JP2014168402A

JP2014168402A - Cell culture vessel

Info

Publication number: JP2014168402A
Application number: JP2013041136A
Authority: JP
Inventors: Masahiko Hase; 谷政彦長
Original assignee: Dai Nippon Printing Co Ltd
Current assignee: Dai Nippon Printing Co Ltd
Priority date: 2013-03-01
Filing date: 2013-03-01
Publication date: 2014-09-18

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a cell culture vessel in which culture solution does not flow out to the outside when centrifugal force is given.SOLUTION: A cell culture vessel 10 comprises: a vessel body 11 which has an inner bottom surface 11a having a cell non-adhesive property or being able to change to have the cell non-adhesive property, and an upper opening 11b; and a lid 12 covering the upper opening 11b of the vessel body 11. The vessel body 11 is provided with an outer screw 13, and the lid 12 is provided with an inner screw 13 fitted to the outer screw 13. Culture solution is flowed in the vessel body 11, the lid 12 covers the vessel body 11, the outer screw 13 and the inner screw 14 are fitted to each other, and the vessel body 11 is sealed by the lid 12. For this reason, when centrifugal force is given to the cell culture vessel 10, the culture solution within the vessel body 11 never flows out to the outside.

Description

本発明は、厚さ方向に複数の細胞が積層された多層構造を有する生体組織の製造に適した細胞培養容器に関する。 The present invention relates to a cell culture container suitable for production of a biological tissue having a multilayer structure in which a plurality of cells are laminated in the thickness direction.

コラーゲン等の培養担体上で細胞を培養させて製造される生体組織は細胞密度が低いため、医療目的の移植用組織として適したものではない。移植に適した、細胞密度が高い細胞シートなどの組織を製造する技術はテッシュエンジニアリングの分野において重要な技術であるといえる。しかしながら、従来の高細胞密度の生体組織の製造法には幾つかの問題点が存在する。 A biological tissue produced by culturing cells on a culture carrier such as collagen is not suitable as a tissue for transplantation for medical purposes because of its low cell density. It can be said that a technique for producing a tissue such as a cell sheet having a high cell density suitable for transplantation is an important technique in the field of tissue engineering. However, there are several problems in the conventional method for producing a high cell density biological tissue.

細胞を培養支持体上に播種し、細胞シートを形成することは一般に広く行われている。細胞シートの剥離を容易にする目的で、細胞接着面に温度応答性高分子化合物の層を設け、細胞の剥離を促進させる技術も開発されており、異物をほとんど含まない細胞シートの回収が可能である。しかしながらこの方法により形成される細胞シートは単層または３層以下の細胞層から構成されることが通常である。このため、多層化を行うには、細胞シートを複数重ね合わせることが必要である。細胞シートは極めて薄く、取り扱いが困難であるため、複数重ね合わせることは容易でなく手間がかかる。 It is generally widely practiced to seed cells on a culture support to form a cell sheet. For the purpose of facilitating cell sheet peeling, a technology that promotes cell peeling by providing a layer of temperature-responsive polymer compound on the cell adhesion surface has been developed, and it is possible to collect cell sheets containing almost no foreign matter. It is. However, the cell sheet formed by this method is usually composed of a single layer or three or less cell layers. For this reason, in order to carry out multilayering, it is necessary to superimpose a plurality of cell sheets. Since cell sheets are extremely thin and difficult to handle, it is not easy to superimpose a plurality of cell sheets, which is troublesome.

そこで、移植に適した生体組織を得るため、細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面を有する細胞培養容器が開発されている。生体組織を作製する場合、まず細胞を含有する培養液を細胞培養容器に注入する。次に細胞培養容器を遠心分離器に設置して内底面方向への遠心力を作用させながら、細胞間接着が形成される条件下で細胞培養を行ない、細胞間を接着させて組織を形成することにより内底面に生体組織を堆積させている（特許文献１〜３参照）。 Therefore, in order to obtain a biological tissue suitable for transplantation, a cell culture container having an inner bottom surface that is non-cell-adhesive or can be changed to cell-non-adhesive has been developed. When producing a biological tissue, first, a culture solution containing cells is injected into a cell culture container. Next, the cell culture vessel is placed in a centrifuge and a centrifugal force is applied toward the inner bottom surface, and cell culture is performed under conditions where cell-cell adhesion is formed, and cells are adhered to form a tissue. Thus, biological tissue is deposited on the inner bottom surface (see Patent Documents 1 to 3).

特開２０１０−１６１９５２号公報JP 2010-161952 A 特開２０１０−１６１９５３号公報JP 2010-161953 A 特開２０１０−１６１９５４号公報JP 2010-161954 A

上述のように移植に適した生体組織を得るための細胞培養容器が開発されている。またこのような細胞培養容器は遠心分離機に設置され、細胞培養容器に対して遠心力が付与されて細胞培養が行なわれる。 As described above, a cell culture container for obtaining a biological tissue suitable for transplantation has been developed. Moreover, such a cell culture container is installed in a centrifuge, and a cell culture is performed by applying a centrifugal force to the cell culture container.

しかしながら、細胞培養容器を遠心分離機に設置して、細胞培養容器に対して遠心力を付与する場合、遠心力を付与する工程中に細胞培養容器内から培養液が外部へ流出してしまうことがある。 However, when the cell culture container is installed in a centrifuge and a centrifugal force is applied to the cell culture container, the culture solution may flow out from the cell culture container during the step of applying the centrifugal force. There is.

本発明はこのような点を考慮してなされたものであり、遠心力を付与する工程中に内部の培養液が外部へ流出することを防止することができる細胞培養容器を提供することを目的とする。 The present invention has been made in consideration of such points, and an object of the present invention is to provide a cell culture vessel capable of preventing an internal culture solution from flowing out during a step of applying a centrifugal force. And

本発明は、細胞を含有する培養液を収納し、内底面方向へ遠心力を作用させながら、細胞間接着が形成される条件下で細胞培養を行ない、細胞間を接着させて組織を形成して内底面に生体組織を堆積させる細胞培養容器において、細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面を有するとともに、上方開口を有する容器本体と、容器本体の上方開口を覆う蓋体とを備え、容器本体に容器本体固定手段が設けられ、蓋体に容器本体固定手段に係合する蓋体固定手段が設けられていることを特徴とする細胞培養容器である。 The present invention accommodates a culture solution containing cells, performs cell culture under conditions where cell-cell adhesion is formed while acting centrifugal force toward the inner bottom surface, and forms cells by adhering cells to each other. In a cell culture container for depositing biological tissue on the inner bottom surface, a container main body having an inner bottom surface that is non-cell-adhesive or capable of changing to cell non-adhesiveness, and an upper opening, and a container main body And a lid body that covers the upper opening of the container, wherein the container body is provided with a container body fixing means, and the lid body is provided with a lid body fixing means that engages with the container body fixing means. It is.

本発明は、容器本体固定手段および蓋体固定手段の一方は内ねじからなり、他方は外ねじからなるものであってもよい。 In the present invention, one of the container main body fixing means and the lid fixing means may be composed of an internal screw, and the other may be composed of an external screw.

本発明は、蓋体固定手段は容器本体側へ突出する突起からなり、容器本体固定手段は突起が入り込むガイド溝からなるものであってもよい。 In the present invention, the lid fixing means may be a protrusion protruding toward the container main body, and the container main body fixing means may be a guide groove into which the protrusion enters.

本発明は、ガイド溝には突起を係止する幅細部が設けられていてもよい。 In the present invention, the guide groove may be provided with a width detail for locking the protrusion.

本発明は、蓋体固定手段は容器本体側へ突出する突起からなり、容器本体固定手段は突起が入り込む溝からなるものであってもよい。 In the present invention, the lid fixing means may be a protrusion projecting toward the container body, and the container body fixing means may be a groove into which the protrusion enters.

本発明は、蓋体固定手段は揺動突起からなり、容器本体固定手段は揺動突起に係合する容器本体の下端からなるものであってもよい。 In the present invention, the lid fixing means may comprise a swinging projection, and the container body fixing means may comprise a lower end of the container body that engages with the swinging projection.

本発明は、容器本体固定手段と蓋体固定手段は、互いに係合して容器本体内の培養液の流出を防止するとともに、容器本体内部と外部雰囲気とを連通可能とするものであってもよい。 In the present invention, the container body fixing means and the lid body fixing means may be engaged with each other to prevent the culture medium from flowing out of the container body and to allow communication between the inside of the container body and the external atmosphere. Good.

以上のように本発明によれば、細胞培養容器内に培養液を注入した後、細胞培養容器に対して遠心力を付与した場合、細胞培養容器内から培養液が外方へ流出することを防止することができる。 As described above, according to the present invention, when a centrifugal force is applied to the cell culture container after injecting the culture liquid into the cell culture container, the culture liquid flows out from the cell culture container. Can be prevented.

図１は本発明による細胞培養容器の第１の実施の形態を示す断面図。FIG. 1 is a sectional view showing a first embodiment of a cell culture container according to the present invention. 図２は本発明による細胞培養容器の第１の実施の形態を示す斜視図。FIG. 2 is a perspective view showing a first embodiment of a cell culture container according to the present invention. 図３（ａ）（ｂ）（ｃ）は細胞培養容器を用いた細胞培養の作用を示す図。FIGS. 3A, 3B and 3C are diagrams showing the effect of cell culture using a cell culture vessel. 図４（ａ）（ｂ）は遠心分離機を示す図。4A and 4B are diagrams showing a centrifuge. 図５（ａ）（ｂ）（ｃ）は本発明による細胞培養容器の第２の実施の形態を示す図。FIGS. 5A, 5B, and 5C are views showing a second embodiment of the cell culture container according to the present invention. 図６（ａ）（ｂ）（ｃ）は本発明による細胞培養容器の第２の実施の形態における変形例を示す図。FIGS. 6A, 6B, and 6C are diagrams showing a modification of the cell culture container according to the second embodiment of the present invention. 図７（ａ）（ｂ）（ｃ）は本発明による細胞培養容器の第３の実施の形態を示す図。FIGS. 7A, 7B, and 7C are views showing a third embodiment of the cell culture container according to the present invention. 図８は本発明による細胞培養容器の第３の実施の形態における変形例を示す図。FIG. 8 is a view showing a modification of the cell culture container according to the third embodiment of the present invention.

発明の実施の形態BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

第１の実施の形態
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。 DESCRIPTION OF EXEMPLARY EMBODIMENTS First Embodiment Hereinafter, an embodiment of the invention will be described with reference to the drawings.

図１乃至図４は本発明による細胞培養容器１０の第１の実施の形態を示す図である。 1 to 4 are views showing a first embodiment of a cell culture container 10 according to the present invention.

細胞培養容器１０は、図１および図２に示すように、細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面１１ａを有するとともに上方開口１１ｂを有する容器本体１１と、容器本体１１の上方開口１１ｂを覆う蓋体１２とを備えている。 As shown in FIGS. 1 and 2, the cell culture container 10 has an inner bottom surface 11a that is non-cell-adhesive or can be changed to cell-non-adhesiveness, and has an upper opening 11b. And a lid 12 that covers the upper opening 11b of the container body 11.

このような細胞培養容器１０は、内底面１１ａと内側面１１ｃにより囲まれた空間に細胞２を含有する培養液１を収納することができ、内底面１１ａ方向へ遠心力を作用させながら、細胞２間接着が形成される条件下で細胞培養を行なうものであり、細胞２間を接着させて組織を形成して内底面１１ａに生体組織を堆積させるものである（図３（ａ）（ｂ）（ｃ）参照）。 Such a cell culture vessel 10 can store the culture solution 1 containing the cells 2 in a space surrounded by the inner bottom surface 11a and the inner side surface 11c, and while applying centrifugal force toward the inner bottom surface 11a, The cell culture is performed under the condition that the adhesion between the two is formed, and the tissue is formed by adhering between the cells 2 and the living tissue is deposited on the inner bottom surface 11a (FIGS. 3A and 3B). ) (C)).

この場合、細胞含有培養液１（図３（ａ）（ｂ）（ｃ）参照）を収容する容器部分の内表面のうち少なくとも内底面１１ａが細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能であればよいが、特に、細胞含有培養液を収容する容器部分の内表面のうち、細胞と接触する表面の全て（例えば容器の内底面１１ａおよび内側面１１ｃ）が細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能であることが好ましい。 In this case, at least the inner bottom surface 11a out of the inner surface of the container portion containing the cell-containing culture solution 1 (see FIGS. 3A, 3B, and 3C) is non-cell-adhesive or non-cell-adhesive. Although it is only necessary to be able to change, in particular, of the inner surface of the container portion that contains the cell-containing culture solution, all of the surfaces that come into contact with the cells (for example, the inner bottom surface 11a and the inner surface 11c of the container) It is preferable that it is adhesive or can be changed to non-cell-adhesive.

本発明に用いられる細胞としては接着性細胞であれば特に限定されない。そのような細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞、骨細胞などが挙げられる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであっても良い。また、細胞は単一種を培養してもよいし二種以上の細胞を共培養してもよい。 The cells used in the present invention are not particularly limited as long as they are adherent cells. Examples of such cells include liver cells that are liver parenchymal cells, Kupffer cells, endothelial cells such as vascular endothelial cells and corneal endothelial cells, fibroblasts, osteoblasts, osteoclasts, periodontal ligament-derived cells, Epidermal cells such as epidermal keratinocytes, tracheal epithelial cells, gastrointestinal epithelial cells, cervical epithelial cells, epithelial cells such as corneal epithelial cells, mammary cells, pericytes, muscle cells such as smooth muscle cells and cardiomyocytes, kidneys Examples include cells, pancreatic islets of Langerhans, nerve cells such as peripheral nerve cells and optic nerve cells, chondrocytes, and bone cells. These cells may be primary cells collected directly from tissues or organs, or may be passaged from one generation to another. Furthermore, these cells are undifferentiated embryonic stem cells, pluripotent stem cells such as pluripotent mesenchymal stem cells, unipotent stem cells such as vascular endothelial progenitor cells that have unipotency, and differentiation has ended. Any of the cells may be used. In addition, the cells may be cultivated as a single species, or two or more types of cells may be co-cultured.

これらの細胞は、予め通常の方法で培養させ、培養物をトリプシン処理等で処理し、培養液中に懸濁させた状態で培養容器に収容される。培養液としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術第三版」５８１頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（ウシ胎児血清等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。また、Ｇｉｂｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）等の市販の無血清培地等を用いることができる。最終的に得られる細胞組織体の臨床応用を考えると動物由来成分を含まない培地を使用することが好ましい。 These cells are cultured in advance by a conventional method, the culture is treated with trypsin treatment or the like, and is stored in a culture vessel in a state of being suspended in a culture solution. Any culture medium can be used without particular limitation as long as it is a cell culture medium usually used in the art. For example, depending on the type of cell used, MEM medium, BME medium, DME medium, αMEM medium, IMDM medium, ES medium, DM-160 medium, Fisher medium, F12 medium, WE medium, RPMI1640 medium, etc. A basal medium as described in “Tissue culture technology third edition”, page 581, edited by the Japanese Society for Tissue Culture can be used. Furthermore, serum (such as fetal bovine serum), various growth factors, antibiotics, amino acids and the like may be added to the basal medium. A commercially available serum-free medium such as Gibco serum-free medium (Invitrogen) can also be used. Considering the clinical application of the finally obtained cell tissue, it is preferable to use a medium that does not contain animal-derived components.

本発明において、細胞非接着性である表面としては、親水性の表面、具体的には２０℃の静的水接触角が４５°以下である表面が挙げられる。このような表面は、炭素酸素結合を有する有機化合物の皮膜を基材の表面上に形成することにより得ることができる。あるいは基材自体を親水性を有する材料で構成してもよい。 In the present invention, the non-cell-adhesive surface includes a hydrophilic surface, specifically, a surface having a static water contact angle at 20 ° C. of 45 ° or less. Such a surface can be obtained by forming a film of an organic compound having a carbon-oxygen bond on the surface of the substrate. Or you may comprise the base material itself with the material which has hydrophilic property.

親水性被膜を表面上に形成するための基材の材料は特に限定されず、具体的には、金属、ガラス、セラミック、シリコン等の無機材料、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。好適には、ポリスチレンが用いられる。 The material of the base material for forming the hydrophilic film on the surface is not particularly limited, and specifically, inorganic materials such as metal, glass, ceramic, silicon, elastomer, plastic (for example, polyester resin, polyethylene resin, And organic materials represented by polypropylene resin, ABS resin, nylon, acrylic resin, fluororesin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, and vinyl chloride resin). Preferably, polystyrene is used.

細胞非接着性表面は、炭素酸素結合を有する有機化合物により形成される、静的水接触角が４５°以下である親水性膜により形成することができる。 The cell non-adhesive surface can be formed by a hydrophilic film formed of an organic compound having a carbon-oxygen bond and having a static water contact angle of 45 ° or less.

炭素酸素結合とは、炭素と酸素との間に形成される結合を意味し、単結合に限らず二重結合であってもよい。炭素酸素結合としてはＣ−Ｏ結合、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合が挙げられる。 The carbon oxygen bond means a bond formed between carbon and oxygen, and is not limited to a single bond but may be a double bond. Examples of the carbon-oxygen bond include a C—O bond, a C (═O) —O bond, and a C═O bond.

親水性膜の主原料としては、水溶性高分子、水溶性オリゴマー、水溶性有機化合物、界面活性物質、両親媒性物質等の親水性有機化合物が挙げられる。これらが相互に物理的または化学的に架橋し、基材と物理的または化学的に結合することにより親水性膜となる。 Examples of the main raw material for the hydrophilic film include hydrophilic organic compounds such as water-soluble polymers, water-soluble oligomers, water-soluble organic compounds, surface active substances, and amphiphilic substances. These are physically or chemically cross-linked with each other and physically or chemically bonded to the substrate to form a hydrophilic film.

親水性膜の平均厚さは、０．８ｎｍ〜５００μｍが好ましく、０．８ｎｍ〜１００μｍがより好ましく、１ｎｍ〜１０μｍがより好ましく、１．５ｎｍ〜１μｍが最も好ましい。平均厚さが０．８ｎｍ以上であれば、基板表面の親水性膜で覆われていない領域の影響を受けにくいため好ましい。また、平均厚さが５００μｍ以下であればコーティングが比較的容易である。 The average thickness of the hydrophilic film is preferably 0.8 nm to 500 μm, more preferably 0.8 nm to 100 μm, more preferably 1 nm to 10 μm, and most preferably 1.5 nm to 1 μm. An average thickness of 0.8 nm or more is preferable because it is not easily affected by a region not covered with the hydrophilic film on the substrate surface. Moreover, if the average thickness is 500 μm or less, coating is relatively easy.

基材表面への親水性膜の形成方法としては、基材へ親水性有機化合物を直接吸着させる方法、基材へ親水性有機化合物を直接コーティングする方法、基材へ親水性有機化合物をコーティングした後に架橋処理を施す方法、基材への密着性を高めるために多段階式に親水性膜を形成させる方法、基材との密着性を高めるために基材上に下地層を形成し、次いで親水性有機化合物をコーティングする方法、基板表面に重合開始点を形成し、次いで親水性ポリマーブラシを重合する方法等を挙げることができる。 The hydrophilic film can be formed on the substrate surface by directly adsorbing the hydrophilic organic compound on the substrate, coating the hydrophilic organic compound directly on the substrate, or coating the hydrophilic organic compound on the substrate. A method of performing a crosslinking treatment later, a method of forming a hydrophilic film in a multi-stage manner in order to increase the adhesion to the substrate, a base layer is formed on the substrate in order to increase the adhesion to the substrate, Examples thereof include a method of coating a hydrophilic organic compound, a method of forming a polymerization initiation point on the substrate surface, and then polymerizing a hydrophilic polymer brush.

本発明で用いられる培養容器の内底面をはじめとする内表面の細胞接触領域は、細胞非接着性であることが、組織の剥離の容易性という観点から好ましいが、細胞培養時には細胞接着性であるが剥離の際に細胞非接着性に変化することが可能である表面であってもよい。このような表面は、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種の刺激応答性高分子が共有結合し基材の表面に固定化することにより形成することができる。刺激応答性高分子としては、刺激の付与が容易である温度応答性ポリマーが好ましいがこれには限定されない。 The cell contact region on the inner surface including the inner bottom surface of the culture vessel used in the present invention is preferably cell non-adhesive from the viewpoint of ease of tissue detachment. However, it may be a surface that can change to non-cell-adhesiveness upon peeling. Such a surface is formed by covalently binding at least one kind of stimulus-responsive polymer selected from the group consisting of a temperature-responsive polymer, a pH-responsive polymer, and an ion-responsive polymer to the surface of the substrate. Can be formed. The stimulus-responsive polymer is preferably a temperature-responsive polymer that can be easily applied with a stimulus, but is not limited thereto.

次に細胞培養容器１０について更に説明する。細胞培養容器１０は上述のように、内底面１１ａと上方開口１１ｂとを有する容器本体１１と、容器本体１１の上方開口１１ｂを覆う蓋体１２とを備え、このうち容器本体１１は円筒状をなすシャーレ型の容器本体となっている。 Next, the cell culture container 10 will be further described. As described above, the cell culture container 10 includes the container body 11 having the inner bottom surface 11a and the upper opening 11b, and the lid body 12 that covers the upper opening 11b of the container body 11, and the container body 11 has a cylindrical shape. It is a petri dish type container body.

容器本体１１の側壁外面には外ねじ１３が設けられ、蓋体１２の側壁内面には容器本体１１の外ねじ１３に係合する内ねじ１４が設けられ、このうち外ねじ１３は容器本体固定手段となり、内ねじ１４は蓋体固定手段となる。 An outer screw 13 is provided on the outer surface of the side wall of the container main body 11, and an inner screw 14 is provided on the inner surface of the side wall of the lid 12 to engage with the outer screw 13 of the container main body 11. The internal screw 14 serves as a lid fixing means.

容器本体１１内に上方開口１１ｂから細胞２を含有する培養液１を収納し、容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により覆い、蓋体１２を回動させて外ねじ１３と内ねじ１４を係合させることにより、容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により密閉することができる。 The culture medium 1 containing the cells 2 is stored in the container main body 11 from the upper opening 11b, the upper opening 11b of the container main body 11 is covered with the lid 12, and the lid 12 is rotated to rotate the external screw 13 and the internal screw 14. The upper opening 11b of the container main body 11 can be sealed with the lid 12 by engaging.

このことにより、後述する遠心分離工程中でも容器本体１１内の培養液１が外方へ流出することが防止される。容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により完全に密封することもでき、この場合は容器本体１１内部は外部雰囲気と遮断される。 This prevents the culture solution 1 in the container body 11 from flowing out even during the centrifugation step described later. The upper opening 11b of the container main body 11 can also be completely sealed by the lid body 12. In this case, the inside of the container main body 11 is blocked from the external atmosphere.

しかしながら、容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により完全に密封することなく、容器本体１１内の培養液１の外方への流出を防止しつつ、容器本体１１内と外部雰囲気とを連通させて細胞培養により低下する容器本体１１内の二酸化炭素を外部雰囲気から補なってもよい。 However, without completely sealing the upper opening 11b of the container main body 11 with the lid 12, the inside of the container main body 11 communicates with the external atmosphere while preventing the culture medium 1 in the container main body 11 from flowing out. The carbon dioxide in the container body 11 that is lowered by cell culture may be supplemented from the external atmosphere.

次にこのような構成からなる本実施の形態の作用について説明する。 Next, the operation of the present embodiment having such a configuration will be described.

まず図３（ａ）に示すように、容器本体１１内に上方開口１１ｂから細胞２を含有する培養液１を注入する。 First, as shown in FIG. 3A, the culture solution 1 containing the cells 2 is injected into the container body 11 from the upper opening 11b.

次に容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により覆い、容器本体１１に対して蓋体１２を回動させて、容器本体１１の外ねじ１３に蓋体１２の内ねじ１４を係合させ、容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により密閉する。このことにより容器本体１１内の培養液１が外方へ流出することが防止される。 Next, the upper opening 11 b of the container body 11 is covered with the lid body 12, the lid body 12 is rotated with respect to the container body 11, and the inner screw 14 of the lid body 12 is engaged with the outer screw 13 of the container body 11. The upper opening 11 b of the container body 11 is sealed with the lid 12. This prevents the culture solution 1 in the container body 11 from flowing out.

次に細胞培養容器１０を図４（ａ）（ｂ）に示す遠心分離機２０に設置する。 Next, the cell culture container 10 is installed in the centrifuge 20 shown in FIGS. 4 (a) and 4 (b).

図４（ａ）（ｂ）に示すように、遠心分離機２０は回動軸２１と、回動軸２１に固定されたアーム２２と、アーム２２の先端に揺動軸２４を介して揺動可能に取付けられたバスケット２３とを有している。 As shown in FIGS. 4A and 4B, the centrifuge 20 swings through a rotating shaft 21, an arm 22 fixed to the rotating shaft 21, and a tip of the arm 22 via a swing shaft 24. And has a basket 23 attached thereto.

そして細胞培養容器１０を遠心分離機２０のバスケット２３上に設置し（図４（ａ）参照）、次に回動軸２１を回動させる（図４（ｂ）参照）。 Then, the cell culture container 10 is placed on the basket 23 of the centrifuge 20 (see FIG. 4A), and then the rotation shaft 21 is rotated (see FIG. 4B).

この場合、アーム２２の先端に揺動軸２４を介して取付けられたバスケット２３が上方へ持上げられ、回動軸２１の回動に伴なって細胞培養容器１０に対して、容器本体１１の内底面１１ａ方向に向かう遠心力が働く。 In this case, the basket 23 attached to the tip of the arm 22 via the rocking shaft 24 is lifted upward, and the inside of the container body 11 is moved with respect to the cell culture container 10 as the rotating shaft 21 rotates. Centrifugal force toward the bottom surface 11a works.

容器本体１１の内底面１１ａ側へ遠心力が働くことにより、培養液１中の細胞２間が接着して組織を形成し、内底面１１ａにシート状の生体組織３が堆積する。 When the centrifugal force acts on the inner bottom surface 11a side of the container body 11, the cells 2 in the culture solution 1 adhere to form a tissue, and the sheet-like biological tissue 3 is deposited on the inner bottom surface 11a.

このようにしてシート状の生体組織３が他の培養液１と分離される（図３（ｂ）参照）。 In this way, the sheet-like biological tissue 3 is separated from the other culture solution 1 (see FIG. 3B).

次に細胞培養容器１０に対して遠心力を付与する工程について更に述べる。 Next, the step of applying centrifugal force to the cell culture container 10 will be further described.

細胞培養容器１０に収容された培養液１に内底面１１ａ方向への遠心力を作用させることにより、細胞間接着が形成される条件下で細胞培養を行い、細胞間を接着させて組織を形成する。遠心力により細胞２が内底面１１ａの形状に応じて内底面１１ａに密着した状態で、細胞２同士が接着し、所望の形状の組織が形成される。 By applying a centrifugal force in the direction of the inner bottom surface 11a to the culture solution 1 accommodated in the cell culture vessel 10, cell culture is performed under conditions where cell-cell adhesion is formed, and cells are adhered to form a tissue. To do. In a state where the cells 2 are in close contact with the inner bottom surface 11a according to the shape of the inner bottom surface 11a due to the centrifugal force, the cells 2 adhere to each other to form a tissue having a desired shape.

図４（ａ）（ｂ）に示す遠心分離機２０から付与される遠心力の大きさは、細胞２の機能に悪影響を与えることなく組織の形成が可能な範囲で適宜選択することができる。例えば２Ｇ〜１４４０Ｇが好ましく、２Ｇ〜７２０Ｇがより好ましい。 The magnitude of the centrifugal force applied from the centrifuge 20 shown in FIGS. 4 (a) and 4 (b) can be appropriately selected as long as the tissue can be formed without adversely affecting the function of the cells 2. For example, 2G-1440G is preferable and 2G-720G is more preferable.

ここで「細胞間接着が形成される条件」とは細胞が活動して細胞同士が接着できる条件を指す。培養する細胞の種類に応じて変動するが、例えば温度条件は２０〜４０℃が好ましく、雰囲気ガス条件としては二酸化炭素濃度が３〜５％であることが好ましく、培養時間としては０．５〜２４時間が好ましい。本発明の有利な特徴の一つは培養時間を短くすることができ、細胞へのダメージを小さくすることができる点にある。培養時間は後述する細胞外マトリクスを別途調製し添加する実施形態では短縮することが可能あり、培養時間を０．５〜３時間とすることができるため好ましい。細胞外マトリクスを添加しない実施形態では、培養時間を１〜２４時間とすることができる。 Here, “the conditions under which cell-cell adhesion is formed” refers to conditions under which cells can act and adhere to each other. Although it varies depending on the type of cells to be cultured, for example, the temperature condition is preferably 20 to 40 ° C., the atmospheric gas condition is preferably a carbon dioxide concentration of 3 to 5%, and the culture time is 0.5 to 24 hours is preferred. One of the advantageous features of the present invention is that the culture time can be shortened and the damage to the cells can be reduced. In the embodiment in which an extracellular matrix described later is separately prepared and added, the culture time can be shortened, and the culture time can be 0.5 to 3 hours, which is preferable. In embodiments where no extracellular matrix is added, the culture time can be 1 to 24 hours.

本実施の形態では培養容器を所望の雰囲気ガス（二酸化炭素濃度５％）で満たされたインキュベータ内で数分間放置したのち、雰囲気ガスが変化しないように培養容器に蓋をして完全に密閉した状態で加重培養を行なう。しかしながらこれには限定されず、例えば雰囲気ガスおよび温度が制御されたインキュベータ内であれば培養容器を完全に密閉せずに開放した状態で加重培養を行うこともできる。 In this embodiment, the culture vessel is left in an incubator filled with a desired atmospheric gas (carbon dioxide concentration 5%) for several minutes, and then the culture vessel is covered and completely sealed so that the atmospheric gas does not change. Weighted culture is performed in the state. However, the present invention is not limited to this. For example, in an incubator in which the atmospheric gas and temperature are controlled, weighted culture can be performed in a state where the culture vessel is opened without being completely sealed.

遠心力を付与して細胞培養を行なう場合、細胞間接着が形成されれば十分であり、細胞数を増殖により増やすことは必須ではない。培養液中における細胞数を適宜調節することにより、作製される組織の厚さ（すなわち組織の厚さ方向の細胞積層数）を制御することが可能である。このように細胞培養工程において細胞の増殖を行う必要がないため、比較的短時間で組織を得ることができる。また組織の厚さ、形状を自在に調節することができる。 When cell culture is performed by applying a centrifugal force, it is sufficient that cell-cell adhesion is formed, and it is not essential to increase the number of cells by proliferation. By appropriately adjusting the number of cells in the culture solution, it is possible to control the thickness of the produced tissue (that is, the number of cells stacked in the thickness direction of the tissue). As described above, since it is not necessary to proliferate cells in the cell culture process, a tissue can be obtained in a relatively short time. The thickness and shape of the tissue can be freely adjusted.

また本実施の形態の細胞培養容器を用いた細胞培養方法によれば、細胞が高密度化された組織を得ることが可能となる。細胞が高密度化された組織は移植用途に好ましい。 In addition, according to the cell culture method using the cell culture container of the present embodiment, it is possible to obtain a tissue in which cells are densified. A tissue in which cells are densified is preferable for transplantation.

次に遠心力を付与する工程の終了後に、蓋体１２を容器本体１１から外す。このとき、蓋体１２を水平方向に回動させて外ねじ１３と内ねじ１４の係合を解くことができるため、培養液１の液面の揺れの発生が抑制され、蓋体１２を容器本体１１から外すときに培養液が外方を流出することが防止される。そして、得られた生体組織３を細胞培養容器１０の内底面１０ｂから剥離し回収する（図３（ｃ）参照）。例えばピペッティング操作などの物理的な操作よって細胞を剥離することができる。細胞培養容器１０の内底面１１ａが細胞非接着性表面であればこの操作は容易であり短時間の培養で組織の作製及び剥離回収が可能である。細胞培養容器１０の内底面１１ａが刺激応答性高分子などの、細胞非接着性に変化する表面である場合には、細胞非接着性となるような環境（例えば下限臨界温度以下の温度）において剥離操作を行う。 Next, after completion of the step of applying centrifugal force, the lid 12 is removed from the container main body 11. At this time, since the lid 12 can be rotated in the horizontal direction to disengage the outer screw 13 and the inner screw 14, the occurrence of the shaking of the liquid level of the culture solution 1 is suppressed, and the lid 12 is placed in the container. The culture medium is prevented from flowing out when removed from the main body 11. Then, the obtained biological tissue 3 is peeled off and collected from the inner bottom surface 10b of the cell culture container 10 (see FIG. 3C). For example, the cells can be detached by a physical operation such as a pipetting operation. If the inner bottom surface 11a of the cell culture vessel 10 is a non-cell-adhesive surface, this operation is easy, and tissue can be prepared and peeled and collected in a short time of culture. When the inner bottom surface 11a of the cell culture vessel 10 is a surface that changes to non-cell-adhesive properties, such as a stimulus-responsive polymer, in an environment in which cell-non-adhesive properties are obtained (for example, a temperature below the lower critical temperature). Perform peeling operation.

以上のように本実施の形態によれば、容器本体１１内に上方開口１１ｂから培養液１を注入した後、容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により覆い、容器本体１１の外ねじ１３に蓋体１２の内ねじ１４を係合させる。このことにより容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により密閉することができ、細胞培養容器１０を遠心分離機１２のバスケット２３上に設置し、細胞培養容器１０に対して内底面１１ａ側へ向う遠心力を作用させながら細胞培養する場合において、容器本体１１内の培養液１が外方へ流出してしまうことが防止される。本実施の形態においては、容器本体の内側面１１ｃに内ねじがあり、蓋体１２の外側に外ねじがあり、内ねじと外ねじとが係合するように構成することもできる。 As described above, according to the present embodiment, after injecting the culture solution 1 into the container body 11 from the upper opening 11b, the upper opening 11b of the container body 11 is covered with the lid 12, and the external screw 13 of the container body 11 is covered. The inner screw 14 of the lid body 12 is engaged with the lid. As a result, the upper opening 11b of the container body 11 can be sealed with the lid 12, and the cell culture container 10 is placed on the basket 23 of the centrifuge 12 so that the cell culture container 10 faces the inner bottom surface 11a. In the case of culturing cells while acting a centrifugal force, the culture solution 1 in the container body 11 is prevented from flowing out. In the present embodiment, the inner side surface 11c of the container main body has an inner screw, the lid body 12 has an outer screw, and the inner screw and the outer screw can be engaged with each other.

なお、上記実施の形態において、容器本体１１の上端および蓋体１２の裏面を互いに当接させるとともに、容器本体１１の上端および蓋体１２の裏面のうち、少なくともいずれか一方にパッキン材を取付けて密閉性を高めてもよい。 In the above embodiment, the upper end of the container body 11 and the back surface of the lid body 12 are brought into contact with each other, and a packing material is attached to at least one of the upper end of the container body 11 and the back surface of the lid body 12. The sealing property may be improved.

第２の実施の形態
以下、図５および図６により本発明の第２の実施の形態について説明する。図５および図６に示す第２の実施の形態は、容器本体１１に設けられた容器本体固定手段と蓋体１２に設けられた蓋体固定手段の構成が異なるのみであり、他の構成は図１乃至図４に示す第１の実施の形態と略同一である。 Second Embodiment Hereinafter, a second embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. 5 and 6. FIG. The second embodiment shown in FIGS. 5 and 6 is different only in the configuration of the container main body fixing means provided in the container main body 11 and the lid fixing means provided in the lid body 12, and the other configurations are as follows. This is substantially the same as the first embodiment shown in FIGS.

図５および図６に示す実施の形態において、図１乃至図４に示す第１の実施の形態と同一部分については同一符号を付して詳細な説明は省略する。 In the embodiment shown in FIGS. 5 and 6, the same parts as those in the first embodiment shown in FIGS. 1 to 4 are denoted by the same reference numerals, and detailed description thereof is omitted.

図５（ａ）（ｂ）（ｃ）に示すように、蓋体１２の側壁内面に、容器本体１１側へ突出する突起（蓋体固定手段）１６が設けられ、容器本体１１の側壁外面に突起１６が入り込むガイド溝（容器本体固定手段）１７が形成されている。 As shown in FIGS. 5A, 5 B, and 5 C, a protrusion (cover fixing means) 16 that protrudes toward the container body 11 is provided on the inner surface of the side wall of the cover body 12. A guide groove (container body fixing means) 17 into which the protrusion 16 enters is formed.

ここで、図５（ａ）は容器本体１１と蓋体１２を示す断面図であり、図５（ｂ）は容器本体１１の側壁外面を示す図であり、図５（ｃ）は蓋体１２の側壁内面を示す図である。 Here, FIG. 5A is a cross-sectional view showing the container body 11 and the lid body 12, FIG. 5B is a view showing the outer side wall of the container body 11, and FIG. FIG.

図５（ａ）（ｂ）（ｃ）に示すように、容器本体１１の側壁外面に設けられたガイド溝１７は、縦方向に延びる縦方向溝１７ａと、縦方向溝１７ａの下端から水平方向に延びる横方向溝１７ｂとを有し、横方向溝１７ｂには突起１６を係止する幅細部１７ｃが形成されている。 As shown in FIGS. 5A, 5B, and 5C, the guide groove 17 provided on the outer surface of the side wall of the container body 11 includes a vertical groove 17a extending in the vertical direction and a horizontal direction from the lower end of the vertical groove 17a. The lateral groove 17b is formed with a width detail 17c for locking the protrusion 16 in the lateral groove 17b.

図５（ａ）（ｂ）（ｃ）において、容器本体１１内に上方開口１１ｂから培養液１が注入され、その後容器本体１１の上方開口１１ｂが蓋体１２により覆われる。次に蓋体１２の側壁内面に設けられた突起１６をガイド溝１７の縦方向溝１７ａ内に嵌合させる。さらに蓋体１２を容器本体１１側へ押込み、突起１６が縦方向溝１７ａの下端に達するまで突起１６を下方へ移動させる。突起１６が縦方向溝１７ａの下端に達したとき、容器本体１１の側壁の上面と蓋体１２の内面とが接触し、容器本体１１と蓋体１２により囲まれた閉空間が形成される。突起１６が縦方向溝１７ａの下端に達した際、蓋体１２を回動させる。このことにより突起１６が横方向溝１７ｂ内に入り、突起１６が幅細部１７ｃを乗り越えて横方向溝１７ｂの先端に達する。 5A, 5 B, and 5 C, the culture solution 1 is injected into the container body 11 from the upper opening 11 b, and then the upper opening 11 b of the container body 11 is covered with the lid 12. Next, the protrusion 16 provided on the inner surface of the side wall of the lid 12 is fitted into the longitudinal groove 17 a of the guide groove 17. Further, the lid body 12 is pushed into the container body 11 side, and the protrusion 16 is moved downward until the protrusion 16 reaches the lower end of the longitudinal groove 17a. When the protrusion 16 reaches the lower end of the longitudinal groove 17a, the upper surface of the side wall of the container body 11 and the inner surface of the lid body 12 come into contact with each other, and a closed space surrounded by the container body 11 and the lid body 12 is formed. When the protrusion 16 reaches the lower end of the longitudinal groove 17a, the lid body 12 is rotated. As a result, the projection 16 enters the lateral groove 17b, and the projection 16 gets over the width detail 17c and reaches the tip of the lateral groove 17b.

横方向溝１７ｂ内の突起１６は幅細部１７ｃにより係止されるため、蓋体１２を容器本体１１に対して堅固に取付けることができる。また、蓋体１２を容器本体１１から外すとき、縦方向溝１７ａにしたがって蓋体１２を回動させて容器本体１１と蓋体１２の係合を解くことができるため、培養液１の液面の揺れの発生が抑制され、蓋体１２を容器本体１１から外すときに培養液が外方を流出することが防止される。 Since the protrusion 16 in the lateral groove 17 b is locked by the width detail 17 c, the lid body 12 can be firmly attached to the container body 11. Further, when the lid body 12 is removed from the container body 11, the lid body 12 can be rotated according to the longitudinal groove 17a to disengage the container body 11 and the lid body 12. Is prevented, and the culture medium is prevented from flowing out when the lid 12 is removed from the container body 11.

なお、ガイド溝は上記の態様に限らず、図６（ａ）（ｂ）（ｃ）に示すように、蓋体１２の側壁内面に容器本体１１側へ突出する突起１６（蓋体固定手段）を設けるとともに、容器本体１１の側壁外面に突起１６が入り込むガイド溝（容器本体固定手段）１７を設けてもよい。 Note that the guide groove is not limited to the above-described mode, and as shown in FIGS. 6A, 6B, and 6C, a protrusion 16 projecting toward the container body 11 on the inner surface of the side wall of the lid 12 (lid fixing means) And a guide groove (container body fixing means) 17 into which the protrusion 16 enters the outer surface of the side wall of the container body 11 may be provided.

ここで、図６（ａ）は容器本体１１と蓋体１２を示す断面図であり、図６（ｂ）は容器本体１１の側壁外面を示す図であり、図６（ｃ）は蓋体１２の側壁内面を示す図である。 Here, FIG. 6A is a cross-sectional view showing the container main body 11 and the lid body 12, FIG. 6B is a view showing the outer surface of the side wall of the container main body 11, and FIG. FIG.

図６（ａ）（ｂ）（ｃ）に示すように、容器本体１１の側壁外面に設けられたガイド溝１７は、縦方向に延びる縦方向溝１７ａを有し、縦方向溝１７ａの下方部には突起１６を係止する幅軸部１７ｃが形成されている。 As shown in FIGS. 6A, 6B, and 6C, the guide groove 17 provided on the outer surface of the side wall of the container body 11 has a longitudinal groove 17a extending in the longitudinal direction, and a lower portion of the longitudinal groove 17a. A width shaft portion 17c for locking the protrusion 16 is formed on the.

図６（ａ）（ｂ）（ｃ）において、容器本体１１内に上方開口１１ｂから培養液１を注入した後、容器本体１１の上方開口１１ｂを蓋体１２により覆う。次に蓋体１２の側壁内面に設けられた突起１６をガイド溝１７の縦方向溝１７ａ内に嵌合させる。さらに蓋体１２を容器本体１１側へ押込む。このことにより突起１６が幅細部１７ｃを乗り越えて縦方向溝１７ａの下端に達する。 6 (a), 6 (b), and 6 (c), after injecting the culture solution 1 into the container body 11 from the upper opening 11b, the upper opening 11b of the container body 11 is covered with a lid 12. Next, the protrusion 16 provided on the inner surface of the side wall of the lid 12 is fitted into the longitudinal groove 17 a of the guide groove 17. Further, the lid body 12 is pushed into the container body 11 side. As a result, the protrusion 16 gets over the width detail 17c and reaches the lower end of the longitudinal groove 17a.

縦方向溝１７ａ内の突起１６は幅細部１７ｃにより係止されるため、蓋体１２を容器本体１１に対して堅固に取付けることができる。 Since the protrusion 16 in the longitudinal groove 17a is locked by the width detail 17c, the lid 12 can be firmly attached to the container body 11.

なお、容器本体１１の外側に突起が設けられ、蓋体１２の内側にガイド溝が設けられるものであってもよい。 In addition, a protrusion may be provided on the outside of the container body 11 and a guide groove may be provided on the inside of the lid body 12.

第３の実施の形態
以下、図７および図８により本発明の第３の実施の形態について説明する。 Third Embodiment Hereinafter, a third embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS.

細胞培養容器３０は、図７（ａ）（ｂ）に示すように、複数の液収納部３１Ａと、液収納部３１Ａ間を連結する連結プレート３１Ｂとを有する容器本体３１と、容器本体３１に装着される蓋本体３２とを備え、容器本体３１はプレート状の容器本体からなる。 As shown in FIGS. 7A and 7B, the cell culture container 30 includes a container main body 31 having a plurality of liquid storage portions 31A and a connection plate 31B connecting the liquid storage portions 31A. The container main body 31 includes a plate-shaped container main body.

ここで図７（ａ）は細胞培養容器を示す断面図であり、図７（ｂ）は細胞培養容器を示す斜視図である。 Here, FIG. 7A is a cross-sectional view showing the cell culture container, and FIG. 7B is a perspective view showing the cell culture container.

図７（ａ）（ｂ）に示すように、容器本体３１の各液収納部３１Ａは内底面３１ａと内側面３１ｃとを有し、上方に上方開口３１ｂが形成されている。また容器本体３１の各液収納部３１Ａの上方開口３１ｂは蓋体３２により覆われている。 As shown in FIGS. 7A and 7B, each liquid storage portion 31A of the container main body 31 has an inner bottom surface 31a and an inner side surface 31c, and an upper opening 31b is formed on the upper side. The upper opening 31 b of each liquid storage portion 31 A of the container body 31 is covered with a lid body 32.

また、蓋体３２の下方部には、内方へ突出する環状突部（蓋体固定手段）３３が設けられ、この蓋体３２の環状突部３３は容器本体３１の下方溝（容器本体固定手段）３５ａに係合して容器本体３１に対して蓋体３２を堅固に固定するようになっている。 In addition, an annular protrusion (lid fixing means) 33 that protrudes inward is provided at the lower part of the lid 32, and the annular protrusion 33 of the lid 32 is formed in a lower groove (container body fixing) of the container body 31. Means) The lid 32 is firmly fixed to the container main body 31 by engaging with 35a.

図７（ａ）（ｂ）において、容器本体３１の各液収納部３１Ａ内に上方開口３１ｂから細胞２を含む培養液１が注入される（図３（ａ）参照）。その後、容器本体３１の各液収納部３１Ａの上方開口３１ｂが蓋体３２により覆われる。 7 (a) and 7 (b), the culture solution 1 containing the cells 2 is injected into each solution storage portion 31A of the container body 31 from the upper opening 31b (see FIG. 3 (a)). Thereafter, the upper openings 31 b of the liquid storage portions 31 A of the container body 31 are covered with the lid body 32.

次に蓋体３２が容器本体３１側へ押込まれ、蓋体３２の環状突起３３が容器本体３１の下方溝３５ａに係合して、容器本体３１に対して蓋体３２を堅固に固定することができる。 Next, the lid body 32 is pushed toward the container body 31, and the annular protrusion 33 of the lid body 32 engages with the lower groove 35 a of the container body 31 to firmly fix the lid body 32 to the container body 31. Can do.

培養液１が注入された細胞培養容器３０は、その後遠心分離機２０（図４（ａ）（ｂ））参照）に設置される。次に遠心分離機２０により細胞培養容器３０に対して遠心力が付与され、細胞培養が行なわれて、各液収納部３１Ａの内底面３１ａに生体組織３が堆積する（図３（ｂ）参照）。 The cell culture container 30 into which the culture solution 1 has been injected is then installed in the centrifuge 20 (see FIGS. 4A and 4B). Next, a centrifugal force is applied to the cell culture container 30 by the centrifuge 20, cell culture is performed, and the living tissue 3 is deposited on the inner bottom surface 31a of each liquid storage portion 31A (see FIG. 3B). ).

この場合、各液収納部３１Ａの内底面３１ａは細胞非接着性であるか、または細胞非接着性に変化することが可能となっている。 In this case, the inner bottom surface 31a of each liquid storage portion 31A is non-cell-adhesive or can be changed to cell-non-adhesive.

このため各液収納部３１Ａの内底面３１ａに堆積した生体組織３をピペッティング操作により容易に剥離して回収することができる（図３（ｃ）参照）。 For this reason, the biological tissue 3 deposited on the inner bottom surface 31a of each liquid storage unit 31A can be easily peeled and recovered by pipetting operation (see FIG. 3C).

また細胞培養容器３０は、図８に示すように、複数の液収納部３１Ａと、液収納部３１Ａ間を連結する連結プレート３１Ｂとを有する容器本体３１と、容器本体３１に装着される蓋本体３２とを備え、容器本体３１はプレート状の容器本体からなっていてもよい。 As shown in FIG. 8, the cell culture container 30 includes a container body 31 having a plurality of liquid storage portions 31A and a connection plate 31B for connecting the liquid storage portions 31A, and a lid body attached to the container main body 31. 32, and the container body 31 may be a plate-shaped container body.

ここで図８は細胞培養容器を示す断面図である。 Here, FIG. 8 is a cross-sectional view showing the cell culture container.

図８に示すように、容器本体３１の各液収納部３１Ａは内底面３１ａと内側面３１ｃとを有し、上方に上方開口３１ｂが形成されている。また容器本体３１の各液収納部３１Ａの上方開口３１ｂは蓋体３２により覆われている。 As shown in FIG. 8, each liquid storage portion 31A of the container body 31 has an inner bottom surface 31a and an inner side surface 31c, and an upper opening 31b is formed on the upper side. The upper opening 31 b of each liquid storage portion 31 A of the container body 31 is covered with a lid body 32.

また、蓋体３２の下端には、揺動軸３６ａを中心に揺動する揺動突起（蓋体固定手段）３６が設けられ、この蓋体３２の揺動突起３６は容器本体３１の下端（容器本体固定手段）３５ｂに係合して容器本体３１に対して蓋体３２を堅固に固定するようになっている。 The lower end of the lid 32 is provided with a swinging projection (lid fixing means) 36 that swings about the swinging shaft 36a. The swinging projection 36 of the lid 32 is the lower end ( The lid 32 is firmly fixed to the container body 31 by engaging with the container body fixing means) 35b.

図８において、容器本体３１の各液収納部３１Ａ内に上方開口３１ｂから細胞２を含む培養液１が注入される（図３（ａ）参照）。その後、容器本体３１の各液収納部３１Ａの上方開口３１ｂが蓋体３２により覆われる。 In FIG. 8, the culture solution 1 containing the cells 2 is injected into each solution storage portion 31 A of the container body 31 from the upper opening 31 b (see FIG. 3A). Thereafter, the upper openings 31 b of the liquid storage portions 31 A of the container body 31 are covered with the lid body 32.

次に蓋体３２が容器本体３１側へ押込まれ、その後蓋体３２の揺動突起３６が揺動軸３６ａを中心として揺動し、容器本体３１の下端３５に係合する。このようにして容器本体３１に対して蓋体３２を堅固に固定することができる。 Next, the lid body 32 is pushed into the container body 31 side, and then the swing protrusion 36 of the lid body 32 swings around the swing shaft 36 a and engages with the lower end 35 of the container body 31. In this way, the lid body 32 can be firmly fixed to the container body 31.

培養液１が注入された細胞培養容器３０は、その後遠心分離機２０（図４（ａ）（ｂ）参照）に設置される。次に遠心分離機２０により細胞培養容器３０に対して遠心力が付与され、細胞培養が行なわれて、各液収納部３１Ａの内底面３１ａに生体組織３が堆積する（図３（ｂ）参照）。 The cell culture container 30 into which the culture solution 1 has been injected is then installed in the centrifuge 20 (see FIGS. 4A and 4B). Next, a centrifugal force is applied to the cell culture container 30 by the centrifuge 20, cell culture is performed, and the living tissue 3 is deposited on the inner bottom surface 31a of each liquid storage portion 31A (see FIG. 3B). ).

１０細胞培養容器
１１容器本体
１１ａ内底面
１１ｂ上方開口
１１ｃ内側面
１２蓋体
１３外ねじ
１４内ねじ
１６突起
１７ガイド溝
１７ａ縦方向溝
１７ｂ横方向溝
１７ｃ幅細部
２０遠心分離機
３０細胞培養容器
３１容器本体
３１Ａ液収納部
３１Ｂ連結プレート
３１ａ内底面
３１ｂ上方開口
３１ｃ内側面
３２蓋体
３３環状突部
３５ａ蓋体の溝
３５ｂ蓋体の下端
３６揺動突起 DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 Cell culture container 11 Container main body 11a Inner bottom surface 11b Upper opening 11c Inner side surface 12 Lid body 13 Outer screw 14 Inner screw 16 Projection 17 Guide groove 17a Longitudinal groove 17b Lateral groove 17c Width details 20 Centrifuge 30 Cell culture container 31 Container body 31A Liquid storage portion 31B Connection plate 31a Inner bottom surface 31b Upper opening 31c Inner side surface 32 Lid body 33 Annular protrusion 35a Lid groove 35b Lid lower end 36 Oscillating protrusion

Claims

細胞を含有する培養液を収納し、内底面方向へ遠心力を作用させながら、細胞間接着が形成される条件下で細胞培養を行ない、細胞間を接着させて組織を形成して内底面に生体組織を堆積させる細胞培養容器において、
細胞非接着性であるか、細胞非接着性に変化することが可能である内底面を有するとともに、上方開口を有する容器本体と、
容器本体の上方開口を覆う蓋体とを備え、
容器本体に容器本体固定手段が設けられ、蓋体に容器本体固定手段に係合する蓋体固定手段が設けられていることを特徴とする細胞培養容器。 Cell culture medium is stored, and cell culture is performed under conditions where cell-to-cell adhesion is formed while acting a centrifugal force toward the inner bottom surface. In a cell culture container for depositing biological tissue,
A container body having an inner bottom surface that is non-cell-adhesive or capable of changing to cell-non-adhesion, and has an upper opening;
A lid covering the upper opening of the container body,
A cell culture container, wherein a container body fixing means is provided in the container body, and a lid fixing means for engaging the container body fixing means is provided in the lid body.

容器本体固定手段および蓋体固定手段の一方は内ねじからなり、他方は外ねじからなることを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。 The cell culture container according to claim 1, wherein one of the container main body fixing means and the lid fixing means comprises an inner screw, and the other comprises an outer screw.

蓋体固定手段は容器本体側へ突出する突起からなり、容器本体固定手段は突起が入り込むガイド溝からなることを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。 2. The cell culture container according to claim 1, wherein the lid fixing means comprises a protrusion protruding toward the container main body, and the container main body fixing means comprises a guide groove into which the protrusion enters.

容器本体固定手段および蓋体固定手段の一方は他方側へ突出する突起からなり、他方は突起が入り込むガイド溝からなることを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。 2. The cell culture container according to claim 1, wherein one of the container body fixing means and the lid fixing means comprises a protrusion protruding to the other side, and the other comprises a guide groove into which the protrusion enters.

ガイド溝には突起を係止する幅細部が設けられていることを特徴とする請求項３または４記載の細胞培養容器。 The cell culture container according to claim 3 or 4, wherein the guide groove is provided with a width detail for engaging the protrusion.

蓋体固定手段は容器本体側へ突出する突起からなり、容器本体固定手段は突起が入り込む溝からなることを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。 The cell culture container according to claim 1, wherein the lid fixing means comprises a protrusion protruding toward the container body, and the container body fixing means comprises a groove into which the protrusion enters.

容器本体固定手段および蓋体固定手段の一方は他方側へ突出する突起からなり、他方は突起が入り込む溝からなることを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。 2. The cell culture container according to claim 1, wherein one of the container body fixing means and the lid fixing means comprises a protrusion protruding toward the other side, and the other comprises a groove into which the protrusion enters.

蓋体固定手段は揺動突起からなり、容器本体固定手段は揺動突起に係合する容器本体の下端からなることを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。 2. The cell culture container according to claim 1, wherein the lid fixing means comprises a swinging protrusion, and the container body fixing means comprises a lower end of the container body engaged with the swinging protrusion.

容器本体固定手段と蓋体固定手段は、互いに係合して容器本体内の培養液の流出を防止するとともに、容器本体内部と外部雰囲気とを連通可能とすることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか記載の細胞培養容器。 The container body fixing means and the lid body fixing means are engaged with each other to prevent the culture medium from flowing out of the container body and to allow communication between the inside of the container body and the external atmosphere. 9. The cell culture container according to any one of 8.