JP2013055911A - Cell culture vessel and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞培養容器及びその製造方法に関する。特に、細胞シートを安定的に作製するための細胞培養容器及びその製造方法に関する。また、上記の細胞培養容器を用いた細胞シートの製造方法に関する。 The present invention relates to a cell culture container and a method for producing the same. In particular, the present invention relates to a cell culture container for stably producing a cell sheet and a method for producing the same. Moreover, it is related with the manufacturing method of the cell sheet using said cell culture container.
近年、再生医療分野において患者から採取した細胞を生体外で培養して細胞シートを作製し、この細胞シートを生体内へ移植することで医療効果を高める効果が期待されている。さらに細胞シートを発展させ、生体外で構築した細胞構造体を患者へと移植することが提案されている。 In recent years, in the field of regenerative medicine, a cell sheet is produced by culturing cells collected from a patient in vitro, and the effect of enhancing the medical effect is expected by transplanting the cell sheet into the living body. Further, it has been proposed to develop a cell sheet and transplant a cell structure constructed in vitro to a patient.
細胞シートは、シャーレなどの支持体上で細胞培養を行うことにより得られるが、支持体上で形成された細胞シートは接着分子などを介して支持体表面と強固に結合しているため、細胞−細胞間の結合を壊さずに細胞培養基材から細胞シートを剥離することは容易ではない。 The cell sheet can be obtained by culturing cells on a support such as a petri dish, but the cell sheet formed on the support is firmly bound to the support surface via adhesion molecules, etc. -It is not easy to peel the cell sheet from the cell culture substrate without breaking the bond between cells.
そこで、細胞培養基材から細胞シートを効率的に剥離する方法がこれまで検討されてきた。細胞−細胞間の結合を壊さず非侵襲的に細胞培養基材から細胞シートを剥離する技術として、細胞の接着度合いが環境温度で変化する温度応答性ポリマーを用いた細胞培養基材が報告されている。このような技術として、例えば、特許文献１や特許文献２を挙げることができる。 Thus, methods for efficiently peeling a cell sheet from a cell culture substrate have been studied so far. A cell culture substrate using a temperature-responsive polymer whose degree of cell adhesion changes with environmental temperature has been reported as a technique for non-invasively peeling a cell sheet from a cell culture substrate without breaking the cell-cell bond. ing. Examples of such a technique include Patent Document 1 and Patent Document 2.
特許文献１では、基材に温度応答性ポリマーとなるモノマーを含む溶液を展開し、これに電子線照射してモノマーを重合するとともに基材に温度応答性ポリマーを固定化した細胞培養基材を作製し、この細胞培養基材上で細胞を培養し、温度応答性ポリマーの臨界溶解温度以下の環境下に移して細胞を剥離する技術が開示されている。 In Patent Document 1, a cell culture substrate in which a solution containing a monomer that becomes a temperature-responsive polymer is developed on a substrate, and the monomer is polymerized by irradiation with an electron beam, and the temperature-responsive polymer is immobilized on the substrate. A technique is disclosed in which cells are prepared, cultured on the cell culture substrate, transferred to an environment below the critical dissolution temperature of the temperature-responsive polymer, and detached.
特許文献２では、所定の表面を有するポリマー基材上に温度応答性ポリマーを含む環境応答性ポリマーを共有結合させた細胞培養基材を用いて、細胞シートを構築し、温度応答性ポリマーの臨界溶解温度以下の環境に移して当該細胞シートを剥離する技術が開示されている。 In Patent Document 2, a cell sheet is constructed using a cell culture substrate in which an environmentally responsive polymer including a temperature responsive polymer is covalently bonded to a polymer substrate having a predetermined surface, and the criticality of the temperature responsive polymer is determined. A technique is disclosed in which the cell sheet is peeled off by moving to an environment below the melting temperature.
このような、所定の条件において細胞非接着性へと変化することが可能な細胞接着性の機能性層を備える細胞培養基材は、トリプシンやＥＤＴＡのようなタンパク質分解酵素や薬品などを用いずに、細胞培養基材から細胞シートを剥離できるので、再生医療分野において有望な技術とされている。 A cell culture substrate having such a cell-adhesive functional layer that can change into a non-cell-adhesive property under predetermined conditions does not use a proteolytic enzyme such as trypsin or EDTA or a drug. Furthermore, since the cell sheet can be peeled from the cell culture substrate, it is considered a promising technique in the field of regenerative medicine.
しかしながら、温度応答性ポリマー層等の、機能性層を備えた細胞培養基材上で作製された細胞シートを安定的に剥離することが困難である場合がある。 However, it may be difficult to stably peel off a cell sheet produced on a cell culture substrate having a functional layer such as a temperature-responsive polymer layer.
そこで本発明は上記の実情に鑑みてなされたものであり、細胞培養基材から細胞シートを安定的に剥離することが可能な細胞培養容器を提供することを目的とする。 Then, this invention is made | formed in view of said situation, and it aims at providing the cell culture container which can peel a cell sheet stably from a cell culture base material.
従来の細胞培養基材は、予め所望の形状に加工された基材の表面に機能性層を付与することにより、或いは、先に基材表面に機能性層を付与し、次いで所望の形状に加工することにより形成される。予め所望の形状に加工された基材の表面に機能性層を付与する場合、細胞培養基材の外周端面（側面）には機能性を付与することが困難である。一方、先に基材表面に機能性層を付与し、次いで所望の形状に加工する場合、細胞培養基材の周縁に位置する機能性層は、機能性層形成後に裁断などの加工がなされるため機能性が失われてしまう。本発明者は、このような事情により細胞培養基材の周縁部分の表面や外周端面には機能性を付与することが困難であること、機能性層表面にて細胞培養を行い細胞シートを形成する場合には、細胞シートの周縁部にあたるこれらの箇所に細胞が不用意に付着してしまうために細胞シートを剥離することが困難な場合があることを見出した。 Conventional cell culture substrates can be obtained by applying a functional layer to the surface of a substrate that has been processed into a desired shape in advance, or by first applying a functional layer to the surface of the substrate and then forming the desired shape. It is formed by processing. When a functional layer is applied to the surface of a substrate that has been processed into a desired shape in advance, it is difficult to provide functionality to the outer peripheral end surface (side surface) of the cell culture substrate. On the other hand, when a functional layer is first applied to the substrate surface and then processed into a desired shape, the functional layer positioned at the periphery of the cell culture substrate is subjected to processing such as cutting after the functional layer is formed. Therefore, functionality will be lost. The present inventor forms a cell sheet by culturing cells on the surface of the functional layer because it is difficult to impart functionality to the surface of the peripheral portion and the outer peripheral end surface of the cell culture substrate due to such circumstances. In this case, it has been found that it may be difficult to peel off the cell sheet because the cells are inadvertently attached to these portions corresponding to the peripheral edge of the cell sheet.
本発明者はまた、機能性層を備えた細胞培養基材を支持体に固定化して使用する場合に、機能性層表面で培養された細胞が、該機能性層表面に接している支持体の一部分と不用意に付着してしまうことがあり、この場合もまた、細胞シートの周縁部にあたる部分が支持体に付着してしまうために細胞シートを剥離することが困難な場合があることを見出した。 The present inventor also provides a support in which cells cultured on the surface of the functional layer are in contact with the surface of the functional layer when the cell culture substrate having the functional layer is immobilized on the support. In some cases, it may be difficult to peel off the cell sheet because the peripheral part of the cell sheet adheres to the support. I found it.
そこで本発明者らは、鋭意研究を行い、細胞培養基材の機能性層表面で構築された細胞シートの剥離に際し、細胞シートの周縁部にあたる位置の一部又は全部に剥離の起点を設けることが、安定的に細胞シートの剥離を行う上で有用であるとの知見を得た。 Therefore, the present inventors have conducted intensive research and, when peeling the cell sheet constructed on the surface of the functional layer of the cell culture substrate, provide a starting point for peeling at a part or all of the position corresponding to the peripheral portion of the cell sheet. However, the present inventors have found that it is useful for stably peeling the cell sheet.
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）支持体と、
基材、及び、該基材の表面上に形成された、所定の条件において細胞非接着性へと変化することが可能な細胞接着性の表面を有する機能性層を備える細胞培養基材と、
前記支持体と前記細胞培養基材とを接合する接合部と、を備え、
前記接合部は、細胞非接着性の表面を有し、且つ、前記機能性層の表面の、培養時に細胞と接触する領域の周縁の少なくとも一部を被覆するように配置されていることを特徴とする細胞培養容器。
（２）前記機能性層の表面の、培養時に細胞と接触する領域の周縁のうち前記接合部により被覆される部分が、前記細胞培養基材の周縁に位置する部分である、（１）の細胞培養容器。
（３）前記支持体には、該支持体を貫通する開口部が形成されており、
前記細胞培養基材は、前記開口部を塞ぐように配置されている、（１）又は（２）の細胞培養容器。
（４）基材と、該基材の表面上に形成された、所定の条件において細胞非接着性へと変化することが可能な細胞接着性の表面を有する機能性層とを備える細胞培養基材を、該機能性層を備えた面を内側とし、該細胞培養基材の一方の側端部と他方の側端部とを接合して形成される筒状の胴部材であって、前記細胞培養基材の一方の側端部と他方の側端部とが、細胞非接着性の表面を有する接合部であって、且つ、該二つの側端部に位置する該機能性層の少なくとも一部を被覆するように配置された接合部により接合されている胴部材と、
前記筒状の胴部材の一端に接合された、該一端を閉塞する底部材と、
前記筒状の胴部材の他端に接合された、通孔が形成された首部材と、を備えたボトル型の細胞培養容器。
（５）支持体と、
基材、及び該基材の表面上に形成された、所定の条件において細胞非接着性へと変化することが可能な細胞接着性の表面を有する機能性層を備える細胞培養基材と、
前記支持体と前記細胞培養基材とを接合する接合部と、を備える細胞培養容器の製造方法であって、
前記支持体と、前記細胞培養基材と、細胞非接着性を有する材料を硬化により生成可能な成分を含む硬化性塗工液との組み合せであって、前記硬化性塗工液が、前記細胞培養基材の前記機能性層の表面の、培養時に細胞と接触する領域の周縁の少なくとも一部を被覆する位置と、前記支持体と前記細胞培養基材とを接合することが可能な位置とに少なくとも適用されている前記組み合わせ、を準備する工程と、
前記組み合わせにおいて前記硬化性塗工液を硬化させることにより前記接合部を形成する工程と、を含む前記方法。
（６）前記支持体には、該支持体を貫通する開口部が形成されており、
前記組み合わせにおいて、前記細胞培養基材は前記開口部を塞ぐように配置されており、前記硬化性塗工液が適用される、前記支持体と前記細胞培養基材とを接合することが可能な位置が、前記開口部の周縁の少なくとも一部を含む、（５）の方法。
（７）前記組み合わせにおいて、前記細胞培養基材の前記機能性層の表面の、培養時に細胞と接触する領域の周縁のうち前記硬化性塗工液により被覆される部分が、前記細胞培養基材の周縁に位置する部分である、（５）又は（６）の方法。
（８）基材と、該基材の表面上に形成された、所定の条件において細胞非接着性へと変化することが可能な細胞接着性の表面を有する機能性層とを備える細胞培養基材を、該機能性層を備えた面を内側とし、該細胞培養基材の一方の側端部と他方の側端部とを、接合部により接合して形成される筒状の胴部材と、
前記筒状の胴部材の一端に接合された、該一端を閉塞する底部材と、
前記筒状の胴部材の他端に接合された、通孔が形成された首部材と、を備えたボトル型の細胞培養容器の製造方法であって、
前記機能性層を備えた面を内側とし、前記細胞培養基材の一方の側端部と他方の側端部とが相互に接合可能な位置に配置されるように筒状に加工した前記細胞培養基材と、細胞非接着性を有する材料を硬化により生成可能な成分を含む硬化性塗工液との組み合わせであって、前記硬化性塗工液が、前記細胞培養基材における前記二つの側端部に位置する機能性層の少なくとも一部を被覆する位置と、前記二つの側端部を接合することが可能な位置とに少なくとも適用されている前記組み合わせを準備する工程と、
前記組み合わせにおいて前記硬化性塗工液を硬化させることにより前記接合部を形成して、前記筒状の胴部材を形成する工程と、
前記筒状の胴部材の一端に前記底部材を取り付け、他端に前記首部材を取り付ける工程と、を含む方法。
（９）（１）〜（４）のいずれかの細胞培養容器の前記機能性層上で細胞を培養する工程と、
前記機能性層に、前記所定の条件を印加して、前記機能性層の表面を細胞非接着性へと変化させる工程と、
培養された細胞の剥離を前記接合部が存在する部位から開始して、前記機能性層から細胞を剥離する工程と、を含むことを特徴とする細胞シートの製造方法。
The present invention includes the following inventions.
(1) a support;
A cell culture substrate comprising a substrate and a functional layer formed on the surface of the substrate and having a cell-adhesive surface capable of changing to a non-cell-adhesive property under a predetermined condition;
A bonding portion for bonding the support and the cell culture substrate,
The joint has a non-cell-adhesive surface, and is arranged so as to cover at least a part of the periphery of the surface of the functional layer that comes into contact with cells during culture. A cell culture container.
(2) The part of the surface of the functional layer, which is covered with the joint part, of the periphery of the region that contacts the cell during culture is a part located at the periphery of the cell culture substrate. Cell culture container.
(3) The support is formed with an opening penetrating the support.
The cell culture container according to (1) or (2), wherein the cell culture substrate is disposed so as to close the opening.
(4) A cell culture medium comprising a base material and a functional layer formed on the surface of the base material and having a cell-adhesive surface capable of changing to a cell non-adhesive property under a predetermined condition The material is a cylindrical trunk member formed by joining one side end and the other side end of the cell culture substrate with the surface provided with the functional layer on the inside, One side end of the cell culture substrate and the other side end are joints having a non-cell-adhesive surface, and at least the functional layer located at the two side ends A body member joined by a joint arranged to cover a part;
A bottom member that is joined to one end of the cylindrical body member and closes the one end;
A bottle-shaped cell culture container, comprising: a neck member formed with a through-hole, joined to the other end of the cylindrical body member.
(5) a support;
A cell culture substrate comprising a substrate and a functional layer formed on the surface of the substrate and having a cell-adhesive surface capable of changing to a non-cell-adhesive property under a predetermined condition;
A joint for joining the support and the cell culture substrate, and a method for producing a cell culture container comprising:
A combination of the support, the cell culture substrate, and a curable coating solution containing a component capable of generating a cell non-adhesive material by curing, wherein the curable coating solution is the cell. A position on the surface of the functional layer of the culture substrate that covers at least a part of the periphery of a region that comes into contact with the cell during culture, and a position where the support and the cell culture substrate can be joined together. Preparing the combination applied at least to:
Forming the joint by curing the curable coating liquid in the combination.
(6) The support is formed with an opening penetrating the support.
In the combination, the cell culture substrate is disposed so as to close the opening, and the support and the cell culture substrate to which the curable coating solution is applied can be joined. The method according to (5), wherein the position includes at least a part of a periphery of the opening.
(7) In the above combination, a portion of the surface of the functional layer of the cell culture substrate that is covered with the curable coating solution in the periphery of a region that contacts the cells during culture is the cell culture substrate. The method of (5) or (6), which is a portion located on the periphery of
(8) A cell culture medium comprising a substrate and a functional layer formed on the surface of the substrate and having a cell-adhesive surface capable of changing to a cell non-adhesive property under a predetermined condition A cylindrical body member formed by joining a material with the surface provided with the functional layer on the inside, and joining one side end and the other side end of the cell culture substrate with a joint; ,
A bottom member that is joined to one end of the cylindrical body member and closes the one end;
A neck member formed with a through-hole joined to the other end of the cylindrical body member, and a manufacturing method of a bottle-type cell culture container,
The cell processed into a cylindrical shape so that the surface provided with the functional layer is the inside, and one side end and the other side end of the cell culture substrate are arranged at positions where they can be joined to each other A combination of a culture substrate and a curable coating solution containing a component capable of generating a material having cell non-adhesive properties by curing, wherein the curable coating solution is a combination of the two in the cell culture substrate. Preparing the combination applied at least to a position covering at least a part of the functional layer located at the side end and a position capable of joining the two side ends;
Forming the joint by curing the curable coating liquid in the combination, and forming the cylindrical body member;
Attaching the bottom member to one end of the cylindrical body member and attaching the neck member to the other end.
(9) culturing cells on the functional layer of the cell culture container of any one of (1) to (4);
Applying the predetermined condition to the functional layer to change the surface of the functional layer to non-cell-adhesive;
Detaching cells from the functional layer by starting detachment of the cultured cells from a site where the joint is present, and a method for producing a cell sheet.
本発明によれば、細胞培養基材から細胞シートを安定的に剥離することができる。 According to the present invention, a cell sheet can be stably peeled from a cell culture substrate.
以下、図面を参照しながら、本発明の実施形態について説明を行う。本発明は以下に説明する形態に限定されることはなく、技術思想を逸脱しない範囲において種々変形を行なって実施することが可能である。また図面においては、説明のために縮尺を誇張して図示することがあり、実際のものとは縮尺が異なる場合がある。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings. The present invention is not limited to the embodiments described below, and various modifications can be made without departing from the technical idea. In the drawings, the scale may be exaggerated for explanation, and the scale may be different from the actual one.
＜１．第１の実施形態＞
（細胞培養容器）
まず本発明に係る細胞培養容器について説明する。
<1. First Embodiment>
(Cell culture vessel)
First, the cell culture container according to the present invention will be described.
本発明の一実施形態に係る細胞培養容器は、支持体と、該支持体に取り付けられた、所定の条件において細胞非接着性へと変化することが可能な細胞接着性の表面を有する機能性層を有する細胞培養基材と、前記細胞培養基材と前記支持体とを接合する接合部と、を備え、前記接合部は、細胞非接着性の表面を有し、且つ、前記機能性層の表面の、培養時に細胞と接触する領域の周縁の少なくとも一部を被覆するように配置されたことを特徴とするものである。 A cell culture container according to an embodiment of the present invention has a support and a functionality attached to the support and having a cell adhesive surface capable of changing to a cell non-adhesive property under predetermined conditions. A cell culture substrate having a layer; and a joint that joins the cell culture substrate and the support; and the joint has a non-cell-adhesive surface, and the functional layer It is characterized by being arranged so as to cover at least a part of the periphery of the area of the surface of which is in contact with cells during culture.
本発明において「機能性層の表面の、培養時に細胞と接触する領域」とは、機能性層の表面のうち、細胞培養容器での細胞が接触可能な位置にある領域を指す。機能性層の表面のうち、細胞培養容器の細胞が収容される部分に露出した領域が「培養時に細胞と接触する領域」に相当する。 In the present invention, the “region on the surface of the functional layer that comes into contact with cells during culture” refers to a region in the surface of the functional layer that is in a position where cells in the cell culture container can contact. Of the surface of the functional layer, a region exposed to a portion of the cell culture container in which the cells are accommodated corresponds to a “region in contact with the cells during culture”.
上記のような細胞培養容器について、図１〜図５を参照して説明する。なお、これらの図で示す実施形態では、前記機能性層の表面の、培養時に細胞と接触する領域の周縁のうち前記接合部により被覆される部分が、前記細胞培養基材の周縁に位置する部分である。 The cell culture container as described above will be described with reference to FIGS. In the embodiments shown in these drawings, the portion of the surface of the functional layer that is covered by the joint portion of the periphery of the region that comes into contact with the cells during culture is located at the periphery of the cell culture substrate. Part.
本発明に係る細胞培養容器の一例を図１（断面図）及び図２（平面図）に示す。細胞培養容器１００は、支持体１０と、支持体１０上に配置された細胞培養基材２０と、支持体１０と細胞培養基材２０とを接合する接合部３０を備える。支持体１０の内側に細胞及び培養液が保持される。細胞は、細胞培養基材２０の表面に接着して培養され、その後、細胞培養基材２０の表面から剥離して系外に取り出される。
An example of the cell culture container according to the present invention is shown in FIG. 1 (sectional view) and FIG. 2 (plan view). The
細胞培養基材２０は、基材２２と、基材２２の表面上に形成された、所定の条件において細胞非接着性へと変化することが可能な細胞接着性の表面を有する機能性層２４とを備える。接合部３０は、少なくとも細胞非接着性の表面を有し、機能性層２４の周縁の少なくとも一部を被覆するように配置されている。培養時に機能性層２４は細胞培養可能な表面として機能する。接合部３０は、細胞に対して非接着部として機能する。機能性層２４表面と接合部３０表面とは細胞の接着度合いに差があり、かつ物理的な段差が存在する。平面視上の機能性層２４との境界近傍に位置する接合部３０は、細胞シートの剥離の開始点として作用する。これにより、機能性層２４上で作製した細胞シートの剥離が容易となる。次に各構成について説明を行う。
The
（支持体）
支持体１０は、細胞と培養液を保持できる構造であることが好ましい。典型的には、図１に示すように、細胞と培養液を保持することが可能なように、円形の底板と、該底板の周縁から上方に立設された側壁とを備える皿状の形状であってもよいし、細胞及び培養液を保持することが可能な他の形状であってもよい。より具体的には、支持体は、シャーレ、フラスコ、ビーカー、ウェルプレート、管等の形状であることができる。また、支持体単独で細胞と培養液を保持できる図１に示すような構造であることは必須ではなく、詳細は後述するが、支持体と細胞培養基材とを組み合わせた形態で細胞と培養液を保持できる構造であってもよい。
(Support)
The
支持体１０の材料には、特に制限は無い。好ましくは細胞培養において一般的に用いられるものであるとよい。例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等のポリマー、表面親水化処理を施した上記の少なくとも１種を含むポリマー、及びガラスや石英等の無機材料であってもよい。なかでもポリスチレン樹脂又はポリエチレンテレフタレート樹脂であることが好ましい。ポリスチレン樹脂は、細胞毒性が低い材料である点で好ましい。また、ポリエチレンテレフタレート樹脂は、低コストで入手可能であり量産作製に適した材料である点で好ましい。
There is no restriction | limiting in particular in the material of the
（細胞培養基材）
細胞培養基材２０は、基材２２と、基材２２上に配置された機能性層２４を含む。図１では、機能性層２４側を天面として細胞培養基材２０が支持体１０の内側底面上に配置された例を示す。細胞培養基材２０は、支持体１０上に少なくとも１つ配置されていればよく、例えば、複数の細胞培養基材が支持体１０上に並設されていてもよい。基材２２は、上記支持体１０の内側に収納可能な大きさや形状であることが好ましい。また、上記支持体１０の内側の形状に沿うものであることが好ましい。好ましくは平坦な板状、シート状、フィルム状である。細胞の培養が行いやすいからである。基材２２の厚さについても特に制限は無いが、取り扱い性を考慮して、例えば、１００μｍ〜５ｍｍとすることができる。
(Cell culture substrate)
The
基材２２の材料には、特に制限は無い。好ましくは細胞培養において一般的に用いられる材料である。具体的には、上記支持体と同様の材料から独立に選択される材料とすることができる。また、上記支持体と同様の材料から独立に選択される材料の片側に多孔質層を設けた材料であってもよい。
There is no restriction | limiting in particular in the material of the
機能性層２４は、基材２２に形成された、所定の条件において細胞非接着性へと変化することが可能な細胞接着性の表面を有する層である。細胞接着性表面から細胞非接着性表面への変化は、可逆的なものであってもよいし、不可逆的なものであってもよいが、可逆的なものであることが好ましい。機能性層としては、所定の刺激によって表面の細胞の接着度合いが変化するポリマー（刺激応答性ポリマー）を含む層等が挙げられる。刺激応答性ポリマーとしては、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー、光応答性ポリマーなどを挙げることができる。なかでも温度応答性ポリマーを用いることが好ましい。刺激の付与が簡単だからである。
The
温度応答性ポリマーとして、例えば、細胞を培養する温度では細胞接着性を示し、作製した細胞シートの剥離する時の温度では細胞非接着性を示すものを用いるとよい。例えば、温度応答性ポリマーは、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込んで膨潤して表面に細胞を接着しにくくする性質（細胞非接着性）を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮して表面に細胞を接着しやすくする性質（細胞接着性）を示すものを用いるとよい。このような臨界溶解温度は、下限臨界溶解温度と呼ばれる。下限臨界溶解温度Ｔが０℃〜８０℃、さらに好ましくは０℃〜５０℃である温度応答性ポリマーを用いるとよい。Ｔが０℃〜８０℃であると、細胞を安定的に培養できるからである。 As the temperature-responsive polymer, for example, a polymer that exhibits cell adhesion at a temperature at which cells are cultured and exhibits cell non-adhesion at a temperature at which the produced cell sheet is peeled may be used. For example, a temperature-responsive polymer has improved affinity to surrounding water at temperatures below the critical dissolution temperature, and the polymer takes up water and swells to make it difficult for cells to adhere to the surface (cell non-adhesiveness). It is preferable to use a material exhibiting a property (cell adhesiveness) that makes the polymer shrink and easily adheres cells to the surface when water is desorbed from the polymer at temperatures equal to or higher than the same temperature. Such a critical solution temperature is called a lower critical solution temperature. A temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature T of 0 ° C. to 80 ° C., more preferably 0 ° C. to 50 ° C. may be used. This is because the cells can be stably cultured when T is 0 ° C to 80 ° C.
上記の温度応答性ポリマーとして、具体的には、アクリル系ポリマーまたはメタクリル系ポリマーを挙げることができる。ポリーＮ−イソプロピルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリーＮ−ｎ−プロピルアクリルアミド（Ｔ＝２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（Ｔ＝約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）等が挙げられる。なお、これらに限らず、種々の公知の材料を用いてもよい。また、温度応答性高分子は、ホモポリマーであってもよいし、コポリマーであってもよい。 Specific examples of the temperature-responsive polymer include acrylic polymers and methacrylic polymers. Poly-N-isopropylacrylamide (T = 32 ° C.), Poly-Nn-propylacrylamide (T = 21 ° C.), Poly-Nn-propylmethacrylamide (T = 32 ° C.), Poly-N-ethoxyethylacrylamide ( T = about 35 ° C.), poly-N-tetrahydrofurfuryl acrylamide (T = about 28 ° C.), poly-N-tetrahydrofurfuryl methacrylamide (T = about 35 ° C.), and poly-N, N-diethylacrylamide ( T = 32 ° C.). In addition, you may use not only these but various well-known materials. The temperature-responsive polymer may be a homopolymer or a copolymer.
上記のいずれかの材料を含む刺激応答性ポリマーを所定の厚さとなるように基材２２上に固定化して、機能性層２４とする。刺激応答性ポリマーとして温度応答性ポリマーを用いる場合には、その膜厚は、例えば、０．５ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内とするよく、なかでも１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であることが好ましい。膜厚を０．５ｎｍ〜３００ｎｍの範囲とすることで細胞の接着と剥離の両立が容易となる。なお、機能性層２４には、その機能を損なわない程度に界面活性剤等の成分を含んでもよい。
The stimuli-responsive polymer containing any of the above materials is immobilized on the
細胞接着性及び細胞非接着性は、一の領域と他の領域における細胞の接着度合いの相対的な関係を示すものである。 Cell adhesion and cell non-adhesion indicate a relative relationship between the degree of cell adhesion in one region and the other region.
細胞接着性とは、細胞が接着しやすいことをいう。細胞接着性は、表面の化学的性質や物理的性質等によって細胞の接着や伸展が起こりやすいか否かで決定される。 Cell adhesion means that cells are easily adhered. Cell adhesion is determined by whether or not cell adhesion or extension is likely to occur depending on the chemical or physical properties of the surface.
細胞接着性を判断する指標として、実際に細胞培養した際の細胞接着伸展率を用いることができる。細胞接着性の表面は、細胞接着伸展率が６０％以上の表面であることが好ましく、細胞接着伸展率が８０％以上の表面であることが更に好ましい。細胞接着伸展率が高いと、効率的に細胞を培養することができる。本発明における細胞接着伸展率は、播種密度が４０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上３００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２未満の範囲内で培養しようとする細胞を測定対象表面に播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内に保管し、１４．５時間培養した時点で接着伸展している細胞の割合（｛（接着している細胞数）／（播種した細胞数）｝×１００（％））と定義する。 As an index for determining cell adhesion, the cell adhesion spreading rate when cells are actually cultured can be used. The cell adhesive surface is preferably a surface having a cell adhesion extension rate of 60% or more, and more preferably a surface having a cell adhesion extension rate of 80% or more. If the cell adhesion extension rate is high, cells can be cultured efficiently. The cell adhesion extension rate in the present invention is such that cells to be cultured within a seeding density of 4000 cells / cm 2 or more and less than 30000 cells / cm 2 are seeded on the surface to be measured, and in an incubator at 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5%. It is defined as the ratio of cells that have adhered and spread when cultured for 14.5 hours ({(number of cells adhered) / (number of cells seeded)} × 100 (%)).
細胞の播種は、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地に懸濁させて測定対象物上に播種し、その後、細胞ができるだけ均一に分布するよう、細胞が播種された測定対象物をゆっくりと振とうすることにより行うものである。さらに、細胞接着伸展率の測定は、測定直前に培地交換を行って接着していない細胞を除去した後に行う。細胞接着伸展率の測定では、細胞の存在密度が特異的になりやすい箇所（例えば、存在密度が高くなりやすい所定領域の中央、存在密度が低くなりやすい所定領域の周縁）を除いた箇所を測定箇所とする。 Cell seeding is suspended in DMEM medium containing 10% FBS, seeded on the measurement object, and then slowly shaken the measurement object on which the cells are seeded so that the cells are distributed as uniformly as possible. It is done by. Furthermore, the measurement of the cell adhesion extension rate is performed after exchanging the medium immediately before the measurement to remove the non-adhered cells. When measuring cell adhesion spread rate, measure the location excluding the location where the cell density tends to be specific (for example, the center of the predetermined area where the density is likely to be high, the periphery of the predetermined area where the density is likely to be low) A place.
一方、細胞非接着性とは、細胞が接着しにくい性質をいう。細胞非接着性は、表面の化学的性質や物理的性質等によって細胞の接着や伸展が起こりにくいか否かで決定される。 On the other hand, cell non-adhesiveness refers to the property that cells are difficult to adhere. Cell non-adhesiveness is determined by whether or not cell adhesion or extension is unlikely to occur due to the chemical or physical properties of the surface.
細胞非接着性の表面は、上記で定義した細胞接着伸展率が６０％未満の表面であることが好ましく、４０％未満の表面であることがより好ましく、５％以下の表面であることが更に好ましく、２％以下の表面であることが最も好ましい。 The non-cell-adhesive surface is preferably a surface having a cell adhesion extension rate as defined above of less than 60%, more preferably less than 40%, and even more preferably 5% or less. The surface is preferably 2% or less, and most preferably.
測定対象物の表面の細胞接着性及び細胞非接着性は、測定対象物の状態によっては水接触角の値を指標として簡易に評価できる場合がある。細胞接着性の表面は、水に対する接触角（水接触角）が６０°以下の表面であることが好ましく、水接触角が４０°以下であることがより好ましい。細胞非接着性の表面は、水接触角が６０°を超える表面であることが好ましく、８０°以上の表面であることがより好ましく、水接触角が９０°以上の表面であることが更に好ましい。なお、水接触角は、温度２５℃、湿度３０％、大気圧下でマイクロシリンジから測定対象表面に純水を滴下して３０秒後に接触角測定器 協和界面科学（株）製 ＣＡ−Ｚ型を用いて測定した値とする。水接触角を細胞接着性／非接着性の指標に用いることができる表面としては、水溶性や水膨潤性を有しない、あるいは水溶性や水膨潤性を有していても極めてその性質が低い高分子表面が挙げられる。具体的には、ポリスチレンやポリジメチルシロキサン等の高分子表面が挙げられる。 Depending on the state of the measurement object, the cell adhesiveness and cell non-adhesiveness of the surface of the measurement object may be easily evaluated using the value of the water contact angle as an index. The cell adhesive surface is preferably a surface having a water contact angle (water contact angle) of 60 ° or less, and more preferably a water contact angle of 40 ° or less. The cell non-adhesive surface is preferably a surface having a water contact angle of more than 60 °, more preferably a surface of 80 ° or more, and further preferably a surface having a water contact angle of 90 ° or more. . The water contact angle was measured at a temperature of 25 ° C., a humidity of 30%, and atmospheric pressure, dropping pure water from the microsyringe onto the surface to be measured, and 30 seconds later, contact angle measuring device manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd. CA-Z type The value measured using. Surfaces that can use the water contact angle as an indicator of cell adhesion / non-adhesion are not water-soluble or water-swellable, or have very low properties even if they have water-solubility or water-swellability. Examples include polymer surfaces. Specific examples include polymer surfaces such as polystyrene and polydimethylsiloxane.
（接合部）
接合部３０は、機能性層２４の、培養時に細胞と接触する領域の周縁の少なくとも一部を被覆するように配置され、細胞培養基材２０と支持体１０とを接合する。図１及び図２では、接合部３０が、細胞培養基材２０の周縁に位置する機能性層２４表面と、細胞培養基材２０の外周端面（側面）の全体とを被覆し、支持体１０の、細胞培養基材２０の外周に近接する部分も被覆している様子を示している。接合部３０は、細胞非接着性を有する材料を含み、少なくとも表面が細胞非接着性を有する。接合部３０を構成する「細胞非接着性を有する材料」としては、例えば、ポリジメチルシロキサン等のシリコーン系ポリマー、フッ素含有ポリマーといった疎水性ポリマーを挙げることができる。なかでも細胞毒性が低いポリジメチルシロキサンを用いることが好ましい。
(Joint part)
The joining
接合部３０は、細胞非接着性を有する材料を硬化により生成可能な成分を含む硬化性塗工液を、硬化させることにより形成することができる。このような硬化性塗工液としては、２液混合型の常温硬化性樹脂、熱硬化型樹脂、又は光硬化性樹脂を含む接着剤等が挙げられる。硬化性塗工液は、硬化により細胞非接着性を有する材料を生成することが可能な組成を有するものであれば特に限定されない。
The
接合部３０は、支持体１０と細胞培養基材２０とを接合するのに十分な量の硬化性塗工液を用いて形成することができる。
The joining
接合部３０の最上部の高さ位置が、機能性層２４の表面の高さ位置よりも高い位置にあることが好ましい。つまり、接合部３０の一部が、機能性層２４の表面に載り上げるように配置されているものである。接合部３０の最上部の位置が機能性層２４の表面よりも高い位置とすることで、機能性層２４の表面上で培養される細胞が接合部３０を物理的な障壁として認識することができる。接合部３０の最上部の高さ位置と機能性層２４の表面の高さ位置との差をＨ（図１参照）とすると、Ｈを、機能性層２４表面で接着や伸展した細胞の高さよりも大きくすることが好ましい。例えば、具体的な数値を挙げるとＨを５μｍ以上とすることが好ましく、１０μｍ以上とすることがより好ましく、３０μｍ以上とすることが更に好ましい。接合部３０の最上部の位置を上記範囲とすることで、例えば、接合部３０を乗り越えて支持体１０の内側の側壁に付着することを防止することができる。
It is preferable that the height position of the uppermost portion of the
接合部３０の、機能性層２４の表面の、培養時に細胞と接触する領域に面する側の側壁は、垂直形状、順テーパー形状（断面視において、機能性層２４表面の、培養時に細胞と接触する領域と前記側壁とが成す角が９０°よりも大きい形状）、逆テーパー形状（断面視において、機能性層２４表面の、培養時に細胞と接触する領域と前記側壁とが成す角が９０°よりも小さい形状）、外側に向かって凸形状（例えば図１に示すように、接合部３０の前記側面が断面視で外側に膨らんだ曲線を描く形状）などの種々の形状をとりうる。
The side wall of the
図２を参照して、上記の各構成の関係について説明する。図２は、本発明に係る細胞培養容器の一例を示す平面図である。支持体１０の内側に細胞培養基材２０及び接合部３０が配置されている。接合部３０は、機能性層２４の周縁を全周にわたり被覆している。図中の点線は、細胞培養基材２０の最外周を示している。露出している機能性層２４が、培養時に細胞と接触する領域となる。接合部３０が細胞非接着性の表面を有するので、細胞が接着することが抑えられ、接合部３０が存在する部位は剥離開始点として作用する。剥離開始点近傍では、細胞シートが細胞培養基材から剥離して一部浮遊可能な状態となり、細胞シートの裏面と細胞培養基材との間に培養液が侵入しやすい構造となる。培養液に動きを与えることにより生じた水流が、細胞シートの裏面を押圧することで、細胞シートが細胞培養基材から剥離することが促進される。
With reference to FIG. 2, the relationship of each said structure is demonstrated. FIG. 2 is a plan view showing an example of a cell culture container according to the present invention. The
接合部３０が、機能性層２４表面の、培養時に細胞と接触する領域の周縁（特に細胞培養基材２０の周縁）を被覆する幅には特に制限は無く、所望の面積の機能性層２４が露出するようにすればよい。なお、製造しやすさの点を考慮すると、接合部３０が機能性層２４の前記領域の周縁を被覆する幅を５０μｍ以上とすることが好ましい。
There is no particular limitation on the width of the
細胞の種類や培養条件等によっては、機能性層２４表面のみならず、支持体１０の内側底面や細胞培養基材２０の外周端面（側面）といった意図しない部位に細胞が接着する場合がある。意図しない部位に接着した細胞は、細胞シートと連なり細胞シートの剥離を困難とするおそれがある。また、細胞培養基材の加工状況によっては細胞培養基材の周縁及び外周端面に細胞が接着し、この細胞の剥離を制御することが困難な場合がある。細胞培養容器１００において、接合部３０を細胞培養基材２０の周縁の全周にわたって配置した場合、接合部３０によって、細胞シートを形成する機能性層２４表面と支持体１０の内側底面とが細胞培養基材２０の外周端面を介して一続きとならないように構成される。つまり、機能性層２４表面と支持体１０表面が、接合部３０により空間的に分断されている。この実施形態では、機能性層２４表面において培養される細胞が、支持体１０の底壁表面の細胞とつながることがなく、より安定的に細胞シートの剥離を行うことができる。
Depending on the type of cells, culture conditions, and the like, cells may adhere not only to the surface of the
各構成の関係は上記に限らない。図３は、本発明に係る細胞培養容器の他の例を示す平面図である。支持体１０及び細胞培養基材２０は図１、２の実施形態と同様である。この実施形態では、支持体１０の内側に、細胞培養基材２０及び接合部３０が配置され、接合部３０は機能性層２４表面の、培養時に細胞と接触する領域の周縁の一部を被覆する。該領域の外周の長さの１／４以上が接合部３０により被覆されていることが好ましい。他の部分において支持体１０と細胞培養基材２０は接着剤等により接合されていてもよい。また、複数の接合部が、機能性層２４表面の前記領域の周縁の一部を被覆するように、それぞれ離散的に配置されていてもよい。複数の接合部が離散的に配置された場合には、各接合部が機能性層２４表面の前記領域の外周を被覆する長さの合計が、前記領域の外周の長さの１／４以上となるようにするとよい。このような態様であっても、接合部３０が細胞非接着性の表面を有するので、接合部３０を開始点として細胞シートの剥離を行うことができる。
The relationship between the components is not limited to the above. FIG. 3 is a plan view showing another example of the cell culture container according to the present invention. The
さらに各構成の関係は上記に限らない。図４は、本発明に係る細胞培養容器の他の例を示す断面図である。支持体１０の内側底面の全面に配置された接合部３０に細胞培養基材２０の一部が埋没するようにして、支持体１０と細胞培養基材２０とが接合されている。つまり支持体１０と細胞培養基材２０の間に接合部３０が介設されている状態である。このような態様であっても、接合部３０が細胞非接着性の表面を有し、かつ細胞が接着可能な領域が露出した機能性層２４の表面に限られるので、より効果的に細胞シートの剥離を行うことができる。
Furthermore, the relationship between the components is not limited to the above. FIG. 4 is a cross-sectional view showing another example of the cell culture container according to the present invention. The
さらに各構成の関係は上記に限らない。図５は、本発明に係る細胞培養容器の他の例を示す断面図である。細胞培養基材２０と支持体１０は、細胞培養基材２０の周縁全周を被覆するように配置された接合部３０により接合され、細胞培養基材２０の下は空洞２６（キャビティ）となっているものである。このような態様であっても、接合部３０が細胞非接着性の表面を有し、かつ細胞が接着可能な領域が露出した機能性層２４の表面に限られるので、より効果的に細胞シートの剥離を行うことができる。
Furthermore, the relationship between the components is not limited to the above. FIG. 5 is a cross-sectional view showing another example of the cell culture container according to the present invention. The
さらに図５に示す実施形態では、接合部３０で囲われた空洞２６が、通常空気で満たされており、細胞培養容器１００の内外で熱のやりとりを低減する断熱効果を奏する。インキュベーター内（３７℃）で細胞培養を行った後、観察するために細胞培養容器を顕微鏡へ移すことがある。通常、顕微鏡は室温（２５℃）下に置かれるため、時間とともに細胞培養容器の内側の温度が変化する。図５に示す細胞培養容器１００は、細胞培養基材１０の下に空洞２６を有するために、細胞培養容器内から熱が逃げにくく、細胞に外乱を与えることなく安定して細胞の観察を行うことができる。
Further, in the embodiment shown in FIG. 5, the
＜２．第２の実施形態＞
本発明の一実施形態に係る細胞培養容器は、第１の実施形態に関して上述した支持体と、細胞培養基材と、接合部とを備える細胞培養容器において、支持体に、当該支持体を貫通する開口部が形成されており、且つ、細胞培養基材が、当該開口部を塞ぐように配置されていることを更なる特徴とする。なお、多くの構成は、上記の実施形態と略同様であるため、重複する説明を省略することがある。
<2. Second Embodiment>
A cell culture container according to an embodiment of the present invention is a cell culture container comprising the support described above with reference to the first embodiment, a cell culture substrate, and a joint, and penetrates the support through the support. An opening is formed, and the cell culture substrate is further arranged to close the opening. In addition, since many structures are substantially the same as said embodiment, the overlapping description may be abbreviate | omitted.
（細胞培養容器）
本実施形態に係る細胞培養容器について、図６〜９を参照して説明する。
図６は、本発明に係る細胞培養容器の別の例を示す断面図である。細胞培養容器２００は、開口部１２が形成された支持体１０上に開口部１２を塞ぐように細胞培養基材２０が配置され、支持体１０と細胞培養基材２０とが接合部３０により接合されている。細胞培養基材２０は、基材２２と、基材２２上に形成された機能性層２４を含む。接合部３０は、少なくとも細胞非接着性の表面を有し、機能性層２４の表面の、培養時に細胞と接触する領域の周縁（図６では細胞培養基材２０の周縁でもある）の少なくとも一部を被覆するように配置されている。機能性層２４表面と接合部３０表面で細胞の接着度合いに差があり、かつ物理的な段差が存在する。接合部３０は、細胞に対して非接着部として機能する。平面視上の機能性層２４との境界近傍に位置する接合部３０は、細胞シートの剥離の開始点として作用する。これにより、機能性層２４上で作製した細胞シートの剥離が容易となる。
(Cell culture vessel)
The cell culture container according to this embodiment will be described with reference to FIGS.
FIG. 6 is a cross-sectional view showing another example of the cell culture container according to the present invention. In the
図６に示す支持体１０は、図１〜５において示す支持体１０と同様の皿形状を有しているが、その底板の略中央を貫通するように開口部１２が形成されている点で図１〜５において示す支持体１０とは異なる。図６では、支持体１０の底板の略中央に１つの開口部１２が形成された例を示したが、これに限定されるものではない。開口部１２は、支持体１０の底板の略中央部以外に形成されていてもよい。支持体１０の底板の一部に開口部１２が複数形成されていてもよい。また、開口部１２の形状や大きさに特に制限は無いが、細胞培養基材２０が支持体１０に係止される幅が２ｍｍ以上であると、安定的に細胞培養基材が支持され、また製造安定性の面からも好ましい。
The
細胞培養基材２０は、支持体１０の開口部１２を一方向から塞ぐように配置される。開口部が複数存在する場合には、開口部ごとに別個の細胞培養基材で塞いでもよいし、一の細胞培養基材で複数の開口部を一括して塞いでもよい。細胞培養基材２０の厚さは、開口部１２上で支持性を確保できる厚さであることが好ましく、例えば、２００μｍ以上とするとよい。本実施形態に係る細胞培養容器は、支持体１０と細胞培養基材２０を含めた形態で細胞と培養液を保持できる構造となっている。
The
接合部３０を形成するための硬化性塗工液は溶剤などを含むため、塗工液を硬化させた後にも溶剤のガスが放出される虞がある。また、硬化段階で気泡が生じる虞がある。硬化させた後の接合部３０に残存するガスが放出されたり、気泡として接合部３０に残ると、細胞培養又は細胞観察時に支障となりうる虞がある。そのためガスを除去しておくことが好ましい。本実施形態では、開口部１２は気体放出部として機能し、開口部１２を通じてガスや気泡が系外に逃げやすい。これにより、安定した細胞培養又は細胞観察を行うことができる。また、接合部３０が細胞非接着性の表面を有するので、接合部３０を開始点として細胞シートの剥離を行うことができる。
Since the curable coating liquid for forming the
以下、本実施形態に係る細胞培養容器の変形例について、図７〜９を参照して説明する。図７は、本発明に係る細胞培養容器の他の例を示す断面図である。細胞培養容器３００は、開口部１２が形成された支持体１０に開口部１２を塞ぐように細胞培養基材２０が取り付けられ、支持体１０と細胞培養基材２０とが接合部３０により接合されている。上記と異なるのは、細胞培養基材２０の機能性層２４を上方に向けて天面とし、支持体１０の下方から開口部１２を塞ぐように取り付けられている点である。
Hereinafter, modified examples of the cell culture container according to the present embodiment will be described with reference to FIGS. FIG. 7 is a cross-sectional view showing another example of the cell culture container according to the present invention. In the
図７に示す実施形態では、機能性層２４の表面の、開口部１２により包囲された領域（培養時に細胞が接触する領域である）の周縁の全周が接合部３０により被覆されているが、前記領域の周縁の少なくとも一部が接合部３０により被覆されていればよい。接合部３０は培養される細胞の剥離の開始点として機能する。
In the embodiment shown in FIG. 7, the entire periphery of the periphery of the region surrounded by the opening 12 (the region in contact with cells during culture) on the surface of the
図８は、本発明に係る細胞培養容器の他の例を示す平面図及び断面図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は（Ａ）のI-Iにおける断面図である。細胞培養容器４００は、一般に６ウェルプレートと呼ばれるタイプの細胞培養容器である。図８（Ａ）に示すように支持体１０には厚さ方向に貫通した複数の開口部１２が形成されており、図８（Ｂ）に示すように複数の開口部１２を一括して塞ぐように細胞培養基材２０が取り付けられ、支持体１０と細胞培養基材２０とが接合部３０により接合されている。各開口部１２の底は細胞培養容器２０で塞がれて、細胞及び細胞培養液を保持できるウェルとして機能する。細胞培養基材２０は、機能性層２４を上方に向けて天面とし、支持体１０の下方から開口部１２を塞ぐように取り付けられている。なお、ウェルの数は図示のものに限定されるものではない。図８に示す実施形態では、機能性層２４の表面の、開口部１２により包囲された複数の領域（培養時に細胞が接触する領域である）の各々の周縁の全周が接合部３０により被覆されているが、前記各領域の周縁の少なくとも一部が接合部３０により被覆されていればよい。接合部３０は培養される細胞の剥離の開始点として機能する。
8A and 8B are a plan view and a cross-sectional view showing another example of the cell culture container according to the present invention, in which FIG. 8A is a plan view and FIG. 8B is a cross-sectional view taken along line II of FIG. The
図９は、本発明に係る細胞培養容器の他の例を示す断面図である。細胞培養容器５００は、一般にフラスコと呼ばれるタイプの細胞培養容器である。細胞培養容器５００には、ボトル状の支持体の少なくとも一面（図９では胴部の壁面）を貫通するように開口部１２が形成されており、この開口部１２を塞ぐように細胞培養基材２０が取り付けられ、支持体１０と細胞培養基材２０とが接合部３０により接合されてなる。支持体１０には、液体用の通孔１４が設けられている。図示しないが、通孔１４には通常キャップが取り付けられる。これにより、細胞培養容器５００の内側は密閉された状態となり、安定して細胞培養を行うことができる。通孔１４より細胞及び培養液を供給したり、回収したりすることができる。また、細胞培養基材２０を支持体１０より剥離して細胞及び培養液を回収してもよい。図９に示す実施形態では、機能性層２４の表面の、開口部１２により包囲された領域（培養時に細胞が接触する領域である）の周縁の全周が接合部３０により被覆されているが、前記領域の周縁の少なくとも一部が接合部３０により被覆されていればよい。接合部３０は培養される細胞の剥離の開始点として機能する。
FIG. 9 is a cross-sectional view showing another example of the cell culture container according to the present invention. The
フラスコタイプの細胞培養容器は、図１７Ｄに示すように、通孔１４以外が閉塞したフラスコ型支持体１７０３の内側に細胞培養基材２０が接合された細胞培養容器１７００の形態であってもよい。細胞培養容器１７００は、フラスコ型支持体１７０３の一部が開放された構造の第一部品１７０１に細胞培養基材２０を組み合わせ（図１７Ａ）、両者を接合するとともに細胞培養基材２０の周縁を被覆する接合部３０を設け（図１７Ｂ）、次に第一部品１７０１と一体化されてフラスコ型支持体１７０３を形成することが可能な第二部品１７０２を第一部品１７０１の開放部分を塞ぐように組み合わせ（図１７Ｃ）、第一部品１７０１と第二部品１７０２とを溶着させるなどして一体化してフラスコ型支持体１７０３を形成する（図１７Ｄ）ことにより製造することができる。
As shown in FIG. 17D, the flask-type cell culture container may be in the form of a
＜３．第３の実施形態＞
本発明の一実施形態に係る細胞培養容器はボトル型の細胞培養容器であって、
基材と、該基材の表面上に形成された、所定の条件において細胞非接着性へと変化することが可能な細胞接着性の表面を有する機能性層とを備える細胞培養基材を、該機能性層を備えた面を内側とし、該細胞培養基材の一方の側端部と他方の側端部とを接合して形成される筒状の胴部材であって、前記細胞培養基材の一方の側端部と他方の側端部とが、細胞非接着性の表面を有し、且つ、該二つの側端部に位置する機能性層の少なくとも一部を被覆するように配置された接合部により接合されている胴部材と、
前記筒状の胴部材の一端に接合された、該一端を閉塞する底部材と、
前記筒状の胴部材の他端に接合された、通孔が形成された首部材と
を備えることを特徴とする。なお、多くの構成は、上記の実施形態と略同様であるため、重複する説明を省略することがある。
<3. Third Embodiment>
The cell culture container according to one embodiment of the present invention is a bottle-type cell culture container,
A cell culture substrate comprising a substrate and a functional layer formed on the surface of the substrate and having a cell-adhesive surface capable of changing to a non-cell-adhesive property under a predetermined condition; A cylindrical body member formed by joining one side end and the other side end of the cell culture substrate with the surface provided with the functional layer inside, the cell culture substrate One side end and the other side end of the material have a cell non-adhesive surface and are arranged so as to cover at least a part of the functional layer located at the two side ends. A body member joined by the joined portion;
A bottom member that is joined to one end of the cylindrical body member and closes the one end;
And a neck member having a through-hole formed on the other end of the cylindrical body member. In addition, since many structures are substantially the same as said embodiment, the overlapping description may be abbreviate | omitted.
（細胞培養容器）
本実施形態に係る細胞培養容器について、図１０を参照して説明する。図１０は、本発明に係る細胞培養容器の別の例を示す斜視図及び断面図であり、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）は（Ａ）のII−IIにおける断面図である。細胞培養容器６００は、図１０（Ａ）に示すように、孔が無く閉塞した底部材６２０、この底部材６２０に対向する、突出した液体用の通孔６１２を有する首部材６１０、及び首部材６１０と底部材６２０を接続する円筒状の胴部材６３０を備えている。胴部材６３０は、細胞培養基材２０を、機能性層２４を備えた面が内側になるように巻いて、細胞培養基材２０の一方の側端部と他方の側端部とを接合部３０により接合して形成される。細胞培養容器６００は、一般にローラーボトルと呼ばれるタイプの細胞培養容器である。図示していないが、首部材６１０の液体用の通孔６１２にボトルキャップが取り付けられる。これにより、首部材６１０、底部材６２０、胴部材６３０、及びボトルキャップにより、細胞培養容器６００の内側は密閉された状態となり、安定して細胞培養を行うことができる。図１０では、胴部材６３０が、横断面が円形である円筒形状である例を示すが、これには限定されず、胴部材は筒状である限り、三角形、四角形、五角形、六角形等の多角形であるなど種々の横断面を有する筒形状であることができる。
(Cell culture vessel)
The cell culture container according to this embodiment will be described with reference to FIG. 10A and 10B are a perspective view and a sectional view showing another example of the cell culture container according to the present invention, wherein FIG. 10A is a perspective view, and FIG. 10B is a sectional view taken along line II-II in FIG. As shown in FIG. 10A, the
図１０（Ｂ）に示すように、細胞培養基材２０は、基材２０の片側全面に機能性層２４が形成されている。先に述べたように胴部材６３０は、機能性層２４が容器の内側となるように細胞培養基材２０を筒状に巻いて形成されている。細胞培養基材２０としては可撓性をもつ材料及び厚さの基材を用いるとよい。細胞培養基材２０を巻いて、その一方の側端部と他方の側端部とが相互に接合可能な位置に配置されるように筒状の形状とし、これらの二つの側端部を接合部３０により接合する。接合部３０は、細胞培養基材２０の前記二つの側端部に位置する機能性層２４の少なくとも一部を被覆するように配置されている。図１０では前記二つの側端部のそれぞれに位置する機能性層２４の全体（胴部材６３０の高さ方向に沿った全体）が接合部３０により被覆されている実施形態を示すがこの実施形態には限定されない。細胞培養基材２０の側端部に位置する機能性層２４表面と、接合部３０表面とは細胞の接着度合いに差があり、かつ物理的な段差が存在する。接合部３０は、細胞シートの剥離の開始点として作用する。これにより細胞培養基材２０から細胞シートを安定的に剥離できる。
As shown in FIG. 10B, the
なお、機能性層２４は、基材２２の片側全面に形成されていることに限定されるものではない。細胞培養基材２０の前記二つの側端部のいずれか一方又は両方に機能性層２４が存在する領域が存在し、それ以外の領域は基材２２が露出したものであってもよい。この場合であっても、機能性層２４の表面の、培養時に細胞と接触する領域の周縁の少なくとも一部を被覆するように接合部３０が配置されており、所期の効果を奏することとなる。
Note that the
＜４．第４の実施形態＞
（細胞培養容器の製造方法）
次に本発明に係る細胞培養容器の製造方法の一例について説明する。本発明の一実施形態に係る細胞培養容器の製造方法は、
支持体と、細胞培養基材と、細胞非接着性を有する材料を硬化により生成可能な成分を含む硬化性塗工液との組み合せであって、前記硬化性塗工液が、前記細胞培養基材の前記機能性層の表面の、培養時に細胞と接触する領域の周縁の少なくとも一部を被覆する位置と、前記支持体と前記細胞培養基材とを接合することが可能な位置とに少なくとも適用されている前記組み合わせ、を準備する工程と、
前記組み合わせにおいて前記硬化性塗工液を硬化させることにより前記接合部を形成する工程と、を含むことを特徴とする。
<4. Fourth Embodiment>
(Method for producing cell culture container)
Next, an example of the manufacturing method of the cell culture container according to the present invention will be described. A method for producing a cell culture container according to an embodiment of the present invention includes:
A combination of a support, a cell culture substrate, and a curable coating solution containing a component capable of generating a non-cell-adhesive material by curing, wherein the curable coating solution comprises the cell culture substrate. At least a position on the surface of the functional layer of the material that covers at least a part of the periphery of the region that contacts the cells during culture, and a position where the support and the cell culture substrate can be joined. Preparing the applied combination; and
Forming the joint by curing the curable coating liquid in the combination.
上記のような細胞培養容器の製造方法について、図１１及び図１２を参照して説明する。図１１は、本発明に係る細胞培養容器の製造方法の一例を示す工程断面図である。 The manufacturing method of the above cell culture container is demonstrated with reference to FIG.11 and FIG.12. FIG. 11 is a process cross-sectional view illustrating an example of a method for producing a cell culture container according to the present invention.
（１）細胞培養基材の準備する工程（図１１（Ａ）参照）
はじめに基材２２を準備する。基材２２は、枚葉状態であってもよいし、ロール状態のものであってもよい。この基材２２上に機能性層２４を形成する方法は特に限定されず、機能性層２４の種類に応じた適切な方法を選択すればよい。
(1) Step of preparing a cell culture substrate (see FIG. 11A)
First, the
機能性層２４が刺激応答性ポリマーの層である場合の、機能性層２４の製造方法の具体的な例を説明する。
A specific example of a method for producing the
基材２２の表面上に、放射線により重合して刺激応答性ポリマーとなるモノマー又はオリゴマーもしくはプレポリマーなどが有機溶剤に溶解した溶液を展開する。溶液は公知の組成にしたがって用意することができる。溶液の展開は、公知の方法により行うことができ、スピンコート、バーコートなどの塗布法、噴霧塗布法等を用いるとよい。また、大面積の基材に対して行う溶液の展開は、ブレードコーティング、グラビアコーティング、オフセットグラビアコーティング等を用いるとよい。
On the surface of the
次いで塗布された前記溶液に所定量の放射線を照射して、刺激応答性ポリマーを形成する重合反応及び刺激応答性ポリマーを基材表面に結合させる結合反応を進行させる。結合反応は、放射線照射による重合によってモノマー又はオリゴマーもしくはプレポリマーからin situで形成された遊離のポリマーが基材表面に結合する現象だけでなく、遊離のモノマーが基材表面に結合した後に当該モノマーを基点としてポリマー鎖が伸張する現象や、塗布用組成物に由来する遊離のプレポリマー又はオリゴマーが基材表面に結合する現象や、基材表面に結合したポリマー又はオリゴマーを基点としてポリマー鎖が伸張する現象などを包含する。 Next, the coating solution is irradiated with a predetermined amount of radiation to cause a polymerization reaction for forming a stimulus-responsive polymer and a binding reaction for binding the stimulus-responsive polymer to the substrate surface. The bonding reaction is not only a phenomenon in which a free polymer formed in situ from a monomer or oligomer or prepolymer by polymerization by irradiation is bonded to the substrate surface, but also after the free monomer is bonded to the substrate surface. The polymer chain stretches starting from the base, the free prepolymer or oligomer derived from the coating composition binds to the substrate surface, or the polymer chain stretches from the polymer or oligomer bound to the substrate surface This includes the phenomenon that
機能性層２４は、刺激応答性ポリマーと、他のポリマーとのグラフト又はブロック共重合体を含む層や、刺激応答性ポリマーと他のポリマーとの混合物を含む層であってもよい。また、刺激応答性ポリマーの意図する機能性が損なわれない範囲で架橋することも可能である。
The
刺激応答性ポリマーとして、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー、光応答性ポリマー等のなかから、作製しようとする細胞シートに適したものを適宜選択し、機能性層２４を形成することができる。 As the stimulus responsive polymer, a suitable one for the cell sheet to be produced is appropriately selected from a temperature responsive polymer, a pH responsive polymer, an ion responsive polymer, a photoresponsive polymer, etc. Can be formed.
放射線としては、α線、β線、γ線、電子線、紫外線等が挙げられる。所望のポリマーを作製するためには電子線を選択することがエネルギー効率の面、かつ生産性の面からも好ましい。紫外線に関しては適当な重合開始剤やシランカップリング剤などのアンカー剤を組合せることで使用できる。 Examples of radiation include α rays, β rays, γ rays, electron rays, ultraviolet rays, and the like. In order to produce a desired polymer, it is preferable to select an electron beam from the viewpoint of energy efficiency and productivity. With respect to ultraviolet rays, it can be used by combining an appropriate polymerization initiator or an anchor agent such as a silane coupling agent.
未反応のモノマー又はオリゴマーもしくはプレポリマーを洗浄により除去し、乾燥を行うことで基材２２上に機能性層２４が固定化された細胞培養基材２０を得る。
細胞培養基材２０を更に必要に応じて細胞培養に適した形状に加工してもよい。
Unreacted monomer or oligomer or prepolymer is removed by washing, and drying is performed to obtain the
The
（２）細胞培養基材を支持体に配置する工程（図１１（Ｂ）参照）
次に支持体１０を準備する。支持体は、市販品を購入して準備してもよいし、射出成型法等により所望のものを作製して準備してもよい。支持体１０上に細胞培養基材２０を位置決めして配置する。細胞培養基材２０の支持体１０と対向する側には、接着剤等が形成されていてもよいし、易接着処理が施されていてもよい。
(2) Step of placing the cell culture substrate on the support (see FIG. 11B)
Next, the
（３）細胞培養基材と支持体とを接合する工程（図１１（Ｃ）参照）
支持体１０の内側の、細胞培養基材２０の周縁の一部を被覆するともに、支持体１０と細胞培養基材２０とを接合可能な位置に接合部用の硬化性塗工液を適用して、前記支持体と前記細胞培養基材と前記硬化性塗工液との組み合せを準備する。細胞培養基材２０の周縁や外周端面には表面に機能性の膜を形成したり、表面処理することが困難なために意図せず細胞が付着し、その細胞の剥離を制御することが困難な場合がある。しかし、本発明では、接合部３０により細胞培養基材２０の周縁の一部又は全部を被覆することで、細胞培養基材２０の周縁や外周端面への細胞の付着を防止することができる。塗工液は、平面視で細胞培養基材２０の全周にわたって連続的に塗布してもよいし、定められた一部もしくは複数の部分に離散的に塗布してもよい。塗工液は、例えば、インクジェット法、ディスペンス法により、所定の幅や高さとなるに液量制御して行うとよい。
(3) The step of joining the cell culture substrate and the support (see FIG. 11C)
A part of the periphery of the
最後に、前記組み合せにおいて適用された塗工液を硬化させて接合部３０を形成する。塗工液が熱硬化型樹脂を含む接着剤である場合には、加熱を行って硬化させる。塗工液が２液混合型の常温硬化性樹脂を含む接着剤である場合には室温で静置して硬化させる。また、塗工液が光硬化性樹脂を含む接着剤である場合には、光照射を行って硬化させる。硬化後、必要に応じて加熱又は減圧環境下で接合部３０の脱泡処理を行うとよい。 Finally, the joint 30 is formed by curing the coating liquid applied in the combination. When the coating liquid is an adhesive containing a thermosetting resin, it is cured by heating. When the coating liquid is an adhesive containing a two-component mixed type room temperature curable resin, it is allowed to stand at room temperature for curing. When the coating liquid is an adhesive containing a photocurable resin, it is cured by light irradiation. After curing, the defoaming treatment of the joint 30 may be performed as necessary under a heating or reduced pressure environment.
さらに必要に応じてエタノールなどのアルコールを用いた滅菌処理、エチレンオキサイドガス（ＥＯＧ）を用いた滅菌処理、電子線を用いた滅菌処理を施す。 Further, sterilization using an alcohol such as ethanol, sterilization using ethylene oxide gas (EOG), and sterilization using an electron beam are performed as necessary.
図１２は、本発明に係る細胞培養容器の製造方法の他の例を示す工程断面図である。本発明の一実施形態に係る細胞培養容器の製造方法は、支持体上に接合部となる塗工液を供給し、この塗工液上に細胞培養基材を配置し、その後塗工液を硬化させることで細胞培養基材と支持体とを接合するものである。前記支持体と前記細胞培養基材と硬化性塗工液との組み合せを準備する工程が、図１１に示す実施形態では、先に支持体と細胞培養基材とを組み合わせ、次に硬化性塗工液を適用する工程であるが、図１２に示す実施形態では、先に支持体に硬化性塗工液を適用し、次に細胞培養基材を組み合わせる工程である。すなわち、前記組み合せを準備する手順は特に限定されない。なお、多くの工程は、上記の実施形態と略同様であるため、重複する説明を省略することがある。 FIG. 12 is a process cross-sectional view illustrating another example of the method for producing a cell culture container according to the present invention. In the method for producing a cell culture container according to an embodiment of the present invention, a coating liquid serving as a joint is supplied onto a support, a cell culture substrate is disposed on the coating liquid, and then the coating liquid is used. By curing, the cell culture substrate and the support are joined. In the embodiment shown in FIG. 11, the step of preparing a combination of the support, the cell culture substrate, and the curable coating solution is a combination of the support and the cell culture substrate first, and then the curable coating. In the embodiment shown in FIG. 12, the curable coating solution is first applied to the support, and then the cell culture substrate is combined. That is, the procedure for preparing the combination is not particularly limited. In addition, since many processes are substantially the same as said embodiment, the overlapping description may be abbreviate | omitted.
この実施形態では、支持体１０の内側に接合部用の塗工液３０ａを供給する。塗工液３０ａを支持体１０の内側底面の全体に供給してもよいし、図１２（Ａ）に示すように細胞培養基材の周縁に位置する領域に部分的に供給してもよい。
In this embodiment, the
次に、少なくとも細胞培養基材２０の周縁の一部が被覆されるように、塗工液３０ａに細胞培養基材２０の一部を埋没させる。細胞培養基材２０の配置を容易にするために、塗工液３０ａを予め乾燥させて半硬化状態としておいてもよい。次に図１２（Ｂ）に示すように塗工液３０ａを硬化させて接合部３０を形成し、細胞培養基材２０と支持体１０とを接合する。硬化後、必要に応じて加熱又は減圧環境下で接合部３０の脱泡処理を行うとよい。
Next, a part of the
なお、上記の細胞培養容器の製造方法において、支持体として底板に少なくとも１つの開口部が形成されたものを用いてもよい。開口部が形成された支持体は、市販品をレーザー等で加工して開口部に対応する部位を除去して準備してもよいし、射出成型法等により所望のものを作製して準備してもよい。図１３は、本発明に係る細胞培養容器の製造方法の別の例を示す工程断面図である。 In the above method for producing a cell culture container, a support having at least one opening formed in the bottom plate may be used. The support formed with the opening may be prepared by processing a commercially available product with a laser or the like to remove the part corresponding to the opening, or preparing and preparing a desired one by an injection molding method or the like. May be. FIG. 13 is a process cross-sectional view illustrating another example of the method for producing a cell culture container according to the present invention.
図１３（Ａ）に示すように、支持体１０の内側であって、支持体１０の側壁に沿って接合部用の塗工液３０ａを供給する。
As shown in FIG. 13A, the
図１３（Ｂ）に示すように、開口部１２を塞ぐように細胞培養基材２０を支持体１０上に配置する。塗工液が細胞培養基材２０の周縁に載り上げるように調整し、なお且つ、塗工液が開口部１２の周縁の、支持体１０と細胞培養基材２０とを接合することが可能な位置に適用される。適用された塗工液を硬化させて接合部３０を形成する。これにより細胞培養基材２０と支持体１０とを接合部３０により接合する。硬化後、接合部３０を加熱又は減圧環境下で接合部３０の脱泡処理を行う。支持体１０に開口部１２が存在するので、気泡が開口部１２を通じて系外に逃げやすいものとなっている。これにより、安定した細胞培養又は細胞観察が可能な細胞培養容器を製造できる。
As shown in FIG. 13B, the
上述では細胞培養基材２０を支持体１０の開口部１２の上方から当てて、開口部１２を塞いだ例を説明した。これに限定されるものではない。例えば、開口部１２を有する支持体１０の下面（外側）の開口部１２の周縁部分に接合部となる塗工液を供給しておき、機能性層２４が天面となるように上方に向けて細胞培養基材２０と支持体１０とを合わせ、塗工液を硬化することで両者を接合してもよい。上記工程と略同様にして図７〜図９に示した細胞培養容器３００〜５００を作製することができる。
In the above description, an example in which the
支持体が開口部を有する実施形態では、開口部が気体放出部として機能するため、硬化性塗工液の適用及び硬化に伴い発生し得るガスや気泡が開口部を通じて系外に逃げやすい。このために均質な品質を有する細胞培養容器の製造が容易となる。 In the embodiment in which the support has an opening, the opening functions as a gas discharge part, so that gas and bubbles that can be generated along with application and curing of the curable coating liquid easily escape from the system through the opening. This facilitates the production of a cell culture container having a uniform quality.
＜５．第５の実施形態＞
（細胞培養容器の製造方法）
次に本発明に係る細胞培養容器の製造方法の他の例について説明する。本発明の一実施形態に係る細胞培養容器の製造方法は、基材と、該基材の表面上に形成された、所定の条件において細胞非接着性へと変化することが可能な細胞接着性の表面を有する機能性層とを備える細胞培養基材を、該機能性層を備えた面を内側とし、該細胞培養基材の一方の側端部と他方の側端部とを、接合部により接合して形成される筒状の胴部材と、
前記筒状の胴部材の一端に接合された、該一端を閉塞する底部材と、
前記筒状の胴部材の他端に接合された、通孔が形成された首部材と、を備えたボトル型の細胞培養容器の製造方法であり
前記機能性層を備えた面を内側とし、前記細胞培養基材の一方の側端部と他方の側端部とが相互に接合可能な位置に配置されるように筒状に加工した前記細胞培養基材と、細胞非接着性を有する材料を硬化により生成可能な成分を含む硬化性塗工液との組み合わせであって、前記硬化性塗工液が、前記細胞培養基材における前記二つの側端部に位置する機能性層の少なくとも一部を被覆する位置と、前記二つの側端部を接合することが可能な位置とに少なくとも適用されている前記組み合わせを準備する工程と、
前記組み合わせにおいて前記硬化性塗工液を硬化させることにより前記接合部を形成して、前記筒状の胴部材を形成する工程と、
前記筒状の胴部材の一端に前記底部材を取り付け、他端に前記首部材を取り付ける工程と、
を含むことを特徴とする。
<5. Fifth Embodiment>
(Method for producing cell culture container)
Next, another example of the method for producing a cell culture container according to the present invention will be described. A method for producing a cell culture container according to an embodiment of the present invention includes a base material and cell adhesiveness formed on the surface of the base material and capable of changing to cell non-adhesiveness under predetermined conditions. A cell culture substrate having a functional layer having the surface of the cell culture substrate, the surface provided with the functional layer being the inside, and one side end of the cell culture substrate and the other side end of the cell culture substrate A cylindrical body member formed by joining with,
A bottom member that is joined to one end of the cylindrical body member and closes the one end;
A neck-shaped member that is joined to the other end of the cylindrical body member and has a through-hole formed therein. The cell culture substrate processed into a cylindrical shape so that one side end and the other side end of the cell culture substrate can be joined to each other, and a material having cell non-adhesiveness In combination with a curable coating solution containing a component that can be generated by curing, wherein the curable coating solution is at least one of the functional layers located at the two side edges of the cell culture substrate. Preparing the combination applied at least to a position covering the portion and a position capable of joining the two side end portions;
Forming the joint by curing the curable coating liquid in the combination, and forming the cylindrical body member;
Attaching the bottom member to one end of the cylindrical body member and attaching the neck member to the other end;
It is characterized by including.
なお、多くの構成や工程は、上記の実施形態と略同様である場合があり、その際には重複する説明を省略することがある。 In addition, many structures and processes may be substantially the same as said embodiment, and the overlapping description may be abbreviate | omitted in that case.
上記のような細胞培養容器の製造方法について、図１４を参照して説明する。図１４は、本発明に係る細胞培養容器の製造方法の他の例を示す工程断面図である。 A method for producing the cell culture container as described above will be described with reference to FIG. FIG. 14 is a process cross-sectional view illustrating another example of the method for producing a cell culture container according to the present invention.
（１）細胞培養基材を筒状に加工する工程（図１４（Ａ）参照）
基材２２の片側の全面に機能性層２４が形成された細胞培養基材２０を準備する。図１４（Ａ）に示すように、機能性層２４を内側にして、細胞培養基材２０の一方の側端部と他方の側端部とが相互に接合可能な位置に配置されるように細胞培養基材２０を円筒状に加工する。
(1) Process of processing a cell culture substrate into a cylindrical shape (see FIG. 14A)
A
（２）細胞培養基材の両端を接合する工程（図１４（Ｂ）参照）
細胞培養基材２０における、二つの側端部に位置する機能性層２４の少なくとも一部を被覆し、且つ、前記二つの側端部を接合可能な部位に、細胞非接着性を有する材料を硬化により生成可能な成分を含む硬化性塗工液を適用する。図１４では筒状の細胞培養基材２０を形成した後に硬化性塗工液を適用する例を示すが、これには限定されず、細胞培養基材２０に硬化性塗工液を適用した後に細胞培養基材２０を筒状に加工してもよいし、細胞培養基材２０の筒状への加工と硬化性塗工液の適用とを同時に実施してもよい。塗工液の適用はディスペンサーなどで実施することができる。適用された塗工液を硬化させることにより接合部３０を形成する。接合部３０は細胞培養基材２０の両側端部を相互に接合し、円筒状の胴部材６３０が形成される。
(2) A step of joining both ends of the cell culture substrate (see FIG. 14B)
A material having cell non-adhesiveness is coated on a portion of the
その後、首部材６１０、底部材６２０を準備し、それぞれを筒状の胴部材６３０の端部に接合する。部材同士の接合は、超音波熱融着、接着剤を利用した接着などの公知の方法や上記塗工液を利用した接着といった方法により行うことができる。これにより、首部材６１０、底部材６２０、胴部材６３０が一体となったローラーボトル型の細胞培養容器６００を作製することができる。
Thereafter, the
＜６．第６の実施形態＞
（細胞シートの製造方法）
次に本発明に係る細胞シートの製造方法について説明する。本発明の一実施形態に係る細胞シートの製造方法は、上記細胞培養容器の前記機能性層上で細胞培養する工程と、前記機能性層に、所定の条件を印加して、前記機能性層の表面を細胞非接着性へと変化させる工程と、培養された細胞の剥離を前記接合部が存在する部位から開始して、前記機能性層から細胞を剥離する工程と、を含むことを特徴とするものである。
<6. Sixth Embodiment>
(Method for producing cell sheet)
Next, the manufacturing method of the cell sheet which concerns on this invention is demonstrated. The method for producing a cell sheet according to an embodiment of the present invention includes a step of culturing cells on the functional layer of the cell culture container, applying a predetermined condition to the functional layer, and the functional layer. And changing the surface of the cell to non-cell-adhesive, and detaching the cultured cells from the functional layer, starting from the site where the junction exists. It is what.
上記のような細胞シートの製造方法について、図１５を参照して説明する。図１５は、本発明に係る細胞シートの製造方法の一例を示す工程断面図である。 The manufacturing method of the above cell sheets is demonstrated with reference to FIG. FIG. 15 is a process cross-sectional view illustrating an example of a method for producing a cell sheet according to the present invention.
（１）細胞を播種する工程（図１５（Ａ）参照）
本発明に用いる細胞に特に制限は無いが、接着細胞であることが好ましい。例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン、グリア細胞、線維芽細胞、血管を構成する血管細胞、生体の代謝に関係する肝実質細胞、非肝実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々組織に存在する幹細胞、さらには骨髄細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等である。これらのうち少なくとも１種の細胞を用いるとよい。細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたもの又は培養下で分化させたものでもよい。
(1) Step of seeding cells (see FIG. 15A)
Although there is no restriction | limiting in particular in the cell used for this invention, It is preferable that it is an adherent cell. For example, epithelial cells and endothelial cells that make up tissues and organs in the body, skeletal muscle cells that exhibit contractility, smooth muscle cells, cardiomyocytes, neurons that make up the nervous system, glial cells, fibroblasts, and blood vessels Vascular cells, liver parenchymal cells related to metabolism in the living body, non-hepatic parenchymal cells and adipocytes, stem cells existing in various tissues as cells having differentiation ability, bone marrow cells, ES cells, iPS cells and the like. Of these, at least one type of cell may be used. The cells may be primary cells collected directly from tissues or organs, or may be those that have been passaged several times or differentiated in culture.
上記のような細胞５０を、培養液（図示せず）を供給した細胞培養容器１００内に播種する。培養液としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術第三版」５８１頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（ウシ胎児血清等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。また、Ｇｉｂｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）等の市販の無血清培地等を用いることができる。
The
（２）細胞を培養する工程（図１５（Ｂ）参照）
その後、細胞を培養する。培養時間は、通常６時間〜９６時間、好ましくは１２時間〜７２時間である。培養する温度は、通常３７℃である。ＣＯ２細胞培養装置などを利用して、５％程度のＣＯ２濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。培養した後、必要に応じて細胞培養基材を洗浄して接着していない浮遊細胞を洗い流してもよい。このようにして機能性層２４上でシート状の細胞（細胞シート５２）となるまで培養される。
(2) Cell culturing step (see FIG. 15B)
Thereafter, the cells are cultured. The culture time is usually 6 hours to 96 hours, preferably 12 hours to 72 hours. The temperature for culturing is usually 37 ° C. It is preferable to culture in a CO 2 concentration atmosphere of about 5% using a CO 2 cell culture device or the like. After culturing, the cell culture substrate may be washed as necessary to wash away floating cells that have not adhered. Thus, it culture | cultivates until it becomes a sheet-like cell (cell sheet 52) on the
（３）細胞シートを剥離する工程（図１５（Ｃ）参照）
培養後に、機能性層２４の種類に応じて所定の条件を印加して機能性層２４の表面を細胞非接着性に変化させる。例えば、機能性層２４が温度応答性ポリマーを含む場合、細胞培養容器を臨界溶解温度未満の環境下に移動する。所定の時間が経過した後、細胞培養基材２０から細胞シート５２を剥離する。接合部３０は細胞が接着しない非接着部であるため、当該箇所が剥離開始点となり、細胞培養基材２０の表面からの細胞シート５２の剥離が促される。機能性層２４が、ｐＨ応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー、光応答性ポリマー等の他の機能性分子を備える場合には、所定の刺激を印加して細胞培養基材２０から細胞シート５２を剥離することができる。
(3) Step of peeling the cell sheet (see FIG. 15C)
After the culture, a predetermined condition is applied according to the type of the
好ましくは、ピペッティング又は細胞培養容器を揺動して培養液に動きを与えることで剥離開始点に物理的な力を加える。当該培養液の動きによる水流が剥離開始位置の細胞シートの裏面を押圧し、細胞シートの剥離をより確実に行うことができる。 Preferably, a physical force is applied to the peeling start point by pipetting or shaking the cell culture vessel to give a motion to the culture solution. The water flow due to the movement of the culture solution presses the back surface of the cell sheet at the separation start position, and the cell sheet can be more reliably detached.
細胞シートの剥離の際、剥離を開始する位置に切れ込みを入れる必要がないので、細胞培養領域に存在した部分が均一な品質を有する。特に、再生医療などへの応用に適したものとなる。 When exfoliating the cell sheet, it is not necessary to make a cut at the position where the exfoliation is started. Therefore, the portion existing in the cell culture region has a uniform quality. In particular, it is suitable for application to regenerative medicine.
（実施例１）
Ａ．細胞培養基材の作製
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを、最終濃度４０重量％になるようにイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に溶解させてＮ−イソプロピルアクリルアミド溶液を調製した。ポリスチレンフィルムシート（ＳＵＮＤＩＣ社製ＯＰＳシート）を準備した。このポリスチレンフィルムシートに前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド溶液を展開し、ミヤバーＮＯ．４でコーティングした。電子線照射装置（岩崎電気社製）を用いて電子線照射を行い、ポリスチレンフィルムシート表面にポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドをグラフト重合により形成した。このときの電子線照射線量は３００ｋＧｙであった。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが結合されたポリスチレンフィルムシートを３４．８ｍｍφの円形に切り出し、５℃のイオン交換水を用いて洗浄し、その後乾燥して細胞培養基材を得た。
Example 1
A. Preparation of cell culture substrate N-isopropylacrylamide was dissolved in isopropyl alcohol (IPA) to a final concentration of 40% by weight to prepare an N-isopropylacrylamide solution. A polystyrene film sheet (OPS sheet manufactured by SUNDIC) was prepared. The N-isopropylacrylamide solution was developed on this polystyrene film sheet, and Miyabar NO. 4 coated. Electron beam irradiation was performed using an electron beam irradiation apparatus (manufactured by Iwasaki Electric Co., Ltd.), and poly-N-isopropylacrylamide was formed on the polystyrene film sheet surface by graft polymerization. The electron beam irradiation dose at this time was 300 kGy. A polystyrene film sheet bonded with poly-N-isopropylacrylamide was cut into a 34.8 mmφ circle, washed with ion exchange water at 5 ° C., and then dried to obtain a cell culture substrate.
Ｂ．支持体への取付け
図１２に模式的に示す手順で細胞培養容器を製造した。
支持体として３５ｍｍφポリスチレンディッシュ（ベクトンディッキンソン社製）を準備した。このポリスチレンディッシュは、円形の底板と、該底板の周縁から上方に立設された側壁とを備える。当該底板の、ポリスチレンディッシュの内側に面する部分（内側底面）の直径が３５ｍｍである。また、重合開始剤を含むポリジメチルシロキサン（東レ・ダウコーニング社製）よりなる塗工液を準備した。ポリスチレンディッシュの内側底面上の、側壁に沿った位置に円を描くように塗工液の幅が約３ｍｍ〜４ｍｍとなるよう制御して塗工液をディスペンサーで１周塗布した。上記細胞培養基材とポリスチレンディッシュを位置合わせし、周縁全周が塗工液に埋没するように支持体の内側底面に貼り付けた。その後、温度４０℃で加熱して塗工液を硬化させて、細胞培養基材と支持体とを接合した。なお、接合部の最上部の位置と、機能性層であるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド層の表面との高さの差が１０μｍであり、接合部の、機能性層に面する側の側壁形状は、外側に向かって凸であった。これを７０％エタノールにて１時間滅菌し、細胞培養容器とした。この細胞培養容器では、前記細胞培養基材の周縁に位置する機能性層及び外周端面が全周にわたり接合部により被覆されている。
B. Attachment to Support A cell culture vessel was produced by the procedure schematically shown in FIG.
A 35 mmφ polystyrene dish (manufactured by Becton Dickinson) was prepared as a support. This polystyrene dish includes a circular bottom plate and a side wall that stands upward from the periphery of the bottom plate. The diameter of the portion of the bottom plate facing the inside of the polystyrene dish (inner bottom surface) is 35 mm. Moreover, the coating liquid which consists of polydimethylsiloxane (Toray Dow Corning company make) containing a polymerization initiator was prepared. The coating liquid was applied once with a dispenser while controlling the width of the coating liquid to be about 3 mm to 4 mm so as to draw a circle at a position along the side wall on the inner bottom surface of the polystyrene dish. The cell culture substrate and the polystyrene dish were aligned and affixed to the inner bottom surface of the support so that the entire periphery was buried in the coating solution. Then, it heated at the temperature of 40 degreeC, the coating liquid was hardened, and the cell culture substratum and the support body were joined. The height difference between the position of the uppermost part of the joint and the surface of the poly-N-isopropylacrylamide layer, which is a functional layer, is 10 μm, and the side wall shape of the joint facing the functional layer Was convex outward. This was sterilized with 70% ethanol for 1 hour to prepare a cell culture container. In this cell culture container, the functional layer located on the periphery of the cell culture substrate and the outer peripheral end surface are covered with the joints over the entire periphery.
Ｃ．細胞シートの作製
ウシ大動脈血管内皮細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク社より入手）を、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるように調整し、細胞培養容器内に播種した。このとき、使用培地は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（シグマ製）であった。培養はＣＯ２インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ２の条件にて４８時間行った。光学位相差顕微鏡にて細胞がシート状に形成されたことを確認した（図１６Ａ１）。
C. Preparation of Cell Sheet Bovine aortic vascular endothelial cells (obtained from Human Science Research Resource Bank) were adjusted to 1 × 10 5 cells / cm 2 and seeded in a cell culture vessel. At this time, the medium used was DMEM containing 10% FBS (manufactured by Sigma). The culture was performed in a CO 2 incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 for 48 hours. It confirmed that the cell was formed in the sheet form with the optical phase-contrast microscope (FIG. 16A1).
Ｄ．細胞シートの剥離
細胞培養容器を２０℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーターに入庫した。２０分後、２０℃のインキュベーターから出庫した。細胞シートは細胞培養基材表面から剥離した（図１６Ｂ１）。この通り、温度を下げるだけで面内均一な細胞シートを得ることができた。
D. The peeled cell culture container of the cell sheet was placed in an incubator under 20 ° C. and 5% CO 2 conditions. After 20 minutes, the product was removed from the incubator at 20 ° C. The cell sheet peeled from the cell culture substrate surface (FIG. 16B1). In this way, it was possible to obtain an in-plane uniform cell sheet simply by lowering the temperature.
（実施例２）
図１３に模式的に示す手順で細胞培養容器を製造した。
実施例１と同様に円形の細胞培養基材を準備した。支持体として３５ｍｍφポリスチレンディッシュを射出成型法により作製した。このポリスチレンディッシュは、中央に開口部が形成された円形の底板と、該底板の周縁から上方に立設された側壁とを備える。当該底板の、ポリスチレンディッシュの内側に面する部分（内側底面）の直径が３５ｍｍであり、当該底板の中央の開口部の直径は２７ｍｍ（２７ｍｍφ）である。ポリスチレンディッシュの内側底面上の、側壁に沿った位置に円を描くように塗工液の幅が約４ｍｍとなるように塗工液をディスペンサーで１周塗布した。実施例１と同様に、上記細胞培養基材とポリスチレンディッシュを位置合わせし、上記細胞培養基材の周縁全周が塗工液に埋没するように支持体の内側底面に貼り付け、その後、温度４０℃で加熱して塗工液を硬化させて、細胞培養基材と支持体とを接合し、これを７０％エタノールにて１時間滅菌し、細胞培養容器を得た。なお、接合部の最上部の位置と、機能性層であるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド層の表面との高さの差が１０μｍであり、接合部の、機能性層に面する側の側壁形状は、外側に向かって凸であった。この細胞培養容器では、前記細胞培養基材の周縁に位置する機能性層及び外周端面が全周にわたり接合部により被覆されている。
(Example 2)
A cell culture vessel was produced by the procedure schematically shown in FIG.
A circular cell culture substrate was prepared in the same manner as in Example 1. A 35 mmφ polystyrene dish was produced as a support by an injection molding method. This polystyrene dish includes a circular bottom plate having an opening formed in the center, and side walls erected upward from the periphery of the bottom plate. The diameter of the portion of the bottom plate facing the inside of the polystyrene dish (inner bottom surface) is 35 mm, and the diameter of the central opening of the bottom plate is 27 mm (27 mmφ). The coating liquid was applied once by a dispenser so that the width of the coating liquid was about 4 mm so as to draw a circle on the inner bottom surface of the polystyrene dish along the side wall. As in Example 1, the cell culture substrate and the polystyrene dish are aligned, and the cell culture substrate is attached to the inner bottom surface of the support so that the entire periphery of the cell culture substrate is buried in the coating solution. The coating solution was cured by heating at 40 ° C., the cell culture substrate and the support were joined, and sterilized with 70% ethanol for 1 hour to obtain a cell culture container. The height difference between the position of the uppermost part of the joint and the surface of the poly-N-isopropylacrylamide layer, which is a functional layer, is 10 μm, and the side wall shape of the joint facing the functional layer Was convex outward. In this cell culture container, the functional layer located on the periphery of the cell culture substrate and the outer peripheral end surface are covered with the joints over the entire periphery.
実施例１と同様の条件で細胞の播種及び培養を行い、細胞培養基材上に細胞シートを形成した。その後、細胞培養容器を２０℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーターに入庫した。２０分後、２０℃のインキュベーターから出庫した。細胞シートは細胞培養基材表面から剥離し、温度を下げるだけで面内均一な細胞シートを得ることができた。 Cells were seeded and cultured under the same conditions as in Example 1 to form a cell sheet on the cell culture substrate. Thereafter, the cell culture container was stored in an incubator under 20 ° C. and 5% CO 2 conditions. After 20 minutes, the product was removed from the incubator at 20 ° C. The cell sheet was peeled off from the surface of the cell culture substrate, and a cell sheet with a uniform in-plane could be obtained simply by lowering the temperature.
（比較例１）
実施例１と同様に円形の細胞培養基材を準備した。この細胞培養基材と、実施例１で用いたのと同様の３５ｍｍφポリスチレンディッシュ（ベクトンディッキンソン社製）とを、接着剤を用いて、細胞培養基材のポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド層が形成されていない側の面と、ポリスチレンディッシュの内側底面との間に接着剤層が形成されるように接着させた。このとき、細胞培養基材の、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド層が形成された面の周縁を含む全面と、細胞培養基材の外周端面とが露出した状態であった。
(Comparative Example 1)
A circular cell culture substrate was prepared in the same manner as in Example 1. A poly-N-isopropylacrylamide layer of the cell culture substrate is formed using this cell culture substrate and the same 35 mmφ polystyrene dish (Becton Dickinson) used in Example 1 with an adhesive. It was made to adhere so that an adhesive layer might be formed between the surface of the side which is not, and the inner bottom of a polystyrene dish. At this time, the entire surface of the cell culture substrate including the periphery of the surface on which the poly-N-isopropylacrylamide layer was formed and the outer peripheral end surface of the cell culture substrate were exposed.
実施例１と同様の条件で細胞の播種及び培養を行い、細胞培養基材上に細胞シートを形成した。 Cells were seeded and cultured under the same conditions as in Example 1 to form a cell sheet on the cell culture substrate.
細胞培養容器を２０℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーターに入庫した。２０分後、２０℃のインキュベーターから出庫した。細胞シートは細胞培養基材表面に接着したままであり、細胞シートの端部から細胞シートを剥離しようと試みたが、剥離できなかった。そこで医療用メスで細胞シートの端部に切れ込みを入れ、接着している細胞を除去することで、細胞培養基材表面から剥離した。しかしながら、得られた細胞シートの端部には複数の切れ込みがあり、面内均一といえるものではなかった。 The cell culture container was stored in an incubator under 20 ° C. and 5% CO 2 conditions. After 20 minutes, the product was removed from the incubator at 20 ° C. The cell sheet remained adhered to the surface of the cell culture substrate, and an attempt was made to peel the cell sheet from the end of the cell sheet, but it could not be peeled. Then, it cut | disconnected from the cell culture substrate surface by making a notch in the edge part of a cell sheet with a medical knife, and removing the adhering cell. However, the end portion of the obtained cell sheet had a plurality of cuts, and it could not be said to be in-plane uniform.
１０……支持体，１２……開口部，１４……通孔，２０……細胞培養基材，２２……基材，２４……機能性層，２６……空洞，３０……接合部，３０ａ……塗工液，５０……細胞，５２……細胞シート，１００，２００，３００，４００，５００，６００，１７００……細胞培養容器，６１０……首部材，６１２……通孔，６２０……底部材，６３０……胴部材
DESCRIPTION OF
Claims (9)
基材、及び、該基材の表面上に形成された、所定の条件において細胞非接着性へと変化することが可能な細胞接着性の表面を有する機能性層を備える細胞培養基材と、
前記支持体と前記細胞培養基材とを接合する接合部と、を備え、
前記接合部は、細胞非接着性の表面を有し、且つ、前記機能性層の表面の、培養時に細胞と接触する領域の周縁の少なくとも一部を被覆するように配置されていることを特徴とする細胞培養容器。 A support;
A cell culture substrate comprising a substrate and a functional layer formed on the surface of the substrate and having a cell-adhesive surface capable of changing to a non-cell-adhesive property under a predetermined condition;
A bonding portion for bonding the support and the cell culture substrate,
The joint has a non-cell-adhesive surface, and is arranged so as to cover at least a part of the periphery of the surface of the functional layer that comes into contact with cells during culture. A cell culture container.
前記細胞培養基材は、前記開口部を塞ぐように配置されている、請求項１又は２の細胞培養容器。 The support is formed with an opening penetrating the support,
The cell culture container according to claim 1 or 2, wherein the cell culture substrate is disposed so as to close the opening.
前記筒状の胴部材の一端に接合された、該一端を閉塞する底部材と、
前記筒状の胴部材の他端に接合された、通孔が形成された首部材と、を備えたボトル型の細胞培養容器。 A cell culture substrate comprising a substrate and a functional layer formed on the surface of the substrate and having a cell-adhesive surface capable of changing to a non-cell-adhesive property under a predetermined condition; A cylindrical body member formed by joining one side end and the other side end of the cell culture substrate with the surface provided with the functional layer inside, the cell culture substrate One side end portion and the other side end portion of the material are joint portions having a non-cell-adhesive surface, and at least a part of the functional layer located at the two side end portions A body member joined by a joint arranged to cover; and
A bottom member that is joined to one end of the cylindrical body member and closes the one end;
A bottle-shaped cell culture container, comprising: a neck member formed with a through-hole, joined to the other end of the cylindrical body member.
基材、及び該基材の表面上に形成された、所定の条件において細胞非接着性へと変化することが可能な細胞接着性の表面を有する機能性層を備える細胞培養基材と、
前記支持体と前記細胞培養基材とを接合する接合部と、を備える細胞培養容器の製造方法であって、
前記支持体と、前記細胞培養基材と、細胞非接着性を有する材料を硬化により生成可能な成分を含む硬化性塗工液との組み合せであって、前記硬化性塗工液が、前記細胞培養基材の前記機能性層の表面の、培養時に細胞と接触する領域の周縁の少なくとも一部を被覆する位置と、前記支持体と前記細胞培養基材とを接合することが可能な位置とに少なくとも適用されている前記組み合わせ、を準備する工程と、
前記組み合わせにおいて前記硬化性塗工液を硬化させることにより前記接合部を形成する工程と、を含む前記方法。 A support;
A cell culture substrate comprising a substrate and a functional layer formed on the surface of the substrate and having a cell-adhesive surface capable of changing to a non-cell-adhesive property under a predetermined condition;
A joint for joining the support and the cell culture substrate, and a method for producing a cell culture container comprising:
A combination of the support, the cell culture substrate, and a curable coating solution containing a component capable of generating a cell non-adhesive material by curing, wherein the curable coating solution is the cell. A position on the surface of the functional layer of the culture substrate that covers at least a part of the periphery of a region that comes into contact with the cell during culture, and a position where the support and the cell culture substrate can be joined together. Preparing the combination applied at least to:
Forming the joint by curing the curable coating liquid in the combination.
前記組み合わせにおいて、前記細胞培養基材は前記開口部を塞ぐように配置されており、前記硬化性塗工液が適用される、前記支持体と前記細胞培養基材とを接合することが可能な位置が、前記開口部の周縁の少なくとも一部を含む、請求項５の方法。 The support is formed with an opening penetrating the support,
In the combination, the cell culture substrate is disposed so as to close the opening, and the support and the cell culture substrate to which the curable coating solution is applied can be joined. The method of claim 5, wherein the location includes at least a portion of a periphery of the opening.
前記筒状の胴部材の一端に接合された、該一端を閉塞する底部材と、
前記筒状の胴部材の他端に接合された、通孔が形成された首部材と、を備えたボトル型の細胞培養容器の製造方法であって、
前記機能性層を備えた面を内側とし、前記細胞培養基材の一方の側端部と他方の側端部とが相互に接合可能な位置に配置されるように筒状に加工した前記細胞培養基材と、細胞非接着性を有する材料を硬化により生成可能な成分を含む硬化性塗工液との組み合わせであって、前記硬化性塗工液が、前記細胞培養基材における前記二つの側端部に位置する機能性層の少なくとも一部を被覆する位置と、前記二つの側端部を接合することが可能な位置とに少なくとも適用されている前記組み合わせを準備する工程と、
前記組み合わせにおいて前記硬化性塗工液を硬化させることにより前記接合部を形成して、前記筒状の胴部材を形成する工程と、
前記筒状の胴部材の一端に前記底部材を取り付け、他端に前記首部材を取り付ける工程と、を含む方法。 A cell culture substrate comprising a substrate and a functional layer formed on the surface of the substrate and having a cell-adhesive surface capable of changing to a non-cell-adhesive property under a predetermined condition; The cylindrical body member formed by joining the side provided with the functional layer on the inside, and joining one side end and the other side end of the cell culture substrate with a joint,
A bottom member that is joined to one end of the cylindrical body member and closes the one end;
A neck member formed with a through-hole joined to the other end of the cylindrical body member, and a manufacturing method of a bottle-type cell culture container,
The cell processed into a cylindrical shape so that the surface provided with the functional layer is the inside, and one side end and the other side end of the cell culture substrate are arranged at positions where they can be joined to each other A combination of a culture substrate and a curable coating solution containing a component capable of generating a material having cell non-adhesive properties by curing, wherein the curable coating solution is a combination of the two in the cell culture substrate. Preparing the combination applied at least to a position covering at least a part of the functional layer located at the side end and a position capable of joining the two side ends;
Forming the joint by curing the curable coating liquid in the combination, and forming the cylindrical body member;
Attaching the bottom member to one end of the cylindrical body member and attaching the neck member to the other end.
前記機能性層に、前記所定の条件を印加して、前記機能性層の表面を細胞非接着性へと変化させる工程と、
培養された細胞の剥離を前記接合部が存在する部位から開始して、前記機能性層から細胞を剥離する工程と、を含むことを特徴とする細胞シートの製造方法。 Culturing cells on the functional layer of the cell culture vessel of any one of claims 1 to 4,
Applying the predetermined condition to the functional layer to change the surface of the functional layer to non-cell-adhesive;
Detaching cells from the functional layer by starting detachment of the cultured cells from a site where the joint is present, and a method for producing a cell sheet.
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