JP2014029278A - 蛍光測定方法及び蛍光測定キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 蛍光測定キットは、試料容器1と試料容器1に予め収容された検査液2とから成る。検査液2は、試料容器1が蛍光光度計の容器装着部31に装着された際、セル部12の底面からの検査液1の液面の高さをh、セル部12内での励起光のビームBの高さ方向の幅をw、セル部12の底面から見た励起光のビームBの中心位置の高さをaとしたとき、h−(a+w/2)≧2.5mmとなる量で収容されている。蛍光が検査液2の液面に反射して検出器33に取り込まれることがないので、精度の良い測定が安定して行える。
【選択図】 図4
Description
例えば、特許文献1には、液相状態の対象物について次々に蛍光測定を行う連続蛍光分析法が開示されている。また、特許文献2には、フォトダイオードを検出器とする半導体蛍光光度計が開示されている。この蛍光光度計は、発光ダイオードやレーザダイオードといった固体光源を励起光源として用いており、工業用水系等における試料のモニターを蛍光測定によって行っている。
また、特許文献3には、蛍光測定を免疫測定に応用した技術が開示されている。ここでは、抗体を蛍光色素により標識し、クエンチングの解消による蛍光強度の変化を指標として液相状態で抗原の濃度を測定したり抗原を可視化したりする技術が開示されている。
しかしながら、発明者の研究によると、微量試料の蛍光測定、特に液相状態の微量試料の蛍光測定においては、精度低下の要因となる問題があることが判明した。本願発明は、この問題を解決するためになされたものであり、液相状態の微量試料の蛍光測定において、精度低下を招くことがない測定方法及びその方法に使用される測定キットを提供するものである。
セル部の底面からの液相対象物の液面の高さをh、
セル部内での励起光のビームの高さ方向の幅をw、
セル部の底面から見たセル部内での励起光のビームの中心位置の高さをaとしたとき、
h−(a+w/2)≧2.5mmの関係を維持しつつ液相対象物に励起光を照射し、照射された液相対象物からの蛍光の強度を測定するという構成を有する。
また、上記課題を解決するため、請求項2記載の発明は、前記請求項1の構成において、前記液相対象物の量は100マイクロリットル以下であるという構成を有する。
また、上記課題を解決するため、請求項3記載の発明は、前記請求項1又は2の構成において、前記液相対象物は、第一の検査液と、第一の検査液に対して別の検査液を加えてなる第二の検査液となっており、第一の検査液に対して励起光を照射して蛍光強度を測定する第一のステップと、第一のステップの後、第二の検査液に対して励起光を照射して蛍光強度を測定する第二のステップとを行う方法であり、
第一のステップにおいて前記h−(a+w/2)≧2.5mmを成立させ、その後、前記別の検査液を加えて第二の検査液とした後に、ビームの大きさ及び導入位置を変更せずに第二のステップを行うことで第二のステップにおいても前記h−(a+w/2)≧2.5mmを成立させて行うという構成を有する。
また、上記課題を解決するため、請求項4記載の発明は、前記請求項3の構成において、前記第二の検査液の量は100マイクロリットル以下であるという構成を有する。
また、上記課題を解決するため、請求項5記載の発明は、前記請求項3又は4の構成において、前記別の検査液は抗原を含んでおり、前記第一の検査液は、当該抗原に対する抗体を含んでおり、前記第一第二のステップを行うことで抗原の濃度を測定するという構成を有する。
試料容器と、試料容器内に予め収容された検査液とから成っており、検査液は、試料が加えられた後に励起光が照射されて蛍光が測定されるものであり、
蛍光光度計は、試料容器を装着する容器装着部を備え、容器装着部に試料容器が装着された際に試料容器のセル部内の検査液に励起光を照射し、検査液から発せられた蛍光を検出器で検出してその強度を測定するものであり、
検査液は、試料容器が蛍光光度計の容器装着部に装着された際、セル部の底面からの検査液の液面の高さをh、セル部内での励起光のビームの高さ方向の幅をw、セル部の底面から見たセル部内での励起光のビームの中心位置の高さをaとしたとき、h−(a+w/2)≧2.5mmとなる量で試料容器内に予め収容されているという構成を有する。
また、上記課題を解決するため、請求項7記載の発明は、前記請求項6の構成において、前記試料は抗原を含んでおり、前記検査液は当該抗原に対する抗体を含んでいるという構成を有する。
また、請求項2又は4記載の発明によれば、上記効果に加え、液相対象物の量が100マイクロリットル以下であるので、試料が限度以上に希釈化されて測定精度が低下したり、測定自体ができなくなってしまったりする問題がないという効果が得られる。
また、請求項3記載の発明によれば、上記効果に加え、第一の検査液での測定と第二の検査液での測定とで、液面高さに依存した蛍光強度の変化が生じないので、測定精度の低下が防止される。
また、請求項5記載の発明によれば、上記請求項3又は4の効果を得つつ蛍光免疫測定を行うことができ、抗原の濃度を精度良く測定することができる。
また、請求項7記載の発明によれば、上記請求項6の効果を得つつ蛍光免疫測定を行うことができ、抗原の濃度を精度良く測定することができる。
図1は、本願発明の実施形態に係る蛍光測定キットの概略図であり、(1)は試料容器の概略図、(2)は個装された状態のキットを示した概略図である。
図1(1)に示すように、実施形態の蛍光測定キットは、試料容器1と、試料容器1内に予め収容されている検査液2とから成っている。「検査液」とは、測定に用いられる液相材料という程度の意味である。また、本明細書において、「対象物」の語は、励起光を照射し、そこからの蛍光を測定する一次的な対象という意味で用いられている。また、「試料」の語は、対象物の蛍光を測定することで最終的に同定や定量を行う目的物又はそのような目的物を含む材料の意味で用いられている。検査液に対してそのまま励起光を照射して蛍光を測定する場合には検査液が液相対象物ということになるし、検査液に試料を加えて測定する場合には試料を加えた検査液が液相対象物ということになる。また、後述するように試料は蛍光色素によって標識される場合があり、このような場合には、測定する蛍光は試料自体から発せられたものではないこともあり得る。尚、「蛍光」は、本明細書では広い概念であり、燐光を含む。
試料容器1は、下端にセル部12を有している。セル部12は、上側の部位に比べて内部空間の断面積が小さいものとなっている。セル部12の内部空間の形状は、この実施形態では直方体状となっている。
図1(2)に示すように、本実施形態の蛍光測定キットは、汚損や異物の混入がないよう個装袋4で密封されて個装された状態でユーザーに届けられる。個装袋4内は、キットの劣化防止のため、減圧脱気されたり、又は窒素充填されたりする場合がある。
図2及び図3に示す蛍光光度計は、試料容器1を装着する容器装着部31と、励起光を放射する光源32と、励起光が照射された液相対象物からの蛍光を検出する検出器33と、光源32からの励起光を試料容器1のセル部12内に導くとともにセル部12内の液相対象物からの蛍光を検出器33に導く光学系34とを備えている。
筐体35は、上面部の一部が開閉蓋351となっている。開閉蓋351を開くと、図2に示すように、試料容器1の挿入孔350が形成されるようになっている。挿入孔350の付近から下方に延びるようにして、筐体35内には容器装着部31が形成されている。容器装着部31は、試料容器1の寸法形状に適合した枠状の部位である。
図2に示すように、ダイクロイックミラー342は、容器装着部31に装着された試料容器1のセル部12とほぼ同じ高さの位置に配置されている。ダイクロイックミラー342は、斜め45°の角度で配置されており、その上方に光源32が配置されている。光源32は、下方に向けて光を放出する姿勢となっている。ダイクロイックミラー342は、励起光の波長の光を反射し、測定する蛍光の波長の光を透過するものである。
蛍光用フィルタ344は、発生する蛍光の波長の光を選択的に透過するものであり、ダイクロイックミラー342と検出器33との間に配置されている。例えば、発生する蛍光の波長が550〜630nmの場合、570〜610nm程度の波長域の光を透過し、それ以外の波長域の光を反射するものが蛍光用フィルタ344として使用される。
集光レンズ341による集光位置(最もビームが細くなる位置)は、セル部12の中央である。尚、ビーム径は最も細い位置で0.5〜1.5mm程度である。尚、集光レンズ341は、液相対象物から発せられた蛍光を集めて検出器33に入射させる目的でも配置されている。
尚、筐体35内には、各部の動作の制御や信号処理を行う制御部を収容した制御ボックス36が設けられている。また、図3に示すように、筐体35の前面には、光度計の動作状態や測定結果を表示するための表示部38が設けられている。制御部は、検出器33で検出された蛍光強度の信号を処理して測定結果を表示部38に表示するプロセッサやデータを記憶するメモリ(RAM等)を有している。また、筐体35内には、電池ケース37が設けられている。電池ケース37には、光源32や検出器33等に必要な電圧を供給する電池が装着される。
この他、制御部は、正確な測定に必要な校正のための設定回路も有している。検出器33からの信号は増幅回路で増幅され、設定回路で設定されている校正用の参照値と比較されて蛍光強度の測定値が出力される。
h−(a+w/2)≧2.5mm 式(1)
の関係が維持されるようになっている。
図5に結果を示す実験では、蛍光色素をバッファ液に溶かしたものを検査液として用いた。使用した蛍光色素はTAMRA(励起光555nm、発生蛍光580nm)で、バッファ液としては、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)を用いた。蛍光色素の濃度は10nmol/Lで一定とし、セル部12への投入量を変化させながら、その蛍光強度を測定した。
尚、容器Bに比べて容器Aの方が蛍光強度が大きい結果となっているが、これは、セル部12の奥行きが容器Aの方が大きいため、励起光で励起される蛍光色素の総量が多くなることによる。容器Bの方が容器Cより蛍光強度が大きいのも同様の理由である。
図6に示すように、励起光Lが検査液2に照射されると、検査液2中の蛍光色素Mから蛍光Fが放出される。蛍光Fは、四方八方に放出され、その一部が図6中不図示の検出器の方向に向かい、検出器に捉えられる。この際、放出された蛍光の一部は、検出液2の液面の方向に向かい、液面で反射する。液面で反射した蛍光Fの一部は検出器の方向に向かい、検出器に捉えられる。この際、図6(1)に示すように、液面が低い場合(検査液が少ない場合)には、液面に反射して検出器の方向に向かう蛍光の量は多い。特に、液面の上側は空気(屈折率1)であり、検査液2はそれより大きな屈折率であるため、反射して検出器の方に向かい易い。一方、図6(2)に示すように、液面が高くなると、蛍光Fは液面に反射しても検出器から外れた方向に進むものが多くなる。このため、液面に反射して検出器に捉えられる蛍光Fは殆ど無くなる。図5に示す結果は、このような状況を示しているものと推測される。
しかしながら、本実施形態のような二液での蛍光測定の場合、不可避的な問題になり得る。即ち、所定量の検査液で最初に蛍光測定を行い、次に追加検査液を加えて再度蛍光測定を行う場合、検査液の全量は不可避的に増加するから、液面での蛍光反射の問題は不可避となる。この場合、前述した蛍光免疫測定のように、最初の検査液での蛍光強度と追加検査液を加えた際の蛍光強度の比を測定するような場合には、蛍光強度の変化が対象物の本来的な性質や量によるものなのか、それと単に液面高さが上昇したことによるものなのかの見分けがつかなくなってしまう。
また、二液タイプの蛍光測定ではなく検査液の追加がない蛍光測定の場合であっても、液面高さが低いと、試料容器1に収容された検査液の量の僅かなばらつきが測定結果がばらつきに直結することになる。したがって、やはり測定精度の低下につながる。
次に、蛍光光度計を垂直に立てた姿勢を保持しながら、電源スイッチをオンにし、表示部38に操作メニューを表示する。そして、操作ボタン391〜396を選択的に操作し、第一の測定操作を行う。これにより、第一の検出液における蛍光強度が測定される。測定結果はメモリの第一の記憶領域に記憶されるとともに、表示部38に表示される。
次に、操作ボタン391〜396を選択的に操作し、測定結果分析を行う。これにより、分析用のプログラムがメモリから呼び出される。プログラムにより、第一の検査薬における蛍光強度と第二の検査薬における蛍光強度が比較され、抗原濃度の測定結果が出力されて表示部38に表示される。
したがって、メタンフェタミン検出用の検査液としては、適宜選択された抗メタンフェタミン抗体に対して、適宜選択された蛍光標識色素を結合させて標識し、それをPBS溶液(リン酸バッファ液)に溶かしたものを第一の検査液として使用することができる。このような第一の検査液を前述したように100μL以下であって前記式(1)が満足されるように試料容器1に予め収容しておく。
試料がメタンフェタミンであれば、抗メタンフェタミン抗体が抗原(メタンフェタミン)に反応することでクエンチングの解消作用が生じる。このため、蛍光強度が増加する。したがって、強度比が一定以上の大きさであるかどうかで、試料がメタンフェタミンかどうか判断することができる。
10 開口
11 開閉蓋
12 セル部
2 検査液
31 容器装着部
32 光源
33 検出器
34 光学系
341 集光レンズ
342 ダイクロイックミラー
343 励起光用フィルタ
344 蛍光用フィルタ
35 筐体
Claims (7)
- 試料容器のセル部に収容された液相対象物に励起光を照射し、液相対象物からの蛍光の強度を測定する蛍光測定方法であって、
セル部の底面からの液相対象物の液面の高さをh、
セル部内での励起光のビームの高さ方向の幅をw、
セル部の底面から見たセル部内での励起光のビームの中心位置の高さをaとしたとき、
h−(a+w/2)≧2.5mmの関係を維持しつつ液相対象物に励起光を照射し、照射された液相対象物からの蛍光の強度を測定することを特徴とする蛍光測定方法。 - 前記液相対象物の量は100マイクロリットル以下であることを特徴とする請求項1記載の蛍光測定方法。
- 前記液相対象物は、第一の検査液と、第一の検査液に対して別の検査液を加えてなる第二の検査液となっており、第一の検査液に対して励起光を照射して蛍光強度を測定する第一のステップと、第一のステップの後、第二の検査液に対して励起光を照射して蛍光強度を測定する第二のステップとを行う方法であり、
第一のステップにおいて前記h−(a+w/2)≧2.5mmを成立させ、その後、前記別の検査液を加えて第二の検査液とした後に、ビームの大きさ及び導入位置を変更せずに第二のステップを行うことで第二のステップにおいても前記h−(a+w/2)≧2.5mmを成立させて行うことを特徴とする請求項1記載の蛍光測定方法。 - 前記第二の検査液の量は100マイクロリットル以下であることを特徴とする請求項3記載の蛍光測定方法。
- 前記別の検査液は抗原を含んでおり、前記第一の検査液は、当該抗原に対する抗体を含んでおり、前記第一第二のステップを行うことで抗原の濃度を測定することを特徴とする請求項3又は4記載の蛍光測定方法。
- 液相対象物の蛍光強度を測定する蛍光光度計とともに使用される蛍光測定キットであって、
試料容器と、試料容器内に予め収容された検査液とから成っており、検査液は、試料が加えられた後に励起光が照射されて蛍光が測定されるものであり、
蛍光光度計は、試料容器を装着する容器装着部を備え、容器装着部に試料容器が装着された際に試料容器のセル部内の検査液に励起光を照射し、検査液から発せられた蛍光を検出器で検出してその強度を測定するものであり、
検査液は、試料容器が蛍光光度計の容器装着部に装着された際、セル部の底面からの検査液の液面の高さをh、セル部内での励起光のビームの高さ方向の幅をw、セル部の底面から見たセル部内での励起光のビームの中心位置の高さをaとしたとき、h−(a+w/2)≧2.5mmとなる量で試料容器内に予め収容されていることを特徴とする蛍光測定キット。 - 前記試料は抗原を含んでおり、前記検査液は当該抗原に対する抗体を含んでいることを特徴請求項6記載の蛍光測定キット。
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