JP2014506455A - ヒト化抗egfr抗体l4−h3及びそのコード遺伝子 - Google Patents
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Abstract
Description
I)配列番号2の85位〜726位で表されるか、又は配列番号2の9位〜729位で表されるヌクレオチド配列、
II)I)に規定するDNA配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記軽鎖をコードするDNA分子、又は
III)I)に規定するDNA配列と70%を超える同一性を示し、前記軽鎖
をコードするDNA分子
で表される。
1)配列番号4で表されるヌクレオチド配列、
2)1)に規定するDNA配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記重鎖をコードするDNA分子、又は
3)1)に規定するDNA配列と70%を超える同一性を示し、前記重鎖をコードするDNA分子
で表される。
上述のコード遺伝子のいずれかを含む組換えベクター、組換え株、組換え細胞、又は発現カセットもまた、本発明の保護範囲に入る。
a)配列番号4の1位〜435位で表されるヌクレオチド配列、
b)a)に規定するDNA配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、タンパク質フラグメントをコードするDNA分子、又は
c)a)に規定するDNA配列と70%を超える同一性を示し、前記タンパク質フラグメントをコードするDNA分子
で表される。
1: 5’−gtgtctagagccgccaccatggactgga−3’ (XbaI);(配列番号6)
2: 5’−gggatccacttacctgttgctttct−3’ (BamHI);(配列番号7)
3: 5’−atccactcaagtctttgtccaggggcctgtcgcacccagtggacgccgtagttagtcaggctgaatccag−3’ (配列番号8)
4: 5’−gagtggatgggagtgatctggagtggtggtaacactgactacaacacccccttcactagcagagtcacc−3’ (配列番号9)
5: 5’−gaccagggttccctggccccagtaggcgaactcgtagtcgtaataagtcagggctctcgcacag−3’ (配列番号10)
6: 5’−cctactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcg−3’ (配列番号11)
(1)コーティングバッファー(PH9.6及び0.05Mの炭酸塩緩衝液):1.59gのNa2CO3、及び2.93gのNaHCO3に蒸留水を加えて1000mLにした。
2)プログラムを設定してrProtein Aアフィニティークロマトグラフィーカラムを接続し、
3)20mMの結合緩衝液(pH7.0)を用いてクロマトグラフィーカラムを平衡化し、
4)調整した細胞上清を1mL/分〜2mL/分の流量で充填し(前記細胞上清の調整:12,000gで15分間の遠心の後に上清を取り出し、次いで該上清をろ過滅菌用の0.22umの硝酸セルロースフィルター膜を通過させる)、
5)充填の終了直前に1Mの抽出バッファー(pH3.0)で標的タンパク質を抽出し、
6)抽出溶液(即ち、標的タンパク質)を回収し、トリス塩基(pH9.0)を用いてpHを7.0に調整し、次いで電気泳動によって分析し、
7)工程1)に記載のチューブ及び小型フィルターを洗浄する。
注:ヒトIgGと比較して、*P<0.01
Claims (10)
- 重鎖及び軽鎖からなる抗体であって、前記重鎖は、重鎖可変領域と重鎖定常領域との組合せにより形成され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3の1位〜145位で表され、前記重鎖定常領域は、ヒト化抗体IgG1の重鎖定常領域であり、前記軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号1で表されることを特徴とする抗体。
- 抗体の重鎖のアミノ酸配列が、配列番号3で表される請求項1に記載の抗体。
- 請求項1又は2に記載の抗体のコード遺伝子、又は
軽鎖のコード遺伝子が、
I)配列番号2の85位〜726位で表されるか、又は配列番号2の9位〜729位で表されるヌクレオチド配列、
II)I)に規定するDNA配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記軽鎖をコードするDNA分子、又は
III)I)に規定するDNA配列と70%を超える同一性を示し、前記軽鎖をコードするDNA分子
で表されるか、又は重鎖のコード遺伝子が、
1)配列番号4で表されるヌクレオチド配列、
2)1)に規定するDNA配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記重鎖をコードするDNA分子、又は
3)1)に規定するDNA配列と70%を超える同一性を示し、前記重鎖をコードするDNA分子
で表されることを特徴とするコード遺伝子。 - 請求項3のコード遺伝子を含むことを特徴とする組換えベクター、組換え株、組換え細胞、又は発現カセット。
- 軽鎖のコード遺伝子を、ベクターpIRESのNhe I制限酵素認識部位及びEcoR I制限酵素認識部位の間に、Nhe I制限酵素認識部位からEcoR I制限酵素認識部位の方向に挿入して中間組換えベクターとしての組換えベクターを得る工程と、重鎖のコード遺伝子を、前記中間組換えベクターのXba I制限酵素認識部位及びNot I制限酵素認識部位の間に、Xba I制限酵素認識部位からNot I制限酵素認識部位の方向に挿入し、得られた組換えベクターが目的の組換え発現ベクターである工程と、を含む方法によって作製された組換え発現ベクターである請求項4に記載の組換えベクター。
- 請求項5の組換え発現ベクターを開始細胞に導入することによって得られた組換え細胞であるか、又は請求項5の組換え発現ベクターを開始細胞に導入することによって得られた組換え細胞であり且つ前記開始細胞が293T細胞である請求項4に記載の組換え細胞。
- 請求項6の組換え細胞を培養する工程、及び上清を回収して請求項1又は2の抗体を得る工程を含む、請求項1又は2の抗体を作製することを特徴とする方法。
- 有効成分が、請求項1又は2の抗体、請求項3のコード遺伝子、請求項4又は5の組換えベクター、請求項4の組換え株、請求項4又は6の組換え細胞、及び請求項4の発現カセットの少なくともいずれかであり、腫瘍は結腸癌であり、腫瘍細胞はSW480細胞であることを特徴とする、上皮成長因子受容体のシグナル伝達経路を阻害する阻害剤、腫瘍細胞の浸潤を阻害する阻害剤、及び腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかのための製品。
- 請求項1又は2の抗体、請求項3のコード遺伝子、請求項4又は5の組換えベクター、請求項4の組換え株、請求項4又は6の組換え細胞、及び請求項4の発現カセットの少なくともいずれかの、上皮成長因子受容体のシグナル伝達経路を阻害する阻害剤の製造のための使用、請求項1又は2の抗体、請求項3のコード遺伝子、請求項4又は5の組換えベクター、請求項4の組換え株、請求項4又は6の組換え細胞、及び請求項4の発現カセットの少なくともいずれかの、腫瘍細胞浸潤を阻害する阻害剤の製造のための使用、及び、請求項1又は2の抗体、請求項3のコード遺伝子、請求項4又は5の組換えベクター、請求項4の組換え株、請求項4又は6の組換え細胞、及び請求項4の発現カセットの少なくともいずれかの、腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかのための製品の製造のための使用であって、腫瘍が結腸癌であり、腫瘍細胞がSW480細胞であることを特徴とする使用。
- タンパク質フラグメント及びそのコード遺伝子であって、
前記タンパク質フラグメントのアミノ酸配列は、配列番号3の1位〜145位で表され、
前記タンパク質フラグメントの前記コード遺伝子は、
a)配列番号4の1位〜435位で表されるヌクレオチド配列、
b)a)に規定するDNA配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記タンパク質フラグメントをコードするDNA分子、又は
c)a)に規定するDNA配列と70%を超える同一性を示し、前記タンパク質フラグメントをコードするDNA分子
で表されることを特徴とするタンパク質フラグメント及びそのコード遺伝子。
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