JP2014520148A - 治療のための神経筋接合部への標的化 - Google Patents
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- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
神経筋接合部に治療薬を標的化する組成物および方法を開示する。神経筋接合部に影響を及ぼす疾患および状態を治療する方法も開示する。組成物は、治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む。組成物はさらに、リンカーペプチドを含む。治療薬を神経筋接合部に標的化し、神経筋接合部に影響を及ぼす疾患および状態を治療する方法は、治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を投与することを含む。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、本明細書に参照により全体を組み込んだ、2011年6月20日出願の仮特許出願第61/498,707号の優先権を主張する。
本出願は、本明細書に参照により全体を組み込んだ、2011年6月20日出願の仮特許出願第61/498,707号の優先権を主張する。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所の国立眼病研究所により付与された助成金第EY14837号に基づいて政府支援により実施された。政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
本発明は、国立衛生研究所の国立眼病研究所により付与された助成金第EY14837号に基づいて政府支援により実施された。政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
配列表の組み込み
「31065−30_ST25.txt」という名前で32,205バイトの大きさ(MS−DOSで決定)のファイルを含む配列表のハードコピーおよびコンピュータで読み取り可能な形式の配列が、本明細書で提供され、本明細書に参照により組み込まれている。この配列表は、配列番号1〜35からなる。
「31065−30_ST25.txt」という名前で32,205バイトの大きさ(MS−DOSで決定)のファイルを含む配列表のハードコピーおよびコンピュータで読み取り可能な形式の配列が、本明細書で提供され、本明細書に参照により組み込まれている。この配列表は、配列番号1〜35からなる。
本開示は一般的に治療薬を標的化する組成物および方法に関する。より具体的には、本開示は、神経筋接合部標的化ペプチドを使用した、神経筋接合部への治療薬の標的化に有用な組成物および方法に関する。
神経筋接合部は、神経が筋肉を収縮させるために信号を送る箇所である。より具体的には、神経筋接合部は、ニューロンの軸索終末と筋繊維細胞膜とのシナプスまたは接合部である。
種々の疾患には、主要な損傷部位として神経筋接合部が関与する。例えば、重症筋無力症は、主に神経筋接合部における骨格筋アセチルコリン受容体(AChR)に対する自己抗体が原因となる自己免疫障害である。この抗体は、神経筋接合部のシナプス後表面に結合し、AChR数の低下を引き起こし、筋肉終板に損害を与え、結果として筋力低下を生じる神経筋伝達不良を招く。グラビス(gravis)の別の部類は、神経筋接合部における筋肉特異的キナーゼ(「MuSK」)に対する抗体が原因である。ランバート−イートン症候群は、抗体による神経筋接合部における電位依存性カルシウムチャンネルの攻撃を特徴とするさらに別の障害である。ミラー・フィッシャー症候群は、抗体による神経終末の攻撃が関与する別の障害である。
補体系は、抗体が細胞表面抗原に結合し、膜攻撃複合体を形成することによって開始する抗体媒介免疫の1つのエフェクター機構の発端となり得る。膜攻撃複合体は、細胞溶解および重症筋無力症の場合には神経筋接合部の破壊を引き起こすタンパク質多量体複合体である。抗体によって惹起される補体カスケードの活性化において、新生C4bおよびC3b断片は、生体膜上の遊離のヒドロキシル基およびアミノ基と縮合する。一旦結合すると、これらの断片は、カスケードの中心的な増幅酵素であるC4b2aおよびC3bBbがアセンブリーするための部位として機能する。自己補体媒介損傷から宿主組織を防御するこれらの活性は、細胞関連および血清調節タンパク質の系によって制御される。
補体阻害剤は、神経筋疾患の治療に有望な薬物の1種である。補体阻害剤は、身体の免疫応答系が自身を攻撃するのを阻止することができる。例えば、エクリズマブは、発作性夜間ヘモグロビン尿症および重症筋無力症治療の第2相試験における使用が承認されている抗C5抗体である。エクリズマブは、補体を阻害することによって機能を果たす。投与は注入によって行うので、薬剤は身体全体の補体を阻害し得る。
別の補体阻害剤は、rEV576(OmCIまたはConversin)である。rEV576は、マダニ(Ornithodoros moubata)唾液から得られた、C5補体を特異的に阻害する18.5kDaの組換えによって生成されたタンパク質である。rEV576はC5に直接結合して、C5転換酵素との相互作用を妨害するようである。rEV576の投与は、血清補体活性を低下(reduce)させ、神経筋接合部でのC9沈着を低減(diminish)させ、処置した動物の血清の細胞毒性を低下させることが示された。
重症筋無力症の療法は一般的に、ピリドスチグミンなどの薬剤を使用してコリンエステラーゼを阻害することによって、神経筋伝達を増強することに焦点が当てられる。副腎皮質ステロイド、アザチオプリン、タクロリムス、およびミコフェノール酸塩(mycophenolate)などのその他の治療法は、免疫系の抑制または調節を対象とする。筋力低下の急性増悪は、血漿交換療法または静脈内免疫グロブリン投与によって治療することができる。これらの治療法は、効果的ではあるが高価であり得、神経筋接合部以外に臓器系に影響を及ぼす副作用を伴うことがある。これらの治療法は身体の全体に投与を行うので、結果としてさらに全身の副作用を生じることがある。免疫療法は、重症筋無力症に特異的に焦点を当てたものではなく、むしろBおよびT細胞活性の抑制によって自己抗体レベルを直接的または間接的に低下させて全般的に免疫応答を緩和するものである。
治療法は神経筋接合部の損傷から生じる状態に利用できるが、有効性、副作用および/または費用に対する懸念が残っている。さらに、補体阻害剤の戦略は、補体の全身阻害を利用する。したがって、神経筋接合部の損傷から生じる状態を治療するための別の治療法および方法を開発する必要性が依然として存在している。
本開示は一般的に、治療薬を標的化するための組成物および方法に関する。より具体的には、本開示は、神経筋接合部標的化ペプチドを使用した、神経筋接合部への治療薬の標的化に有用な組成物および方法に関する。
一態様では、本開示は、治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を対象とする。
別の態様では、本開示は、治療薬を神経筋接合部に送達する方法を対象とする。この方法は、治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を投与することを含む。
別の態様では、本開示は、神経筋接合部に関連する疾患または状態を治療する方法を対象とする。この方法は、治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、治療ポリペプチドをコードする異種核酸配列に作動可能に連結した、神経筋接合部標的化ペプチドをコードする組換え核酸コンストラクトを対象とする。
以下の詳細な説明を考慮すると、本開示はよりよく理解され、前述したもの以外の特徴、態様および利点が明らかになるだろう。このような詳細な説明は、以下の図面を参照する。
本開示は、様々な改変および代替形態が可能であるが、それらの特定の実施形態を例として図面に示し、本明細書において以下に詳細に記載する。しかし、特定の実施形態の記載は、本開示を制限せず、添付した特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨および範囲内にある改変、同等物および代替物の全てを含むものとする。
他に定義がない限り、本明細書で使用した技術用語および科学用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載したものと類似または同等のいかなる方法および材料も本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に説明する。
本開示により、神経筋接合部への標的化を可能にする組成物および方法を発見した。この組成物および方法は、神経筋接合部への治療薬の標的化送達を可能にするので、顕著な効果を発揮する。この組成物および方法はさらに、例えば、神経筋接合部が影響を受けることがある重症筋無力症、実験的に得られた重症筋無力症、ランバート−イートン症候群およびミラー・フィッシャー症候群などの神経筋接合部に関連する疾患および状態の治療を可能にする。
組成物
一態様では、本開示は、治療薬(「TA」)に結合した神経筋接合部標的化ペプチド(「NMJTP」)を含む組成物を対象とする(例えば、図14参照)。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、特に指示しない限り、本明細書では交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを意味する。
一態様では、本開示は、治療薬(「TA」)に結合した神経筋接合部標的化ペプチド(「NMJTP」)を含む組成物を対象とする(例えば、図14参照)。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、特に指示しない限り、本明細書では交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを意味する。
本明細書では、「に結合した」とは、神経筋接合部標的化ペプチドが治療薬に直接的もしくは間接的に付着、融合、合体および/または連結している組成物を意味する。例えば、組成物が公知の組換えタンパク質発現法を使用して調製されるならば、神経筋接合部標的化ペプチドをコードする核酸配列は治療薬をコードする核酸配列に合体していてもよい。このような例では、神経筋接合部標的化ペプチドは治療薬に直接的に結合しているだろう。別の例では、神経筋接合部標的化ペプチドをコードする核酸配列は、神経筋接合部標的化ペプチドと治療薬との間に少なくとも1個のリンカーを含むことによって、治療薬をコードする核酸配列に間接的に合体していてもよい。
本開示の組成物は、神経筋接合部標的化ペプチドが治療薬に結合している最終組成物を生成するために、さらにプロセシングを受けるより大きなコンストラクトの一部として調製してもよい。より大きなコンストラクトのドメイン構造を図14に例示する。一実施形態では、例えば、このコンストラクトは、治療薬(「TA」)に結合したリンカーに結合した神経筋接合部標的化ペプチド(「NMJTP」)に結合したプロテアーゼ切断部位(「プロテアーゼ部位」)に結合した親和性タグに結合したATG開始部位を含んでいてもよい(図14参照)。別の実施形態では、ドメイン構造は、TAに結合したリンカーに結合したNMJTPに結合したリンカーに結合したNMJTPに結合したプロテアーゼ切断部位に結合した親和性タグに結合したATG開始部位を含んでいてもよい(図14参照)。表1は、図14で示された神経筋接合部標的化ペプチドおよびそれらの特異性(結合標的)をまとめて示す。
治療薬は、神経筋接合部標的化ペプチドのN末端またはC末端のいずれかに結合させることができる。本明細書でさらに記載したようにさらにプロセシングした後、例えば、組成物は、治療薬が神経筋接合部標的化ペプチドのC末端に結合したNMJTP−TA構造を有していてもよい。別の例では、組成物は、さらにプロセシングした後、治療薬が神経筋接合部標的化ペプチドのN末端に結合したTA−NMJTP構造を有していてもよい。同様に、神経筋接合部標的化ペプチドは、神経筋接合部標的化ペプチドのN末端、C末端、またはN末端およびC末端の両方のいずれかでリンカーに結合していてもよい(図14参照)。リンカーが組成物に含まれる場合、リンカーは、神経筋接合部標的化ペプチドと治療薬との間に位置する。一実施形態では、組成物は、さらにプロセシングした後、NMJTP−リンカー−TAの構造を有していてもよい。別の実施形態では、組成物は、さらにプロセシングした後、TA−リンカー−NMJTPの構造を有していてもよい。さらに別の実施形態では、組成物は、さらにプロセシングした後、NMJTP−リンカー−NMJTP−リンカー−TAの構造を有していてもよい。さらに別の実施形態では、組成物は、さらにプロセシングした後、TA−リンカー−NMJTP−リンカー−NMJTPの構造を有していてもよい。
本明細書で記載したように、組成物はさらにプロセシングを受けることができる。例えば、親和性タグの存在は、当業者に公知で、本明細書に記載した親和性タグと親和性基質との間の相互作用による精製を可能にする。組成物はまた、親和性タグと神経筋接合部標的化ペプチドとの間の位置で組成物を切断するプロテアーゼによる処理を受けることができる。プロテアーゼ処理は、少なくとも1個のリンカーをさらに含み得る神経筋接合部標的化ペプチドおよび治療薬を含む組成物の調製を可能にする。
神経筋接合部標的化ペプチド
本開示の組成物は、神経筋接合部標的化ペプチド(「NMJTP」)を含む。神経筋接合部標的化ペプチドは、神経筋接合部に位置するかもしくは近くにある分子に結合するかまたは相互作用するペプチド分子であってもよい。例えば、この分子は、神経筋接合部の前シナプス(presynaptic)側かまたは後シナプス(postsynaptic)側に位置していてもよい。適切な神経筋接合部標的化ペプチドは、神経筋接合部のまたはその近くのニューロンに存在する分子に結合するかまたは相互作用してもよい。その他の適切な神経筋接合部標的化ペプチドは、神経筋接合部のまたはその近くの筋肉細胞に存在する分子に結合するかまたは相互作用してもよい。神経筋接合部標的化ペプチドは、約0.5nMから約50μMの結合親和性を有する。特に適切な結合親和性は、例えば、約1nMから約40μMであり得る。さらにより適切な結合親和性は、例えば、約0.1μMから約0.75μMであり得る。神経筋標的化ペプチドの結合は、当業者に公知の方法によって測定することができる。結合親和性を測定するために適切な方法は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、ウェスタンブロット分析および免疫染色法であってもよい。単独または治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドはまた、結合が直接的に検出され得るよう、例えば、蛍光タグなどの検出可能な標識をさらに含めるために、例えば、組換えタンパク質発現法を使用して調製することができる。免疫染色したかまたは直接標識した組成物の分析は、例えば結合親和性を測定するために、蛍光ピクセル分析によってさらに分析してもよい。
本開示の組成物は、神経筋接合部標的化ペプチド(「NMJTP」)を含む。神経筋接合部標的化ペプチドは、神経筋接合部に位置するかもしくは近くにある分子に結合するかまたは相互作用するペプチド分子であってもよい。例えば、この分子は、神経筋接合部の前シナプス(presynaptic)側かまたは後シナプス(postsynaptic)側に位置していてもよい。適切な神経筋接合部標的化ペプチドは、神経筋接合部のまたはその近くのニューロンに存在する分子に結合するかまたは相互作用してもよい。その他の適切な神経筋接合部標的化ペプチドは、神経筋接合部のまたはその近くの筋肉細胞に存在する分子に結合するかまたは相互作用してもよい。神経筋接合部標的化ペプチドは、約0.5nMから約50μMの結合親和性を有する。特に適切な結合親和性は、例えば、約1nMから約40μMであり得る。さらにより適切な結合親和性は、例えば、約0.1μMから約0.75μMであり得る。神経筋標的化ペプチドの結合は、当業者に公知の方法によって測定することができる。結合親和性を測定するために適切な方法は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、ウェスタンブロット分析および免疫染色法であってもよい。単独または治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドはまた、結合が直接的に検出され得るよう、例えば、蛍光タグなどの検出可能な標識をさらに含めるために、例えば、組換えタンパク質発現法を使用して調製することができる。免疫染色したかまたは直接標識した組成物の分析は、例えば結合親和性を測定するために、蛍光ピクセル分析によってさらに分析してもよい。
適切な神経筋接合部標的化ペプチドは、例えば、より大きなタンパク質分子から得られたペプチドであってもよい。その他の適切な神経筋接合部標的化ペプチドは、例えば、抗体分子であってもよい。特に適切な抗体分子は、例えば、抗体可変領域、抗体重鎖、抗体軽鎖、Fab、F(ab’)2、F(ab’)および1本鎖抗体(scFv)であり得る。
適切な神経筋接合部標的化ペプチドは、例えば、ラミニン、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ヌクレオカプシドタンパク質のジンクフィンガードメイン、狂犬病ウイルス糖タンパク質(RVG)、α−ブンガロトキシン、アグリン、アセチルコリン受容体に対する抗体、アセチルコリンエステラーゼ、筋肉特異的キナーゼ、カルシウムチャンネルおよびナトリウムチャンネルに対する抗体などのタンパク質から得てもよい。特に適切な神経筋接合部標的化ペプチドは、例えば、ラミニンペプチド、例えば、HIVヌクレオカプシドタンパク質のジンクフィンガードメインなどのヒト免疫不全ウイルスペプチド、狂犬病ウイルス糖タンパク質ペプチド、α−ブンガロトキシンペプチド、アグリンペプチド、アセチルコリンエステラーゼに特異的に結合する1本鎖抗体ペプチドおよびアセチルコリン受容体に特異的に結合する1本鎖抗体ペプチドであってもよい。適切な神経筋接合部標的化ペプチドはまた、ニコチンなどの非ペプチド化学物質であってもよい。特に適切な神経筋接合部標的化ペプチドは、例えば、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号7、配列番号8、および配列番号9のアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。
治療薬
本開示の組成物は、神経筋接合部標的化ペプチドに結合した治療薬を含む。本明細書では、「治療薬」という用語は、疾患または医学的状態を治療、制御または予防するために使用されるいかなる種類の薬物、薬品、医薬品、ホルモン、抗生物質、タンパク質、遺伝子、成長因子、生理活性物質等をも意味する。本明細書では、「誘導体」という用語は、別の化合物(例えば、リードまたは親化合物)から得られた化合物またはペプチドを意味する。治療薬は、治療的ポリペプチドに対応するアミノ酸配列をコードする核酸配列が、神経筋接合部標的化ペプチドに対応するアミノ酸配列をコードする核酸配列および/またはリンカーに対応するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結することができるように組換え発現され得るタンパク質であってもよい。
本開示の組成物は、神経筋接合部標的化ペプチドに結合した治療薬を含む。本明細書では、「治療薬」という用語は、疾患または医学的状態を治療、制御または予防するために使用されるいかなる種類の薬物、薬品、医薬品、ホルモン、抗生物質、タンパク質、遺伝子、成長因子、生理活性物質等をも意味する。本明細書では、「誘導体」という用語は、別の化合物(例えば、リードまたは親化合物)から得られた化合物またはペプチドを意味する。治療薬は、治療的ポリペプチドに対応するアミノ酸配列をコードする核酸配列が、神経筋接合部標的化ペプチドに対応するアミノ酸配列をコードする核酸配列および/またはリンカーに対応するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結することができるように組換え発現され得るタンパク質であってもよい。
適切な治療薬は、例えば、補体阻害剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、栄養剤、および麻痺剤(paralytic agent)であってもよい。適切な補体阻害剤は、例えば、崩壊促進因子(「DAF」;「CD55」))、rEV576、補体受容体1(「CR1」;「CD35」)、補体調節タンパク質(「MCP」;「CD46」)、コンプスタチン、コンプスタチン誘導体、POT−4、C1阻害剤、C4b結合タンパク質(「C4BP」)、H因子(「FH」)、補体受容体Ig(「CRIg」)、CD59、クラスタリン、C3阻害剤、ペプチド2J、ヒトβ−ディフェンシン2、CRIT−H17、Ac−SHLGLAR−H、Ac−RLLLAR−H、C1s−INH−248、S−タンパク質、およびCrryであってもよい。その他の適切な治療薬は、例えば、完全長の補体阻害剤から得られたペプチドであってもよい。例えば、DAFの制御タンパク質反復は、治療薬として使用することができる。ペプチドではないが、補体を阻害する化学物質およびペプチド模倣薬などのその他の適切な治療薬は、例えば、クルクミン(circumin)、W−54011、NGD2000−1、NDT9520492、CP−447,697、NDT9513727、SB290157、SB290157(A)、SB290157(B)、BCX1470、C1s阻害剤、BCX1470、PMX53、PMX205、C089、JPE1375であってもよい。
特に適切な治療薬は、例えば、配列番号11および配列番号12のアミノ酸配列を有するものであってもよい。
リンカー
それに加えて、またはその代わりに、組成物は、神経筋接合部標的化ペプチドが治療薬に間接的に結合するように少なくとも1個のリンカーを含んでいてもよい(図14参照)。一実施形態では、組成物は、神経筋接合部標的化ペプチド(「NMJTP」)と治療薬(「TA」)との間に位置するリンカーを含んでいてもよい(図14参照)。別の実施形態では、組成物は、例えば組成物が1本鎖抗体を使用し、第1のリンカーが1本鎖抗体のVHとVLとの間に位置する場合などにおいて、神経筋接合部標的化ペプチドの2個のドメインの間に位置するリンカーを含んでいてもよい(図14参照)。神経筋接合部標的化ペプチドとして1本鎖抗体を使用する実施形態では、抗体の2個の可変領域は、適当な折り畳み構造が標的タンパク質への結合を生じさせるように、リンカーによって分離されている。例えば、組成物が公知の組換えタンパク質発現法を使用して調製される場合、神経筋接合部標的化ペプチドをコードする核酸配列は、治療薬をコードする核酸配列と結合させ得る、リンカーをコードする核酸配列と結合させることができる。
それに加えて、またはその代わりに、組成物は、神経筋接合部標的化ペプチドが治療薬に間接的に結合するように少なくとも1個のリンカーを含んでいてもよい(図14参照)。一実施形態では、組成物は、神経筋接合部標的化ペプチド(「NMJTP」)と治療薬(「TA」)との間に位置するリンカーを含んでいてもよい(図14参照)。別の実施形態では、組成物は、例えば組成物が1本鎖抗体を使用し、第1のリンカーが1本鎖抗体のVHとVLとの間に位置する場合などにおいて、神経筋接合部標的化ペプチドの2個のドメインの間に位置するリンカーを含んでいてもよい(図14参照)。神経筋接合部標的化ペプチドとして1本鎖抗体を使用する実施形態では、抗体の2個の可変領域は、適当な折り畳み構造が標的タンパク質への結合を生じさせるように、リンカーによって分離されている。例えば、組成物が公知の組換えタンパク質発現法を使用して調製される場合、神経筋接合部標的化ペプチドをコードする核酸配列は、治療薬をコードする核酸配列と結合させ得る、リンカーをコードする核酸配列と結合させることができる。
理論に拘束されることは意図しないが、リンカーは、例えば、普通ならば治療薬の活性または神経筋接合部標的化ペプチドによる標的化を妨害し得る立体的障害の可能性を制限するためにも、神経筋標的化ペプチドと治療薬との間に追加的な距離または分離を提供するものと考えられる。リンカーは、神経筋接合部標的化ペプチドおよび/または治療薬の適当な折り畳み構造をさらに可能にする。特に適切なリンカーをコードするヌクレオチド配列は、例えば、表2に示したものであり得る。
医薬製剤
本開示の組成物はまた、医薬製剤を含んでいてもよい。医薬製剤は、例えば、当業者に公知の医薬上許容される塩、担体、アジュバント、媒体、油および脂質を含んでいてもよい。医薬製剤はまた、例えば、当業者に公知の錠剤、カプセル剤、摂取可能な液体、粉末、リポソーム、ナノ粒子および放出制御製剤であってもよい。
本開示の組成物はまた、医薬製剤を含んでいてもよい。医薬製剤は、例えば、当業者に公知の医薬上許容される塩、担体、アジュバント、媒体、油および脂質を含んでいてもよい。医薬製剤はまた、例えば、当業者に公知の錠剤、カプセル剤、摂取可能な液体、粉末、リポソーム、ナノ粒子および放出制御製剤であってもよい。
組換えタンパク質、ベクター、宿主細胞および発現
本開示の組成物は、組換えタンパク質発現法を使用して組換えタンパク質として調製してもよい。適切なポリヌクレオチドは、例えば、配列番号13(ラミニン−rEV)、配列番号15(HIV−rEV)、および配列番号17(RVG−rEV)であり得る。これらはまた、例えば、遺伝子コードの縮重、ポリペプチドを発現する宿主細胞に有利なコドンの偏り、および生じるタンパク質における保存的アミノ酸置換によって、配列中のある程度の変動を許容する。したがって、本発明のポリペプチドおよびコンストラクトは、前記配列と配列が同一のものだけでなく、実質的に同一のままである構造的および機能的特性を備えたそれらの変異体ポリペプチドも含む。
本開示の組成物は、組換えタンパク質発現法を使用して組換えタンパク質として調製してもよい。適切なポリヌクレオチドは、例えば、配列番号13(ラミニン−rEV)、配列番号15(HIV−rEV)、および配列番号17(RVG−rEV)であり得る。これらはまた、例えば、遺伝子コードの縮重、ポリペプチドを発現する宿主細胞に有利なコドンの偏り、および生じるタンパク質における保存的アミノ酸置換によって、配列中のある程度の変動を許容する。したがって、本発明のポリペプチドおよびコンストラクトは、前記配列と配列が同一のものだけでなく、実質的に同一のままである構造的および機能的特性を備えたそれらの変異体ポリペプチドも含む。
このような変異体(または「類似体」)は、基準配列と80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の配列相同性(「同一性」)を有し得る。この意味において、アミノ酸配列「類似性」を決定するための技術は当技術分野では周知である。一般的に、「類似性」は、適切な位置における2つ以上のポリペプチドの正確なアミノ酸対アミノ酸比較であって、アミノ酸が同一であるか、または類似の化学的および/または物理的特性、例えば電荷もしくは疎水性を有するものを意味する。いわゆる「パーセント類似性」は、その後、比較したポリペプチド配列の間で決定することができる。核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術もまた当技術分野において周知であり、その遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列(通常、cDNA中間体を介する)を決定すること、そこにコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれを第2のアミノ酸配列と比較することを含む。一般的に、「同一性」とは、2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、それぞれ正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を意味する。2つ以上のポリヌクレオチド配列は、2つ以上のアミノ酸配列で可能なように、それらの「パーセント同一性」を決定することによって比較することができる。例えば、BLASTなどの利用可能なプログラムは、2つのポリヌクレオチドの間の同一性と、2つのポリペプチド配列の間の同一性および類似性の両方をそれぞれ計算することができる。配列間の同一性または類似性を計算するためのその他のプログラムは、当技術分野で公知である。
本開示はさらに、神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物をコードする核酸配列を含むベクターを対象とする。本明細書では、「ベクター」という用語は、宿主細胞に異種DNAを導入するために使用することができるいかなる組換えポリヌクレオチドコンストラクトをも意味する。本開示のベクターはさらに、治療薬をコードする核酸配列に作動可能に連結した神経筋接合部標的化ペプチドをコードする核酸配列を含み得る。本開示のベクターはさらに、治療薬をコードする核酸配列に作動可能に連結しているリンカーをコードする核酸配列に作動可能に連結している、神経筋接合部標的化ペプチドをコードする核酸配列を含み得る。
本開示の組成物は、特定の宿主細胞に適した発現ベクターを使用して原核および真核細胞において産生させることができる。特に適した原核細胞は、例えば、大腸菌(Escherichia coli)およびサルモネラ(Salmonella)種であってもよい。特に適した真核細胞は、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞および酵母細胞であってもよい。
本明細書では、「コンストラクト」という用語は、いかなる組換えポリヌクレオチド分子をも意味する。コンストラクトの例は、任意の原料から得られ、ゲノムへの組み込みまたは自己複製が可能であり、1個または複数個のポリヌクレオチド分子が機能的に作動可能に連結した、すなわち、作動可能に連結したポリヌクレオチド分子を含む、プラスミド、コスミド、ウイルス、自己複製ポリヌクレオチド分子、ファージ、または線状もしくは環状の1本鎖もしくは2本鎖DNAもしくはRNAポリヌクレオチド分子であり得る。
本明細書では、「作動可能に連結」とは、1つの配列が連結した配列に必要な機能を提供することができるように核酸配列を合体することを意味する。プロモーターの場合、「作動可能に連結」は、関心のある配列の転写がそのプロモーターによって制御され調節されるように、プロモーターが関心のある配列に繋がれることを意味する。関心のある配列がタンパク質をコードするものであってそのタンパク質の発現が所望される場合、「作動可能に連結」は、生じる転写物が効率よく翻訳されるような方法でプロモーターが配列に連結されることを意味する。プロモーターのコーディング配列への連結が転写的融合であり、コードされるタンパク質の発現が所望される場合、生じる転写物の第1の翻訳開始コドンがコーディング配列の開始コドンであるよう連結が行われる。あるいは、プロモーターのコーディング配列への連結が翻訳的融合であり、コードされるタンパク質の発現が所望される場合、5’非翻訳配列に含有される第1の翻訳開始コドンがプロモーターと関連するよう連結が行われ、且つ、生じる翻訳生成物が所望するタンパク質をコードする翻訳オープンリーディングフレームとインフレーム(in frame)であるよう連結が行われる。作動可能に連結できる核酸配列は、例えば、遺伝子発現機能を提供する配列(すなわち、プロモーター、5’非翻訳領域、イントロン、タンパク質コーディング領域、3’非翻訳領域、ポリアデニル化部位、および/または転写終結因子などの遺伝子発現要素)、DNA移入および/または組み込み機能を提供する配列、選択機能を提供する配列(すなわち、抗生物質耐性マーカー、生合成遺伝子)、スコア化可能なマーカー機能を提供する配列(すなわち、レポーター遺伝子)、インビトロ(in vitro)またはインビボ(in vivo)の配列の操作を容易にする配列(すなわち、ポリリンカー配列、部位特異的組換え配列)および複製機能を提供する配列(すなわち、細菌の複製開始点、自己複製配列、セントロメア配列)であってもよい。作動可能に連結してもよい追加的配列は、例えば、親和性タグなどの組換え発現タンパク質の精製を容易にする配列であってもよい。作動可能に連結してもよいその他の追加的配列は、例えば、プロテアーゼ切断部位をコードする配列であってもよい。
「単離された」ポリヌクレオチド(例えば、「単離されたDNA」または「単離されたRNA」)とは、天然に生じる(naturally occurring)生物の他の成分、例えば細胞構造成分またはポリヌクレオチドに関連することが通常見出されているその他のポリペプチドもしくは核酸の少なくともいくつかから少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。
「単離された」ポリペプチドとは、天然に生じる生物の他の成分、例えば細胞もしくは構造成分またはポリペプチドに関連することが通常見出されているその他のポリペプチドもしくは核酸の少なくともいくつかから少なくとも部分的に分離されたポリペプチドを意味する。
成分に作動可能に連結することによって一旦ベクターが構築されると、ベクターは宿主細胞に導入することができる。神経筋接合部標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を治療薬および/またはリンカーをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結すると、本開示に示したように、宿主細胞から発現ポリペプチドの産生が生じる。ベクターは、当業者に公知の方法によって宿主細胞に導入することができる。適切な方法は、例えば、遺伝子導入、形質転換およびエレクトロポレーションであり得る。その後、宿主細胞は、組成物の発現を可能にするために適切な条件下で培養して、次いで、組成物は単離および/または精製によって回収される。
本開示による組換え発現組成物は、当業者に公知の方法によってさらに単離し精製することができる。例えば、タンパク質精製は、アフィニティークロマトグラフィー、沈降法、クロマトグラフィー(例えば、アフィニティー、イオン交換、HPLC、ゲル濾過)、抽出、限外濾過、電気泳動、およびそれらの組み合わせによって実施することができる。タンパク質単離および精製は、配列およびアミノ酸モチーフを含めることによって、またはアフィニティー精製のための配列およびアミノ酸モチーフを有するタンパク質発現ベクターの使用によって容易にすることができる。適切な配列およびモチーフは、例えば、ヒスチジンタグ、抗原ペプチドタグ、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−S−トランスフェラーゼおよび当業者に公知のその他の適切なタグであってもよい。特に適切な親和性タグは、例えば、図14で例示したヒスチジンタグ(「Hisタグ」)であり得る。当業者に公知なように、親和性タグは、親和性タグを含有するタンパク質の精製の助けとなる。
本開示による組換え発現組成物は、他のドメインから組成物をさらに単離するために、プロテアーゼ切断部位をさらに含むことができる。適切なプロテアーゼ切断部位は、当業者に公知のいかなるプロテアーゼ切断部位であってもよい。適切なプロテアーゼは、例えば、第Xa因子、エンテロキナーゼ、トロンビン、TEVプロテアーゼ(Invitrogen、Carlsbad、CA)、PRESCISSION(GE Healthcare Life Sciences、Piscataway、NJ)、ペプシン切断部位、トリプシン切断部位、キモトリプシン切断部位、サーモリシン切断部位、および当業者に公知のその他のプロテアーゼ切断部位であり得る。特に適切なプロテアーゼ切断部位は、例えば、トロンビン切断部位であり得る。
さらに、または代わりに、本開示の組成物は、化学的合成法を使用して調製することができる。適切な化学合成法は当技術分野では周知で、例えば、液相ペプチド合成、固相ペプチド合成、断片縮合、および化学的ライゲーションを含み得る。
治療薬を神経筋接合部に送達する方法
別の態様では、本開示は、治療薬を神経筋接合部に送達する方法を対象とする。この方法は、治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を投与することを含む。
別の態様では、本開示は、治療薬を神経筋接合部に送達する方法を対象とする。この方法は、治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を投与することを含む。
神経筋接合部標的化ペプチドは、本明細書で記載したいかなる神経筋接合部標的化ペプチドであってもよい。治療薬は、本明細書で記載したいかなる治療薬であってもよい。組成物はさらに、本明細書で記載した少なくとも1つのリンカーを含んでいてもよい。
投与は、対象に対するものであり得る。対象に対する適切な投与方法は、例えば、静脈注射、静脈注入、腹腔内注射、皮内注射、筋肉内注射、皮下注射、経鼻、経口および当業者に公知のその他の方法によるものであり得る。投与はまた、培養細胞に対するものであってもよい。培養細胞に対する適切な投与方法は、例えば、組成物を含有する溶液のピペッティング、灌注(pouring)、および当技術分野で公知のその他の方法によるものであってもよい。
投与する組成物の用量は、当業者によって決定することができる。用量は、例えば、状態または疾患、対象の体重、対象の年齢、投与方法、投与経路、インビボにおける目的のために投与するかどうか、インビトロにおける目的のために投与するかどうか、およびその他の要因などの様々な要因に左右され得る。対象に対する用量は一般的に、対象における少なくとも1つの臨床症状のいくらかの軽減、緩和、または減少(decrease)をもたらすために、対象にいくらかの改善または利益をもたらすのに十分な量を含む。この用量はまた、例えば、インビトロにおける補体阻害効果または補体依存細胞溶解の防止をもたらすために十分な量を含んでいてもよい。
適切な用量は、約0.001μg/mlから約4μg/mlであり得る。特に適切な用量は、約0.001μg/mlから約0.02μg/mlであり得る。適切な用量は、例えば、抗体感作赤血球の補体溶血活性の阻害を調べることによって、抗体によって惹起される細胞株の補体媒介性損傷のルミネセンスバイオアッセイによって(例えば、Cambrex、Rockland、MEから市販されているtoxilightバイオアッセイ)、インビトロにおいて測定することができる。適切な用量はまた、例えば、神経筋接合部への標的化を分析すること、対象における筋力低下の表れを分析すること、および全身補体活性における変化を測定することによって、インビボにおいて測定することができる。当業者であれば、治療効果は、対象にいくらか利益がもたらされる限り、完全であったり、治癒であったりする必要はないことは理解されよう。
神経筋接合部関連疾患または状態を治療する方法
別の態様では、本開示は、神経筋接合部関連疾患または状態を治療する方法を対象とする。この方法は、治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、神経筋接合部関連疾患または状態を治療する方法を対象とする。この方法は、治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
本明細書では、「神経筋接合部関連疾患または状態」とは、神経筋接合部における損傷および/または神経筋接合部に対する損傷から生じる疾患または状態を意味する。神経筋接合部関連疾患または状態は、例えば、重症筋無力症、実験的に得られた重症筋無力症、ランバート−イートン症候群、ミラー・フィッシャー症候群、先天性筋無力症症候群、ボツリヌス中毒、有機リン中毒、および神経筋接合部を損なう(compromise)その他の毒素であってもよい。
この方法には、本明細書で記載した神経筋接合部における損傷および/または神経筋接合部に対する損傷から生じる神経筋接合部関連疾患または状態に罹患した個体を含む、組成物を必要とする対象に対する組成物の投与が含まれる。さらに、組成物を必要とする対象には、神経筋接合部における損傷および/または神経筋合部に対する損傷から生じる疾患または状態を模倣するように実験的に誘導され、したがってこれらの疾患および状態の動物モデルとして役立つ実験動物が含まれる。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、一般集団の全てがこれらの方法によって利益を得ることはできないので、本明細書で開示した方法は、一般集団の小集団を対象とする。
適切な対象は哺乳動物であり得る。適切な哺乳動物は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、およびサルであり得る。
神経筋接合部標的化ペプチドは、本明細書で記載したいかなる神経筋接合部標的化ペプチドであってもよい。治療薬は、本明細書で記載したいかなる治療薬であってもよい。組成物はさらに、本明細書で記載した少なくとも1つのリンカーを含んでいてもよい。
適切な投与方法は、例えば、静脈注射、静脈注入、腹腔内注射、皮内注射、筋肉内注射、皮下注射、経鼻、経口、および当業者に公知のその他の方法によるものであり得る。
適切な治療有効量は、例えば、約1ng/kgから約0.1mg/kgであり得る。より具体的には、治療有効量は約5mg/kgであり得る。適切な治療有効量はさらに、約0.001μg/mlから約40μg/mlの半数阻害濃度(IC50)を有するように記載されてもよい。特に適切なIC50は、約10ng/mlから約20μg/mlであり得る。治療有効量は、例えば、対象における筋力低下の表れが認められることなく長期の生物学的効果が認められることを特徴とすることができる。対象に投与する組成物の治療有効量は、当業者によって決定することができる。治療有効量は、例えば、状態または疾患、対象の体重、対象の年齢、投与方法、投与経路、およびその他の要因などの様々な要因に左右され得る。一般的に、治療有効量は、対象における少なくとも1つの臨床症状のいくらかの軽減、緩和または減少をもたらすために、対象にいくらかの改善または利益をもたらすのに十分な量を含む。当業者であれば、効果は、対象にいくらか利益がもたらされる限り、完全であったり、治癒であったりする必要はないことは理解されよう。
本開示は、以下の非限定的実施例を考察してより完全に理解されるだろう。
実施例1
L−rEVクローニングおよび発現
この実施例では、rEV(配列番号10によってコードされる)に結合したラミニン由来神経筋接合部標的化ペプチド(配列番号1によってコードされる)を含む組成物を組換えタンパク質発現によって調製した。
L−rEVクローニングおよび発現
この実施例では、rEV(配列番号10によってコードされる)に結合したラミニン由来神経筋接合部標的化ペプチド(配列番号1によってコードされる)を含む組成物を組換えタンパク質発現によって調製した。
具体的には、ラミニン神経筋接合部標的化ペプチドをrEVに結合した。図1に示したように、コンストラクトはさらに、リンカー、Hisタグおよびトロンビン切断部位を含んだ。コドン最適化は、Integrated DNA Technologiesから入手可能なコドン最適化プログラムを使用して実施した。
ラミニン−リンカー−rEVをコードするcDNAは、原核細胞発現ベクタープラスミドpET−28−a(+)にマルチクローニングサイト内のNheIおよびEcoRIサイトを介してサブクローニングした。プラスミドは、制限酵素分析およびダイレクトシークエンス法(direct sequencing)によって確認した。プラスミドコンストラクトの概略図を図2に示す。
ラミニン−リンカー−rEVの組換えタンパク質発現のために、BL21大腸菌(E. coli)を前記で調製したpET28a−ラミニン−リンカー−rEVプラスミドで形質転換し、1mMのイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)で4時間誘導した。細胞は、3.2mMのNa2HPO4、0.5mMのKH2PO4、1.3mMのKCl、135mMのNaCl(pH7.4)、5mMのイミダゾール、リゾチームおよびプロテアーゼ阻害剤錠(Roche)を含有する溶解緩衝液中で超音波処理によって溶解した。4℃で13,000rpmで20分間遠心分離した後、可溶性画分をTalon metalアフィニティーカラム(Clontech)に添加し、緩衝液A(3.2mM Na2HPO4、0.5mM KH2PO4、1.3mM KCl、135mM NaCl(pH7.4))で洗浄し、異なる濃度のイミダゾール(20mMから500mM)を含有する緩衝液Aで溶出した。関心のあるタンパク質を含有する画分をプールし、Amicon ultra 10K MWCOフィルター(Millipore)を使用して濃縮した。次に、ゲル濾過クロマトグラフィーのために、濃縮したタンパク質をSuperdex200カラム(GE healthcare)に添加した。溶出した画分のタンパク質存在を分析し、陽性画分の濃度を確認した。得られたタンパク質を−80℃で保存するか、またはさらに実験するために使用した。
精製したタンパク質の濃度をブラッドフォードアッセイによって測定した。図3に示したように、誘導されたBL21細胞は、誘導後1時間以内にラミニン−rEVの発現を開始し、4時間後に最大発現した。抗rEV抗体を使用したウェスタンブロット分析によって、誘導細胞における発現を確認した。図4を参照のこと。
実施例2
HIV−rEV
この実施例では、rEV(配列番号10によってコードされる)に結合したHIV由来の神経筋接合部標的化ペプチド(配列番号3によってコードされる)を含む組成物を実施例1で記載したように調製した。
HIV−rEV
この実施例では、rEV(配列番号10によってコードされる)に結合したHIV由来の神経筋接合部標的化ペプチド(配列番号3によってコードされる)を含む組成物を実施例1で記載したように調製した。
具体的には、HIV神経筋接合部標的化ペプチドをrEVに結合した。図5に示したように、コンストラクトはさらに、リンカー、Hisタグおよびトロンビン切断部位を含んだ。コドン最適化は、Integrated DNA Technologiesから入手可能なコドン最適化プログラムを使用して実施した。
BL21大腸菌は、pET28a−HIV−リンカー−rEVプラスミドで形質転換し、IPTGで4時間誘導した。細胞を溶解し、タンパク質を前記の実施例1で記載したように精製した。得られたタンパク質を−80℃で保存するか、またはさらに実験するために使用した。
実施例3
RVG−rEV
この実施例では、rEV(配列番号10によってコードされる)に結合したRVG由来の神経筋接合部標的化ペプチド(配列番号5によってコードされる)を含む組成物を実施例1で記載したように調製した。
RVG−rEV
この実施例では、rEV(配列番号10によってコードされる)に結合したRVG由来の神経筋接合部標的化ペプチド(配列番号5によってコードされる)を含む組成物を実施例1で記載したように調製した。
具体的には、RVG神経筋接合部標的化ペプチドをrEVに結合した。図6に示したように、コンストラクトはさらに、リンカー、Hisタグおよびトロンビン切断部位を含んでいた。コドン最適化は、Integrated DNA Technologiesから入手可能なコドン最適化プログラムを使用して実施した。
BL21大腸菌は、pET28a−RVG−リンカー−rEVプラスミドで形質転換し、IPTGで4時間誘導した。細胞を溶解し、タンパク質を前記の実施例1で記載したように精製した。得られたタンパク質を−80℃で保存するか、またはさらに実験するために使用した。
実施例4
この実施例では、崩壊促進因子(DAF)に結合したMab35由来の1本鎖抗体断片(scFv)を使用して、神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を実施例1で記載したように調製した。
この実施例では、崩壊促進因子(DAF)に結合したMab35由来の1本鎖抗体断片(scFv)を使用して、神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を実施例1で記載したように調製した。
具体的には、scFvをDAFに融合させ、図7に概略を示したpET16b発現ベクターに挿入した。scFvのVH−VL断片を生成するために、Mab35抗体を分泌するTIB−175ハイブリドーマ細胞系(ATCCから入手)からRNAを得た。可変重鎖(VH)および/または可変軽鎖(VL)は、RT−PCRによって増幅した。重複PCRを使用して、1本鎖AChR抗体scFvを作製するために(GGGGS)3(配列番号34)リンカーを備えたVH−VL断片を生成した。配列決定によって、クローニングした断片の正体はVHおよびVL領域であると確認した。次に、CD59断片またはIgGシグナルペプチドを使用して、2種類のシグナルペプチドコンストラクトを作製した。次に、CD59sp−またはIgGsp−シグナルペプチドをVH−VL断片に融合し、pIRES2−AcGFP1ベクター(Clonetech、Mountain View、CA)にクローニングした。BHK−21細胞をこれらのコンストラクトで遺伝子導入した。図8は、IgG VH−VL断片で遺伝子導入した遺伝子導入BHK−21細胞によるGFPの発現を示す。
次に、DAFをCD59sp−VH−VLまたはIgGsp−VH−VLのいずれかに融合させた。CD59sp−VH−VL−DAFは、537アミノ酸ペプチド(配列番号34)である。IgGsp−VH−VL−DAFは、534アミノ酸ペプチド(配列番号35)である。
BL21細胞は、以前に記載したscFv−DAFコンストラクトを含有するpET16b発現ベクターで形質転換した。発現したタンパク質は、Hitrap chelating HPカラム(製造者)を使用して精製し、尿素勾配透析によってリフォールディングした。発現、精製、およびリフォールディング工程中に採取した試料をSDS−PAGEによって分析した。図9を参照のこと。列1は、誘導前のpET16b−scFv−DAF/BL21の試料である。列2は、誘導後のpET16b−scFv−DAF/BL21の試料である。列3および4は、Hitrap chelating HPカラムからの融合タンパク質の溶出ピークである。列5および6は、尿素勾配透析後のリフォールディングした融合タンパク質である。列Mは分子量マーカーである。
実施例5
scFv−DAF融合タンパク質を、ELISAによってhAChRα1−210ペプチドに対する特異的結合について分析した。
scFv−DAF融合タンパク質を、ELISAによってhAChRα1−210ペプチドに対する特異的結合について分析した。
hAChRα1−210ペプチド(2μg/ml)をプレートにコーティングし、連続希釈したscFv−DAFまたはscFv1956と共にインキュベートした。結果はODで表した。結果を図10に示す。値は、平均±SDで表した。*P<0.05。
実施例6
scFv−DAF融合タンパク質を、インビトロにおける補体調節機能について分析した。
scFv−DAF融合タンパク質を、インビトロにおける補体調節機能について分析した。
抗体で感作したヒツジ赤血球を標的として使用した。補体媒介溶血の程度は、ヘモグロビンの上清への放出によって定量し、アッセイ中に存在する阻害剤のモル濃度に対してプロットした。結果は、3連で実施した実験の平均値±SDを表す。結果を図11に示す。*P0.05。
実施例7
この実施例では、神経筋接合部へのscFv−35−DAFの標的化を分析した。
この実施例では、神経筋接合部へのscFv−35−DAFの標的化を分析した。
実施例6で調製したscFv−35−DAFを、補体損傷に強い感受性のあるC57/Black6およびCD59−/−、DAF−/−マウスに注射した。24時間後、体重および筋力低下を評価した。動物には、体重上昇が見出され、強度の損失は示されず、scFv−35−DAFは神経筋接合部伝達を阻害しないことが示唆された。横隔膜は、接合部を同定するための抗ラットIgGおよびブンガロトキシンによってscFv−35−DAFの神経筋接合部に対する局在を視覚化するために使用した。図12に示したように、scFv−35−DAFは、両動物における神経筋接合部に局在し、補体調節因子欠損マウスにおいてさえも組織破壊の証拠はなかった。これらの結果によって、scFv−35−DAFコンストラクトが安全で、神経筋接合部を特異的に標的とすることが確認された。
scFv−35−DAFはまた、ルイスラットに投与した。実験的に重症筋無力症を誘導して24時間後にアセチルコリン受容体抗体をルイスラットに投与した。48時間後に、筋力低下の重症度は対照ラットで最大になった。scFv−35−DAFで処置した5匹の動物のうち、全てが生存し、軽度から中程度の筋力低下を示した。scFv−35で処置したラットでは、3匹の動物が死亡し、2匹が重度の筋力低下を有した。これらの結果は、scFv−35−DAFが安全であったこと、および着実な防御効果を有することを示唆した。
実施例8
この実施例では、TE671細胞上のC3の沈着に対するscFv−35−DAFの影響を分析した。
この実施例では、TE671細胞上のC3の沈着に対するscFv−35−DAFの影響を分析した。
TE671細胞は、scFv−DAF、scFv1956、およびDAF(100nM)を有する正常基礎培地で処置した。陰性対照は、mAb35の代わりにPBSで処置した。細胞は、FITC結合抗C3抗体で染色し、対比染色としてエオジン染色溶液で染色した。画像は、200×(パネルA〜E)、400×(パネルF〜J)および1000×(パネルK〜O)で得た。細胞はまた、フローサイトメトリーによって分析した。
結果を図13に示す。scFv−DAFおよびscFv1956で処置した細胞上に沈着したC3の染色は斑状で中程度であった(パネルLおよびM参照)。TE671細胞周囲のC3沈着の染色は拡散していた(パネルM、NおよびO参照)。スケールバー=10μm。
結果によって、scFv−DAF融合タンパク質はTE671細胞表面のC3沈着を阻害することが示された。
実施例9
この実施例では、EAMGマウスおよびラットにおけるscFv−35−DAFの治療効果を分析した。
この実施例では、EAMGマウスおよびラットにおけるscFv−35−DAFの治療効果を分析した。
具体的には、EAMGをDAF−/−、CD59ab−/−マウスおよびルイスラットに導入し、その後scFv、scFv−DAF、およびPBS(対照として)で処置した。マウスは全て疾患の証拠を示さなかったが(図15参照)、scFv−DAFで処置したラットは、EAMGからの顕著な保護を示した(図16)。補体沈着の定量的分析によって、媒体処置およびscFv処置ラットの両方と比較してscFv−Daf処置動物の終板におけるMAC沈着はかなり少ないことが示された。scFvおよび媒体の比較において、scFvは補体沈着の有意傾向な増加を示した。良好な臨床結果と矛盾せず、AChR密度は、scFvおよび媒体処置ラットよりもscFv−DAF処置ラットにおいて顕著に良好であった(示さず)。
前記を考慮して、本開示のいくつかの利点は実現し、その他の有利な結果が達成されることがわかるだろう。本開示の範囲を逸脱せずに前記プロセスおよび複合物(composite)に様々な変更を行うことができるので、前記説明に含まれ、添付の図面に見られる事柄は全て例示として解釈され、制限を意味しない。
本開示の要素またはその様々なバージョン、実施形態もしくは態様を示す場合、冠詞「ある(a)」、「ひとつの(an)」、「該(the)」および「前記(said)」は、1つまたは複数の要素があることを意味するものとする。「含む(comprising)」、「含む(including)」および「有する(having)」という用語は、包括的であり、列挙した要素以外の要素を追加してもよいことを意味する。
Claims (20)
- 治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物。
- 神経筋接合部標的化ペプチドが、ラミニンペプチド、ヒト免疫不全ウイルスのヌクレオカプシドジンクフィンガードメイン、狂犬病ウイルスの糖タンパク質ペプチド、α−ブンガロトキシンペプチド、アグリンペプチド、アセチルコリンエステラーゼに特異的に結合する1本鎖抗体ペプチドおよびアセチルコリン受容体に特異的に結合する1本鎖抗体ペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- 神経筋接合部標的化ペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号7、配列番号8、および配列番号9からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
- 治療薬が、補体阻害剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、栄養剤および麻痺剤からなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 補体阻害剤が崩壊促進因子、rEV、rEV576、補体調節タンパク質、コンプスタチン、コンプスタチン誘導体、POT−4、C1阻害剤、C4b結合タンパク質、H因子、補体受容体Ig、CD59、クラスタリン、C3阻害剤、ペプチド2J、ヒトβ−ディフェンシン2、CRIT−H17、Ac−SHLGLAR−H、Ac−RLLLAR−H、C1s−INH−248、S−タンパク質、Crry、クルクミン、W−54011、NDT9520492、NGD2000−1、CP−447,697、NDT9513727、SB290157、SB290157(A)、SB290157(B)、BCX1470、PMX53、PMX205、C089、およびJPE1375である、請求項4に記載の組成物。
- リンカーをさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- リンカーが、グルタミン−セリンリンカー、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、および配列番号33からなる群から選択される、請求項6に記載の組成物。
- 治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を投与すること
を含む、治療薬を神経筋接合部に送達する方法。 - 神経筋接合部標的化ペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号7、配列番号8、および配列番号9からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の方法。
- 治療薬が、補体阻害剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、栄養剤、および麻痺剤からなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 組成物が、リンカーをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- リンカーが、グルタミン−セリンリンカー、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、および配列番号33からなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- 神経筋接合部に関連する疾患または状態の治療を必要とする対象において神経筋接合部に関連する疾患または状態を治療する方法であって、治療有効量の、治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を該対象に投与することを含む方法。
- 神経筋接合部に関連する疾患または状態が、重症筋無力症、実験的に得られた重症筋無力症、ランバート−イートン症候群、ミラー・フィッシャー症候群、先天性筋無力症症候群、ボツリヌス中毒および有機リン中毒からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 神経筋接合部標的化ペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号7、配列番号8、および配列番号9からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項13に記載の方法。
- 治療薬が、補体阻害剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、栄養剤、および麻痺剤からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 補体阻害剤が、DAF、rEV、rEV576、補体調節タンパク質、コンプスタチン、コンプスタチン誘導体、POT−4、C1阻害剤、C4b結合タンパク質、H因子、補体受容体Ig、CD59、クラスタリン、C3阻害剤、ペプチド2J、ヒトβ−ディフェンシン2、CRIT−H17、Ac−SHLGLAR−H、Ac−RLLLAR−H、C1s−INH−248、S−タンパク質、Crry、クルクミン、W−54011、NDT9520492、NGD2000−1、CP−447,697、NDT9513727、SB290157、SB290157(A)、SB290157(B)、BCX1470、PMX53、PMX205、C089、およびJPE1375からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 投与ステップが、注入、注射、経口、経鼻、局所および皮下投与によるものである、請求項13に記載の方法。
- 治療有効量が、約0.001μg/mlから約40μg/mlの半数阻害濃度を有する、請求項13に記載の方法。
- 組成物が、約0.5nMから約50μMの結合親和性を有する、請求項13に記載の方法。
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