CN115505041A - 抗EphA2抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗体领域，特别涉及抗EphA2抗体及其应用。本发明提供了抗EPH受体A2(EphA2)抗体及其用途。本申请还提供了抗EphA2抗体的嵌合抗体和人源化抗体形式。这些抗体对人EphA2蛋白具有高亲和性，是用于预防和/或治疗EphA2相关疾病，例如EphA2相关的肿瘤、骨质疏松、阿尔茨海默症等的一种有前景的抗体分子。

Description

抗EphA2抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体领域，特别涉及抗EphA2抗体及其应用。
背景技术
肿瘤发生是体细胞基因突变的结果，肿瘤微环境、细胞外基质及免疫***在肿瘤发生发展中发挥着重要作用。当癌变细胞逃过免疫监视、克服免疫功能的控制，肿瘤才能进展或致死宿主。因此，改善人体免疫***、调节免疫微环境是治疗或预防肿瘤发生发展的重要手段。随着人们对肿瘤免疫机制的深入了解，肿瘤免疫治疗技术得到了快速发展，成为许多中晚期癌症患者可选择治疗方式，极大地提高其生存期及生活质量。
胰腺癌是肿瘤治疗中最具挑战性的恶性肿瘤之一，其特征在于侵袭性强、早期转移和对治疗的高度抗性。患者平均5年生存率仅为4％。目前，手术切除是唯一可行的治疗方法；然而，80％-85％的胰腺癌患者初诊已是晚期，失去了手术机会。胰腺癌等癌症的不良预后促使研究者们寻找新的治疗靶标。
EphA2(Ephrin type-A receptor 2)是1990年鉴定的酪氨酸激酶受体分子，其配体为EphrinA1。EphA2蛋白在许多肿瘤比如皮肤癌、消化道肿瘤、***癌、卵巢癌、乳腺癌中等高表达，是肿瘤患者预后不良的分子标志物。EphA2发挥作用有两种模式：其一为配体非依赖性癌基因模式，EphA2通过激活下游的PI3K、Rho/Rac1 GTPase/MAPK信号通路，促进细胞增殖、迁移；其二为EphrinA1配体依赖性抑癌基因模式，EphrinA1-EphA2结合后，可以反馈性抑制MAPK通路，抑制肿瘤细胞增殖及迁移。Ye Hu等教授发现部分胰腺癌患者出现靶向药吉西他滨耐药性，这个抗性在肿瘤细胞间的传递，由外泌体介导，而外泌体的内化是EphA2依赖性的。EphA2过表达同时也参与介导乳腺癌、***和黑色素瘤的治疗抵抗。最近的研究表明，抑制EphA2可减弱胰腺癌的侵袭性，增加黑色素瘤对vemurafenib和乳腺癌对他莫昔芬的敏感性，表明EphA2有望成为癌症免疫治疗的目标。
2018年EphA2激动型抗体由日本科学家制备，该抗体具有内化的特性，体外实验证实EphA2抗体偶联免疫毒剂可以杀伤黑色素瘤细胞。目前国内外尚无治疗性EphA2抗体上市，研发阶段处于临床前。这些数据提示EphA2可能是治疗胰腺癌和其他EphA2阳性肿瘤的有前途的治疗靶点。
阿尔茨海默病(AD)是一种进行性的神经***退行性疾病。临床上以记忆障碍、失认功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。当前阿尔兹海默病的研发方向主要关注淀粉样斑块和神经原纤维缠结。研究发现Eph/Ephrin蛋白参与大脑的学***均大幅上调，这些外泌体通过EphrinA2与成骨细胞膜上的EphA2受体相互作用，从而抑制成骨细胞活性，造成骨质疏松。这些数据同时提示EphA2可能也是治疗阿尔茨海默病和骨质疏松症的靶点。
因此，提供抗EphA2抗体及其应用具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了抗EphA2抗体及其应用。该特异性结合EphA2的抗体或其抗原结合部分能够诱导EphA2介导的抗肿瘤免疫应答，和/或抑制肿瘤生长和阿尔茨海默病和骨质疏松症等。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供特异性结合EphA2的抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区；
所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2或HCDR3序列中的任意一个或多个：
(I)、所述HCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.1、7或13所示的氨基酸序列；或
所述HCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.2、8或14所示的氨基酸序列；或
所述HCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.3、9或15所示的氨基酸序列；
或
(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分包含重链可变区；
所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2或HCDR3序列中的任意一个或多个：
(I-1)、所述HCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或
所述HCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或
所述HCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；
或
(II-1)、如(I-1)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I-1)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III-1)、与如(I-1)或(II-1)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列；或
(I-2)、所述HCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；或
所述HCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列；或
所述HCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.9所示的氨基酸序列；
或
(II-2)、如(I-2)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I-2)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III-2)、与如(I-2)或(II-2)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列；或
(I-3)、所述HCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.13所示的氨基酸序列；或
所述HCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.14所示的氨基酸序列；或
所述HCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.15所示的氨基酸序列；
或
(II-3)、如(I-3)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I-3)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III-3)、与如(I-3)或(II-3)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分还包含轻链可变区；
所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2或LCDR3序列中的任意一个或多个：
(I)、所述LCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.4、10或16所示的氨基酸序列；或
所述LCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.5、11或17所示的氨基酸序列；或
所述LCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.6、12或18所示的氨基酸序列；
或
(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分还包含轻链可变区；
所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2或LCDR3序列中的任意一个或多个：
(I-1)、所述LCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；或
所述LCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；或
所述LCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；
或
(II-1)、如(I-1)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I-1)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III-1)、与如(I-1)或(II-1)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列；或
(I-2)、所述LCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.10所示的氨基酸序列；或
所述LCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.11所示的氨基酸序列；或
所述LCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.12所示的氨基酸序列；
或
(II-2)、如(I-2)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I-2)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III-2)、与如(I-2)或(II-2)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列；或
(I-3)、所述LCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.16所示的氨基酸序列；或
所述LCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.17所示的氨基酸序列；或
所述LCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.18所示的氨基酸序列；
或
(II-3)、如(I-3)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I-3)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III-3)、与如(I-3)或(II-3)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2或HCDR3序列中的任意一个或多个：
(I)、所述HCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或
所述HCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或
所述HCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；
或
(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2或LCDR3序列中的任意一个或多个：
(IV)、所述LCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；或
所述LCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；或
所述LCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；
或
(V)、如(IV)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(IV)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(VI)、与如(IV)或(V)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2或HCDR3序列中的任意一个或多个：
(I)、所述HCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；或
所述HCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列；或
所述HCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.9所示的氨基酸序列；
或
(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2或LCDR3序列中的任意一个或多个：
(IV)、所述LCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.10所示的氨基酸序列；或
所述LCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.11所示的氨基酸序列；或
所述LCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.12所示的氨基酸序列；
或
(V)、如(IV)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(IV)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(VI)、与如(IV)或(V)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2或HCDR3序列中的任意一个或多个：
(I)、所述HCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.13所示的氨基酸序列；或
所述HCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.14所示的氨基酸序列；或
所述HCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.15所示的氨基酸序列；
或
(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2或LCDR3序列中的任意一个或多个：
(IV)、所述LCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.16所示的氨基酸序列；或
所述LCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.17所示的氨基酸序列；或
所述LCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.18所示的氨基酸序列；
或
(V)、如(IV)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(IV)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(VI)、与如(IV)或(V)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述抗原结合部分选自：Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv片段、Fd片段或单域抗体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述抗体为鼠源抗体，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示，和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.22所示；或
所述抗体为嵌合抗体，任选地，所述嵌合抗体包含氨基酸序列如SEQ ID No.20所示的重链，和/或氨基酸序列如SEQ ID No.23所示的轻链；或
所述抗体为人源化抗体，任选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.21所示，和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.24所示。
在本发明的一些具体实施方案中，所述EphA2为灵长类EphA2；优选的，所述灵长类EphA2选自人EphA2或猴EphA2。
在本发明的一些具体实施方案中，所述取代、缺失或添加一个或多个氨基酸中的多个为2个、3个、4个或5个。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分还包括恒定区，所述抗体或其抗原结合部分的重链的恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任意一种；所述抗体或其抗原结合部分的轻链的恒定区为κ型或λ型。
本发明还提供了所述抗体或其抗原结合部分、在制备预防和/或治疗EphA2相关疾病的药物中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述EphA2相关疾病为肿瘤、骨质疏松或阿尔茨海默症中的一种或多种；优选的，所述肿瘤选自以下胃癌、胰腺癌、肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和膀胱癌或上述肿瘤的转移瘤中的一种或多种。
本发明提供的特异性结合EphA2的抗体或其抗原结合部分能够诱导EphA2介导的抗肿瘤免疫应答，和/或抑制肿瘤生长和阿尔茨海默病和骨质疏松症等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示抗人EphA2杂交瘤抗体FACS筛选；
图2示候选克隆抗体与配体竞争结合FACS筛选；
图3示抗EphA2嵌合抗体克隆FACS鉴定；(A)13E4、1D6抗体与人源结肠癌细胞HCT116结合；(B)6D5抗体与人源结肠癌细胞HCT116结合；
图4(A)示抗EphA2人源化13E4抗体与人源肝癌细胞HepG2结合鉴定结果；图4(B)示抗EphA2人源化13E4抗体与人源肺癌细胞HCC827结合鉴定结果；图4(C)示抗EphA2人源化13E4抗体与人源乳腺癌细胞MDA-MB-231结合鉴定结果；
图5(A)示11D6与人/鼠EphA2蛋白结合活性鉴定；图5(B)示6D5与人/鼠EphA2蛋白结合活性鉴定；
图6示抗EphA2抗体6D5对破骨相关基因活性的影响。
具体实施方式
本发明公开了抗EphA2抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
定义
如本文所用的，术语“抗体”指包含四条多肽链，即通过双硫键互连的两条重链(H)及两条轻链(L)的免疫球蛋白分子，以及其多聚体(例如IgM)。各重链包含重链可变区(缩写为VH)及重链恒定区(缩写为CH)。重链恒定区包含三个域，即CH1、CH2及CH3。各轻链包含轻链可变区(缩写为VL)及轻链恒定区(缩写为CL)。轻链恒定区包含一个域(CL1)。VH及VL区可进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其中穿插有称为构架区(FR)的保守区。在一些实施方案中，从N-末端至C-末端，轻链与重链可变结构域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
如本文所用的，术语抗体的“抗原结合部分”是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区段。抗原结合部分可以包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)或上述两者。抗体的抗原结合部分可使用任何适合的标准技术从完整抗体分子制备，所述标准技术包括蛋白水解消化或重组遗传工程化技术等。抗原结合部分的非限制性实例包括：Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)分子、单域抗体、dAb片段及由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如分离的CDR)。术语“抗原结合部分”也包括其它工程化的分子，如双抗体、三抗体、四抗体及微型抗体等。例如，本文中所述Fd片段指由VH与CH1结构域组成的抗体片段；Fv片段由抗体的单臂中VL与VH结构域组成；dAb片段(Ward等人，Nature1989；341：544-546)由VH结构域组成。
本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即Kabat定义和Chothia定义，例如参见Kabat等人,“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，National Institutes of Health,Bethesda，MD.(1991)；Al-Lazikani等人，J Mol Biol 273:927-948(1997)；以及Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定VH和VL序列中CDR区序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR序列。在本文中，重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3分别简称为HCDR1、HCDR2及HCDR3；轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3分别简称为LCDR1、LCDR2及LCDR3。
对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中CDR区序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http://www.abysis.org/)。
如本文所用的，术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合，例如抗体以比其对非特异性抗原的亲和性大至少两倍的亲和性结合于特异性抗原的能力。然而应了解，抗体能够特异性结合两种或更多种与其序列相关的抗原。例如，本申请的抗体可特异性结合人EphA2。
如本文所用的，术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性(参见，美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
如本文所用的，术语“鼠源抗体”是指其中所有结构域序列均为小鼠序列的任何抗体。此类抗体可通过杂交瘤产生。
如本文所用的，术语“嵌合抗体”是指包含来自两种或更多种不同抗体的区段的抗体。在一些实施方案中，一个或多个CDR衍生自小鼠抗EphA2抗体。在另一些实施方案中，所有CDR均衍生自小鼠抗EphA2抗体。在一些实施方案中，在嵌合抗体中组合来自一种以上小鼠抗EphA2抗体的CDR。例如，嵌合抗体可包含来自第一种小鼠抗EphA2抗体中轻链的CDR1、来自第二种小鼠抗EphA2抗体中轻链的CDR2、与来自第三种小鼠抗EphA2抗体中轻链的CDR3，以及来自重链的CDR可衍生自一种或多种其它抗EphA2抗体。此外，构架区可来自相同抗EphA2抗体或来自一个或多个不同的个体。
如本文所用的，术语“人源化抗体”是指CDR移植抗体，具体是指将小鼠的CDR区序列移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。目的是克服嵌合抗体由于携带大量其他物种例如小鼠的蛋白成分从而在人体中诱导强烈的免疫副反应。
如本文所用的，术语“核酸分子”可以指DNA分子及RNA分子，其可以是单链或双链的。核酸分子也可以为cDNA。
如本文所用的，术语“EphA2相关疾病”包括与EphA2信号通路相关的疾病和/或病症。示例性EphA2相关疾病或病症包括肿瘤，癌例如胃癌、胰腺癌、肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和膀胱癌以及上述的转移癌及老年痴呆和骨质疏松症。
如本文所用的，术语“免疫反应”指脊椎动物内针对外来作用剂的生物反应，该反应保护生物体抵抗此类作用剂及由其引起的疾病。免疫反应系由免疫***的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞)及由此类细胞中的任一者或由肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子及补体)的作用介导，其导致选择性靶向、结合、损害、破坏和/或自脊椎动物身体消除侵入病原体、经病原体感染的细胞或组织、癌性或其他异常细胞或在自体免疫或病理炎症的情形下正常人类细胞或组织。免疫反应包括T细胞(例如效应T细胞)或Th细胞(例如CD4+或CD8+ T细胞)的活化或抑制或Treg细胞的抑制。
如本文所用的，术语“癌症”指以体内异常细胞不受控生长为特点的一大类疾病。失调的细胞***可形成侵袭相邻组织且可经由淋巴***或血流转移至身体的远处部分的恶性肿瘤或细胞。
如本文所用的，术语“治疗”指对受试者实施的任何类型的介入或方法或向其施用活性剂，其中目的是逆转、缓和、改善、抑制或缓解或预防症状、并发症、病况或与疾病相关的进展、发展、严重程度或复发。
如本文所用的，术语“预防”指对未患疾病的受试者施用，以防止疾病发生或使其影响(若存在)最小化。
本发明人筛选得到了三株杂交瘤细胞，其上清中的抗体能够与表达EphA2细胞结合。因此，本申请提供了三种能特异性结合EphA2的新型抗EphA2抗体或其抗原结合部分。本发明人还通过基因工程手段从鼠源抗EphA2抗体制备了嵌合抗体和人源化抗体形式，这些抗体能够与细胞表面表达的EphA2特异性结合，从而有效地诱导EphA2介导的免疫应答，并起到预防或治疗EphA2相关疾病的作用。
在第一方面，本申请提供了特异性结合EphA2的抗体或其抗原结合部分13E4克隆，其包含重链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列中的任意一项或多项，其中所述HCDR1序列为GYTFTSYWIQ(SEQ ID No.1)，所述HCDR2序列为YINPSTGYN ENSQKFKD(SEQ ID No.2)，所述HCDR3序列为RGTWGFAY(SEQ ID No.3)。
在优选的实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合部分的重链可变区包含SEQID No.1所示的HCDR1、SEQ ID No.2所示的HCDR2和SEQ ID No.3所示的HCDR3序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中的任意一项或多项，其中所述LCDR1序列为RASENINSYLT(SEQ ID No.4)，所述LCDR2序列为NAKTLAE(SEQ ID No.5)，所述LCDR3序列为QHHYVTPLT(SEQ ID No.6)。
在优选的实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合部分的轻链可变区包含SEQID No.4所示的LCDR1、SEQ ID No.5所示的LCDR2和SEQ ID No.6所示的LCDR3序列。
在优选的实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID No.1所示的HCDR1、SEQ ID No.2所示的HCDR2和SEQ ID No.3所示的HCDR3序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID No.4所示的LCDR1、SEQID No.5所示的LCDR2和SEQ ID No.6所示的LCDR3序列。
本申请提供了特异性结合EphA2的抗体或其抗原结合部分1D6克隆，其包含重链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列中的任意一项或多项，其中所述其中所述HCDR1序列为GYTFTSYWIQ(SEQ ID No.7)，所述HCDR2序列为IDPSDSYT(SEQ ID No.8)，所述HCDR3序列为ARGAY(SEQ ID No.9)。
在优选的实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合部分的重链可变区包含SEQID No.7所示的HCDR1、SEQ ID No.8所示的HCDR2和SEQ ID No.9所示的HCDR3序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中的任意一项或多项，其中所述LCDR1序列为RASENINSYLT(SEQ ID No.10)所述NAKTLAE(SEQ ID No.11)，所述LCDR3序列为QHHYVTPLT(SEQ ID No.12)。
在优选的实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合部分的轻链可变区包含SEQID No.10所示的LCDR1、SEQ ID No.11所示的LCDR2和SEQ ID No.12所示的LCDR3序列。
本申请提供了特异性结合EphA2的抗体或其抗原结合部分6D5克隆，其包含重链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列中的任意一项或多项，其中所述HCDR1序列为GFNIKDTY(SEQ ID No.13)，所述HCDR2序列为VDPANGKI(SEQ ID No.14)，所述HCDR3序列为AKHYGVTYAMDY(SEQ ID No.15)。
在优选的实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合部分的重链可变区包含SEQID No.13所示的HCDR1、SEQ ID No.14所示的HCDR2和SEQ ID No.15所示的HCDR3序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中的任意一项或多项，其中所述LCDR1序列为QGISNY(SEQ ID No.16)，所述YTS(SEQ ID No.17)，所述LCDR3序列为QHGDTLPT(SEQ ID No.18)。
在优选的实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合部分的轻链可变区包含SEQID No.16所示的LCDR1、SEQ ID No.17所示的LCDR2和SEQ ID No.18所示的LCDR3序列。
在一些更具体的实施方案中，本文公开的抗体可以为抗人EphA2单克隆抗体。抗EphA2抗体类型与亚型可由本领域已知的任何方式确定。通常，抗体类型与亚型可使用特异于特定抗体类型与亚型的抗体确定。可使用ELISA测定法测定抗EphA2抗体同种型，例如可使用鼠Ig吸附的抗人Ig鉴定人Ig。
在一些实施方案中，本文所述的抗体为鼠源抗体，优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示，和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.22所示。
在优选的实施方案中，本文所述的鼠源抗体包含SEQ ID No.20所示的重链可变区和SEQ ID No.23所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文所述的抗体为嵌合抗体。本文所述的嵌合抗体包含鼠源抗体的可变区(包括重链可变区VH和/或轻链可变区VL)和人抗体的恒定区。
在优选的实施方案中，本文所述的嵌合抗体包含鼠源抗体的可变区(包括重链可变区和轻链可变区)和人抗体的恒定区。
优选地，所述嵌合抗体包含SEQ ID No.21所示的重链，和/或SEQ ID No.24所示的轻链。
在优选的实施方案中，本文所述的嵌合抗体包含SEQ ID No.21所示的重链和SEQID No.24所示的轻链。
在一些实施方案中，本文所述的抗体为人源化抗体。本文所述的人源化抗体包含鼠源抗体的CDR区(包括HCDR1、HCDR2和HCDR3中的任意一项或多项和/或LCDR1、LCDR2和LCDR3中的任意一项或多项)、人抗体可变区的框架区(包括FR1、FR2、FR3和FR4中的任意一项或多项)，以及任选地人抗体的恒定区。
在优选的实施方案中，本文所述的人源化抗体包含鼠源抗体的CDR区(包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)、人抗体可变区的框架区(包括FR1、FR2、FR3和FR4)，以及任选地人抗体的恒定区。
优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示，和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.22所示。
在优选的实施方案中，本文所述的人源化抗体包含SEQ ID No.20所示的重链可变区和SEQ ID No.23所示的轻链可变区。
本文所述的抗体还可以包含鼠或人抗体恒定区。鼠抗体恒定区包括鼠IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3的重链恒定区以及κ或λ型轻链恒定区等。人抗体恒定区包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区以及κ或λ型轻链恒定区等。
在一些实施方案中，本文所述的EphA2为灵长类EphA2。优选地，本文所述的灵长类EphA2选自人EphA2或猴EphA2。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合部分选自：Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段或单域抗体。
本文所用的术语“Fab片段”包含轻链以及重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
本文所用的术语“Fab’段”含有轻链以及重链的部分或片段，所述部分或片段含有VH结构域和CH1结构域以及在CH1和CH2结构域之间的区域，使得在2个Fab’片段的两条重链之间可以形成链间二硫键，以形成F(ab')2分子。
本文所用的术语“F(ab')2片段”含有两条轻链和两条重链，所述重链含有在CH1和CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab')2片段因而由两个Fab'片段组成，而两个Fab'片段通过两条重链之间的二硫键连接在一起。
本文所用的术语“Fv片段”包含来自重链和轻链的可变区，但是缺少恒定区。
本文所用的术语“单链Fv”或“scFv”，是指包含抗体的VH结构域和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域以单一多肽链形式存在。通常，Fv多肽还包含VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，所述接头使scFv能够形成期望的结构以进行抗原结合。
本文所用的术语“单域抗体”指包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区的抗原结合部分。最初是在羊驼外周血液中发现的一种天然缺失轻链的抗体，该抗体虽然只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH晶体分子量只有15KDa，因此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)
本文公开的抗EphA2单克隆抗体的制备方法可包括：在表达条件下培养宿主细胞，从而表达抗EphA2单克隆抗体；分离和纯化表达的抗EphA2单克隆抗体。利用上述方法，可以获得粗抗EphA2单克隆抗体。然后通过纯化方法，包括基于EphA2的亲和纯化、非变性凝胶纯化、HPLC或RP-HPLC、分子排阻、在蛋白A柱上纯化、或这些技术的任何组合，将抗EphA2单克隆抗体纯化为基本均一物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。
本申请提供了第一方面所述的抗体或其抗原结合部分、第二方面所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗EphA2相关疾病的药物中的用途。
本文使用的术语“个体”是指哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫以及诸如大鼠和小鼠的啮齿类动物。优选地，哺乳动物为非人类的灵长类或者人类。特别优选的哺乳动物是人。本文使用的“个体”和“受试者”可以互换使用。
“治疗”既指治疗性处理，也指预防性或防止性的措施，其目的就是预防或减缓(减轻)目标病理状态或病症。需要治疗的个体包括那些已经存在所述病症的个体，还包括那些将发展为该病症的或欲对其病症进行预防的个体。因此，本文中欲被治疗的个体已经被诊断为患有该病症或倾向于或易患该病症。
在任一实施方案中，所述EphA2相关疾病为肿瘤、阿尔茨海默病和骨质疏松症。
在一些实施方案中，本文所述的肿瘤为原发性癌症或转移性癌症。在具体的实施方案中，肿瘤选自肺癌例如非小细胞肺癌、结直肠癌、膀胱癌、造血***癌症例如白血病、乳腺癌、胃癌、食管癌、B淋巴细胞型非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、间变大细胞淋巴瘤、头颈癌例如头颈部鳞状细胞癌、恶性胶质瘤、肾癌、黑色素瘤、***癌、骨癌、骨巨细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌、肉瘤、肝癌、皮肤鳞癌、甲状腺癌、***、鼻咽癌、子宫内膜癌，或上述肿瘤的转移癌。
应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。
本发明公开了特异性结合哺乳动物(人、灵长类动物等)EphA2的抗体，本发明提供此类蛋白质在治疗等方面的应用，如在癌症治疗中的用途。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的范围内。本领域技术人员能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明。
本发明提供的抗EphA2抗体及其应用中，所涉及的原料及试剂均可由市场购得。
以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。在不背离本申请精神和实质的情况下，对本申请方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因***到载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域具有普通技术的人员来说是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，例如参见Sambrook,J.,Fritsch,EF.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press。
本发明中，序列信息记载如下：
13E4 VH鼠源Sequence
Protein sequence
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(117aa)
QVQLLESGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWIQWVKQRPGQGLEWIGYINPSTGYNENSQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRGTWGFAYWGQGTLVTVSA
13E4 HCDR1序列为GYTFTSYWIQ(SEQ ID No.1)
13E4 HCDR2序列为YINPSTGYNENSQKFKD(SEQ ID No.2)
13E4 HCDR3序列为RGTWGFAY(SEQ ID No.3)
13E4 VL鼠源Sequence(Vκ)
Protein sequence
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(107aa)
DIVMTQTPASLSASVGETVTITCRASENINSYLTWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYVTPLTFGAGTKLELK
13E4 LCDR1序列为RASENINSYLT(SEQ ID No.4)，
13E4 LCDR2序列为NAKTLAE(SEQ ID No.5)，
13E4 LCDR3序列为QHHYVTPLT(SEQ ID No.6)
1D6 VH鼠源Sequence
DVQLLESGAELVNPGASVKISCKASGYTFTSYWLNWVKQRPGQGLEWIGDIDPSDSYTNKNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGAYWGQGTLVTVSA
1D6 HCDR1序列为GYTFTSYW(SEQ ID No.7)
1D6 HCDR2序列为IDPSDSYT(SEQ ID No.8)
1D6 HCDR3序列为ARGAY(SEQ ID No.9)
1D6 VL鼠源Sequence(Vκ)
DVVMTQSPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVCKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIK
1D6 LCDR1序列为QSLLDSDGKTY(SEQ ID No.10)
1D6 LCDR2序列为LVC(SEQ ID No.11)
1D6 LCDR3序列为WQGTHFPQT(SEQ ID No.12)
6D5 VH鼠源Sequence
EVQLLESGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYIHWVKLRPEQGLEWIGRVDPANGKIKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLHLSSLTSEDAAVFYCAKHYGVTYAMDYWGQGASVTVSS
6D5 HCDR1序列为GFNIKDTY(SEQ ID No.13)
6D5 HCDR2序列为VDPANGKI(SEQ ID No.14)
6D5 HCDR3序列为AKHYGVTYAMDY(SEQ ID No.15)
6D5 VL鼠源Sequence(Vκ)
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQGISNYLNWYQRKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQHGDTLPTFGGGTKLEMKKGDTPGISK
6D5 LCDR1序列为QGISNY(SEQ ID No.16)
6D5 LCDR2序列为YTS(SEQ ID No.17)
6D5 LCDR3序列为QHGDTLPT(SEQ ID No.18)
13E4 VH人源化Sequence
Protein sequence
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIQWVKQAPGQGLEWIGYINPSTGYNENSQKFKDRVTLTADKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGTWGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.19序列为GYTFTSYWIQ(SEQ ID No.19)
SEQ ID No.20序列为YINPSTGYNENSQKFKD(SEQ ID No.20)
SEQ ID No.21序列为RGTWGFAY(SEQ ID No.21)
13E4 VL人源化Sequence
Protein sequence
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENINSYLTWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYVTPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID No.22序列为RASENINSYLT(SEQ ID No.22)
SEQ ID No.23序列为NAKTLAE(SEQ ID No.23)
SEQ ID No.24序列为QHHYVTPLT(SEQ ID No.24)
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1.EphA2高表达细胞株的构建
通过稳定细胞株构建平台构建人EphA2的高表达细胞株，具体步骤如下：
质粒pEnter-EphA2-puromycin的构建：以EphA2 cDNA(通用生物***(安徽)有限公司)为模板，用引物扩增得到约3000bp的片段，胶回收；将pENTER质粒用KpnI/HindIII酶切，胶回收大片段7450bp；将上述所得的片段分别利用重组技术连接入胶回收的用KpnI/HindIII酶切的pENTER质粒大片段，挑阳性克隆送测序，测序正确的质粒分别命名为pEnter-EphA2-puromycin。
将293T细胞(协和细胞库)接种于T25培养瓶，每个培养瓶接种的细胞数为2×106。第二天将293T细胞培养液更换为4mL Opti-MEM(Thermofisher ScientificCat.31985070)。将EphA2的质粒pEnter-EphA2-puromycin 5μg加入到Opti-MEM中，终体积为500μL，另准备500μL Opti-MEM，并在其中加入7μL转染试剂PEI(3μg/mL)，将二者混匀并室温静置20min后，加入到上述培养好的4ml 293T细胞中。第三天将细胞培养液更换为5mLDMEM高糖培养基。第四天加入2μg/mL嘌呤霉素进行筛选。2-3天后细胞大量死亡，更换新鲜培养基至细胞稳定生长后，进行单克隆筛选，扩增培养并冻存保种。
本申请构建的稳定表达目的基因的细胞株命名为293T-EphA2细胞。所用蛋白序列源自公开发表的数据库。
实施例2.产生抗EphA2抗体的杂交瘤的制备
制备方法如下：
1.取8-10周Balb/c小鼠，皮下注射EphA2蛋白(50μg/剂/只)。人EphA2蛋白蛋白序列(XP_016856026.1)胞外区Glu28-Arg328，C末端含有His、Fc标签，分子量66kDa。在3-8周内，重复此剂量3次。进行融合前4天，给予小鼠腹腔注射EphA2蛋白，连续3天。
2.进行融合前1天，取昆明鼠腹腔内巨噬细胞作为滋养层，接种于96孔板中。
3.取来自经免疫接种的小鼠的脾与非分泌性骨髓瘤SP2/0细胞系融合，将细胞加入到提前铺有滋养层的96孔板中，对融合的细胞进行HAT选择(Galfre and Milstein,Methods Enzymol 1981；73:3-46)。
4.回收一组分泌抗EphA2特异性抗体的杂交瘤细胞。初次筛选利用酶联免疫分析法(ELISA)确定杂交瘤分泌的抗EphA2抗体的滴度。
抗EphA2杂交瘤复筛(FACS)
复筛方法1如下：
收集293T-EphA2细胞，用PBS缓冲液洗涤一次，以2×105个/孔细胞铺到96孔深孔板，每孔加入50μL杂交瘤上清，孵育1个小时。
每孔加入400μl FACS缓冲液洗涤两次，加入APC抗小鼠IgG Fc二抗(Biolegend，Cat405308)，孵育1小时后上流式细胞仪检测。
结果如表1、图1所示，获得5个候选抗体，克隆号为1D6、6H3、6D5、13A6、13E4。
表1抗人EphA2杂交瘤抗体筛选
Figure BDA0003125746430000131
Figure BDA0003125746430000141
复筛方法2如下：
收集293T-EphA2EphrinA1细胞，用PBS缓冲液洗涤一次，以2×105个/孔细胞铺到96孔深孔板，每孔加入50μL杂交瘤上清，同时加入重组EphrinA1-hFc配体蛋白，进行配体竞争结合，设置不加杂交瘤上清的阳性对照和空白、二抗对照，孵育1h。
每孔加入400μl FACS缓冲液洗涤两次，加入APC抗人IgG Fc二抗(Biolegend，Cat405308)，孵育1小时后上流式细胞仪检测。
表2候选克隆抗体配体竞争结合筛选结果
初始杂交瘤克隆号 293T-EphA2细胞结合活性
二抗 1,988
EphrinA1蛋白 227,994
13E4+EphrinA1蛋白 22,614
1D6+EphrinA1蛋白 189,106
6D5+EphrinA1蛋白 166,373
6H3+EphrinA1蛋白 171,080
结果如表2图2所示，杂交瘤细胞13E4，该克隆上清中的抗体能特异阻断配体293T-EphA2与EphrinA1蛋白的结合，表明该杂交瘤细胞分泌的抗EphA2抗体是一种阻断型抗体，1D6、6H3和6D5为亲合非阻断抗体。
实施例3.抗EphA2嵌合抗体和人EphA2阳性细胞的结合活性(FACS检测)
抗EphA2嵌合抗体的制备
获取13E4、1D6、6D5杂交瘤细胞cDNA，用本实验室保存的抗体引物通过PCR扩增测序，最终获得鼠源抗EphA2抗体重链编码VH-13E4、VH-1D6、VH-6D5以及相应的抗体轻链编码VL-13E4、VL-1D6、VL-6D5的核苷酸序列。抗EphA2抗体的轻重链编码核酸序列通过全合成的方式构建成质粒pUC57 EphA2 VH-13E4、pUC57 EphA2 VL-13E4、pUC57 EphA2 VH-1D6、pUC57 EphA2 VL-1D6、和pUC57 EphA2 VH-6D5、pUC57 EphA2 VL-6D5(通用生物***(安徽)有限公司)，分别以相应的pUC57 EphA2 VH、pUC57EphA2 VL为模板，使用金牌Mix PCR试剂盒(TSINGKE公司)，按照试剂盒的说明书，扩增抗EphA2 VH、EphA2 VL片段，其扩增产物大小约为0.4kb；同时以限制性内切酶SapI(NEB,R0569S)对载体质粒pQKX1和pQKX2(通用生物***(安徽)有限公司)进行酶切，将所得的PCR扩增产物和酶切载体以BM无缝克隆试剂盒(博迈德公司)，按照试剂盒的说明书，进行重组连接以获得重链表达载体pQK EphA2 H-13E4、pQK EphA2 L-13E4、pQK EphA2 H-1D6、pQK EphA2 L-1D6、pQK EphA2 H-6D5、pQK EphA2 L-6D5。
将293Fv细胞(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)稀释到1.5×106个细胞/mL，终体积为200ml，37℃摇床培养24h。用转染体积10％的新鲜培养基稀释配对质粒pQK EphA2 H和pQK EphA2 L，按转染细胞体积计算，至浓度为1μg/mL。向稀释后质粒中按细胞体积的1/1000加入3mg/mL的PEI 200μl，立即涡旋震荡10秒，室温放置15分钟，将质粒/PEI混合物滴加到细胞培养基中，边滴加边轻轻摇动培养瓶，放入摇床培养，7天后收集培养上清，使用Mab sure Lx 5ml纯化柱从培养上清中捕获抗体，流速设定为3ml/min，用5个柱体积的20mM PB+150mM Nacl,pH7.4平衡液平衡纯化柱，柱平衡稳定后上样，上样结束选择20mM PB+150mM Nacl,pH7.4淋洗，淋洗结束使用50mM柠檬酸pH3.0洗脱液进行洗脱，收集用1M Tris-Hcl,pH9.0中和洗脱的抗体。
收集一个T75细胞培养瓶的人结肠癌细胞株HCT116，FACS缓冲液洗涤一次，用FACS缓冲液重悬计数，调整细胞浓度为1×106；稀释抗体，终浓度为10μg/ml，取10μL稀释后的各抗体10μg分别加入上述调整浓度后的细胞样品100μL，混匀，室温孵育1小时。
每孔加入400μl FACS缓冲液洗涤两次，人源化抗体组加入APC抗人IgG Fc二抗，孵育1小时，上流式细胞仪检测，结果见表3和图3。表5的结果表明抗嵌合1D6、6D5和13E4均肿瘤细胞株HCT116特异性结合。
表3抗EphA2嵌合抗体13E4、1D6和6D5细胞结活性
Figure BDA0003125746430000151
实施例4.抗EphA2人源化抗体13E4和人EphA2阳性细胞的结合活性(FACS检测)
抗EphA2人源化抗体13E4克隆的制备
抗EphA2人源化抗体编码VH和VL核苷酸序列由上海奥浦迈生物科技有限公司提供序列优化服务。其中抗EphA2抗体的VH3、VL12编码核酸序列通过全合成的方式构建成质粒pUC57 EphA2 VH3和pUC57 EphA2 VL1中，分别以pUC57 EphA2 VH3和pUC57 EphA2 VL1为模板，使用金牌Mix PCR试剂盒，按照试剂盒的说明书，扩增抗EphA2 VH3和EphA2 VL1片段，其扩增产物大小约为0.4kb；同时以限制性内切酶SapI(NEB,R0569S)对载体质粒pQKX1和pQKX2进行酶切，将所得的PCR扩增产物和酶切载体以BM无缝克隆试剂盒(博迈德公司)，按照试剂盒的说明书，进行重组连接以获得重链表达载体pQK EphA2 H3和pQK EphA2 L1。
将293Fv细胞稀释到1.5×106个细胞/mL，终体积为200ml，37℃摇床培养24h。用转染体积10％的新鲜培养基稀释质粒pQK EphA2 H3和pQK EphA2 L1，按转染细胞体积计算，至浓度为1μg/mL。向稀释后质粒中按细胞体积的1/1000加入3mg/mL的PEI 200μl，立即涡旋震荡10秒，室温放置15分钟，将质粒/PEI混合物滴加到细胞培养基中，放入摇床培养，7天后收集培养上清，使用Mab sure Lx 5ml纯化柱从培养上清中捕获抗体，流速设定为3ml/min，20mM PB+150mM Nacl,pH7.4平衡液平衡纯化柱，柱平衡稳定后上样，上样结束选择20mM PB+150mM Nacl,pH7.4淋洗，淋洗结束使用50mM柠檬酸pH3.0洗脱液进行洗脱，收集用1MTris-Hcl,pH9.0中和洗脱抗体。
收集一个T75细胞培养瓶的人肝癌细胞株HepG2，非小细胞肺癌细胞株HCC827和乳腺癌细胞株MDA-MB-231，FACS缓冲液洗涤一次，用FACS缓冲液重悬计数，调整细胞浓度为1×106；稀释抗体，终浓度为10μg/ml，细胞样品100μL，混匀。设配体EphrinA1-Fc重组蛋白为阳性对照，室温孵育1h。
每孔加入400μl FACS缓冲液洗涤两次，加入APC抗人IgG Fc二抗，孵育1h，上流式细胞仪检测，结果见表4和图4。表4的结果表明抗EphA2人源化抗体和对照配体蛋白EphrinA1-Fc均与各肿瘤细胞株特异性结合，并且抗EphA2人源化抗体的峰图与配体重组蛋白基本相同。
表4人源化13E4抗体和人EphA2阳性细胞结合活性
Figure BDA0003125746430000152
Figure BDA0003125746430000161
实施例5.抗EphA2抗体1D6、6D5与小鼠EphA2蛋白结合活性检测(Fortebio)
人EphA2-his-Fc蛋白由专利申请单位制备，小鼠EphA2-his蛋白购自北京义翘神州生物技术有限公司(SinoBiological,Cat:50586-M08H)。蛋白结合活性检测采用仪器为fortebio分子相互作用仪。抗原所带标签为His，选择Ni-NTA传感器固定抗原，工作浓度为10μg/mlL
，洗涤后结合抗体鼠抗人EphA2抗体1D6、6D5抗体，工作浓度100nM。观察结合/解离曲线，利用仪器自有程序分析蛋白结合活性。结果见表5、图5。结果表明，1D6和6D5抗体均与人源EphA2蛋白结合，1D6抗体不结合鼠源EphA2蛋白，6D5抗体结合鼠源EphA2蛋白，其KD值为6.00E-08。
表5.抗人EphA2抗体与小鼠抗原的结合活性检测
Figure BDA0003125746430000162
实施例6.抗EphA2抗体6D5抑制破骨细胞相关基因活性检测
鼠破骨细胞购自普诺赛公司(Procell,Cat:CP-M088)公司，常规培养于破骨细胞完全培养基(Procell Cat NO.CM-M088)。
收集一个T75培养瓶细胞，弃去培养皿内培养基，加入PBS清洗细胞一次，加入一定量的胰酶在37℃进行消化，待细胞开始变松散后加入血清及时终止消化，轻柔吹打细胞，将细胞收集到15ml离心管内，离心弃去上清。破骨细胞完全培养基调整细胞密度为1.5x105/ml，接种破骨细胞至6孔板，每孔2ml。
加入鼠源抗EphA2-6D5抗体，终浓度为10μg/ml，同时设置同型对照抗体作为阴性对照。抗体作用24h后，弃去上清，加入1ml Trizol，裂解细胞，氯仿/异丙醇分离提纯RNA，用无Rnase酶的水溶解RNA。取1μg，采用随机引物/逆转录酶反转录成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增，获得与破骨活性相关的基因Trap、Ctsk、Mmp9和Clc7表达丰度，结果见表6、图6。表6结果表明抗EphA2-6D5抗体和对照抗体相比，可降低破骨活性基因的表达丰度，抑制破骨细胞的功能。
表6.抗EphA2抗体对破骨相关基因活性的影响
Figure BDA0003125746430000163
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京免疫方舟医药科技有限公司
<120> 抗EphA2抗体及其应用
<130> MP2036248
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gln
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Asn Glu Asn Ser Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Gly Thr Trp Gly Phe Ala Tyr
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asn Ser Tyr Leu Thr
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln His His Tyr Val Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr
1 5
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ala Arg Gly Ala Tyr
1 5
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Leu Val Cys
1
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Val Asp Pro Ala Asn Gly Lys Ile
1 5
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Ala Lys His Tyr Gly Val Thr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 17
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Tyr Thr Ser
1
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gln His Gly Asp Thr Leu Pro Thr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gln
1 5 10
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Asn Glu Asn Ser Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Arg Gly Thr Trp Gly Phe Ala Tyr
1 5
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asn Ser Tyr Leu Thr
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gln His His Tyr Val Thr Pro Leu Thr
1 5

Claims (15)

1.特异性结合EphA2的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，包含重链可变区；
所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2或HCDR3序列中的任意一个或多个：
(I)、所述HCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.1、7或13所示的氨基酸序列；或
所述HCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.2、8或14所示的氨基酸序列；或
所述HCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.3、9或15所示的氨基酸序列；
或
(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，包含重链可变区；
所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2或HCDR3序列中的任意一个或多个：
(I-1)、所述HCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或
所述HCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或
所述HCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；
或
(II-1)、如(I-1)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I-1)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III-1)、与如(I-1)或(II-1)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列；或
(I-2)、所述HCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；或
所述HCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列；或
所述HCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.9所示的氨基酸序列；
或
(II-2)、如(I-2)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I-2)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III-2)、与如(I-2)或(II-2)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列；或
(I-3)、所述HCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.13所示的氨基酸序列；或
所述HCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.14所示的氨基酸序列；或
所述HCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.15所示的氨基酸序列；
或
(II-3)、如(I-3)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I-3)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III-3)、与如(I-3)或(II-3)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，还包含轻链可变区；
所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2或LCDR3序列中的任意一个或多个：
(I)、所述LCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.4、10或16所示的氨基酸序列；或
所述LCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.5、11或17所示的氨基酸序列；或
所述LCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.6、12或18所示的氨基酸序列；
或
(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。
4.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2或LCDR3序列中的任意一个或多个：
(I-1)、所述LCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；或
所述LCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；或
所述LCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；
或
(II-1)、如(I-1)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I-1)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III-1)、与如(I-1)或(II-1)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列；或
(I-2)、所述LCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.10所示的氨基酸序列；或
所述LCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.11所示的氨基酸序列；或
所述LCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.12所示的氨基酸序列；
或
(II-2)、如(I-2)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I-2)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III-2)、与如(I-2)或(II-2)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列；或
(I-3)、所述LCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.16所示的氨基酸序列；或
所述LCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.17所示的氨基酸序列；或
所述LCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.18所示的氨基酸序列；
或
(II-3)、如(I-3)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I-3)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III-3)、与如(I-3)或(II-3)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。
5.如权利要求1至4任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，包含重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2或HCDR3序列中的任意一个或多个：
(I)、所述HCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或
所述HCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或
所述HCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；
或
(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2或LCDR3序列中的任意一个或多个：
(IV)、所述LCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；或
所述LCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；或
所述LCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；
或
(V)、如(IV)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(IV)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(VI)、与如(IV)或(V)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求1至4任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，包含重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2或HCDR3序列中的任意一个或多个：
(I)、所述HCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；或
所述HCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列；或
所述HCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.9所示的氨基酸序列；
或
(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2或LCDR3序列中的任意一个或多个：
(IV)、所述LCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.10所示的氨基酸序列；或
所述LCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.11所示的氨基酸序列；或
所述LCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.12所示的氨基酸序列；
或
(V)、如(IV)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(IV)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(VI)、与如(IV)或(V)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。
7.如权利要求1至4任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，包含重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2或HCDR3序列中的任意一个或多个：
(I)、所述HCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.13所示的氨基酸序列；或
所述HCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.14所示的氨基酸序列；或
所述HCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.15所示的氨基酸序列；
或
(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2或LCDR3序列中的任意一个或多个：
(IV)、所述LCDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID No.16所示的氨基酸序列；或
所述LCDR2的氨基酸序列具有如SEQ ID No.17所示的氨基酸序列；或
所述LCDR3的氨基酸序列具有如SEQ ID No.18所示的氨基酸序列；
或
(V)、如(IV)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(IV)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(VI)、与如(IV)或(V)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。
8.如权利要求1至7任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗原结合部分选自：Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv片段、Fd片段或单域抗体。
9.如权利要求1至8任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体为鼠源抗体，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示，和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.22所示；或
所述抗体为嵌合抗体，任选地，所述嵌合抗体包含氨基酸序列如SEQ ID No.20所示的重链，和/或氨基酸序列如SEQ ID No.23所示的轻链；或
所述抗体为人源化抗体，任选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.21所示，和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.24所示。
10.如权利要求1至9任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述EphA2为灵长类EphA2；优选的，所述灵长类EphA2选自人EphA2或猴EphA2。
11.如权利要求1至10任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述取代、缺失或添加一个或多个氨基酸中的多个为2个、3个、4个或5个。
12.如权利要求1～11任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，还包括恒定区，所述抗体或其抗原结合部分的重链的恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任意一种；所述抗体或其抗原结合部分的轻链的恒定区为κ型或λ型。
13.如权利要求1～12任一项所述的抗体或其抗原结合部分在制备预防和/或治疗EphA2相关疾病的药物中的应用。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述EphA2相关疾病为肿瘤、骨质疏松或阿尔茨海默症中的一种或多种；优选的，所述肿瘤选自以下胃癌、胰腺癌、肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和膀胱癌或上述肿瘤的转移瘤中的一种或多种。
15.药物，其特征在于，包括如权利要求1～12任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
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