CN114196675A - 靶向linc00624的反义寡核苷酸及其在乳腺癌治疗中的应用 - Google Patents

靶向linc00624的反义寡核苷酸及其在乳腺癌治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于乳腺癌治疗技术领域，具体公开了靶向LINC00624的反义寡核苷酸及其在乳腺癌治疗中的应用。本发明发现了乳腺癌耐药的分子标志物LINC00624，并获得能高效靶向降解细胞中LINC00624的5种反义寡核苷酸(ASO1‑5)，对其进行了胆固醇修饰后，通过对小鼠静脉注射验证，本发明的5种反义寡核苷酸(ASO1‑5)单个或者混合使用，均能够对乳腺癌移植瘤的抑制作用，从而实现单用或联合用药，增强抗癌效果的药物。

Description

靶向LINC00624的反义寡核苷酸及其在乳腺癌治疗中的应用
技术领域
本发明属于乳腺癌治疗技术领域，涉及靶向LINC00624的反义寡核苷酸及其在乳腺癌治疗中的应用。
背景技术
LINC00624是一个在肿瘤细胞中高表达的长链非编码RNA。数据显示是一个新发现的长链非编码RNA。LINC00624可通过稳定ADAR1，抑制细胞内RNA感知，从而降低干扰素通路的活化并促进乳腺癌治疗耐药。同时，LINC00624高表达可以降低免疫治疗的疗效。ASO可作为工具对LINC00624进行干扰，具有转化价值。
目前已在多种肿瘤中确定了大量发挥癌基因作用的LncRNA。在乳腺癌中的相关研究发现，长链非编码基因HOTAIR的表达可促进***受体(ER)的转录因子活性，从而促进他莫昔芬耐药。小鼠中MaTAR 25(Mammary Tumor-Associated RNA 25，乳腺肿瘤相关RNA25)的lncRNA可促进细胞迁移和侵袭。敲除该基因可以明显抑制小鼠乳腺癌生长及转移，该LncRNA的人基因组同源产物LINC01271高表达与乳腺肿瘤的恶性进展直接相关。因此LncRNA具有作为乳腺癌风险基因、诊断标志物、预后标志物和治疗靶点的价值。
现有研究使用的敲低长链非编码RNA表达的工具包括：小分子干扰核糖核酸(small interfering RNA,siRNA)或者短发卡RNA(short hairpin RNA)，其中具有较大临床应用潜力的是小分子干扰核糖核酸(短发卡RNA需要载体过表达到细胞中，临床转化潜力低)。目前，尚未有研究报道针对LINC00624的小分子干扰核糖核酸在乳腺癌治疗领域中的作用。
发明内容
基于现有技术存在的缺陷，本发明发现了乳腺癌耐药的分子标志物和治疗靶点LINC00624，并获得能高效靶向降解细胞中LINC00624的反义寡核苷酸，从而实现单用或联合用药，增强抗癌效果的药物。
第一方面，本发明提供了反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸能够特异性结合LINC00624以抑制/降解其表达。
在某些实施例中，所述反义寡核苷酸选自由如下(1)-(2)任一项所组成的组：
(1)如SEQ ID NO：1-5中任一条序列所示；
(2)如SEQ ID NO：1-5所示序列中的至少2条；
(3)能够和如(1)所示的序列在高严格性或非常高的严格性条件下杂交的序列的互补序列编码的一种或多种核苷酸。
在某些实施例中，所述反义寡核苷酸具有至少一个修饰；所述修饰选自核苷间键修饰、甲基化修饰或胆固醇修饰中的一种或多种；优选的，所述核苷间键修饰为胆固醇修饰，以便增强对癌细胞膜和细胞核膜的穿透性。
第二方面，本发明提供了一种能够治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物种活性成分为本发明第一方面所述的反义寡核苷酸，所述癌症选自黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、脑癌、乳癌、肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌；优选的，乳腺癌。
在某些实施例中，所述核苷酸存在于脂质体中或连接到药学上可接受的载体上。
第三方面，本发明提供了上述第一方面所述的反义寡核苷酸在制备具有以下任一所述功能的药物中的应用，所述应用选自：
(1)预防和/或治疗癌症；
(2)抑制癌细胞的生长；
(3)缓慢持续杀伤癌细胞；
(4)癌症的免疫治疗；
其中，所述癌症选自黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、脑癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌；优选为乳腺癌。
在某些实施例中，所述细胞选自增生性的、瘤性的、前癌性的或转移性的细胞。
在某些实施例中，所述转移性的细胞选自转移性的肿瘤细胞。
第四方面，本发明还提供了一种缓慢持续杀伤细胞的方法，用于非疾病诊断和治疗目的，所述方法包括将细胞与前述第一方面所述的反义寡核苷酸或前述第二方面所述的药物组合物接触。
在某些实施例中，所述细胞选自增生性的、瘤性的、前癌性的或转移性的细胞；所述转移性的细胞选自转移性的肿瘤细胞。
在某些实施例中，所述药物组合物可以通过口服、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、经皮、鼻腔、经直肠，肿瘤体内注射、肿瘤腔内留置、神经鞘内注射、蛛网膜下腔注射或***性施用；可选的，所述***性施用包括通过血管内施用；优选的，所述血管内施用选自注射、灌注。
在某些实施例中，所述方法还包括施用第二抗癌疗法，所述第二种抗癌疗法为化学疗法、放射疗法、免疫疗法、生物疗法、靶向疗法和手术疗法中一种或多种的组合。
本发明相对于现有技术具有以下技术效果：
1)本发明首次发现LINC00624可以作为乳腺癌耐药的分子标志物，为预防或治疗乳腺癌提供了新靶标和新思路。
2)本发明针对靶标LINC00624制备了能够高效靶向降解细胞中LINC00624的5种反义寡核苷酸(ASO1-5)，并对其进行了胆固醇修饰，通过对小鼠静脉注射验证，本发明的5种反义寡核苷酸(ASO1-5)单个或者混合使用，均能够对乳腺癌移植瘤的抑制作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为63例接受新辅助化疗HER2阳性乳腺癌患者术前空芯针穿刺LINC00624表达量；FPKM，fragments per kilobase per million。
图2为本中心319例乳腺癌标本队列的无复发生存Kapan-Meier生存分析(A)所有分型患者中RFS Kaplan-Meier生存曲线；(B)ER/PR阳性患者中RFS Kaplan-Meier曲线；(C)HER2阳性患者中RFS Kaplan-Meier曲线；(D)TNBC患者中RFS Kaplan-Meier曲线。HR：hazard ratio,风险比；95％CI：confidence interval，95％置信区间。
图3为乳腺癌细胞中5个ASO的敲低效果鉴定。
图4为胆固醇修饰的ASO1-5单用或混合使用后动物实验，其中左图：BT474乳腺癌细胞裸鼠成瘤生长曲线，右图：瘤体剥离后拍照图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施案例所描述的内容仅用于说明和解释本发明，并不用于限制权利要求书中所详细描述的本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备如无特别说明，均为常规方法，所使用的试验材料如无特别说明，均可从商业公司获取。
定义
在本公开的权利要求和/或说明书中，词语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在本公开中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
在本公开中，术语“反义寡核苷酸(ASO)”表示体内表达的或人工合成的，与靶基因或mRNA某一区段互补的核酸片断，可以通过碱基互补原则结合于靶基因/mRNA上，从而封闭基因的表达。
本公开使用的术语“癌症”包括任何癌症，包括但不限于黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、癌(例如脑癌、乳癌、肝癌、胃癌、肺癌和结肠癌)及白血病。
本公开使用的术语“预防”、“治疗”或这些术语的任何变形，包括为实现期望结果(例如癌症治疗)的任何可测量的减少或完全抑制。期望结果包括但不限于癌症或增生性病症或癌症相关症状的缓解、降低、减慢或根除，以及改善的生活质量或生命延长。
在一些技术方案中，本公开涉及用于限定两个多核苷酸互补程度的杂交条件严格性。可选的，前述多核苷酸可以选自DNA。本公开使用的“严格性”指杂交期间的温度和离子强度条件以及是否存在某些有机溶剂。严格性越高，靶核苷酸序列与经标记的多核苷酸序列之间的互补程度越高。“严格条件”指仅具有高频率互补碱基的核苷酸序列将杂交的温度和离子条件。本文使用的术语“在高严格性或非常高的严格性条件下杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件。用于进行杂交反应的指导可见于Current Protocols inMolecularBiology，John Wiley和Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中。本公开提及的具体杂交条件如下：1)高严格性杂交条件：在约45℃的6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，然后于65℃下用0.2XSSC、0.1％SDS洗涤一次或更多次；2)非常高严格性杂交条件：65℃的0.5M磷酸钠，7％SDS，然后于65℃下用0.2X SSC、1％SDS洗涤一次或更多次。
在本公开的某些方面，细胞包含在患者体内，该细胞可为增生性的、瘤性的、前癌性的、转移性的细胞。示例性的，所述细胞选自癌细胞。
在一个具体的技术方案中，所述癌细胞选自黑素瘤细胞、肉瘤细胞、淋巴瘤细胞、癌(例如脑癌、乳癌、肝癌、胃癌、肺癌和结肠癌)细胞。
在本公开的某些方面，在施用可为口服、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、经皮、鼻腔或经直肠施用。在某些方面，组合物被***性施用，特别是通过血管内施用，包括注射、灌注等施用方式。
本公开中的术语“放疗剂”包括使用引起DNA损伤的药物。放疗已广泛用于癌症和疾病治疗，并且包括通常称为γ射线、X射线的那些和/或将放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。
本公开中的术语“化疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的类别包括，但不限于：烷化剂、抗代谢产物、激酶抑制剂、纺锤体毒物植物生物碱、细胞毒/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、光敏剂、抗-***和选择性***受体调节剂、抗-孕酮、***受体下调剂、***受体拮抗剂、促黄体激素释放激素激动剂、抗-雄激素类、芳香化酶抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、抑制涉及异常细胞增殖或肿瘤生长的基因表达的反义寡核苷酸。可用于本公开的治疗方法的化疗剂包括细胞生长抑制剂和/或细胞毒性剂。
本公开中的术语“免疫治疗剂”包括“免疫调节剂”和促进或介导促进细胞介导的免疫应答的抗原呈递的试剂。其中，“免疫调节剂”包含免疫检查点调节剂，例如免疫检查点蛋白受体及其配体介导T细胞介导的细胞毒性的抑制，并且通常由肿瘤或在肿瘤微环境中的无反应性T细胞上表达，并允许肿瘤逃避免疫攻击。免疫抑制检查点蛋白受体及其配体的活性的抑制剂可以克服免疫抑制性肿瘤环境，以允许肿瘤的细胞毒性T细胞攻击。免疫检查点蛋白质的实例包括但不限于PD-1、PD-L1、PDL2、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103。此类蛋白质的活性的调节(包括抑制)可以通过免疫检查点调节剂完成，其可以包括例如靶向检查点蛋白质的抗体、适体、小分子和检测点受体蛋白质的可溶性形式，等等。PD-1靶向抑制剂包括经批准的药物试剂派姆单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab)，而易普利姆玛(ipilimumab)是经批准的CTLA-4抑制剂。对PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103特异性的抗体是已知的和/或商品化的，并且也可以由本领域技术人员产生。
本公开中采用的分子生物学方法，均可以参见“最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology，Wiley出版)”，“分子克隆实验指南(Molecular Cloning：ALaboratory Manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。
本公开中的反义寡核苷酸的合成方法没有特别限定，可使用已知的寡核苷酸合成仪，例如通过phosphoroamidite法，硫代磷酸酯法，磷酸三酯法等方法进行合成。
在本公开的一种实施方式中，反义寡核苷酸包括含有修饰的骨架或非天然的核苷间键的寡核苷酸。如本说明书所确定的，具有修饰的骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留了磷原子的那些寡核苷酸和骨架中不含有磷原子的那些寡核苷酸。为了本说明书的目的，以及如本领域有时所引用的，核苷间骨架中不含有磷原子的修饰的寡核苷酸也可被看作是寡核苷。
在本公开的一种实施方式中，修饰的寡核苷酸骨架包括，例如，硫代磷酸酯(phosphorothioate)，手性硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨烷基磷酸三酯，甲基和其它烷基磷酸酯，包括3′-烯烃基磷酸酯和手性磷酸酯，膦，氨基磷酸酯，包括3′-氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酰酯，硫羰氨基磷酸酯，硫羰烷基磷酸酯，硫羰烷基磷酸三酯，和具有正常3′-5′键的硼烷基磷酸酯，其2′-5′连接的类似物，以及具有反转极性，其中相邻配对核苷单位为3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′连接。还包括多种盐，混合盐和游离酸形式。
在本公开的一种实施方式中，不包括磷原子的优选修饰的寡核苷酸骨架为由短链烷基或环烷基核苷间键，混合的杂原子和烷基或环炔基核苷间键，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。它们包括含有吗啉代键(由核苷的糖部分部分形成的)；硅氧烷骨架；硫化物，亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；包含烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和氨苯磺胺骨架；酰胺骨架；和含有混合的N，O，S和CH2构成部分的骨架的那些骨架。
在其它优选的寡核苷酸模拟物中，糖和核苷间键，亦即，核苷酸单位的骨架被新基团取代。碱基单位被保留以便与适宜的核酸靶化合物杂交。一种所述寡聚化合物，已显示出具有优良杂交特性的寡核苷酸模拟物，被称为核酸肽(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被包含胺酰胺的骨架，特别是氨基乙基甘氨酸骨架置换。核碱基被保留，并直接或间接与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子结合。
本公开优选的实施方案是具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸。修饰的寡核苷酸还可包含一个或多个取代的糖部分。
在本公开中，其它优选的修饰包括2′-甲氧基(2′O-CH 3)，2′-氨基丙氧基(2′-OCH2 CH 2 CH 2 NH 2)和2′-氟(2′-F)。相似的修饰还可在寡核苷酸上的其它位置进行，所述其它位置特别是3′端核苷酸上糖的3′位或在2′-5′连接的寡核苷酸中和5′端核苷酸的5′位。寡核苷酸还可具有诸如以环丁基部分代替戊呋喃糖的糖模拟物形式。寡核苷酸还可包括核碱基(在本领域中通常被简称为“碱基”)修饰或取代。如此处所使用的，“未修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和尿嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其它合成和天然核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-Me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤素，8-氨基，8-硫醇，8-硫烷基，8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤素特别是5-溴代，5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤和7-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。
本公开的寡核苷酸的其它修饰包括将能增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或结合物化学连接至寡核苷酸。所述部分包括(但不限于)脂质部分，诸如胆固醇部分，胆酸，硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇，硫代胆固醇，脂肪族链，例如，癸二酸或十一烷基残基，磷脂，例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-邻-十六烷基外消旋甘油-3-H-磷酸酯，多胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸、棕榈基部分，或十八胺或己基氨基-羰基-氧胆甾醇部分。
在本公开中，反义寡核苷酸的所有位置无须被全部均匀修饰，事实上在单个化合物中或甚至是在寡核苷酸内的单个核苷上可以掺入多于一个的上述修饰。本公开还包括是嵌合化合物的反义寡核苷酸。在本公开中，“嵌合”反义寡核苷酸或“嵌合体”是反义寡核苷酸，特别是寡核苷酸，其包含两个或多个可化学区分的区域，各由至少一个单体单位构成，比如寡核苷酸化合物中的的核苷酸。这些寡核苷酸典型地包括至少一个其中寡核苷酸被修饰的区域，以便赋予寡核苷酸对核酸酶降解抗性的增加，细胞摄取的增加，和/或对靶核酸结合亲和力的增加。寡核苷酸的附加区域可作为能剪切RNA：DNA或RNA：RNA杂合体的酶的底物。举例来说，RNaseH是剪切RNA：DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。因此，RNaseH的活化会导致剪切RNA靶，由此极大地增强了寡核苷酸抑制基因表达的效能。因此，当使用嵌合寡核苷酸时，与和相同靶区域杂交的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸相比，采用较短寡核苷酸通常可获得相当的结果。RNA靶的剪切可通过凝胶电泳，以及(如有需要)本领域已知的相关核酸杂交技术进行常规检测。
本公开的嵌合反义寡核苷酸可被构建为上述两个或多个寡核苷酸，修饰的寡核苷酸，寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。在本领域中所述反义寡核苷酸还被称为杂合体。
在一个具体的实施方式中，为了增加本公开中的反义寡核酸的稳定性和其对细胞的亲和性，可在不显著降低其活性的前提下通过用另一种更稳定的基团替换磷酸基或者核糖部分中的羟基所得的衍生物。这种反义寡核苷酸衍生物的特定实施例包括硫代磷酸基，甲基磷酸基团等替代磷酸基，或核糖部分的羟基被烷氧基例如甲氧基，烯丙氧基等或氨基，氟原子等代替的衍生物。
本公开的反义寡核苷酸的分子设计中，组成反义寡核苷酸的核苷酸序列是很重要的。寡核苷酸成了包括天然存在的核苷酸分子及上述非天然的修饰寡核苷酸外，肽核酸类的修饰的修饰化合物。本公开中的翻译官核苷酸优选地是在其结构中具有糖(优选的是戊糖。这么做的目的是有利于穿透细胞膜，核膜等结构。
在一个具体的实施方式中，本公开的反义寡核苷酸优选地带有胆固醇修饰，以便增强对癌细胞膜和细胞核膜的穿透性。
本公开中的反义寡核苷酸也可以单独使用。因此，本公开提供癌症细胞生长抑制剂和癌症的治疗或预防制剂(下文中有时指所有药物制品)可以由所述的反义寡核苷酸组成，但优选地是通过已知方法将反义寡核苷酸与药学上接受的物质混合，从而形成混合物而得到的药物制剂。此处，虽然癌细胞生长抑制剂与癌症治疗或预防制剂没有在组成、生产过程等方面进行特别区分，但二者是不同的，因为癌细胞生长抑制剂除了用于减轻或改善癌症症状或治疗或预防癌症外，还用于抑制癌细胞生长，例如在通常的实验过程中作为普通的试剂。药物制剂可通过下述方式进行制备。
例如，注射剂可通过将本公开中的反义寡核苷酸溶解到水、生理盐水、葡萄糖溶液等溶剂中而进行制备，如果需要，可含有缓冲剂、防腐剂、稳定剂等物质。
药膏可通过将本公开中的反义寡核苷酸溶解或分散在脂油性、乳剂性或水溶性物质中而进行制备，如果需要，可含有稳定剂、pH调节剂、可塑剂、乳化剂、表面活性剂、增溶剂、保湿剂、防腐剂、杀菌剂、溶剂、吸收加速剂等物质。
乳剂、洗剂等可通过将本公开中的反义寡核苷酸溶解或分散到水相中，然后用油相成分，例如烃或高级醇乳化而进行制备，如果需要，可含有稳定剂、pH调节剂、可塑剂、乳化剂、表面活性剂、增溶剂、保湿剂、防腐剂、杀菌剂、溶剂、吸收加速剂等物质。
本公开中的细胞生长抑制剂可制备成干燥型产品，当加入溶剂，例如作为通用溶剂的水后则可很容易地形成溶液。
当需要将本公开中的反义寡核苷酸更有效地整合到活体中或期望具有持续作用时，则反义寡核苷酸优选地与药学上接受的已知载体一起形成药物制剂。载体包括例如基于脂类例如脂质体的载体、脂肪乳化剂及微囊，肽类载体例如多聚赖氨酸，多聚鸟氨酸合成的多聚体载体例如聚乙烯亚胺及聚乳酸/乙二醇共聚物。特别地，与脂质体联合的药物制剂是优选的。在药物制剂中，本公开的反义寡核苷酸优选地以包埋在脂质体中的形式存在。可通过已知方法用这些载体进行配制。
例如，用脂质体配制的方法在Gregory，G.(ed)，Liposome Technology：LiposomePreparation and Related Techniques，2 nd Ed.，CRC Pr.，1992等中进行了描述。与脂质体联合的药物制剂不仅可以包括通常用于形成脂质体的脂类，例如磷脂、糖脂和中性脂，而且也可以包括提供阳离子电荷以形成脂质体的物质，例如联十六烷基磷酸、硬脂酰胺等，及防止脂质体氧化的物质，例如α-生育酚等。对于增强对细胞的整合和增强对靶向细胞的导向性的目的，可以使用修饰后的上述载体。
此处，这些药物制剂可以包括其它已知具有抗癌作用的组分。
在上述药物制剂中，本公开中的反义寡核苷酸可在连接到载体上，例如整合到任意载体上后进行使用。在这种情况下，反义寡核苷酸优选地是可操作地连接到合适的启动子上。术语“可操作地”是指反义寡核苷酸(RNA)可在该启动子的作用下在活体细胞中进行表达。载体包括但不限于，例如腺病毒载体、痘病毒载体、逆转录病毒载体等。这些载体可用作基因治疗的载体。对于构建这些载体的方法、其特定的用途等可参考文献例如Sambrook，J.，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；2nd Ed.，Cold SpringHarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY.，1989等。
本公开的药物制剂中的反义寡核苷酸含量没有特别限定，可以进行适当的调整以达到每种药物制剂所需的效果。通常含量约为质量的1％到10％是合适的。
本公开中的癌细胞生长抑制剂和癌症治疗或预防制剂可通过上述方法获得。因此，用本公开中的反义寡核苷酸生产本公开中的癌细胞生长抑制剂和癌症治疗或预防制剂的方法作为本公开的另一个实施方案进行提供。
对活体施用本公开中的癌症治疗或预防制剂的方法根据治疗或预防制剂的形式可包括但不特别限定于，例如口服给药、静脉内给药、经皮给药、局部给药、腹膜内给药等。作为给药本公开的癌症治疗或预防制剂的方法，更有效的方法可根据个体和疾病的状况进行选择，通常静脉内给药是优选的。癌症治疗或预防制剂的给药剂量根据症状等进行确定，并不特别限定。在静脉内给药的情况下，癌症治疗或预防制剂的剂量以本公开中的反义寡核苷酸的量来说，优选地是每人每天0.1到1mg/(体重)kg，更优选地是0.1到0.5mg/(体重)kg。可以每天一次给药或每天多次分部给药。给药周期也不进行特别限定。
此处，给药本公开中的癌症治疗或预防制剂的活体并不限定于上述的人，而且包括例如哺乳动物等其它动物。本公开中的癌细胞生长抑制剂也与本公开中的癌症治疗或预防制剂的使用方式相同。
作为本公开的癌细胞生长抑制剂和癌症治疗或预防制剂靶点的癌细胞的部位无特别限定，特别优选地是癌细胞来源于身体表面例如皮肤；消化道例如食道、胃和大肠；抑制剂或制剂可进行动脉内施用于肝脏等部位。
实施例1
利用63例接收新辅助化疗HER2阳性乳腺癌患者术前空芯针穿刺组织样本，提取组织RNA，逆转录进行qPCR检测LINC00624的表达水平，根据新辅助治疗疗效进行分组：病理完全缓解pCR和病理不完全缓解non-pCR，绘制散点图，如图1所示，发现non-PCR组，LINC00624表达较高，p＝0.011，具有统计学意义，证明LINC00624高表达提示较差治疗疗效。
实施例2
利用319例乳腺癌标本队列，提取组织RNA，逆转录进行qPCR检测LINC00624的表达水平，并对队列进行随访，进行生存分析，结果如图2所示，发现LINC00624高表达在总分型中以及luminal型和HER2分型中，提示较差预后。
实施例3
SK-BR-3(ATCC号：HTB-30)、BT-474(ATCC号：HTB-20)、和B16(ATCC号：CRL-6322)，NF639(ATCC号：CRL-3090)细胞系购自ATCC。其中，BT-474、B16、和NF639细胞系在含有10％胎牛血清(FBS，Gibco，South America)的RPMI 1640(Gibco，Grand Island，New York，USA)中培养。SK-BR-3在含有10％FBS的McCOY’s 5A(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(Gibco，Grand Island，NY，USA)中培养。所有细胞均用支原体抑制试剂(Normicin)(Invivogen，USA)以避免支原体感染并且通过STR测序验证。
按照TRIzol(Invitrogen，CA，USA)试剂的方案从组织或细胞中提取总RNA。使用Nanodrop(Thermofisher，Rockford，USA)测量RNA浓度。通过使用HiScript逆转录酶(HiScript Reverse Transcriptase)(Vazyme，Nanjing，China)来逆转录RNA。通过使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(Vazyme，Nanjing，China)在Applied Biosystems7500中进行实时qPCR试验。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用作内部对照。
ASO的转染
基于建议浓度和指示剂量，在Opti-MEM(Gibco，Grand Island，NY，USA)中稀释RNAiMAX(Invitrogen，CA，USA)，同时在Opti-MEM中稀释胆固醇修饰的LINC00624 ASO(HippoBio，Huzhou，China)、或相应对照，其后在室温下用稀释的RNAiMAX培养5分钟。最后，将ASO-脂质复合物均匀滴入之前根据实验要求制备的细胞中。
结果如图3所示，我们使用ASO进行LINC00624敲低，共设计5种ASO在乳腺癌细胞系中检测敲低效果，5种ASO1-5的序列如下：
LINC00624 ASO1：GCCTATTTATTCACACCAAG(SEQ ID NO.1)；
LINC00624 ASO2：TGTTTCCTGCAGTATGCACC(SEQ ID NO.2)；
LINC00624 ASO3：GCAGAAGTAGGCCACATCTT(SEQ ID NO.3)；
LINC00624 ASO4：GAATACCTACCTTGGGCACA(SEQ ID NO.4)；
LINC00624 ASO5：CAACTTGCCTGGTACGGAGG(SEQ ID NO.5)；从图中可以看出，消除总LINC00624达50％以上。
实施例4
对于小鼠乳腺癌模型ASO治疗试验，小鼠接种前一周将17BESTRADIO(0.72mg颗粒，SE-121，IRA)皮下植入6周龄裸鼠体内。取2.5×106个pCDH或LINC00624过表达BT-474细胞，在D-PBS溶液(Gibco)中重新悬浮，与BME(Cultrex,3632-010-02)按体积比1:1混合，并皮下注射到第四个***脂肪垫中。10天后可触及成瘤后，进行6次ASO注射治疗：使用10nmol ASO2和3混合物(每个5nmol，ASO2和ASO3混合比例是1:1)或ASO对照，每次对每只小鼠进行静脉注射。并每2-3天测量一次瘤体，根据体积绘制瘤体曲线。35天后，处死裸鼠，剥离瘤体进行拍照。
结果如图4所示，采用使用10nmol ASO2和3的混合物治疗后肿瘤的直径明显减小，说明本发明的反义寡核苷酸混合使用能够对乳腺癌移植瘤产生明显的抑制作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (12)

1.反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸能够特异性结合LINC00624以抑制/降解其表达。
2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸选自由如下(1)-(3)任一项所组成的组：
(1)如SEQ ID NO：1-5中任一条序列所示；
(2)如SEQ ID NO：1-5所示序列中的至少2条；
(3)能够和如(1)所示的序列在高严格性或非常高的严格性条件下杂交的序列的互补序列编码的一种或多种核苷酸。
3.根据权利要求2所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸具有至少一个修饰；所述修饰选自核苷间键修饰、甲基化修饰或胆固醇修饰中的一种或多种；优选的，所述核苷间键修饰为胆固醇修饰。
4.一种能够治疗癌症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中活性成分为权利要求1-3任一所述的反义寡核苷酸，所述癌症选自黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、脑癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌；优选为乳腺癌。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述核苷酸存在于脂质体中或连接到药学上可接受的载体上。
6.权利要求1-3任一所述的反义寡核苷酸在制备具有以下任一所述功能的药物中的应用，其特征在于，所述应用选自：
(a)预防和/或治疗癌症；
(b)抑制癌细胞的生长；
(c)缓慢持续杀伤癌细胞；
(d)癌症的免疫治疗；
其中，所述癌症选自黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、脑癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌；优选为乳腺癌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞选自增生性的、瘤性的、前癌性的或转移性的细胞。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述转移性的细胞选自转移性的肿瘤细胞。
9.一种缓慢持续杀伤细胞的方法，用于非疾病诊断和治疗目的，其特征在于，所述方法包括将细胞与权利要求1-3所述的反义寡核苷酸或权利要求4-5所述的药物组合物接触。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述细胞选自增生性的、瘤性的、前癌性的或转移性的细胞；所述转移性的细胞选自转移性的肿瘤细胞。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述药物组合物可以通过口服、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、经皮、鼻腔、经直肠，肿瘤体内注射、肿瘤腔内留置、神经鞘内注射、蛛网膜下腔注射或***性施用；可选的，所述***性施用包括通过血管内施用；优选的，所述血管内施用选自注射、灌注。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括施用第二抗癌疗法，所述第二种抗癌疗法为化学疗法、放射疗法、免疫疗法、生物疗法、靶向疗法和手术疗法中一种或多种的组合。
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