JP2014502599A - チオセミカルバゾン化合物および癌の治療における使用 - Google Patents

チオセミカルバゾン化合物および癌の治療における使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、Ｒ１がシクロへキシルまたはエチルである式（Ｉ）のジピリジルチオセミカルバゾン化合物；ならびにこれらの化合物を含有する医薬組成物および癌の治療におけるこれらの化合物および組成物の使用に関する。
【化１】

Description

本願は、全内容が相互参照により本明細書によって組み込まれる、２０１０年１２月１７日出願のオーストラリア特許仮出願第２０１０９０５５３９号からの優先権を主張する。
技術分野
本発明は、チオセミカルバゾン化合物および治療におけるそれらの使用に関する。とりわけ、本発明は、ジピリジルチオセミカルバゾン化合物の選択、これらの化合物を含有する医薬組成物および癌の治療でのこれらの化合物および組成物の使用に関する。
背景技術
チオセミカルバゾン鉄キレート剤は、インビトロおよびインビボの両方で多くの様々な新生物に対して非常に効力が強く、選択的であることが分かっている抗癌剤類である。これらの化合物は、癌細胞においてＤＮＡ合成に対する必須元素である鉄を標的とすることにより機能する。鉄キレート剤は最初、β−サラセミアなどの鉄過剰性疾患に対して開発されたものであり、キレート剤デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）がこの疾患に対して最も広く使用される治療剤である。しかし、神経芽細胞腫に対してＤＦＯを試験する臨床治験から、この薬剤が一部の患者においてこの癌の進行を抑制するのに効果的であったことが分かった。これらの初期研究において、抗癌剤としての鉄キレート剤の可能性が初めて確認された。それ以来、癌治療用に特別に設計された鉄キレート剤が開発されており、チオセミカルバゾン鉄キレート剤３−アミノピリジン−２−カルボキサルデヒドチオセミカルバゾン（トリアピン（登録商標））（Vion Pharmaceuticals,アメリカ合衆国コネチカット州ニューヘブン（New Haven CT））が多くのフェーズＩおよびＩＩ臨床治験に入っている。
チオセミカルバゾン鉄キレート剤は、鉄および銅を結合させ、レドックス活性錯体を形成させることにより機能し、癌細胞毒性を誘導する反応性酸素種（ＲＯＳ）生成へと導く。開発された、現在までで最も活性が高い化合物の１つは、チオセミカルバゾン類の鉄キレート剤、ジ−２−ピリジルケトン４，４−ジメチル−３−チオセミカルバゾン（本明細書中でＤｐ４４ｍＴと略称）であり、これは国際公開第２００４／０６９８０１号に記載されている。Ｄｐ４４ｍＴは、インビトロおよびインビボで多くの様々な腫瘍の成長を著しくおよび顕著に抑制することが明らかになっており、トリアピン（登録商標）よりも強力で毒性が少ないことが分かった。しかし、高い非最適用量のＤｐ４４ｍＴを用いた実験から、ヌードマウスにおいて心臓毒性を幾分誘導したことが分かった。
チオセミカルバゾン化合物は、転移抑制因子、ＮＤＲＧ１を標的とする。ＮＤＲＧ１は、成長および転移の両方ならびにインビボでの膵臓癌の血管形成を阻害し、腫瘍進行抑制へとつながる。さらに、ＮＤＲＧ１はまた、最近、膵臓癌の分化促進と関連付けられており、膵臓癌に対する有望な治療標的としてのその可能性が報告されている（例えばKovacevic, Z.およびD. R. Richardson (2006年). Carcinogenesis 27:2355-66、Maruyama, Y., M. Onoら. (2006年). Cancer Res 66:6233-42）。ＮＤＲＧ１は、ＮＤＲＧ１に反応して上方制御される、腫瘍抑制因子、ＰＴＥＮおよびＳＭＡＤ４を含め、膵臓癌において重要な多くの分子標的を有する。したがって、ＮＤＲＧ１は、特に、膵臓癌の治療のための、有望な治療標的であり得る。ＮＤＲＧ１は最近、インビトロおよびインビボにおいて、鉄−キレート抗癌剤を用いて上方制御されることが分かった。鉄キレート剤は、低酸素誘導性転写因子（ＨＩＦ−１）依存性の機構を介してＮＤＲＧ１発現を向上させたが、ＨＩＦ−１とは独立した経路も認められている。したがって、鉄キレート抗癌剤により、鉄の枯渇によって、癌細胞においてＮＤＲＧ１発現を標的とするための重要な機会が与えられる。
癌に対する新規の代替的な治療が必要とされている。本発明は、有利に細胞増殖を阻害し、癌の治療に有用であり得る、チオセミカルバゾン化合物の選択を対象とする。
発明の概要
一態様において、本発明は、一般式（Ｉ）のチオセミカルバゾン化合物：
Figure 2014502599
（式中、Ｒ１はシクロへキシルまたはエチルである。）；
およびそれらの塩、水和物および溶媒和物に関する。
好ましい実施形態において、本発明は、化合物ジ−２−ピリジルケトン４−エチル−４−メチル−３−チオセミカルバゾン（本明細書中でＤｐ４ｅ４ｍＴと略称）およびそれらの塩、水和物および溶媒和物に関する。
別の好ましい実施形態において、本発明は、化合物ジ−２−ピリジルケトン４−シクロへキシル−４−メチル−３−チオセミカルバゾン（本明細書中でＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴと略称）、それらの塩、水和物および溶媒和物に関する。
好ましい実施形態において、この塩とは、薬学的に許容可能な塩である。塩酸塩などの酸付加塩は、本発明の特に好ましい実施形態である。
別の態様において、本発明は、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤またはアジュバントと共に式（Ｉ）の化合物またはそれらの塩、水和物もしくは溶媒和物を含む医薬組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、癌の治療を必要とする哺乳動物に、有効量の、式（Ｉ）の化合物またはそれらの塩、水和物もしくは溶媒和物またはその医薬組成物を投与することを含む、哺乳動物において癌を治療する方法に関する。好ましい実施形態において、哺乳動物はヒトである。
別の態様において、本発明は、癌の治療のための薬剤の製造における、式（Ｉ）の化合物またはそれらの塩、水和物もしくは溶媒和物の使用に関する。
さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療のための、式（Ｉ）の化合物またはそれらの塩、水和物もしくは溶媒和物またはそれらの医薬組成物に関する。
本発明の化合物は、メラノーマ、皮膚癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、肝臓癌、消化管癌、結腸直腸癌、脳腫瘍、頭頸部癌、骨癌、膵臓癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌ならびに血液系腫瘍（例えば白血病およびリンパ腫）を含むがこれらに限定されない、固形および非固形腫瘍を含む、多岐にわたる癌の治療に有用である。好ましい実施形態において、癌は、膵臓癌、肺癌および脳腫瘍から選択される。特に好ましい実施形態において、癌は膵臓癌である。他の特に好ましい実施形態において、癌は肺癌である。他の好ましい実施形態において、癌は脳腫瘍である。好ましい実施形態において、本発明の化合物は、固形腫瘍の治療に有用である。他の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、非固形腫瘍の治療に有用である。
本明細書中で開示される本発明の他の実施形態は、有効量の式（Ｉ）の化合物またはそれらの塩、水和物もしくは溶媒和物と１つ以上の細胞とを接触させることを含む、細胞増殖を阻害する方法を対象とする。この細胞はインビトロまたはインビボであり得る。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞である。
本願を通じて、文脈から別段の要求がない限り、「含む（comprise）」という用語または「含む（comprises）」または「含んでいる（comprising）」などの変形形態は、規定される要素、整数もしくは段階または、要素、整数もしくは段階の群を含むが、何らかの他の要素、整数もしくは段階または、要素、整数もしくは段階の群を除外するものではないことを示すと理解される。したがって、本願の文脈において、「含んでいる（comprising）」という用語は、「基本的に含むが、必ずしもそれらだけではない」ことを意味する。
本願に含まれている、文献、行為、材料、装置、論文などの何れの考察も、本発明に対する内容を提供する目的であるにすぎない。これは、オーストラリア内外で、本願の各請求の優先日前に、これらの事項の何れかまたは全てが先行技術基準の一部を形成するかまたは、本発明に関連する技術分野における一般的知識であったことを受け入れるものとみなされるべきものではない。
Ａ．化合物Ｄｐ４ｅ４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴの構造式。Ｂ．Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴに対する一般合成スキーム。 ＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫に対するＤｐ４ｅ４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴの抗増殖活性。 膵臓癌細胞株に対するＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴの抗増殖活性。 ＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞における鉄排出（Ａ）および鉄取り込み（Ｂ）実験。 ヌードマウスにおけるＤＭＳ−５３肺癌の成長。４Ｄｐ４ｅ４ｍＴ ｉ．ｖ投与実験。 ヌードマウスにおけるＤＭＳ−５３肺癌の成長。Ｄｐ４ｅ４ｍＴ ｉ．ｖ投与実験：心臓繊維症の評価。 ヌードマウスにおけるＤＭＳ−５３肺癌の成長。Ｄｐ４ｅ４ｍＴ経口投与実験：Ａ．処置日数に対する腫瘍サイズ。Ｂ．腫瘍重量。 ヌードマウスにおけるＤＭＳ−５３肺癌。Ｄｐ４ｅ４ｍＴ経口投与実験：心臓、脾臓、肝臓の組織学的分析。 ヌードマウスにおけるＰＡＮＣ１膵臓癌の成長。Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ ｉ．ｖ投与実験：Ａ．処置日数に対する腫瘍サイズ。Ｂ．腫瘍重量。Ｃ．代表的腫瘍の写真。 ヌードマウスにおけるＰＡＮＣ１膵臓癌の成長。Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ ｉ．ｖ投与実験：心臓、脾臓、肝臓の組織学的分析。 ヌードマウスにおけるＰＡＮＣ１膵臓癌の成長。Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ ｉ．ｖ投与実験：ＮＤＲＧ−１、ＴｆＲおよび細胞周期分子におけるＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴの影響。 インビトロでのｍｅｔＨｂ形成におけるＤＦＯおよびチオセミカルバゾンキレート剤の影響。１〜２５μＭのキレート剤とともに、３７℃で３時間、全ＲＢＣを温置した。超純水を用いて細胞を溶解し、分光光度計によりｍｅｔＨｂレベルを測定した。結果は、３回の実験からの平均±ＳＤである。 インビボでのｍｅｔＨｂ形成におけるチオセミカルバゾンキレート剤の影響。インビボでの、６ｍｇ／ｋｇ用量での尾静脈を介した静脈内投与によるＤｐ４４ｍＴ、トリアピン（登録商標）またはＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ処理後のＭｅｔＨｂ。対照群のマウスはビヒクルのみで処置した。ｍｅｔＨｂレベルの測定のために、投与から３０分後、全血を回収した。 インビボでのｍｅｔＭｂ形成における、チオセミカルバゾンキレート剤の影響。６ｍｇ／ｋｇ用量での尾静脈を介した静脈内投与によるインビボでのＤｐ４４ｍＴトリアピン（登録商標）またはＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ処置後のｍｅｔＭｂレベル。対照群のマウスはビヒクルのみで処置した。ｍｅｔＭｂレベルの測定のために、投与から３０分後、心臓全体を摘出した。
定義
以下のものは、本発明の記載を理解する上で一助となり得るいくつかの定義である。これらは、一般的な定義であり、本発明の範囲をこれらの用語のみに限定するものではないが、次の記載のより良好な理解のために提示する。
文脈から別段の要求がない限り、または具体的な別段の記載がない限り、単数の整数、段階または要素として本明細書中で引用される本発明の整数、段階または要素は、引用される整数、段階または要素の単数および複数形の両方を明確に包含する。
本明細書中に記載の発明が、具体的に記載されるものの他に変更形態および変形形態を含む余地があることを当業者ならば理解するであろう。本発明が全てのこのような変更形態および変形形態を含むことを理解されたい。本発明はまた、本願で言及されるかまたは示される、段階、特性、組成物および化合物を全て、個々にまたはまとめて、およびこれらの段階、特性、組成物および化合物の２つ以上のありとあらゆる組み合わせを含む。
式（Ｉ）の化合物は、鉄（Ｆｅ（ＩＩ）およびＦｅ（ＩＩＩ））など、遷移金属イオンをキレートすることができる三座リガンドである。したがって、この明細書を通じて、本発明の化合物は、「リガンド」、「キレート剤」または「鉄キレート剤」と呼ばれ得る。本願を通じて、本発明の「化合物」または「キレート剤」または「リガンド」への言及は、式（Ｉ）の化合物への言及であり、別段の明確な断りがない限り、それらの塩、水和物および溶媒和物が含まれる。
本発明は、その範囲内に、全てのジアステレオ異性体（シス／トランス異性体を含む。）、ラセミ体および鏡像異性体を含め、本明細書中で開示される、式（Ｉ）の化合物の全ての異性体型およびそれらの塩、水和物および溶媒和物を含む。
本願の文脈において、「投与すること（administering）」および、「投与する（administer）」および「投与（administration）」を含むこの語の変化形は、本発明の化合物または組成物を生物、哺乳動物、または表面と、何らかの好適な手段によって、接触させるか、それに適用するか、送達するかまたは提供することを含む。
本願の文脈において、「哺乳動物」という用語は、ヒトおよび、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）、げっ歯類、マウス、ヤギ、ウサギおよび鳥類に属するものを含むがこれらに限定されない、社会的に、経済的にまたは研究において重要な何らかの種の個体を含む。好ましい実施形態において、哺乳動物はヒトである。
本願の文脈において、「治療」という用語は、何であれ、疾患状態または症状を改善するか、疾患の確立を予防するかまたは、そうでなければ、疾患もしくは他の望ましくない症状の進行を予防するか、妨げるか、遅延させるかまたは回復に向かわせる、ありとあらゆる使用を指す。したがって、疑義を避けるために、本明細書中での「治療」への言及は、治癒的な、一時的な緩和である、および予防的な処置への言及を含む。
本願の文脈において、「有効量」という用語は、その意味の範囲内に、本発明の化合物または組成物の、所望の治療効果をもたらすのに十分ではあるが無毒性である量を含む。必要とされる正確な量は、治療を受ける種、対象の年齢および全身状態、治療する状態の重症度、投与する特定の薬剤、投与形式などの因子に依存して、対象ごとに異なる。したがって、正確な「有効量」を特定することはできない。しかし、いかなる場合に対しても、好適な「有効量」は、通常の実験のみを使用して当業者により決定され得る。
本発明の実施形態の詳細な説明
本発明は、抗増殖特性を有し、したがって、癌の治療において有用であり得るチオセミカルバゾン化合物の選択を対象とする。特に、本発明は、一般式（Ｉ）のチオセミカルバゾン化合物：
Figure 2014502599
（式中、Ｒ１はシクロへキシルまたはエチルである。）；
およびそれらの塩、水和物および溶媒和物に関する。
とりわけ、本発明は、ジ−２−ピリジルケトン４−エチル−４−メチル−３−チオセミカルバゾン（Ｄｐ４ｅ４ｍＴ）およびジ−２−ピリジルケトン４−シクロへキシル−４−メチル−３−チオセミカルバゾン（Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ）ならびにそれらの塩、水和物および溶媒和物に関する：
Figure 2014502599
本発明による化合物は鉄キレート剤であり、Ｆｅ（ＩＩ）およびＦｅ（ＩＩＩ）をキレートすることができる。したがって、式（Ｉ）の化合物の鉄錯体（すなわちＦｅ（ＩＩ）およびＦｅ（ＩＩＩ）錯体）も本発明により包含される。
例えば、Advanced Organic Chemistry, 4th Ed (John WileyおよびSons,ニューヨーク1992年)ならびにVogel's Textbook of Practical Organic Chemistry, 5th Ed (John WileyおよびSons,ニューヨーク,1989年)などに記載のような、ケトンを用いたイミンのシッフ塩基縮合を含め、当業者にとって公知の方法によって、本発明による式（Ｉ）の化合物またはそれらの塩、水和物もしくは溶媒和物を調製し得る。
式（Ｉ）の化合物を調製するための代表的な一般的合成スキームは下記スキーム１で示す：
Figure 2014502599
第一段階は、二硫化炭素との二級アミン（ＮＨＲａＲｂ）の反応からのカルボキシメチルジチオカルバメートの形成を含む。二級アミンのＲａおよびＲｂ基は、同じでも、または異なっていてもよく、直鎖状または環状Ｃ１〜６アルキルであり得る。本発明の好ましい実施形態において、スキーム１によると、Ｒａはメチルであり、Ｒｂはエチルまたはシクロへキシルである。好適な酢酸塩の例としては、クロロ酢酸塩およびブロモ酢酸塩が挙げられる。好適な塩基は当業者にとって周知であり、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、アンモニア、ジエチルアミンなどが挙げられる。通常、第一段階は周囲温度（例えば約２０〜２５℃）で行われる。標準的な酸処理（例えば塩酸水溶液、硫酸水溶液など）により、カルボキシメチルジチオカルバメートが得られる。
次の段階は、カルボキシメチルジチオカルバメートをヒドラジン水和物と反応させることによる、チオセミカルバジド中間体化合物の形成を含む。通常、この段階は水中で、約２５℃〜約６０℃の範囲の温度にて穏やかに加熱しながら行われる。一般的に、モル過剰のヒドラジン水和物を使用する。
次に、式（Ｉ）のチオセミカルバゾン化合物を生成させるために、チオセミカルバジド化合物をシッフ塩基縮合反応においてジ−２−ピリジルケトンと反応させる。通常、この反応は、何らかの好適な極性溶媒、例えばエタノール、プロパノール、テトラヒドロフラン中など、で行われ得る。この反応は通常、通常は約１〜約２４時間、例えば約２〜約８時間、より典型的には約２時間〜約４時間などであり得る、好適な時間にわたり、混合物を還流状態で加熱することにより行われる。場合によっては、乾燥剤、例えばＴｉＣｌ４もしくは分子ふるいを入れることにより、または共沸蒸留により、縮合反応中に生じた水を除去し得る。
式（Ｉ）の化合物の塩形態は、当業者にとって公知の技術を用いて容易に調製し得る。例えば、ヘキサン、ジクロロメタンなどの好適な非極性溶媒中で式（Ｉ）の化合物を溶解し、所望の塩に対応する酸の水溶液とともに撹拌することによって、酸付加塩を調製し得る。例えば、塩酸により塩酸塩が得られ、硝酸により硝酸塩が得られ、硫酸により硫酸塩が得られる。
当業者にとって公知の標準的な技術を用いて、一般式（Ｉ）の化合物またはそれらの塩、水和物および溶媒和物を精製し得る。好ましい実施態様において、好適な溶媒または溶媒混合物からの結晶化によって、式（Ｉ）の化合物を精製し得る。好適な溶媒は当業者にとって公知であり、例えば、メタノール、エタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、Ν，Ν−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドおよびそれらの混合物が挙げられる。他の実施形態において、上記で列挙したものなどの１つ以上の有機溶媒および水を含む溶媒混合物から生成物を再結晶化し得る。精製後、一般式（Ｉ）の化合物は実質的に純粋であり得る。例えば、式（Ｉ）の化合物を少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％，または９９％純粋である形態で分離し得る。
治療
本発明はまた、治療における、一般式（Ｉ）のチオセミカルバゾン化合物およびそれらの塩、水和物および溶媒和物の使用にも関する。特に、式（Ｉ）のチオセミカルバゾン化合物は抗増殖特性を有し、したがって癌の治療において有用であり得る。本発明のチオセミカルバゾン化合物は鉄キレート剤である。本発明の化合物は、メラノーマ、皮膚癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、肝臓癌、消化管癌、結腸直腸癌、脳腫瘍、頭頸部癌、骨癌、膵臓癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌ならびに血液系腫瘍（例えば白血病およびリンパ腫）を含むが限定されない、多岐にわたる癌（腫瘍）の治療に有用であり得る。特に好ましい実施形態において、癌は膵臓癌である。他の特に好ましい実施形態において、癌は肺癌である。他の好ましい実施形態において、癌は脳腫瘍である。好ましい実施形態において、本発明の化合物は、固形腫瘍の治療に有用である。他の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、非固形腫瘍の治療に有用である。
膵臓癌は、診断から最初の５年以内に症例の９８〜１００％が死に至る深刻な疾患であり、この疾患からの生存率は、現在も２０年前と同じである。膵臓癌に対して現在利用可能な最良の治療は、抗癌剤、ヌクレオシド、デオキシシチジンの類似体であるゲムシタビンである。ゲムシタビンは、細胞内で活性代謝物、ジフルオロデオキシシチジンジ−およびトリ−ホスフェート（ｄＦｄＣＤＰ、ｄＦｄＣＴＰ）に変換されるプロドラッグである。膵臓癌治療におけるゲムシタビンの奏効は限定的である。実際に、この薬剤を使用した臨床治験から、患者の生存期間を平均でわずか約３ヶ月しか延ばさないことが分かっている。ゲムシタビンは、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの他の抗癌剤と組み合わせられてきたが、その結果、その活性が幾分向上した。しかし、膵臓癌患者に対する予後は依然として不良である。
意外にも、本発明のチオセミカルバゾン化合物またはそれらの塩、水和物もしくは溶媒和物は、有利に、既知の抗癌剤と少なくとも同程度に良好な、および好ましくはそれよりも良好な抗増殖特性を示す。例えば、好ましい実施形態において、本発明のチオセミカルバゾン化合物は、ゲムシタビンおよび５−フルオロウラシルと比較した場合、癌細胞（例えば膵臓癌細胞）の増殖を阻害することにおいてより効果が高い。したがって、（単独でまたは他の抗癌剤と組み合わせて、または治療計画の一部として使用される）本発明の化合物は、既存の抗癌剤と比較して、１つ以上の有利な治療特性を保持する代替的な抗癌剤である。
本発明の別の意外かつ有利な特徴は、本発明のチオセミカルバゾン化合物またはそれらの塩、水和物もしくは溶媒和物が、特に侵襲性の強い形態の癌であることが周知である膵臓腫瘍の成長を実質的に抑制し得ることである。したがって本発明の化合物は、膵臓癌治療において、単独でまたは他の抗癌剤と組み合わせて、または治療計画の一部として使用され得る。好ましい実施形態において、チオセミカルバゾン化合物はＤｐ４ｅ４ｍＴまたはそれらの塩もしくは水和物である。他の好ましい実施形態において、チオセミカルバゾンはＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴまたはそれらの塩もしくは水和物である。
本発明のさらなる意外かつ有利な特徴は、本発明のチオセミカルバゾン化合物が、強力な抗増殖チオセミカルバゾン化合物であるジ−２−ピリジルケトン４，４−ジメチル−３−チオセミカルバゾン（Ｄｐ４４ｍＴ）よりも効果が高く、毒性が低いものであり得ることである。特に好ましい実施形態において、本発明のチオカルバゾン化合物、例えばＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴまたはＤｐ４ｅ４ｍＴは、Ｄｐ４４ｍＴよりも実質的に心臓毒性が低い。
タンパク質ミオグロビン（Ｍｂ）は、酸素の貯蔵および筋肉への供与において重要な役割を果たし、ヘモグロビンに対する単量体の対応物である。トリアピン（登録商標）を含む癌の臨床治験において、メトヘモグロビン血症および低酸素症の誘発は、用量を制限する副作用として指摘されている（Attia S, Kolesar Jら(2008). Invest New Drugs 26: 369-379; Ma B, Goh BCら(2008年).Invest New Drugs 26: 169-73）。癌に対する化学療法を受けている患者において、この合併症は、これらの患者の呼吸器の性能を低下させることが多かったので、望ましくない。したがって、ｍｅｔＨｂの過剰産生により、トリアピン（登録商標）の臨床的有用性が低下する。特に化合物Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴにおいて、本発明の化合物は、抗腫瘍活性を維持しながら、メトヘモグロビン（ｍｅｔＨｂ）および／またはメトミオグロビン（ｍｅｔＭｂ）形成を誘導しないか、または本化合物は、ｍｅｔＨｂおよび／またはｍｅｔＭｂ形成の誘導がＤｐ４４ｍＴおよびトリアピン（登録商標）などの他の抗癌剤よりも顕著に少ないので、他の抗癌剤を凌ぐさらなる長所を有する。
製剤
本発明によれば、感染、疾患または障害の治療または予防のために使用される場合、本発明の化合物は、単独でまたは治療計画の一部として他の薬剤と組み合わせて投与され得る。本化合物は、本発明による少なくとも１つの化合物を含む医薬または獣医学用製剤として投与され得る。本化合物はまた、薬学的に許容可能な塩を含め、好適な塩としても存在し得る。
本発明の化合物の送達に好適な医薬組成物およびそれらの調製法は、当業者にとって容易に明らかとなろう。このような組成物およびそれらの調製のための方法は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995年)で見出すことができる。
他の実施形態において、１つ以上の他の治療剤と組み合わせて本発明の化合物を製剤化し得る。
本発明の他の実施形態において、本発明の化合物は、外科手術および／または他の既知の処置または治療剤、例えば他の抗癌剤、特に化学療法剤、放射線治療薬および／またはアジュバントまたは予防薬との併用治療計画に含まれ得る。好適な薬剤は、例えば、内容全体が参照により本明細書中に組み込まれる、Merck Index, An Encyclopaedia of Chemicals, Drugs and Biologicals, 12th Ed., 1996年に列挙されている。
例えば、固形腫瘍の治療において使用される場合、アドリアマイシン、タキソール、ドセタキセル、フルオロウラシル、メルファラン、シスプラチン、αインターフェロン、ＣＯＭＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、メトトレキサートおよびプレドニゾン）、エトポシド、ｍＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびデキサメタゾン）、ＰＲＯＭＡＣＥ／ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート（ｗ／ロイコビンレスキュー）、ドキソルビシン、シクロホスファミド、タキソール、エトポシド／メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾン及びプロカルバジン）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、アンギオインヒビン、ＴＮＰ−４７０、ペントサンポリサルフェート、血小板第４因子、アンギオスタチン、ＬＭ−６０９、ＳＵ−１０１、ＣＭ−１０１、テクガラン（Techgalan）、サリドマイド、ＳＰ−ＰＧなど、１つ以上の化学療法剤またはそれらの組み合わせとともに本発明の化合物を投与し得る。
抗癌剤の他の例としては、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（例えばメクロレタミン、メルファラン、クロランブシル、シクロホスファミド、（Ｌ−サルコリシン）およびイホスファミド）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（例えばヘキサメチルメラミン、チオテパ）、アルキルスルホネート（例えばブスルファン）、ニトロソウレア（例えばカルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン）、トリアゼン（例えばダカルバジン（ジメチルトリアゼノ−イミダゾールカルボキサミド）、テモゾロミド）、葉酸類似体（例えばメトトレキサート）、ピリミジン類似体（例えば５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、ゲムシタビン）、プリン類似体（例えば６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、ペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン）クラドリビン、フルダラビン）、ビンカアルカロイド（例えばビンブラスチン、ビンクリスチン）、タキサン（例えばパクリタキセル、ドセタキセル）、エピポドフィロトキシン（例えばエトポシド、テニポシド）、カンプトテシン（トポテカン、イリノテカン）、抗生物質（例えばアクチノマイシンＤ、ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ミトラマイシン）、酵素（例えばＬ−アスパラギナーゼ）、インターフェロン−α、インターロイキン−２、シスプラチン、カルボプラチン、ミトキサントロン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、ミトタン、アミノグルテチミド、イマチニブ、副腎皮質ステロイド（例えばプレドニゾン）、プロゲスチン（例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール）、エストロゲン（例えばジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール）、抗エストロゲン（例えばタモキシフェン、アナストロゾール）、アンドロゲン（例えばプロピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン）、抗アンドロゲン物質（例えばフルタミド）およびゴナドトロピン放出ホルモン類似体（例えばロイプロリド）が挙げられる。
特に好ましい実施形態において、ゲムシタビンもしくは５−フルオロウラシルと組み合わせて、またはゲムシタビンおよび５−フルオロウラシルと組み合わせて、１つまたはそれ以上の本発明の化合物を使用し得る。
併用計画は、各場合において必要に応じて、共に、連続して、または間隔をあけて投与される活性薬剤を含み得る。本発明の化合物を含む活性薬剤の組み合わせは、相乗効果があり得る。
薬学的に許容可能な塩とは、健全な医学的判断の範囲内で、不好適な毒性、刺激、アレルギー反応などなく、ヒトおよび下等な動物の組織と接触させるという使用に好適であり、妥当なリスク・ベネフィット比と釣り合っている塩を意味する。薬学的に許容可能な塩は当技術分野で周知である。塩酸塩などの酸付加塩は、本発明の特に好ましい実施形態である。
例えば、本発明による化合物の好適な薬学的に許容可能な塩は、薬学的に許容可能な酸（無機および有機酸を含む。）または薬学的に許容可能な塩基（無機および有機塩基を含む。）と本発明の化合物を混合することにより調製し得る。したがって本発明の化合物の好適な薬学的に許容可能な塩としては、酸付加塩および塩基の塩が挙げられる。
好適な薬学的に許容可能な酸としては、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エテンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、シュウ酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。現在のところ好ましい酸付加塩は、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩および硫酸塩であり、最も特に好ましいのは塩酸塩である。
好適な塩基性塩は、無毒性塩を形成する塩基から形成され得る。例としては、アルミニウム、アルギニン、ベンザチン、カルシウム、コリン、ジエチルアミン、ジオラミン、グリシン、リジン、マグネシウム、メグルミン、オラミン、カリウム、ナトリウム、トロメタミンおよび亜鉛塩が挙げられる。
酸および塩基のヘミ塩、例えばヘミ硫酸塩およびヘミカルシウム塩も形成させ得る。
S. M. Bergeらは、J Pharmaceutical Sciences, 1977年, 66: 1-19において薬学的に許容可能な塩を詳細に記載しており、好適な塩における概説は、StahlおよびWermuth著、Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use（Wiley-VCH,ドイツ、ヴァインバイム, 2002年）により提供される。両文献とも、その全体が本明細書中に組み込まれる。
本発明の化合物の最終的な単離および精製中に、または別個に好適な有機酸と遊離塩基化合物を反応させることによって、塩をインサイチュで調製し得る。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン、トリエタノールアミンなどを含むが限定されない、無毒性アンモニウム、四級アンモニウムおよびアミン陽イオンなどが挙げられる。
本発明の化合物の好都合な投与方式としては、非経口（例えば皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、髄腔内、眼内、鼻腔内、心室内注射または点滴技術）、腹腔内、経口投与、吸入、経皮投与、局所クリームもしくはジェルもしくは粉末または直腸投与が挙げられる。投与経路に依存して、本化合物の治療活性を不活性化させ得る、酵素、酸および他の天然状態の作用から本化合物を保護するための材料で、本製剤および／または本化合物を被覆し得る。
本発明による化合物の分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、および油中で調製され得る。通常の貯蔵および使用の条件下で、医薬品は、微生物の増殖を防止するために保存料を含有し得る。
注射に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液（好適に水溶性である活性物質に対して）または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調合製剤のための滅菌粉末を含む。理想的には、本組成物は製造および貯蔵の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して組成物を安定化させるために、保存料を含み得る。
本発明の一実施形態において、本発明の化合物は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な可食担体とともに経口投与され得る。本化合物および他の成分はまた、硬または軟殻ゼラチンカプセルに封入されるか、錠剤に圧縮されるか、または個人の食事に直接組み込まれ得る。経口の治療用投与の場合、本化合物は賦形剤とともに組み込まれ得、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェーハ剤などの形態で使用され得る。好適には、このような組成物および調合物は少なくとも１重量％の活性化合物を含有し得る。医薬組成物および調合物中の、本発明の化合物のパーセンテージは言うまでもなく変動し得る。例えば、量は、都合よく、投与単位の重量の約２％〜約９０％、約５％〜約８０％、約１０％〜約７５％、約１５％〜約６５％；約２０％〜約６０％、約２５％〜約５０％、約３０％〜約４５％または約３５％〜約４５％の範囲であり得る。治療的に有用な組成物中の化合物の量は、好適な投与量を得ることができるようなものである。単回または複数回投与によって、好適な用量を得ることができる。
「薬学的に許容可能な担体」という用語は、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性のある物質のための、このような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。従来の媒体または薬剤が本化合物と不適合である場合を除き、治療用組成物および治療および予防法においてそれらを使用することが企図される。本発明によると、補助的な活性化合物も組成物に組み込み得る。投与しやすさおよび用量の均一性のため、非経口組成物を単位剤形に製剤化することは特に有利である。
「単位剤形」という用語は、本明細書中で使用される場合、治療しようとする個体のための単一の投与量として適した、物理的に別個の単位を指し；所定量の化合物を含有する各単位は、必要な薬剤担体と合わせて所望の治療効果をもたらすように計算される。本化合物は、許容可能な投与単位で、好適な薬学的に許容可能な担体とともに、有効量で、都合が良く、有効な投与のために製剤化され得る。補助的な活性成分を含有する組成物の場合、投与量は、通常の用量および前記成分の投与方式を参照することにより決定される。
一実施形態において、担体は、経口投与可能な担体であり得る。
医薬組成物の別の形態は、経口投与に好適な腸溶性の被覆がある顆粒剤、錠剤またはカプセル剤として製剤化される剤形である。
遅延または持続放出製剤も本発明の範囲に含まれる。
好ましい実施形態において、本発明の化合物を注射により投与し得る。注射溶液の場合、担体は、例えば水（例えば注射用の水）、生理食塩水、５％グルコース溶液、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適当な混合物および植物油を含有する、溶媒または分散媒であり得る。好適な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散の場合には必要な粒径の維持により、および界面活性剤（例えばポリソルベート８０）の使用により、維持され得る。微生物の作用の阻止は、様々な抗菌剤および／または抗真菌剤を含めることにより達成され得る。好適な薬剤は、当業者にとって周知であり、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ベンジルアルコール、アスコルビン酸、チメロサールなどが挙げられる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを本組成物中に含むことが好ましいものであり得る。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによって実現し得る。
滅菌注射溶液は、上記で列挙された成分の１つまたは組み合わせとともに、必要な量の類似体を好適な溶媒中に組み込み、その後、必要に応じて濾過滅菌することによって調製し得る。一般に分散液は、基本的な分散媒および上記で列挙されたものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに類似体を組み込むことにより調製し得る。
錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤などは、次のものも含有し得る：結合剤、例えばグラガカント（gragacanth）ガム、アカシアゴム、コーンスターチまたはゼラチンなど；賦形剤、例えばリン酸二カルシウムなど；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸など；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムなど；および甘味料、例えばスクロース、ラクトースもしくはサッカリンなど、または香味料、例えばペパーミント、ウィンターグリーン油もしくはチェリー香味料など。単位剤形の形状がカプセル剤である場合、上記のタイプの物質に加えて、液体担体を含有し得る。様々な他の物質が、コーティングとして、または用量単位の物理的形状をあるいは修飾するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、シェラック、糖または両方で被覆し得る。シロップ剤またはエリキシル剤は、類似体、甘味料としてのスクロース、保存料としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素および、チェリーまたはオレンジ香味料などの香料を含有し得る。言うまでもなく、何らかの単位剤形を調製する際に使用される何れの物質も、薬学的に純粋であり、使用される量で実質的に無毒性でなければならない。さらに、類似体は、徐放性の調合物および製剤に組み込まれ得る。
好ましくは、本医薬組成物は、酸の加水分解を最小限に抑えるために好適な緩衝液をさらに含み得る。好適な緩衝剤は当業者にとって周知であり、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明による医薬組成物の単回または複数回投与を行い得る。当業者は、日常的な実験により、本発明の化合物および／または組成物の効果的な無毒性の投与量レベルおよび、化合物および組成物が適用可能である疾患および／または感染の治療に適するような投与パターンを決定することができる。
さらに、定められた日数にわたる、１日当たりに与えられる本発明の化合物または組成物の投与回数など、最適な治療コースが、治療決定試験の従来のコースを用いて確認される得ることが、当業者には明らかであろう。
一般に、２４時間当たりの有効薬量は、約０．０００１ｍｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重；好適には約０．００１ｍｇ〜約７５０ｍｇ／ｋｇ体重；約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重；約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重；約０．１ｍｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ体重；または約１．０ｍｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。より好適には、２４時間当たりの有効薬量は、約１．０ｍｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重；約１．０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重；約１．０ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重；約１．０ｍｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重；約５．０ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重；約５．０ｍｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重；または約５．０ｍｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。
あるいは、有効薬量は、治療しようとする患者の体表面積（ＢＳＡ）に従い計算され得る。患者のＢＳＡは、当業者にとって公知の方法を用いて容易に計算し得る。好適な用量は一般的に約５００ｍｇ／ｍ２以下であり得る。例えば、一般的に、有効薬量は、約１０〜約５００ｍｇ／ｍ２、約２５〜約３５０ｍｇ／ｍ２、約２５〜約３００ｍｇ／ｍ２、約２５〜約２５０ｍｇ／ｍ２、約５０〜約２５０ｍｇ／ｍ２および約７５〜約１５０ｍｇ／ｍ２の範囲であり得る。
ここで、以下の非限定例を参照して、本発明を説明する。
実施例１−Ｄｐ４ｃｙｃｈ４ｍＴ、Ｄｐ４ｅ４ｍＴおよび対応する塩酸塩の合成
方法：
確立されている方法の組み合わせを用いて、キレート剤、ジ−２−ピリジルケトン４−エチル−４−メチル−３−チオセミカルバゾン（Ｄｐ４ｅ４ｍＴ）およびジ−２−ピリジルケトン４−シクロへキシル−４−メチル−３−チオセミカルバゾン（Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ）を合成した（Scovill, J P(1990年).Phosphorous, Sulphur and Silicon 60:15-19; Richardson, D.Rら(2006年). J Med Chem. 49: 6510-6521）。簡潔に述べると、ＮａＯＨ溶液（２５０ｍＬ、０．８Ｍ）中のＮ−メチルシクロへキシルアミンまたはＮ−エチルメチルアミン（０．２ｍｏｌ）に、二硫化炭素（０．２ｍｏｌ）を滴下して添加し、有機層が殆ど消失するまで反応させた。次に、クロロ酢酸ナトリウム（０．２ｍｏｌ）を水性抽出液に添加し、室温で一晩反応させた。濃ＨＣｌ（２５ｍＬ）の添加により、固体のカルボキシメチルチオカルバメート中間体が得られた。およそ０．０８ｍｏｌのカルボキシメチルチオカルバメート中間体を２０ｍＬヒドラジン水和物＋１０ｍＬ水の中で溶解した。この後、穏やかな加熱（発煙するまで）および冷却を５サイクル行った。次に、チオセミカルバジド中間体の微細な白色結晶が形成されるまで溶液を静置した。ＥｔＯＨ（１５ｍＬ）中で溶解させたジ−２−ピリジルケトン（１０ｍｍｏｌ）に水（１５ｍＬ）中のチオセミカルバジド中間体（１０ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。次に、５滴の氷酢酸を添加し、混合物を２時間還流させ、５℃に冷却したところ、黄色のＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴまたはＤｐ４ｅ４ｍＴ沈殿物がそれぞれ得られた。最終的に、最小体積の冷ヘキサン中でＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴまたはＤｐ４ｅ４ｍＴを溶解し、等モルのＨＣｌを添加し、対応するＨＣｌ塩を得た。合成スキームを図１Ｂで示す。
結果：
Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ：収率６４％（ＣＳ２より）。分析計算値、Ｃ１９Ｈ２３Ｎ５Ｓに対して：Ｃ、６４．５６；Ｈ、６．５６；Ｎ、１９．８１％。実測値：Ｃ、６４．５１；Ｈ、６．４７；Ｎ、２０．０４％。
Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ．ＨＣｌ．５Ｈ２Ｏ 収率８７％（Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴより）。分析計算値、Ｃ１９Ｈ２３Ｎ５Ｓ．ＨＣｌ ５．５Ｈ２Ｏに対して：Ｃ、４７．５４；Ｈ、７．１４；Ｎ、１４．５９％。実測値：Ｃ、４７．０６；Ｈ、６．６５；Ｎ、１４．９５％。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．８２（ｄ，１Ｈ）、８．６１（ｄ，１Ｈ）、８．０４−７．９０（ｍ，３Ｈ）、７．６２−７．５６（ｔ，２Ｈ）、７．５０−７．４６（ｔ，１Ｈ）、３．１８（ｓ，３Ｈ）、１．８３−１．４９（ｍ，７Ｈ）、１．４０−１．１０（ｍ，３Ｈ）．ＭＳ ｍ／ｚ（％）３７６．３（Ｍ＋Ｈ，５）、３７６（Ｍ＋Ｎａ，３４）。
Ｄｐ４ｅ４ｍＴ：収率４４％（ＣＳ２より）。分析計算値、Ｃ１５Ｈ１６Ｎ４Ｓに対して：Ｃ、６３．４；Ｈ、５．７；Ｎ、１９．７％。実測値：Ｃ、６２．８；Ｈ、５．９；Ｎ、１９．５％。
Ｄｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌ．５．５Ｈ２Ｏ 収率９１％（Ｄｐ４ｅ４ｍＴより）。分析計算値、Ｃ１５Ｈ１７Ｎ５Ｓ．ＨＣｌ ５．５Ｈ２Ｏに対して：Ｃ、４１．４２；Ｈ、６．７２；Ｎ、１６．１０％。実測値：Ｃ、４１．３１；Ｈ、６．４５；Ｎ、１５．９５％。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．８４（ｄ，１Ｈ）、８．６６（ｄ，１Ｈ）、８．１３−８．０９（ｔ，１Ｈ）、８．０４−７．９７（ｄｔ，２Ｈ）、７．６７−７．５９（ｄｔ，３Ｈ）、３．３２（ｓ，３Ｈ）、１．２０（ｓ，３Ｈ）．ＭＳ ｍ／ｚ（％）３２２．０（Ｍ＋Ｎａ，４６）、６２０．８７（Ｍ；二量体、＋Ｎａ、１００）。
実施例２−Ｄｐ４ｅ４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴの抗増殖活性
方法：
American Type Culture Collection (ATCC;アメリカ合衆国メリーランド州ロックヴィル)よりＳＫ−Ｎ−ＭＣヒト神経上皮腫細胞を入手して、既に述べられている方法に従って培養した（Richardson, D Rら(1995年). Blood 86:4295-306）。１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；JRH Biosciences,アメリカ合衆国カンザス州）、１％非必須アミノ酸（Gibco,オーストラリア、ヴィクトリア州）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（Gibco, オーストラリア、ヴィクトリア州）およびファンギゾン（０．２８ｎｇ／ｍＬ；Squibb Pharmaceuticals,カナダ、モントリール）を含有した最小必須培地（ＭＥＭ；Invitrogen,アメリカ合衆国カリフォルニア州）中で細胞を維持した。
ＭＩＡＰａＣａ−２、ＰＡＮＣ１、ＣＡＰＡＮ−２およびＣＦＰＡＣ−１を含む膵臓癌細胞株は、Andrew Biankin教授（Garvan Institute,オーストラリア、ニューサウスうエールズ州）の厚意により譲渡された。ＭＩＡＰａＣａ−２、ＰＡＮＣ１およびＣＦＰＡＣ−１細胞株をＤＭＥＭ培地（Invitrogen）中で増殖させ、ＣＡＰＡＮ−２細胞をマッコイ培地（Invitrogen）中で増殖させた。培地には全て、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Invitrogen）、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸（Invitrogen）、１％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム（Invitrogen）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Invitrogen）、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Invitrogen）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Invitrogen）および０．２８μｇ／ｍＬファンギゾンを補給した。
結果：
最初に化合物の細胞増殖阻害能をＭＴＴアッセイによりＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞において評価した。Ｄｐ４ｅ４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴの両方が、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞において、ＤＦＯ（ｐ＜０．０５）および鉄キレート剤、２−ヒドロキシ−１−ナフチルアルデヒドイソニコチノイルヒドラゾン（３１１）よりも有意に高い（ｐ＜０．０５）抗増殖活性を示し（図２；表１）、ＩＣ５０値はそれぞれ０．００４１および０．０１３μＭであった。
表１．ＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫に対するＤｐ４ｅ４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴの抗増殖活性。ＭＴＴアッセイにより求めた場合の、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞株におけるＤｐ４ｅ４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴのＩＣ５０（μＭ）値。細胞を播種し、ウェルに２４時間接着させ、次いで対照培地またはキレート剤とともに３７℃で７２時間温置した。結果は平均±ＳＤ（３回の実験）である。
Figure 2014502599
キレート剤、Ｄｐ４ｅ４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴは、アルキル官能基による末端窒素（Ｎ４）での水素原子の置換を通じて、化合物ジ−２−ピリジルケトン４−メチル−３−チオセミカルバゾン（Ｄｐ４ｍＴ）と構造的に関連がある。Ｄｐ４ｅ４ｍＴの生成は、Ｄｐ４ｍＴのＮ４での水素原子のエチル基による置換を含み、一方でＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴは、シクロへキシル置換基を特徴とする。これらの構造修飾は、Ｄｐ４ｍＴと比較して、両類似体の抗増殖活性を有意に（ｐ＜０．００１）向上させることが分かったが、このＩＣ５０値は０．３４μＭである（図２、表１）。
抗増殖活性スペクトルをさらに調べるために、ＰＡＮＣ１、ＭＩＡＰａＣａ−２、ＣＦＰＡＣ−１およびＣＡＰＡＮ−２膵臓癌細胞を用いてＭＴＴ増殖アッセイを行い、インビトロで膵臓癌に対してＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴを試験した。比較として、ゲムシタビンおよび５−フルオロウラシルを含め、膵臓癌に対して現在使用される治療薬も試験した。鉄キレート剤、ＤＦＯを陽性対照として含めた。
ＭＩＡＰａＣａ−２、ＰＡＮＣ１およびＣＡＰＡＮ−２細胞において、最大抗増殖活性は、Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴで観察され（図３Ａ、ＢおよびＣ）、ＩＣ５０値はゲムシタビンおよび５−フルオロウラシルと比較して有意に（ｐ＜０．０１）低かった（表２Ａ）。実際に、Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴに対するＩＣ５０値は、４種類の細胞タイプのうち２種類において、ゲムシタビンおよび５−フルオロウラシルと比較した場合、それぞれ、少なくとも１００倍および１０００倍低かった（表２Ａ）。陽性対照ＤＦＯの抗増殖活性は比較的低かった。
表２Ａ．膵臓癌細胞株に対するＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴの抗増殖活性。ＭＴＴアッセイにより測定した場合の、様々な膵臓細胞株における、ＤＦＯおよび臨床で使用される薬物、ゲムシタビンおよび５−フルオロウラシルと比較した、Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴの成長および抗増殖活性ＩＣ５０（μＭ）値。細胞を播種し、ウェルに２４時間接着させ、次いで対照培地またはキレート剤とともに３７℃で７２時間温置した。結果は平均±ＳＤ（３回の実験）である。
Figure 2014502599
チオセミカルバゾンが最大抗増殖活性を有した他のタイプの細胞と対照的に、ＣＦＰＡＣ−１細胞はゲムシタビンに最も感受性があった。実際に、ゲムシタビンに対するＩＣ５０値は、Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴよりも有意に（ｐ＜０．０５）低かった（図３Ｄおよび表２Ａ）。Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴのＩＣ９０値は、ＣＦＰＡＣ−１細胞においてゲムシタビンよりも低かった（図３Ｄ、表２Ｂ）。したがって、これらのデータから、チオセミカルバゾンは、より高い用量で使用された場合、インビトロでこの細胞タイプの増殖をほぼ完全に阻害する可能性があり、その一方でゲムシタビンの抗増殖活性がより限定的であることが示唆され（図３Ｄ）、様々な細胞タイプの間で反応が異なることが明らかとなる。
表２Ｂ．膵臓癌細胞株に対するＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴの抗増殖活性。ＭＴＴアッセイにより測定した場合の、様々な膵臓細胞株における、ＤＦＯおよび臨床で使用される薬物、ゲムシタビンおよび５−フルオロウラシルとの比較における、Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴのＩＣ９０値（μＭ）。細胞を播種し、ウェルに２４時間接着させ、次いで対照培地またはキレート剤とともに３７℃で７２時間温置した。結果は平均±ＳＤ（３回の実験）である。
Figure 2014502599
実施例３−細胞からのＦｅ排出および、Ｄｐ４ｅ４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴからのトランスフェリンからのＦｅ取り込みの阻害
方法：
鉄排出アッセイ
確立されている方法を用いて、予め標識したＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞からの５９Ｆｅの放出における、鉄キレート剤、Ｄｐ４ｅ４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴの影響を調べた（例えばBaker, Eら(1992年). Hepatology 15:492-501）。最初にＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を３５ｍｍ培養皿に播種し、それらがおよそ８０％コンフルエントになるまで、３７℃で５％ＣＯ２／９５％大気の加湿恒温槽中で温置した。この後、０．０６ｍｇ／ｍＬの５９Ｆｅ−Ｔｆ（Baker, Eら(1992年). Hepatology 15:492-501で概説されるように調製）を含有する好適な培地とともに３７℃で３時間温置することにより、細胞を予め標識した。次に、培養皿を氷上に置き、過剰な５９Ｆｅ−Ｔｆを含有する上清を吸引し、氷冷ＰＢＳを用いて細胞を４回洗浄した。次いで、２５μＭキレート剤を含有する培地または培地単独（対照）で、３７℃でさらに３時間、細胞を温置した。３時間後、培養皿を再び氷上に置き、計数管中で培地を回収し、これにより、放出された５９Ｆｅの測定を行った。細胞を含有するプレートに氷冷ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加し、Ｔｅｆｌｏｎスパーテルを用いてプラスチック面から細胞を擦り取り、これもまた計数管中で回収した。これらの管は、細胞内５９Ｆｅ含量に相当する。結果は、存在する総５９Ｆｅの％としての総放出５９Ｆｅとして表す。Wallac Wizard 3” ガンマカウンター（PerkinElmer,アメリカ合衆国マサチューセッツ州）を用いて、放射能を測定した。
鉄取り込みアッセイ
確立されている方法を用いて、ＳＫ−Ｎ−ＭＣが培地から５９Ｆｅを得る能力に対する鉄キレート剤、Ｄｐ４ｅ４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴの影響を調べた（Richardson, D Rら(1995年).Blood 86: 4295-306; Baker, Eら(1992年). Hepatology 15: 492-501）。鉄排出実験と同じようにして細胞を培養した。細胞がおよそ８０％コンフルエントになったら、２５μＭキレート剤を含有する培地または培地単独（対照）で、これらを３７℃で３時間温置した。５９Ｆｅ−Ｔｆ（０．０６ｍｇ／ｍＬ）を培地に添加した。温置終了時に、培養皿を氷上に置き、培地を吸引し、氷冷ＰＢＳで細胞を４回洗浄した。プロテアーゼ（１ｍＬ；１ｍｇ／ｍＬ；Sigma-Aldrich,オーストラリア,ニューサウスウエールズ州）溶液を各プレートに添加し、氷上で３０分間静置した。これによって、膜結合５９Ｆｅ−Ｔｆの除去が促進された。次に、Ｔｅｆｌｏｎスパーテルを用いてプラスチック面から細胞を擦り取り、エッペンドルフ管中で回収した。これらを１００００ｒｐｍおよび４℃で３分間遠心した。次に、上清を計数管に移し、細胞ペレットをＰＢＳ中で再懸濁した後、これも別のセットの計数管に移した。Wallac Wizard 3” ガンマカウンター（PerkinElmer,アメリカ合衆国マサチューセッツ州）を用いて放射能を測定した。結果は、対照値の％としての細胞分画の平均５９Ｆｅ含量として表す。
実施例３ａ−Ｄｐ４ｅ４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴが介在する細胞からのＦｅ排除
全てのジピリジルチオセミカルバゾン化合物が、対照細胞と比較して有意な鉄排出活性の上昇を示した（ｐ＜０．００１）（図４Ａ）。対照細胞は、新鮮培地との３時間の再温置後、細胞内総５９Ｆｅの７％を放出した（図４Ａ）。化合物Ｄｐ４ｅ４ｍＴは、細胞内５９Ｆｅの３８％を動員することができ（図４Ａ）、これは４２％の細胞内Ｆｅを動員した化合物Ｄｐ４ｍＴと同等であった。化合物Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴが動員した細胞内５９Ｆｅは僅か２２％であり、これは、１６％の細胞内Ｆｅを動員した、臨床で使用されているキレート剤ＤＦＯと同様であったが、構造的に関連のある類似体Ｄｐ４ｍＴよりも少なかった（図４Ａ）。このことから、Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴは、ＤＦＯおよびＤｐ４ｍＴと比較して、その顕著な抗増殖活性を考えると、Ｆｅキレート化以外の他の作用機構を有し得ることが示唆される（表１）。内部標準として化合物３１１の鉄排出プロファイルも調べたところ、これは先行実験と一致した。
実施例３ｂ−Ｄｐ４ｅ４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴによる５９Ｆｅトランスフェリンからの細胞５９Ｆｅ取り込みの阻害
Ｆｅキレート化効率の特徴をさらに調べるために、Ｄｐ４ｅ４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴの５９Ｆｅ−Ｔｆからの５９Ｆｅ取り込み阻害能を、構造的に関連がある化合物Ｄｐ４ｍＴと比較した。Ｄｐ４ｅ４ｍＴは、５９Ｆｅ細胞内取り込みを対照の１２％に制限したが、これは、５９Ｆｅ細胞内取り込みを対照の６％に制限したＤｐ４ｍＴと同等であった（図４Ｂ）。Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴは、Ｄｐ４ｅ４ｍＴまたはＤｐ４ｍＴの何れよりも効果が小さく、５９Ｆｅ取り込みを２１％に制限した（図４Ｂ）。しかし、化合物は全て、未処理細胞で見られたものの８４％までしか５９Ｆｅ取り込みを制限しなかったＤＦＯよりもかなり高い活性を示した（ｐ＜０．００１）（図４Ｂ）。鉄排出実験と同様に、化合物３１１も内部標準として調べたところ、５９Ｆｅ細胞内取り込みを５％に制限したが、これは先行実験と一致した（例えばRichardson, D Rら(1995). Blood 86:4295-306）。
実施例４−Ｄｐ４ｅ４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃｈ４ｍＴによる腫瘍成長のインビボでの阻害
方法：
インビボ試験のために雌ヌードマウス（ＢＡＬＢｃ ｎｕ／ｎｕ）、８週齢を使用し、試験は全て、Animal Ethics Committee（シドニー大学）により承認された。標準的技術により腫瘍異種移植片（Whitnall, M, J. Howardら(2006). Proc Natl Acad Sci USA 103: 14901-6）を確率した。ＤＭＳ−５３肺癌の成長を調べる試験において、指数関数的に増殖する細胞を回収し、細胞１ｘ１０７個／１００μＬを用いて、細胞含有培地およびマトリゲル（登録商標）（BD Biosciences,アメリカ合衆国マサチューセッツ州）の１：１混合物を調製した。メトキシフルランで麻酔したマウスの右脇腹に細胞／マトリゲル混合物をｓ．ｃ．注射した。ＰＡＮＣ１膵臓癌細胞の増殖を調べる実験において、各マウスの皮下にマトリゲル（BD Biosciences, アメリカ合衆国カリフォルニア州サンノゼ）中で懸濁した２ｘ１０６個のＰＡＮＣ１細胞を注射した。ノギスにより腫瘍サイズを測定し、以前に記載のとおり腫瘍体積を計算した（Balsari, A., M. Tortoretoら (2004). Eur J Cancer 40: 1275-81）。腫瘍が平均９０ｍｍ３に到達したら、処置を開始した（第０日；図５）。
０．９％生理食塩水中の３０％プロピレングリコール中でＤｐ４４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ．ＨＣｌを溶解し、個々の試験において特定された投与量で、５日／週で静脈内（尾静脈を介して）注射するか、または５日／週で強制経口投与により与えた。
ＰＡＮＣ１試験において、０．９％生理食塩水中の１５％プロピレングリコール中でゲムシタビンを溶解し、３日に１回、腹腔内注射し、各群（ｎ＝８）は、ゲムシタビン（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｄｐ４４ｍＴ（０．４ｍｇ／ｋｇ）、Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ．ＨＣｌ（５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル対照の何れかの投与を受けた。ＰＡＮＣ１試験において、ビヒクル対照群をさらに２つの群（ｎ＝４）に分け、一方に０．９％生理食塩水中の３０％プロピレングリコールを５日／週で静脈内注射し、これを鉄キレート剤処置群に対する対照とした。他方の群には０．９％生理食塩水中の１５％プロピレングリコールを３日に１回、腹腔内投与し、これはゲムシタビン処置に対する好適な対照であった。対照腫瘍が１，０００ｍｍ３に到達したら、倫理的要件のため、安楽死させた。
血液学、生化学および組織学：
インビボ実験の終了時に、心臓穿刺により血液を回収し、標準的方法により血液学的指標をアッセイした（Dunn, L. L, et al (2006) Carcinogenesis 27.2157-69）。臓器および腫瘍を含む組織をパラフィンブロック中に包埋し、切片を作製した。３種類の異なる染色法、すなわちヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、ペルルス（Pearl’s）またはゴモリトリクローム染色を利用した。ＰＡＮＣ１腫瘍異種移植片試験において、独立した獣医病理学者（Dr Terrence Rothwell, Rothwell Consulting,オーストラリア、ニューサウスウエールズ州アバロンビーチ）が、病理学的特徴の組織学的分析および定量を行った。
統計解析：
スチューデントのｔ検定を用いてデータを比較した。結果は、別段の断りがない限り、平均±ＳＥＭとして表した。ｐ＜０．０５である場合、データは統計学的に有意であるとみなした。
実施例４ａ−ＤＭＳ−５３ヒト肺癌のインビボ阻害におけるｉ．ｖ投与によるＤｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌの影響
ヌードマウス中のＤＭＳ−５３異種移植片モデルにおいてＤｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌに対する強力な反応が観察された（図５）。２５日後、対照ビヒクル処理マウスにおける平均正味腫瘍サイズは、最初の腫瘍体積の７８０％であり、一方で、４または６ｍｇ／ｋｇのＤｐ４ｅ４ｍＴで処置したマウスでは正味腫瘍サイズが最初の体積の１２０〜１２２％であった。これは、最初の腫瘍体積の１２２％まで腫瘍成長を抑制した０．７５ｍｇ／ｋｇのＤｐ４４ｍＴにより示された腫瘍抑制度と同等であった（図５）。
実施例４ａ（ｉ）−ｉ．ｖ．によるＤｐ４ｅ４ｍＴ処置後の生物学的評価：
ＤＭＳ−Ｓ３ヒト肺癌腫を有するマウスにおける体重減少および血液学的分析
ＤＭＳ−５３肺癌試験において、０．７５ｍｇ／ｋｇのＤｐ４４ｍＴでｉ．ｖ．処置したマウスは、最初の体重の９％、体重が減少した（表３）。対照的に、４または６ｍｇ／ｋｇのＤｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌで処置したマウスの体重減少は、２５日間の処置後、それぞれ、最初の体重の０．６％および７％であった（表３）。この実験における対照マウスの体重減少は最初の体重の６％であった（表３）。
Figure 2014502599
血液学に関して、０．７５ｍｇ／ｋｇのＤｐ４４ｍＴまたは１．５、４もしくは６ｍｇ／ｋｇのＤｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌでの処置の２週間後、赤血球細胞数、ヘモグロビンまたは白血球細胞数の有意な変化はなかった（表４）。このことから、使用した用量および投与スケジュールにおいて、Ｄｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌが耐容性良好であったことが示される。
Figure 2014502599
実施例４ａ（ｉｉ）−ＤＭＳ−５３ヒト肺癌を有するマウスにおけるｉ．ｖ． Ｄｐ４ｅ４ｍＴ処置後の組織学におけるＤｐ４ｅ４ｍＴの影響
ｉ．ｖ．ＤＭＳ−５３ヒト肺癌実験からの組織において、組織学的評価を行った。ビヒクル、Ｄｐ４４ｍＴ（０．７５ｍｇ／ｋｇで２週間）またはＤｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌ（４ｍｇ／ｋｇおよび６ｍｇ／ｋｇで２週間）で処置した、ＤＭＳ−５３異種移植片を移植したマウスからの組織を比較して、結果を考察する。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した切片において、対照およびキレート剤処置マウスからの肝臓、脾臓、腎臓、脳または腫瘍の組織学において、顕著な差は見られなかった。
しかし、Ｄｐ４４ｍＴ（０．７５ｍｇ／ｋｇ；図６）で処置したマウスにおいて心筋病変が観察された。このような病変は、あまり分化していない壊死病巣から構成され、ゴモリトリクローム染色を用いて明らかになった未熟な繊維性組織に置き換わっており（矢印；図６）、これはＤｐ４４ｍＴに対して以前記載されたものと一致した（Whitnall, M., J. Howardら (2006年).Proc Natl Acad Sci USA 103:14901-6）。しかし、Ｄｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌは、ｉ．ｖ．投与２週間後、４ｍｇ／ｋｇまたは６ｍｇ／ｋｇで心筋病変を誘発しなかった（図６）。
実施例４ｂ−ＤＭＳ−５３ヒト肺癌のインビボ阻害における、経口投与によるＤｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌの影響
Ｄｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌをｉ．ｖ．投与により与えた場合に見られたものと同様に（図５）、ＤＭＳ−５３異種移植片を有するヌードマウスにおいて、強制経口投与によるＤｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌに対する強力な反応が観察された（図７Ａ）。２１日後、対照ビヒクル処置マウスにおける平均正味腫瘍サイズは、最初の腫瘍体積の１１２４％であり、一方、７．５または１０ｍｇ／ｋｇのＤｐ４ｅ４ｍＴで処置したマウスでは、最初の腫瘍体積の正味腫瘍サイズは、それぞれ４０４％および２８４％であった（図７Ａ）。低用量のＤｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌ（２．５および５ｍｇ／ｋｇ）も、腫瘍成長を最初の体積の６４５％および７３３％にそれぞれ制限した（図７Ａ）。
腫瘍重量を見てみると、２１日の処置期間終了時、未処置対照マウスの腫瘍重量は平均で１．８ｇとなった（図７Ｂ）。強制経口投与により１０ｍｇ／ｋｇのＤｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌで処置したマウスの平均腫瘍重量は、強力かつ有意に（ｐ＜０．０００２）０．４６ｇに減少した（図７Ｂ）。強制経口投与による低用量のＤｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌも、腫瘍重量を有意に抑制した（図７Ｂ）。例えば、最低用量である２．５ｍｇ／ｋｇを投与した結果、平均腫瘍重量が０．６３ｇに有意に（ｐ＜０．００２）減少した（図７Ｂ）。
実施例４ｂ（ｉ）−経口Ｄｐ４ｅ４ｍＴ処置後の生物学的評価：ＤＭＳ−５３ヒト肺癌を有するマウスにおける体重減少および血液学的分析
Ｄｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌで経口により処置したＤＭＳ−５３肺癌試験マウスにおいて、対照群と比較して、どの処置群も有意な体重減少はなかった（表５）。例えば、対照マウスがそれらの最初の体重の９６％を維持した一方で、最高用量のＤｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌ（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスはそれらの最初の体重の９４％を保持しており、このことから、この用量での処置が耐容性良好であったことが示される（表５）。
Figure 2014502599
血液学に関して、２．５、５、７．５または１０ｍｇ／ｋｇのＤｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌでの２１日間の処置後、赤血球細胞数、ヘマトクリットまたは白血球細胞数の有意な変化があった（表６）。未処置動物と比較して、５ｍｇ／ｋｇのＤｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌにより白血球細胞が有意に（ｐ＜０．０５）減少し、１０ｍｇ／ｋｇでヘモグロビンが有意に（ｐ＜０．０５）減少したものの、これらの変化の臨床的意義は不明である。全体としては、血液学により、Ｄｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌを使用した用量および投与スケジュールは耐容性良好であったことが示された。
血清生化学分析から、５ｍｇ／ｋｇのＤｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌ処置によって、「総鉄結合能（ＴＩＢＣ）」が対照と比較して有意に（ｐ＜０．０５）低下したことが示された（それぞれ、５３．１±１．２〜６０．７±２μｍｏｌ／Ｌ；表６）。しかし、より高い投与量の処置群では、ＴＩＢＣの抑制は示されなかった（表６）。さらに、「不飽和鉄結合能」（ＵＩＢＣ）が、未処置対照と比較して、５および７．５ｍｇ／ｋｇのＤｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌ処置群で有意に（ｐ＜０．０１）上昇したが、１０ｍｇ／ｋｇ処置群では、何ら顕著な変化は示されなかった（表６）。１０ｍｇ／ｋｇのＤｐ４ｅ４ｍＴ／ＨＣｌ処置マウスにおいて、未処置対照と比較して、アルカリホスファターゼも有意に上昇し（ｐ＜０．０１）（それぞれ、８９．５±４．５〜６８．７±１２．８；表６）、２．５および７．５ｍｇ／ｋｇ群でも有意に上昇した（表６）。
Figure 2014502599
実施例４ｂ（ｉｉ）−ＤＭＳ−５３ヒト肺癌を有するマウスにおける経口Ｄｐ４ｅ４ｍＴ処置後の組織学におけるＤｐ４ｅ４ｍＴの影響
経口ＤＭＳ−５３ヒト肺癌実験からの組織において、組織学的評価を行った。ビヒクル、Ｄｐ４４ｍＴ（０．７５ｍｇ／ｋｇで２週間）またはＤｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌ（２．５、５、７．５および１０ｍｇ／ｋｇで３週間）で処置したＤＭＳ−５３異種移植片を移植したマウスからの組織と比較して、結果を考察する。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した切片において、対照およびチオセミカルバゾン処置マウスからの肝臓、脾臓、腎臓、脳または腫瘍の組織学において、顕著な差は見られなかった（図８）。
しかし、Ｄｐ４４ｍＴ（０．７５ｍｇ／ｋｇ；図８）で処置したマウスにおいて心筋病変が観察された。このような病変は、あまり分化していない壊死病巣から構成され、ゴモリトリクローム染色を用いて明らかになった未熟な繊維性組織で置き換わっていた（矢印；図８）。しかし、Ｄｐ４ｅ４ｍＴ．ＨＣｌは、２．５、５、７．５および１０ｍｇ／ｋｇの経口投与３週間後、心筋病変を誘発しなかった（図８）。
実施例４ｃ−ＰＡＮＣ１ヒト膵臓癌のインビボでの抑制におけるｉ．ｖ投与によるＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ．ＨＣｌの影響
インビトロ分析から、チオセミカルバゾンＤｐ４４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ．ＨＣｌは、ゲムシタビンと比較した場合、一連の膵臓癌細胞株の増殖を阻害する点で非常に有効であることが明らかとなった（図３Ａ〜Ｃ、表２ＡおよびＢ）。膵臓癌に対してチオセミカルバゾンの有効性の特徴をさらに調べるために、インビボ実験を行った。
ＰＡＮＣ１異種移植片を用いて、処置６週間後、ビヒクル対照マウスの平均腫瘍サイズは、最初の腫瘍体積のおよそ６４０％に達し、一方でゲムシタビン、Ｄｐ４４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ．ＨＣｌで処置した群の平均は、元の腫瘍サイズのそれぞれ３１９％、３０５％および１１２％となった（図９Ａ）。ゲムシタビン（ｐ＜０．０１）、Ｄｐ４４ｍＴ（ｐ＜０．０５）およびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ．ＨＣｌ（＜０．００１）は全て、処置４３日後、対照と比較して腫瘍体積が有意に低下した。
さらに、処置４３日後の最終腫瘍重量は腫瘍体積を反映しており、対照腫瘍の重量は平均２９２±６５ｍｇとなり、一方でゲムシタビン、Ｄｐ４４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ．ＨＣｌで処置した腫瘍の重量はそれぞれ平均６７±２５ｍｇ、１２２±３３ｍｇおよび４０±１２ｍｇであった（図９Ｂ）。これらの結果から、各処置が、インビボで腫瘍異種移植片の成長および進行を有意に抑制することができたことが示される。
Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ．ＨＣｌとゲムシタビン腫瘍体積との間の差が統計学的に有意ではなかった（ｐ＞０．０５）ものの、得られたデータから、第３２日の後、ゲムシタビンおよびＤｐ４４ｍＴ処置の両方が、Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ．ＨＣｌと比較した場合、腫瘍成長を阻害する点で効果が僅かに低かったことが示された（図９Ａ）。ビヒクル対照群の腫瘍サイズはこの実験の持続期間の限定要因であったので、倫理的制限のために、４３日後、さらなる処置を継続することができなかった。
実施例４ｃ（ｉ）−ｉ．ｖ．Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ．ＨＣｌ処置後の生物学的評価：ＰＡＮＣ１ヒト膵臓癌を有するマウスにおける体重減少および血液学的分析
上記のインビボの試験で使用した様々な薬剤が何らかの毒性を付随したか否かを判定するために、血液学的指標ならびに体重および臓器重量を安楽死後に分析した。
Figure 2014502599
処置６週間後の動物の体重は、Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ．ＨＣｌを除き、各群に対して処置前の体重の１００％に近いままであった（表７Ａ）。これらの動物は、それらの処置前の体重と比較した場合、体重減少が１２％と、有意（ｐ＜０．００１）であった（表７Ａ）。様々な処置群の間で臓器重量において有意差は見られなかったものの（表７Ａ）、Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ．ＨＣｌ群も、対照群と比較した場合、脾臓が有意に（ｐ＜０．００１）小さかったことが観察された（表７Ａ）。脾臓の組織学的分析から、全群においてマウスの脾赤髄が、造血細胞の正常な集団を含有したことが分かった。したがって、脾臓毒性を示唆する証拠はなかった（図１０）。
Figure 2014502599
チオセミカルバゾン化合物は鉄キレート剤であるので、血液学的指標、特に貧血の兆候は、調べるべき重要なパラメーターであった。対照と様々な処置群との間で赤血球細胞（ＲＢＣ）、白血球細胞（ＷＢＣ）または血小板数の有意差は検出されなかった（表７Ｂ）。しかし、Ｄｐ４４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ．ＨＣｌ群は、対照群と比較した場合、ヘモグロビン（Ｈｂ）が有意に（ｐ＜０．０１）低く、網状赤血球レベルは有意に（ｐ＜０．０５）高かった（表７Ｂ）。これは、これらの動物における軽度の貧血の指標であり得る。
実施例４ｃ（ｉｉ）−ＰＡＮＣ１ヒト膵臓癌を有するマウスにおける経口Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ．ＨＣｌ処置後の組織学における影響
臓器における様々な処置の潜在的な毒作用をさらに調べるために、Ｈ＆Ｅ（全般的な病理学）、ペルルス（Pearls’）（鉄の有無について）およびゴモリトリクローム（繊維症について）で染色することによって、脾臓、腎臓、肝臓、心臓、肺、脳および骨髄の組織学的分析を行った。獣医病理学者が組織学的分析を行い、結果を表８で与える。
Figure 2014502599
２匹のＤｐ４４ｍＴ処置マウスは、肝臓において造血細胞のいくつかの証拠を含有した。さらに、１０匹の対照処置マウスのうち５匹および全てのＤｐ４４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ．ＨＣｌ−処置動物の腎臓において鉄蓄積が観察されたが（表８）、これは、それぞれ、食事中の鉄および尿中でのチオセミカルバゾンキレート剤により形成される鉄錯体の排出によるものであり得る。ゲムシタビン処置群は、腎臓における鉄蓄積の証拠はなかった（表８）。Ｄｐ４４ｍＴ群の各マウスの心筋は、心筋繊維変性および、繊維性組織による置き換えを伴う壊死を特徴とした心筋病変を呈した（図１０；表８）。右心室の壁で認められた病理学的変化が最も顕著であり、左心室の心内膜下の心筋でも見られた（図１０）。これは、Ｄｐ４４ｍＴ−処置ヌードマウスにおける、心臓繊維症も検出された先行試験と一致する。Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ．ＨＣｌ処置群の心臓において、線維性病変の顕著な証拠はなく、このことから、この化合物がより高い用量でインビボでＤｐ４４ｍＴよりも強力であり、毒性がかなり低かったことが明らかとなる。
重大なこととして、調べた他の臓器の何れでも、病理学的な証拠はなく（表８）、このことから、Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ．ＨＣｌもゲムシタビンも、非処置対照と比較した場合、顕著な組織損傷を誘発しなかったことが示唆される。
実施例４ｄ：転移抑制因子タンパク質ＮＤＲＧ−１、トランスフェリン受容体および細胞周期制御分子の発現におけるＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴの影響：
方法：
ウエスタンブロット分析
既に記載されているようにタンパク質単離を行った（Dunn, L. L., et al(2006年) Carcinogenesis 27: 2157-69。
確立されたプロトコールを介してウエスタン分析を行った（Gao, J. and D. R. Richardson (2001年). Blood 98:842-50）。使用した一次抗体は、ＮＤＲＧ１（Abcam;UK）、ｐ２１、サイクリンＤ１、トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１；アメリカ合衆国カリフォルニア州サンタクルズ）およびβ−アクチン（Sigma-Aldrich）に対するものであり、二次ＨＲＰ−結合ヤギおよびマウス抗体（Sigma-Aldrich）を使用した。
結果：
Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴがＮＤＲＧ−１発現を上方制御し得るか否かを判定するために、Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴを試験した。細胞周期進行に関与する他のキーとなる分子におけるキレート剤Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴの影響をさらに評価するために、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞におけるサイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ｐ２１ならびにサイクリンＤ１の発現も調べた。トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）はチオセミカルバゾン化合物により上方制御されることが既に分かっているので、鉄キレート剤処置に対する陽性対照として、このタンパク質も調べた。
Ｄｐ４４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴは両者とも、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞においてＮＤＲＧ１発現を有意に（ｐ＜０．０１）上方制御したが、一方でゲムシタビンは顕著な影響がなかった（図１１）。さらに、Ｄｐ４４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴも、これらの細胞においてｐ２１発現を顕著に（ｐ＜０．０５）増加させながら、サイクリンＤ１レベルを有意に（ｐ＜０．０５）低下させた（図１）。さらに、チオセミカルバゾン化合物での処置後、ＴｆＲ１レベルも、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞において有意に（ｐ＜０．０５）上方制御され、このことから、これらの薬剤が細胞で鉄を効果的に枯渇させたことが示唆される（図１１）。他方では、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞において、ゲムシタビン処置により、サイクリンＤ１、ｐ２１またはＴｆＲ１レベルは調節されず（図１１）、このことから、その作用機構がチオセミカルバゾンの作用機構とは異なることが示される。
まとめると、これらの結果からＮＤＲＧ１がＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴにより顕著に上方制御されることが示され、Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴは、癌細胞におけるＮＤＲＧ１発現を標的とすることにより、癌に対する有益な治療計画となり得ることが示唆される。
実施例５：鉄キレート剤による、メトヘモグロビン（ｍｅｔＨｂ）レベルおよびメトミオグロビン（ｍｅｔＭｂ）のインビトロおよびインビボの調節
方法
化学物質
トリアピン（登録商標）を合成し、公開されている方法に従って特徴を調べた（Liu MC, Lin TCら(1992年). J Med Chem 35: 3672-3677）。Ｄｐ４４ｍＴ、Ｂｐ４ｅＴ、ＤｐＣ、ジ−２−ピリジルケトン−４−エチル−４−メチル−３−チオセミカルバゾン（Ｄｐ４ｅ４ｍＴ）、ジ−２−ピリジルケトン−４−フェニル−３−チオセミカルバゾン（Ｄｐ４ｐＴ）およびジ−２−ピリジルケトン−２−メチル−３−チオセミカルバゾン（Ｄｐ２ｍＴ）も合成し、公開されている方法に従って特徴を調べた。Richardson DR, Sharpe PCら(2006年). J Med Chem 49: 6510-6521; Kalinowski DS, Yu Yら(2007年). J Med Chem 50: 3716-3729)。他の化学物質は全て、Sigma-Aldrich(アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイス)から購入した。下記に記載のアッセイでの使用のために、化合物をＤＭＳＯ中で新たに調製し、希釈した（最終［ＤＭＳＯ］＜０．０５％）。
赤血球細胞分離
健康なヒト提供者またはマウスから、ＥＤＴＡを含有する好適な採血管中に全血試料を回収し、すぐに使用した。遠心（４８０ｘｇ／５分／４℃）により赤血球細胞（ＲＢＣ）を分離し、次いでハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で洗浄した。ＨＢＳＳ中、１：１でＲＢＣを再懸濁し、３７℃で全ＲＢＣアッセイを行った。
ミオグロビン調製
マウス心臓組織を徹底的に氷冷ＨＢＳＳでかん流して血液を除去し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche,スイス,バーゼル）を含有する氷冷ＨＢＳＳ中でホモジナイズ処理した。心臓ホモジネートを遠心（１６，０００ｘｇ／４５分／４℃）し、上清（［ｏｘｙＭｂ］＝５０μＭ）をすぐに使用した。
ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度分析法によるｍｅｔＨｂおよびｍｅｔＭｂレベルの測定
公開されている方法に従い、Shimadzu UV-Vis分光光度計（UV-1800；島津製作所、日本、京都）を用いて、ｍｅｔＨｂおよびｍｅｔＭｂに対して５７７ｎｍおよび６３０ｎｍで、ＲＢＣ溶解液中のｍｅｔＨｂおよびｍｅｔＭｂレベルを調べた（Winterbourn CCおよびCarrell RW(1977). Biochem J 165: 141-148）。
マウスにおけるＭｅｔＨｂ−およびｍｅｔＭｂ−形成
シドニー大学のAnimal Ethics Committeeにより承認されたプロトコール下でＣ５７ＢＬ／６マウス（７〜８週齢）を使用した。３０％プロピレングリコール／生理食塩水中でＤｐ４４ｍＴ、トリアピン（登録商標）またはＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ（全て６ｍｇ／ｋｇ）を溶解し、尾部静脈を介してｉｖ投与した。続いて、投与から３０分後、イソフルランでマウスに麻酔をかけ、心臓穿刺により血液試料を採取した。ｍｅｔＨｂの概算のために２．５体積の超純水を用いて血液試料を溶解した。イソフルランを用いて安楽死によりマウスを屠殺し、心臓をＨＢＳＳで徹底的にかん流し、Ｍｂを分離した。
統計
スチューデントのｔ検定を用いてデータを比較した。結果は、ｐ＜０．０５である場合、有意とみなした。結果は平均±ＳＤである。
実施例５ａ−ヒトＲＢＣにおける鉄キレート剤のＭｅｔＨｂ形成誘導能
無傷ＲＢＣとのｍｅｔＨｂ生成におけるキレート剤濃度（１〜２５μＭ）の影響を評価した（図１２）。３ｈ／３７℃後、トリアピン（登録商標）またはＤｐ４４ｍＴで処理した無傷ＲＢＣにおいて、対照と比較して、ｍｅｔＨｂの有意な（ｐ＜０．００１）用量依存的上昇が全てのリガンド濃度で検出された（図１２）が、ｍｅｔＨｂ形成誘導能を示すキレート剤はこれらのみであった。２５μＭで、これらのキレート剤によって、それぞれ総Ｈｂの１９．９５±１．０および１９．９±３．０％にｍｅｔＨｂ形成が増加した（図１２）。陰性対照キレート剤Ｄｐ２ｍＴは、意図的に錯体形成を妨げるメチル基を特色としている。したがって、このキレート剤は、ｍｅｔＨｂ形成を引き起こす鉄とのレドックス−相互作用に関与することができない（図１２）。さらに、鉄過剰症に対する治療薬として現在使用されている非レドックス活性のキレート剤ＤＦＯもｍｅｔＨｂ形成を増加させなかった。
重要なこととして、Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴは、インビトロでｍｅｔＨｂ形成を促進しなかった（図１２）。これは、トリアピン（登録商標）と比べて、ＤｐｃｙｃＨ４ｍＴ療法の明確な長所となり得る。
実施例５ｂ−鉄キレート剤トリアピン、Ｄｐ４４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴのインビボでのｍｅｔＨｂ形成誘導能
Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴがｍｅｔＨｂ形成を促進しなかったことを示す実施例５ａのインビトロでの結果を確認するために、上述のようなマウスモデルにおけるｍｅｔＨｂ形成を調べた。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＤｐ４４ｍＴ（６ｍｇ／ｋｇ）、トリアピン（登録商標）（６ｍｇ／ｋｇ）またはＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ（６ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与し、ｍｅｔＨｂを評価するために３０分後に採血した（図１３）。既に観察されているように、Ｄｐ４４ｍＴにより、ビヒクルと比較して、有意な（ｐ＜０．００１）ｍｅｔＨｂレベルが誘導されたが（それぞれ、総Ｈｂに対する１．３±０．９％のｍｅｔＨｂ％に対して、６．３±０．８）、一方でＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴにより誘導されたｍｅｔＨｂレベルは対照と同等であった（図１３）。
Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴを用いたこの結果から、実施例５ａにおけるインビトロ試験の結果が確認され、さらに、Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴが、Ｄｐ４４ｍＴと比較して、ｍｅｔＨｂを誘導しないという特定の長所を有し得ることが示唆される。
実施例５ｃ−鉄キレート剤トリアピン、Ｄｐ４４ｍＴおよびＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴのインビボでのメトミグロビン（metmyglobin）（ｍｅｔＭｂ）形成誘導能
タンパク質ミオグロビン（Ｍｂ）は、酸素の貯蔵および筋肉への供与において重要な役割を果たし、ヘモグロビンに対する単量体対応物である。したがって、インビボでのｍｅｔＭｂ形成における強力な抗癌活性キレート剤の影響を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＤｐ４４ｍＴ（６ｍｇ／ｋｇ）、トリアピン（登録商標）（６ｍｇ／ｋｇ）またはＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴ（６ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与し、ｍｅｔＭｂを評価するために３０分後に採血した（図１４）。
キレート剤Ｄｐ４４ｍＴは、ｍｅｔＭｂレベルを有意に（ｐ＜０．００１）誘導したが（８２．３±２．６％）、これはトリアピン（登録商標）（７５．２±４．２％）と同様であり、一方で、Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴが生成させたｍｅｔＭｂのレベルは有意に（ｐ＜０．００１）低かった（３１．７±３．２％；図１４）。
しかし、Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴが介在するｍｅｔＭｂレベルは、対照よりも有意に（ｐ＜０．００１）高かった（１２．６±２．４％；図１４）。
まとめると、抗腫瘍活性を維持しながら、ｍｅｔＨｂおよびｍｅｔＭｂ形成の誘導において非常に影響が少ないということに関するＤｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴの特性から（Kovacevic Z, Chikhani Sら(2011年). Mol Pharm 80: 598-609）、Ｄｐ４ｃｙｃＨ４ｍＴがトリアピン（登録商標）およびＤｐ４４ｍＴを凌ぐ重要な長所を有することが示唆される。

Claims (17)

  1. 一般式（Ｉ）の化合物：
    Figure 2014502599
    （式中、Ｒ１はシクロへキシルまたはエチルである。）；
    およびそれらの塩、水和物および溶媒和物。
  2. ジ−２−ピリジルケトン４−エチル−４−メチル−３−チオセミカルバゾンである請求項１に記載の化合物およびそれらの塩、水和物および溶媒和物。
  3. ジ−２−ピリジルケトン４−シクロへキシル−４−メチル−３−チオセミカルバゾンである請求項１に記載の化合物およびそれらの塩、水和物および溶媒和物。
  4. 前記塩が薬学的に許容可能な塩である、請求項１〜３の何れか１項に記載の化合物。
  5. ジ−２−ピリジルケトン４−エチル−４−メチル−３−チオセミカルバゾン塩酸塩である、請求項２に記載の化合物。
  6. ジ−２−ピリジルケトン４−シクロへキシル−４−メチル−３−チオセミカルバゾン塩酸塩である、請求項３に記載の化合物。
  7. 薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤またはアジュバントと共に、請求項１〜６の何れか１項に記載の式（Ｉ）の化合物またはそれらの塩、水和物もしくは溶媒和物を含む、医薬組成物。
  8. 癌の治療を必要とする哺乳動物に、有効量の、請求項１〜６の何れか１項に記載の式（Ｉ）の化合物またはそれらの塩、水和物もしくは溶媒和物、または請求項７に記載の医薬組成物を投与することを含む、哺乳動物において癌を治療する方法。
  9. 前記癌が、メラノーマ、皮膚癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、肝臓癌、消化管癌、結腸直腸癌、脳腫瘍、頭頸部癌、骨癌、膵臓癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌および血液系腫瘍（例えば白血病およびリンパ腫）から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 前記癌が、膵臓癌、肺癌および脳腫瘍から選択される、請求項８または９に記載の方法。
  11. 前記癌が固形腫瘍である、請求項８に記載の方法。
  12. 前記哺乳動物がヒトである、請求項８〜１１の何れか１項に記載の方法。
  13. 癌の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜６の何れか１項に記載の式（Ｉ）の化合物またはそれらの塩、水和物もしくは溶媒和物の使用。
  14. 前記癌が、メラノーマ、皮膚癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、肝臓癌、消化管癌、結腸直腸癌、脳腫瘍、頭頸部癌、骨癌、膵臓癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌および血液系腫瘍（例えば白血病およびリンパ腫）から選択される、請求項１３に記載の使用。
  15. 前記癌が、膵臓癌、肺癌および脳腫瘍から選択される、請求項１４に記載の使用。
  16. 前記癌が固形腫瘍である、請求項１４に記載の使用。
  17. 癌の治療における使用のための、請求項１〜６の何れか１項に記載の式（Ｉ）の化合物またはそれらの塩、水和物もしくは溶媒和物。
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