JP2014500250A - ナノポリマーをベースとした核酸送達のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物を提供する。1つの局面において、p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物は、500nm未満の脱アセチル化ポリ−N−アセチルグルコサミン乳酸誘導体ナノ粒子および核酸を含んでいる。また、本発明は、核酸を被験体に投与する方法であって、p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物を被験体に投与する工程を含む方法をも提供する。ある実施形態において、p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物は被験体に皮下投与される。
DNAワクチンとは、正確かつ効果的に抗原を免疫系に提示する柔軟な戦略である。しかしながら、DNAワクチンは理論上あらゆる利点を持っているにも関わらず、DNAワクチンを用いた臨床実験は、期待を裏切る結果ばかりであった。DNAワクチンの臨床応用(clinical translation)における中心的な問題の一つが、プラスミドDNA送達に最適ではないプラットフォームであるということは、ますます明白になってきている。また、核酸送達のために改良されたプラットフォームは、in vivoおよびex vivoにおける様々な遺伝子治療への応用にも必要とされている。
本発明は、ポリ−N−アセチルグルコサミン(「p−GlcNAc」)ナノ粒子/核酸組成物を提供する。一局面において、p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物は、ポリ−N−アセチルグルコサミン、および核酸を含有し、該ポリ−N−アセチルグルコサミンのうち、少なくとも40%は脱アセチル化されている。幾つかの実施形態において、上記核酸はDNAである。ある実施形態においては、上記p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物中の該ナノ粒子のサイズは、約5nmから500nmである。幾つかの実施形態において、p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物中の該ナノ粒子の少なくとも50%が、約5nmから500nmのサイズである。ある実施形態においては、上記p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物中の該ナノ粒子は、約10nmから500nmまで、20nmから200nmまで、20nmから150nmまで、20nmから100nmまで、25nmから250nmまで、25nmから150nmまで、25nmから100nmまで、50nmから200nmまで、または50nmから150nmまでのサイズである。特定の実施形態において、上記p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物中の該ナノ粒子のうち、少なくとも50%は、約10nmから500nmまで、20nmから200nmまで、20nmから150nmまで、20nmから100nmまで、25nmから250nmまで、25nmから150nmまで、25nmから100nmまで、50nmから200nmまで、または50nmから150nmまでのサイズである。特定の実施形態においては、上記ナノ粒子の少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、98%、または99%は、5nmから500nmまで、10nmから500nmまで、20nmから200nmまで、20nmから150nmまで、20nmから100nmまで、25nmから250nmまで、25nmから150nmまで、25nmから100nmまで、50nmから200nmまで、または50nmから150nmまでのサイズである。ある実施形態においては、上記ナノ粒子のサイズは、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察に基づいて決定される。幾つかの実施形態において、上記組成物は、さらにアジュバントを含有している。特定の実施形態において、該アジュバントはポリI:Cである。別の実施形態では、該アジュバントはサイトカインである。
用語「アルキル」とは、一価の直鎖状または分枝状の飽和炭化水素基のことであり、本明細書中に記載されているように、アルキレンを任意で置換してもよい。また用語「アルキル」は、特に記載しない限り、直鎖状のアルキルおよび分枝状のアルキルの両方を包含する。ある実施形態において、上記アルキルは、1〜20(C1−20)、1〜15(C1−15)、1〜10(C1−10)、もしくは1〜6(C1−6)の炭素原子を有する一価の直鎖状飽和炭化水素基であるか、または3〜20(C3−20)、3〜15(C3−15)、3〜10(C3−10)、もしくは、3〜6(C3−6)の炭素原子を有する一価の分枝状飽和炭化水素基である。本明細書中でも使用されているように、直鎖状C1−6アルキル基および分枝状C3−6アルキル基は、「低級アルキル」とも呼ばれる。例えば、アルキル基としては、メチル、エチル、プロピル(全ての異性体を含む)、n−プロピル、イソプロピル、ブチル(全ての異性体を含む)、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、ペンチル(全ての異性体を含む)、およびヘキシル(全ての異性体を含む)などが包含されるが、これらに限定されない。例えば、C1−6アルキルとは、1〜6の炭素原子を有する一価の直鎖状飽和炭化水素基、または、3〜6の炭素原子を有する一価の分枝状飽和炭化水素基である。
図1(A)−(F)は、p−GlcNAcナノ粒子の走査型電子顕微鏡写真である。
5.1 p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物
以下、p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物について説明する。ある実施形態においては、p−GlcNAcナノ粒子/DNA組成物がポリ−N−アセチルグルコサミンまたはその誘導体を含有している。幾つかの実施形態において、ポリ−N−アセチルグルコサミンは、β−1→4配置を有している。他の実施形態において、ポリ−N−アセチルグルコサミンは、α−1→4配置を有している。また、ある実施形態において、ポリ−N−アセチルグルコサミンの純度は、約100%、99.9%、99.8%、99.5%、99%、98%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、または20%である。特定の実施形態においては、ポリ−N−アセチルグルコサミンの純度は90〜100%である。幾つかの実施形態において、ポリ−N−アセチルグルコサミンは90%より高い、95%より高い、98%より高い、99%より高い、または99.5%より高い純度にもなる。ある実施形態において、ポリ−N−アセチルグルコサミンのうち、25%〜50%、40%〜95%、40%〜90%、40%〜80%、40%〜65%、50%〜65%、50%〜95%、50%〜90%、50%〜80%、60%〜95%、60%〜90%、60%〜80%、65%〜75%、65%〜95%、65%〜90%、65%〜80%、70%〜95%、70%〜90%、75%〜80%、75%〜85%、85%〜95%、90%〜99%、または95%〜100%が脱アセチル化されている。幾つかの実施形態では、ポリ−N−アセチルグルコサミンのうち、25%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、または100%が脱アセチル化されている。幾つかの実施形態では、ポリ−N−アセチルグルコサミンのうち、少なくとも25%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%、またはそれを上回る割合が脱アセチル化されている。特定の実施形態においては、ポリ−N−アセチルグルコサミンまたは脱アセチル化されたポリ−N−アセチルグルコサミンが、それらの可溶化を容易にするために、有機酸または無機酸を用いて誘導体化され、アンモニウム塩を生成しているものもある。ある実施形態においては、ポリ−N−アセチルグルコサミンまたは脱アセチル化ポリ−N−アセチルグルコサミンを、乳酸を用いて誘導体化している。ある実施形態において、ポリ−N−アセチルグルコサミンまたは脱アセチル化ポリ−N−アセチルグルコサミンは、それらの可溶化を容易にするために、乳酸を用いて誘導体化されている。米国特許第5,622,834号; 第5,623,064号; 第5,624,679号; 第5,686,115号; 第5,858,350号; 第6,599,720号; 第6,686,342号;および第7,115,588号(各文献は、その全体を参照により本明細書に援用する)には、ポリ−N−アセチルグルコサミンとその誘導体、およびそれらを製造する方法が記載されている。
p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物は、当業者に知られている任意の核酸を含むことができる。このような核酸としては、cDNA、ゲノムDNA、プラスミドDNA、プラスミドRNA、mRNA、siRNA、microRNA、一重鎖RNA、二重鎖RNA、オリゴヌクレオチド、一重鎖もしくは二重鎖オリゴヌクレオチド、三重鎖オリゴヌクレオチド、および他の核酸などの、DNAやRNAがあるが、これらに限らない。ここでの核酸は、センス方向やアンチセンス方向における核酸、修飾核酸、非修飾核酸、および合成核酸を含む。特定の実施形態において、核酸は遺伝子のコード領域である。
ある実施形態においては、本明細書におけるp−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物は、アジュバントを含んでいるか、またはアジュバントとともに投与される。本明細書における組成物と共に投与されるアジュバントは、該組成物の投与前に投与されても、組成物と共に投与されても、組成物の投与後に投与されてもよい。特定の実施形態において、アジュバントは、p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物中に含まれた状態で投与される。他の実施形態では、アジュバントは、核酸と同一の組成物とともに投与されるが、核酸と同一の組成物中に含まれた状態では投与されない。
ある実施形態において、可溶化するために(セクション5.1で上述)、乳酸、クエン酸、琥珀酸、グルコン酸、グルクロン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、酒石酸、タルトロン酸、またはフマル酸等の無機酸または有機酸によって誘導体化された、脱アセチル化ポリ−N−アセチルグルコサミンを含有するp−GlcNAc組成物は、緩衝剤(例えば、酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液または酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液等の酢酸緩衝液)中で希釈され、任意で、一定の温度(例えば、45℃〜55℃、50℃〜55℃、50℃〜60℃、55℃〜60℃、55℃〜65℃、60℃〜75℃、または45℃〜75°)で、一定時間(例えば、5〜10分、5〜15分、10〜15分、10〜20分、15〜30分、30〜45分、30分〜1時間、45分〜1時間、5分〜1時間、10分〜1時間、または少なくとも5〜10分)インキュベートされる。ある実施形態において、上記有機酸は、RCOOHの構造を有しており、Rは任意で置換されたアルキル、アルケニル、またはアルキニルでもよい。幾つかの実施形態では、Rは、任意で置換されたアルキルでもよい。幾つかの実施形態では、Rは1または複数の水酸基によって置換されたアルキルである。ある実施形態において、RCOOHは、グルコン酸または乳酸である。他の実施形態では、RCOOHはクエン酸、琥珀酸、グルコン酸、グルクロン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、酒石酸、タルトロン酸、またはフマル酸である。特定の実施形態において、本明細書中上記の方法において用いられる該緩衝剤は、上記p−GlcNAc組成物を希釈する上で効力のあるものであれば、どのような緩衝剤でもよい。
ここでは、被験体へのin vivoおよびex vivoでの核酸の送達方法について説明する。特定の実施形態において、遺伝子治療やワクチン接種のための、被験体へのin vivoでの核酸の送達方法が述べられている。該方法は、一般的に、被験体にp−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物を投与する工程を含む。ある実施形態においては、p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物が核酸だけでなくアジュバントも含有している。他の実施形態において、アジュバントは、p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物の投与前、投与中、または投与後に、p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物とは別個で投与される。
本発明は、p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物を製造するための1つ以上の原料で満たされた1つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。特定の実施形態において、薬学的パックまたはキットは容器中に脱アセチル化ポリ−N−アセチルグルコサミンアンモニウム塩誘導体(例えば、乳酸誘導体)を含んでいる。ある実施形態において、上記薬学的パックまたはキットは、下記(i)〜(iv)のうち1つ以上を含んでいる:(i)容器に入れられたpH5.7酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液(例えば、25mMのpH5.7酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液);(ii)容器に入れられた硫酸ナトリウム(例えば、50mMの硫酸ナトリウム);(iii)容器に入れられた核酸;および(iv)容器に入れられたアジュバント。
6.1 実施例1:p−GlcNAcナノ粒子/核酸組成物の調製
ステップ1:p−GlcNAcスラリー濃度の決定
1.1 p−GlcNAcスラリー原料を、脱イオン(DI)水を用いて20リットルに希釈し、一晩中もしくは24時間シェーカーで混ぜる。
マットボックスの寸法は、22cm×22cmであり、したがってボックスの面積は484cm2である。
3.1 40%のシグマ水酸化ナトリウム(NaOHフレーク)溶液は、冷却されるまでに24時間かかるため、脱アセチル反応をする1日前に作製しておく。ここでは、体積に対する重量で記載する;つまり、DI水60mLに対して、NaOHフレークは40グラムである(体積に対する重量)。溶液が冷めたら、1リットルのボトルに注ぎ入れる。
4.1 酢酸標準品(0.01、0.02、および0.03M)およびグルコサミン標準品(0.005、0.015、および0.035mg/mL)を生成し、それらをプログラムされた分光光度計にかけて標準曲線を得る。
69%脱アセチル化膜の例:
アセチルグルコサミン 221.2×.31=6857.2
グルコサミン 215.6×.69=14876.4
合計=21733.6/100=217−平均MW
ポリマーの重量 10g/217=0.046M
30%乳酸=3.33M
p−GlcNAc:LAのモル比を1:1にする場合、
46/3.33=13.81mLの乳酸が本サンプルには必要である。
(1)p−GlcNAcゲルを25mMのpH5.7酢酸ナトリウム−酢酸緩衝剤で100倍に希釈し、55℃のウォーターバスに15分間置く(希釈後の最終p−GlcNAcゲルの濃度は0.02%になる)。(2)10マイクログラムのDNAプラスミドを100マイクロリットルの50mM硫酸ナトリウムに添加し、55℃のウォーターバスに10分間置く。(3)サンプルを高速の渦流にかけながら、100マイクロリットルの希釈したp−GlcNAcゲルをDNA−硫酸ナトリウム溶液に添加する。(4)当該混合物の渦流処理を20秒間継続する。(5)被験動物に注射する前に、混合物を室温で2時間未満置いておく。得られたp−GlcNAcナノ粒子/DNA組成物は被験動物への注射に使用する。
セクション6.1に記載の手順を用いて、ルシフェラーゼをコードしたプラスミドDNAを含有するp−GlcNAcナノ粒子/DNA組成物を生成した。ルシフェラーゼをコードしたDNAを含むプラスミド調製品(pcDNALuc)(100μg/マウス)をネイキッドのDNA調製品として筋肉内に(「i.m」)注射し、または、ネイキッドのDNAもしくはp−GlcNAcナノ粒子/DNA組成物として皮下(「s.c」)に注射した。上記DNA組成物の投与後1日目、7日目、および14日目に、ルシフェリン基質を腹腔内注射し、IVSシステムを用いた生物発光イメージングによってルシフェラーゼ活性を検出した。図2はpcDNALuc組成物が注射された全てのマウスのルシフェラーゼ活性を示す。全体の内で最も高いルシフェラーゼ活性は、p−GlcNAcナノ粒子/DNA組成物の皮下注射を受けたマウスにおいて検出された。注目すべきことに、筋肉内注射を受けたマウスと同程度のDNA発現が、p−GlcNAcナノ粒子/DNA組成物を一回皮下注射した同じ動物において注射後4日までに検出された。さらに、図2はp−GlcNAcナノ粒子/DNA組成物の接種後14日までに検出された導入遺伝子の発現を示す。これによれば、投与された箇所において抗原の有効性が局所的に継続している事が示唆されている。このデータによれば、p−GlcNAcポリマーナノ粒子が、コードされた抗原の継続的発現をもたらすようにプラスミドDNAを放出することが可能であることがわかる。
DNAがプロフェッショナル抗原提示細胞に効果的に取り込まれ、流入領域リンパ節に輸送されたか否かを判断するために、p−GlcNAcナノ粒子を単独で、またはGFPをコードしたプラスミドDNA100μgを含むp−GlcNAcナノ粒子/DNA組成物を、6匹のマウスの足蹠に注射した。p−GlcNAcナノ粒子/DNA組成物の生成にはセクション6.1に記載の手順を用いた。注射の1日後に流入領域リンパ節を摘出し、PEに結合されたMHCクラスIIに対するモノクローナル抗体を用いて細胞懸濁液を染色した。MHCクラスIIおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)の二重発現について、フローサイトメトリー法によって細胞懸濁液を調べた。図3はp−GlcNAcナノ粒子/pGFP組成物を用いて免疫性を付与したマウスおよびp−GlcNAcナノ粒子単体を用いて免疫性を付与したマウスの流入領域リンパ節に由来する細胞懸濁液をフローサイトメトリーによって分析した結果を示す。図3によれば、p−GlcNAcナノ粒子/DNA組成物を接種したマウスでは、摘出したリンパ節の約30%のMCHクラスII陽性細胞中にGFPシグナルが見られた。このことから、p−GlcNAcナノ粒子が局所的に注射された箇所にDNAを送達することが可能であり、その結果、コードされた生成物がプロフェッショナル抗原提示細胞(APCs)によって流入領域リンパ節に取り込まれ、かつ輸送され、該生成物の発現に成功したことがわかる。
hgp100DNAを含有したp−GlcNAcナノ粒子をセクション6.1の手順を用いて生成した。106のPmel脾細胞(ナイーブPmel細胞:ヒトgp100(つまり、hgp100)内のエピトープに対するTCRトランスジェニックのCD8+T細胞)の養子免疫伝達の24時間後、ネイキッドのhgp100DNAを筋肉注射および皮下注射でマウスに接種するか、p−GlcNAcナノ粒子/hgp100を皮下注射でマウスに接種するか、またはマウスにワクチンを接種しなかった。血中Pmel細胞濃度は、血液サンプルのフローサイトメトリーによって判定した。図4に脾臓、末梢血液(「血液」)、およびリンパ節(「LN」)内へのネイキッドのhgp100DNAまたはp−GlcNAcナノ粒子/hgp100DNAの接種に反応したPmel細胞の増殖を示す。リンパ節において、増殖したドナーPmel細胞がより高頻度で見られた。p−GlcNAcナノ粒子/phgp100組成物を用いた免疫付与に反応したナイーブPmel細胞の増殖から分かるように、p−GlcNAcナノ粒子/DNA組成物は抗原特異的なCD8+T細胞反応を効果的に促進した。
マウスおよびヒトのメラノーマに高発現するメラノサイト分化抗原であるTRP2をコードしたDNAを用いた既に確立されたワクチン接種モデルが用いられた。従来の研究によれば、TRP2をコードしたネイキッドDNAの接種による治療効力は最低限のものである。2種類の実験手法、つまり、皮下治療モデルおよび転移治療モデルを利用して、p−GlcNAcナノ粒子/DNA組成物およびp−GlcNAcナノ粒子/DNA/アジュバント組成物の有効性を検査した。
Claims (42)
- ポリ−N−アセチルグルコサミンおよび核酸を含有しているポリ−N−アセチルグルコサミンナノ粒子/核酸組成物であって、
該ナノ粒子は、約5nmから500nmの大きさであり、該ポリ−N−アセチルグルコサミンのうち、少なくとも40%が脱アセチル化されていることを特徴とするポリ−N−アセチルグルコサミンナノ粒子/核酸組成物。 - 上記脱アセチル化ポリ−N−アセチルグルコサミンは、脱アセチル化ポリ−N−アセチルグルコサミンアンモニウム塩誘導体を含むことを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 上記脱アセチル化ポリ−N−アセチルグルコサミンは、脱アセチル化ポリ−N−アセチルグルコサミン乳酸塩誘導体を含むことを特徴とする請求項2に記載の組成物。
- 上記脱アセチル化ポリ−N−アセチルグルコサミンは、有機酸または無機酸を用いて可溶化されていることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 上記脱アセチル化ポリ−N−アセチルグルコサミンは、乳酸を用いて可溶化されていることを特徴とする請求項4に記載の組成物。
- 上記ポリ−N−アセチルグルコサミンのうち、少なくとも65%は脱アセチル化されていることを特徴とする請求項1〜5の何れか1項に記載の組成物。
- 上記ポリ−N−アセチルグルコサミンのうち、少なくとも70%は脱アセチル化されていることを特徴とする請求項1〜5の何れか1項に記載の組成物。
- 上記ポリ−N−アセチルグルコサミンのうち、40%〜90%は脱アセチル化されていることを特徴とする請求項1〜5の何れか1項に記載の組成物。
- 上記ポリ−N−アセチルグルコサミンのうち、60%〜80%は脱アセチル化されていることを特徴とする請求項1〜5の何れか1項に記載の組成物。
- 上記ポリ−N−アセチルグルコサミンは、50〜200μmの長さを有する繊維であることを特徴とする請求項1〜9の何れか1項に記載の組成物。
- 上記ポリ−N−アセチルグルコサミンは、50〜100μmの長さを有する繊維であることを特徴とする請求項1〜9の何れか1項に記載の組成物。
- 上記ナノ粒子の少なくとも50%が約5nmから500nmの大きさであることを特徴とする請求項1〜11の何れか1項に記載の組成物。
- 上記ナノ粒子の少なくとも50%が約10nmから500nmの大きさであることを特徴とする請求項1〜11の何れか1項に記載の組成物。
- 上記ナノ粒子の少なくとも50%が約20nmから200nmの大きさであることを特徴とする請求項1〜11の何れか1項に記載の組成物。
- 上記ナノ粒子の少なくとも50%が約25nmから150nmの大きさであることを特徴とする請求項1〜11の何れか1項に記載の組成物。
- 上記大きさは、透過電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって決定されることを特徴とする請求項1〜11の何れか1項に記載の組成物。
- 上記核酸はDNAであることを特徴とする請求項1〜16の何れか1項に記載の組成物。
- さらにアジュバントを含有していることを特徴とする請求項1〜17の何れか1項に記載の組成物。
- 上記アジュバントはサイトカインであることを特徴とする請求項18に記載の組成物。
- 上記アジュバントは、ポリイノシン酸:ポリシチジル酸(「ポリI:C」)であることを特徴とする請求項18に記載の組成物。
- 被験体に核酸を投与する方法であって、
上記被験体に請求項1〜20の何れか1項に記載の組成物を投与する工程を含んでいることを特徴とする方法。 - 上記被験体はヒトであることを特徴とする請求項21に記載の方法。
- 上記被験体は、ヒト以外の動物であることを特徴とする請求項21に記載の方法。
- 上記組成物は、皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与されることを特徴とする請求項21〜23の何れか1項に記載の方法。
- 上記組成物は皮下投与されることを特徴とする請求項24に記載の方法。
- 上記組成物は、上皮細胞に投与されることを特徴とする請求項25に記載の方法。
- 上記組成物を投与することによって、少なくとも1週間にわたり、該組成物中の核酸が持続的に発現することを特徴とする請求項21〜26の何れか1項に記載の方法。
- 上記組成物を投与することによって、少なくとも2週間にわたり、該組成物中の核酸が持続的に発現することを特徴とする請求項21〜26の何れか1項に記載の方法。
- 上記組成物を投与することによって、少なくとも4週間にわたり、該組成物中の核酸が持続的に発現することを特徴とする請求項21〜26の何れか1項に記載の方法。
- 上記投与は繰り返し行われることを特徴とする請求項21〜29の何れか1項に記載の方法。
- 被験体に核酸を投与する方法であって、
上記被験体に請求項18〜20の何れか1項に記載の組成物を投与する工程を含んでおり、
上記組成物を投与することによって、上記核酸及び上記アジュバントの両方を持続的にかつ同時に放出することを特徴とする方法。 - ポリ−N−アセチルグルコサミンナノ粒子/核酸組成物の製造方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法:
(a)塩基をポリ−N−アセチルグルコサミンに加え、該ポリ−N−アセチルグルコサミンのうち、少なくとも40%を脱アセチル化する工程;
(b)無機酸または有機酸を加え、脱アセチル化ポリ−N−アセチルグルコサミンアンモニウム塩誘導体を作製する工程;
(c)緩衝剤を加え、希釈を容易にする工程;および
(d)核酸を加え、それによってポリ−N−アセチルグルコサミンナノ粒子/核酸組成物を製造する工程。 - 上記無機酸または有機酸は乳酸であることを特徴とする請求項32に記載の方法。
- 工程(c)における上記緩衝剤は、酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液であることを特徴とする請求項32または33に記載の方法。
- 上記核酸は、塩と組み合わせられていることを特徴とする請求項32〜34の何れか1項に記載の方法。
- 上記塩は、硫酸ナトリウムであることを特徴とする請求項35に記載の方法。
- 上記ポリ−N−アセチルグルコサミンのうち、40%〜90%は脱アセチル化されていることを特徴とする請求項32〜36の何れか1項に記載の方法。
- 上記ポリ−N−アセチルグルコサミンのうち、65%を上回る割合のポリ−N−アセチルグルコサミンが脱アセチル化されていることを特徴とする請求項32〜36の何れか1項に記載の方法。
- 上記ポリ−N−アセチルグルコサミンのうち、60%〜80%は脱アセチル化されていることを特徴とする請求項32〜36の何れか1項に記載の方法。
- さらに工程(d)において、アジュバントを加える工程をさらに含むことを特徴とする請求項32〜39の何れか1項に記載の方法。
- 上記ポリ−N−アセチルグルコサミンナノ粒子/核酸組成物をアジュバントと組み合わせる工程をさらに含むことを特徴とする請求項32〜39の何れか1項に記載の方法。
- 上記アジュバントは、ポリI:Cであることを特徴とする請求項40または41に記載の方法。
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