low molecular weight hyaluronic acid in DMF-containing dimethylaminopyridine. It is known to inhibit proliferation.

ｉｉ． イソ尿素共役又は臭化シアン活性化
アントラサイクリン系抗生物質アドリアマイシン及びダウノマイシンは、臭化シアン（ＣＮＢｒ）活性化を介してヒアルロン酸と共役させられた。この反応スキームは、一般に、オリゴ糖蓄積を活性化して反応性の高いイソ尿素中間対を介して親和マトリックスを生成するために使用される。治療薬は オリゴ糖蓄積又は、ウレタン結合を介してグリコサミノグリカンのヒドロキシル官能基の１つに付着するが、分光検証はなかった。さらに、反応条件の厳しさはヒアルロン酸の完全性及び生体適合性を危険にさらす可能性がある。 ii. Isourea coupling or cyanogen bromide activation The anthracycline antibiotics adriamycin and daunomycin were conjugated to hyaluronic acid via cyanogen bromide (CNBr) activation. This reaction scheme is generally used to activate oligosaccharide accumulation and generate an affinity matrix via a highly reactive isourea intermediate pair. The therapeutic agent attached to one of the hydroxyl functional groups of glycosaminoglycan via oligosaccharide accumulation or urethane linkages, but there was no spectroscopic verification. Furthermore, the severity of the reaction conditions can jeopardize the integrity and biocompatibility of hyaluronic acid.

ｉｉｉ． ペルオキシダーゼ酸化
反応性ビスアルデヒド官能基は、ペルオキシダーゼナトリウムの酸化で、ヒアルロン酸上の近接第２級アルコールから生成することができる。 iii. Peroxidase oxidation Reactive bisaldehyde functional groups can be generated from proximate secondary alcohols on hyaluronic acid by oxidation of sodium peroxidase.

反応性官能基ｂｉｓａｌｄｅｈｙｄｅナトリウムペルオキシダーゼによる酸化によってヒアルロン酸に隣接第二級アルコール関数から生成することができる。この化学的性質（現象・作用）は、親和固定化又は蛍光プローブへの変換のための、糖タンパク質の化学活性化の標準方法である。ペルオキシダーゼ活性化されたヒアルロン酸で、第１級アミノと共役させることで、架橋、細胞付着ドメインを含むペプチドの付着、固定化材料を得ることができる。厳しい酸化処理は、鎖切断及び潜在的且つ免疫原性結合をヒアルロン酸生体材料の中に入り込ませる。   It can be generated from a secondary alcohol function adjacent to hyaluronic acid by oxidation with the reactive functional group bisaldehyde sodium peroxidase. This chemical property (phenomenon / action) is a standard method for chemical activation of glycoproteins for affinity immobilization or conversion to fluorescent probes. By conjugating with primary amino acid with peroxidase activated hyaluronic acid, it is possible to obtain a cross-linked, peptide-attached or cell-immobilized material containing a cell adhesion domain. Severe oxidation treatment causes strand scission and potential and immunogenic binding to enter the hyaluronic acid biomaterial.

ｉｖ． 還元末端修飾
ヒアルロン酸の還元末端の還元的アミノ化は、、親和マトリックス、フルオロフォアで標識した材料、ヒアルロン酸リン脂質を調製してヒアルロン酸リポソーム内へ挿入するために使用されている。例えば、低分子量ヒアルロン酸はホスファチジル・エタノールアミンに共有結合され、この複合体は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子の表面上の保護用「砂糖の装飾」のために使用されている。グリコサミノグリカン毎に１つだけの付着店があるので、末端標識化は、ヒアルロン酸生体材料又はプロドラッグの用途に広く使用されていない。 iv. Reducing End Modification Reductive amination of the reducing end of hyaluronic acid has been used to prepare and insert affinity matrices, fluorophore-labeled materials, hyaluronic acid phospholipids into hyaluronic acid liposomes. For example, low molecular weight hyaluronic acid is covalently bound to phosphatidyl ethanolamine, and this complex is used for protective “sugar decoration” on the surface of low density lipoprotein (LDL) particles. End labeling has not been widely used for hyaluronic acid biomaterials or prodrug applications because there is only one attachment store per glycosaminoglycan.

ｖ． アミド修飾
幾つかの調合剤では、天然ヒアルロン酸は、誘導体化され得る多くの自然脱アシル化グルコサミン単位を持つ。還元末端修飾と同様に、これは非常に低い修飾率を提供する。しかし、一般的使われているヒドラジン分解法が使用される場合、Ｎ−アセチル基の修飾は重要になることもある。ヒアルロン酸の限られたヒドラジンは、ヒアルロン酸上でフリーグルコサミン残留物を作成するだけでなく、塩基誘導主鎖分解及び還元末端修飾をもたらすことがある。
v. Amide Modification In some formulations, natural hyaluronic acid has many naturally deacylated glucosamine units that can be derivatized. Like the reducing end modification, this provides a very low modification rate. However, modification of the N-acetyl group may be important when a commonly used hydrazine decomposition method is used. Hyaluronic acid's limited hydrazine not only creates a free glucosamine residue on hyaluronic acid, but may also lead to base-induced backbone degradation and reducing end modification.

更に他の実験では、材料は以下のような方法を含むことがある。   In yet other experiments, the material may include the following methods.

１． 実験的方法
１． 実験００１−１２：油中水乳剤架橋反応 1. Experimental method Experiment 001-12: Water-in-oil emulsion cross-linking reaction

１． 反応は油中水乳剤反応である
２． 室温で１時間で反応させる
３． 遠心分離機でゲル粒子を収集する
４． アセトンで洗浄する 1. The reaction is a water-in-oil emulsion reaction. 2. React in 1 hour at room temperature. 3. Collect gel particles with a centrifuge. Wash with acetone

２． 実験００１−１４   2. Experiment 001-14

１． 最初にＸ−Ｌｉｎｋｅｒ混合を調合する。 1. First prepare X-Linker mix.

２． 次に、反応混合物する。   2. Next, the reaction mixture is prepared.

３． 「ａ」〜「ｅ」のＸ−Ｌｉｎｋｅｒ混合をＨＡに添加する。反応が起こる。   3. Add X-Linker mix of “a”-“e” to HA. A reaction takes place.

４． Ｘ−Ｌｉｎｋｅｒ混合をＨＡの中にうまく入り込むようにヘラでよく混ぜる。   4). Mix well with a spatula so that the X-Linker mix goes well into the HA.

５． ３０〜６０分おきに混ぜながら、各反応が室温で起こるようにする。   5. Allow each reaction to occur at room temperature with mixing every 30-60 minutes.

６． 反応の８時間後の生産物は架橋ヒアルロン酸ゲルである。   6). The product after 8 hours of reaction is a crosslinked hyaluronic acid gel.

７． ３０分おきに混ぜながら、５２℃で、３時間で置いておく。   7). Leave at 52 ° C. for 3 hours with mixing every 30 minutes.

８． ＰＢＳで３Ｘ洗浄する。   8). Wash 3X with PBS.

３． ＨＡ Ｘ−ｌｉｎｋｉｎｇ過程の中の成分の境界条件
実験００１−１６：Ｘ−ｌｉｎｋｅｒ混合保管期間及び反応温度
１． Ｘ−ｌｉｎｋｅｒ混合は調合してから２４時間内で使用、室温条件で保管しなければならない。 3. Boundary conditions of components in the HA X-linking process Experiment 001-16: X-linker mixed storage period and reaction temperature X-linker mixes must be used within 24 hours of preparation and stored at room temperature.

１． ５０℃の反応温度は１時間以上保持するには高すぎる。   1. The reaction temperature of 50 ° C. is too high to hold for 1 hour or more.

実験００１−１７：１％ ＮａＯＨの保管期間
２． Ｘ−ｌｉｎｋｅｒを含むＮａＯＨ溶液は調製してから１時間ないで使用すべきである。 Experiment 001-17: Storage period of 1% NaOH A NaOH solution containing X-linker should be used within one hour of preparation.

３． １．でのＮａＯＨ濃度は、完全的反応生産物を得るには低すぎる。   3. 1. The NaOH concentration at is too low to obtain a complete reaction product.

１． Ｘ−Ｌｉｎｋｅｒ保管期間 − ＢＤＤＥ
１． 実験００１−１８：一旦ＢＤＤＥを含む混合物がＮａＯＨと混合されたら、３時間内で使用すべきであることが分かる。
1. X-Linker storage period-BDDE
1. Experiment 001-18: Once the mixture containing BDDE is mixed with NaOH, it can be seen that it should be used within 3 hours.

４． Ｘ−Ｌｉｎｋｅｒ保管期間 − ＤＶＳ “ＴＢＤ”
５． 実験００１−１９ 4). X-Linker storage period-DVS “TBD”
5. Experiment 001-19

１． ＡとＢを一緒に添加してよく混合する。 1. Add A and B together and mix well.

２． ３０分おきに混ぜながら、室温で、２時間で置いておく。   2. Leave at room temperature for 2 hours, mixing every 30 minutes.

３． ３０分おきに混ぜながら、５０℃で、１時間で置いておく。   3. Leave at 50 ° C. for 1 hour with mixing every 30 minutes.

４． 生産物は、Ｊｕｖｅｄｅｒｍという商品に非常によく似ている。
4). The product is very similar to a product called Juvederm.

６． 実験００１−２１   6). Experiment 001-21

１． ＡとＢ１〜Ｂ５のそれぞれと一緒に添加してよく混合する。 1. Add together with each of A and B1-B5 and mix well.

２． ３０分おきに混ぜながら、室温で、２時間で置いておく。   2. Leave at room temperature for 2 hours, mixing every 30 minutes.

３． ３０分おきに混ぜながら、５０℃で、１時間で置いておく。   3. Leave at 50 ° C. for 1 hour with mixing every 30 minutes.

４． 生産物は、Ｊｕｖｅｄｅｒｍという商品に非常によく似ている。   4). The product is very similar to a product called Juvederm.

７． Ｘ−Ｌｉｎｋｉｎｇレベルの効果
１． 実験００１−２２：ＢＤＤＥ （１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル） 7). Effect of X-Linking level Experiment 001-22: BDDE (1,4-butanediol diglycidyl ether)

１． 実験
００１−２５： ＤＶＳ （ジビニルスルホン）
２． 1. Experiment 001-25: DVS (Divinylsulfone)
2.

一実施形態では、ＨＡは、単相の特性を有するシステムを形成するために、直列に架橋することができる。ＩＰＮのような生体適合性架橋高分子は、ヘテロ多糖類を架橋して単一架橋材料を形成し、単一架橋材料の上に１つ以上の追加架橋を行って多重架橋材料を形成する。多重架橋材料は、前記単一架橋材料より、人体内で長く持続できるコアを有している。その結果、少しされたところから高度に架橋されたコアまで、スムーズな連続体の材料が形成される。少し架橋材料は、小さなゲージ注射器でＨＡを人体内に簡単に入り込ませることができるが、このような少し架橋材料が人体内で長く持続しない。しかし、従来のＨＡ皮膚充填剤と異なって、高度架橋材料は、人体内に長く持続して身体増強の定期的なタッチアップが要らないである。 In one embodiment, the HA can be cross-linked in series to form a system with single phase properties. Biocompatible cross-linked polymers such as IPN cross-link heteropolysaccharides to form a single cross-linked material and perform one or more additional cross-links on the single cross-linked material to form multiple cross-linked materials. The multiple cross-linking material has a core that can last longer in the human body than the single cross-linking material. As a result, a smooth continuous material is formed from a small amount to a highly crosslinked core. A little cross-linked material can allow HA to easily enter the human body with a small gauge syringe, but such a little cross-linked material does not last long in the human body. However, unlike traditional HA skin fillers, highly cross-linked materials do not require long-lasting, regular touch-up of body enhancement in the human body.

好適な実施形態による遅延架橋剤の、安定且つ非水の懸濁液は、以下のいずれかを変化させることによって制御することができる。   Stable and non-aqueous suspensions of delayed crosslinkers according to preferred embodiments can be controlled by changing any of the following:

１）使用された架橋化合物
２） 懸濁液中のＨＡの粒径
３）ＨＡを含む流体のｐＨ
４）ＨＡ懸濁液の濃度（すなわち、負荷）
５）溶液の温度
実例として、同様の条件下で使用された場合、ＨＡ化合物の分子量の種類は、水溶性溶液正確な架橋時間を制御するように効果的に用いることができる。より具体的には、よりゆっくりと低分子量酸の懸濁液よりも大きい分子量ＨＡは、クロスリンクの懸濁液。 1) Cross-linked compound used 2) Particle size of HA in suspension 3) pH of fluid containing HA
4) Concentration of HA suspension (ie load)
5) Solution temperature As an example, when used under similar conditions, the type of molecular weight of the HA compound can be effectively used to control the exact crosslinking time of the aqueous solution. More specifically, a molecular weight HA that is slower than a low molecular weight acid suspension is a cross-linked suspension.

懸濁（した）ヒアルロン酸の粒径に関して、粒径が大きくなるにつれて、水溶性高分子溶液の架橋のために必要となる時間が増加していく。逆に、粒径が小さくなるにつれて、水溶性高分子溶液の架橋のために必要となる時間が減少していく。   Regarding the particle size of the suspended hyaluronic acid, the time required for crosslinking the water-soluble polymer solution increases as the particle size increases. Conversely, as the particle size decreases, the time required for crosslinking of the water-soluble polymer solution decreases.

水溶性高分子溶液の架橋の前のｐＨは、架橋時間を制御するために使用することができる。水溶性高分子溶液のｐＨは、遅延架橋剤の安定且つ非水性の懸濁液の溶解速度に影響を及ぼす。具体的に言うと、懸濁液にはＨＡ粒子の大部分が含まれている場合、水溶性高分子溶液のｐＨが高くなるにつれて、架橋剤懸濁液の溶解速度が増加していくのに対し、懸濁液にはホウ砂粒子の大部分が含まれている場合、水溶性高分子溶液のｐＨが低くなるにつれて、架橋剤懸濁液の溶解速度が減少していく。逆に、懸濁液にはホウ砂粒子の大部分が含まれている場合、水溶性高分子溶液のｐＨが低くなるにつれて、架橋剤懸濁液の溶解速度が減少していくのに対し、懸濁液にはＨＡ粒子の大部分が含まれている場合、水溶性高分子溶液のｐＨが高くなるにつれて、架橋剤懸濁液の溶解速度が増加していく。   The pH prior to crosslinking of the water soluble polymer solution can be used to control the crosslinking time. The pH of the water-soluble polymer solution affects the dissolution rate of the stable and non-aqueous suspension of the delayed crosslinker. Specifically, when the suspension contains most of HA particles, the dissolution rate of the crosslinking agent suspension increases as the pH of the water-soluble polymer solution increases. On the other hand, when the suspension contains most of the borax particles, the dissolution rate of the crosslinking agent suspension decreases as the pH of the water-soluble polymer solution decreases. Conversely, when the suspension contains most of the borax particles, the dissolution rate of the crosslinker suspension decreases as the pH of the water-soluble polymer solution decreases, When the suspension contains most of the HA particles, the dissolution rate of the crosslinking agent suspension increases as the pH of the water-soluble polymer solution increases.

水溶性高分子溶液中の遅延ＨＡ架橋剤の安定且つ非水の懸濁液の濃度（即ち負荷）及びの懸濁液の含有量の両方は、水溶性高分子溶液の架橋時間に同様に影響を与える。水溶性高分子溶液中の遅延ＨＡ架橋剤の懸濁液の濃度、或いは、架橋剤懸濁液の含有量のいずれかが高くなるにつれて、水溶性高分子溶液の架橋時間が減少していく。逆に、水溶性高分子溶液中の遅延ホウ素架橋剤の懸濁液の濃度、或いは、架橋剤懸濁液の含有量のいずれかが低くなるにつれて、水溶性高分子溶液の架橋時間が増加していく。   Both the stable and non-aqueous suspension concentration (ie loading) of the delayed HA crosslinker in the water soluble polymer solution and the content of the suspension similarly affect the crosslinking time of the water soluble polymer solution. give. As either the concentration of the suspension of the delayed HA crosslinking agent in the water-soluble polymer solution or the content of the crosslinking agent suspension increases, the crosslinking time of the water-soluble polymer solution decreases. Conversely, as either the concentration of the delayed boron crosslinker suspension in the water soluble polymer solution or the content of the crosslinker suspension decreases, the crosslinking time of the water soluble polymer solution increases. To go.

温度は、水溶性高分子溶液の架橋時間を変更するために使用することができる。水溶性高分子溶液の温度が上がるにつれて、その架橋時間が減少する。逆に、水溶性高分子溶液の温度が下がるにつれて、その架橋時間が増加する。更に、水溶性高分子溶液の架橋時間の増加又は減少は、遅延ＨＡ架橋剤の安定且つ非水の懸濁液の形成に用いられる粘土の種類によって決まる。   The temperature can be used to change the crosslinking time of the water-soluble polymer solution. As the temperature of the water-soluble polymer solution increases, its crosslinking time decreases. Conversely, as the temperature of the water-soluble polymer solution decreases, its crosslinking time increases. Furthermore, the increase or decrease of the crosslinking time of the water-soluble polymer solution depends on the type of clay used to form a stable and non-aqueous suspension of the delayed HA crosslinking agent.

その上、分子微小球、高分子ミセル、可溶性高分子、ヒドロゲル形式材料のような材料は、生化学的分解から薬剤を保護するために使用され、生物医学的応用、特に薬物送達装置の成分として用いられるのように、大きな可能性を示している。医用高分子のデザインとエンジニアリング（例えば、生理学的条件下での使用のための高分子）は、一般的に特殊且つ厳密な要件の対象となっている。特に、このようなポリマー材料は、それらが使用される生物学的環境と互換でなくてはならない。即ち、それらが親水性のある特徴を示すということである。それらはまた、適切な生分解性（即ち、それらは、低分子量種に分解する。高分子フラグメントは、痕跡を残さずに、順番に体内で代謝されか、または***される）。を証明しなければならない。生分解性は、典型的には、主鎖に加水分解に不安定な結合を有する高分子を合成するか、または使用することによって達成される。この特徴を持つ最も一般的な化学官能基は、エステル、無水物、オルトエステル、及びアミドである。加水分解に不安定な主鎖の化学的加水分解は、高分子の分解のために一般的な機構である。生分解性高分子は、天然または合成のいずれかのものである。医学的応用及び生物医学研究に一般的に使用される合成高分子は、ポリエチレングリコール（薬物動態および免疫応答調整剤）、ポリビニルアルコール（薬剤担体）、およびポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）（薬剤担体）を含む。また、天然高分子は、生物医学的用途にも使用される。例えば、デキストラン、ヒドロキシエチル澱粉、アルブミン、及び一部加水分解されたタンパク質は血漿代用薬から、放射性医薬品、非経口栄養までの用途において有用であることが分かる。一般的に、合成高分子は、天然材料より、広い範囲の特性及び予測可能なロット間一様性を提供するように調整することができる大きな利点を持つ。   In addition, materials such as molecular microspheres, polymeric micelles, soluble polymers, hydrogel format materials are used to protect drugs from biochemical degradation and as components of biomedical applications, especially drug delivery devices. As used, it shows great potential. The design and engineering of medical macromolecules (eg, macromolecules for use under physiological conditions) are generally subject to special and stringent requirements. In particular, such polymeric materials must be compatible with the biological environment in which they are used. That is, they exhibit hydrophilic characteristics. They are also suitable biodegradable (ie, they break down into low molecular weight species. High molecular fragments are sequentially metabolized or excreted in the body, leaving no trace). Must prove. Biodegradability is typically achieved by synthesizing or using a polymer having a hydrolytically unstable bond in the backbone. The most common chemical functional groups with this feature are esters, anhydrides, orthoesters, and amides. Chemical hydrolysis of the hydrolytically unstable backbone is a common mechanism for polymer degradation. Biodegradable polymers are either natural or synthetic. Synthetic polymers commonly used in medical applications and biomedical research are polyethylene glycol (pharmacokinetic and immune response modifiers), polyvinyl alcohol (drug carrier), and poly (hydroxypropylmethacrylamide) (drug carrier). including. Natural polymers are also used for biomedical applications. For example, dextran, hydroxyethyl starch, albumin, and partially hydrolyzed proteins prove to be useful in applications from plasma substitutes to radiopharmaceuticals and parenteral nutrition. In general, synthetic polymers have significant advantages over natural materials that can be tailored to provide a wide range of properties and predictable lot-to-lot uniformity.

一実施形態では、リンカーは、カルボニル間で少なくとも３個の原子のあるジカルボン酸であり、エステルを形成するカルボニルへのヘテロ原子アルファを含む；リンカーが、カルボニル間で少なくとも３個の原子のあるジカルボン酸であり、エステルを形成するカルボニルへのヘテロ原子アルファを含まない場合、放出半減期は約１００時間強である；リンカーが、カルボニル間で２個の原子のあるジカルボン酸であり、テザーが窒素と反応性水素を含む場合、ＨＡの放出半減期は約０．１〜約２０時間である；放出半減期は、複合体がＰＨＦ−ＳＡ−Ｇｌｙ−ＣＰＴ、ＰＨＦ−（ｍｅｔｈｙｌ）ＳＡ−Ｇｌｙ−ＣＰＴ、ＰＨＦ−（２，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ）ＳＡ−Ｇｌｙ−ＣＰＴ、ＰＨＦ−（２−ｎｏｎｅｎ−２−ｙｌ）ＳＡ−Ｇｌｙ−ＣＰＴ、ＰＨＦ−ＳＡ−Ｇｌｙ−Ｔａｘｏｌ、又はＰＨＦ−ＳＡ−Ｇｌｙ−Ｉｌｌｕｄｉｎではないという条件で、 ３７℃で、０．０５Ｍリン酸緩衝液、０．９％生理食塩水（ｐＨ７．４）の中で測定される。   In one embodiment, the linker is a dicarboxylic acid with at least 3 atoms between the carbonyls and includes a heteroatom alpha to the carbonyl forming an ester; the linker is a dicarboxylic acid with at least 3 atoms between the carbonyls. If it is an acid and does not contain the heteroatom alpha to the carbonyl forming the ester, the release half-life is just over 100 hours; the linker is a dicarboxylic acid with two atoms between the carbonyl and the tether is nitrogen And the reactive hydrogen, the release half-life of HA is about 0.1 to about 20 hours; the release half-life is such that the complex is PHF-SA-Gly-CPT, PHF- (methyl) SA-Gly- CPT, PHF- (2,2-dimethyl) SA-Gly-CPT, PHF- (2-nonen-2-yl) SA-Gly In 0.05M phosphate buffer, 0.9% saline (pH 7.4) at 37 ° C., not CPT, PHF-SA-Gly-Taxol, or PHF-SA-Gly-Illudin Measured in

いくつかの実施形態において、ｐｏｌｙａｌがアセタールである。他の実施形態では、ｐｏｌｙａｌがケタールである。いくつかの実施形態において、アセタールがＰＨＦ。いくつかの実施形態において、ＲｉがＨ。他の実施形態では、ＲｉがＣＨ３。いくつかの実施形態において、Ｒ２が−ＣＨ（Ｙ）−Ｃ（Ｏ）−である（式中、Ｙは天然に存在するアミノ酸の側鎖の一つである）。いくつかの実態形態において、Ｒ２がアリール基である。いくつかの実施形態において、Ｒ２がヘテロアリール基である。他の実施形態において、Ｒ２が脂肪族環である。いくつかの実施形態において、Ｒｉ及びＲ２が窒素と一緒に結合したら、環を形成する。他の実施形態は当業者によく知られている。例えば、いくつかの実施形態は、ＵＳ２０１０／０３６４１３に記載され、その内容は参考として包含される。   In some embodiments, poly is acetal. In other embodiments, the poly is a ketal. In some embodiments, the acetal is PHF. In some embodiments, Ri is H. In other embodiments, Ri is CH3. In some embodiments, R2 is -CH (Y) -C (O)-, wherein Y is one of the naturally occurring amino acid side chains. In some aspects, R2 is an aryl group. In some embodiments, R2 is a heteroaryl group. In other embodiments, R2 is an aliphatic ring. In some embodiments, when Ri and R2 are attached together with nitrogen, a ring is formed. Other embodiments are well known to those skilled in the art. For example, some embodiments are described in US 2010/036413, the contents of which are incorporated by reference.

図１は、多重架橋ＨＡを直列にに製造する模範的なシステムを示す。図１において、ＨＡ材料Ｐ−１５及び水酸化ナトリウムＰ−１６は、ゲート及び測定単位Ｐ−１４に提供される。そのアウトプットは混合器Ｐ−１７に提供される。架橋剤ソースＥ９は化学反応炉Ｉ−７に提供され、そのアウトプットはタンクＰ２１に格納される。その後、格納された架橋ＨＡは霧化することができる（噴霧される？）。   FIG. 1 shows an exemplary system for producing multiple cross-linked HAs in series. In FIG. 1, HA material P-15 and sodium hydroxide P-16 are provided to the gate and measurement unit P-14. The output is provided to mixer P-17. Crosslinker source E9 is provided to chemical reactor I-7 and its output is stored in tank P21. Thereafter, the stored crosslinked HA can be atomized (sprayed?).

図２は、多重架橋ＨＡを直列に製造する別の模範的なシステムを示す。図２において、ＨＡ及び水酸化ナトリウムは、ＰＶＳ１、ＰＶＳ２、ＰＶＳ３ソースのように複数の架橋剤ソースを受け取る化学反応炉に提供される。化学反応炉は直列に多重架橋ＨＡを生成し、その後多重架橋ＨＡは、残留物を除去し、ｐＨを約７．４に変更するためにチャンバーで洗浄される。チャンバーは蒸留水及びｐＨの約７．４のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を受け取る。洗浄されたアウトプットは最終組み立てそして放送装置に送付される。   FIG. 2 shows another exemplary system for producing multi-bridge HA in series. In FIG. 2, HA and sodium hydroxide are provided to a chemical reactor that receives multiple crosslinker sources such as PVS1, PVS2, PVS3 sources. The chemical reactor produces multiple cross-linked HA in series, which is then washed in a chamber to remove residues and change the pH to about 7.4. The chamber receives distilled water and PBS (phosphate buffered saline) at a pH of about 7.4. The cleaned output is final assembled and sent to the broadcast equipment.

図３は、結果として得られる多重架橋ＨＡの模範的な図を示す。軽度架橋した拡張が組成物を小さなゲージ針を通して注入できるようし、第２の直列架橋センターが生物学的過程による吸収に耐性がある特徴とし、
軽度に架橋した拡張又は腕を有する第１高分子の第１部分３００；
第１部分と重複する第１の直列架橋センター及び、直列架橋センターに隣接した１以上の軽度架橋した拡張を有する高分子の第２部分３１０；
第２部分と重複する第２直列架橋領域及び、直列架橋センターに隣接した１以上の軽度架橋した拡張を有する高分子の第３部分３２０
を含む組成物である。 FIG. 3 shows an exemplary diagram of the resulting multi-crosslinked HA. A mildly cross-linked extension allows the composition to be injected through a small gauge needle, and a second in-line cross-linking center features resistance to absorption by biological processes,
A first portion 300 of a first polymer having a mildly crosslinked extension or arm;
A polymeric second portion 310 having a first serial crosslinking center overlapping the first portion and one or more lightly crosslinked extensions adjacent to the serial crosslinking center;
A third portion 320 of the polymer having a second series cross-linking region overlapping the second portion and one or more lightly cross-linked extensions adjacent to the series cross-linking center.
It is a composition containing this.

領域３５０は、生分解耐性のための多重架橋になることがある。高分子は、コラーゲン、ヒアルロン酸、セルロース、タンパク質、糖質、生物系の細胞外マトリックス：ポリマーは、のいずれかである。   Region 350 may be a multiple cross-link for biodegradation resistance. The polymer is one of collagen, hyaluronic acid, cellulose, protein, carbohydrate, biological extracellular matrix: polymer.

他の実施形態において、生体適合性の架橋されたＩＰＮ高分子は、ヘテロ多糖類を架橋して第１架橋材料を形成したり；第１の架橋材料の１つ以上の追加架橋を行って多重架橋材料を形成したりすることで実施することができる。結果単相ＨＡは、生体適合性架橋高分子で軟組織を増強させるために使用することができる。   In other embodiments, the biocompatible cross-linked IPN polymer can be cross-linked with heteropolysaccharides to form a first cross-linked material; It can be carried out by forming a crosslinked material. Results Single phase HA can be used to enhance soft tissue with biocompatible crosslinked polymers.

ブレンドの成分の両方を架橋してＩＰＮ及びセミＩＰＮを得る前述の方法の他に、セミＩＰＮは、ブレンドの成分の両方は、架橋剤の存在下及び、天然酸性多糖の存在下でのモノマーの重合又はその半合成エステル系誘導体により得ることもできる。   In addition to the above-described method of cross-linking both components of the blend to obtain IPN and semi-IPN, semi-IPN comprises both of the components of the blend in the presence of a crosslinker and in the presence of a natural acidic polysaccharide. It can also be obtained by polymerization or its semi-synthetic ester derivatives.

以下の実施例では、ＨＡ組成物の割合は組成物全体の７５％から９９％まで変化させ、架橋剤の割合は以下のように１％から２５％まで変化させる。   In the following examples, the proportion of HA composition is varied from 75% to 99% of the total composition and the proportion of crosslinker is varied from 1% to 25% as follows.

ＨＡの割合が増加するにつれて、材料が柔らかいが生分解に対する耐性が減っていく。より多くの架橋剤が導入されるにつれて、材料がより硬くなり長持ちしていく。多重直列架橋過程は手触りが柔らかいが、長持ちするという利点をもたらす。ＩＰＮから放射状に広がり続けながらも絶えず柔らかくなる機械的・物理的性質の変化は、高分子が硬くなり、同時に周囲に準拠になって生体適合性がより良くなるようにし、自然な触りが感じられる。 As the proportion of HA increases, the material is softer but less resistant to biodegradation. As more cross-linking agent is introduced, the material becomes harder and lasts longer. The multiple series crosslinking process is soft to the touch but has the advantage of long lasting. Changes in mechanical and physical properties that continue to radiate from the IPN and become softer continuously, make the polymer stiffer, and at the same time make it more compliant and better biocompatible, giving a natural feel .

多重架橋プロセスは、ＨＡが一回目、そして２回目、３回目架橋されてから直列架橋の追加を形成する、個別又はデジタルプロセスと似ている。この個別又はデジタルプロセスは、従来の連続的なプロセスとはの比較した場合である。一実施形態では、ＩＰＮセンターは、相対的な水性フロントが存在するところにある。   The multiple cross-linking process is similar to an individual or digital process in which the HA is cross-linked for the first, second, and third before forming an addition of serial cross-links. This individual or digital process is a comparison with a conventional continuous process. In one embodiment, the IPN center is where there is a relative aqueous front.

なお、ＨＡの長寿の目的で、加水分解が好まれていないため、より疎水性の架橋剤のが優れていることに言及すべきである。立体的に込み合った架橋剤も挙げられた同じ理由で望ましいである。但し、この場合の疎水性は、ＨＡ高分子の生体適合性を低下させ、不正且つ不要な異物反応になる可能性が高い。プロセスの全ての部部に使用される架橋剤も、長寿・生体適合性・物理的性質という特性に変化をもたらす。アプリケーション要件は、それらの特性のバランスを与える理想的な高分子組成物を決定する。   It should be noted that for the purpose of HA longevity, hydrolysis is not preferred, so that more hydrophobic cross-linking agents are superior. Sterically crowded crosslinkers are also desirable for the same reasons listed. However, the hydrophobicity in this case reduces the biocompatibility of the HA polymer and is likely to be an illegal and unnecessary foreign body reaction. Cross-linking agents used in all parts of the process also change the properties of longevity, biocompatibility and physical properties. Application requirements determine the ideal polymer composition that provides a balance of their properties.

直列架橋の工程を経って、架橋ＨＡ（ヒアルロン酸）分子マクロ構造は、基本水性媒体と接続する表面では最も高く、中心コーアに向かっては最も低く相互貫通架橋される。初期の架橋反応工程の後、架橋ＨＡ連鎖は重要な移動性を失った。従って、ＩＰＮ（相互貫通網目）高分子は後続の順次的な架橋反応で安易に形成される。   Through a series of cross-linking steps, the cross-linked HA (hyaluronic acid) molecular macrostructure is highest on the surface connecting with the basic aqueous medium and lowest cross-linked toward the central core. After the initial cross-linking reaction step, the cross-linked HA chain lost important mobility. Accordingly, the IPN (interpenetrating network) polymer is easily formed by the subsequent sequential crosslinking reaction.

架橋ＨＡのレオロジーは、非ニュートン流体の挙動を有するものとして特徴付けられる。二次元空洞流れでの混合に関する理論によれば、効果的な混合の鍵は、「馬蹄マップ」と呼ばれる操作である、反復的な伸縮及び折り畳みを生産することにある。混合は、Ｃｈａｖａｎらによる「Ｍｉｘｉｎｇ ｏｆ Ｖｉｓｃｏｕｓ Ｎｅｗｔｏｎｉａｎ ａｎｄ Ｎｏｎ−Ｎｅｗｔｏｎｉａｎ Ｆｌｕｉｄｓ」（粘性ニュートン及び非ニュートン流体の混合）のページ２１１〜２５２に記載されたように、粘性ニュートン及び非ニュートン流体を混合することででき、当該資料の内容は参考することにより組み込まれる。もう一つの方法として、Ｐａｕｌｏ Ｅ． Ａｒｒａｔｉａによる「Ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ ａｎｄ ｍｉｘｉｎｇ ｏｆ ｎｏｎ−Ｎｅｗｔｏｎｉａｎ ｆｌｕｉｄｓ ｉｎ ｔｉｍｅ−ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｆｌｏｗｓ」（時間周期的なフローでの非ニュートン流体伸縮及び折り畳み）に記載されたように混合することもでき、当該資料の内容は参考することにより組み込まれる。混合工程のスケーリングは、Ｗｉｌｋｅｎｓらによる「Ｈｏｗ ｔｏ Ｓｃａｌｅ Ｕｐ Ｍｉｘｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ Ｎｏｎ−Ｎｅｗｔｏｎｉａｎ Ｆｌｕｉｄｓ」（非ニュートン流体中の混合工程のスケールアップ方法）に記載されたように行うことができ、当該資料の内容は参考することにより組み込まれる。   The rheology of crosslinked HA is characterized as having non-Newtonian fluid behavior. According to the theory of mixing in a two-dimensional cavity flow, the key to effective mixing is to produce repetitive stretching and folding, an operation called a “horseshoe map”. Mixing can be accomplished by mixing viscous Newtonian and non-Newtonian fluids as described on pages 211-252 of Chavan et al., “Mixing of Viscous Newtonian and Non-Newtonian Fluids”. Yes, the contents of this document are incorporated by reference. As another method, Paulo E. et al. It can be mixed as described in “Stretching and mixing of non-Newtonian fluids in time-periodic flows” by Arartia (non-Newtonian fluid expansion and contraction in time-periodic flow). It is incorporated by doing. The mixing process can be scaled as described in Wilkens et al., “How to Scale Up Mixing Processes in Non-Newtonian Fluids”. Are incorporated by reference.

最終生成物において、架橋レベルは、ＨＡ高分子マトリックス全体にわたって不均一となり、高分子連鎖は２軸配向（２軸延伸）になる。配向はＨＡ高分子が存在する極性媒体の結果である。   In the final product, the cross-linking level is non-uniform throughout the HA polymer matrix and the polymer chain is biaxially oriented (biaxial stretching). The orientation is a result of the polar medium in which the HA polymer is present.

反応物を混合する様々な実装は以下に記載される。   Various implementations for mixing the reactants are described below.

１． 手動の混合：
この例では、 混合は手動である。この方法では、組み立てが簡単で、高価な機器を必要としない。架橋剤＊の種類と様々な工程で使用する架橋剤の量＊＊は望ましい特性に最適化される事がある。 1. Manual mixing:
In this example, mixing is manual. This method is easy to assemble and does not require expensive equipment. The type of crosslinker * and the amount of crosslinker used in various processes ** may be optimized for the desired properties.

ａ． ＨＡを水酸化ナトリウムの中で溶解させる（ｐＨが高くなるにつれて、反応の反応性が増加していく）
ｂ． 架橋反応
ｉ． 架橋剤を添加する
ｉｉ． 混合物を機械的に混合する
ｉｉｉ． 架橋ステップの数は、望ましい特性に応じて変化することがある
ｃ． 同じ架橋剤及び／又は別の架橋剤の種類で「ｂ」ステップを繰り返す。架橋剤の量は、望ましい物理的な特性に応じて同じ又は違う場合がある。 a. HA is dissolved in sodium hydroxide (the reactivity of the reaction increases with increasing pH)
b. Cross-linking reaction i. Add a cross-linking agent
ii. Mix the mixture mechanically iii. The number of cross-linking steps can vary depending on the desired properties c. Repeat the “b” step with the same crosslinker and / or another crosslinker type. The amount of cross-linking agent may be the same or different depending on the desired physical properties.

ｄ． 反応生成物の精製：主生成物が干渉されることなくその機能を実行できるために、加工助剤、未反応の反応物、不純物を除去するように反応性生物を洗浄することが重要である。   d. Purification of reaction products: It is important to wash reactive organisms to remove processing aids, unreacted reactants and impurities so that the main product can perform its function without interference .

この反応で使用される全ての化学成分が水溶性であり、反応生成物は水溶性ではないので、架橋ＨＡ高分子はＤＩ水を用いて精製することができる。更に、水は反応生産物を膨潤させ、不純物を簡単に高分子から拡散させて除去する多くの折り目を作り出す。さらに、水は不純物が簡単にポリマーから拡散し、排除することができ、反応生成物の多くのひだを膨潤します。 ＤＩ水での連続洗い流しは、精製プロセスをスピードアップし、反応生成物から効果的に望ましくない不純物を取り除く。   Since all chemical components used in this reaction are water soluble and the reaction product is not water soluble, the crosslinked HA polymer can be purified using DI water. Furthermore, water swells the reaction product, creating many folds that easily diffuse impurities away from the polymer. In addition, water can easily diffuse and eliminate impurities from the polymer and swell many pleats of reaction products. Continuous flushing with DI water speeds up the purification process and effectively removes unwanted impurities from the reaction product.

架橋ＨＡと混合する前及び、架橋ＨＡと混合した後の水のｐＨがプロセスを通じての洗浄効果ための良好な間接的指示薬である。Ｔｈｅ ｏｆ ｔｈｅ ｗａｔｅｒ ｐＨ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｓｈｏｕｌｄ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｃｈａｎｇｅｄ．
ｅ． リン酸緩衝生理食塩水を釣り合わせ、ｐＨが約７．４であるレベルを平均させる：架橋ＨＡから全ての水を排出する。少なくとも架橋ＨＡのボリュームの３倍までの新鮮なＰＢＳを添加し、混合物溶液が約２時間で釣り合うようにする。。 ｐＨが７．４±０．７程度になるまで、更にプロセスを２回繰り返す。 The pH of the water before mixing with the crosslinked HA and after mixing with the crosslinked HA is a good indirect indicator for the cleaning effect throughout the process. The of the water pH before and after shoulder not significant changed.
e. Balance the phosphate buffered saline and average the level where the pH is about 7.4: Drain all the water from the crosslinked HA. Add at least 3 times the volume of cross-linked HA fresh PBS to allow the mixture solution to balance in about 2 hours. . The process is repeated twice more until the pH is around 7.4 ± 0.7.

２． 機械的圧力ポンプ ： この取り組み方の利点はその連続的な性質である。連続的な処理の利点は、製造できる生成物の量での柔軟性である。上限はあるが、定量のバッチ処理とは違っている。   2. Mechanical pressure pump: The advantage of this approach is its continuous nature. The advantage of continuous processing is the flexibility in the amount of product that can be produced. Although there is an upper limit, it is different from quantitative batch processing.

ａ． ＨＡをＮａＯＨに溶解させ、ＮａＯＨの濃度は ＨＡポリマー鎖の反応性ＯＨ端子に直接的な影響を与える。   a. HA is dissolved in NaOH, and the concentration of NaOH directly affects the reactive OH terminal of the HA polymer chain.

ｂ． 架橋反応は、ＮａＯＨ溶液中のＨＡが架橋剤と接触したとたん、すぐに行われる。   b. The cross-linking reaction takes place as soon as the HA in the NaOH solution comes into contact with the cross-linking agent.

ｉ． 架橋剤の種類が変化することがある。   i. The type of cross-linking agent may change.

ｉｉ． 架橋剤の量が変化することがある。   ii. The amount of crosslinker may vary.

ｃ． 混合が迅速且つ効率的に行われることは、最終生成物の再現性にとって重要である。   c. The rapid and efficient mixing is important for the reproducibility of the final product.

ｉ． 図２に示されるように、この方法での混合は、反応混合物が変化する様々なパイプ内径の中で移動する間に行われる。   i. As shown in FIG. 2, mixing in this manner occurs while the reaction mixture moves through various pipe inner diameters.

ｉｉ． 反応混合物が混合管装置に移動する回数は、望ましい物理的特性が達成されるように最適化することができる。   ii. The number of times the reaction mixture is transferred to the mixing tube device can be optimized so that the desired physical properties are achieved.

３． 機械的蠕動ポンプ：この取り組み方は機械的圧力ポンプの方法と比べてこの方法では混合成分が異なる。機械的圧力の方法では、混合機構は混合管装置（図１）で、蠕動ポンプの方法では、混合機構はローラの中である（ポンピング機構も同様）。   3. Mechanical peristaltic pump: This approach differs in the mixing components in this method compared to the mechanical pressure pump method. In the mechanical pressure method, the mixing mechanism is a mixing tube device (FIG. 1), and in the peristaltic pump method, the mixing mechanism is in a roller (the pumping mechanism is the same).

４． 分子マクロ構造の２軸配向のある架橋ＨＡ
ａ． 界面活性剤
本実施形態では、ＨＡ分子は、ビニルの機能的終端分子とエーテル結合を安易に形成するなどのようなアルカリ媒体の中の反応性ヒドロキシルであろういくつかのヒドロキシル末端を有する。そのアルカリ媒体は多くのＨＡ修飾物を一段の反応にする。 4). Biaxially oriented crosslinked HA with molecular macro structure
a. Surfactant In this embodiment, the HA molecule has several hydroxyl ends that may be reactive hydroxyls in an alkaline medium such as easily forming an ether linkage with a vinyl functional termination molecule. The alkaline medium makes many HA modifications a one-step reaction.

１，４−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ｄｉｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ，
１，４−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ，
１， ６−ｈｅｘａｎｅｄｉｏｌ ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ，
１， ６−ｈｅｘａｎｅｄｉｏｌ ｄｉｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ，
Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ
Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ
Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）＊ ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ
Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）＊ ｄｉｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ
＊は、分子量ポリエチレングリコールの多様な種類を示す。 1,4-butanediol dimethacrylate,
1,4-butanediol diacrylate,
1, 6-hexanediol diacrylate,
1, 6-hexanediol dimethylacrylate,
Ethylene glycol dimethacrylate
Ethylene glycol diacrylate
Poly (ethylene glycol) * diacrylate
Poly (ethylene glycol) * dimethylacrylate
* Indicates various types of molecular weight polyethylene glycol.

これらの疎水性架橋剤は通常、水溶性／水混和性ではありません。各分子が合わせる好ましい環境を作り出し、化学反応を起こすための界面活性剤は必要とされる。極性のスペクトルは界面活性剤および媒体によって媒介されて作成されるため、架橋ＨＡ生成物は高い２軸配向性である。極性及び非極性分子の配向マクロ構造は、生成物が入っている媒体の極性の配向に従う。   These hydrophobic crosslinkers are usually not water soluble / water miscible. Surfactants are required to create a favorable environment in which each molecule combines and cause chemical reactions. Because the polar spectrum is mediated by surfactants and media, the crosslinked HA product is highly biaxially oriented. The orientation macrostructure of polar and nonpolar molecules follows the polar orientation of the medium containing the product.

反対分子マクロ構造は媒体の表面から離れて移動し、分子の中心コアに集まる。この場合には、より疎水性相貫通互架橋ＨＡ網目。分子は元の柔らかさ及び生体適合性を維持する。   The opposite molecular macrostructure moves away from the surface of the medium and collects in the central core of the molecule. In this case, a more hydrophobic interpenetrating cross-linked HA network. The molecules maintain their original softness and biocompatibility.

さらに、分子マクロ構造架橋ＨＡは、同様の物理的性質を有する隣接分子種に配向される。この特性は、物理的性質が自動調整であるという点で独特である。   Furthermore, the molecular macrostructure crosslinked HA is oriented to adjacent molecular species having similar physical properties. This property is unique in that the physical properties are self-adjusting.

ｂ． 独立架橋前ＨＡの使用
一実施形態に係る生成物の特徴付けに使用される他の方法は、その制限にならず実施形態の好適な実施形態を解説する以下の例に記載されている。変形及び修正は、もちろん、本発明の精神と範囲から逸脱することなく行われることができる。例えば、ＨＡは、顔面充填剤、皮膚充填剤、お尻充填剤、胸充填剤及び他の身体部分の充填剤として使用することができる。本発明の移植組織は、移植の前か後に、指定薬物及び他の化学薬品又は診断用薬で点滴することができる。このような薬剤の例としてはこれらに限定されないが、抗生物質、化学療法、他のがん治療学、照射効果のための小線源治療的材料、領域の同定のためのＸ線不透過性材料又は金属材料、出血抑制のための止血剤、成長因子ホルモン、免疫系因子、遺伝子治療、生化学的指標又はベクター、患者の治療効果を高め得る治療用物質又は診断材料の他の種類が挙げられる。 b. Use of Pre-Independent Crosslinking HA Other methods used to characterize the product according to one embodiment are described in the following examples that illustrate preferred embodiments of the embodiments, without limitation thereof. Variations and modifications can, of course, be made without departing from the spirit and scope of the invention. For example, HA can be used as a facial filler, skin filler, butt filler, breast filler and other body part filler. The transplanted tissue of the present invention can be instilled with designated drugs and other chemicals or diagnostic agents before or after transplantation. Examples of such agents include, but are not limited to, antibiotics, chemotherapy, other cancer therapeutics, brachytherapy materials for radiation effects, radiopaque for region identification Materials or metal materials, hemostatic agents for bleeding control, growth factor hormones, immune system factors, gene therapy, biochemical indicators or vectors, other types of therapeutic or diagnostic materials that can enhance the patient's therapeutic effect It is done.

１ ＩＰＮ実施形態の利点は、次の一つ又はそれ以上を含む。自然な感じは、既存の組織と移植組織の間の特性の粘弾性調和によって得られる。これは、粒径及び粒度分布の比率を介して流動特性を通って移植組織の粘性成分を操作することによって行うことができる。弾性成分は、材料三次構造（分子量及び立体障害）及び架橋密度の中に固有である。相互貫通高分子網目ヒドロゲルは、多くの望ましい特性を有する。これらは、高含水率の高い抗張力を含み、皮膚の充填用途で使用するために相互貫通高分子網目ヒドロゲルの優れた特性である。他の利点及び特徴は、何よりも、タッチアップなしの長寿、循環血液量過多症の分解、解放学準拠及び等浸透圧という点がある。   Advantages of one IPN embodiment include one or more of the following. The natural feeling is obtained by viscoelastic harmony of properties between existing tissue and transplanted tissue. This can be done by manipulating the viscous component of the transplanted tissue through the flow characteristics through the ratio of particle size and particle size distribution. The elastic component is inherent in the material tertiary structure (molecular weight and steric hindrance) and crosslink density. Interpenetrating polymer network hydrogels have many desirable properties. These include high moisture content and high tensile strength and are excellent properties of interpenetrating polymer network hydrogels for use in skin filling applications. Other advantages and features are, among other things, longevity without touch-up, degradation of circulating blood volume, liberation compliance and isosmotic pressure.

本発明は、特に胸、お尻、又は身体の移植組織に関して解説していたが、本発明は、顔など他の身体部分へ適用できることは当業者なら言うまでもない。従って、本発明は、欠落した又は損傷した軟部組織・構造組織・骨の取換え、或いは、化粧組織又は骨材の交換にも適用可能である。   Although the present invention has been described with particular reference to breast, buttocks, or body grafts, it will be appreciated by those skilled in the art that the present invention can be applied to other body parts such as the face. Therefore, the present invention can also be applied to replacement of missing or damaged soft tissue / structural tissue / bone, or replacement of cosmetic tissue or aggregate.

本発明はその特定の実施形態に関して説明されていたが、多くの変形・修正及び他の用途は当業者には明らかになるであろう。従って、本発明がここの特定の開示ではなく、添付の特許請求範囲だけによって制限されることが望ましいである。一実施形態による生成物の特徴付けのために使用される他の方法は、その制限にならない一実施形態の好ましい実施形態を解説する以下の例で述べられる。本発明の範囲及び趣旨から逸脱せずに、変化及び修飾は、言うまでもなく、実施できるであろう。   Although the invention has been described with reference to specific embodiments thereof, many variations and modifications and other uses will become apparent to those skilled in the art. Accordingly, it is desired that the invention be limited not by the specific disclosure herein, but only by the appended claims. Other methods used for product characterization according to one embodiment are set forth in the following example that illustrates a preferred embodiment of one embodiment that is not limiting. It will be appreciated that changes and modifications can be effected without departing from the scope and spirit of the invention.

Claims (23)

ヘテロ多糖類を架橋して単一架橋材料を形成するのと
単一架橋材料上で１つ以上の追加架橋を行って多重架橋材料を形成するのを備え、
多重架橋材料が、単一架橋材料より、人体内で生分解に耐える１つ以上のＩＰＮ領域を有し、１つ以上の単一架橋拡張がＩＰＮから広がり、ＩＰＮと拡張の組合せは、生分解耐性、柔らかな肌触り、体内に導入する容易さを提供する（ことを特徴とする）、相互貫通高分子網目（ＩＰＮ）を有する生体適合性架橋高分子を形成する方法。 Cross-linking the heteropolysaccharide to form a single cross-linked material and performing one or more additional cross-links on the single cross-linked material to form a multiple cross-linked material;
Multiple cross-linked materials have one or more IPN regions that resist biodegradation in the human body than single cross-linked materials, and one or more single cross-linked extensions extend from the IPN, and the combination of IPN and extension A method of forming a biocompatible crosslinked polymer having an interpenetrating polymer network (IPN) that provides (characterized by) resistance, soft touch, and ease of introduction into the body. 低侵襲で生体適合性架橋高分子を注入することを含む、請求項１に記載の方法   2. The method of claim 1, comprising injecting a biocompatible crosslinked polymer in a minimally invasive manner. 低侵襲で生体適合性架橋高分子を皮膚に注入すること含む、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, comprising injecting a minimally invasive and biocompatible crosslinked polymer into the skin. 低侵襲で注射器を用いて生体適合性架橋高分子を皮膚の下に注入すること含む、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, comprising injecting the biocompatible crosslinked polymer under the skin using a syringe with minimal invasiveness. 低侵襲で注射器を用いて生体適合性架橋高分子を***又は臀部、或いは軟部組織の下に注入することを含む、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, comprising injecting the biocompatible crosslinked polymer under the breast or hip or soft tissue using a syringe in a minimally invasive manner. 低侵襲で機械式ポンプを用いて生体適合性架橋高分子を軟部組織の下に注入することを含む、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, comprising injecting the biocompatible crosslinked polymer beneath the soft tissue using a minimally invasive mechanical pump. 高分子がコラーゲン、ヒアルロン酸、セルロース、タンパク質、糖類、生物系の細胞外マトリックスのいずれ１つを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the macromolecule comprises any one of collagen, hyaluronic acid, cellulose, protein, saccharide, and extracellular matrix of biological system. 高分子が高分子を熱硬化性樹脂に変換する熱可塑性物質を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, wherein the polymer comprises a thermoplastic that converts the polymer to a thermosetting resin. 架橋剤を使用したり熱硬化高分子を形成したりし、多官能性モノマーを用いて他の高分子一種と架橋共重合体を形成することを含む、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, comprising using a crosslinking agent, forming a thermosetting polymer, or forming a crosslinked copolymer with another kind of polymer using a polyfunctional monomer. ２相混合物を含む生体適粘弾性ゲルスラリとの組成物を移植することを含み、
前記２相は下記のとおりである：
第１相は、微粒子生体適合ゲル相であり、前記ゲル相が化学架橋グリコサミノグリカンを含み、前記グリコサミノグリカンが多糖とたんぱく質から成る群から選択される少なくとも１つの他の高分子と化学的に共架橋し、前記ゲル相が生理学許容される水性媒体中に膨潤され、第２相に均一に分布される；
前記第２相は、前記生理学許容される水性媒体中の多糖、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンオキシドから成る群から選択される親水性生体適合高分子の高分子溶液を含；
２相混合物中の高分子溶液が０．０１％から９９．５％までの構成となり、ゲル相が、増強が望まれる生体の部分にその残りの分を構成する；
請求項１に記載の方法。 Implanting a composition with a biocompatible viscoelastic gel slurry comprising a two-phase mixture;
The two phases are as follows:
The first phase is a particulate biocompatible gel phase, wherein the gel phase includes chemically cross-linked glycosaminoglycan, and the glycosaminoglycan is selected from at least one other polymer selected from the group consisting of polysaccharides and proteins. Chemically co-cross-links, the gel phase is swollen in a physiologically acceptable aqueous medium and uniformly distributed in the second phase;
The second phase comprises a polymer solution of a hydrophilic biocompatible polymer selected from the group consisting of polysaccharides, polyvinylpyrrolidone, polyethylene oxide in the physiologically acceptable aqueous medium;
The polymer solution in the two-phase mixture is comprised between 0.01% and 99.5%, and the gel phase constitutes the remainder of the body part where enhancement is desired;
The method of claim 1. 生体適合性のために組成物に１つの物質を添加することを含む、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, comprising adding a substance to the composition for biocompatibility. 生理学的事象に従って所定のタイミングで、薬剤放出を制御することを含む、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, comprising controlling drug release at a predetermined timing according to a physiological event. 生体適合性且つ性分解性の薬剤を持つことを含む、請求項１に記載の方法。   2. The method of claim 1, comprising having a biocompatible and sex degradable agent. 生分解性高分子の材料マトリックス全体にわたって均一に薬剤を調剤することを含む、請求項１に記載の方法。   2. The method of claim 1 comprising dispensing the drug uniformly throughout the biodegradable polymeric material matrix. 薬剤をコアシェル構造に収納し、薬剤放出が拡散及び溶解性に基づくことを含む、請求項１に記載の方法。     The method of claim 1, wherein the drug is contained in a core shell structure, and the drug release is based on diffusion and solubility. 非構造性薬剤送達の高分子用途から生分解性のネジやアンカーの用途までの応用に必要となる機械的性能及び再吸収率を満たすように調整される、ポリラクチド（ＰＬＡ）・ポリグリコリド（ＰＧＡ）・ＰＬＡ／ＰＧＡの共重合体のいずれか１つを含む薬剤を持つ高分子を提供すること含む、請求項１に記載の方法。   Polylactide (PLA) and polyglycolide (PGA) tailored to meet the mechanical performance and resorption rate required for applications from non-structural drug delivery polymer applications to biodegradable screw and anchor applications 2) The method of claim 1, comprising providing a polymer having a drug comprising any one of PLA / PGA copolymers. 高分子の分解速度及び高分子マトリックスから拡散する薬剤の速度と同じ速度で、生物環境に薬剤を放出することを含む、請求項１に記載の方法。   2. The method of claim 1, comprising releasing the drug into the biological environment at the same rate as the degradation rate of the polymer and the rate of the drug diffusing from the polymer matrix. 薬剤担体高分子組成物及び充填剤高分子組成物を所定の比率で混合することを含む、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, comprising mixing the drug carrier polymer composition and the filler polymer composition in a predetermined ratio. 麻酔薬、
リドカイン、
急性炎症反応を低下させ又は除去する合成物、
ステロイド・コルチコステロイド・デキサメタゾン・トリアムシノロンから成る群から選択される組成物
のいずれかを添加することを含む、請求項１に記載の方法。 Anesthetic,
Lidocaine,
A compound that reduces or eliminates an acute inflammatory response,
The method according to claim 1, comprising adding any of the compositions selected from the group consisting of steroids, corticosteroids, dexamethasone, and triamcinolone. 徐放性物質又は速放物質を提供することを含む、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, comprising providing a sustained release material or an immediate release material. 軽度に架橋した拡張が組成物を小さなゲージ針を通して注入できるようし、第２の直列架橋センターが生物学的過程による吸収に耐性がある特徴とし、
軽度の架橋を有する第１高分子の第１の部分；
第１の部分を重なった第１の直列架橋センター及び、直列架橋センターに隣接した１以上の軽度架橋した拡張を有する高分子の第２の部分；
第２の部分を重なった第２の直列架橋センター及び、直列架橋センターに隣接した１以上の軽度架橋した拡張を有する高分子の第３の部分
を含む組成物。 A lightly cross-linked extension allows the composition to be injected through a small gauge needle, and a second in-line cross-linking center features resistance to absorption by biological processes,
A first portion of the first polymer having mild crosslinking;
A first series cross-linking center overlapping the first part and a second part of the polymer having one or more lightly cross-linked extensions adjacent to the series cross-linking center;
A composition comprising: a second series cross-linking center overlying the second part; and a third part of the polymer having one or more lightly cross-linked extensions adjacent to the series cross-linking center. 高分子が、コラーゲン、ヒアルロン酸、セルロース、タンパク質、糖類、生物系の細胞外マトリックスを含む特徴とする請求項２１に記載の組成物。   The composition according to claim 21, wherein the polymer comprises collagen, hyaluronic acid, cellulose, protein, saccharide, and an extracellular matrix of a biological system. 高分子が、フリーラジカル捕捉剤及び／又は抗酸化物質及び／又はビタミン及び／又は酵素阻害薬のいずれかを含む特徴とする請求項２１に記載の組成物。
The composition according to claim 21, wherein the polymer comprises any of free radical scavengers and / or antioxidants and / or vitamins and / or enzyme inhibitors.