JP2014064513A - Method for preparation of 2-deoxy-scyllo-inosose - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、酵素法により、D-グルコースから2-デオキシ-scyllo-イノソースを調製する方法に関する。 The present invention relates to a method for preparing 2-deoxy-scyllo-inosose from D-glucose by an enzymatic method.
本発明の方法は、従来法よりも効率的に2-デオキシ-scyllo-イノソースを調製することが可能であり、また、得られる2-デオキシ-scyllo-イノソースは簡便な化学変換により芳香族化合物などへの変換が可能である。このため、本発明の方法により、グルコースからベンゼン系化合物やシクロヘキサン系化合物を効率的に生産することが可能になる。 The method of the present invention can prepare 2-deoxy-scyllo-inosose more efficiently than the conventional method, and the obtained 2-deoxy-scyllo-inosose can be converted into an aromatic compound by a simple chemical conversion. Conversion to is possible. For this reason, according to the method of the present invention, it becomes possible to efficiently produce a benzene compound or a cyclohexane compound from glucose.
2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素は、グルコース-6-リン酸を基質として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)を補酵素として、炭素環化合物、2-デオキシ-scyllo-イノソースへの変換反応を触媒する酵素である（特許文献１、図１）。従って、2-デオキシ-scyllo-イノソース生産のためには、基質としてグルコース-6-リン酸の供給が必要である。試験管内では、グルコース-6-リン酸は、グルコースからアデノシン三リン酸(ATP)の存在下、ヘキソキナーゼの作用により調製できるが（図１）、非常に高価なATPを用いるため、実用に用いることができない。従って、現在のところ、微生物の代謝系を利用したグルコース-6-リン酸の供給、すなわち発酵系による2-デオキシ-scyllo-イノソースの生産利用が考えられている（図１）。しかしながら、グルコース-6-リン酸は一次代謝である解糖系における最初の化合物であるが故に、発酵法においてグルコース-6-リン酸の2-デオキシ-scyllo-イノソースへの変換の効率は必ずしも高いものではない。また、生成した2-デオキシ-scyllo-イノソースの精製法も問題点である。現在では、微生物の遺伝子工学による代謝の遮断により、2-デオキシ-scyllo-イノソースの蓄積生産の可能性も試みられているが(非特許文献１)、精製法、コストの問題など本質的に組換え微生物による発酵系に由来する問題点は残されている。 2-deoxy-scyllo-inosose synthase is converted to carbocyclic compound, 2-deoxy-scyllo-inosose using glucose-6-phosphate as a substrate and nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + ) as a coenzyme (Patent Document 1, FIG. 1). Therefore, in order to produce 2-deoxy-scyllo-inosose, it is necessary to supply glucose-6-phosphate as a substrate. In a test tube, glucose-6-phosphate can be prepared from glucose by the action of hexokinase in the presence of adenosine triphosphate (ATP) (Fig. 1). I can't. Therefore, at present, the supply of glucose-6-phosphate using the metabolic system of microorganisms, that is, the production and utilization of 2-deoxy-scyllo-inosose by a fermentation system is considered (FIG. 1). However, because glucose-6-phosphate is the first compound in the glycolysis system that is the primary metabolism, the efficiency of conversion of glucose-6-phosphate to 2-deoxy-scyllo-inosose is not necessarily high in the fermentation process. It is not a thing. Another problem is the purification method of the produced 2-deoxy-scyllo-inosose. At present, the possibility of accumulation production of 2-deoxy-scyllo-inosose has been attempted by blocking the metabolism of microorganisms through genetic engineering (Non-patent Document 1). Problems remaining from the fermentation system with the replacement microorganism remain.
上述のように、ATPを用いる酵素法による2-デオキシ-scyllo-イノソースの生産は実用的ではなく、また、発酵法による2-デオキシ-scyllo-イノソースの生産も種々の問題がある。 As described above, the production of 2-deoxy-scyllo-inosose by an enzymatic method using ATP is not practical, and the production of 2-deoxy-scyllo-inosose by a fermentation method has various problems.
本発明は、このような従来の2-デオキシ-scyllo-イノソース生産手段に代わる新規な2-デオキシ-scyllo-イノソース生産手段を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a novel means for producing 2-deoxy-scyllo-inosose in place of such conventional means for producing 2-deoxy-scyllo-inosose.
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素の基質であるグルコース-6-リン酸を、ヘキソキナーゼではなく、ポリリン酸グルコキナーゼ（ポリリン酸をリン酸供給源としてグルコースの６位を直接リン酸化する酵素）により供給するという発想を得た。 As a result of intensive studies in order to solve the above problems, the present inventor has determined that glucose-6-phosphate, which is a substrate of 2-deoxy-scyllo-inosose synthase, is not a hexokinase but a polyphosphate glucokinase (polyphosphate). Was obtained using an enzyme that directly phosphorylates the 6-position of glucose using a phosphoric acid source.
また、本発明者は、ポリリン酸グルコキナーゼと2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素を固定化して基質と反応させたところ、高収率で2-デオキシ-scyllo-イノソースが得られることを見出した。 In addition, the present inventors have found that 2-deoxy-scyllo-inosose can be obtained in a high yield when polyphosphate glucokinase and 2-deoxy-scyllo-inosose synthase are immobilized and reacted with a substrate. .
更に、本発明者は、放線菌ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）からポリリン酸グルコキナーゼを初めて取得し、この酵素を用いて2-デオキシ-scyllo-イノソースの調製を行った。 Furthermore, the present inventor obtained polyphosphate glucokinase for the first time from Streptomyces coelicolor and prepared 2-deoxy-scyllo-inosose using this enzyme.
本発明は、以上の知見及び発想に基づき完成されたものである。 The present invention has been completed based on the above knowledge and idea.
即ち、本発明は、以下の（１）〜（５）を提供するものである。
（１）ポリリン酸グルコキナーゼによりグルコースをグルコース-6-リン酸に変換する工程と、2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素によりグルコース-6-リン酸を2-デオキシ-scyllo-イノソースに変換する工程を有することを特徴とする2-デオキシ-scyllo-イノソースの調製法。
（２）ポリリン酸グルコキナーゼ及び2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素が固定化されていることを特徴とする（１）に記載の2-デオキシ-scyllo-イノソースの調製法。
（３）ポリリン酸グルコキナーゼが、ストレプトマイセス・セリカラー由来のポリリン酸グルコキナーゼであることを特徴とする（１）又は（２）に記載の2-デオキシ-scyllo-イノソースの調製法。
（４）ポリリン酸グルコキナーゼが、以下の(a)又は(b)のタンパク質であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の2-デオキシ-scyllo-イノソースの調製法、
(a)配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリリン酸グルコキナーゼ活性を有するタンパク質。
（５）2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素が、バチルス・サーキュランス由来の2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素であることを特徴とする（１）乃至（４）のいずれかに記載の2-デオキシ-scyllo-イノソースの調製法。
That is, the present invention provides the following (1) to (5).
(1) A step of converting glucose to glucose-6-phosphate by polyphosphate glucokinase and a step of converting glucose-6-phosphate to 2-deoxy-scyllo-inosose by 2-deoxy-scyllo-inosose synthase A process for preparing 2-deoxy-scyllo-inosose, comprising
(2) The method for preparing 2-deoxy-scyllo-inosose according to (1), wherein polyphosphate glucokinase and 2-deoxy-scyllo-inosose synthase are immobilized.
(3) The method for preparing 2-deoxy-scyllo-inosose according to (1) or (2), wherein the polyphosphate glucokinase is a polyphosphate glucokinase derived from Streptomyces sericolor.
(4) The method for preparing 2-deoxy-scyllo-inosose according to (1) or (2), wherein the polyphosphate glucokinase is the following protein (a) or (b):
(a) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(b) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having polyphosphate glucokinase activity.
(5) The 2-deoxy-scyllo-inosose synthase is a 2-deoxy-scyllo-inosose synthase derived from Bacillus circulans, according to any one of (1) to (4) -Deoxy-scyllo-inosose preparation method.
ポリリン酸グルコキナーゼによるグルコース-6-リン酸の供給が可能であれば、２つの酵素を利用した１ポットの反応で、2-デオキシ-scyllo-イノソースの生産が可能となる。その際には、高価なNAD+は必要最低限に抑えられ、さらにリン酸供給源として、食品添加物として非常に安価で入手可能なポリリン酸を使用することになり、2-デオキシ-scyllo-イノソース生産のコスト低減を図ることができる。また、この反応系が効率よく進行すると、反応系に中性分子は目的生産物の2-デオキシ-scyllo-イノソースだけが存在することになり、イオン交換樹脂を用いて簡便に2-デオキシ-scyllo-イノソースを精製でき、この点でも2-デオキシ-scyllo-イノソース生産のコスト低減を計ることができる。さらに2-デオキシ-scyllo-イノソース生産の副生成物として生成する無機リン酸は、焼結によりポリリン酸へと再生できる。また、酵素固定化による流体型反応プロセスへの応用も可能と考えられ、更なる効率化も期待できる。 If glucose-6-phosphate can be supplied by polyphosphate glucokinase, 2-deoxy-scyllo-inosose can be produced by a one-pot reaction using two enzymes. In that case, expensive NAD + is suppressed to the minimum necessary, and furthermore, polyphosphoric acid that is available at a very low price as a food additive is used as a phosphoric acid source, and 2-deoxy-scyllo- The cost of innosauce production can be reduced. Moreover, if this reaction system proceeds efficiently, the neutral molecule in the reaction system will be only the target product 2-deoxy-scyllo-inosose. -Inosose can be purified, and in this respect as well, the cost of 2-deoxy-scyllo-inosose production can be reduced. Furthermore, inorganic phosphoric acid produced as a by-product of 2-deoxy-scyllo-inosose production can be regenerated into polyphosphoric acid by sintering. Moreover, it is considered possible to apply to fluid type reaction process by enzyme immobilization, and further efficiency can be expected.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明の2-デオキシ-scyllo-イノソースの調製法は、ポリリン酸グルコキナーゼによりグルコースをグルコース-6-リン酸に変換する工程と、2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素によりグルコース-6-リン酸を2-デオキシ-scyllo-イノソースに変換する工程を有することを特徴とする。 The method for preparing 2-deoxy-scyllo-inosose according to the present invention comprises the steps of converting glucose to glucose-6-phosphate with polyphosphate glucokinase, and glucose-6-phosphate with 2-deoxy-scyllo-inosose synthase. Is converted to 2-deoxy-scyllo-inosose.
ポリリン酸グルコキナーゼとしては、例えば、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）由来のポリリン酸グルコキナーゼを使用することができるが、これ以外にもサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）由来のポリリン酸グルコキナーゼ（Appl Microbiol Biotechnol, 93, 1109-1117 (2012).）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）由来のポリリン酸グルコキナーゼ（Appl Microbiol Biotechnol, 87, 703-713 (2010).）、アルスロバクター（Arthrobacter） sp. strain KM由来のポリリン酸グルコキナーゼ（Appl Environ Microbiol, 69, 3849-3857 (2003).）なども使用することができる。ストレプトマイセス・セリカラー由来のポリリン酸グルコキナーゼは、本発明者によって初めて単離精製されたものであり、そのアミノ酸配列は、配列番号１に示すとおりである。 As polyphosphate glucokinase, for example, polyphosphate glucokinase derived from Streptomyces coelicolor can be used, but besides this, polyphosphate glucokinase derived from Thermobifida fusca (Thermobifida fusca) Appl Microbiol Biotechnol, 93, 1109-1117 (2012).), Polyphosphate glucokinase derived from Corynebacterium glutamicum (Appl Microbiol Biotechnol, 87, 703-713 (2010).), Arthrobacter ( Arthrobacter) sp. Strain KM-derived polyphosphate glucokinase (Appl Environ Microbiol, 69, 3849-3857 (2003).) And the like can also be used. Polyphosphate glucokinase derived from Streptomyces sericolor was isolated and purified for the first time by the present inventor, and its amino acid sequence is as shown in SEQ ID NO: 1.
また、ポリリン酸グルコキナーゼとしては、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリリン酸グルコキナーゼ活性を有するタンパク質を使用することもできる。ここでいう「１若しくは数個」とは、通常は、１〜１０個であり、好ましくは、１〜５個であり、より好ましくは１〜３個であり、更に好ましくは１個である。また、「欠失、置換若しくは付加」には、人為的な変異のほか、個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutantやvariant）も含まれる。 Further, as polyphosphate glucokinase, a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having polyphosphate glucokinase activity is used. You can also. The “one or several” referred to herein is usually 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and still more preferably 1. Further, “deletion, substitution or addition” includes not only artificial mutations but also naturally occurring mutations (mutants and variants) such as cases based on individual differences, species or genus differences.
更に、ポリリン酸グルコキナーゼとしては、配列番号１に記載のアミノ酸配列と高い同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつポリリン酸グルコキナーゼ活性を有するタンパク質を使用することもできる。ここでいう「高い同一性」とは、通常９０％以上の同一性、好ましくは９５以上の同一性、より好ましくは９７％以上の同一性、更に好ましくは９９％以上の同一性を意味する。なお、本明細書における「同一性」の値は、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出することができる。例えば、NCBIの相同性アルゴリズムBLAST（Basic local alignment search tool）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。 Furthermore, as the polyphosphate glucokinase, a protein having an amino acid sequence having high identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having polyphosphate glucokinase activity can also be used. “High identity” here means usually 90% or more identity, preferably 95 or more identity, more preferably 97% or more identity, and even more preferably 99% or more identity. The value of “identity” in the present specification can be calculated using a homology search program known to those skilled in the art. For example, it can be calculated by using default (initial setting) parameters in NCBI homology algorithm BLAST (Basic local alignment search tool).
使用するポリリン酸グルコキナーゼは、精製や固定化のためのタグが付加されたものであってもよい。このようなタグとしては、ヒスチジンタグ、グルタチオンS-トランスフェラーゼタグ、マルトース結合タンパク質タグ、ストレプタクチンタグなどを例示できる。 The polyphosphate glucokinase to be used may have a tag for purification or immobilization. Examples of such tags include histidine tags, glutathione S-transferase tags, maltose binding protein tags, streptactin tags, and the like.
2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素としては、例えば、バチルス・サーキュランス（Bacilllus circulans）由来の2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素（J. Org. Chem., 69, 593-600 (2004)、J. Antibiot., 59, 358-361 (2006)、特開2000-236881号公報）、ストレプトアロテイカス・ヒンダスタヌス（Streptoalloteichus hindustanus）由来の2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素（J Antibiot, 59, 358-361 (2006).）、ストレプトマイセス・フラジアエ（Streptomyces fradiae）由来の2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素（J Antibiot, 58, 766-774 (2005).）、ミクロモノスポラ・エキノスポラ（Micromonospora echinospora）由来の2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素（J Antibiot, 57, 436-445 (2004).）、ストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）由来の2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素（Arch Biochem Biophys, 429, 204-214 (2004).）、ストレプトマイセス・テネブラリウス（Streptomyces tenebrarius）由来の2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素（FEMS Microbiol Lett, 230, 185-190 (2004).）などを使用することができる。 As the 2-deoxy-scyllo-inosose synthase, for example, 2-deoxy-scyllo-inosose synthase derived from Bacillus circulans (J. Org. Chem., 69, 593-600 (2004), J. Antibiot., 59, 358-361 (2006), JP 2000-236881), 2-deoxy-scyllo-inosose synthase derived from Streptoalloteichus hindustanus (J Antibiot, 59, 358-361 (2006).), 2-deoxy-scyllo-inosose synthase derived from Streptomyces fradiae (J Antibiot, 58, 766-774 (2005).), Micromonospora echinospora ( 2-deoxy-scyllo-inosose synthase from Micromonospora echinospora (J Antibiot, 57, 436-445 (2004).), 2-deoxy-scyllo-inosose from Streptomyces kanamyceticus Synthetic enzyme (Arch Biochem B iophys, 429, 204-214 (2004).), 2-deoxy-scyllo-inosose synthase derived from Streptomyces tenebrarius (FEMS Microbiol Lett, 230, 185-190 (2004).), etc. Can be used.
使用する2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素は、ポリリン酸グルコキナーゼと同様に精製や固定化のためのヒスチジンタグなどが付加されたものであってもよい。 The 2-deoxy-scyllo-inosose synthase to be used may be one to which a histidine tag for purification and immobilization is added in the same manner as polyphosphate glucokinase.
グルコースをグルコース-6-リン酸に変換する工程とグルコース-6-リン酸を2-デオキシ-scyllo-イノソースに変換する工程は、別々に行ってもよいが、１ポット反応、即ち、グルコースを、ポリリン酸グルコキナーゼ及び2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素と共存させ、中間生成物であるグルコース-6-リン酸を単離精製することなく、2-デオキシ-scyllo-イノソースを生成させる反応として行うことが好ましい。この際、反応液中には、リン酸供給源となるポリリン酸と2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素の補酵素となるNAD+を添加しておく。 The step of converting glucose to glucose-6-phosphate and the step of converting glucose-6-phosphate to 2-deoxy-scyllo-inosose may be carried out separately, but a one-pot reaction, that is, glucose, Co-existing with polyphosphate glucokinase and 2-deoxy-scyllo-inosose synthase, this is a reaction that produces 2-deoxy-scyllo-inosose without isolating and purifying the intermediate product glucose-6-phosphate It is preferable. At this time, polyphosphate serving as a phosphate supply source and NAD + serving as a coenzyme for 2-deoxy-scyllo-inosose synthase are added to the reaction solution.
反応液中のグルコース濃度は特に限定されないが、通常1 mM〜1000 mMであり、好適には2 mM〜50 mMである。反応液中のポリリン酸グルコキナーゼ濃度も特に限定されないが、通常0.1μM〜50μMであり、好適には5μM〜10μMである。反応液中の2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素濃度も特に限定されないが、通常0.1μM〜50μMであり、好適には5μM〜10μMである。反応液中のポリリン酸濃度も特に限定されないが、通常1 mM〜1000 mMであり、好適には10 mM〜100 mMである。反応液中のNAD+濃度も特に限定されないが、通常0.1 mM〜100 mMであり、好適には0.1 mM〜1 mMである。 The glucose concentration in the reaction solution is not particularly limited, but is usually 1 mM to 1000 mM, preferably 2 mM to 50 mM. The concentration of polyphosphate glucokinase in the reaction solution is not particularly limited, but is usually 0.1 μM to 50 μM, and preferably 5 μM to 10 μM. The concentration of 2-deoxy-scyllo-inosose synthase in the reaction solution is not particularly limited, but is usually 0.1 μM to 50 μM, preferably 5 μM to 10 μM. The concentration of polyphosphoric acid in the reaction solution is also not particularly limited, but is usually 1 mM to 1000 mM, preferably 10 mM to 100 mM. The concentration of NAD + in the reaction solution is not particularly limited, but is usually 0.1 mM to 100 mM, preferably 0.1 mM to 1 mM.
反応液の温度は特に限定されないが、通常20〜46℃であり、好適には25〜30℃である。反応液のpHも特に限定されないが、通常6.5〜8.5であり、好適には7.5〜8.0である。反応開始から、通常、2〜24時間程度で、十分な量の2-デオキシ-scyllo-イノソースが生成する。 Although the temperature of a reaction liquid is not specifically limited, Usually, it is 20-46 degreeC, and is 25-30 degreeC suitably. The pH of the reaction solution is not particularly limited, but is usually 6.5 to 8.5, preferably 7.5 to 8.0. A sufficient amount of 2-deoxy-scyllo-inosose is usually produced in about 2 to 24 hours from the start of the reaction.
使用するポリリン酸グルコキナーゼ及び2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素は、適当な担体に固定化されたものであってもよい。この場合、グルコース、ポリリン酸、及びNAD+を含む溶液を、酵素が固定化された担体と接触させることにより、2-デオキシ-scyllo-イノソースを生成させることができる。酵素を固定化する方法としては、各酵素にヒスチジンタグを付加しておき、これらを、コバルトイオンなどのヒスチジンタグに親和性を示す物質を含む樹脂などに固定化する方法などが例示できる。他の方法としては、例えば、グルタチオンS-トランスフェラーゼタグ、マルトース結合タンパク質タグ、ストレプタクチンタグを利用した方法、ポリアクリルアミドなどを利用した包括方法などがある。 The polyphosphate glucokinase and 2-deoxy-scyllo-inosose synthase used may be immobilized on a suitable carrier. In this case, 2-deoxy-scyllo-inosose can be generated by contacting a solution containing glucose, polyphosphate, and NAD + with a carrier on which an enzyme is immobilized. Examples of the method for immobilizing the enzyme include a method in which a histidine tag is added to each enzyme, and these are immobilized on a resin containing a substance having affinity for the histidine tag such as cobalt ion. Other methods include, for example, a method using a glutathione S-transferase tag, a maltose-binding protein tag, a streptactin tag, a comprehensive method using polyacrylamide and the like.
生成した2-デオキシ-scyllo-イノソースの単離精製は、クロマトグラフィーなどを利用した常法に従って行うことができる。 Isolation and purification of the produced 2-deoxy-scyllo-inosose can be performed according to a conventional method using chromatography or the like.
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
（１）2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素遺伝子の発現プラスミドベクターの構築及び形質転換
pUC19ベクター導入されている2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素遺伝子（BtrC）をpET28(a)ベクターへベクター交換を行った。ここで得られたプラスミドベクターを、大腸菌BL21株のコンピテントセルにエレクトロポレーション法で形質転換し、組換え大腸菌を作製した。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
(1) Construction and transformation of 2-deoxy-scyllo-inosose synthase gene expression plasmid vector
The vector exchange of the 2-deoxy-scyllo-inosose synthase gene (BtrC) introduced with the pUC19 vector was carried out to the pET28 (a) vector. The plasmid vector obtained here was transformed into competent cells of E. coli BL21 strain by electroporation to prepare recombinant E. coli.
（２）精製酵素の取得
2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素の形質転換体を30 mg/Lのカナマイシンを含むLBプレートで、37℃、1日間培養して、コロニーを形成させた。次いで30 mg/Lのカナマイシンを含むLB培地3 mLを10 mL容の試験管に入れ、上記プレートからコロニーをつま楊枝で植菌し、37℃で、1日間培養し、遠心分離で菌体を回収し、LB培地：20%グリセロール＝１：１の溶液で懸濁しグリセロールストックを作製した。
(2) Acquisition of purified enzyme
A transformant of 2-deoxy-scyllo-inosose synthase was cultured on an LB plate containing 30 mg / L kanamycin at 37 ° C. for 1 day to form colonies. Next, add 3 mL of LB medium containing 30 mg / L kanamycin to a 10 mL test tube, inoculate the colonies with toothpicks from the above plate, incubate at 37 ° C for 1 day, and collect the cells by centrifugation. A glycerol stock was prepared by suspending in a solution of LB medium: 20% glycerol = 1: 1.
30 mg/Lのカナマイシンを含むLB培地5 mLを10 mL容の試験管に入れ、上記グリセロールストックからつま楊枝で植菌し、37℃で、1日間培養を行い、これを本培養の前培養液とした。 Place 5 mL of LB medium containing 30 mg / L kanamycin into a 10 mL test tube, inoculate with a toothpick from the above glycerol stock, and incubate at 37 ° C for 1 day. It was.
500 mL容のバッフル付き三角フラスコ3本に、30 mg/Lのカナマイシンを含むLB培地を200 mLずつ入れ、それぞれのバッフル付き三角フラスコに1 mLの前培養液を添加し、37℃で、2.5〜3.5時間、200 rpmで回転震盪培養を行った。OD（600 nm）が0.5程度になったところで、1時間コールドショックを行い、15℃で、1日間、200 rpmで回転震盪培養を行った。 Place 200 mL of LB medium containing 30 mg / L kanamycin into three 500 mL baffled Erlenmeyer flasks, add 1 mL of preculture to each baffled Erlenmeyer flask, and add 2.5 mL at 37 ° C. Rotating shaking culture was performed at 200 rpm for ~ 3.5 hours. When the OD (600 nm) reached about 0.5, cold shock was performed for 1 hour, and rotary shaking culture was performed at 15 ° C. for 1 day at 200 rpm.
次いでこの培養液を、4℃、6,000 rpm、30分間遠心分離して上清を除去し、10%グリセロールを含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）で数回洗浄しながら菌体を回収した。回収した菌体を、10％グリセロールを含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）で懸濁し、超音波にて菌体破砕を行った。菌体破砕後の溶液を、4℃で、10,000 rpm、30分間遠心分離して菌体残渣を除去し、上清を回収した。ここで得られた酵素溶液を、10％グリセロールを含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）で平衡化した「Talon Metal Affinity Resin」（タカラバイオ株式会社）に吸着させ、0.2 mM塩化コバルト六水和物を含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）で平衡化させた後、5 mMおよび20 mMのイミダゾール、0.2 mM塩化コバルト六水和物を含有する50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）、各10 mLで洗浄し、500 mMのイミダゾール、0.2 mM塩化コバルト六水和物を含有する50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）によって酵素を溶出させた。 The culture is then centrifuged at 4 ° C, 6,000 rpm for 30 minutes to remove the supernatant, and the cells are recovered while washing several times with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 10% glycerol. did. The collected cells were suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 10% glycerol, and the cells were crushed by ultrasonic waves. The solution after disruption of the cells was centrifuged at 4 ° C. and 10,000 rpm for 30 minutes to remove cell residues, and the supernatant was collected. The enzyme solution obtained here was adsorbed on “Talon Metal Affinity Resin” (Takara Bio Inc.) equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 10% glycerol, and 0.2 mM cobalt chloride 6 After equilibration with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing hydrate, 50 mM Tris-HCl buffer containing 5 mM and 20 mM imidazole and 0.2 mM cobalt chloride hexahydrate ( After washing with 10 mL each of pH 7.7), the enzyme was eluted with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 500 mM imidazole and 0.2 mM cobalt chloride hexahydrate.
上記で得られた酵素を、0.2 mg/L塩化コバルト六水和物を含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）で平衡化した「PD-10」（GEヘルスケア・ジャパン株式会社）にて脱塩及び濃縮を行い、精製2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素を得た。 The enzyme obtained above was equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 0.2 mg / L cobalt chloride hexahydrate to “PD-10” (GE Healthcare Japan, Inc.) Then, desalting and concentration were performed to obtain purified 2-deoxy-scyllo-inosose synthase.
（３）ポリリン酸グルコキナーゼ(PPGK)遺伝子 （SCO5059）の発現、精製
PPGK遺伝子を増幅するためのPCRプライマーとして、センスプライマーは(GGCATATGCAGATCTTCGGCGTGGAC（配列番号３）)を有するオリゴDNAを、アンチセンスプライマーは(GCAAGCTTCCCCCCGCGTGACCG（配列番号４）)を用い、放線菌Streptomyces coelicolorのゲノムを鋳型としたPCR法によるPPGK遺伝子の増幅を行い、7416塩基対からなるPCR産物を取得し、pMD19-Tベクターにライゲーションした。
(3) Expression and purification of polyphosphate glucokinase (PPGK) gene (SCO5059)
As a PCR primer for amplifying the PPGK gene, an oligo DNA having (GGCATATGCAGATCTTCGGCGTGGAC (SEQ ID NO: 3)) is used as a sense primer and (GCAAGCTTCCCCCCGCGTGACCG (SEQ ID NO: 4)) is used as an antisense primer, and the Streptomyces coelicolor genome is used. A PPGK gene was amplified by PCR using a template, and a PCR product consisting of 7416 base pairs was obtained and ligated to the pMD19-T vector.
ここで得られたPCR産物の遺伝子配列をDNAシークエンサーで解析することで確認し、PPGK遺伝子を得た。 PPGK遺伝子を発現用ベクターpColdIベクターへベクター交換を行った。 The gene sequence of the PCR product obtained here was confirmed by analyzing with a DNA sequencer, and the PPGK gene was obtained. The PPGK gene was exchanged with the expression vector pColdI vector.
ここで得られたプラスミドベクターを、大腸菌BL21株のコンピテントセルにエレクトロポレーション法で形質転換し、組換え微生物を作製した。PPGKの形質転換体を100 mg/Lのアンピシリンを含むLBプレートで、37℃、1日間培養して、コロニーを形成させた。次いで100 mg/Lのアンピシリンを含むLB培地3 mLを10 mL容の試験管に入れ、上記プレートからコロニーをつま楊枝で植菌し、37℃で、1日間培養し、遠心分離で菌体を回収し、LB培地：29％グリセロール＝１：１の溶液で懸濁しグリセロールストックを作製した。 The plasmid vector obtained here was transformed into competent cells of E. coli BL21 strain by electroporation to prepare recombinant microorganisms. The transformant of PPGK was cultured on an LB plate containing 100 mg / L ampicillin at 37 ° C. for 1 day to form colonies. Next, add 3 mL of LB medium containing 100 mg / L ampicillin to a 10 mL test tube, inoculate the colonies with toothpicks from the above plate, incubate at 37 ° C for 1 day, and collect the cells by centrifugation. A glycerol stock was prepared by suspending in a LB medium: 29% glycerol = 1: 1 solution.
100 mg/Lのアンピシリンを含むLB培地5 mLを10 mL容の試験管に入れ、上記グリセロールストックからつま楊枝で植菌し、37℃で、1日間培養を行い、これを本培養の前培養液とした。 Place 5 mL of LB medium containing 100 mg / L ampicillin in a 10 mL test tube, inoculate with a toothpick from the above glycerol stock, and incubate at 37 ° C for 1 day. It was.
500 mL容のバッフル付き三角フラスコ３本に、100 mg/Lのアンピシリンを含むLB培地を200 mLずつ入れ、それぞれのバッフル付き三角フラスコに1 mLの前培養液を添加し、37℃で、2.5〜3.5時間、200 rpmで回転震盪培養を行った。OD（600 nm）が0.5程度になったところで、1時間コールドショックを行い、15℃で、1日間、200 rpmで回転震盪培養を行った。次いでこの培養液を、4℃、6,000 rpm、30分間遠心分離して上清を除去し、10％グリセロールを含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）で数回洗浄しながら菌体を回収した。回収した菌体を、10％グリセロールを含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）で懸濁し、超音波にて菌体破砕を行った。菌体破砕後の溶液を、4℃で、10,000 rpm、30分間遠心分離して菌体残渣を除去し、上清を回収した。ここで得られた酵素溶液を、10％グリセロールを含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）で平衡化した「Talon Metal Affinity Resin」（タカラバイオ株式会社）に吸着させ、10％グリセロールを含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）で平衡化させた後、5 mMのイミダゾール、10％グリセロールを含有する50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）で洗浄し、200 mMのイミダゾール、10％グリセロールを含有する50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）によって酵素を溶出させた。ここで得られた酵素を、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）で平衡化した「PD-10」（GEヘルスケア・ジャパン株式会社）にて脱塩及び濃縮を行い、精製PPGKを得た。なお、ここで得られたPPGKには、pColdIベクター由来のヒスチジンタグが付加されている（このヒスチジンタグ付加型のPPGKのアミノ酸配列を配列番号２に示す。）。 Place 200 mL of LB medium containing 100 mg / L ampicillin into three 500 mL baffled Erlenmeyer flasks, add 1 mL of the preculture to each baffled Erlenmeyer flask, and add 2.5 mL at 37 ° C. Rotating shaking culture was performed at 200 rpm for ~ 3.5 hours. When the OD (600 nm) reached about 0.5, cold shock was performed for 1 hour, and rotary shaking culture was performed at 15 ° C. for 1 day at 200 rpm. The culture is then centrifuged at 4 ° C, 6,000 rpm for 30 minutes to remove the supernatant, and the cells are recovered while washing several times with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 10% glycerol. did. The collected cells were suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 10% glycerol, and the cells were crushed by ultrasonic waves. The solution after disruption of the cells was centrifuged at 4 ° C. and 10,000 rpm for 30 minutes to remove cell residues, and the supernatant was collected. The enzyme solution obtained here is adsorbed to “Talon Metal Affinity Resin” (Takara Bio Inc.) equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 10% glycerol, and contains 10% glycerol. After equilibration with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7), washing was performed with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 5 mM imidazole and 10% glycerol, and 200 mM imidazole, 10 The enzyme was eluted with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing% glycerol. The enzyme obtained here was desalted and concentrated with “PD-10” (GE Healthcare Japan, Inc.) equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) to obtain purified PPGK. It was. The PPGK obtained here has a histidine tag derived from the pColdI vector (the amino acid sequence of this histidine-tagged PPGK is shown in SEQ ID NO: 2).
（４）酵素法による2-デオキシ-scyllo-イノソースの調製
50 mLファルコンチューブに、グルコース 54 mg、ポリリン酸 184 mg、1 mM MgCl2、0.3 mM NAD+、上記で精製した2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素 10 μM、同じく上記で精製したPPGK 10 μMを加え、0.2 mM塩化コバルト六水和物を含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）で全容を10 mLとし、28℃で１日撹拌した。エタノールを10 mLで加え、4℃、10,000 rpmで10分間遠心分離して上清を50 mLのファルコンチューブに回収した。その一部を既知の方法（J. Antibiot., 45, 767-773 (1992).）で、2-デオキシ-scyllo-イノソースを分析したところ、変換率は90%以上であった。残りの水溶液をアンバーライトIR200(H+型)とアンバーライトIRA400(アセタート型)を各20 mL含むカラムに充填し、蒸留水で溶出し、溶出液を凍結乾燥させたところ、2-デオキシ-scyllo-イノソースを41 mg（収率85%）得られた。
(4) Preparation of 2-deoxy-scyllo-inosose by enzymatic method
In a 50 mL Falcon tube, add 54 mg glucose, 184 mg polyphosphate, 1 mM MgCl 2 , 0.3 mM NAD + , 10 μM 2-deoxy-scyllo-inosose synthase purified above, and 10 μM PPGK purified above as well. In addition, the whole volume was adjusted to 10 mL with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 0.2 mM cobalt chloride hexahydrate, and stirred at 28 ° C. for 1 day. Ethanol was added at 10 mL, centrifuged at 4 ° C. and 10,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected in a 50 mL Falcon tube. When a part of the sample was analyzed for 2-deoxy-scyllo-inosose by a known method (J. Antibiot., 45, 767-773 (1992)), the conversion rate was 90% or more. The remaining aqueous solution was packed in a column containing 20 mL each of Amberlite IR200 (H + type) and Amberlite IRA400 (acetate type), eluted with distilled water, and the eluate was lyophilized to give 2-deoxy-scyllo. -41 mg (yield 85%) of inosose was obtained.
（５）固定化酵素を利用した2-デオキシ-scyllo-イノソースの調製
上記と同じ要領で、2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素およびPPGKの無細胞抽出液を、10％グリセロールを含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）で平衡化した「Talon Metal Affinity Resin」（タカラバイオ株式会社）に吸着させ、10％グリセロールを含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）、次いで0.2 mM塩化コバルト六水和物を含む10％グリセロールを含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）で平衡化し、5 mMおよび20 mMのイミダゾール、0.2 mM 塩化コバルト六水和物を含有する10％グリセロールを含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）、各10 mLで洗浄し、0.2 mM塩化コバルト六水和物を含む10％グリセロールを含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）で平衡化した。
(5) Preparation of 2-deoxy-scyllo-inosose using immobilized enzyme In the same manner as above, a cell-free extract of 2-deoxy-scyllo-inosose synthase and PPGK was added to 50 mM Tris containing 10% glycerol. -Adsorbed on "Talon Metal Affinity Resin" (Takara Bio Inc.) equilibrated with -HCl buffer (pH 7.7), 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 10% glycerol, then 0.2 mM cobalt chloride Equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 10% glycerol containing hexahydrate, containing 10% glycerol containing 5 mM and 20 mM imidazole, 0.2 mM cobalt chloride hexahydrate The cells were washed with 10 mL of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) and equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 10% glycerol containing 0.2 mM cobalt chloride hexahydrate.
２つの酵素が吸着している樹脂をバイアルに移し、0.2 mM塩化コバルト六水和物を含む10％グリセロールを含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7）10 mL、グルコース 18 mg、ポリリン酸 61 mg、1 mM MgCl2、0.1 mM NAD+を加え、室温で１日撹拌した。 Transfer the resin on which the two enzymes are adsorbed to a vial, 10 mL of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) containing 10% glycerol containing 0.2 mM cobalt chloride hexahydrate, glucose 18 mg, polyphosphate 61 mg, 1 mM MgCl 2 and 0.1 mM NAD + were added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 day.
反応溶液からレジンを濾過し、溶液を300容ナスフラスコに回収した。この溶液を上記と同様の操作を行ったところ、2-デオキシ-scyllo-イノソースを14 mg（収率89%）得られた。 The resin was filtered from the reaction solution, and the solution was recovered in a 300-volume eggplant flask. When this solution was subjected to the same operation as described above, 14 mg (yield 89%) of 2-deoxy-scyllo-inosose was obtained.
回収した樹脂を、バイアルに移し、上記と同様な操作で再度反応を行ったところ、2-デオキシ-scyllo-イノソースを5 mg（収率30%）得られた。 The collected resin was transferred to a vial and reacted again in the same manner as described above. As a result, 5 mg (yield 30%) of 2-deoxy-scyllo-inosose was obtained.
本発明は、2-デオキシ-scyllo-イノソースが必要とされる各種産業分野において利用可能である。 The present invention can be used in various industrial fields where 2-deoxy-scyllo-inosose is required.
Claims (5)
(a)配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリリン酸グルコキナーゼ活性を有するタンパク質。 The method for preparing 2-deoxy-scyllo-inosose according to claim 1 or 2, wherein the polyphosphate glucokinase is the following protein (a) or (b):
(a) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(b) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having polyphosphate glucokinase activity.
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