JP2014064579A - 毒性分子に対する抗毒性蛋白質をコードする配列を含む組換体クローンの選択方法 - Google Patents

毒性分子に対する抗毒性蛋白質をコードする配列を含む組換体クローンの選択方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2014064579A
JP2014064579A JP2013231763A JP2013231763A JP2014064579A JP 2014064579 A JP2014064579 A JP 2014064579A JP 2013231763 A JP2013231763 A JP 2013231763A JP 2013231763 A JP2013231763 A JP 2013231763A JP 2014064579 A JP2014064579 A JP 2014064579A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
toxic
nucleotide sequence
recombinant
antitoxic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2013231763A
Other languages
English (en)
Inventor
Philippe Gabant
ギャバン，フィリップ
Melderen Laurence Van
ヴァン，メルダレン，ローレンス
Yves Szpirer Cedric
スパイラー，セドリック，イーブ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Libre de Bruxelles ULB
Original Assignee
Universite Libre de Bruxelles ULB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Libre de Bruxelles ULB filed Critical Universite Libre de Bruxelles ULB
Publication of JP2014064579A publication Critical patent/JP2014064579A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

【課題】毒性分子に対する抗毒性蛋白質をコードする配列を含む組換体クローンの選択方法の提供。
【解決手段】毒性蛋白質をコードする第１組換えヌクレオチド配列が染色体ＤＮＡ中に組込まれた組換体原核細胞であって、前記第１組換えヌクレオチド配列の発現は毒性蛋白質に対する抗毒性蛋白質によって抑制および／または制御されており、前記抗毒性蛋白質は前記細胞中にもたらされる第２ヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする組換体原核細胞。
【選択図】なし

Description

本発明は組換えＤＮＡ技術の分野に属する。
より正確には、本発明は、毒性分子に対する抗毒性蛋白質をコードする配列を含む組換体クローンを選択するための方法、核酸のコンストラクト、ベクターおよび細胞に係わる。
組換体の選択を行わずに、放射性同位体標識プローブを用いたハイブリッド形成、小規模なプラスミドの制限作用によるスクリーニングまたはＸ−Ｇａｌの存在下でのα相補性の不活性化に基づくスクリーニング（ブルー／ホワイト・スクリーニング）による識別に時間をかけることによってＤＮＡインサートをクローニングすることは可能である。
１０年以上前から採用されているこのようなアプローチでは、完全なゲノム配列決定プログラムにつながる大規模なクローニングプロジェクトには対応できない。入手可能な配列情報は今後ますます増大する。
同定されたコード配列の生物学的機能を解析するには、生物のゲノムに存在する対応遺伝子を特異的に変異（欠失または修飾）（例えば、ノックアウト・マウスにおいて）させなければならず、それによって導入された変異に関連する表現型を調べることができる。変異の特異性は、相同な組換アームを含む（大腸菌中で構築された）標的ベクターによってもたらされる。
配列決定技術が発展して、配列が決定した遺伝子の数が激増してもなお、組換体クローンを得て対応遺伝子の機能に関する情報を得るための大規模な遺伝子のクローニングおよびサブクローニングが、機能的なゲノム・プログラムの律速段階である。
それぞれの遺伝子のクローニングおよびサブクローニングは“機能的なゲノム”プログラムの障壁である。従って、これらの処理をスピードアップできる新規のクローニング法が必要である。
組換体の確認が律速段階であるから、組換体のポジティブ選択が、従来の方法から数千個の遺伝子の取り扱いを可能にする高処理能力のクローニングへ移行する必要があることは明白である。
組換体菌株の直接選択（ポジティブ選択）を可能にするクローニングベクターは既に提案されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。但し、多くのクローニングベクターには以下の欠点がある：（ｉ）大きいヌクレオチド断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の挿入には利用できない、（ｉｉ）マニピュレート（ｍａｎｉｐｕｌａｔｅ）が容易ではない、（ｉｉｉ）微生物の死を伴うことなく、多数のコピーを微生物に生成させることができない。
また、公知の制限酵素反応および連結酵素（ｌｉｇａｓｅ）反応の代わりに、部位−特異的な組換え法を採用することができ、目的のインサートによるｃｃｄＢ遺伝子（毒素／抗毒素遺伝子ファミリーの一員）の置換によって組換え体を選択することができる（米国特許第５，９１０，４３８号明細書（特許文献１）、米国特許第６，１８０，４０７号明細書（特許文献２）および国際公開ＷＯ ９９／５８６５２号パンフレット（特許文献３））。
他のポジティブ選択システムと比較した場合のＣｃｄＢ遺伝子含有ベクターの主な長所は、ｉ）選択遺伝子のサイズが小さいこと（ｃｃｄＢ：３０３ｂｐ）、ｉｉ）ＣｃｄＢ毒に対する総抵抗性をもたらす変異を含む宿主中でベクターを増幅させることができるということ（ｇｙｒＡ４６２抵抗性菌株；Ｂｅｒｎａｒｄ ａｎｄ Ｃｏｕｔｕｒｉｅｒ，１９９２）。大腸菌は、多くのモレキュラークローニングストラテジーにおいて使用される宿主であるから、クローニングの可能性を高め、拡大することができる新規のシステムを開発することが重要である。ＣｃｄＢ遺伝子を使用するポジティブ選択技術は、特定の目的に合う新規のベクターを得るために用いられている：ＰＣＲクローニングベクター（Ｇａｂａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、細菌遺伝学用のベクター（Ｇａｂａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、また、最近では、ＣｃｄＢファミリーに属するｋｉｄ遺伝子が新規のクローニングベクターの設計に使用されている（Ｇａｂａｎｔ ｅｔ ａｌ．，２０００および国際公開ＷＯ０１／４６４４４号パンフレット（特許文献４））。
ＣｃｄＢ遺伝子を使用する他の例が米国特許第５，８８８，７３２号明細書（特許文献５）に開示されている。この文献は“ゲートウェイシステム（Ｇａｔｅｗａｙ ｓｙｓｔｅｍ）”として知られているクローニング法の原理を開示している。この方法では、従来の制限酵素反応および連結酵素（ｌｉｇａｓｅ）反応の代わりに部位−特異的な組換え法を採用し、ｃｃｄＢ遺伝子を目的の遺伝子によって不活性化（欠失）させることにより組換体を選択する。この方法は自動的なサブクローニングにより生物のすべての遺伝子をある１つのベクターから別のベクター（即ち、発現ベクター）へ迅速且つ効率的に転移させることができる。得られるサブクローンは翻訳融合を可能にする位置付けおよび読み枠を維持する。（総論については、Ｈａｒｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０００を参照）。
但し、前記技術は、ｒｐｓｌ，ｔｅｔＲ，ｓａｃＢ，またはｃｃｄＢといった逆選択遺伝子を使用する必要のある逆選択遺伝子に基づく技術であり、これによって第１ラウンド組換えからの“傷”を持ち込んでいないシームレスな第２ラウンド生成物を得ることができる。
逆選択（毒性遺伝子の不活性化または欠失のための選択）は、多くの場合、ポジティブ選択（新しい性質の獲得）よりも効率が悪い。意図される組換えは逆選択の淘汰圧に対する解決策のうちの１つに過ぎないからである。逆選択可能な遺伝子の発現を消すような突然変異もまた逆選択の淘汰圧下において発生する。
このように、稀な遺伝学的事象（頻度が逆選択可能な遺伝子の突然変異による不活性化に匹敵する）に対しては、第２ラウンド逆選択方法から得られる候補をスクリーニングすることによって意図された組換え事象を発見する必要がある。
実際、理由は不明であるが、意図する生成物と意図しない生成物との比は広い範囲（＜１％ないし１５％−８５％）で変動する（Ｍｕｙｒｅｒｓ Ｇ．Ｐ．Ｐ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．２６，ｎｏ．５，ｐ．３２５−３３１，２００１（非特許文献１））。
米国特許第５，９１０，４３８号明細書 米国特許第６，１８０，４０７号明細書 国際公開ＷＯ９９／５８６５２号パンフレット 国際公開ＷＯ０１／４６４４４号パンフレット 特許第５，８８８，７３２号明細書 Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．２６，ｎｏ．５，ｐ．３２５−３３１，２００１
本発明は従来技術の欠点を伴わず、組換体クローンの改良されたポジティブ選択を可能にする改良された新規の方法および生成物を提供することにある。
本発明の目的の１つは、稀な遺伝学的事象の選択、特に、長いＤＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）が組み込まれた組換体クローンの選択を可能にする前記方法および生成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記ポジティブ選択に使用される細胞において抵抗性変異が発生しても、これに全く影響されないか、またはほとんど影響されない方法および生成物を提案することにある。
本発明は、以下の（１）〜（１９）の構成を有するものである。
［１］目的の遺伝子（６）と、毒性分子（５）に対して機能する抗毒性蛋白質（４）をコードするヌクレオチド配列（３）とが組み込まれた組換体クローンの選択方法であって、前記組換体クローンが、前記毒性分子（５）をコードするヌクレオチド配列（２１）をそのゲノム中に含む宿主細胞（２０）に組み込んだ後も生き残る組換体クローンであることを特徴とする前記方法。
［２］抗毒性蛋白質（４）および毒性分子（５）がそれぞれ抗毒素蛋白質および毒素蛋白質であることを特徴とする［１］に記載の方法。
［３］抗毒素蛋白質および毒素蛋白質が、以下の組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする［２］に記載の方法。：ＣｃｄＡ蛋白質／ＣｃｄＢ蛋白質、Ｋｉｓ蛋白質／Ｋｉｄ蛋白質、Ｐｈｄ蛋白質／Ｄｏｃ蛋白質、ＳｏＫ蛋白質／ＨｏＫ蛋白質、ＲｅｌＢ蛋白質／ｒｅｌＥ蛋白質、ＰａｓＢ蛋白質（またはＰａｓＣ蛋白質）／ＰａｓＡ蛋白質、ｍａｚＦ蛋白質／ｍａｚＥ蛋白質、その他のプラスミド由来か或いはプラスミド由来ではない抗毒素蛋白質／毒素蛋白質。
［４］毒性分子（５）に対する抗毒性蛋白質（４）をコードするヌクレオチド配列（３）、目的の遺伝子（６）または前記目的の遺伝子が組み込まれるための部位とから成るカセット配列（２）を含む核酸のコンストラクトであって、前記カセット配列（２）が第１組換え部位（７）と第２組換え部位（８）との間に介在することを特徴とする核酸のコンストラクト（１）。
［５］抗毒性蛋白質（４）をコードするヌクレオチド配列（３）が不活性の抗毒性蛋白質（４）をコードする少なくとも１個のヌクレオチドを含み、目的の遺伝子（６）がカセット配列（２）に正しく組み込まれた後、前記抗毒性蛋白質（４）が機能的な抗毒性蛋白質（４）として再構成されることを特徴とする［４］に記載の核酸のコンストラクト（１）。
［６］抗毒性蛋白質（４）および毒性分子（５）がそれぞれ抗毒素蛋白質および毒素蛋白質であることを特徴とする［４］または［５］に記載の核酸のコンストラクト（１）。
［７］抗毒素蛋白質および毒素蛋白質を、以下の組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする［６］に記載の核酸のコンストラクト（１）：ＣｃｄＡ蛋白質／ＣｃｄＢ蛋白質、Ｋｉｓ蛋白質／Ｋｉｄ蛋白質、Ｐｈｄ蛋白質／Ｄｏｃ蛋白質、ＳｏＫ蛋白質／ＨｏＫ蛋白質、ＲｅｌＢ蛋白質／ｒｅｌＥ蛋白質、ＰａｓＢ蛋白質（またはＰａｓＣ蛋白質）／ＰａｓＡ蛋白質、ｍａｚＦ蛋白質／ｍａｚＥ蛋白質、その他のプラスミド由来か或いはプラスミド由来ではない抗毒素蛋白質／毒素蛋白質。
［８］目的の遺伝子（６）の挿入部位を含むヌクレオチド配列が毒性分子をコードするヌクレオチド配列であることを特徴とする［４］乃至［７］のいずれかに記載の核酸のコンストラクト。
［９］抗毒性蛋白質（４）をコードするヌクレオチド配列（３）または目的の遺伝子（６）がプロモーター／オペレーター配列（９）につながれていることを特徴とする［４］乃至［８］のいずれかに記載の核酸のコンストラクト（１）。
［１０］第１組換え部位（７）および第２組換え部位（８）がファージλ由来のａｔｔ部位であることを特徴とする［４］乃至［９］のいずれか１項に記載の核酸のコンストラクト。
［１１］［４］乃至［１０］のいずれかに記載の核酸のコンストラクトを含むことを特徴とするベクター。
［１２］自己複製ベクター、好ましくはウィルスまたはプラスミド・ベクターであることを特徴とする［１１］に記載のベクター。
［１３］ベクター・ドナーＤＮＡ分子（１０）であることを特徴とする［１１］に記載のベクター。
［１４］少なくとも１個の選択マーカーを含む第１ＤＮＡ断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）および／または第２ＤＮＡ断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）から成るベクター・ドナーＤＮＡ分子（１０）であって、前記第１または第２ＤＮＡ断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）は、互いに再結合することのない少なくとも第１組換え部位と第２組換え部位とによって挟まれており、選択マーカーが、毒性分子に対する抗毒性蛋白質をコードするヌクレオチド配列であることを特徴とするベクター・ドナーＤＮＡ分子（１０）。
［１５］選択マーカーが、毒素蛋白質に対する抗毒素蛋白質をコードするヌクレオチド配列であることを特徴とする［１４］に記載のベクター。
［１６］抗毒素蛋白質および毒素蛋白質が、以下の組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする［１５］に記載のベクター：ＣｃｄＡ蛋白質／ＣｃｄＢ蛋白質、Ｋｉｓ蛋白質／Ｋｉｄ蛋白質、Ｐｈｄ蛋白質／Ｄｏｃ蛋白質、ＳｏＫ蛋白質／ＨｏＫ蛋白質、ＲｅｌＢ蛋白質／ｒｅｌＥ蛋白質、ＰａｓＢ蛋白質（またはＰａｓＣ蛋白質）／ＰａｓＡ蛋白質、ｍａｚＦ蛋白質／ｍａｚＥ蛋白質、その他のプラスミド由来か或いはプラスミド由来ではない抗毒素蛋白質／毒素蛋白質。
［１７］［４］乃至［１６］のいずれかに記載のベクターまたは核酸のコンストラクトのための宿主細胞（２０）であって、前記細胞（２０）が、その染色体ＤＮＡ中に組み込まれた毒性分子（５）をコードする少なくとも１つの第１ヌクレオチド配列（２１）を有しており、前記第１ヌクレオチド配列が、好ましくは抑制的なプロモーター／オペレーター・ヌクレオチド配列の制御下にあり、且つ／または前記毒性分子に対する抗毒性蛋白質をコードする第２ヌクレオチド配列によって制御され、前記第２ヌクレオチド配列が、好ましくは抑制的なプロモーター／オペレーター・ヌクレオチド配列の制御下で抑制され得ることを特徴とする前記宿主細胞（２０）。
［１８］寄託番号ＬＭＧＰ−２１３９９号の細胞であることを特徴とする［１２］に記載の細胞。
［１９］［４］乃至［１０］のいずれかに記載の核酸のコンストラクト、［１１］乃至［１６］のいずれかに記載のベクターおよび／または［１７］または［１８］に記載の細胞および、或いは、インサート・ドナーＤＮＡ分子（１１）から成るクローニングキットおよび／または配列決定キットであって、互いに再結合することのない少なくとも第１組換え部位と、場合によっては第２組換え部位とに挟まれた第１ＤＮＡ断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）を含むことを特徴とする前記キット。
第１の本発明は、目的の遺伝子と、（細胞、好ましくは原核細胞に対する）毒性分子に対して機能する抗毒性蛋白質をコードするヌクレオチド配列とが組み込まれた組換体クローンの選択方法に係わり、その組換体クローンは、毒性分子をコードするヌクレオチド配列をそのゲノム中に含む宿主細胞に組み込んだ後も生き残る組換体クローンである。
また、本発明は、前記方法を実施するのに使用される生成物、特に、（細胞、好ましくは原核細胞に対しての）毒性分子に対する抗毒性蛋白質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、目的の遺伝子または目的の遺伝子の挿入部位（好ましくは、前記挿入部位は抗毒性蛋白質をコードするヌクレオチド配列中には存在しない）とから成る少なくとも１つのカセット・ヌクレオチド配列を含む核酸のコンストラクトに係わる。尚、前記カセット・ヌクレオチド配列は、前記核酸のコンストラクトにおいて第１組換え部位と第２組換え部位との間に介在する（前記第１組換え部位と前記第２組換え部位とは互いに再結合することはない）。
本発明の好ましい実施例では、抗毒性蛋白質と毒性分子がそれぞれ抗毒素蛋白質と毒素蛋白質である。前記抗毒性蛋白質または毒素蛋白質は、野生型の蛋白質でも改変された蛋白質でもよく、生来的または人工的に毒性を有し、細胞（好ましくは原核細胞）の１つまたは２つ以上の生体機能に影響を与えて細胞死を引き起こすものである。
抗毒性蛋白質および毒性分子は、好ましくは、ＣｃｄＡ蛋白質／ＣｃｄＢ蛋白質、Ｋｉｓ蛋白質／Ｋｉｄ蛋白質、Ｐｈｄ蛋白質／Ｄｏｃ蛋白質、ＳｏＫ蛋白質／ＨｏＫ蛋白質、ＲｅｌＢ蛋白質／ｒｅｌＥ蛋白質、ＰａｓＢ蛋白質（またはＰａｓＣ蛋白質）／ＰａｓＡ蛋白質、ｍａｚＦ蛋白質／ｍａｚＥ蛋白質、その他のプラスミド由来か或いはプラスミド由来ではない抗毒素蛋白質／毒素蛋白質の組み合わせから成る群から選択される。
毒性分子は、生来的または人工的に毒性を有し、（原核）細胞の１つまたは２つ以上の生体機能に影響を与える毒素蛋白質であってもよい。
（枯草菌からの）ｓａｃＢ遺伝子がコードする蛋白質、ＧｐＥ蛋白質、ＧＡＴＡ−１蛋白質およびＣｒｐ蛋白質は、そのような毒性分子の他の例である。
ｓａｃＢ遺伝子は、スクロースを大腸菌に対して有毒な生成物に加水分解する反応を触媒するレバン・スクラーゼ（ｔｈｅ ｌｅｖａｎ ｓｕｃｒａｓｅ）をコードしている（Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．８９，Ｎｏ６（１９９２）ｐ．２０５６−２０６０）。６つのユニーク（ｕｎｉｑｕｅ）な制限酵素切断部位を含むバクテリオファージｊＸ１７４からのＥ遺伝子が、大腸菌細胞の溶菌を引き起こす蛋白質ｇｐＥをコードしている。（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．４２ ｎｏ３（１９８６）ｐ．３４５−３４９）。蛋白質ＧＡＴＡ−１は、トゥルーデルら（Ｔｒｕｄｅｌ ｅｔ ａｌ．）によって説明されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９６，Ｖｏｌ．２０（４），ｐ．６８４−６９３）。蛋白質ＣｒＰはシュリーパーら（Ｓｃｈｌｉｅｐｅｒ ｅｔ ａｌ．）によって説明されている（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，Ｖｏｌ．２５７（２），ｐ．２０３−２０９）。
前記毒性分子に対する抗毒性蛋白質とは、対応する毒性分子が細胞（好ましくは原核細胞）によって生成されたとき、前記細胞に対する前記毒性分子の効果を軽減または抑制することができるどんな蛋白質でもよい。
本発明の他の好ましい実施例では、抗毒性蛋白質をコードするヌクレオチド配列が、目的の遺伝子がカセット配列に正しく組み込まれると活性化（機能的）され得る不活性な抗毒性蛋白質をコードする第１ヌクレオチド断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）である。
好ましくは、本発明の核酸のコンストラクト中に存在するカセット配列が、構成的に、または目的の遺伝子（インサート）の挿入の後に、または組換え事象によって発現させ得る抗毒性蛋白質を発現させるためのプロモーター／オペレーター配列をも含む。
例えば、目的の遺伝子（インサート）が抗毒性蛋白質の発現を可能にする転写信号および／または翻訳信号を含む配列を有しているとき、または目的の遺伝子が挿入または組換え事象によって他の抗毒性分子の配列、その一部またはそのＣ−転写信号または翻訳信号と一体化しているときに、抗毒活性が得られる。
前記のメカニズムにより、目的の遺伝子が核酸のコンストラクト内へ正しく挿入されたものが有利に選択され得る。
前記目的の遺伝子は、前記抗毒性蛋白質の発現を可能にするか或いは高めるプロモーター／アクティベーター配列をも含むか、または前記抗毒性蛋白質を機能的（毒性分子に対して活性）にするために、前記抗毒性蛋白質の第１ヌクレオチド断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）を補完する第２ヌクレオチド断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含んでいてもよい。
本発明の他の実施例では、目的の遺伝子の挿入部位が、組換え部位、或いは１つまたは２つ以上の制限酵素によって特異的に切断されるヌクレオチド配列のようなクローニング部位である。
前記目的の遺伝子の挿入部位が、毒性分子、好ましくは毒素蛋白質をコードするヌクレオチド配列中に含まれていると好都合である。従って、本発明の核酸のコンストラクトは、まず第一に、（毒性分子をコードするヌクレオチド配列中に目的の遺伝子を組み込んで前記配列を不活化する）ネガティブ選択に基づき、第二に、（抗毒性蛋白質の発現を可能にする）ポジティブ選択に基づいている。
この二つの選択により、本発明の核酸のコンストラクトへの極めて長いＤＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の組み込みというような稀な遺伝学的事象を伴う組換体クローンの改良された選択が可能になる。
本発明の核酸のコンストラクトにおいて、組換えによって識別される第１および第２組換え部位は、好ましくは、ファージｌ由来のａｔｔ部位（Ｐｔａｓｈｎｅら（Ｐｔａｓｈｎｅ Ｍ． ｅｔ ａｌ．）によって説明されているような特異的な組換え部位である（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｗｉｔｃｈ，Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９９２））。好ましくは、前記ａｔｔ部位は、ランディら（Ｌａｎｄｙ Ａ．ｅｔ ａｌ．）によって説明されている方法で本発明の核酸のコンストラクトに組み込まれる（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．５８，ｐ．９１３，１９８９）。
但し、その他のタイプの組換え部位が本発明の核酸のコンストラクトに組み込まれていてもよい。
また、本発明は、本発明の核酸のコンストラクトを含むベクター（例えば、プラスミド、バクテリオファージ、ウィルス、陽イオン小胞のような自己複製ベクターまたはその他のタイプのベクター）にも係わる。
本発明の好ましい実施例は、第１ＤＮＡ断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）と第２ＤＮＡ断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）とから成るベクター・ドナーＤＮＡ分子に係わり、前記第１および第２ＤＮＡ断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）は、選択マーカーとして、毒性分子に対する抗毒性蛋白質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、前記第１および第２ＤＮＡ断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）は、互いに再結合することのない少なくとも第１および第２組換え部位によって挟まれている。
本発明のベクターＤＮＡ分子中の前記選択マーカーはまた、少なくとも１つの抗毒性分子の配列の不活性断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）をも含んでいてもよく、前記第１および第２組換え部位にわたって、前記選択マーカーの不活性断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含むさらなるＤＮＡ断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）（抗毒性分子の配列の他の断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ））と組み換えられることによって機能的な選択マーカーが得られる。
ベクター・ドナーＤＮＡ分子において、組み換え部位は、上記組み換え部位、好ましくは、米国特許第５，８８８，７３２号明細書に記載されているような種々の組み換え部位から成る群から選択される。
本発明のベクター・ドナーＤＮＡ分子は、インサート・ドナーＤＮＡ分子と組合わせて、複数の部品（ｐａｒｔｓ）からなるキット（ｋｉｔ）（好ましくは、クローニングキット）とするのが好都合であり、前記インサート・ドナーＤＮＡ分子は、互いに再結合することのない第１および第２組換え部位によって挟まれた第１ＤＮＡ配列を含む。前記インサートＤＮＡ分子の特徴は、参考のためここに引用する米国特許第５，８８８，７３２号明細書および国際公開ＷＯ９９／２１９７７号、ＷＯ０１／３１０３９号、ＷＯ０１／４２５０９号パンフレットに記載されている。
また、本発明は細胞に係わり、場合によっては、上記キットに組み込まれた細胞、好ましくは、本発明のベクターまたは核酸のコンストラクトのための宿主原核細胞であり、前記細胞は、その染色体ＤＮＡ中に組み込まれた毒性分子をコードする少なくとも１つの（好ましくは、少なくとも２つ以上の）ヌクレオチド配列を有する（核酸のコンストラクト中に存在するヌクレオチド配列が、その毒性分子に対する抗毒性分子をコードしている）。上記毒性分子の発現は、好ましくは、転写および／または翻訳を抑制する手段、例えば、毒性分子をコードする前記ヌクレオチド配列に抑制プロモーター／オペレーター・ヌクレオチド配列を加えることによってネガティブ抑制（制御）されており、それによって毒素蛋白質の転写および／翻訳の抑制的制御が可能になり、細胞死を防ぐことができる。
但し、前記抑制的制御は、特定の化合物（即ち：糖類）を細胞に対して添加するか或いは添加を抑制することによって解除することができ、それによってこの細胞による毒性分子の発現が可能になる。
また、毒性分子の活性は、条件的であってもよい（例えば、熱感受性アレルまたは特異的なアンバー変異抑制を導入することによって）。
さらにまた、細胞は、ある条件下で発現して細胞における毒性分子の悪影響を阻止できる抗毒性分子を含んでいてもよい。
好ましくは、本発明の細胞は、寄託番号ＬＭＧＰ−２１３９９の細胞である。
上記細胞は２００２年２月１５日付でＢＣＣＭ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ ｖｏｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｇｅｎｅｒａｌｅｍｅｎｔ，Ｋ．Ｌ．ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ ３５，Ｂ−９０００ Ｇｅｎｔ，Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｅｌｇｉａｎ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に寄託された（番号ＬＭＧＰ−２１３９９号）。この寄託は、微生物寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に従って行われた。
また、本発明は、組換え体の選択を目的とする前記生成物の使用、および、組換えクローンの選択方法に係わり、この選択方法は、本発明の核酸のコンストラクトまたはベクター中にカセット配列を設けるか、さもなければ前記カセット配列中に設けられた挿入部位に目的の遺伝子を挿入し、本発明の細胞を本発明の核酸のコンストラクトまたはベクターで形質転換して生存する組換え細胞クローンを選択するステップから成る。
本発明は、以下の例に基づいて詳細に説明されるが、この例に限定されるものではない。
核酸のコンストラクトを示す図。 大腸菌株ＣＹＳ１０のコンストラクションを模式的に示す図。
プラスミドおよび菌株の説明
図１に示す本発明の核酸のコンストラクト１は、毒性分子５に対する抗毒性蛋白質４をコードするヌクレオチド配列３および目的の遺伝子６または目的の遺伝子６の挿入部位から成るカセット・ヌクレオチド配列２とプロモーター／オペレーター配列９とを含み；カセット配列２は第１組換え部位７と第２組換え部位８との間に介在し、前記第１および第２組換え部位７，８は互いに再結合することがない。
前記核酸のコンストラクト１は、選択マーカー１１をも含むインサート・ドナーＤＮＡベクター１０であるベクターに組み込まれることが有益である。前記インサートＤＮＡドナーベクター１０は、組換え部位１３およびもう一つの選択マーカー１４を含むインサート・アクセプターＤＮＡベクター１２と結合させることができる。前記インサート・ドナーＤＮＡベクター１０とインサート・アクセプターベクターまたは分子１２は、組換え後、本発明の組換体ベクター１５を形成する。正しい組換え方向は、選択マーカー１１の特徴を利用するとともに染色体に存在する毒性分子５をコードする１つまたは２つ以上の遺伝子配列を発現する細菌菌株を利用することによって選択される。
この例において、抗毒性蛋白質４をコードするヌクレオチド配列は、細菌によって発現される毒性分子５（ＣｃｄＢ蛋白質）に対する抗毒性分子であるＣｃｄＡ蛋白質をコードするヌクレオチド配列である。
インサート・ドナーＤＮＡベクター１０に存在する第１の選択マーカー１１は毒素蛋白質ｋｉｄであり、第２の選択マーカー１４は抗生物質（アンピシリン）に対する遺伝的耐性である。
インサート・ドナーＤＮＡベクター１０は、第１の選択マーカー１１の活性に対する抵抗性を有する細菌、例えば、毒蛋白質ｋｉｄに対する抗毒素蛋白質ｋｉｓを発現する細菌中において増幅させれば好都合である。
構成的にｋｉｓ配列を含むこの種の細菌は文献ＷＯ０１／４６４４４に記載されており、寄託番号ＬＭＧＰ−１９１７１号によって保護されている。
また、本発明は、組換え体クローンの選択が行われる宿主細胞の菌株２０に係わる。
好ましい菌株は、ＤＨ１０Ｂ菌株由来の大腸菌菌株ＣＹＳ１０である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって商品化されたｍｃｒＡΔ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）ｆ８０ｌａｃＺｄＭ１５ ΔｌａｃＷ７４ ｅｎｄＡ１ ｒｅｃＡｌ ｄｅｏＲ Δ（ａｒａ，ｌｅｕ）７６９７ ａｒａＤ１３９ ｇａ／Ｕ ｇａ／Ｋ ｎｕｐＧ ｒｐｓＬ）。この菌株は、染色体のｄｃｍ遺伝子においてＰｔａｃプロモーター２２の制御下にあるｃｃｄＢ毒遺伝子２１と、λＰＥＲＦＬＵＯＲＯＣＡＲＢＯＮ ＬＩＱＵＩＤプロモーターおよび温度感受性のＣＩ８５７リプレッサーの制御下にあるＲｅｄおよびＧａｍ機能を発現するディフェクティブλ（このシステムの説明：Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０００，ＰＮＡＳ ９７：５９７８−５９８３）と２つのプラスミド（Ｐｕｌｂ３５６６プラスミド２３、Ｐｓｃ１０１Ｌａｃｌｑプラスミド２４）とを有する。ｐＵＬＢ３５６６プラスミド２３はＰｂａｄプロモーターの制御下にあるＣｃｄＡ抗毒素３を生成し、アンピシリン耐性遺伝子を有する。Ｐｓｃ１０１ ｌａｃｌｑプラスミド２４はＬａｃｌｑリプレッサーを生成し、スペクチノマイシン耐性遺伝子を有する。ｃｃｄＢ毒遺伝子の発現を制御するＰｔａｃプロモーター２２はＬａｃｌｑ蛋白質によって抑制され、培地にＩＰＴＧ ２６（イソプロピル β−Ｄチオガラクトシド、Ｃ９Ｈ１８Ｏ５Ｓ、Ｒｏｃｈｅ；０．５ミリモル／リットル）を添加することにより誘導される。但し、Ｌａｃｌｑ蛋白質の存在するときでもＰｔａｃプロモーター２２は完全には抑制されず、残留発現を伴う。ｃｃｄＡ抗毒素遺伝子３の発現を制御するＰｂａｄプロモーターは、アラビノース２５が存在しないときには完全に抑制されるが、培地にアラビノース２５（１％）を添加することによって発現が誘導される（Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７７，ｐ．４１２１−４１３０）。
温度感受性ＤＩ８５７リプレッサーの作用により、菌株は３０℃においてのみ成長する。染色体中にｃｃｄＢが存在するため、菌株は、抗毒素ＣｃｄＡの生成を可能にするアラビノースの存在下でのみ成長する。従って、菌株はＬＢ培地で、アラビノース（１％）の存在下で、３０℃において成長する。
ＣＹＳ１０のコンストラクションを図２に模式的に示す。
但し、前記毒性分子の活性（ｃｃｄＢの生成）に対して抵抗性を有する突然変異体の選択を減少させるかまたは回避するために、熱感受性を除くこと、およびさらに多くの毒性分子をコードする遺伝子配列を追加して導入することによって、前記菌株の特性を改善することができる。

Claims (9)

  1. 毒性蛋白質をコードする第１組換えヌクレオチド配列が染色体ＤＮＡ中に組込まれた組換体原核細胞であって、前記第１組換えヌクレオチド配列の発現は毒性蛋白質に対する抗毒性蛋白質によって抑制および／または制御されており、前記抗毒性蛋白質は前記細胞中にもたらされる第２ヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする組換体原核細胞。
  2. 抗毒性蛋白質をコードするヌクレオチド配列がプラスミド中に存在することを特徴とする請求項１に記載の細胞。
  3. 抗毒性蛋白質および毒性蛋白質が、以下の組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞：ＣｃｄＡ蛋白質／ＣｃｄＢ蛋白質、Ｋｉｓ蛋白質／Ｋｉｄ蛋白質、Ｐｈｄ蛋白質／Ｄｏｃ蛋白質、ＲｅｌＢ蛋白質／ｒｅｌＥ蛋白質、ＰａｓＢ蛋白質／ＰａｓＡ蛋白質、ＰａｓＣ蛋白質／ＰａｓＡ蛋白質、ｍａｚＥ蛋白質／ｍａｚＦ蛋白質、その他のプラスミド由来か或いはプラスミド由来ではない抗毒性蛋白質／毒性蛋白質。
  4. 寄託番号ＬＭＧＰ−２１３９９号の細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞。
  5. 第１ヌクレオチド配列の転写が第１プロモータ／オペレータヌクレオチド配列によって制御されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の組換体原核細胞。
  6. 第２ヌクレオチド配列の転写が第２プロモータ／オペレータヌクレオチド配列によって制御されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換体原核細胞。
  7. 以下のことを含む、組換体クローンの選択方法：
    − 毒性蛋白質をコードするヌクレオチド配列をゲノム中に含む宿主細胞を得ること、そして
    − 前記毒性蛋白質に対する機能的な抗毒性蛋白質をコードするヌクレオチド配列を前記宿主細胞に導入すること、ただし、前記組換体クローンは、前記ヌクレオチド配列の導入後に生き残る組換体クローンであり、前記ヌクレオチド配列は、不活性な抗毒性蛋白質をコードするベクター、および抗毒性蛋白質の失われた部分をコードする他のヌクレオチド配列、または転写もしくは翻訳信号と一体化しているＤＮＡインサートからなる。
  8. 抗毒性蛋白質および毒性蛋白質が、以下の組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法：ＣｃｄＡ蛋白質／ＣｃｄＢ蛋白質、Ｋｉｓ蛋白質／Ｋｉｄ蛋白質、Ｐｈｄ蛋白質／Ｄｏｃ蛋白質、ＲｅｌＢ蛋白質／ｒｅｌＥ蛋白質、ＰａｓＢ蛋白質／ＰａｓＡ蛋白質、ＰａｓＣ蛋白質／ＰａｓＡ蛋白質、ｍａｚＥ蛋白質／ｍａｚＦ蛋白質、その他のプラスミド由来か或いはプラスミド由来ではない抗毒性蛋白質／毒性蛋白質。
  9. 毒性蛋白質に対する抗毒性蛋白質をコードするヌクレオチド配列が、不活性な抗毒性蛋白質をコードする第１ヌクレオチド断片であり、毒性蛋白質に対する抗毒性蛋白質をコードするヌクレオチド配列の第２ヌクレオチド断片を含むインサートであって毒性蛋白質に対する機能的な抗毒性蛋白質を再構成するインサートの正しい組み込みの後、前記不活性な抗毒性蛋白質が機能的になることを特徴とする請求項７または８に記載の方法。
JP2013231763A 2001-02-23 2013-11-08 毒性分子に対する抗毒性蛋白質をコードする配列を含む組換体クローンの選択方法 Pending JP2014064579A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US27120401P 2001-02-23 2001-02-23
US60/271,204 2001-02-23

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002566361A Division JP5442177B2 (ja) 2001-02-23 2002-02-22 毒性分子に対する抗毒性蛋白質をコードする配列を含む組換体クローンの選択方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2014064579A true JP2014064579A (ja) 2014-04-17

Family

ID=23034627

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002566361A Expired - Lifetime JP5442177B2 (ja) 2001-02-23 2002-02-22 毒性分子に対する抗毒性蛋白質をコードする配列を含む組換体クローンの選択方法
JP2013231763A Pending JP2014064579A (ja) 2001-02-23 2013-11-08 毒性分子に対する抗毒性蛋白質をコードする配列を含む組換体クローンの選択方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002566361A Expired - Lifetime JP5442177B2 (ja) 2001-02-23 2002-02-22 毒性分子に対する抗毒性蛋白質をコードする配列を含む組換体クローンの選択方法

Country Status (7)

Country Link
US (2) US8470580B2 (ja)
EP (1) EP1362110B1 (ja)
JP (2) JP5442177B2 (ja)
CN (1) CN100560724C (ja)
AU (1) AU2002235676B2 (ja)
CA (1) CA2435956C (ja)
WO (1) WO2002066657A1 (ja)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE1006085A3 (fr) * 1992-07-31 1994-05-10 Univ Bruxelles Vecteur de clonage.
DE69942249D1 (de) 1998-05-07 2010-05-27 Univ Bruxelles Auf cytotoxinen basierendes biologisches einschlusssystem
ATE443074T1 (de) 1999-03-02 2009-10-15 Life Technologies Corp Zubereitungen und methoden zur verwendung in rekombinatorischem klonen von nukleinsäuren
AU2002235676B2 (en) * 2001-02-23 2006-10-26 Universite Libre De Bruxelles Method for the selection of recombinant clones comprising a sequence encoding an antidote protein to a toxic molecule
CA2477194A1 (en) * 2002-03-19 2003-09-25 Universite Libre De Bruxelles Poison/antidote genetic systems for the selection of genetically modified eucaryote cells or organisms
US8318497B2 (en) * 2002-09-03 2012-11-27 Universite Libre De Bruxelles Reversible, parallel and multitask cloning method and kit
US9309518B2 (en) 2002-09-03 2016-04-12 Universite Libre De Bruxelles Reversible, parallel and multitask cloning method and kit
US7398634B2 (en) * 2006-04-04 2008-07-15 Sanguinetti Peter S Wattle manufacturing system
EP2119789A1 (en) 2008-05-16 2009-11-18 Université Libre de Bruxelles Hyperproliferative recombinant cell
EP2543720A1 (en) 2011-07-07 2013-01-09 Delphi Genetics Genetically modified phage and use thereof
JP6174019B2 (ja) 2011-07-07 2017-08-02 デルフィ ジェネティクス 遺伝子組換えファージ及びその利用
US9920323B2 (en) 2011-07-07 2018-03-20 Delphi Genetics Genetically modified phage and use thereof
US9670504B2 (en) 2011-07-08 2017-06-06 Cilbiotech S.A. Transgenic system for reversibly immortalizing mammalian quiescent cells
US10550384B2 (en) 2013-03-14 2020-02-04 President And Fellows Of Harvard College Methods for selecting microbes from a diverse genetically modified library to detect and optimize the production of metabolites
BR122021015417B1 (pt) 2013-08-19 2022-11-08 Syngulon Sa Célula microbiana geneticamente engenheirada que compreende um ácido nucleico que codifica uma bacteriocina
BR112017001463A2 (pt) 2014-07-25 2018-02-20 Delphi Genetics célula hospedeira melhorada para produzir proteínas
JP7418796B2 (ja) * 2016-11-03 2024-01-22 テンプル・ユニバーシティ－オブ・ザ・コモンウェルス・システム・オブ・ハイアー・エデュケイション 細胞株の開発のための相同組換えベクターの高速生成のためのｄｎａプラスミド
US11458172B2 (en) 2017-09-08 2022-10-04 New Portal Limited Nucleic acid systems that enable bacteria to specifically target solid tumors via glucose-dependent viability
US11932672B2 (en) 2017-12-19 2024-03-19 Syngulon S.A. Fermentation process
CN117187281A (zh) * 2023-09-11 2023-12-08 云舟生物科技(广州)股份有限公司 一种无抗性质粒生产***及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11513562A (ja) * 1995-10-17 1999-11-24 バイオスター，インコーポレイテッド 組換えプラスミドの生産方法
WO2000061804A1 (en) * 1999-04-14 2000-10-19 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
JP2004527238A (ja) * 2001-02-23 2004-09-09 ユニベルスィテ リーブル ドゥ ブリュッセル 毒性分子に対する抗毒性蛋白質をコードする配列を含む組換体クローンの選択方法

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0273040B1 (en) 1986-03-26 1994-06-22 GX BioSystems A/S Biological containment
US5464764A (en) 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
US5300431A (en) 1991-02-26 1994-04-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Positive selection vector for the bacteriophage P1 cloning system
US7176029B2 (en) 1992-07-31 2007-02-13 Universite Libre De Bruxelles Cloning and/or sequencing vector
BE1006085A3 (fr) 1992-07-31 1994-05-10 Univ Bruxelles Vecteur de clonage.
JP2590761B2 (ja) 1994-11-22 1997-03-12 日本電気株式会社 Ｔａｂ式半導体装置およびｔａｂ式半導体装置を回路基板に接続する方法
EP0937098B1 (en) 1995-06-07 2002-08-14 Invitrogen Corporation Recombinational cloning in vitro using engineered recombination sites
US6143557A (en) 1995-06-07 2000-11-07 Life Technologies, Inc. Recombination cloning using engineered recombination sites
EP0876094A4 (en) 1995-10-13 2002-04-24 Purdue Research Foundation METHOD FOR PRODUCING HYBRID PLANTS
WO1999021977A1 (en) 1997-10-24 1999-05-06 Life Technologies, Inc. Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites
DE69942249D1 (de) 1998-05-07 2010-05-27 Univ Bruxelles Auf cytotoxinen basierendes biologisches einschlusssystem
US6271359B1 (en) 1999-04-14 2001-08-07 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
WO2001031039A1 (en) 1999-10-25 2001-05-03 Invitrogen Corporation Methods of manipulating and sequencing nucleic acid molecules using transposition and recombination
CA2392753A1 (en) 1999-12-10 2001-06-14 Invitrogen Corporation Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning
EP1111061A1 (en) 1999-12-20 2001-06-27 Universite Libre De Bruxelles Double selection vector
DE10038573A1 (de) 2000-08-03 2002-02-21 Mpb Cologne Gmbh Molecular Pla Verfahren zur Selektion auf Wirtszellen mit eliminierten DNA-Sequenzen
CA2477194A1 (en) 2002-03-19 2003-09-25 Universite Libre De Bruxelles Poison/antidote genetic systems for the selection of genetically modified eucaryote cells or organisms
US9309518B2 (en) 2002-09-03 2016-04-12 Universite Libre De Bruxelles Reversible, parallel and multitask cloning method and kit
US8318497B2 (en) 2002-09-03 2012-11-27 Universite Libre De Bruxelles Reversible, parallel and multitask cloning method and kit

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11513562A (ja) * 1995-10-17 1999-11-24 バイオスター，インコーポレイテッド 組換えプラスミドの生産方法
WO2000061804A1 (en) * 1999-04-14 2000-10-19 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
JP2004527238A (ja) * 2001-02-23 2004-09-09 ユニベルスィテ リーブル ドゥ ブリュッセル 毒性分子に対する抗毒性蛋白質をコードする配列を含む組換体クローンの選択方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN5003012836; ＧＡＢＡＮＴ　Ｐ: ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ Ｖ２８Ｎ４, 200004, Ｐ７８４-７８８, ＥＡＴＯＮ　ＰＵＢＬＩＳＨＩＮＧ *
JPN6015004199; Ｅｎｇｅｌｂｅｒｇ-Ｋｕｌｋａ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｇｌａｓｅｒ，　Ｇ．: 'Ａｄｄｉｃｔｉｏｎ　ｍｏｄｕｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　ａｎｄ　ａｎｔｉｄｅａｔｈ　ｉｎ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ．' Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．５３, 1999, ｐａｇｅｓ　４３-７０ *

Also Published As

Publication number Publication date
US20130280810A1 (en) 2013-10-24
CA2435956C (en) 2012-07-10
US8470580B2 (en) 2013-06-25
JP2004527238A (ja) 2004-09-09
CN1688699A (zh) 2005-10-26
CN100560724C (zh) 2009-11-18
WO2002066657A1 (en) 2002-08-29
CA2435956A1 (en) 2002-08-29
EP1362110B1 (en) 2012-09-12
EP1362110A1 (en) 2003-11-19
JP5442177B2 (ja) 2014-03-12
AU2002235676B2 (en) 2006-10-26
US20040115811A1 (en) 2004-06-17
US8877504B2 (en) 2014-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2014064579A (ja) 毒性分子に対する抗毒性蛋白質をコードする配列を含む組換体クローンの選択方法
Huang et al. Development of a RecE/T‐assisted CRISPR–Cas9 toolbox for Lactobacillus
JP4020429B2 (ja) 操作された組換え部位を使用する組換えクローニング
Haldimann et al. Conditional-replication, integration, excision, and retrieval plasmid-host systems for gene structure-function studies of bacteria
EP3604524B1 (en) New technique for genomic large fragment direct cloning and dna multi-molecular assembly
Carr et al. Engineering the genome of Thermus thermophilus using a counterselectable marker
WO2020086144A2 (en) APPLICATIONS OF CRISPRi IN HIGH THROUGHPUT METABOLIC ENGINEERING
AU2002235676A1 (en) Method for the selection of recombinant clones comprising a sequence encoding an antidote protein to a toxic molecule
WO1996040724A9 (en) Recombinational cloning using engineered recombination sites
Ramirez-Chamorro et al. Strategies for bacteriophage T5 mutagenesis: expanding the toolbox for phage genome engineering
CN115605597A (zh) 用于产生赋予低至中等表达的组成型细菌启动子的方法
Julien Characterization of the integrase gene and attachment site for the Myxococcus xanthus bacteriophage Mx9
EP2848691B1 (en) Broad host range expression vector for diverse prokaryotes
Tong et al. CRISPR-BEST: a highly efficient DSB-free base editor for filamentous actinomycetes
US20080286871A1 (en) Modular genomes for synthetic biology and metabolic engineering
WO2003064623A2 (en) Methods and vectors for facilitating site-specific recombination
WO2017009418A1 (en) Modifying bacteriophage
Widney et al. CRISPR-Cas9-assisted genome editing in E. coli elevates the frequency of unintended mutations
Chaperon A method for the construction of in frame substitutions in operons: Deletion of the essential Escherichia coli holB gene coding for a subunit of the DNA polymerase III holoenzyme
AU2004201501A1 (en) Recombinational cloning using engineered recombination sites

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20150203

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20150703