JP2014520121A

JP2014520121A - 癌の処置における治療抗体の標的としてのＦｒｉｚｚｌｅｄ２

Info

Publication number: JP2014520121A
Application number: JP2014516055A
Authority: JP
Inventors: タランエス．グジュラール; ギャビンマクビース
Original assignee: プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ
Priority date: 2011-06-17
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2014-08-21
Anticipated expiration: 2032-06-15
Also published as: US20160215343A1; US20180002754A1; WO2012174446A1; US9260519B2; CA2839755A1; EP3281640A1; US20140242070A1; EP2720721B1; AU2017239515A1; JP6081995B2; EP2720721A4; US9765401B2; AU2012271413A1; EP2720721A1; AU2012271413B2

Abstract

本明細書において、Fzd2をダウンモジュレートする抗体またはその抗原結合断片の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、対象における癌を処置する方法、ならびに対象における癌細胞の増殖、遊走、および／または浸潤を阻害する方法が開示される。抗体はFzd2に特異的に結合してもよく、癌細胞によるFzd2受容体のインターナリゼーションを促進してもよく、および／またはFzd2に対するリガンド結合を防止してもよい。特異的抗体および抗体結合に関するFzd2分子の特異的部分も開示される。1つの態様において、抗体は、エピトープHGAEQICVGQNHSEDGAPAL（SEQ ID NO: 1）に特異的に結合する。処置に関して意図される特異的癌（たとえば、後期肝細胞癌）が提供され、これにはFzd2および／またはWnt5aの過剰発現を示す癌が含まれる。

Description

関連出願
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下で、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる、2011年6月17日に提出された米国特許仮出願第61/498,353号の恩典を主張する。

政府の支援
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたGM072872によって政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。

発明の分野
本発明は、癌治療の分野に関する。

発明の背景
肝臓癌は、癌による死因の第3位であり、世界中で年間の死者はおよそ500,000人から100万人に及ぶ[1]。アメリカ癌学会は、2010年にアメリカで発症した肝臓癌の新規症例は約24,000例であり、これらの80％より多くが肝細胞癌（HCC）であると推定した。2010年にアメリカにおける推定で19,000人の死亡が肝臓癌に起因した。肝臓癌の発生率および死亡率は1980年代初期以降増加し続けている。

今日まで、手術による切除は肝臓癌の最善の処置であると考えられているが、手術に適する患者の割合は低く、再発率は高い[2]。HCCを有する多くの患者はいかなる治療も受けていない。肝臓移植は、限られた進行度のHCCの処置において成功している。しかし、移植に適するのはHCC患者のごく少数に過ぎない。標準化学療法は、切除に適しない患者において認容性が不良である。ドキソルビシンおよびシスプラチンはいずれもしばしば用いられるが、奏功率は低く、いずれも実質的に生存を延長しない。肝臓癌患者の5年生存率は14％である。癌が初期段階で発見される患者では、5年生存率は26％であるのに対し、遠位臓器に転移後に癌が発見される場合にはわずか2％に過ぎない。それゆえ、この破滅的疾患の病因において肝要な役割を果たしうる新規治療標的を同定するために、分子レベルで肝臓癌発生をよりよく理解することが極めて重要である。

HCCは、肝臓を起源とする最も一般的な腫瘍である[2]。最近の研究により、Wnt/β-カテニン経路、Hedgehogシグナル伝達、および受容体チロシンキナーゼ関連経路を含む、肝臓癌発生における様々なシグナル伝達経路の役割が強調されている。これらの発見は、新規標的治療の可能性がある代替物を提供する。特に、Wntシグナル伝達の役割は、HCCの分子的発病を理解する上で考慮すべき関心対象である[3]。異常なWntシグナル伝達は、結腸、皮膚、脳、肝臓および前立腺の癌を含む多くのタイプの癌に関係している[4]。結腸直腸癌において、β-カテニンの異常な蓄積は、主にβ-カテニン自身の変異ならびにAPCおよびアキシンの変異の結果として生じる。しかし、これらの変異はHCCでは比較的まれであり、Wnt経路の誤調節は、WntリガンドおよびFzd受容体などの経路の他の成分の過剰発現を含む他の様式で起こることを示唆している[3]。しかし、今日まで、リガンドまたは受容体が、HCCにおけるβ-カテニン経路の活性化の原因であることは知られていない。

本発明の1つの局面は、抗体またはその抗原結合断片が対象の癌細胞に送達されて、それによって癌を処置するように、Fzd2をダウンモジュレートする抗体またはその抗原結合断片の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、対象における癌を処置する方法に関する。

本発明の1つの局面は、抗体またはその抗原結合断片が癌細胞に送達されて、それによって癌を処置するように、Fzd2をダウンモジュレートする抗体またはその抗原結合断片の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、対象における癌細胞の増殖、遊走、および／または浸潤を阻害する方法に関する。

本明細書において記述される様々な方法の1つの態様において、抗体はFzd2に特異的に結合する。本明細書において記述される様々な方法の1つの態様において、抗体はFzd2に結合して、癌細胞によるFzd2受容体のインターナリゼーションを促進する。本明細書において記述される様々な方法の1つの態様において、Fzd2に対する抗体は、Fzd2に対するリガンドの結合を防止する。本明細書において記述される様々な方法の1つの態様において、抗体は、Fzd2タンパク質の細胞外部分に特異的に結合する。本明細書において記述される様々な方法の1つの態様において、抗体は、Fzd2の24〜247番目のアミノ酸に対応するFzd2の領域内でFzd2に特異的に結合する。本明細書において記述される様々な方法の1つの態様において、抗体は、Fzd2の125〜163番目のアミノ酸に対応するFzd2の領域内でFzd2に特異的に結合する。本明細書において記述される様々な方法の1つの態様において、抗体は、Fzd2の134〜163番目のアミノ酸に対応するFzd2の領域内でFzd2に特異的に結合する。本明細書において記述される様々な方法の1つの態様において、抗体は、Fzd2の144〜163番目のアミノ酸に対応するFzd2の領域内でFzd2に特異的に結合する。本明細書において記述される様々な方法の1つの態様において、抗体は、エピトープ

に特異的に結合する。

本明細書において記述される様々な方法の1つの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。本明細書において記述される様々な方法の1つの態様において、抗体はポリクローナル抗体である。本明細書において記述される様々な方法の1つの態様において、抗体はヒト化抗体である。

本明細書において記述される様々な方法の1つの態様において、癌は、消化管癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、頭頚部癌、肺癌、非小細胞肺癌、神経系の癌、腎臓癌、網膜癌、皮膚癌、肝臓癌、膵臓癌、尿生殖器癌、および膀胱癌からなる群より選択される。本明細書において記述される様々な方法の1つの態様において、癌は肝臓癌である。本明細書において記述される様々な方法の1つの態様において、癌は後期肝細胞癌である。本明細書において記述される様々な方法の1つの態様において、癌は、Fzd2の過剰発現を示す。本明細書において記述される様々な方法の1つの態様において、癌は、Wnt5aの過剰発現を示す。

Fzd2が、後期の分化の不良な肝細胞癌（HCC）において過剰発現されることを示す実験結果を示す。組織病理学的に確認されたHCC（ステージI、n＝7；ステージII、n＝8；ステージIII、n＝8；ステージIV、n＝3；腫瘍病変、n＝14）を有する患者から得られた組織試料48個と共に正常な肝臓試料（n＝8）。図1Aは、Fzd2 mRNA発現が、正常組織と比較して肝細胞癌の後期（ステージIIIおよびIV）において有意に増加したことを示す棒グラフである（P＜0.05）。図1Bは、Fzd2発現のmRNAレベルが組織分化と相関したことを示す棒グラフである。分化が中等度および不良である腫瘍は、分化が良好である腫瘍タイプと比較して高いFzd2レベルを示した。 Fzd2が、より上皮様のHepG2 HCC細胞株と比較してFOCUS細胞株において高度に過剰発現されることを示す実験結果を示す。棒グラフは、HepG2細胞と比較してFOCUS細胞において様々なWntシグナル伝達受容体および共受容体の相対的mRNA発現を示す。 Fzd2が、Wnt5a媒介細胞遊走および浸潤において本質的な役割を果たすことを示す実験結果を示す。図3Aおよび図3Bは、Fzd2のsiRNA媒介ノックダウンまたは抗Fzd2抗体による前処置が、2時間でWnt5aの細胞遊走（図3A）および浸潤（図3B）効果を低減させることを示す棒グラフである。抗Fzd2抗体が細胞表面Fzd2受容体のインターナリゼーションを引き起こすことを示す実験結果を示す。図4Aは、Wnt5aまたは抗Fzd2前処置の際にタンパク質レベルの低減を示すビオチニル化細胞表面Fzd2タンパク質のウェスタンブロットの写真である。図4Bは、全細胞溶解物中の総Fzd2に関して標準化した細胞表面Fzd2レベルの相対的定量を示す棒グラフである。 Fzd2ノックダウンがヌードマウスにおいて腫瘍の増殖を低減させることを示す実験結果を示す。FOCUS細胞を無胸腺マウスの皮下に注射して、細胞の腫瘍増殖物形成能を、Fzd2に対するsiRNAの存在下または非存在下でモニターした。処置群および対照群の腫瘍増殖曲線は、Fzd2に対するsiRNAの存在下では、腫瘍の増殖は有意に遅く、指数増殖期の顕著な遅延が示されることを示している。動物に、Fzd2-siRNAまたは対照を注射した。抗Fzd2抗体のエピトープマッピングを示す実験結果を示す。図6A左側は、Fzd2タンパク質の完全長のドメイン構造を示す略図である。抗Fzd2抗体のエピトープをマップするために設計された3つの断片のドメイン構造も同様に示す。図6A右側は、抗Fzd2抗体が断片1および3のみを認識することができることを示すウェスタンブロットの写真である。図6B左側は、抗Fzd2抗体のエピトープをマップするように設計された3つのペプチドにおける重なり合う残基の位置を示す略図である。図6B右側は、抗Fzd2抗体がペプチド2のみを認識することを示すペプチドアレイ画像である。完全長のFzd2遺伝子または空のベクター（陰性）を過剰発現するHEK293細胞の全細胞溶解物もまた、これらのアレイにプリントした。CRD、システインリッチドメイン；TM、膜貫通領域。ヒトFzd2タンパク質（SEQ ID NO:2）のアミノ酸配列である。 Fzd2がWnt5a媒介細胞移動、浸潤、および腫瘍の増殖において本質的な役割を果たすことを示す実験結果を示す。図8A左側は、5つのFzd2-shRNAまたは対照-shRNA発現FOCUS細胞の相対的mRNA発現を示す棒グラフである。図8A右側は、Fzd2タンパク質レベルのノックダウンを示すウェスタンブロットの画像である。図8Bは、Fzd2のノックダウンがFOCUS細胞の遊走を低減させることを示すデータのグラフ表示である。親（野生型）またはFzd2-shRNAまたは対照shRNA発現FOCUS細胞の相対的創傷密度を60時間モニターした。図8C左側は、ボイデンチャンバーの底部において外因性のWnt5aの存在下で、抗Fzd2抗体の存在下またはFzd2抗体の非存在下で処置したFOCUS細胞の2時間での細胞遊走が低減することを示すデータの棒グラフである。図8C右側は、ボイデンチャンバーの底部において外因性のWnt5aの存在下で抗Fzd2抗体の存在下または非存在下で処置したFOCUS細胞の細胞浸潤が低減することを示すデータの棒グラフである。図8Dは、抗Fzd2抗体が、細胞表面Fzd2受容体のインターナリゼーションを引き起こすことを示す一連のデータである。図8D左側は、ビオチニル化細胞表面Fzd2タンパク質のウェスタンブロットの画像である。Wnt5aまたは抗Fzd2前処置によって、低減されたタンパク質レベルが観察された。図8D右側は、全細胞溶解物における総Fzd2に関して標準化された細胞表面Fzd2レベルの相対的定量を示す棒グラフである。図8Eおよび図8Fは、Fzd2ノックダウンにより、ヌードマウスにおける腫瘍の増殖が低減されることを示すデータのグラフ表示である。FOCUS細胞を、無胸腺マウスに皮下注射して、Fzd2に対するsiRNA（図8E）またはFzd2-shRNA（図8F）の存在下または非存在下で、細胞の腫瘍増殖物形成能をモニターした。 HCC患者40人に関するカプラン-マイヤー生存曲線を示す。コックスマンテルログランク検定によって統計学的p値を得た。抗Fzd2抗体について行った結合分析試験のグラフ表示である（Precision Antibody（商標）によって行ったBioCore試験）。分析により、本明細書における実験において用いたFzd2に対する市販のFzd2 AbのKDが、約20 nMであることが示された。 Fzd2がSerpin E1およびsICAM1の放出を媒介することを示す実験結果を示す。図11Aは、FOCUS-WT（上）およびFOCUS-shFzd2（下）からの条件培地によってプロービングしたヒトサイトカインアレイの画像を含む。検出後、アレイデータを定量してタンパク質プロファイルを作製した。図11Bは、このアッセイを用いて測定した36個のサイトカインの量を示す棒グラフである。放出されたSerpinE1およびsiCAM1は、FOCUS-shFzd2細胞の条件培地では有意に低かった。マトリクスメタロプロテナーゼ（MMP）およびSerpinE1が、後期の侵襲性で分化が不良な肝細胞癌（HCC）株において過剰発現されることを示す実験結果を示す。棒グラフは、初期の非侵襲性（HepG2およびHuh7）および後期の侵襲性（SNU475およびFOCUS）細胞株における様々なMMPおよびSerpinE1の相対的mRNA発現を示す。mRNA発現を18Sに対して標準化した。 Fzd2がマトリクスメタロプロテナーゼ（MMP）およびSerpinE1のmRNA発現を調節することを示す実験結果を示す。棒グラフは、FOCUS-CTLまたはFOCUS-shFzd2細胞における様々なMMPおよびSerpinE1の相対的mRNA発現を示す。 Fzd2が、Stat3、ERK1/2およびMEK1/2のリン酸化状態ならびにその転写活性を調節することを示す実験結果を示す。図14Aは、野生型FOCUS細胞およびFzd2をノックダウンしたFOCUS細胞におけるSTAT3、ERK1/2、およびMEK1/2リン酸化を示すイムノブロットの画像である。類似の結果が他の後期細胞株および抗Fzd2抗体処置において証明された。図14Bは、野生型FOCUSおよびSNU449細胞ならびにFzd2またはSTAT3をノックダウンした細胞におけるレポーター/ルシフェラーゼに基づくアッセイを用いたstat3転写活性を示す棒グラフである。類似の結果が他の後期細胞株および抗Fzd2抗体による処置において証明された。図14Cは、後期HCC細胞株（FOCUS）の細胞遊走に及ぼすStat3に対する低分子阻害剤の効果を示す一連の用量反応曲線である。 Fzd2が、後期HCC細胞株においてStat3をリン酸化するSrcファミリーキナーゼのリン酸化状態を調節することを示す実験結果を示す。図15Aは、野生型FOCUS細胞およびFzd2をノックダウンしたFOCUS細胞におけるsrcファミリーキナーゼのリン酸化を示す棒グラフである。同様な結果が他の後期細胞株について示された。図15Bは、SFKに対する分子阻害剤（ダサチニブ）が、FOCUS細胞におけるstat3リン酸化を消失させることを示す実験結果の写真である。図15Cは、後期HCC細胞株（FOCUS）の細胞遊走に及ぼすSFKに対する低分子阻害剤の効果を示す一連の用量反応曲線である。

発明の詳細な説明
本発明の局面は、肝細胞癌細胞上のFrizzled 2受容体（Fzd2）が抗体に特異的結合すると、細胞の様々な腫瘍形成特性を低減させるという知見に関する。抗体が結合すると、細胞の遊走、細胞の浸潤ならびに細胞の増殖を低減させる。そのため、本発明の1つの局面は、腫瘍細胞の1つまたは複数の腫瘍形成特性（たとえば、増殖、遊走、および／または浸潤）を阻害する方法に関する。方法は、細胞におけるFzd2をダウンモジュレートする剤（たとえば、抗体またはその抗原結合断片）の有効量を腫瘍細胞に接触させて、それによって細胞においてFzd2をダウンモジュレートする段階を含む。1つの態様において、剤は、細胞においてFzd2を特異的にダウンモジュレートし、すなわち剤は、他の近縁のタンパク質（たとえば、本明細書において記述される他のFzdタンパク質）をダウンモジュレートしない。1つの態様において、剤は、Fzd2受容体の癌細胞による十分なインターナリゼーションを促進して、細胞の1つまたは複数の腫瘍形成特性を阻害する。1つの態様において、剤は、Fzd2に対するリガンド（Wnt5a）の結合を防止する。

本明細書において報告される知見を、対象における腫瘍（たとえば、癌）の処置へと外挿することができる。そのため、本発明のもう1つの局面は、対象における腫瘍（たとえば、癌）を処置する方法に関する。方法は、Fzd2をダウンモジュレートする剤（たとえば、抗体またはその抗原結合断片）の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。1つの態様において、剤は、細胞においてFzd2を特異的にダウンモジュレートする。投与は、対象の腫瘍細胞の十分な部分に剤の有効量を送達して、それによって治療結果を生じる方法によって行われる。有効な処置によって、対象における腫瘍細胞の増殖、遊走、および浸潤を含む腫瘍細胞の1つまたは複数の特性の阻害が起こる。1つの態様において、処置は、対象における腫瘍細胞の転移の阻害にとって有用である。

本明細書において記述される方法は、前段階の病期から有意に進行した病期に及ぶ、様々な進行期の腫瘍の処置に応用可能である。腫瘍が高い増殖速度、有意な遊走、および浸潤の特性を示す、進行した病期はしばしば、対象における他の位置または臓器（たとえば、リンパ節、肺、脳）への腫瘍細胞の転移を検出することによって示される。1つの態様において、増殖制御の喪失、遊走、および浸潤の特性の1つまたは複数が腫瘍によって示される。

処置前に本明細書において記述される方法によって標的とされる腫瘍細胞の状態を決定することは有利でありうる。当技術分野における標準的な手段によって検出される再現可能な統計学的に有意な量は、本明細書において記述される腫瘍細胞の1つまたは複数の特性の存在を示すために十分である。各々の特性（たとえば、増殖速度および遊走の程度および浸潤特性）の程度をさらに、当技術分野における標準的な方法によって測定することができる。そのような方法を用いて、処置による腫瘍細胞の阻害（1つまたは複数の特性の低減）を検出するために、処置期間の後またはあいだに腫瘍細胞の状態をこれらの特性に関して決定することができる。

1つの態様において、特性（増殖、遊走、浸潤、および転移）の1つまたは複数は、対象の腫瘍細胞において検出不能である。そのような状況では、本明細書において記述される方法によって、特性の1つまたは複数の発生の遅延または防止が起こりうる。

標的細胞タイプ
本明細書において記述される方法は、多様な腫瘍細胞タイプにおいて用いるために適している。腫瘍は、原発腫瘍でありうるか、または二次腫瘍でありうる。腫瘍は、対象における任意の細胞または臓器を起源としうる。1つの態様において、腫瘍は上皮腫瘍である。1つの態様において、腫瘍は、対象の消化管、前立腺、卵巣、乳腺、頚部、中枢神経系、末梢神経系、肺、腎臓、網膜、血液、皮膚、肝臓、膵臓、または尿生殖器系（たとえば、精巣、膀胱）において発生する。

腫瘍は、癌のステージへと進行しうる。1つの態様において、癌は消化管癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、頭頚部癌、肺癌、リンパ腫、非小細胞肺癌、神経系の癌、腎臓癌、網膜癌、皮膚癌（たとえば、基底細胞癌、扁平上皮癌、および黒色腫）、肝臓癌、膵臓癌、尿生殖器癌、または膀胱癌である。1つの態様において、癌細胞は、癌腫、肉腫、リンパ腫、胚芽細胞腫瘍または芽腫である。1つの態様において、癌は肝細胞癌である。

癌は、可能性がある任意の進行期の癌（たとえば、ステージ0、I、II、III、IV）でありうる。1つの態様において、癌は後期肝細胞癌である。1つの態様において、癌は転移の徴候を示している。

1つの態様において、腫瘍は、適切な対照細胞または組織と比較して、Fzd2および／またはWnt5aの過剰発現を示す。過剰発現は、タンパク質の量またはレベルの増加を意味する。そのような増加は、標的分子または複数の分子（たとえば、Fzd2またはWnt5a）の物理的存在下で、同定される再現可能な定量的または定性的増加として検出される。本明細書において記述される方法に関連すると見なされる増加は、適切な対照におけるタンパク質レベルの少なくとも約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、約100％の増加である。2倍増加を超える有意により高い増加も同様に、本明細書において記述される方法に対して関連するであろう。さらに、標的タンパク質の過剰発現は、標的タンパク質をコードする細胞におけるmRNAの分析によって決定することができる。本明細書において記述される方法に関連すると見なされる増加は、適切な対照におけるmRNAレベルの少なくとも約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、約100％の増加である。2倍増加を超える有意により高い増加も同様に、本明細書において記述される方法に関連するであろう。

増加量は、既定量を生じるために、標的細胞または組織中の標的分子を測定した（たとえば、定量的に）後に、正常または非疾患状態で適切な対照細胞または組織中の標的分子を測定することによって得られる対照量と比較することによって決定される。標的細胞または組織における測定と対照細胞または組織における測定は、所定の実験条件下で可能な限り同一の方法に近づけて行われる。適切な対照細胞は、当業者によって決定することができる。たとえば、同じ細胞タイプの正常な隣接組織がしばしば対照として用いられる。

本明細書において記述される方法に起因するFzd2タンパク質のダウンモジュレーションは、多様な手段によって検出することができる。Fzd2タンパク質発現の減少に起因するダウンモジュレーションは、細胞におけるタンパク質の定量的測定によって検出することができる。1つまたは複数のタンパク質機能（たとえば、リガンド結合）の低減に起因するダウンモジュレーションは、その機能の分析（たとえば、結合したリガンドの量を測定すること）によって検出することができる。1つの態様において、ダウンモジュレーションは、Fzd2受容体のインターナリゼーションの増加に起因する。1つの態様において、インターナリゼーションは、細胞表面上のFzd2受容体の全量を低減させる。1つの態様において、細胞表面上のFzd2受容体は、適切な対照細胞上の量の少なくとも約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、約100％減少する。

Fzdタンパク質
「frizzledタンパク質」または「frizzled受容体」という用語は、哺乳動物タンパク質ファミリーを意味する。Frizzledファミリーは、少なくとも10個の哺乳動物遺伝子を含む。ヒトFrizzled受容体は、Fzdl、Fzd2、Fzd3、Fzd4、Fzd5、Fzd6、Fzd7、Fzd8、Fzd9、およびFzd10を含む。異なるヒトFrizzled受容体の配列が公開されて入手可能である。哺乳動物Frizzledタンパク質は、多数の共通の構造モチーフを共有する。細胞外膜表面に位置するN末端の後に、シグナル配列、システイン残基10個の不変パターンを有するアミノ酸120個のドメイン、および高度に可変の親水性アミノ酸40〜100個の高度に多様な領域が続く。推定の疎水性セグメントは、親水性ループによって連結された7回膜貫通ヘリックスを形成して、膜の細胞内表面に位置するC末端で終わる。システインリッチドメイン（CRD）および膜貫通セグメントは強く保存され、細胞外CRDが可変のリンカー領域によって7回膜貫通らせんの束に繋がれるという作業モデルを示唆する。それゆえ、Frizzledタンパク質受容体は、アミノ末端リガンド結合ドメインを有するGタンパク質共役受容体と類似の動的な膜貫通シグナル伝達モデルに関係している。

ヒトFzd2のアミノ酸配列を図7に記載する。1〜23番目のアミノ酸は、シグナルペプチドである。Fzd2の細胞外ドメインは、24〜247、301〜327、392〜414、および483〜519番目のアミノ酸に含まれる。

Wnt5a
Wnt5a（wingless-related MMTV integration site 5a）は、大きいシステインリッチ増殖因子ファミリーメンバーである。このファミリーのタンパク質は、高度に保存されて、自然に分泌される。Wnt5aタンパク質は、Fzd2を含む、細胞表面上の7回膜貫通ドメイン受容体のFrizzled（Fzd）ファミリーメンバーに結合して、これは、最終的に遺伝子の転写を調節する一連の細胞内事象を誘発する。これらの細胞内事象は、公知の2つのシグナル伝達経路、すなわち正規のWnt/β-カテニン経路（He et al, Science 275:652-654, 1997; Toyofuku et al, J. Cell Biol. 150:225-41, 2000; Kawakami et al, Cell 104:891-900, 2001）、およびWnt/Ca++経路（Slusarski et al, Dev. Biol. 182: 114-120, 1997; Kuhl et al, J. Biol. Chem. 275: 12701-12711, 2000; and Kuhl et al, Mech. Dev. 106:61-76, 2001）に従って分けられる。WNT5aの遺伝子発現のアップレギュレーションが様々なヒト癌において観察されており（Lejeune et al., Clin. Cancer Res. 1 :215-222, 1995; Tozzo et al., Cancer Res. 55:3495-3499, 1995）、WNT5aは、最近、ヒト転移性黒色腫において細胞の浸潤を促進することが報告されている（Weeraratna et al., Cancer Cell 1 :279-88, 2002）。細胞、組織、または特異的癌におけるWnt5aの発現レベルの決定は、米国特許第7,723,055号において詳細に記述されている。

ダウンモジュレーションのための剤
1つの態様において、ダウンモジュレーション剤は、Fzd2に対して特異的である。本明細書においてFzd2のダウンモジュレーションに関連して用いられる特異的という用語は、他のFrizzledタンパク質または受容体（たとえば、Fzd1またはFzd3-Fzd10）などの他の関連タンパク質の有意なダウンモジュレーションが存在しないことを意味する。Fzd2を特異的にダウンモジュレートするが、他のFzd2タンパク質を有意にダウンモジュレートしない剤は、ルーチンの方法によって生成することができる。

本明細書において記述されるダウンモジュレーション剤は、化学物質、低分子、核酸配列、核酸アナログ、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、またはその断片でありうる。そのような多くの剤が当技術分野において公知であり、本発明において用いることができる。そのような他の剤を、本発明において用いるために同定または生成することができる。

そのような剤は、通常存在しない（外因性である）かまたは細胞に提供されるレベルより低いレベルで存在する任意の実体の形をとることができる。Fzd2をダウンモジュレートするために用いるために、化学物質、低分子、核酸配列、核酸アナログ、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、またはその抗原結合断片などの剤を同定または生成することができる。

タンパク質および／またはペプチドまたはその断片の形状の剤を用いて、Fzd2をダウンモジュレートすることができる。有用なタンパク質の例は、変異タンパク質、遺伝子操作タンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組み換え型タンパク質、キメラタンパク質、抗体、ミディボディ、ミニボディ、トリアボディ、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、修飾タンパク質およびその断片である。剤はまた、本明細書において同定された遺伝子産物、およびまだ同定されていない遺伝子産物の核酸および／またはタンパク質を不活化するように機能する、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）、中和抗体、抗体断片、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣体、アプタマー、ホルモン、低分子、炭水化物、またはその変種を含む。阻害剤はまた、化学物質、低分子、化学的実体、核酸配列、核酸アナログ、またはタンパク質もしくはポリペプチドまたはそのアナログもしくは断片でありうる。

剤は、投与される形状で直接機能しうる。または、それによって細胞内でFzd2の核酸および／またはタンパク質阻害剤が産生される、核酸配列の細胞への導入およびその転写などの、Fzd2をダウンモジュレートする剤を産生するために、剤を細胞内で修飾または利用することができる。剤は、合成および天然に存在する非タンパク質様実体を含むがこれらに限定されるわけではない任意の化学的実体または化学的部分から作製することができる。ある態様において、剤は、化学的部分を有する低分子である。たとえば、化学的部分は、非置換または置換アルキル部分、芳香族部分、またはマクロライド、レプトマイシン、および関連する天然物もしくはそのアナログを含むヘテロシクリル部分を含む。剤は、所望の活性および／または特性を有することが公知でありうるか、または多様な化合物のライブラリから選択することができる。

抗体および抗体結合断片
Fzd2の細胞外領域に結合する抗体は、本明細書において記述される方法において用いるために特に適している。1つの態様において、抗体はFzd2に特異的に結合するが、関連するF***には認識可能に結合しない。Fzd2（たとえば、細胞外領域）に特異的に結合するが、他のFzdタンパク質に有意に結合しない抗体は、ルーチンの方法によって生成されるかまたはそうでなければ同定することができる。例として、Fzd2に対して特異的であるエピトープを用いて、本明細書において記述される方法によって、抗体またはその抗原結合断片を生成または同定することができる。そのようなエピトープの位置は、たとえばFzd2タンパク質のアミノ酸配列を、関連するFzdファミリーメンバーのアミノ酸配列と比較して、それによって非類似性領域を同定することによって決定することができる。1つの態様において、抗体は、Fzd2タンパク質の細胞外部分に結合する。Fzd2タンパク質の有用な細胞外部分は、24〜247番目のアミノ酸、125〜163番目のアミノ酸、134〜163番目のアミノ酸、および144〜163番目のアミノ酸に対応するFzd2の領域を含むがこれらに限定されるわけではない。1つの態様において、抗体または抗原結合断片は、アミノ酸配列

を含むFzd2の断片に結合する。1つの態様において、抗体または抗原結合断片は、
アミノ酸配列

内のエピトープに結合する。1つの態様において、抗体または抗原結合断片は、Fzd2タンパク質（たとえば、図7に示されるアミノ酸配列を有する）の状況において存在する場合、アミノ酸配列

内のアミノ酸のサブセットに結合する。1つの態様において、抗体または抗原結合断片は、野生型Fzd2タンパク質の状況において

の19個またはそれ未満の連続アミノ酸に結合する。1つの態様において、抗体または抗原結合断片は、野生型Fzd2タンパク質の状況において、

の18個もしくはそれ未満、17個もしくはそれ未満、16個もしくはそれ未満、15個もしくはそれ未満、14個もしくはそれ未満、13個もしくはそれ未満、12個もしくはそれ未満、11個もしくはそれ未満、10個もしくはそれ未満、9個もしくはそれ未満、8個もしくはそれ未満、7個もしくはそれ未満、6個もしくはそれ未満、5個もしくはそれ未満、4個もしくはそれ未満、3個もしくはそれ未満、または2個もしくはそれ未満の連続アミノ酸に結合する。

非ヒト種のFzd2に対して生成された抗体もまた、ヒトFzd2に対してアミノ酸同一性（たとえば、100％同一性）を有する領域に存在するエピトープに対して生成される場合には、ヒトFzd2を認識すると予想される。

Fzd2の領域またはエピトープに対する抗体の特異的結合の検出を本明細書において例証する。領域またはエピトープがFzd2のより長い領域または完全長のFzd2に対する抗体の結合を競合的に阻害できることを同様に用いて、抗体または抗原結合断片が結合する領域またはエピトープを同定することができる。

1つの態様において、抗体はFzd2に結合して、その結合が腫瘍細胞によるFzd2受容体のインターナリゼーションを促進する。1つの態様において、Fzd2に抗体が結合すると、内因性のリガンドに対するFzd2の結合を防止するか、またはそうでなければ有意に低減させる。そのような1つのリガンドはWnt5aである。

本発明において用いられる抗体は、様々な免疫グロブリンアイソタイプの任意の1つの抗体でありうる。本明細書において記述される抗体の抗原結合断片もまた、本明細書において記述される方法において有用であり、これには、Fab、scFv、Fv、dAb、およびFd断片が含まれるがこれらに限定されるわけではない。ヒトの治療的使用にとって好ましいのは、強力なインビボ活性を有する、高親和性のマウス、キメラ、ヒトおよびヒト化抗体、ならびにその抗原結合断片である。

構造的に、最も単純な抗体（IgG）は、4つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互結合した2つの重鎖（H）および2つの軽鎖（L）を含む。軽鎖は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2つの別個の形状で存在する。各々の鎖は、定常領域（C）および可変領域（V）を有する。各々の鎖は、一連のドメインに構築される。軽鎖は、2つのドメイン、すなわちC領域に対応するドメインとV領域に対応するドメインを有する。重鎖は、4つのドメイン、すなわちV領域に対応する1つのドメインと、C領域における3つのドメイン（1、2、および3）を有する。抗体は2つのアーム（各々のアームはFab領域である）を有し、その各々が互いに会合したVLおよびVH領域を有する。抗体が互いに異なるのは（アミノ酸配列の変化により）V領域のこの対（VLとVH）であり、これらは共に抗原認識および抗原結合部位（ABS）の提供を担当する。さらにより詳しく言えば、各々のV領域は、4つのフレームワーク領域（FR）によって離れた3つの相補性決定領域（CDR）で構成される。CDRは可変領域の最も可変部分であり、それらは重要な抗原結合機能を行う。CDR領域は、組み換え、変異、および選択を伴う複雑なプロセスを介して多くの可能性がある生殖系列配列から誘導される。

抗体全体のある同定可能な断片も同様に、抗原の結合能を保持する。そのような結合断片は、（i）VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなるFab断片；（ii）VHおよびCH1ドメインからなるFd断片；（iii）抗体の1つのアームのVLおよびVHドメインからなるFv断片；（iv）VHドメインからなるdAb断片（Ward, E. S. et al, Nature 341, 544-546 (1989）；（v）単離されたCDR領域；および（vi）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価の断片であるF(ab')2断片である。

Fv断片の2つのドメインは、異なる遺伝子によってコードされるが、組み換え法によってそれらを1つのタンパク質鎖（一本鎖Fv、(scFv)として知られる；Bird, R. E. et al., Science 242, 423-426 (1988) Huston, J. S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85, 5879-5883 (1988)）として生成させる合成リンカーを作製することが可能である。これらのscFv断片は、既に単離されているモノクローナル抗体からの遺伝子から構築された。この応用において、本出願人は、既に単離されている抗体の一部ではないVHおよびVLドメインからscFv断片を構築するプロセスを記述する。

本発明において有用な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、および組み換え型抗体の形でありうる。抗原結合断片は、当業者に公知の方法によって抗体から生成することができる。抗体は、抗原による免疫によってウサギまたはマウスなどの動物において容易に作製される。免疫したマウスは、ハイブリドーマを製造するためのB細胞源を提供するために特に有用であり、これらのハイブリドーマを培養すると大量のモノクローナル抗体が産生される。

抗体は、広範囲の標的抗原およびハプテンに対して高い結合アビディティおよび独自の特異性を提供する。本発明の実践において有用なモノクローナル抗体は、抗体全体およびその断片を含み、ハイブリドーマ合成、組み換えDNA技術、およびタンパク質合成などの通常の技術に従って生成される。

ポリクローナル抗体またはその断片は、任意の種から誘導することができる。

有用なモノクローナル抗体および断片は、任意の種（ヒトを含む）から誘導することができ、または1つより多くの種の配列を使用するキメラタンパク質として形成することができる。ヒトモノクローナル抗体または「ヒト化」マウス抗体もまた、本発明に従って用いられる。たとえば、マウスモノクローナル抗体は、マウスFv領域（すなわち、抗原結合部位を含む）またはその相補性決定領域をコードするヌクレオチド配列を、ヒト定常ドメイン領域およびFc領域をコードするヌクレオチド配列と遺伝子組み換えすることによって、「ヒト化」することができる。ヒト化標的化部分は、宿主レシピエントにおいて抗体またはポリペプチドの免疫反応性を減少させると認識され、欧州特許出願第0,411,893 A2号に開示されている様式と類似の様式で、半減期を増加させて、有害な免疫反応の可能性を低減させる。マウスモノクローナル抗体は、好ましくはヒト型で使用すべきである。抗原結合活性は、抗体の可変部分（Fv）の軽鎖および重鎖上に存在する（各3個）6個の相補性決定領域（CDR）のアミノ酸の配列およびコンフォメーションによって決定される。軽鎖の可変領域（VL）と、重鎖の可変領域（VH）が短いペプチドスペーサー配列によって結合することによって構成される25 kDaの一本鎖Fv（scFv）分子は、今日まで開発された最小の抗体断片である。scFvの遺伝子を含む糸状ファージの表面上にscFv断片を表示する技術が開発されている。広範囲の抗原特異性を有するscFv分子は、scFvファージライブラリの1つの大きいプールに存在することができる。本発明の方法において有用な高親和性モノクローナル抗体およびそのキメラ誘導体のいくつかの例は、欧州特許出願第186,833号、PCT特許出願WO92/16553、および米国特許第6,090,923号に記述されている。

キメラ抗体は、異なる動物種に由来する2つまたはそれより多くのセグメントまたは部分を特徴とする免疫グロブリン分子である。一般的に、キメラ抗体の可変領域は、マウスモノクローナル抗体などの非ヒト哺乳動物抗体に由来して、免疫グロブリン定常領域は、ヒト免疫グロブリン分子に由来する。好ましくは、領域および組み合わせはいずれも、ルーチンで決定される低い免疫原性を有する。

scFv分子の1つの制限は、標的抗原との相互作用が一価であることである。その標的抗原に対するscFvの結合を改善する最も容易な方法の1つは、多量体の作製を通してその機能的親和性を増加させることである。同一のscFv分子が会合してディアボディ、トリアボディ、およびテトラボディを形成すると、同一の多数のFvモジュールを含むことができる。それゆえ、これらの試薬は、多価であるが、単特異的である。各々が異なる親Igに由来するVHおよびVLドメインを含む2つの異なるscFv分子が会合すれば、完全に機能的な二重特異的ディアボディを形成するであろう。二重特異的scFvの独自の応用は、2つの（隣接する）表面エピトープを介して同じ標的分子上の2つの部位に同時に結合することである。これらの試薬は、1つのscFvまたはFab断片と比較して有意なアビディティの利点を得る。たとえばミニ抗体、二量体ミニ抗体、ミニボディ、(scFv)2、ディアボディ、およびトリアボディを含む多数の多価scFv骨格構造が操作されている。これらの分子は広範囲の価数（2個から4個の結合部位）、大きさ（50〜120 kDa）、柔軟性、および産生の容易さに及ぶ。一本鎖Fv抗体断片（scFv）は、VHおよびVLドメインが少なくとも12残基のポリペプチドリンカーによって結合する場合、主に単量体である。単量体scFvは、全ての条件下で長さがアミノ酸12および25個のリンカーによって熱力学的に安定となる。非共有結合ディアボディおよびトリアボディ分子は操作が容易であり、1つのscFv分子の可変重鎖および可変軽鎖を結合するペプチドリンカーの長さを短くすることによって産生される。scFv二量体を、高度の柔軟性を提供する両親媒性のらせんによって結合して、ミニ抗体構造を修飾して、二重らせんによって結合した2つのミニ抗体（4つのscFv分子）を含む二量体二重特異的（DiBi）ミニ抗体を作製することができる。遺伝子融合またはジスルフィド結合したscFv二量体は、中等度の柔軟性を提供して、C末端Gly4Cys配列を付加する容易なクローニング技術によって生成される。scFv-CH3ミニボディは、直接（LDミニボディ）または非常に柔軟なヒンジ領域を介して（Flexミニボディ）IgG CH3ドメインに結合した2つのscFv分子を含む。およそ80 kDaの分子量を有するこれらの二価の構築物は、抗原に有意に結合することができる。Flexミニボディは、マウスの腫瘍に強い局在を示す。二重および三重特異的多量体は、異なるscFv分子の会合によって形成することができる。機能的親和性の増加は、Fabまたは一本鎖Fv抗体断片（scFv）が二量体、三量体、またはより大きい集合体を形成する場合に得ることができる。一価のscFvおよびFab断片と比較して多価scFvの最も重要な利点は、標的抗原に対する機能的結合親和性（アビディティ）の増加である。高いアビディティは、scFv多量体が標的抗原を分離するために同時に結合することができることを必要とする。scFv単量体と比較してscFvディアボディの機能的親和性の増加は有意であり、低減されたオフ速度（off-rate）に主に認められるが、これは2つまたはそれより多くの標的抗原に多数が結合することおよび1つのFvが解離しても再結合することに起因する。そのようなscFv分子が多量体に会合する場合、それらを、1つの標的抗原に対する高いアビディティまたは異なる標的抗原に対する多数の特異性のいずれかを有するように設計することができる。抗原に対する多数の結合は、Fvモジュールにおける正確な整列および方向に依存する。多価scFv標的において完全なアビディティを得るためには、抗原結合部位は、同じ方向を向いていなければならない。多数の結合が立体的に可能でない場合、機能的親和性の明白な増加は、拡散速度および抗原濃度に依存する再結合の増加の効果による可能性がある。その特性を改善する部分に結合した抗体もまた、本発明に関して企図される。たとえば、インビボでのその半減期を増加させるPEGと結合した抗体を本発明のために用いることができる。免疫ライブラリは、ナイーブのまたは免疫した動物または患者のBリンパ球からの多様な抗体断片をコードする遺伝子をPCR増幅に供することによって調製される。免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子ファミリーに対して特異的であるオリゴヌクレオチドの組み合わせが用いられる。免疫グロブリン生殖系列遺伝子を用いて、半合成抗体レパートリーを調製することができ、様々な断片の相補性決定領域が縮重プライマーを用いてPCRによって増幅される。これらのシングルポットライブラリは、多数の抗原に対する抗体断片を、1つのライブラリから単離することができる利点を有する。ファージディスプレイ技術を用いて、抗体断片の親和性を増加させることができ、新しいライブラリは、ランダムなコドンに基づくもしくは部位特異的変異誘発によって、個々のドメインの鎖をナイーブレパートリーからの断片の鎖とシャッフルすることによって、または細菌変異体株によって、既存の抗体断片から調製される。

1つの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、たとえばGenpharmによって開発されたモデルであるSCID-huマウスによって産生される。1つの態様において、多価相互作用の効果を利用することによって作製された、ペンタボディと呼ばれるあるタイプの高アビディティ結合分子が企図される。

Fzd2に対するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座の少なくとも1つのセグメントをコードするトランスジーンを有する非ヒトトランスジェニック哺乳動物から産生することができる。通常、そのようなトランスジェニック哺乳動物の内因性の免疫グロブリン座は、機能的に不活化される。好ましくは、ヒト免疫グロブリン座のセグメントは、重鎖および軽鎖成分の再配列されていない配列を含む。内因性の免疫グロブリン遺伝子の不活化および外因性の免疫グロブリン遺伝子の導入はいずれも、標的化相同組み換えによって、またはYAC染色体の導入によって行うことができる。このプロセスによって生じるトランスジェニック哺乳動物は、免疫グロブリン成分の配列を機能的に再配列することができ、内因性の免疫グロブリン遺伝子を発現させることなく、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされる様々なアイソタイプの抗体レパートリーを機能的に発現させることができる。これらの特性を有する哺乳動物の産生および特性は、たとえば、Lonberg et al, W093/12227 (1993)；米国特許第5,877,397号、米国特許第5,874,299号、米国特許第5,814,318号、米国特許第5,789,650号、米国特許第5,770,429号、米国特許第5,661,016号、米国特許第5,633,425号、米国特許第5,625,126号、米国特許第5,569,825号、米国特許第5,545,806号、Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)（その各々が全ての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み入れられる）によって詳細に記述されている。トランスジェニックマウスは特に適している。抗Fzd2抗体は、LonbergまたはKucherlapati、前記によって記述される方法などのトランスジェニック非ヒト哺乳動物を、Fzd2またはその断片によって免疫することによって得られる。モノクローナル抗体は、たとえば通常のKohler-Milsteinの技術を用いて、そのような哺乳動物からのB細胞を、適した骨髄腫細胞株に融合させることによって調製される。ヒトポリクローナル抗体もまた、免疫原物質によって免疫したヒトの血清の形で提供することができる。任意で、そのようなポリクローナル抗体は、アフィニティ試薬としてFzd2または他のFzd2ペプチドを用いるアフィニティ精製によって濃縮することができる。

ヒトFzd2抗体を得るためのさらなるアプローチは、Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989)によって概観される一般的プロトコールに従ってヒトB細胞のDNAライブラリをスクリーニングすることである。トリオーマ技術に関して記述されているように、そのようなB細胞は、Fzd2、断片、Fzd2もしくは断片を含むより長いポリペプチド、または抗イディオタイプ抗体によって免疫したヒトから得ることができる。任意で、そのようなB細胞は、最終的に抗体処置を受ける患者から得られる。Fzd2またはその断片に対する抗体結合を選択する。次に、そのような抗体（または結合断片）をコードする配列をクローニングして増幅する。Huseによって記述されるプロトコールは、ファージディスプレイ技術と組み合わせるとより効率的となる。たとえば、Dower et al, WO 91/17271およびMcCafferty et al, WO 92/01047、米国特許第5,877,218号、米国特許第5,871,907号、米国特許第5,858,657号、米国特許第5,837,242号、米国特許第5,733,743号、および米国特許第5,565,332号（その各々が全ての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。これらの方法において、メンバーがその外部表面上に異なる抗体を表示するファージのライブラリが産生される。抗体は通常、FvまたはFab断片として表示される。所望の特異性を有する抗体を表示するファージを、Fzd2ペプチドまたはその断片に対するアフィニティ濃縮によって選択する。

ファージディスプレイ法の変化形において、選択したマウス抗体の結合特異性を有するヒト抗体を産生することができる。2001年1月9日に公布された米国特許第6,172,197号を参照されたい。この方法において、選択されたマウス抗体の重鎖または軽鎖可変領域のいずれかが、開始材料として用いられる。たとえば、軽鎖可変領域を開始材料として選択する場合、メンバーが同じ軽鎖可変領域（すなわち、マウス開始材料）および異なる重鎖可変領域を表示するファージライブラリが構築される。重鎖可変領域は、再配列したヒト重鎖可変領域のライブラリから得られる。Fzd2に対して強い特異的結合を示すファージ（たとえば、少なくとも108および好ましくは少なくとも109 M-1）が選択される。このファージからのヒト重鎖可変領域は、さらなるファージライブラリを構築するための開始材料として役立つ。このライブラリにおいて、各ファージは、同じ重鎖可変領域（すなわち、第一のディスプレイライブラリから同定された領域）および異なる軽鎖可変領域を表示する。軽鎖可変領域は、再配列されたヒト軽鎖可変領域のライブラリから得られる。この場合も、Fzd2に対して強い特異的結合を示すファージが選択される。これらのファージは、完全にヒトの抗Fzd2抗体の可変領域を示す。これらの抗体は通常、マウス開始材料と同じまたは類似のエピトープ特異性を有する。

1つの態様において、剤は、遺伝子発現を阻害する（すなわち、関心対象遺伝子（たとえば、Fzd2遺伝子）の発現を抑制および／または抑圧する）。そのような剤は、当技術分野において「遺伝子サイレンサー」と呼ばれ、当業者に一般的に公知である。例には、核酸配列（たとえば、RNA、DNA、または核酸アナログ）が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。これらは一本鎖または二本鎖でありうる。それらは、関心対象タンパク質をコードすることができ、オリゴヌクレオチド、核酸アナログでありうる。一般的および／または特異的阻害剤は「核酸配列」という用語に含まれる。いくつかの公知の核酸アナログは、ペプチド核酸（PNA）、偽相補PNA（pc-PNA）、ロックド核酸（LNA）、およびその誘導体である。核酸配列剤はまた、転写リプレッサー、アンチセンス分子、リボザイム、低分子阻害性核酸配列（たとえば、RNAi、shRNAi、siRNA、マイクロRNAi（miRNA））およびアンチセンスオリゴヌクレオチドとして作用するタンパク質をコードする核酸配列でありうる。Fzd2を阻害するそのような多くの分子が当技術分野において公知である。そのため、これらの阻害剤は、本発明において剤として機能することができる。

本発明において用いるための1つのタイプのダウンモジュレート剤は、RNAi分子（たとえば、siRNAまたはmiRNA）である。本発明の剤に関して「RNAi」および「RNA干渉」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。本明細書において用いられる「RNAi」という用語は、干渉RNAまたはRNA干渉を意味し、これはmRNAに結合してそのプロセシングを阻害する、たとえばmRNA翻訳を阻害するかまたはmRNA分解が起こる分子による特異的mRNAの破壊による選択的転写後遺伝子沈黙化の手段である。本明細書において用いられる「RNAi」という用語は、siRNAi、shRNAi、内因性のマイクロRNA、および人工マイクロRNAを含むがこれらに限定されるわけではない任意のタイプの干渉RNAを意味する。例として、これはRNAの下流のプロセシングの機構によらず、siRNAとして既に同定された配列を含む（すなわち、siRNAは、それによってmRNAの切断が起こる特異的インビボプロセシング法を有すると考えられているが、そのような配列を、本明細書において記述される隣接配列の状況でベクターに組み入れることができる）。

RNAi分子は典型的に、標的遺伝子に対して特異的な核酸または核酸アナログの配列からなる。核酸配列はRNAまたはDNAでありえて、一本鎖または二本鎖でありえて、関心対象タンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、核酸アナログ、たとえばペプチド-核酸（PNA）、偽相補性PNA（pc-PNA）、ロックド核酸（LNA）を含む群から選択することができる。

本明細書において用いられる、「siRNA」は、siRNAが標的遺伝子、たとえばHDF遺伝子と同じ細胞に存在するかまたは発現される場合に、二本鎖RNAが遺伝子または標的遺伝子の発現を低減させるかまたは阻害することができる、二本鎖RNAを形成する核酸を意味する。二本鎖RNA siRNAは、相補鎖によって形成することができる。1つの態様において、siRNAは、二本鎖siRNAを形成することができる核酸を意味する。siRNAの配列は、完全長の標的遺伝子またはその小配列に対応することができる。典型的に、siRNAは少なくとも長さが約15〜50ヌクレオチドである（たとえば、二本鎖siRNAの各々の相補的配列は長さが約15〜50ヌクレオチドであり、二本鎖siRNAは長さが約15〜50塩基対であり、好ましくは約19〜30塩基ヌクレオチド、好ましくは長さが約20〜25ヌクレオチド、たとえば長さが20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチドである）。siRNAは、化学合成することができ、インビトロ転写によって産生することができ、またはそのような産生のために特異的に利用される細胞内で産生することができる。

1つの態様において、siRNAは、Fzd2の発現を阻害するように設計される。そのようなsiRNAの例および発現を阻害するために用いられる方法は当技術分野において公知である（公開された特許出願WO 2010/039679; Truong et al, Genes & Dev. 20: 3185-3197 (2006); Barbieri et al, Cancer Res 65:2314-2320 (2005); Yuan et al, BMC Cancer 11 :57 (2011); Yang et al. Cancer Res 71 :3688-3700 (2011)）。Fzd2を阻害するために有用なsiRNA配列の例を本明細書において提供する。

1つの態様において、剤の使用によって、細胞における標的Fzd2 mRNAレベルが、RNAiの非存在下で細胞において典型的に測定されるmRNAレベルの少なくとも約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、約100％減少が起こる。1つの態様において、mRNAレベルは、少なくとも約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、または約100％減少する。

標的細胞において発現される核酸である剤は、ベクターを含みうる。標的哺乳動物細胞に外因性の遺伝子を移入するために有用なそのような多くのベクターが利用可能である。ベクターは、エピソーム、たとえばプラスミド、サイトメガロウイルス、アデノウイルス等などのウイルス由来ベクターであってもよく、または相同組み換えもしくはランダム組み込みを通して、たとえばMMLV、HIV-1、ALV等などのレトロウイルス由来ベクターを通して標的細胞ゲノムに組み入れてもよい。幹細胞を改変する場合、レンチウイルスベクターが好ましい。HIVまたはFIV gag配列に基づくベクターなどのレンチウイルスベクターを用いて、ヒト幹細胞の休止期などの非***細胞にトランスフェクトさせることができる（Uchida et al. (1998) P.N.A.S. 95(20): 11939-44を参照されたい）。本明細書において用いられる「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。好ましいベクターは、それらが連結される核酸の自律複製および／または発現を行うことができるベクターである。それらが機能的に連結される遺伝子の発現を指示することができるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。

剤の細胞への送達
剤を、細胞に対してその意図される効果を発揮することができるように、細胞に接触させる。1つの態様において、剤は、細胞の外部と単に相互作用させることによって（たとえば、抗体または抗原結合断片などによって受容体に結合することによって）細胞に対してその効果を発揮する。細胞の内部に作用する剤（たとえば、RNAi）は、細胞に接触させた場合に細胞によって容易に取り込まれる形（たとえば、細胞の取り込みおよび適切な細胞下位置への送達を容易にする製剤で）で送達されうる。1つの態様において、剤は、それがその効果を発揮することができるように、細胞によって容易に取り込まれる製剤に存在する。

コロイド分散系は、送達媒体として用いられ、特定の臓器、組織、または細胞タイプに対する剤のインビボ安定性を増強するために用いられうる。コロイド分散系は、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、リポソーム、および特徴付けされていない構造の脂質:オリゴヌクレオチド複合体を含む脂質を主成分とする系を含むがこれらに限定されるわけではない。好ましいコロイド分散系は、複数のリポソームである。リポソームは、二重層の形状で整列した脂質で構成される1つまたは複数の外層によって取り囲まれた水性のコアを有する顕微鏡サイズの球体である（一般的に、Chonn et al., Current Op. Biotech. 1995, 6, 698-708を参照されたい）。細胞取り込みまたは膜破壊部分の他の例には、ポリアミン、たとえばスペルミジンまたはスペルミン基またはポリリジン；脂質および脂肪親和性基；ポリミキシンまたはポリミキシン由来ペプチド；オクタペプチン；膜孔形成ペプチド；イオノフォア；プロタミン；アミノグリコシド；ポリエン；およびその他が挙げられる。他のおそらく有用な機能的な群は、インターカレート剤；ラジカル生成剤；アルキル化剤；検出可能な標識；キレート剤；またはその他を含む。

リポソームまたは微結晶などの他のコロイド分散系の脂質粒子または小胞は、投与にとって適している可能性がある。粒子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがその中に含まれる限り、単層または多層などの任意の適した構造の粒子でありうる。N-[I-(2,3ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチル-アンモニウムメチルスルフェートまたは「DOTAP」などの陽性荷電脂質は、そのような粒子および小胞にとって特に好ましい。そのような脂質粒子の調製は、周知である。たとえば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,880,635号；第4,906,477号；第4,911,928号；第4,917,951号；第4,920,016号；および第4,921,757号を参照されたい。他の非毒性の脂質を主成分とする小胞成分も同様に、細胞による核酸化合物の取り込みを促進するために利用してもよい。

いくつかの態様において、本明細書において開示されるRNAi剤のヌクレアーゼ抵抗性を増加させるために、非ホスホジエステル骨格結合、たとえばメチルホスホネート、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート結合またはその混合物をRNAi剤の1つまたは複数の非RNアーゼH活性化領域に組み入れることができる。そのような非活性化領域は、さらに2'-置換基を含んでもよく、同様に結合親和性および二重らせんの安定性を増加させるために鏡像的に選択された骨格結合を含むことができる。他の官能基も同様に、細胞膜を通してのオリゴヌクレオチド配列の取り込みを増強するため、安定性を増強するため、または標的核酸とのハイブリッド形成を増強するため、または標的との架橋形成を促進するため（ソラレン光架橋置換基の場合のように）などの望ましい多様な特性を得るためにオリゴヌクレオチド配列に結合させてもよい。たとえば、参照により本明細書に組み入れられる、PCT公開番号WO92/02532を参照されたい。

RNAi干渉（RNAi）剤、たとえばsiRNAまたはRNA干渉剤を含むベクターを標的細胞（たとえば、水平基底細胞）に送達する方法は、たとえば（i）RNA干渉剤、たとえばsiRNAを含む組成物の注射、または（ii）RNA干渉剤、たとえばsiRNAを含む組成物を細胞に直接接触させる段階を含むことができる。もう1つの態様において、RNA干渉剤、たとえばsiRNAは、たとえば流体力学的注射またはカテーテル法により、静脈、動脈、細静脈または細動脈などの任意の血管に直接注射することができる。いくつかの態様において、siRNAなどのRNAi剤は、特異的臓器に局所的に、または全身投与によって送達することができる。

薬学的組成物
1つの態様において、本明細書において記述される剤は、薬学的に許容可能な担体を含む組成物中の活性成分である（本明細書において薬学的組成物と呼ばれる）。そのような組成物は、本明細書において薬学的組成物と呼ばれる。「薬学的に許容可能な担体」は、標的化送達組成物を混合および／または対象に送達するための薬学的に許容可能な任意の手段を意味する。本明細書において用いられる「薬学的に許容可能な担体」という用語は、1つの臓器または体の部分からの対象剤の、もう1つの臓器または体の部分への運搬または輸送に関係する、液体または固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料などの薬学的に許容可能な材料、組成物、または媒体を意味する。各担体は、組成物の他の成分と適合性であるという意味において「許容可能」でなければならず、対象、たとえばヒトへの投与に適合する。そのような組成物は、本明細書において記述される投与経路などの多数の経路の1つまたは複数によって投与するために具体的に調合することができる。補助活性成分も同様に、組成物に組み入れることができる。本明細書において記述される剤、製剤、または薬学的組成物を対象に投与する場合、好ましくは治療的有効量が投与される。本明細書において用いられる「治療的有効量」という用語は、状態の改善または治癒が起こる量を意味する。

投与
薬学的組成物の投与は、その中に含まれる剤が標的細胞または組織（たとえば、腫瘍または癌）に接触する手段によって行われる。そのような経路の例は、局所または全身であり、これには非経口、腸管内、および表面投与が含まれるがこれらに限定されるわけではない。非経口投与は通常、注射によって行われ、これには、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、脳脊髄内、腫瘍内および胸骨内注射および注入が含まれるがこれらに限定されるわけではない。投与は、当業者によって必要であると決定される全身投与または局所でありうる。局所投与は、標的組織の位置に向けて行うことができる。本明細書において記述される明記された投与様式のための薬学的組成物および製剤もまた、本発明によって包含される。本発明の化合物は、注射によって、または経時的に徐々に注入することによって非経口投与することができ、蠕動ポンプ手段によって送達することができる。

本明細書において記述される剤は、対象の腫瘍組織または細胞に剤を送達する経路および製剤によって対象に投与される。腫瘍細胞への送達は、意図される効果を発揮するために剤によって必要とされる様式での、剤による癌細胞の最終的な接触を意味する。例として、抗体またはその抗原結合断片は、癌細胞の外部（細胞外位置）に位置するFzd2受容体との接触を促進する経路および製剤で投与される。対象に送達される量は、癌細胞に送達される剤の有効量を促進するために十分である。投与経路は、癌細胞の位置、癌細胞での所望の最終濃度を含む多様な要因に依存するであろう。好ましい投与経路および投与レベルならびに適切な製剤は、各個々の対象に関して当業者によって決定されるであろう。

投与は、経粘膜または経皮手段によって行ってもよい。経粘膜または経皮投与の場合、浸透される障壁に対して適切な浸透剤を製剤において用いる。そのような浸透剤は一般的に当技術分野において公知であり、たとえば経粘膜投与に関して胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。さらに、透過性を促進するために洗浄剤を用いてもよい。経粘膜投与は、たとえば点鼻スプレーを通してまたは坐剤を用いることによって行われうる。経口投与の場合、本発明の化合物は、カプセル剤、錠剤、およびトニックなどの通常の経口投与剤形に調合される。

表面投与の場合、薬学的組成物は、当技術分野において一般的に公知である軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに処方される。

本発明の治療組成物は、たとえば単位用量の注射によって、慣例的に静脈内投与される。本発明の治療組成物に関連して用いる場合の「単位用量」という用語は、各々の単位が、必要な希釈剤、すなわち担体または媒体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された活性材料の既定量を含む、対象の単位用量として適した物理的に個別の単位を意味する。

組成物は、投与製剤と適合性である様式で、および治療的に有効量で投与される。投与される量およびタイミングは、処置される対象、対象の系が活性成分を利用する能力、および所望の治療効果の程度に依存する。投与されるために必要な活性成分の正確な量は、医師の判断に依存して、各個体に対して特有である。

典型的に、剤は、薬学的組成物として対象に投与される。薬学的組成物は、本明細書において記述される活性剤、および薬学的に許容可能な担体を含む。組成物はさらに、さらなる活性剤などの1つまたは複数のさらなる成分を含みうる。

薬学的組成物の製剤は、投与される生理学的および細胞環境において活性成分を保護するための成分をさらに含むことができる。たとえば、製剤は、消化酵素による分解から、または対象の免疫系による攻撃から剤を保護するための成分を含みうる。

本明細書において用いられる「薬学的に許容可能な」という用語は、妥当な利益/リスク比に釣り合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を引き起こすことなく、健全な医学的判断の範囲内においてヒトおよび動物の組織に接触して用いるために適した化合物、材料、組成物、および／または投与剤形を意味する。

本明細書において用いられる「薬学的に許容可能な担体」という用語は、体の1つの臓器または部分から体のもう1つの臓器または部分への対象化合物の運搬または輸送に関係する、液体または固体増量剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤（たとえば、潤滑剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、またはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸）、または溶媒封入材料などの薬学的に許容可能な材料、組成物、または媒体を意味する。各々の担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者に対して有害でないという意味において「許容可能」でなければならない。薬学的に許容可能な担体として役立つことができる材料のいくつかの例には：（1）ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；（2）コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（3）セルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、結晶セルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；（4）粉末トラガカント；（5）麦芽：（6）ゼラチン；（7）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクなどの潤滑剤；（8）カカオバターおよび坐剤用ロウなどの賦形剤；（9）落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油などの油；（10）プロピレングリコールなどのグリコール；（11）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（PEG）などのポリオール；（12）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（13）寒天；（14）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（15）アルギン酸；（16）発熱性物質除去水；（17）等張食塩水；（18）リンゲル液；（19）エチルアルコール；（20）pH緩衝液；（21）ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリアンヒドリド；（22）ポリペプチドおよびアミノ酸などの増量剤；（23）血清アルブミン、HDL、およびLDLなどの血清成分；（22）エタノールなどのC2-C12アルコール；ならびに（23）薬学的製剤において使用される他の非毒性の適合性物質、が挙げられる。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味料、着香料、保存剤、および抗酸化剤も同様に製剤に存在することができる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容可能な担体」、またはその他という用語は、本明細書において互換的に用いられる。

本発明のFzd2のダウンモジュレート剤（たとえば、抗Fzd2ペプチドおよび／またはAb）は、個々の治療剤として、または他の治療剤と併用して投与することができる。それらは単独で投与することができるが、一般的に、選択された投与経路および標準的な薬学的実践に基づいて選択された薬学的担体と共に投与される。

投与される用量は、当然、特定の剤の薬力学的特徴、その投与様式および経路、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、症状の性質および程度、併用処置の種類、処置の回数、ならびに所望の効果などの公知の要因に応じて変化するであろう。たいていの場合、活性成分の一日量は、約0.01から100 mg/kg体重でありうる。通常、1.0から5 mgおよび好ましくは1から10 mg/kg体重/日を1日に1回から6回の分割用量でまたは徐放性製剤で投与することは、所望の結果を得るために有効である。

内部投与にとって適した投与剤形（組成物）は一般的に、単位あたり約0.1 mgから約500 mgの活性成分を含む。これらの薬学的組成物において、活性成分は通常、組成物の全量に基づいて約0.5から95重量％の量で存在するであろう。

非制限的な例として、ヒトまたは動物における本明細書において記述される方法による癌の処置を、本発明の抗Fzd2ペプチド、モノクローナルキメラおよび／またはマウス抗体を含む薬学的組成物の一日量として、0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90、または100 mg/kg/日などの0.1から100 mg/kgの用量で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40日目の少なくとも1回、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20週目の少なくとも1回、1回用量でまたは24、12、8、6、4、または2時間毎の分割用量、またはその任意の組み合わせを用いて提供することができる。

非経口投与に関して、抗Fzd2抗体または抗原結合断片は、液剤、懸濁剤、乳剤、または薬学的に許容可能な非経口媒体に関連した凍結乾燥粉末として製剤化することができる。そのような媒体の例は、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース液、および5％ヒト血清アルブミンである。リポソームおよび固定油などの非水性媒体も同様に用いることができる。媒体または凍結乾燥粉末は、等張性（たとえば、塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性（たとえば、緩衝剤および保存剤）を維持する添加剤を含むことができる。製剤は、一般的に用いられる技術によって滅菌される。

定義
ダウンモジュレーションは、タンパク質（Fzd2）の1つまたは複数の機能（たとえば、リガンド結合、シグナル伝達等）を低減させることを意味する。これは、細胞における機能的Fzd2そのものの産生を直接阻害することによって（たとえば、遺伝子発現またはタンパク質合成を低減させることによって）および／またはFzd2機能／活性を低減させることによって行うことができる。Fzd2機能／活性は、たとえばFzd2タンパク質そのものを直接阻害することによって（たとえば、リガンド結合を阻害することによって）、またはそうでなければそのタンパク質を分解の標的とすることによって、低減させることができる。そのため、本発明において有用な剤は、Fzd2遺伝子発現もしくはタンパク質合成を阻害する、または1つもしくは複数のFzd2機能もしくは活性を阻害する剤である。ダウンモジュレーションは、細胞表面上の受容体の量の低減によって（たとえば、受容体のインターナリゼーションの促進によって）行われうる。本発明の1つの局面において、細胞表面上に発現されるFzd2レベルは、細胞においてFzd2をダウンモジュレートする剤を細胞に接触させることによって低減される。1つの態様において、剤は、細胞のFzd2に特異的に結合して、細胞によるFzd2のインターナリゼーションを促進する。そのような剤は、本明細書において記述される。有意な量のダウンモジュレーションは、本明細書において記述される方法において有用な結果を生じると予想される。1つの態様において、ダウンモジュレーションによって、処置を行わない場合に典型的に観察されるまたは予想されるレベルと比較して、本明細書において記述される方法によって細胞におけるFzd2タンパク質またはmRNAレベルの少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも99％低減が起こる。

本明細書において用いられる「処置する」および「処置」および／または「緩和する」という用語は、対象が状態の改善を有するように、たとえば検出可能な有益なまたは所望の臨床結果を有するように、Fzd2を阻害する（たとえば受容体のインターナリゼーションを促進するおよび／またはリガンド結合を阻害する）ために、剤の有効量を対象に投与することを意味する。本発明の目的に関して、有益なまたは所望の臨床結果は、1つまたは複数の症状の部分的または完全な軽減を含む症状の重症度の減少；1つまたは複数の指標、症状、またはマーカーの発生の防止または遅延；状態によって被った不快感の程度の縮小（すなわち悪化しない）；状態の進行の遅延、状態の改善または緩和、および同様に状態の完全な回復を含むがこれらに限定されるわけではない。本明細書において記述される腫瘍または癌の1つまたは複数の指標、症状、または、マーカーの発生の減少は、処置を行わない場合に典型的に観察されるまたは予想される場合の少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも99％減少でありうる。1つの態様において、1つまたは複数の症状、指標、またはマーカーの発生は完全に予防される。1つの態様において、投与前に経験した腫瘍または癌の1つまたは複数の症状は、処置を行わない場合に経験する症状の少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも99％軽減される。

「治療的有効量」という用語は、その状態を有する典型的な対象に投与する場合、処置される疾患、障害、または損傷に関連する症状の治療的に有意な低減を行うために十分である量を意味する。症状の治療的に有意な低減は、対照または無処置対象と比較してたとえば約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約100％、約125％、約150％またはそれより多くの低減である。

本明細書において開示される組成物は、予防的または治療的有効量で投与することができる。予防的有効量は、少なくとも部分的に、処置される特定の疾患または障害の発生を遅らせる、進行を阻害する、または発生もしくは進行を完全に停止させるために必要な量を意味する。

治療または予防に関するそのような量は、当然、処置される特定の状態、状態の重症度、ならびに年齢、身体の状態、体格、体重、および併用処置を含む個々の患者のパラメータに依存するであろう。これらの要因は、当業者に周知であり、単なるルーチンの実験によって対処することができる。最大用量、すなわち健全な医学的判断に従う安全な最大用量を用いることが一般的に好ましい。しかし、医学的理由、心理学的理由、または実質的に他の任意の理由により、より低い用量または認容量を投与することができることは、当業者によって理解されるであろう。

本明細書において用いられるように、抗体の抗原結合断片は、Fab、scFv、Fv、dAb、およびFd断片を含むがこれらに限定されるわけではない。例としての抗原結合断片は、（i）VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなるFab断片；（ii）VHおよびCH1ドメインからなるFd断片；（iii）抗体の1つのアームのVLおよびVHドメインからなるFv断片；（iv）VHドメインからなるdAb断片（Ward, E. S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)；（v）単離されたCDR領域；および（vi）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した2つのFab断片を含む二価の断片であるF(ab')2断片である。Fv断片の2つのドメインは、異なる遺伝子によってコードされるが、組み換え法によってそれらを1つのタンパク質鎖（一本鎖Fv（scFv）として知られる；Bird, R. E. et al, Science 242, 423- 426 (1988) Huston, J. S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85, 5879-5883 (1988)）として作製することができる合成リンカーを作製することが可能であることが証明されている。

「対象」という用語は、本発明の化合物または組成物の投与によって利益を得ることができる、疾患、障害、または損傷に罹患し得るヒトおよび非ヒト動物などの生物を意味する。対象、個体、および患者という用語は、本明細書において互換的に用いられる。本発明の「非ヒト動物」という用語は、哺乳動物（たとえば、齧歯類（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）、霊長類、イヌ、ウマ、ウシ、ネコ、ブタ）および非哺乳動物を含むがこれらに限定されるわけではない全ての脊椎動物を含む。非ヒト霊長類もまた、可能性がある対象である。特異的対象は、ヒト、ヒツジ、イヌ、ウシ、ウマ、ニワトリ、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、両生類、は虫類等を含むがこれらに限定されるわけではない。本明細書において記述される細胞は、本明細書において記述される任意のそのような対象の状況において存在しうるまたはそうでなければそのような対象から単離することができる。

「減少する」、「低減された」、「低減」、「減少」、または「阻害する」という用語は全て、適切な参照レベルと比較した場合に、本明細書において用いられる一般的に統計学的に有意な量の減少を意味する。1つの態様において、低減は、参照レベルと比較して少なくとも10％、または少なくとも約20％、または少なくとも約30％、または少なくとも約40％、または少なくとも約50％、または少なくとも約60％、または少なくとも約70％、または少なくとも約80％、または少なくとも約90％、または100％までおよび100％を含む低減（たとえば、参照レベルと比較して存在しないレベルまたは検出不能なレベル）である。

「腫瘍細胞」という用語は、前癌様および同様に癌様細胞を意味するために用いられる。

本明細書において用いられる「投与する」という用語は、所望の効果を生じるように、所望の部位（たとえば、腫瘍組織または腫瘍細胞）に組成物の有効量の少なくとも部分的局在が起こる方法または経路による、対象における薬学的に許容可能な組成物の留置を意味する。本明細書において記述される化合物または組成物は、経口、または静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、鼻、直腸、および表面（口腔内および舌下）投与を含む非経口経路を含むがこれらに限定されない当技術分野において公知の任意の適切な経路によって投与することができる。

例示的な投与様式には、注射、注入、点滴注入、吸入、または摂取が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。「注射」には、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管支、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内注射および注入が含まれるがこれらに限定されるわけではない。好ましい態様において、組成物は静脈内注入または注射によって投与される。

本明細書においてそれ以外であると定義されている場合を除き、本出願に関連して用いられる科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有するであろう。さらに、本文によってそれ以外に必要とされている場合を除き、単数形は複数形を含み、複数形は単数形を含むであろう。

本発明は、特定の方法論、プロトコール、および試薬等は変化しうることから、それらに限定されないと理解すべきである。本明細書において用いられる用語は、特定の態様を記述する目的に限られ、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を制限すると意図されない。

作業実施例以外において、または特記されている場合を除き、本明細書において用いられる成分または反応条件の量を表記する数値は全て、全ての場合において「約」という用語によって修飾されると理解すべきである。百分率に関連して本発明を記述するために用いられる「約」という用語は、±1％を意味する。

1つの局面において、本発明は、本発明にとって必須であるが、なおも必須であるか否かによらず明記されていない要素を含める（「含む」）ことを受け入れる、本明細書において記述される組成物、方法、および各々のその成分に関する。いくつかの態様において、組成物、方法、またはその各々の成分の記述に含められる他の要素は、本発明の基本的特徴および新規特徴に物質的な影響を及ぼさない要素に限定される（「本質的にからなる」）。このことは、その中の組成物および成分と共に、記述の方法における段階に等しく当てはまる。他の態様において、本明細書において記述される本発明、組成物、方法、およびその各々の成分は、成分、組成物、または方法に対して必須の要素ではないと思われるいかなる要素も除外すると意図される（「からなる」）。

同定された全ての特許、特許出願、および刊行物は、たとえば本発明に関連して用いられうるそのような刊行物において記述される方法論を記述および開示する目的のために明白に参照により本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、単にその開示が本出願の提出日より前になされたために提供される。この点においていかなるものも、本発明者らが先行発明に基づいて、またはいかなる理由にせよ、そのような開示に先行する権利がないと自認したと解釈すべきではない。これらの文書の日付または内容に関する表現に関する全ての声明は、出願人にとって入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確性に関していかなる承認も与えない。

本発明は、以下の番号をつけた段落のいずれか1つにおいて定義されうる。
1．Fzd2をダウンモジュレートする抗体またはその抗原結合断片の治療的有効量を対象に投与する段階を含み、その結果、該抗体またはその抗原結合断片が、該対象の癌細胞に送達されて、それによって癌を処置する、対象における癌を処置する方法。
2．Fzd2をダウンモジュレートする抗体またはその抗原結合断片の治療的有効量を対象に投与する段階を含み、その結果、該抗体またはその抗原結合断片が癌細胞に送達されて、それによって癌を処置する、対象における癌細胞の増殖、遊走、および／または浸潤を阻害する方法。
3．抗体が、Fzd2に特異的に結合する、段落1または2のいずれかに記載の方法。
4．抗体がFzd2に結合し、かつ癌細胞によるFzd2受容体のインターナリゼーションを促進する、段落3に記載の方法。
5．Fzd2に対する抗体がFzd2に対するリガンドの結合を防止する、段落3〜4のいずれかに記載の方法。
6．抗体がFzd2タンパク質の細胞外部分に特異的に結合する、段落3〜5のいずれか1つに記載の方法。
7．抗体が、Fzd2の24〜247番目のアミノ酸に対応するFzd2の領域内でFzd2に特異的に結合する、段落3〜6のいずれか1つに記載の方法。
8．抗体が、Fzd2の125〜163番目のアミノ酸に対応するFzd2の領域内でFzd2に特異的に結合する、段落3〜7のいずれか1つに記載の方法。
9．抗体が、Fzd2の134〜163番目のアミノ酸に対応するFzd2の領域内でFzd2に特異的に結合する、段落3〜7のいずれか1つに記載の方法。
10．抗体が、Fzd2の144〜163番目のアミノ酸に対応するFzd2の領域内でFzd2に特異的に結合する、段落3〜7のいずれか1つに記載の方法。
11．抗体が、エピトープ

に特異的に結合する、段落3〜10のいずれか1つに記載の方法。
12．抗体がモノクローナル抗体である、段落3〜11のいずれか1つに記載の方法。
13．抗体がポリクローナル抗体である、段落3〜11のいずれか1つに記載の方法。
14．抗体がヒト化抗体である、段落3〜12のいずれか1つに記載の方法。
15．癌が、消化管癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、頭頚部癌、肺癌、非小細胞肺癌、神経系の癌、腎臓癌、網膜癌、皮膚癌、肝臓癌、膵臓癌、尿生殖器癌、および膀胱癌からなる群より選択される、段落1〜14のいずれか1つに記載の方法。
16．癌が肝臓癌である、段落1〜15のいずれか1つに記載の方法。
17．癌が後期肝細胞癌である、段落1〜16のいずれか1つに記載の方法。
18．癌がFzd2の過剰発現を示す、段落1〜17のいずれか1つに記載の方法。
19．癌がWnt5aの過剰発現を示す、段落1〜18のいずれか1つに記載の方法。

本発明を、さらなる制限として解釈すべきではない以下の実施例によってさらに説明する。

実施例1：肝細胞癌の処置における治療抗体の標的としてのFrizzled 2受容体
Fzd2は後期および分化が不良なHCCにおいて過剰発現される
肝細胞癌におけるWnt受容体発現に関する最初の研究により、後期および分化の不良なHCCにおいてFrizzled 2（Fzd2）が顕著に過剰発現されることが明らかとなった（図1）。Fzd2遺伝子の転写物レベルを、組織病理学的に確認されたHCC（ステージI、n＝7；ステージII、n＝8、ステージIII、n＝8、ステージIV、n＝3；腫瘍の病変、n＝14）を有する患者から得た組織試料48個と共に正常な肝臓試料（n＝8）において測定した。Fzd2は、正常組織と比較して後期HCC（ステージIIIおよびIV）において有意に過剰発現されることが見いだされた（P＜0.05）。さらに、Fzd2発現レベルは、組織分化の程度と反比例した。分化が中等度から不良である腫瘍は、良好に分化した腫瘍タイプと比較してより高いレベルのFzd2を示した。さらに、本発明者らは、より上皮様のHepG2 HCC細胞株と比較して、間葉様で転移性のHCC細胞株（FOCUS）においてFzd2が高度に過剰発現されることを見いだした（図2）。

Fzd2ノックダウンまたは抗Fzd2抗体による処置は、インビトロでの細胞の遊走および浸潤を低減させる
Wntタンパク質は、増殖、遊走、および浸潤において極めて重要な役割を果たすことが示されている増殖因子である。Wntタンパク質は、Fzdファミリー受容体に結合して活性化することによって、その効果を媒介する。Fzd2のsiRNA媒介ノックダウンまたは抗Fzd2抗体による処置は、インビトロでFOCUS細胞のWnt媒介細胞遊走および浸潤を阻害することが見いだされ、Fzd2によって媒介される非標準Wntシグナル伝達がこれらのプロセスにとって極めて重要であることを示唆している（図3）。

抗Fzd2抗体は、細胞表面Fzd2受容体のインターナリゼーションを引き起こす
細胞表面ビオチニル化アッセイを用いて、抗Fzd2抗体によるFOCUS細胞の処置が、Fzd2のインターナリゼーションおよび分解を引き起こすことが示された。具体的に、Fzd2は、その同系のリガンドであるWnt5aの非存在下で細胞膜に発現されることが見いだされた。細胞表面でのFzd2のタンパク質レベルは、Wnt5a刺激によってまたは抗Fzd2抗体による処置によって顕著に減少した（図4）。

Fzd2ノックダウンは、ヌードマウスにおける腫瘍の増殖を低減させる
HCCの病因におけるFzd2変化の程度を理解するために、FOCUS細胞を無胸腺マウスに皮下注射して、細胞の腫瘍増殖物形成能をモニターした。FOCUS細胞はこのモデルにおいて急速に増殖して、4日までに測定可能な腫瘍を生じた。増殖物がおよそ200 mm³に達すると、マウスを無作為に2群に分けた（対照および処置）。処置群には、1日おきにFzd2-siRNAの注射を2週間行った（MWF）が、対照群にはインビボトランスフェクション試薬のみを皮下注射した。Fzd2に対するsiRNAの存在下で、腫瘍の増殖は、指数増殖期において顕著な遅延を示し、有意に遅かった（図5）。興味深いことに、処置群の腫瘍は、Fzd2-siRNA注射を中止すると、急速に増殖し始めた。これらのデータは、FOCUS細胞の高い腫瘍形成能が部分的にFzd2を通して媒介されることを示唆している。

全体として、インビトロおよびインビボデータは、Fzd2がHCCにおいて腫瘍形成性であること、およびFzd2の過剰発現がHCCの進行および転移に関与することを示唆している。

抗Fzd2抗体のエピトープマッピング
抗Fzd2抗体（(R & D Systems; MAB 1307）のエピトープをマッピングするために、Fzd2のN末端領域における26〜172番目の残基に及ぶ3つの重なり合う構築物を設計した（図6A）。HEK293細胞において過剰発現させると、断片1（完全長、26〜172番目のアミノ酸）および断片3（C末端領域、100〜172番目のアミノ酸）のみが抗Fzd2抗体によって認識され、このことは、抗Fzd2抗体のエピトープが断片3領域内に存在することを示唆している（図6A）。抗Fzd2抗体のエピトープをさらにマッピングするために、断片3に及ぶ3つの重なり合うペプチドを合成した。ペプチドアレイを用いて、ペプチド2（134〜163番目のアミノ酸）のみが抗Fzd2抗体によって認識されることが認められた（図6B）。抗Fzd2抗体はペプチド1（100〜132番目のアミノ酸）または重なり合うペプチド2（125〜143番目のアミノ酸）を認識しなかったことから、抗Fzd2抗体のエピトープは、Fzd2のN末端領域の残基134 -

内に存在すると決定された。このエピトープは、Fzd2に対して非常に特異的である領域に存在し、他のFzdファミリーメンバーと相同性を共有せず、抗Fzd2抗体の高い特異性を示唆する。これらの配列は、NCBI参照番号NP_001457としてヒトfzd-2に関して示される配列に対応する。

材料および方法
細胞株および試薬
肝臓癌細胞株HepG2およびHEK293T細胞をAmerican Type Culture Collection（ATCC, Rockville, MD）から得た。FOCUS細胞は、J. Wands（Brown University）から得たが、これらは既に記述されている[5]。細胞株は全て、10％（v/v）ウシ胎児血清（FBS）、2 mMグルタミン、100 IU/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において維持した。

Signal Silence Fzd2 siRNAを、Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz, CA）から購入した。Lipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて、製造元の説明書に従って、siRNAを細胞に導入した。組み換え型ヒトWnt5aは、R&D Systems（Minneapolis, MN）から得た。一次抗体は以下の起源から得た：ウサギ抗β-カテニン（Cell Signaling Technology）、ヤギ抗Fzd2（Santa Cruz Biotechnology）、ラット抗Fzd2（R&D Systems）、ウサギ抗Fzd2（Abcam）。

RNA抽出および定量的リアルタイムPCR
HepG2およびFOCUS細胞から血清を24時間枯渇させて、総細胞RNAをRNeasy Mini Kit（QIAGEN, Santa Clara, CA）を用いて単離した。Wnt関連遺伝子84個のmRNAレベルをRT2 profiler（商標）qPCRアレイ（SA Biosciences Corporation, Frederick, MD）を用いて決定した。簡単に説明すると、総RNA 1μgをRT2 First Strand Kit（SA Bioscience）を用いて第一鎖cDNAに逆転写した。得られたcDNAを、84個のWnt関連遺伝子および5個のハウスキーピング遺伝子（B2M、HPRT1、RPL13A、GAPDH、およびACTB）を含む96個の異なる遺伝子に関するヒト遺伝子特異的プライマーを用いてqPCRに供した。qPCR反応を、Mx3000P（商標）QPCRシステム（Stratagene, La Jolla, CA）を用いて、95℃で10分間の初回変性段階の後に、95℃で15秒間および60℃で60秒間の40サイクルによって行った。

各遺伝子のmRNAレベルを5個のハウスキーピング遺伝子の平均レベルと比較して標準化して、2-△△Ct法を用いて非刺激血清枯渇細胞から得たデータと比較した。この方法に従って、mRNAの標準化レベルXを、等式1を用いて決定する：（1）
X＝2^-Ct(GOI)／2^-Ct(CTL) （1）
式中Ctは、閾値サイクル（ベースラインシグナルより上のレポーター蛍光の増加が検出されるサイクル数）である。GOIは、関心対象遺伝子を意味し、CTLは、対照のハウスキーピング遺伝子を意味する。この方法は、CtがmRNAの初回濃度と反比例すること、および産物量がサイクルごとに倍加することを仮定している。

TissueScan腫瘍学パネルアレイ
腫瘍生検に由来する一連のcDNA試料48個をOriGene Technologies Inc.（Rockville, MD）から得た。試料は、肝臓癌の4つ全てのステージを表すと共に正常組織を表した。遺伝子発現を上記のようにqPCRによって評価した。癌のデータを、正常組織試料から収集したデータに対して標準化して、有意水準0.05でクラスカル-ウォリス検定を用いて分析した。

細胞遊走アッセイ
細胞の遊走は、QCM（商標）化学走性96-ウェル細胞遊走アッセイキット（Chemicon, Temecula, CA）を用いて評価した。簡単に説明すると、Fzd2-siRNAまたは対照siRNAを一過性に48時間トランスフェクトしたFOCUS細胞をDMEM中に浮遊させて、上室に入れた。Wnt5a（200 ng/mL）を含むDMEMを下室に2時間添加した。下室に遊走した細胞を、メンブレンから解離させて溶解し、CyQuant GR色素を添加することによって定量した。測定を3つ組みで行って、対照細胞に対して標準化した。

類似の遊走アッセイを、Fzd2を阻害するために、Fzd2-siRNAによる一過性のトランスフェクションの代わりに抗Fzd2抗体を利用して行った。抗Fzd2抗体を細胞培養培地に最終濃度10μg/mlで2時間添加した後、遊走アッセイを行った。

細胞浸潤アッセイ
細胞浸潤アッセイは、CytoSelect（商標）細胞浸潤アッセイ（Cell Biolabs）を用いて、製造元の説明書に従って測定した。簡単に説明すると、Fzd2-siRNAまたは対照siRNAを一過性に48時間トランスフェクトしたFOCUS細胞を播種して、Wnt5a（200 ng/mL）に向かって2時間浸潤させた。浸潤メンブレンの底部の浸潤細胞を染色した後、CyQuant GR色素を添加することによって定量した。測定は3つ組みで行い、対照細胞に対して標準化した。

類似の細胞浸潤アッセイを、Fzd2を阻害するために、Fzd2-siRNAによる一過性のトランスフェクションの代わりに、抗Fzd2抗体を利用して行った。抗Fzd2抗体を細胞培養培地に最終濃度10μg/mlで2時間添加した後、遊走アッセイを行った。

表面ビオチニル化アッセイ
表面タンパク質のビオチニル化を、記述のように行った[6]。簡単に説明すると、PBS（対照）Wnt5a（100 ng/mL）または抗Fzd2抗体（10μg/ml最終濃度）のいずれかによって1時間処置したFOCUS細胞を、1 mM MgCl2および0.1 mM CaCl2を含むPBSによって2回洗浄した後、ビオチニル化緩衝液（154 mM NaCl、10 mM Hepes[pH 7.6]、3 mM KCl、1 mM MgCl2、0.1 mM CaCl2、10 mMグルコース、0.5 mg/mL EZ Link Sulfo HNS-SS-ビオチン（Thermo Scientific, Rockford, IL）中で4℃で40分間インキュベートした。次に、細胞を100 mMグリシンを含むPBS中で4℃で5分間インキュベートした後、1 mM MgCl2および0.1 mM CaCl2を含むPBS中で1回洗浄した。細胞を溶解して、総タンパク質濃度をBCAタンパク質アッセイ（Pierce, Rockford, IL）を用いて決定した。ビオチニル化タンパク質をストレプトアビジンビーズによって免疫沈降させて、総表面Fzd2を、以下に記述されるように、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングによって決定した。

ヌードマウスにおける腫瘍形成性
インビボ実験は全て、6週齢から8週齢の無胸腺ヌードマウス（NIH）において行った。マウスを一定温度および湿度のクリーンルームで維持した。FOCUS細胞をマウスの各脇腹に皮下接種した。細胞（2×10⁶個、浮遊液）を0日目に注射して、腫瘍の増殖を、2から3日毎にノギスを用いて腫瘍の直径を測定することによって追跡した。腫瘍の体積（V）を式：V＝AB2/2（A、軸の直径；B、回転方向の直径）を用いて計算した。増殖物がおよそ200 mm³に達すると、マウスを無作為に2群（対照および処置）に分けた。処置群にはFzd2-siRNA注射を1日おきに（MWF）2週間行ったが、対照群にはインビボトランスフェクション試薬のみを皮下注射した。Fzd2に対するsiRNAの存在下では、腫瘍の増殖は、指数増殖期の顕著な遅延を示し、有意に遅かった。

タンパク質の単離および定量的ウェスタンブロッティング
細胞をリン酸緩衝生理食塩液（PBS）中ですすいで、溶解緩衝液（1 mMオルトバナジン酸ナトリウム、1 mMフッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）、10μg/mLアプロチニン、および10μg/mLロイペプチンを添加した、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1％Triton X-100（v/v）、2 mM EDTA、pH 7.8）中で溶解した。BCAタンパク質アッセイ（Pierce, Rockford, IL）を用いてタンパク質濃度を決定して、標準的な技法を用いてイムノブロット実験を行った。定量的イムノブロットに関して、一次抗体を、1：5000倍希釈のIRDye 680標識ヤギ抗ウサギIgGまたはIRDye 800標識ヤギ抗マウスIgG（LI-COR Biosciences, Lincoln, NE）によって検出した。バンドを可視化して、Odyssey近赤外イメージングシステム（LI-COR Biosciences）を用いて定量した。

抗Fzd抗体のエピトープマッピング
抗Fzd2抗体のエピトープをマッピングするために、26〜172番目の残基に及ぶ3つの重なり合う断片を、pcDNA3.1哺乳動物発現ベクターにおいて構築した。これらの構築物をHEK293細胞において一過性にトランスフェクトさせて、48時間後に収集した全細胞溶解物を、上記のように抗Fzd2抗体によるウェスタンブロッティングに供した。断片3（100〜172番目のアミノ酸）の領域をさらにマッピングするために、3つの重なり合うペプチドを民間企業が合成した（LifeTein, NJ）。Fzd2完全長遺伝子または空のベクター（陰性）を発現するHEK293細胞からのこれらのペプチドおよび溶解物を、Aushon 2470アレイヤーを用いてニトロセルロースコーティングスライドガラス上にプリントした。ペプチドアレイスライドを3％（v/v）BSAによってブロックして、抗Fzd2抗体によってプロービングした。スポットをOdyssey近赤外イメージングシステム（LI-COR Biosciences）を用いて可視化および定量した。

参考文献

実施例2：Wnt受容体：肝臓癌に対する新規生物学標的
Fzd2ノックダウンまたは抗Fzd2抗体による処置は、インビトロで細胞の遊走および浸潤を低減させる
RNAiによるFzd2のノックダウン、または細胞の抗Fzd2抗体への曝露により、HCC細胞の細胞の運動性および浸潤性が低減することが示され、腫瘍形成表現型は正常な上皮様状態へと復帰する（図8）。細胞表面ビオチニル化アッセイを用いて、抗Fzd2抗体によってFOCUS HCC細胞を処置すると、Fzd2のインターナリゼーションおよび分解を引き起こすことが見いだされた（図8）。Wnt5aによって刺激すると、Fzd2の細胞表面レベルは顕著に減少したが、このダウンレギュレーションはまた、抗Fzd2抗体によって処置した細胞においても観察される。しかし、抗体は、下流のシグナル伝達を活性化しない。

Fzd2ノックダウンは、マウスにおけるHCCの異種移植片モデルにおいて細胞抑制を誘導する
HCCの病因におけるFzd2変化の程度を理解するために、FOCUS細胞を無胸腺マウスに皮下注射して、細胞の腫瘍増殖物形成能をモニターした。FOCUS細胞はこの異種移植片腫瘍モデルにおいて急速に増殖して、4日までに測定可能な腫瘍を産生した。腫瘍が約200 mm³に達すると、マウスを無作為に2群（対照および処置）に分けた。処置群には1日おきに（MWF）Fzd2-siRNA注射を2週間行ったが、対照群にはインビボトランスフェクション試薬のみを皮下注射した。Fzd2に対するsiRNAの存在下で、腫瘍の増殖は指数増殖期の顕著な遅延を示し、有意に遅かった（図8E）。処置群における腫瘍は、Fzd2-siRNA注射を中断すると、急速な増殖を再開した。これらのデータは、FOCUS細胞の高い腫瘍形成能が、部分的にFzd2によって媒介されること、およびFzd2-siRNAが細胞死よりむしろ細胞抑制を誘導することを示唆している。同様に、Fzd2に対するshRNAを用いるFzd2の安定なノックダウンもまた、ヌードマウスにおける腫瘍の増殖を低減させた（図8F）。

全体として、インビトロおよびインビボデータは、Fzd2がHCCにおいて腫瘍形成性であり、Fzd2の過剰発現がHCCの進行に関与することを示唆している。Fzd2が腫瘍の細胞死よりむしろ細胞抑制を引き起こすという事実は、増殖因子受容体に結合する標的化薬物の典型である。たとえば抗ErbB薬の場合、細胞抑制によってヒト患者において有効な腫瘍の阻害が起こりうることが示されている。

HCC患者40人のカプランマイヤー生存分析
カプランマイヤー生存データは、転移性HCC患者が高いFzd2受容体発現を有し、低いFzd2発現を有する無転移患者より実質的に短い生存（p＝0.0053）に相関したことを示している（図9）。

Fzd2特異的抗体の結合分析
エピトープマッピングしたfrizzled-2抗体（実施例1において考察）およびfrizzled-2に関して結合分析を行った。分析の結果を以下の表1および図10に示す。抗体は、Fzd2に対して高い親和性の結合を有すると決定された（＜20 nM）。

HCC患者の臨床試料および転帰から誘導したカプランマイヤー生存分析と共に、siRNAおよびshRNA試験により、Fzd2がHCCにおける優れた標的であることが証明されている。さらに、本発明者らは、本明細書において市販の抗体によって同定されたエピトープに対する結合が、受容体のインターナリゼーションおよび下流のシグナル伝達経路の不活化（たとえば、↓pStat3）を引き起こすことを示している。

材料および方法：
細胞株および試薬
肝臓癌細胞株SNU449、SNU475、およびHepG2細胞をAmerican Type Culture Collection（ATCC, Rockville, MD）から得た。FOCUS細胞は、J. Wands（Brown University）から得て、既に記述されている[1]。細胞株は全て、10％（v/v）ウシ胎児血清（FBS）、2 mMグルタミン、100 IU/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において維持した。

Signal Silence Fzd2 siRNAをSanta Cruz Biotechnology（Santa Cruz, CA）から購入した。Lipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて製造元の説明書に従ってsiRNAを細胞に導入した。組み換え型ヒトWnt5aは、R&D Systems（Minneapolis, MN）から得た。一次抗体は以下の起源から得た：ウサギ抗β-カテニン（Cell Signaling Technology）、ヤギ抗Fzd2（Santa Cruz Biotechnology）、ラット抗Fzd2（R&D Systems）、ウサギ抗Fzd2（Abcam）。

Fzd2ノックダウン安定細胞株の作製
細胞株にFzd2-shRNA構築物（Open Biosystems）をトランスフェクトして、トランスフェクションの48時間後、4μg/mLピューラマイシン（puramycin）（Invitrogen）中で選択した。クローンをFACSによってソーティングして、ウェスタンブロットによってFzd2ノックダウンに関してスクリーニングした。安定な細胞株を、10％FBS、および2μg/mLピューラマイシンを添加したDMEMにおいて維持した。

RNA抽出および定量的リアルタイムPCR
HepG2およびFOCUS細胞から血清を24時間枯渇させて、総細胞RNAをRNeasy Mini Kit（QIAGEN, Santa Clara, CA）を用いて単離した。84個のWnt関連遺伝子のmRNAレベルを、RT2 profiler（商標）qPCRアレイ（SA Biosciences Corporation, Frederick, MD）を用いて決定した。簡単に説明すると、総RNA 1μgをRT2 First Strand Kit（SA Biosciences）を用いて第一鎖cDNAに逆転写した。得られたcDNAを、84個のWnt関連遺伝子および5個のハウスキーピング遺伝子（B2M、HPRT1、RPL13A、GAPDH、およびACTB）を含む96個の異なる遺伝子に関するヒト遺伝子特異的プライマーを用いてqPCRに供した。qPCR反応を、Mx3000P（商標）QPCRシステム（Stratagene, La Jolla, CA）を用いて、95℃で10分間の初回変性段階の後に、95℃で15秒間および60℃で60秒間の40サイクルによって行った。

各遺伝子のmRNAレベルを5個のハウスキーピング遺伝子の平均レベルと比較して標準化して、2-△△Ct法を用いて非刺激血清枯渇細胞から得たデータと比較した。この方法に従って、mRNAの標準化レベルXを、等式1を用いて決定する：（1）
X＝2^-Ct(GOI)／2^-Ct(CTL) （1）
式中Ctは閾値サイクル（ベースラインシグナルより上のレポーター蛍光の増加が検出されるサイクル数）である。GOIは、関心対象遺伝子を意味し、CTLは、対照のハウスキーピング遺伝子を意味する。この方法は、CtがmRNAの初回濃度と反比例すること、および産物量がサイクルごとに倍加することを仮定している。

細胞遊走アッセイ
細胞の遊走は、QCM（商標）化学走性96-ウェル細胞遊走アッセイキット（Chemicon, Temecula, CA）を用いて評価した。簡単に説明すると、Fzd2-siRNAまたは対照siRNAを一過性に48時間トランスフェクトしたFOCUS細胞をDMEM中に浮遊させて、上室に入れた。Wnt5a（200 ng/mL）を含むDMEMを下室に2時間添加した。下室に遊走した細胞を、メンブレンから解離させて溶解し、CyQuant GR色素を添加することによって定量した。測定を3つ組で行って、対照細胞に対して標準化した。

創傷治癒動態アッセイ
FOCUS細胞の遊走に及ぼすFzd2ノックダウンの効果を、創傷治癒アッセイを用いて調べた。FOCUS細胞を96ウェルプレート（Essen ImageLock, Essen Instruments, MI, US）において平板培養して、創傷スクラッチャー（Essen Instruments）によって引っ掻き傷を作製した。異なる用量の低分子阻害剤を創傷作製後直ちに添加して、創傷のコンフルエンスをIncucyte Live-Cellイメージングシステムおよびソフトウェア（Essen Instruments）を用いてモニターした。各実験において少なくとも4つの生物学的複製物の平均相対的創傷密度を比較することによって、創傷の閉鎖を48〜72時間のあいだ毎時間観察した。

細胞浸潤アッセイ
細胞浸潤アッセイは、CytoSelect（商標）細胞浸潤アッセイ（Cell Biolabs）を用いて製造元の説明書に従って測定した。簡単に説明すると、Fzd2-siRNAまたは対照siRNAを一過性に48時間トランスフェクトしたFOCUS細胞を播種して、Wnt5a（200 ng/mL）に向かって2時間浸潤させた。浸潤メンブレンの底部の浸潤細胞を染色した後、CyQuant GR色素を添加することによって定量した。測定を3つ組で行い、対照細胞に対して標準化した。

表面ビオチニル化アッセイ
表面タンパク質のビオチニル化を、記述されるように行った[2]。簡単に説明すると、PBS（対照）、Wnt5a（100 ng/ml）または抗Fzd2抗体のいずれかによって1時間処置したFOCUS細胞を1 mM MgCl2および0.1 mM CaCl2を含むPBSによって2回洗浄した後、ビオチニル化緩衝液（154 mM NaCl、10 mM Hepes[pH 7.6]、3 mM KCl、1 mM MgCl2、0.1 mM CaCl2、10 mMグルコース、0.5 mg/ml EZ Link Sulfo HNS-SS-ビオチン（Thermo Scientific, Rockford, IL）中で4℃で40分間インキュベートした。細胞を、100 mMグリシンを含むPBS中で4℃で5分間インキュベートした後、1 mM MgCl2および0.1 mM CaCl2を含むPBS中で1回洗浄した。細胞を溶解して、総タンパク質濃度をBCAタンパク質アッセイ（Pierce, Rockford, IL）を用いて決定した。ビオチニル化タンパク質をストレプトアビジンビーズによって免疫沈降させて、総表面Fzd2を以下に記述されるように、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングによって決定した。

ヌードマウスにおける腫瘍形成性
インビボ実験は全て、6週齢から8週齢の無胸腺ヌードマウス（NIH）を用いて行った。マウスを一定温度および湿度のクリーンルームで維持した。FOCUS細胞をマウスの各脇腹に皮下接種した。細胞（2×10⁶個、浮遊液）を0日目に注射して、腫瘍の増殖を、2から3日毎にノギスを用いて腫瘍の直径を測定することによって追跡した。腫瘍の体積（V）を式：V＝AB2/2（A、軸の直径；B、回転方向の直径）を用いて計算した。増殖物がおよそ200 mm³に達すると、マウスを無作為に2群（対照および処置）に分けた。処置群にはFzd2-siRNA注射を1日おきに（MWF）2週間行ったが、対照群にはインビボトランスフェクション試薬のみを皮下注射した。Fzd2に対するsiRNAの存在下では、腫瘍の増殖は、指数増殖期の顕著な遅延を示し、有意に遅かった。

抗Fzd抗体のエピトープマッピング
抗Fzd2抗体のエピトープをマッピングするために、26〜172番目の残基に及ぶ3つの重なり合う断片を、pcDNA3.1哺乳動物発現ベクターにおいて構築した。これらの構築物をHEK293細胞に一過性にトランスフェクトして、48時間後に収集した全細胞溶解物を上記のように抗Fzd2抗体によるウェスタンブロッティングに供した。断片3（100〜172番目のアミノ酸）の領域をさらにマッピングするために、3つの重なり合うペプチドを民間企業が合成した（LifeTein, NJ）。Fzd2完全長遺伝子または空のベクター（陰性）を発現するHEK293細胞からのこれらのペプチドおよび溶解物を、Aushon 2470アレイヤーを用いてニトロセルロースコーティングスライドガラス上にプリントした。ペプチドアレイスライドを3％（v/v）BSAによってブロックして、抗Fzd2抗体によってプロービングした。スポットをOdyssey近赤外イメージングシステム（LI-COR Biosciences）を用いて可視化および定量した。

カプランマイヤー生存分析
HCC患者40人のカプランマイヤー生存曲線を、既に公表されたデータセット[3]を用いて作製した。

Cignal finder 45パスウェイレポーターアレイ
Cignal（商標）45-パスウェイレポーターアレイ（SABiosciences, Frederick, MD）を用いて、GFPまたはFzd2-shRNAを発現するFOCUS細胞において、製造元の説明書に従って45個の異なるシグナル伝達経路を同時に評価した。簡単に説明すると、Cignal Finder 96ウェルプレートの各プレートウェル中のレポーターDNA構築物を、Opti-MEM 50μlに浮遊させた後、希釈したLipofectamineトランスフェクション試薬50μlと混合した。細胞をOpti-MEM中で浮遊させて、リバーストランスフェクションにより細胞にパスウェイレポーターを導入するためにウェル（細胞10,000個/ウェル）に播種した。細胞を5％CO2で37℃で48時間インキュベートした。次に細胞を溶解して、ホタルおよびウミシイタケ（内部トランスフェクション対照）ルシフェラーゼ活性を定量的発光アッセイ（Dual Glo, Promega）によって測定した。

STAT3レポーター細胞株の作製
Cignal Lenti STAT3レポーターキット（SABiosciences）を用いて、STAT3経路の活性化を評価するために、製造元のプロトコールに従ってレンチレポーターを細胞に形質導入した。簡単に説明すると、FOCUS細胞を6ウェルプレートのウェル（細胞200,000個/ウェル）に播種して、湿潤5％CO₂インキュベータ中で37℃で24時間増殖させた。次に、細胞に、レンチCMVレポーターまたはレンチSTAT3レポーター（レンチウイルス粒子100μl/ウェル）を形質導入して、10μg/ml SureEntry形質導入試薬を含む抗生物質を含まない増殖培地2 mlと共に24時間インキュベートした後、新鮮な増殖培地中で37℃および5％CO₂でさらに24時間インキュベートした。その後、細胞を、形質導入細胞を選択するための増殖培地中で4.0μg/mlピューロマイシンによって処置した。ピューロマイシン抵抗性細胞コロニーを100 mm細胞培養皿において増殖させて、10％FBSおよび2μg/mLピューラマイシンを添加したDMEMにおいて維持した。

サイトカインアレイ
GFP-shRNAまたはFzd2-shRNAを発現するFOCUS細胞を、無血清DMEM中で48時間培養した後、培養上清中のサイトカインレベルをヒトサイトカインアレイキット（R&D Systems, Minneapolis, MN）を用いて製造元のプロトコールに従って検出した。簡単に説明すると、上清を、36個のサイトカインに対する抗体をアレイにしたメンブレンと共に4Cで終夜インキュベートした。2回洗浄後、メンブレンをビオチン結合一次抗サイトカイン抗体と共に2時間インキュベートした後、2回洗浄した。次にメンブレンをIRDye 800CWストレプトアビジン（LI-COR）と共に室温で1時間インキュベートした後、2回洗浄した。シグナルを、Odyssey近赤外イメージングシステム（LI-COR Biosciences）を用いて検出および定量した。

実施例2の参考文献

実施例3：肝臓癌治療のための薬力学バイオマーカー
Fzd2媒介遊走および浸潤が、少なくとも部分的にプラスミノーゲン／プラスミノーゲン活性化因子系（PAI-1）のセリンプロテアーゼおよびマトリクスメタロプロテナーゼ（MMP2、MMP3、およびMMP9）ファミリーからのいくつかのプロテアーゼの放出が原因であることは決定されている。これらのプロテアーゼの発現および放出は、後期HCC細胞株におけるFzd2受容体の発現と高度に相関している（p＜0.01）。さらに、Stat3およびsrcファミリーキナーゼを含むFzd2の下流の新規シグナル伝達経路が解明されている。具体的に、srcファミリーキナーゼおよびStat3のリン酸化状態の減少ならびにその転写活性の減少は、低分子干渉によるFzd-2のノックダウンまたは抗体処置に関連している。このように、stat3およびsrcファミリーキナーゼのリン酸化状態は、Fzd2治療物質の近位の薬力学バイオマーカーとして用いることができる。

MMP
MMP、特にMMP9、2および3は、40年より長く、癌に関連付けられている。ECM分解におけるその役割のほかに、多数の証拠が、癌細胞の浸潤および転移にとって極めて重要である血管新生、リンパ管新生、および脈管新生におけるその役割を示唆している。たとえば、MMP9は、結腸および膵臓癌などのいくつかの癌において、隔離されたVEGFのその受容体に対する結合の生物学的利用率を増加させる。MMP9はまた、HCCにおける重要な増殖因子であるTGF-βのタンパク質分解による活性化を媒介する。

PAI-1（SerpinE1）
プラスミノーゲンは、ECM分解におけるもう1つの重要な系である。しかし、低いのではなくてむしろ驚くほど高いレベルのプラスミノーゲン活性化因子阻害剤（PAI-1）が、多様な異なる癌に罹患している患者の不良な生存予後を予測する。PAI-1の明らかな逆説的役割は、インビトロおよびインビボの両方において腫瘍の増殖および血管新生を促進することを証明している。PAI-1によるタンパク質分解切断の厳密な制御が新しい血管の形成にとって必須であることが示されている。さらに、ビトロネクチン、uPAR、およびインテグリンとの相互作用を遮断することによって、PAI-1は、細胞外マトリクスからの細胞の剥離を誘導して、それによって細胞の遊走および腫瘍の浸潤を促進する可能性がある。

sICAM-1
細胞内接着分子-1（ICAM-1）の発現は、固形腫瘍の予後不良と相関することが確立されている。転移性癌の浸潤におけるICAM-1の原因的役割は、乳腺および肺などの癌において示されている。細胞表面でのICAM-1の発現は、一連のマクロファージおよび好中球の動員および活性化による腫瘍の転移能を必然的に決定して、血管内およびリンパ管内障壁の破壊ならびに内皮を超えての腫瘍細胞遊走を可能にする。循環中に存在するICAM-1の可溶性型（sICAM-1）は、臨床的に評価することが難しいICAM-1の直接のマーカーである。

STAT3
Stat3、シグナル伝達分子および転写因子の発現の脱調節は、癌の約80％に関係しており、それによって癌細胞の増殖および浸潤が起こる。

Srcファミリーキナーゼ
Stat3をリン酸化することができるSrcファミリーキナーゼの脱調節は、多くのタイプの癌に関係している。これらの分泌型タンパク質およびFzd2の下流のシグナル伝達分子の発見は、Fzd2がどのように腫瘍細胞の遊走および浸潤を促進するかに関する機序の詳細の一助となるのみならず、Fzd2経路を標的とする治療物質に関する薬力学マーカーとして用いることができる。

Fzd2はSerpinE1およびsICAM1の放出を媒介する
ヒトサイトカインアレイを作製して、これを用いてタンパク質発現を分析した。アレイは、ニトロセルロースメンブレン上に2つ組みでスポットした抗体からなり、条件培地中での36個のサイトカイン、ケモカイン、および急性期タンパク質のハイスループット多検体プロファイリングを可能にする。FOCUS-WTまたはFOCUS-shFzd2細胞からの条件培地をビオチニル化検出抗体のカクテルと混合した後、ヒトサイトカインアレイと共にインキュベートした。次に、アレイを、赤外線-800標識ストレプトアビジンと共にインキュベートした後LiCor odysseysイメージングシステムを用いて赤外線検出を行った。分析結果を図11に示す。ヒトサイトカインアレイの画像をFOCUS-WT（図11A上）およびFOCUS-shFzd2（図11A下）からの条件培地によってプロービングした。検出後、アレイデータを定量してタンパク質プロファイルを作製した。このアッセイを用いて測定した36個のサイトカインの量を、図11Bに示す。放出されたSerpinE1およびsiCAM1の量は、FOCUS-shFzd2細胞からの条件培地において有意に低かった。

マトリクスメタロプロテナーゼ（MMP）およびSerpinE1は、後期侵襲性分化不良肝細胞癌（HCC）株において過剰発現される
初期の非侵襲性（HepG2およびHuh7）および後期の侵襲性（SNU475およびFOCUS）細胞株における様々なMMPおよびSerpinE1の相対的mRNA発現を調べるために分析を行った。結果を図12に示す。

Fzd2はマトリクスメタロプロテナーゼ（MMP）およびSerpinE1のmRNA発現を調節する
FOCUS-CTLまたはFOCUS-shFzd2細胞における様々なMMPおよびSerpinE1の相対的mRNA発現を調べるために分析を行った。結果を図13に示す。

Fzd2はStat3、ERK1/2およびMEK1/2のリン酸化状態ならびにその転写活性を調節する
野生型FOCUS細胞およびFzd2をノックダウンしたFOCUS細胞におけるSTAT3、ERK1/2およびMEK1/2細胞のリン酸化を調べるための分析を行った。類似の分析を他の後期細胞株および抗Fzd2抗体による処置を行った細胞において行った。結果を図14Aに示す。野生型FOCUSおよびSNU449細胞ならびにFzd2またはSTAT3をノックダウンした細胞におけるレポーター／ルシフェラーゼに基づくアッセイを用いたStat3転写活性を図14Aに示す。類似の結果が、他の後期細胞株および抗Fzd2抗体による処置において証明された（図14C）。後期HCC細胞株（FOCUS）の細胞遊走に及ぼすStat3に対する低分子阻害剤の効果を図14Cに示す。

Fzd2は後期HCC細胞株におけるStat3をリン酸化するSrcファミリーキナーゼのリン酸化状態を調節する
Srcファミリーキナーゼのリン酸化を野生型FOCUS細胞、およびFzd2をノックダウンしたFOCUS細胞、ならびに他の後期細胞株において分析した（図15A）。低分子阻害剤（ダサチニブ）によってSrcファミリーキナーゼを阻害する効果も同様に調べた。阻害剤は、FOCUS細胞においてstat3リン酸化を消失させた（図15B）。後期HCC細胞株（FOCUS）の細胞遊走に及ぼす阻害剤の効果も同様に調べた。用量反応曲線を図15Cに示す。

Claims

Fzd2をダウンモジュレートする抗体またはその抗原結合断片の治療的有効量を対象に投与する段階を含み、その結果、該抗体またはその抗原結合断片が、該対象の癌細胞に送達されて、それによって癌を処置する、対象における癌を処置する方法。
Fzd2をダウンモジュレートする抗体またはその抗原結合断片の治療的有効量を対象に投与する段階を含み、その結果、該抗体またはその抗原結合断片が癌細胞に送達されて、それによって癌を処置する、対象における癌細胞の増殖、遊走、および／または浸潤を阻害する方法。
抗体が、Fzd2に特異的に結合する、請求項1または2のいずれかに記載の方法。
抗体がFzd2に結合し、かつ癌細胞によるFzd2受容体のインターナリゼーションを促進する、請求項3記載の方法。
Fzd2に対する抗体がFzd2に対するリガンドの結合を防止する、請求項3〜4のいずれかに記載の方法。
抗体がFzd2タンパク質の細胞外部分に特異的に結合する、請求項3〜5のいずれか1項に記載の方法。
抗体が、Fzd2の24〜247番目のアミノ酸に対応するFzd2の領域内でFzd2に特異的に結合する、請求項3〜6のいずれか1項に記載の方法。
抗体が、Fzd2の125〜163番目のアミノ酸に対応するFzd2の領域内でFzd2に特異的に結合する、請求項3〜7のいずれか1項に記載の方法。
抗体が、Fzd2の134〜163番目のアミノ酸に対応するFzd2の領域内でFzd2に特異的に結合する、請求項3〜7のいずれか1項に記載の方法。
抗体が、Fzd2の144〜163番目のアミノ酸に対応するFzd2の領域内でFzd2に特異的に結合する、請求項3〜7のいずれか1項に記載の方法。
抗体が、エピトープ

に特異的に結合する、請求項3〜10のいずれか1項に記載の方法。
抗体がモノクローナル抗体である、請求項3〜11のいずれか1項に記載の方法。
抗体がポリクローナル抗体である、請求項3〜11のいずれか1項に記載の方法。
抗体がヒト化抗体である、請求項3〜12のいずれか1項に記載の方法。
癌が、消化管癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、頭頚部癌、肺癌、非小細胞肺癌、神経系の癌、腎臓癌、網膜癌、皮膚癌、肝臓癌、膵臓癌、尿生殖器癌、および膀胱癌からなる群より選択される、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
癌が肝臓癌である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
癌が後期肝細胞癌である、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
癌がFzd2の過剰発現を示す、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
癌がWnt5aの過剰発現を示す、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。