JP2014006266A - 蛍光検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】表面プラズモン増強を利用した蛍光検出方法において、誘電体プリズム22の一面に設けられた金属膜12を含む検出部に電場増強場Ewを発生せしめ、この電場増強場Ewの励起効果によって生じる、被検出物質Aに付与された蛍光標識Fからの蛍光を、光検出器30により検出する際に、複数の金属微粒子Pを検出部の上に分散させる。
【選択図】図1
Description
誘電体プリズムの一面に設けられた金属膜を含む検出部に被検出物質及び複数の金属微粒子を含む試料を供給し、
金属膜の上面に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめ、かつ、金属微粒子間及び金属膜と金属微粒子との間に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめるように、誘電体プリズムと金属膜との界面に対して誘電体プリズムを通して励起光を照射し、
被検出物質に付与された蛍光標識からの蛍光を光検出器により検出し、
光検出器によって検出された蛍光量に基づいて被検出物質の存在量を検出することを特徴とするものである。
誘電体プリズムの一面に設けられた金属膜を含む検出部に被検出物質を含む試料を供給し、
試料を供給した後、蛍光標識を検出部に供給し、
被検出物質および蛍光標識を検出部に固着させる工程が終わった後、複数の金属微粒子を検出部に供給し、
金属膜の上面に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめ、かつ、金属微粒子間及び金属膜と金属微粒子との間に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめるように、誘電体プリズムと金属膜との界面に対して誘電体プリズムを通して励起光を照射し、
被検出物質に付与された蛍光標識からの蛍光を光検出器により検出し、
光検出器によって検出された蛍光量に基づいて被検出物質の存在量を検出することを特徴とするものである。
<第1の実施形態>
図1は、本実施形態による蛍光検出装置の概略部分断面図である。本実施形態では、被検出物質としての抗原Aを含む試料Sから、抗原Aを検出する場合について説明する。
0.1MのNHSと0.4MのEDCとを等体積混合した溶液を30ul加え、30分間室温静置する。
NHS:N-hydrooxysuccinimide
EDC:1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
(2)1次抗体の固定化
PBSバッフア(pH7.4)で5回洗浄後、1次抗体溶液(500ug/ml)を30ul加え、30〜60分間室温静置する。
(3)未反応の−COOH基をブロッキング
PBSバッフア(pH7.4)で5回洗浄後、1Mのエタノールアミン(pH8.5)を30ul加え、20分間室温静置する。さらにPBSバッフア(pH7.4)で5回洗浄する。
(2)金コロイド表面分散剤の置換(クエン酸→シロキサン)
5×=10−4molの金コロイド水溶液500ml(ミリ・リットル)に、APS((3-Aminopropyl)trimethoxysilane)水溶液(2.5ml、1mmol)を添加し、15分間強攪拌することにより、金コロイド表面のクエン酸を置換する。
(3)金コロイド表面のSiO2修飾
pH10〜11に調整したsodium silicate0.54重量%水溶液20mlを工程(2)の金コロイド水溶液に添加し、強攪拌する。24時間経過すると、厚さが約4nmのSiO2膜が形成される。この溶液を遠心分離により30mlまで濃縮した溶液に、170mlのエタノールを添加する。さらに0.6mlのNH4OH(28%)を滴下し、80μl(マイクロ・リットル)のTES(テトラエトキシシラン)を添加し、24時間ゆっくり攪拌すると、厚さ20nmのSiO2膜からなる誘電体層41が形成される。
平均粒径が役30nmのクエン酸安定化金ナノ粒子を最大約360pmol(=7×10−11重量%)含む水分散液を1ml用意し、これを遠心分離にかけた後、上澄み0.95mlを捨てる。残った暗赤色、粘稠性の沈殿物を1mlのDMF(N,N-dimethylformamide)に再分散させる。なお、過剰のクエン酸イオンは粒子のカプセル化を阻害する。また、小粒径の粒子を用いる場合は、DMFを加える前に水で洗浄した方が良い。
上記(1)の工程で得られた、平均粒径(粒径は、透過型電子顕微鏡による直接観察や、光吸収スペクトルから換算する方法にて決定することができる。)が約30nmのクエン酸安定化金ナノ粒子を約648pmol(=7×10−11重量%)含むDMF分散液1mlに、ポリスチレン-ポリアクリル酸ブロック共重合体(ポリスチレンが約100量体、ポリアクリル酸が約13量体)のDMF溶液(約10−2g/ml)10μlを加え、シリンジポンプにより8.3μl/minの流量で水200μlを加えて激しく撹拌する。10分撹拌すると溶液の色が徐々に紫色に変化するので、そこで1重量%のドデカンチオールDMF溶液5μlを加え、24時間撹拌する。その後、さらにシリンジポンプにより、2ml/hの流量で水3mlを加える。
図4は、本実施形態による蛍光検出方法および蛍光検出装置における、金属微粒子Pを分散させた検出部付近を示す概略部分断面図である。本実施形態において使用する蛍光検出装置は、図1に示す第1の実施形態で説明した蛍光検出装置と同様である。一方、本実施形態による蛍光検出方法は、入射する励起光Liの波長として、金属微粒子Pに局在プラズモンを誘起することが可能である特定の波長を用いている点で第1の実施形態と異なる。そのため、その他の構成は、第1の実施形態の場合と同様であり、図1および図2に示す第1の実施形態と同等の要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。
図5は、本実施形態による蛍光検出方法および蛍光検出装置における、金属微粒子Pを分散させた検出部付近を示す概略部分断面図である。本実施形態において使用する蛍光検出装置は、図1に示す第1の実施形態で説明した蛍光検出装置と同様である。一方、本実施形態による蛍光検出方法は、被検出物質を標識する蛍光標識として、蛍光色素分子を、蛍光色素分子から生じる蛍光を透過させると共に、金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる消光防止性蛍光物質を用いている点と、金属微粒子Pを覆う誘電体層41を必要としない点で第1の実施形態と異なる。そのため、その他の構成は、第1の実施形態の場合と同様であり、図1および図2に示す第1の実施形態と同等の要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。
以上すべての実施形態において、金属微粒子Pを試料S中の溶媒に分散させて蛍光を検出する場合について説明してきたが、本発明は上記の場合に限られず、溶媒を乾燥させた後に蛍光を検出する方法としても本発明における課題を解決できる。
12a 誘電体プリズムおよび金属膜の界面
13 試料保持部
14 不撓性膜
15 蛍光色素分子
16 透光材料
21 光源
22 誘電体プリズム
30 光検出器
40 ホットスポット
41 誘電体層
90 試料中の不純物
S 試料
A 抗原
B1 1次抗体
B2 2次抗体
F・F’ 蛍光標識
FB 消光防止性蛍光物質
Li 励起光
Ls 散乱光
P 金属微粒子
Ew エバネッセント波
NL 近接場光
SP 表面プラズモン
Claims (7)
- 誘電体プリズムの一面に設けられた金属膜を含む検出部に被検出物質及び複数の金属微粒子を含む試料を供給し、
前記金属膜の上面に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめ、かつ、前記金属微粒子間及び前記金属膜と前記金属微粒子との間に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめるように、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対して前記誘電体プリズムを通して励起光を照射し、
前記被検出物質に付与された蛍光標識からの蛍光を光検出器により検出し、
該光検出器によって検出された蛍光量に基づいて前記被検出物質の存在量を検出することを特徴とする蛍光検出方法。 - 誘電体プリズムの一面に設けられた金属膜を含む検出部に被検出物質を含む試料を供給し、
前記試料を供給した後、蛍光標識を前記検出部に供給し、
前記被検出物質および前記蛍光標識を前記検出部に固着させる工程が終わった後、複数の金属微粒子を前記検出部に供給し、
前記金属膜の上面に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめ、かつ、前記金属微粒子間及び前記金属膜と前記金属微粒子との間に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめるように、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対して前記誘電体プリズムを通して励起光を照射し、
前記被検出物質に付与された前記蛍光標識からの蛍光を光検出器により検出し、
該光検出器によって検出された蛍光量に基づいて前記被検出物質の存在量を検出することを特徴とする蛍光検出方法。 - 前記金属微粒子の粒径が40〜200nmであることを特徴とする請求項1または2に記載の蛍光検出方法。
- 前記金属微粒子がナノロッドであることを特徴とする請求項1から3いずれかに記載の蛍光検出方法。
- 前記蛍光標識が、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過させると共に、金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる消光防止性蛍光物質であることを特徴とする請求項1から4いずれかに記載の蛍光検出方法。
- 前記検出部が、前記誘電体プリズムがある反対側の前記金属膜表面に、疎水性材料からなる膜厚10〜100nmの不撓性膜を有するものであることを特徴とする請求項1から5いずれかに記載の蛍光検出方法。
- 前記不撓性膜が、ポリマー材料から構成されるものであることを特徴とする請求項6に記載の蛍光検出方法。
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