JP2014093960A - Method for producing microbial fermentation product - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、微生物醗酵生産物の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a microbial fermentation product.
医薬成分、香料、香料原料、油脂やそれらの中間体等の有用物質の中には酵素や微生物等の生体触媒を用いて製造されるものが数多く存在する。
例えば、３ａ,６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン（以下、「化合物Ａ」と表記する）は、抹香鯨の体内に生ずる病的分泌物アンバーグリースに含まれている香気成分で、アンバー系合成香料として欠かせない重要化合物であり、スクラレオールから微生物変換により３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルデカヒドロナフト[２,１−ｂ]フラン−２（１Ｈ）−オン（以下、「スクラレオリド」と表記する）及び１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オール（以下、「ジオール体」と表記する）を得、これを環化させて製造することができる（特許文献１及び２）。
Many useful substances such as pharmaceutical ingredients, fragrances, fragrance raw materials, fats and oils, and intermediates thereof are produced using biocatalysts such as enzymes and microorganisms.
For example, 3a, 6,6,9a-tetramethyldodecahydronaphtho [2,1-b] furan (hereinafter referred to as “Compound A”) is contained in a pathological secretion amber grease produced in the body of a perfumed whale. Is an important compound that is indispensable as an amber-based synthetic fragrance, and 3a, 6,6,9a-tetramethyldecahydronaphtho [2,1-b] furan-2 (1H) by microbial conversion from sclareol -On (hereinafter referred to as "sclareolide") and 1- (2-hydroxyethyl) -2,5,5,8a-tetramethyldecahydronaphthalen-2-ol (hereinafter referred to as "diol form") Can be produced by cyclization (Patent Documents 1 and 2).
ジオール体のように微生物変換により菌体外に難水溶性や疎水性の微生物醗酵生産物が生産される場合には、作業効率を考慮して、微生物醗酵生産物を含む培養液に疎水性溶媒を加えて抽出により微生物醗酵生産物の回収が行われる。通常、培養液中には、微生物醗酵生産物の他に未反応の反応基質や微生物、培地成分等が混在していて、抽出の際にこれら微生物醗酵生産物以外の成分も同時に回収されてしまうため、微生物醗酵生産物の疎水性溶媒抽出液をフィルターで濾過し、微生物醗酵生産物以外の成分を濾別するのが好ましい。 When a microbial fermentation product that is poorly water-soluble or hydrophobic is produced outside the cell by microbial transformation, such as a diol, a hydrophobic solvent is added to the culture solution containing the microbial fermentation product in consideration of work efficiency. And microbial fermentation products are recovered by extraction. Usually, in the culture solution, unreacted reaction substrates, microorganisms, medium components and the like are mixed in addition to the microbial fermentation product, and components other than these microbial fermentation products are also recovered at the time of extraction. For this reason, it is preferable to filter the hydrophobic solvent extract of the microbial fermentation product with a filter and to filter out components other than the microbial fermentation product.
しかしながら、微生物醗酵生産物の疎水性溶媒抽出液を濾過すると、濾過速度が低下してしまう場合があることが判明した。
すなわち、微生物培養の際に泡が発生し、この泡に反応基質が含まれてしまうため反応効率が低下したり、反応終了後の培養液中に基質が多く残存したりすることがある。とりわけ、反応を良好にするため、基質の分散性を向上させようと界面活性剤を用いると泡が発生し易い。そのため、培地に消泡剤を添加して発泡を抑えるが、微生物醗酵生産物の疎水性溶媒抽出液の濾過速度が大幅に低下するという課題が見出された。濾過速度が低下すると、微生物醗酵生産物の製造効率、作業効率が悪くなり、また、製造コストが多くかかる。濾過速度が低下する原因は明らかではないが、消泡剤に由来する物質、又は未反応の反応基質、微生物若しくは培地成分等と消泡剤に由来する物質の夾雑物が分離膜に何らかの作用を及ぼすためであると考えられる。
However, it has been found that filtering the hydrophobic solvent extract of the microbial fermentation product may reduce the filtration rate.
That is, bubbles are generated during culturing of microorganisms, and reaction substrates are contained in the bubbles, so that the reaction efficiency may be reduced, or a large amount of substrates may remain in the culture solution after the reaction is completed. In particular, if a surfactant is used to improve the dispersibility of the substrate in order to improve the reaction, bubbles are likely to be generated. Therefore, an antifoaming agent is added to the culture medium to suppress foaming, but a problem has been found that the filtration rate of the hydrophobic solvent extract of the microbial fermentation product is greatly reduced. When the filtration rate decreases, the production efficiency and work efficiency of the microbial fermentation product deteriorate, and the production cost increases. The cause of the decrease in the filtration rate is not clear, but the substances derived from the antifoaming agent, or contaminants of the unreacted reaction substrate, microorganisms, medium components, etc. and the substance derived from the antifoaming agent have some effect on the separation membrane. It is thought to be because of the effect.
従来、微生物や浮遊物、吸着性物質等が分離膜に捕捉されることで低下した濾過能力を回復させるために、熱水や酸、アルカリ等を用いて分離膜を洗浄し、目詰まり物質を除去する方法が知られているが（特許文献３〜５）、これらの技術は濾過工程終了後の分離膜に対して処理を行って分離膜を再生させるものであって、濾過工程における濾過速度の低下を抑えるものではない。
本発明は、斯かる実情に鑑み、濾過速度を低下させずに微生物醗酵生産物の疎水性溶媒抽出液を濾過させて、効率良く微生物醗酵生産物を製造することのできる方法を提供しようとするものである。
Conventionally, in order to recover the reduced filtration capacity due to trapping of microorganisms, suspended solids, adsorbents, etc., the separation membrane is washed with hot water, acid, alkali, etc. Although the removal method is known (patent documents 3 to 5), these techniques are to regenerate the separation membrane by treating the separation membrane after the filtration step, and the filtration rate in the filtration step It does not suppress the decline.
In view of such circumstances, the present invention intends to provide a method capable of efficiently producing a microbial fermentation product by filtering the hydrophobic solvent extract of the microbial fermentation product without reducing the filtration rate. Is.
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討したところ、予め微生物醗酵生産物の疎水性溶媒抽出液とアルカリ水溶液を混合し、アルカリ水溶液層を除去すれば、分離膜の閉塞が抑えられ、濾過速度を低下させずに疎水性溶媒抽出液を長時間にわたり安定して濾過させることができることを見出した。 The present inventor has intensively studied in view of the above problems, and previously mixed the hydrophobic solvent extract of the microbial fermentation product and the alkaline aqueous solution, and removing the alkaline aqueous solution layer suppresses the clogging of the separation membrane, and the filtration rate. It was found that the hydrophobic solvent extract can be stably filtered over a long period of time without lowering.
すなわち、本発明は、次の工程（１）、（２）及び（３）：
（１）消泡剤を含有する培地中で反応基質を微生物変換して得られる微生物醗酵生産物を、疎水性溶媒にて抽出する工程、
（２）工程（１）で得られた微生物醗酵生産物を含む疎水性溶媒抽出液とアルカリ水溶液を混合した後、疎水性溶媒抽出液をアルカリ水溶液から分離する工程、
（３）工程（２）でアルカリ水溶液から分離して得られた疎水性溶媒抽出液を濾過する工程、
を含む微生物醗酵生産物の製造方法を提供するものである。
That is, the present invention includes the following steps (1), (2) and (3):
(1) A step of extracting a microbial fermentation product obtained by microbial conversion of a reaction substrate in a medium containing an antifoaming agent with a hydrophobic solvent,
(2) A step of separating the hydrophobic solvent extract from the aqueous alkaline solution after mixing the hydrophobic solvent extract containing the microbial fermentation product obtained in step (1) and the aqueous alkaline solution,
(3) A step of filtering the hydrophobic solvent extract obtained by separating from the alkaline aqueous solution in the step (2),
The manufacturing method of the microbial fermentation product containing this is provided.
本発明によれば、濾過速度を低下させることなく、疎水性溶媒中に含まれる微生物醗酵生産物以外の成分を濾別できるので、高品質の微生物醗酵生産物を効率良く得ることができる。 According to the present invention, since components other than the microbial fermentation product contained in the hydrophobic solvent can be filtered out without reducing the filtration rate, a high-quality microbial fermentation product can be obtained efficiently.
本発明の方法における工程（１）は、消泡剤を含有する培地中で反応基質を微生物変換して得られる微生物醗酵生産物を、疎水性溶媒にて抽出する工程である。
本発明の方法で製造される微生物醗酵生産物とは、香料、香料原料、油脂として使用される化合物又はその中間体であり、親水性、疎水性、両親媒性の何れの性質を有していてもよいが、培養液からの生産物の分離性の点から、水に溶解し難いものが好ましい。微生物醗酵生産物の水への溶解度（２５℃）は、０．１〜１００００ｍｇ／Ｌが好ましく、更に０．１〜５０００ｍｇ／Ｌが好ましい。
そして、反応基質、当該基質を変換する微生物、培養条件は、これら微生物醗酵生産物の種類に応じて適宜選択することができる。
Step (1) in the method of the present invention is a step of extracting a microbial fermentation product obtained by microbial conversion of a reaction substrate in a medium containing an antifoaming agent with a hydrophobic solvent.
The microbial fermentation product produced by the method of the present invention is a compound used as a fragrance, a fragrance material, an oil or an intermediate thereof, and has any property of hydrophilicity, hydrophobicity, and amphiphilicity. However, from the viewpoint of separability of the product from the culture solution, those that are difficult to dissolve in water are preferable. The solubility (25 ° C.) of the microbial fermentation product in water is preferably 0.1 to 10,000 mg / L, more preferably 0.1 to 5000 mg / L.
The reaction substrate, the microorganism that converts the substrate, and the culture conditions can be appropriately selected according to the type of the microbial fermentation product.
以下に、本発明の好ましい実施態様の一例として、次の一般式（１ａ）及び／又は（１ｂ） In the following, as an example of a preferred embodiment of the present invention, the following general formula (1a) and / or (1b)
で表される化合物（スクラレオール）を反応基質として、微生物を用いて次の式（２） Using a compound represented by the formula (sclareol) as a reaction substrate and a microorganism, the following formula (2)
で表される１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オール（ジオール体）を製造する方法を説明する。 A method for producing 1- (2-hydroxyethyl) -2,5,5,8a-tetramethyldecahydronaphthalen-2-ol (diol form) represented by the formula:
ジオール体の製造において、微生物変換に利用できる微生物としては、前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物を基質として式（２）で表されるジオール体を生成し、菌体外に産出する能力を有する微生物であればよく、例えば子嚢菌綱（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物、担子菌綱（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物が挙げられる。
子嚢菌綱（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物としては、ハイホジーマ（Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ）属に属する微生物が挙げられる。また、担子菌綱（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物としては、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物が挙げられる。なかでも、ジオール体の生成効率の点から、子嚢菌綱（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物が好ましい。
ハイホジーマ（Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ）属に属する具体的な微生物としては、例えばＡｓｃｏｍｙｃｅｔｅ ｓｐ．ＫＳＭ−ＪＬ２８４２と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）にＦＥＲＭ Ｐ−２０７５９として２００６年１月１２日に寄託された微生物、特許第２５４７７１３号明細書に記載のハイホジーマ ロセオニガー ＡＴＣＣ２０６２４株が挙げられる。
In the production of a diol body, as a microorganism that can be used for microbial conversion, a diol body represented by the formula (2) is produced using the compound represented by the formula (1a) and / or (1b) as a substrate, Any microorganism may be used as long as it has an ability to be produced outside, for example, microorganisms belonging to Ascomycetes and microorganisms belonging to Basidiomycetes.
Examples of microorganisms belonging to the class of Ascomycetes include microorganisms belonging to the genus Hyphozyma. Examples of microorganisms belonging to the class Basidiomycetes include microorganisms belonging to the genus Cryptococcus. Among these, microorganisms belonging to Ascomycetes are preferable from the viewpoint of the production efficiency of diol.
Specific microorganisms belonging to the genus Hyphozyma include, for example, Ascomycete sp. It was named KSM-JL2842, and was deposited on January 12, 2006 as FERM P-20759 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (address: 1-1-1 Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki) And microorganisms such as Hyhozyma roseoniger ATCC 20624 described in Japanese Patent No. 2547713.
また、ジオール体の製造において、微生物変換に利用できる微生物は、ジオール体の生成能を指標として土壌から単離することができる。当該ジオール体の生成能は、供試微生物を前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物を含有する培地にて培養し、培地中に含まれるジオール体を検出することで評価することができる。ジオール体の検出は、例えばガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、気液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、赤外スペクトル（ＩＲ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）等の従来公知の分析方法を用いることができる。 Further, in the production of diol bodies, microorganisms that can be used for microbial conversion can be isolated from soil using the ability to produce diol bodies as an index. The ability to produce the diol form is evaluated by culturing the test microorganism in a medium containing the compound represented by the formula (1a) and / or (1b) and detecting the diol form contained in the medium. can do. The detection of the diol is performed, for example, by gas chromatography (GC), gas-liquid chromatography (GLC), thin layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC), infrared spectrum (IR), nuclear magnetic resonance (NMR). Conventional analysis methods such as) can be used.
本発明においては、微生物を培養する培地として消泡剤を含有する培地を用いる。
消泡剤は、醗酵時の発泡を抑制でき、醗酵阻害の少ないものであればよく、例えばシリコーン系消泡剤、動植物油系消泡剤、脂肪酸系消泡剤、脂肪酸エステル系消泡剤、又はアルコール系消泡剤等が挙げられる。なかでも、消泡性能が良好であり、醗酵阻害が少ない観点から、シリコーン系消泡剤が好ましい。シリコーン系消泡剤としては、例えばジメチルポリシロキサン、有機変性ポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、シリコーン処理粉末、シリコーンペースト、フッ素シリコーン等が挙げられる。
In the present invention, a medium containing an antifoaming agent is used as a medium for culturing microorganisms.
The antifoaming agent can suppress foaming at the time of fermentation, and only needs to have a small amount of fermentation inhibition. Or an alcohol type antifoamer etc. are mentioned. Among these, a silicone-based antifoaming agent is preferable from the viewpoint of good antifoaming performance and less fermentation inhibition. Examples of the silicone-based antifoaming agent include dimethylpolysiloxane, organically modified polysiloxane, silicone emulsion, silicone-treated powder, silicone paste, and fluorine silicone.
培地中の消泡剤の含有量は、過剰な発泡を抑制する観点から、好ましくは０．５質量％（以下、単に「％」と記載する）以上、より好ましくは０．７５％以上である。また、消泡剤の含有量は、ジオール体生産性を良好にする観点から、好ましくは２％以下、より好ましくは１．５％以下である。また上記観点より、好ましくは０．５〜２％、より好ましくは０．７５〜２％、更に好ましくは０．７５〜１．５％である。
消泡剤は培養に先立って培地に添加してもよく、また培養中に添加してもよいが、培養中に添加することが好ましい。
The content of the antifoaming agent in the medium is preferably 0.5% by mass (hereinafter simply referred to as “%”) or more, more preferably 0.75% or more, from the viewpoint of suppressing excessive foaming. . Further, the content of the antifoaming agent is preferably 2% or less, more preferably 1.5% or less, from the viewpoint of improving the diol body productivity. Moreover, from the said viewpoint, Preferably it is 0.5 to 2%, More preferably, it is 0.75 to 2%, More preferably, it is 0.75 to 1.5%.
The antifoaming agent may be added to the medium prior to the culture or during the culture, but is preferably added during the culture.
培地は、微生物が生育可能であればいかなる組成の培地をも使用することができる。使用可能な培地としては、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、有機酸塩等の炭素源；無機並びに有機アンモニウム塩、窒素含有有機物、アミノ酸等の窒素源；塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等の金属ミネラル類及びビタミン類等を含有する液体培地を挙げることができる。
培地には、基質の分散性を良好として、ジオール体の生産性を良好とする観点から、界面活性剤を添加することが好ましい。界面活性剤は、醗酵阻害の少ないものであればよく、ノニオン性界面活性剤が好ましい。
A medium having any composition can be used as long as the microorganism can grow. Usable media include carbon sources such as monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides and organic acid salts; nitrogen sources such as inorganic and organic ammonium salts, nitrogen-containing organic substances and amino acids; sodium chloride, ferrous sulfate, Examples thereof include liquid media containing metal minerals such as magnesium sulfate, manganese sulfate, zinc sulfate, and calcium carbonate, vitamins, and the like.
A surfactant is preferably added to the medium from the viewpoint of good substrate dispersibility and good diol productivity. The surfactant is not particularly limited as long as it has little fermentation inhibition, and a nonionic surfactant is preferable.
微生物を培養する際の培養条件としては、例えば通気培養、嫌気培養、撹拌培養、振盪培養、静置培養、発酵槽による培養の他、休止菌体反応及び固定化菌体反応を用いることができる。なかでも、微生物増殖性及びジオール体の生産性を良好にする観点から、通気培養が好ましい。通気培養での培養日数は、反応基質の添加から１〜１５日が好ましい。 As culture conditions for culturing microorganisms, for example, aeration culture, anaerobic culture, agitation culture, shaking culture, stationary culture, culture using a fermentor, resting cell reaction and immobilized cell reaction can be used. . Among these, aeration culture is preferable from the viewpoint of improving the microorganism growth and the productivity of the diol. The culture days in the aeration culture are preferably 1 to 15 days from the addition of the reaction substrate.
培地の初発ｐＨ（２５℃）は、微生物増殖性及びジオール体生産性を良好にする観点から、好ましくは３以上、より好ましくは４以上、更に好ましくは５以上であり、また好ましくは８以下、より好ましくは７以下である。 The initial pH (25 ° C.) of the medium is preferably 3 or more, more preferably 4 or more, still more preferably 5 or more, and preferably 8 or less, from the viewpoint of improving microbial growth and diol body productivity. More preferably, it is 7 or less.
培養温度は、微生物増殖性及びジオール体生産性を良好にする観点から、好ましくは１０℃以上、より好ましくは１５℃以上、更に好ましくは２０℃以上であり、また好ましくは３５℃以下、より好ましくは３０℃以下である。 The culture temperature is preferably 10 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher, further preferably 20 ° C. or higher, and preferably 35 ° C. or lower, more preferably, from the viewpoint of improving microbial growth and diol body productivity. Is 30 ° C. or lower.
反応基質として培地に添加する前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物の濃度は、ジオール体の生成効率の点から、培地中に０．１〜５０％とすることが好ましく、１〜１０％とすることがより好ましい。基質は培養に先立って培地に添加してもよく、培養途中で添加してもよい。 The concentration of the compound represented by the formula (1a) and / or (1b) added to the medium as a reaction substrate is preferably 0.1 to 50% in the medium from the viewpoint of the production efficiency of the diol body. 1 to 10% is more preferable. The substrate may be added to the medium prior to the culture or may be added during the culture.
（工程（１））
このような微生物変換により生産されるジオール体を培養液から疎水性溶媒にて抽出する。当該培養液には、ジオール体の他、未反応の反応基質、微生物、培地成分等が含まれていてもよい。
本発明においては、ジオール体を疎水性溶媒にて抽出する前に、製造されるジオール体の匂い・色相を良好なものとする観点から、培養液中の培地成分等の水分の一部を予め遠心分離等で除去してもよい。
遠心分離は、分離板型、円筒型、デカンター型等の一般的な遠心分離機を用いることができ、バッチ式、連続式のいずれを用いることもできる。遠心分離の条件は適宜調整することができる。
(Process (1))
The diol produced by such microbial conversion is extracted from the culture solution with a hydrophobic solvent. In addition to the diol, the culture solution may contain unreacted reaction substrates, microorganisms, medium components, and the like.
In the present invention, before extracting the diol form with a hydrophobic solvent, from the viewpoint of improving the odor and hue of the produced diol form, a part of water such as medium components in the culture solution is previously stored. It may be removed by centrifugation or the like.
For the centrifugal separation, a general centrifugal separator such as a separation plate type, a cylindrical type, or a decanter type can be used, and any of a batch type and a continuous type can be used. Centrifugation conditions can be adjusted as appropriate.
本発明で「疎水性溶媒」とは、１００ｇの水中における２５℃での溶解度が１質量％以下の溶媒をいう。
本発明で用いられる疎水性溶媒のＳＰ値は、ジオール体の溶解性の観点から、好ましくは１４（ＭＰａ）1/2以上、より好ましくは１５（ＭＰａ）1/2以上、更に好ましくは１６（ＭＰａ）1/2以上、更に好ましくは１７（ＭＰａ）1/2以上である。また、疎水性溶媒のＳＰ値は、水との分層性の観点から、好ましくは１９（ＭＰａ）1/2以下、より好ましくは１８．５（ＭＰａ）1/2以下である。また上記観点より、好ましくは１４〜１９（ＭＰａ）1/2、より好ましくは１５〜１９（ＭＰａ）1/2、更に好ましくは１６〜１８．５（ＭＰａ）1/2、更に好ましくは１７〜１８．５（ＭＰａ）1/2である。
ここで、疎水性溶媒のＳＰ値とは、溶解度パラメーターを示し、液体分子凝集エネルギーＥと分子容Ｖから（Ｅ／Ｖ）1/2（ＭＰａ）1/2で与えられる物質定数である。各種方法で求められるが、本発明におけるＳＰ値は、Ｊ．ＢＲＡＮＤＲ ＵＰ著「ＰＯＬＹＭＥＲ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ４ｔｈ」（ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ＆ＳＯＮＳ，ＩＮＣ １９９９年発行）、ＶＩＩ６８８〜６９４項に示された値を用いることができ、そこに記載のないものについてはＦｅｄｏｒｓの方法に従い、Ｊ．ＢＲＡＮＤＲ ＵＰ著「ＰＯＬＹＭＥＲ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ４ｔｈ」、ＶＩＩ６８５〜６８６項に示されるパラメーターを用いて算出した値を用いることができる。
複数の溶媒を組み合わせて用いる場合は、各溶媒のＳＰ値の体積平均値を計算することにより求める。
In the present invention, the “hydrophobic solvent” refers to a solvent having a solubility in 100 g of water at 25 ° C. of 1% by mass or less.
The SP value of the hydrophobic solvent used in the present invention is preferably 14 (MPa) 1/2 or more, more preferably 15 (MPa) 1/2 or more, still more preferably 16 (MPa), from the viewpoint of solubility of the diol body. MPa) 1/2 or more, more preferably 17 (MPa) 1/2 or more. The SP value of the hydrophobic solvent is preferably 19 (MPa) 1/2 or less, more preferably 18.5 (MPa) 1/2 or less, from the viewpoint of layer separation with water. From the above viewpoint, it is preferably 14 to 19 (MPa) 1/2 , more preferably 15 to 19 (MPa) 1/2 , still more preferably 16 to 18.5 (MPa) 1/2 , and still more preferably 17 to 18.5 (MPa) 1/2 .
Here, the SP value of the hydrophobic solvent indicates a solubility parameter, and is a substance constant given by (E / V) 1/2 (MPa) 1/2 from the liquid molecule aggregation energy E and the molecular volume V. The SP value in the present invention is determined by various methods. The values shown in BRANDR UP “POLYMER HANDBOOK 4th” (JOHN WILEY & SONS, INC 1999), items VII688 to 694 can be used. The value calculated using the parameters shown in BRANDR UP “POLYMER HANDBOOK 4th”, paragraphs VII 685 to 686 can be used.
When a plurality of solvents are used in combination, the volume average value of SP values of each solvent is calculated.
好ましい疎水性溶媒としては、例えばシクロヘキサン（ＳＰ値＝１６．８（ＭＰａ）1/2）、４−メチル−２−ペンタノン（ＳＰ値＝１７．２（ＭＰａ）1/2）、キシレン（ＳＰ値＝１８．０（ＭＰａ）1/2）、トルエン（ＳＰ値＝１８．２（ＭＰａ）1/2）、酢酸エチル（ＳＰ値＝１８．６（ＭＰａ）1/2）等が挙げられる。 Preferred examples of the hydrophobic solvent include cyclohexane (SP value = 16.8 (MPa) 1/2 ), 4-methyl-2-pentanone (SP value = 17.2 (MPa) 1/2 ), xylene (SP value). = 18.0 (MPa) 1/2 ), toluene (SP value = 18.2 (MPa) 1/2 ), ethyl acetate (SP value = 18.6 (MPa) 1/2 ) and the like.
疎水性溶媒の使用量は、使用する溶媒により適宜設定することが好ましい。本発明においては、ジオール体の回収率（歩留まり）の観点から、培養液１００ｍＬに対して１０〜２０００ｍＬとするのが好ましく、１００〜１５００ｍＬとするのがより好ましく、２００〜１２００ｍＬとするのがより好ましい。 The amount of the hydrophobic solvent used is preferably set as appropriate depending on the solvent used. In the present invention, from the viewpoint of the recovery rate (yield) of the diol, it is preferably 10 to 2000 mL, more preferably 100 to 1500 mL, and more preferably 200 to 1200 mL with respect to 100 mL of the culture solution. preferable.
培養液と疎水性溶媒を混合した際の混合液の温度は、０〜８０℃であることが好ましく、２０〜６５℃であることがより好ましい。このときの混合時間は、ジオール体の溶解性及び製造されるジオール体の匂い・色相を良好なものとする観点から、好ましくは１分間以上、より好ましくは５分間以上であり、また好ましくは１２０分間以下、より好ましくは６０分間以下である。 The temperature of the mixed solution when the culture solution and the hydrophobic solvent are mixed is preferably 0 to 80 ° C, and more preferably 20 to 65 ° C. The mixing time at this time is preferably 1 minute or longer, more preferably 5 minutes or longer, and preferably 120 minutes from the viewpoint of improving the solubility of the diol body and the odor and hue of the diol body produced. It is not more than minutes, more preferably not more than 60 minutes.
培養液と疎水性溶媒を混合した後、疎水性溶媒層と水層を分離させ、水層を除去して疎水性溶媒抽出液を得る。水層には、微生物や微生物由来の不純物等が含まれており、これにより不純物等を除去できる。疎水性溶媒層と水層を分離する手段としては、静置分離、遠心分離等が挙げられる。
分離条件は適宜調整することができるが、例えば静置分離は１０〜６０分間行い、疎水性溶媒層を分取することが好ましい。静置時の混合液の温度は特に規定されないが、０〜８０℃であることが好ましく、２０〜６５℃であることがより好ましい。
After mixing the culture solution and the hydrophobic solvent, the hydrophobic solvent layer and the aqueous layer are separated, and the aqueous layer is removed to obtain a hydrophobic solvent extract. The water layer contains microorganisms, impurities derived from microorganisms, and the like, which can remove impurities and the like. Examples of means for separating the hydrophobic solvent layer and the aqueous layer include stationary separation and centrifugation.
Separation conditions can be adjusted as appropriate. For example, it is preferable to perform stationary separation for 10 to 60 minutes and to separate the hydrophobic solvent layer. Although the temperature of the liquid mixture at the time of standing is not prescribed | regulated, it is preferable that it is 0-80 degreeC, and it is more preferable that it is 20-65 degreeC.
（工程（２））
本発明の方法における工程（２）は、前記工程（１）で得られた微生物醗酵生産物を含む疎水性溶媒抽出液をアルカリ水溶液と混合した後、疎水性溶媒抽出液をアルカリ水溶液から分離する工程である。
予め微生物醗酵生産物を含む疎水性溶媒抽出液をアルカリ水溶液と混合することにより濾過能力の低下を抑えられる理由は必ずしも明らかではないが、疎水性溶媒抽出液に混入した消泡剤に由来する物質、又は未反応の反応基質、微生物若しくは培地成分等と消泡剤に由来する物質の夾雑物がアルカリ水溶液に移行又は溶解されるためと考えられる。
(Process (2))
In the step (2) of the method of the present invention, the hydrophobic solvent extract containing the microbial fermentation product obtained in the step (1) is mixed with an alkaline aqueous solution, and then the hydrophobic solvent extract is separated from the alkaline aqueous solution. It is a process.
The reason why the decrease in filtration capacity can be prevented by mixing the hydrophobic solvent extract containing the microbial fermentation product with the alkaline aqueous solution in advance is not clear, but the substance derived from the defoamer mixed in the hydrophobic solvent extract It is also considered that contaminants of substances derived from the unreacted reaction substrate, microorganisms, medium components, etc. and the antifoaming agent are transferred or dissolved in the alkaline aqueous solution.
本発明で用いられるアルカリとしては、例えばアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物、アンモニア、アミン類等が挙げられる。これらは１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。なかでも、取り扱い性の点から、アルカリ金属の水酸化物が好ましく、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムがより好ましく、水酸化ナトリウムが更に好ましい。 Examples of the alkali used in the present invention include alkali metal or alkaline earth metal hydroxides, ammonia, and amines. These can be used alone or in combination of two or more. Of these, alkali metal hydroxides are preferable from the viewpoint of handleability, sodium hydroxide or potassium hydroxide is more preferable, and sodium hydroxide is still more preferable.
アルカリ水溶液中のアルカリの濃度は、濾過速度の低下を防ぐ観点から、好ましくは０．１ｍｏｌ／ｄｍ3以上、より好ましくは１ｍｏｌ／ｄｍ3以上である。また、アルカリ水溶液中のアルカリの濃度は、ジオール体の変性を防ぐ観点から、好ましくは１０ｍｏｌ／ｄｍ3以下、より好ましくは５ｍｏｌ／ｄｍ3以下である。また上記観点より、好ましくは０．１〜１０ｍｏｌ／ｄｍ3、より好ましくは０．１〜５ｍｏｌ／ｄｍ3、更に好ましくは１〜５ｍｏｌ／ｄｍ3である。 The concentration of alkali in the aqueous alkali solution is preferably 0.1 mol / dm 3 or more, more preferably 1 mol / dm 3 or more, from the viewpoint of preventing a decrease in filtration rate. In addition, the concentration of alkali in the aqueous alkali solution is preferably 10 mol / dm 3 or less, more preferably 5 mol / dm 3 or less, from the viewpoint of preventing modification of the diol. Also from the above standpoint, it preferably 0.1~10mol / dm 3, more preferably 0.1 to 5 mol / dm 3, more preferably at 1 to 5 mol / dm 3.
また、アルカリ水溶液の使用量は、濾過速度の低下を防ぐ観点から、疎水性溶媒抽出液１００ｍＬに対して、好ましくは１ｍＬ以上、より好ましくは５ｍＬ以上である。また、アルカリ水溶液の使用量は、乳化を防ぐ観点から、疎水性溶媒抽出液１００ｍＬに対して、好ましくは１００ｍＬ以下、より好ましくは２０ｍＬ以下である。 Moreover, the usage-amount of alkaline aqueous solution is from a viewpoint of preventing the fall of a filtration rate, Preferably it is 1 mL or more with respect to 100 mL of hydrophobic solvent extracts, More preferably, it is 5 mL or more. Moreover, the usage-amount of alkaline aqueous solution becomes like this. From a viewpoint of preventing emulsification, Preferably it is 100 mL or less with respect to 100 mL of hydrophobic solvent extracts, More preferably, it is 20 mL or less.
疎水性溶媒抽出液とアルカリ性水溶液を混合する際の温度は、ジオール体が混合液中で析出しない温度であればよく、０〜８０℃、更に２０〜６５℃が好ましい。また、混合時間は、１〜１２０分間であることが好ましく、５〜６０分であることがより好ましい。 The temperature at the time of mixing the hydrophobic solvent extract and the alkaline aqueous solution may be a temperature at which the diol body does not precipitate in the mixed solution, and is preferably 0 to 80 ° C, more preferably 20 to 65 ° C. The mixing time is preferably 1 to 120 minutes, more preferably 5 to 60 minutes.
混合後、疎水性溶媒抽出液をアルカリ水溶液から分離する。疎水性溶媒抽出液を分離する手段としては、静置分離、遠心分離等が挙げられる。
分離条件は適宜調整することができるが、例えば静置分離は１〜１２０分間、より好ましくは１０〜６０分間行い、疎水性溶媒抽出液を分取することが好ましい。また、静置時の混合液の温度は、０〜８０℃であることが好ましく、２０〜６５℃であることがより好ましい。
After mixing, the hydrophobic solvent extract is separated from the aqueous alkaline solution. Examples of means for separating the hydrophobic solvent extract include stationary separation and centrifugation.
Separation conditions can be appropriately adjusted. For example, it is preferable to perform stationary separation for 1 to 120 minutes, more preferably for 10 to 60 minutes, and to extract the hydrophobic solvent extract. Moreover, it is preferable that it is 0-80 degreeC, and, as for the temperature of the liquid mixture at the time of standing, it is more preferable that it is 20-65 degreeC.
本発明においては、濾過に先立ち、疎水性溶媒抽出液をアルカリ水溶液から分離した後、更に水と混合し、水を除去する処理を行ってもよい。
水の使用量は、濾過速度の低下を防ぐ観点から、疎水性溶媒抽出液１００ｍＬに対して、好ましくは１ｍＬ以上、より好ましくは５ｍＬ以上である。また、水の使用量は、乳化を防ぐ観点から、疎水性溶媒抽出液１００ｍＬに対して、好ましくは１００ｍＬ以下、より好ましくは２０ｍＬ以下である。また、水の温度は、０〜８０℃、更に２０〜６５℃が好ましい。また、混合時間は、１〜１２０分間であることが好ましく、５〜６０分であることがより好ましい。
このような処理は、１回でもよく、複数回（例えば２回、３回）繰り返してもよい。疎水性溶媒抽出液を水から分離する手段としては、上記同様、静置分離、遠心分離等が挙げられる。
In the present invention, prior to filtration, the hydrophobic solvent extract may be separated from the alkaline aqueous solution and then mixed with water to remove the water.
The amount of water used is preferably 1 mL or more, more preferably 5 mL or more with respect to 100 mL of the hydrophobic solvent extract from the viewpoint of preventing a decrease in filtration rate. Moreover, the usage-amount of water is from a viewpoint of preventing emulsification, Preferably it is 100 mL or less with respect to 100 mL of hydrophobic solvent extracts, More preferably, it is 20 mL or less. Moreover, the temperature of water is 0-80 degreeC, Furthermore, 20-65 degreeC is preferable. The mixing time is preferably 1 to 120 minutes, more preferably 5 to 60 minutes.
Such processing may be performed once or may be repeated a plurality of times (for example, twice or three times). Examples of means for separating the hydrophobic solvent extract from water include static separation and centrifugation as described above.
また、濾過に先立ち、吸着剤による吸着処理を行ってもよい。
吸着処理において用いられる吸着剤としては、例えば、白土、活性炭、珪藻土、セルロース又はこれらの組み合わせ等が挙げられる。
吸着剤の使用量は、濾過速度の低下を防ぐ観点から、疎水性溶媒抽出液１００ｍＬに対して、０．０１〜１０ｇが好ましく、更に０．１〜１ｇが好ましい。また、吸着処理時の疎水性溶媒抽出液と吸着剤の混合物の温度は、０〜８０℃が好ましく、更に２０〜６５℃が好ましい。疎水性溶媒抽出液と吸着剤の接触時間は、１〜１２０分間であることが好ましく、更に５〜６０分が好ましい。圧力は、減圧下でも常圧でもよいが、酸化抑制及び脱色性の点から減圧下が好ましい。
Prior to filtration, an adsorption treatment with an adsorbent may be performed.
Examples of the adsorbent used in the adsorption treatment include clay, activated carbon, diatomaceous earth, cellulose, or a combination thereof.
The use amount of the adsorbent is preferably 0.01 to 10 g, more preferably 0.1 to 1 g, with respect to 100 mL of the hydrophobic solvent extract from the viewpoint of preventing a decrease in the filtration rate. The temperature of the mixture of the hydrophobic solvent extract and the adsorbent during the adsorption treatment is preferably 0 to 80 ° C, and more preferably 20 to 65 ° C. The contact time between the hydrophobic solvent extract and the adsorbent is preferably 1 to 120 minutes, and more preferably 5 to 60 minutes. The pressure may be a reduced pressure or a normal pressure, but is preferably a reduced pressure from the viewpoint of oxidation inhibition and decolorization.
（工程（３））
本発明の方法における工程（３）は、前記工程（２）でアルカリ水溶液から分離して得られた疎水性溶媒抽出液を濾過する工程である。
本発明における濾過は、吸引濾過、加圧濾過、遠心濾過、自然濾過等の一般的な方法を用いることができる。濾過に用いるフィルターの大きさは、微生物を除去する観点から、微生物の大きさよりも小さいものが好ましい。例えば、目開き０．１〜１０μｍ、更に０．２〜１μｍが好ましい。
濾過フィルターの材質は、抽出で用いる有機溶剤に対して耐性のあるものであればよく、例えば四フッ化エチレンやナイロン、セルロースアセテート等の樹脂が挙げられる。
(Process (3))
Step (3) in the method of the present invention is a step of filtering the hydrophobic solvent extract obtained by separating from the alkaline aqueous solution in the step (2).
For the filtration in the present invention, general methods such as suction filtration, pressure filtration, centrifugal filtration, and natural filtration can be used. The size of the filter used for filtration is preferably smaller than the size of the microorganism from the viewpoint of removing the microorganism. For example, the aperture is preferably 0.1 to 10 μm, more preferably 0.2 to 1 μm.
The material of the filter is not particularly limited as long as it is resistant to the organic solvent used for extraction, and examples thereof include resins such as ethylene tetrafluoride, nylon, and cellulose acetate.
工程（３）によって得られた濾過液を、精製工程で通常行われる乾燥及び／又は晶析等することにより、高品質なジオール体を収率よく得ることができる。当該ジオール体は、粉末状、固体状、液体状等のいずれの形態であってもよい。
精製工程で乾燥を行う場合、その方法は特に制限されないが、乾燥温度は室温〜９０℃が好ましい。また、減圧乾燥を行ってもよい。
さらに、得られたジオール体は、酸性触媒、例えばｐ−トルエンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸クロリド、触媒量の硫酸又は酸性イオン交換体等を用いて、種々の溶媒中で脱水環化により化合物Ａに変換することができる。
上述のように、前記の工程（１）、（２）及び（３）によって、高品質の微生物醗酵生産物を効率良く得ることができる。
By subjecting the filtrate obtained in the step (3) to drying and / or crystallization usually performed in the purification step, a high-quality diol can be obtained with high yield. The diol body may be in any form such as powder, solid, and liquid.
When drying is performed in the purification step, the method is not particularly limited, but the drying temperature is preferably room temperature to 90 ° C. Moreover, you may dry under reduced pressure.
Furthermore, the obtained diol form is obtained by dehydration cyclization in various solvents using an acidic catalyst such as p-toluenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid chloride, a catalytic amount of sulfuric acid, or an acidic ion exchanger. A can be converted to A.
As described above, a high-quality microbial fermentation product can be efficiently obtained by the steps (1), (2) and (3).
本発明の態様及び好ましい実施態様を以下に示す。
＜１＞次の工程（１）、（２）及び（３）：
（１）消泡剤を含有する培地中で反応基質を微生物変換して得られる微生物醗酵生産物を、疎水性溶媒にて抽出する工程、
（２）工程（１）で得られた微生物醗酵生産物を含む疎水性溶媒抽出液とアルカリ水溶液を混合した後、疎水性溶媒抽出液をアルカリ水溶液から分離する工程、
（３）工程（２）でアルカリ水溶液から分離して得られた疎水性溶媒抽出液を濾過する工程、
を含む微生物醗酵生産物の製造方法。
Aspects and preferred embodiments of the present invention are shown below.
<1> Next steps (1), (2) and (3):
(1) A step of extracting a microbial fermentation product obtained by microbial conversion of a reaction substrate in a medium containing an antifoaming agent with a hydrophobic solvent,
(2) A step of separating the hydrophobic solvent extract from the aqueous alkaline solution after mixing the hydrophobic solvent extract containing the microbial fermentation product obtained in step (1) and the aqueous alkaline solution,
(3) A step of filtering the hydrophobic solvent extract obtained by separating from the alkaline aqueous solution in the step (2),
A method for producing a microbial fermentation product comprising
＜２＞アルカリ水溶液のアルカリの濃度が、好ましくは０．１ｍｏｌ／ｄｍ3以上、より好ましくは１ｍｏｌ／ｄｍ3以上であり、また、好ましくは１０ｍｏｌ／ｄｍ3以下、より好ましくは５ｍｏｌ／ｄｍ3以下である前記＜１＞に記載の微生物醗酵生産物の製造方法。
＜３＞アルカリが、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物、アンモニア及びアミン類から選ばれる１種又は２種以上であり、好ましくはアルカリ金属の水酸化物であり、より好ましくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はこれらの組み合わせであり、更に好ましくは水酸化ナトリウムである上記＜１＞又は＜２＞に記載の微生物醗酵生産物の製造方法。
＜４＞消泡剤が、シリコーン系消泡剤、動植物油系消泡剤、脂肪酸系消泡剤、脂肪酸エステル系消泡剤、又はアルコール系消泡剤であり、好ましくはシリコーン系消泡剤である上記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の微生物醗酵生産物の製造方法。
＜５＞消泡剤を培地中に０．５質量％以上、好ましくは０．７５質量％以上、また２質量％以下、好ましくは１．５質量％以下含む上記＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の微生物醗酵生産物の製造方法。
＜６＞培地が、界面活性剤、好ましくはノニオン性界面活性剤を含む上記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の微生物醗酵生産物の製造方法。
＜７＞疎水性溶媒が、ＳＰ値１４（ＭＰａ）1/2以上、好ましくは１５（ＭＰａ）1/2以上、より好ましくは１６（ＭＰａ）1/2以上、更に好ましくは１７（ＭＰａ）1/2以上、また、ＳＰ値１９（ＭＰａ）1/2以下、好ましくは１８．５（ＭＰａ）1/2以下の範囲内にある溶媒である上記＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の微生物醗酵生産物の製造方法。
＜８＞疎水性溶媒が、シクロヘキサン、４−メチル−２−ペンタノン、キシレン、トルエン及び酢酸エチルから選ばれる１種又は２種以上であり、好ましくはトルエンである上記＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の微生物醗酵生産物の製造方法。
＜９＞反応基質が、次の一般式（１ａ）及び／又は（１ｂ）
<2> The alkali concentration of the aqueous alkali solution is preferably 0.1 mol / dm 3 or more, more preferably 1 mol / dm 3 or more, and preferably 10 mol / dm 3 or less, more preferably 5 mol / dm 3 or less. The method for producing a microbial fermentation product according to <1>, wherein
<3> The alkali is one or more selected from hydroxides of alkali metals or alkaline earth metals, ammonia and amines, preferably alkali metal hydroxides, more preferably hydroxylated The method for producing a microbial fermentation product according to <1> or <2> above, which is sodium, potassium hydroxide, or a combination thereof, and more preferably sodium hydroxide.
<4> The antifoaming agent is a silicone-based antifoaming agent, an animal or vegetable oil-based antifoaming agent, a fatty acid-based antifoaming agent, a fatty acid ester-based antifoaming agent, or an alcohol-based antifoaming agent, preferably a silicone-based antifoaming agent. The method for producing a microbial fermentation product according to any one of <1> to <3> above.
<5> The antifoaming agent according to the above <1> to <4>, containing 0.5% by mass or more, preferably 0.75% by mass or more, and 2% by mass or less, preferably 1.5% by mass or less The manufacturing method of the microbial fermentation product in any one.
<6> The method for producing a microbial fermentation product according to any one of <1> to <5>, wherein the medium contains a surfactant, preferably a nonionic surfactant.
<7> The hydrophobic solvent has an SP value of 14 (MPa) 1/2 or more, preferably 15 (MPa) 1/2 or more, more preferably 16 (MPa) 1/2 or more, and further preferably 17 (MPa) 1. / 2 or more, also, SP value 19 (MPa) 1/2 or less, preferably according to any one of 18.5 above the solvent that is in the range (MPa) 1/2 or less of <1> to <6> Of producing a microbial fermentation product.
<8> The hydrophobic solvent is one or more selected from cyclohexane, 4-methyl-2-pentanone, xylene, toluene, and ethyl acetate, preferably toluene. The manufacturing method of the microbial fermentation product in any one.
<9> The reaction substrate is represented by the following general formula (1a) and / or (1b)
で表される化合物であり、製造される微生物醗酵生産物が次の式（２） The microbial fermentation product produced by the compound represented by the following formula (2)
で表される１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オールである上記＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の微生物醗酵生産物の製造方法。
＜１０＞微生物が、子嚢菌綱（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物又は担子菌綱（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物であり、好ましくは子嚢菌綱（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物であり、より好ましくはハイホジーマ（Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ）属に属する微生物である上記＜９＞に記載の微生物醗酵生産物の製造方法。
The microbial fermentation product according to any one of <1> to <8>, which is 1- (2-hydroxyethyl) -2,5,5,8a-tetramethyldecahydronaphthalen-2-ol represented by the formula: Manufacturing method.
<10> The microorganism is a microorganism belonging to the Ascomycetes class or a microorganism belonging to the Basidiomycetes class, preferably a microorganism belonging to the Ascomycetes class, more preferably a genus Hyphozyma. The method for producing a microbial fermentation product according to <9>, wherein the microorganism is a microorganism belonging to the above.
＜ジオール体及びスクラレオールの分析方法＞
培養液５００μＬに酢酸エチル１０００μＬを添加し、室温で激しく撹拌後、遠心分離（１５０００ｒ／ｍｉｎ、２５℃、３分間）を行い、酢酸エチル層のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析でジオール体とスクラレオールの濃度を算出した。また、トルエン層のジオール体濃度をＧＣにて分析した。条件は下記のとおりである。
装置：Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７８９０Ａ
カラム：ＤＢ−ＷＡＸ（Ｊ＆Ｗ製）、１０ｍ×１００μｍ×０．１μｍ
注入口温度：２５０℃
オーブン温度：２００℃→（昇温１０℃／分）→２５０℃（５分間保持）
キャリアガス：Ｈｅ
注入法：スプリットモード（スプリット比１００：１）
圧力：５７．０９ｐｓｉ
トータルフロー：４３．４１ｍＬ／ｍｉｎ
カラム流量：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１μＬ
検出器：ＦＩＤ
検出器温度：２５０℃
<Analytical method of diol and sclareol>
Add 1000 μL of ethyl acetate to 500 μL of the culture, stir vigorously at room temperature, perform centrifugation (15000 r / min, 25 ° C., 3 minutes), and analyze the diol and sclareol by gas chromatography (GC) analysis of the ethyl acetate layer. Concentration was calculated. Moreover, the diol body density | concentration of a toluene layer was analyzed by GC. The conditions are as follows.
Equipment: Agilent technology 7890A
Column: DB-WAX (manufactured by J & W), 10 m × 100 μm × 0.1 μm
Inlet temperature: 250 ° C
Oven temperature: 200 ° C. → (temperature increase 10 ° C./min)→250° C. (hold for 5 minutes)
Carrier gas: He
Injection method: split mode (split ratio 100: 1)
Pressure: 57.09 psi
Total flow: 43.41 mL / min
Column flow rate: 0.4 mL / min
Injection volume: 1 μL
Detector: FID
Detector temperature: 250 ° C
[濾過速度の算出方法]
疎水性溶媒抽出液５０ｇを親水性ＰＴＦＥフィルター（アドバンテック製、直径４７ｍｍ、孔径１μｍ、品名：H100A047A）で、常圧にて濾過し、濾液が３０ｇ得られるまでの濾過時間を測定し、１分間あたりの濾液回収量を濾過速度とした。
[Calculation method of filtration rate]
50 g of the hydrophobic solvent extract was filtered with a hydrophilic PTFE filter (manufactured by Advantech, diameter 47 mm, pore size 1 μm, product name: H100A047A) at normal pressure, and the filtration time until 30 g of filtrate was obtained was measured per minute. The filtrate recovery amount was taken as the filtration rate.
［ジオール体収量の算出方法］
濾液３０ｇに含まれるジオール体の量を測定し、濾過１分間あたりのジオール体の回収量を求めた。
[Calculation method of diol yield]
The amount of the diol body contained in 30 g of the filtrate was measured, and the recovered amount of the diol body per minute of filtration was determined.
実施例１
Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ ｓｐ．ＫＳＭ−ＪＬ２８４２（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７５９）株を２．１％ＹＭブロスに１白金耳植菌し、２５℃にて３日間振盪培養したものを種菌とした。次いで、２．１％ＹＭブロス、０．１％硫酸マグネシウムからなる培地に種菌を０．３％植菌し、三角フラスコにて液温２４℃、攪拌速度２００ｒ／ｍｉｎにて３日間通気培養を行った。その後、培地に、１０％Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）、２０％スクラレオールからなる基質を培地中のスクラレオール濃度が３．８７％になるように添加し、同条件で１１日間培養を行った。基質添加から７日後に消泡剤（ＫＭ−７２Ｆ、信越シリコーン製）を培地に対して１％添加した。ｐＨは成り行きとした。
得られた培養液を分析したところ、ジオール体２．７％、スクラレオール０．２４％、その他水分と固形分（菌体等）が含まれていた。
Example 1
Ascomycete sp. KSM-JL2842 (FERM P-20759) strain was inoculated with 1 platinum ear in 2.1% YM broth and shake-cultured at 25 ° C. for 3 days as a seed. Next, 0.3% inoculum was inoculated in a medium consisting of 2.1% YM broth and 0.1% magnesium sulfate, and aerated culture was performed in an Erlenmeyer flask at a liquid temperature of 24 ° C. and a stirring speed of 200 r / min for 3 days. went. Thereafter, a substrate comprising 10% Tween 80 (registered trademark) and 20% sclareol was added to the medium so that the sclareol concentration in the medium was 3.87%, and the cells were cultured under the same conditions for 11 days. Seven days after the addition of the substrate, 1% of an antifoaming agent (KM-72F, manufactured by Shin-Etsu Silicone) was added to the medium. The pH was expected.
When the obtained culture broth was analyzed, diol body 2.7%, sclareol 0.24%, other moisture and solid content (bacteria etc.) were contained.
前記培養液３０ｇにトルエン２６５ｇ（培養液１００ｍＬに対しトルエン１０２３ｍＬ）を加え、攪拌速度４００ｒ／ｍｉｎ、２５℃で６０分間混合した後、６０分間静置してトルエン層をと水相を分層させ、トルエン層を得た。 265 g of toluene (1023 mL of toluene with respect to 100 mL of the culture solution) was added to 30 g of the culture solution, and the mixture was stirred for 60 minutes at a stirring speed of 400 r / min and 25 ° C. A toluene layer was obtained.
次いで、トルエン層５０ｇに、０．１ｍｏｌ／ｄｍ3水酸化ナトリウム水溶液５．７ｍＬを添加し（トルエン層１００ｍＬに対し水酸化ナトリウム水溶液９．８ｍＬ）、攪拌速度４００ｒ／ｍｉｎ、２５℃で６０分間混合した後、２５℃で６０分間静置してトルエン層と水酸化ナトリウム水溶液層を分層させ、トルエン層を得た。 Next, 5.7 mL of a 0.1 mol / dm 3 sodium hydroxide aqueous solution was added to 50 g of the toluene layer (9.8 mL of sodium hydroxide aqueous solution with respect to 100 mL of the toluene layer), and mixing was performed at 25 ° C. for 60 minutes at a stirring speed of 400 r / min. Then, the mixture was allowed to stand at 25 ° C. for 60 minutes to separate the toluene layer and the sodium hydroxide aqueous solution layer to obtain a toluene layer.
分取したトルエン層５０ｇを親水性ＰＴＦＥフィルター（アドバンテック製、直径４７ｍｍ、孔径１μｍ）で濾過し、濾液３０ｇを回収した。 50 g of the collected toluene layer was filtered with a hydrophilic PTFE filter (manufactured by Advantech, diameter 47 mm, pore diameter 1 μm), and 30 g of filtrate was collected.
実施例２〜５
培地に対して表１に示す量の消泡剤を添加し、また、表１に示す濃度のアルカリ水溶液を使用した以外は実施例１と同様にしてトルエン層を得た。分取したトルエン層５０ｇを実施例１と同様に濾過し、濾液３０ｇを回収した。
Examples 2-5
A toluene layer was obtained in the same manner as in Example 1 except that an antifoaming agent in an amount shown in Table 1 was added to the medium, and an alkaline aqueous solution having a concentration shown in Table 1 was used. 50 g of the collected toluene layer was filtered in the same manner as in Example 1, and 30 g of the filtrate was recovered.
参考例
微生物変換において培地に消泡剤を添加せず、また、アルカリ水溶液を使用しなかった以外は実施例１と同様にしてトルエン層を得た。トルエン層５０ｇを実施例１と同様に濾過し、濾液３０ｇを回収した。
Reference Example A toluene layer was obtained in the same manner as in Example 1 except that no antifoaming agent was added to the medium in the microbial conversion and no alkaline aqueous solution was used. 50 g of the toluene layer was filtered in the same manner as in Example 1, and 30 g of the filtrate was recovered.
比較例１〜２
培地に対して表１に示す量の消泡剤を添加し、また、アルカリ水溶液を使用しなかった以外は実施例１と同様にしてトルエン層を得た。トルエン層５０ｇを実施例１と同様に濾過し、濾液３０ｇを回収した。
Comparative Examples 1-2
A toluene layer was obtained in the same manner as in Example 1 except that the amount of antifoaming agent shown in Table 1 was added to the medium, and an alkaline aqueous solution was not used. 50 g of the toluene layer was filtered in the same manner as in Example 1, and 30 g of the filtrate was recovered.
比較例３
培地に対して表１に示す量の消泡剤を添加し、また、アルカリ水溶液に代えて水を使用した以外は実施例１と同様にしてトルエン層を得た。分取したトルエン層５０ｇを実施例１と同様に濾過し、濾液３０ｇを回収した。
各実施例及び比較例の条件と結果を表１に示す。
Comparative Example 3
A toluene layer was obtained in the same manner as in Example 1 except that the amount of antifoaming agent shown in Table 1 was added to the medium, and water was used instead of the alkaline aqueous solution. 50 g of the collected toluene layer was filtered in the same manner as in Example 1, and 30 g of the filtrate was recovered.
Table 1 shows the conditions and results of each Example and Comparative Example.
表１から明らかなように、培地に消泡剤を添加して微生物変換を行うと濾過速度の低下が見られ、単位時間あたりのジオール体の収量は少なくなった。他方、本発明の方法によれば、濾過速度の低下を抑えられ、ジオール体を効率良く得ることができた。また、アルカリ水溶液を混合する前と混合した後で、トルエン層中のジオール体濃度に大きな変化は見られなかった。 As is apparent from Table 1, when microbial conversion was carried out by adding an antifoaming agent to the medium, the filtration rate was reduced, and the yield of diol was reduced per unit time. On the other hand, according to the method of the present invention, a decrease in filtration rate was suppressed, and a diol body could be obtained efficiently. Moreover, the big change was not seen by the diol body density | concentration in a toluene layer after mixing before and after mixing aqueous alkali solution.
Claims (8)
（１）消泡剤を含有する培地中で反応基質を微生物変換して得られる微生物醗酵生産物を、疎水性溶媒にて抽出する工程、
（２）工程（１）で得られた微生物醗酵生産物を含む疎水性溶媒抽出液をアルカリ水溶液と混合した後、疎水性溶媒抽出液をアルカリ水溶液から分離する工程、
（３）工程（２）でアルカリ水溶液から分離して得られた疎水性溶媒抽出液を濾過する工程、
を含む微生物醗酵生産物の製造方法。 Next steps (1), (2) and (3):
(1) A step of extracting a microbial fermentation product obtained by microbial conversion of a reaction substrate in a medium containing an antifoaming agent with a hydrophobic solvent,
(2) A step of separating the hydrophobic solvent extract from the aqueous alkaline solution after mixing the hydrophobic solvent extract containing the microbial fermentation product obtained in step (1) with the aqueous alkaline solution,
(3) A step of filtering the hydrophobic solvent extract obtained by separating from the alkaline aqueous solution in the step (2),
A method for producing a microbial fermentation product comprising
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