JP5301894B2 - 検出方法 - Google Patents
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- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
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Description
前記センサ部に試料を接触させることにより、該センサ部上に、該試料に含有される被検出物質の量に応じた量の蛍光標識結合物質を結合させ、
前記センサ部に励起光を照射し、該励起光の照射により該センサ部上に増強された電場を生じさせ、該増強された電場内における、前記蛍光標識結合物質の蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する検出方法において、
前記蛍光標識結合物質に磁性微粒子を付与し、
前記誘電体プレートの前記一面と対向する他面側に配置された磁界印加手段により、前記磁性微粒子が修飾された前記蛍光標識結合物質を前記誘電体プレートの前記センサ部近傍に引き寄せた状態で前記被検出物質の量を検出することを特徴とする検出方法。
前記蛍光物質の粒径は、5300nm以下であることが好ましく、70nm〜900nmであることがより好ましく、さらには130nm〜500nmであることが特に好ましい。なお、本明細書において、蛍光物質の粒径は、略球状の粒子の場合にはその直径であり、球状でない粒子の場合にはその最大幅と最小幅との平均の長さで定義するものとする。
さらに、前記蛍光色素分子を包含する前記材料が、前記蛍光色素分子が金属層に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料であり、前記蛍光物質が消光防止性蛍光物質であることが特に好ましい。ここで、消光防止性とは、金属消光を生じるのを防ぐ機能を有することを意味し、消光防止材料は、内包される蛍光色素分子を、金属膜に対して金属消光が生じない距離に離間させることができるものであればよい。
また、「前記蛍光標識結合物質の蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する」方法としては、蛍光標識からの蛍光を直接検出するものであってもよいし、間接的に検出するものであってもよい。
具体的には、以下の態様(1)〜(4)が挙げられる。
前記センサチップを収容する収容部と、
前記センサ部に励起光を照射する励起光照射光学系と、
前記励起光の照射により生じる、前記被検出物質に応じた量の光を検出する光検出手段と、
前記収容部の、該収容部に前記センサチップが収容された際に、前記誘電体プレートの他面側となる側に配置された磁界発生手段とを備えたことを特徴とするものである。
液体試料が流下される流路を有する基台と、
前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
前記流路の、前記注入口と前記空気孔との間に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の少なくとも一部に設けられた誘電体プレートと該プレートの試料接触面の所定領域に少なくとも金属層が設けられてなるセンサ部とからなるセンサチップ部とを備えてなることを特徴とするものである。
前記液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記流路の、前記注入口と前記空気孔との間に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の少なくとも一部に設けられた誘電体プレートと、該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた少なくとも金属層を含むセンサ部とからなるセンサチップ部と、該センサ部上に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第1の結合物質とを備えた試料セル、および
前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に、前記流路内に流下される、前記被検出物質と特異的に結合する第2の結合物質、および前記被検出物質と競合して前記第1の結合物質と特異的に結合する第3の結合物質のうちのいずれか一方の結合物質と、該一方の結合物質が修飾された蛍光標識とからなり、磁性微粒子が付与されてなる蛍光標識結合物質を含む標識用溶液を備えてなることを特徴とするものである。
「検出方法および装置」
本発明の検出方法は、例えば図1に示すように、誘電体プレート11と誘電体プレート11の一面に設けられた少なくとも金属層12を含むセンサ部14とを有してなるセンサチップ10を用い、センサ部14に試料を接触させることにより、該センサ部14上に、該試料に含有される被検出物質Aの量に応じた量の蛍光標識結合物質BFを結合させ、センサ部14に励起光L0を照射し、励起光L0の照射によりセンサ部14上の電場を増強させ、該増強された電場D内における、蛍光標識結合物質BFの蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質Aの量を検出する検出方法であって、蛍光標識結合物質BFに磁性微粒子Mを付与し、誘電体プレート11の一面と対向する他面側に配置された磁界印加手段35により、磁性微粒子Mが付与された蛍光標識結合物質BFを誘電体プレート11のセンサ部14近傍に引き寄せた状態で被検出物質Aの量を検出するものである。
まず、ポリスチレン粒子(Estapor社、φ500nm、10%solid、カルボキシル基、製品番号K1―050)を調液して0.1%solid in phosphate(ポリスチレン溶液:pH7.0)を作製する。
次に、蛍光色素分子(林原生物化学研究所 NK−2014(励起 〜780nm))0.3mgの酢酸エチル溶液(1mL)を作製する。
上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離(15000rpm、4℃、20分を2回)を行い、上清を除去する。以上の工程により、金属消光を防止する機能を有するポリスチレンにより蛍光色素を内包してなる消光防止性蛍光物質Fを得ることができる。このような手順で、ポリスチレン粒子に蛍光色素を含浸させて作製された消光防止性蛍光物質Fの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一(上記例ではφ500nm)となる。
一方、蛍光色素分子は、表面プラズモンによって増強された、金属膜表面に染み出したエバネッセント波によって励起される。エバネッセント波の到達範囲(金属膜表面からの距離)は励起光の波長λ程度であり、その電界強度は金属膜表面からの距離に応じて指数関数的に急激に減衰することが知られている。蛍光色素分子を励起する電界強度は大きいほど望ましいので、効果的な励起を行なうためには、金属膜表面と蛍光色素分子との距離を100nmより小さくすることが望ましい。
蛍光標識として消光防止性蛍光物質を用いれば、蛍光色素分子fは消光防止材料で覆われていることから直接金属膜に触れることはなく、また、消光防止性蛍光物質中には複数の蛍光色素分子が内包されていることから、金属膜から10〜100nmの距離の範囲に複数の蛍光色素分子が存在する状態を容易に達成することができる。
第1実施形態の検出方法および装置について図1を参照して説明する。図1は第1の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、表面プラズモン共鳴により電場を増強させ、増強された電場において励起された蛍光を検出する蛍光検出方法および装置である。
センサチップ10は、ガラス板などの誘電体プレート11の一表面の所定領域に金属層12として金属膜が成膜されたものである。金属膜12は、所定領域に開口を有するマスクをプレート11の一表面に形成し、既知の蒸着法で成膜形成することができる。金属膜12の厚みは、金属膜12の材料と、励起光の波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが望ましい。例えば、励起光として780nmに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜として金(Au)膜を用いる場合、金属膜の厚みは50nm±20nmが好適である。さらに好ましくは、47nm±10nmである。なお、金属膜は、Au、Ag、Cu、Al、Pt、Ni、Ti、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも1種の金属を主成分とするものが好ましい。
ここでは、一例として、試料Sに含まれる被測定物質として抗原Aを検出する場合について説明する。
まず、試料保持部13中に検査対象である試料Sを流し、センサチップ10の金属膜12上に試料Sを接触させる。次いで同様に抗原Aと特異的に結合する第2の結合物質である2次抗体B2と蛍光標識Fとからなる蛍光標識結合物質BFを含む溶液を流す。この場合、金属膜12に表面修飾される1次抗体B1と蛍光標識結合物質BFの2次抗体B2として、被検出物質である抗原Aに対して互いに別の部位に結合するものを用いる。なお、ここでは、蛍光標識Fとして、磁性微粒子Mと蛍光色素分子fを内包する蛍光物質Fを用いている。試料S中に抗原Aが存在すれば、1次抗体B1に抗原Aが特異的に結合し、さらに抗原Aに蛍光標識結合物質BFの2次抗体B2が結合して、サンドイッチが形成される。その後、結合物と、未反応の蛍光標識結合物質BFを分離するため、バッファ溶液を流し、未反応の蛍光標識結合物質を排除する。
上述の各実施形態においては励起光Loとして、界面に所定の角度θで入射する平行光を入射するものとしたが、励起光としては、図3に模式的に示すような、角度θを中心に角度幅Δθを持つファンビーム(集束光)を用いてもよい。ファンビームの場合、プリズム122とプリズム上の金属膜112との界面に対して、角度θ―Δθ/2〜θ+Δθ/2の範囲の入射角度で入射することになり、この角度範囲内に共鳴角があれば、金属膜112に表面プラズモンを励起することができる。金属膜上への試料供給の前後において、金属膜上の媒質の屈折率が変化し、そのために表面プラズモンが生じる共鳴角が変化する。上述の実施形態のように平行光を励起光として用いる場合、共鳴角が変化するたびに平行光の入射角度を調整する必要がある。しかし、図3に示すような、界面に入射する入射角度に幅を持たせたファンビームを用いることにより、入射角度の調整をすることなく、共鳴角の変化に対応することができる。なお、ファンビームは入射角度による強度変化が少ないフラットな分布を持つものであることがより好ましい。
第2の実施形態である検出方法および装置について図4を参照して説明する。図4は第2の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、局在プラズモン共鳴により電場を増強させ、増強された電場において励起された蛍光を検出する蛍光検出方法および装置である。なお、以下においては、第1実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
図5(A)に示すセンサチップ10Aは、誘電体プレート11と、該プレート11の所定領域上にアレイ状に固着された複数の金属粒子73aからなる金属微細構造体73で構成されている。金属粒子73aの配列パターンは適宜設計できるが、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、金属粒子73aの平均的な径及びピッチが励起光Loの波長よりも小さく設計される。
図5(C)に示す例では、マッシュルーム状の金属75aの頭部が粒子状であり、サンプルプレート表面から見れば、金属微粒子が配列されたような構造になっている。かかる構成では、マッシュルーム状の金属75aの頭部が凸部であり、その平均的な径およびピッチが測定光Lの波長よりも小さく設計される。
センサチップを用意し、抗原―抗体反応をさせる工程は、第1の実施形態と同様であるため、説明を省略する。以下の実施形態において同様とする。
センサチップ10’を収容部19にセットした状態で、磁界印加手段35により磁界を生じさせ、磁性微粒子Mをセンサ部14に引き寄せる。磁性微粒子Mを内包する蛍光物質Fをセンサ部14に引き寄せた状態で、センサチップ10の誘電体プレート11の所定領域に向けて励起光照射光学系20により励起光Loを照射する。光源21から出射された励起光Loはハーフミラー23により反射されてセンサチップ10’の試料接触面上に入射される。この励起光Loの照射により、金属層12’の表面で局在プラズモンが励起される。励起光の入射により金属層上に生じている光電場(近接場光に起因する電場)が、この局在プラズモンにより増強され、金属層上に電場増強領域Dが形成される。電場増強領域には、磁界印加手段35により磁性微粒子Mを含む蛍光物質Fが引き寄せられており、その蛍光物質F中の蛍光色素分子fが励起されて蛍光Lfが発生する。この蛍光Lfを光検出器30により検出をすることにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および/または量を検出することができる。
第3の実施形態の検出方法および装置について図6を参照して説明する。図6は第3の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、表面プラズモン共鳴により電場を増強させ、増強された電場において励起された蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートの金属層形成面と反対の面側から放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する放射光検出方法および装置である。
センサチップ10を収容部19にセットした状態で、磁界印加手段35により磁界を生じさせ、磁性微粒子Mをセンサ部14に引き寄せる。磁性微粒子Mを内包する蛍光物質Fをセンサ部14に引き寄せた状態で、第1の実施形態と同様に、励起光照射光学系20により励起光Loを照射する。励起光照射光学系20により励起光Loが誘電体プレート11と金属膜12との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜上12の試料S中にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波によって金属膜12中に表面プラズモンが励起される。励起光の入射により金属層上に生じている光電場(エバネッセント波に起因する電場)が、この表面プラズモンにより増強され、金属層上に電場増強領域Dが形成される。電場増強領域Dには、磁界印加手段35により磁性微粒子Mを含む蛍光物質Fが引き寄せられており、その蛍光物質F中の蛍光色素分子fが励起されて蛍光Lfが発生する。このとき、表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。金属膜12上で生じたこの蛍光Lfが、金属膜12に表面プラズモンを新たに誘起し、この表面プラズモンによりセンサチップ10の金属膜形成面と反対側から特定の角度で放射光Lpが射出される。光検出器30によって、この放射光Lpを検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および/または量を検出することができる。
第4の実施形態の検出方法および装置について図7を参照して説明する。図7は第4の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、金属層上に光導波層を備えたセンサチップを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードにより電場を増強させ、増強された電場において励起された蛍光を検出する蛍光検出方法および装置である。
第5の実施形態の検出方法および装置について図8を参照して説明する。図8は第5の実施形態の検出装置の概略構成示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、金属層上に光導波層を備えたセンサチップを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードにより電場を増強させ、増強された電場において励起された蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートの金属層形成面と反対の面側から放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する放射光検出方法および装置である。
まず、前述手順により消光防止性蛍光物質を作製し、その表面にポリエチレンイミン(PEI)(エポミン、日本触媒社)を修飾する。
次に、粒子表面のPEIに粒径15nmのPdナノ粒子(平均粒径19nm、徳力本社)を吸着させる。
Pdナノ粒子が吸着したポリスチレン粒子を無電解金メッキ液(HAuCl4、小島化学薬品社)に浸漬させることで、Pdナノ粒子を触媒とする無電界メッキを利用して、ポリスチレン粒子表面に金膜を作製する。
本発明の検出方法のセンサチップとして使用される検出用試料セルについて説明する。
図10(A)は、第1の実施形態の試料セル50の構成を示す平面図、同図(B)は試料セル50の側断面図である。
検出用試料セル50は、誘電体プレートからなる基台51と、該基台51上に液体試料Sを保持し、液体試料Sの流路52を形成するスペーサ53と、試料Sを注入する注入口54aおよび流路52を流下した試料を排出する排出口となる空気孔54bを備えたガラス板からなる上板54とから構成され、流路52の注入口54aと空気孔54bとの間の試料接触面となる基台51の所定領域上に設けられた金属層58a、59aからなるセンサ部58、59が備えられている。また、注入口54aから流路52に至る箇所にはメンブレンフィルター55が備えられ、流路52下流の空気孔54bに接続する部分には廃液だめ56が形成されている。
図11は、サンドイッチ法によるアッセイに適した第2の実施形態の試料セルの側断面を示すものである。本実施形態の試料セル50Aにおいては、基台51上に流路52上流側から、被検出物質である抗原と特異的に結合する2次抗体(第2の結合物質)B2と該2次抗体B2が表面修飾された消光防止性蛍光物質Fからなる蛍光標識結合物質BF(以下、「標識2次抗体BF」という。)が物理吸着させてある標識2次抗体吸着エリア57、被検出物質である抗原と特異的に結合する1次抗体(第1の結合物質)B1が固定された第1の測定エリア58、被検出物質である抗原Aとは結合せず2次抗体B2と特異的に結合する1次抗体B0が固定された第2の測定エリア59が順に設けられている。この第1および第2の測定エリア58,59がセンサ部に相当する。本例では、センサ部に2つの測定エリアを設けた例を挙げているが、測定エリアは1つのみであってもよい。なお、蛍光標識結合物質BFは磁性微粒子Mが付与されてなるものである。磁性微粒子Mの付与の形態は、既述の図2A〜Dに示すいずれのものであってもよいが、ここでは、図2Dに示すように蛍光物質Fに磁性微粒子Mが内包されているものとしている。
step2:全血Soはメンブレンフィルター55により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
step3:メンブレンフィルター55で血球分離された血液(血漿)Sが毛細管現象で流路52に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔54bにポンプを接続し、メンブレンフィルター55で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図12中において血漿Sは斜線領域で示している。
step4:流路52に染み出した血漿Sと標識2次抗体BFとが混ぜ合わされ、血漿中の抗原Aが標識2次抗体BFの2次抗体B2と結合する。
step5:血漿Sは流路52に沿って空気孔54b側へと徐々に流れ、標識2次抗体BFと結合した抗原Aが、第1の測定エリア58上に固定されている1次抗体B1と結合し、抗原Aが1次抗体B1と2次抗体B2(標識2次抗体BF)で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
step6:抗原Aと結合しなかった標識2次抗体BFの一部は第2の測定エリア59上に固定されている1次抗体B0と結合する。さらに抗原Aまたは1次抗体B0と結合しなかった標識2次抗体BFが測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識2次抗体を洗い流す。
図13は、競合法によるアッセイに適した第3の実施形態の試料セルを示すものである。本実施形態の試料セル50Bにおいては、基台51上には流路52上流側から、被検出物質である抗原Aとは結合せず、後述の1次抗体と特異的に結合する2次抗体C3(第3の結合物質)と該2次抗体C3が表面修飾された消光防止性蛍光物質からなる蛍光標識結合物質CF(以下、「標識2次抗体CF」という。)を物理吸着させてある標識2次抗体吸着エリア57’、被検出物質である抗原Aおよび2次抗体C3と特異的に結合する1次抗体C1(第1の結合物質)が固定された第1の測定エリア58’、被検出物質である抗原Aとは結合せず標識2次抗体CFの2次抗体C3と特異的に結合する1次抗体C0が固定された第2の測定エリア59’が順に設けられている。なお、蛍光標識結合物質CFは磁性微粒子Mが付与されてなるものである。磁性微粒子Mの付与の形態は、既述の図2A〜Dに示すいずれのものであってもよいが、ここでは、図2Dに示すように蛍光物質Fに磁性微粒子Mが内包されているものとしている。
step2:全血Soはメンブレンフィルター55により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
step3:メンブレンフィルター55で血球分離された血液(血漿)Sが毛細管現象で流路52に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔54bにポンプを接続し、メンブレンフィルター55で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図14中において血漿Sは斜線領域で示している。
step4:流路52に染み出した血漿Sと標識2次抗体CFとが混ぜ合わされる。
step5:血漿Sは流路52に沿って空気孔54b側へと徐々に流れ、抗原Aと標識2次抗体CFの2次抗体C3とが競合して、第1の測定エリア58’上に固定されている1次抗体C1と結合する。
step6:第1の測定エリア58’上の1次抗体C1と結合しなかった標識2次抗体CFの一部は、第2の測定エリア59’上に固定されている1次抗体C0と結合する。さらに1次抗体C1またはC0と結合していない標識2次抗体CFが測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識2次抗体を洗い流す。
光導波モードによる電場増強を利用する検出方法および装置に用いる試料セルの断面図を図15に示す。図10に示した第1の実施形態の試料セルの構成と略同一であるが、センサ部の金属層58a、59a上にさらに光導波層58b、59bを備えている。
本発明の検出方法に使用される検出用キットについて説明する。
step2:全血Soはメンブレンフィルター55により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。引き続き、メンブレンフィルター55で血球分離された血液(血漿)Sが毛細管現象で流路52に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、メンブレンフィルター55で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図17中において血漿Sは斜線領域で示している。
step3:血漿Sは流路52に沿って空気孔54b側へと徐々に流れ、血漿S中の抗原Aが、第1の測定エリア58上に固定されている1次抗体B1と結合する。
step4:磁性微粒子Mが付与された標識2次抗体BFを含む標識用溶液63を供給口54aから注入する。
step5:標識2次抗体BFが毛細管現象により流路52に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、メンブレンフィルター55で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
step6:標識2次抗体BFは徐々に下流側に流れ、該標識2次抗体BFの2次抗体B2が抗原Aと結合し、抗原Aが1次抗体B1と2次抗体B2で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。抗原Aと結合しなかった2次抗体B2の一部は第2の測定エリア59上に固定されている1次抗体B0と結合する。さらに抗原Aまたは1次抗体B0と結合しなかった標識2次抗体BFが測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識2次抗体を洗い流す。
磁性微粒子Mを内包したポリマー粒子(例えば、モリテックス社製 M1-030/40 フェライト含有ポリエチレンビーズ φ〜400nm)を用い、このポリマー部分に蛍光色素を含浸させることにより、磁性微粒子Mと蛍光色素分子fを内包する蛍光物質Fを調製する。この磁性微粒子Mおよび蛍光色素分子Fを内包する蛍光物質Fを50mM MESバッファーおよび、5.0mg/mLの抗hCGモノクローナル抗体(Anti−hCG 5008 SP−5、Medix Biochemica社)溶液中に加えて撹拌する。これにより蛍光物質への抗体の修飾がなされる。
さらに、2mol/L Glycine水溶液を添加し撹拌した後、遠心分離にて、粒子を沈降させる。
最後に、上清を取り除き、PBS(pH7.4)を加え、超音波洗浄機により磁性微粒子Mおよび蛍光色素分子Fを内包する蛍光物質Fを再分散させる。さらに遠心分離を行い、上清を除いた後、1%BSAのPBS(pH7.4)溶液500μL加え、蛍光物質Fを再分散させて標識用溶液とする。
光導波モードによる電場増強を利用する検出方法および装置に用いる試料セルとしては、図15に示す、センサ部の金属層58a、59a上にさらに光導波層58b、59bを備え試料セルの光導波層58b、59b上に、それぞれ1次抗体B1、1次抗体B1とは異なる1次抗体B0を固定したものを用いればよい。
10、10’、10” センサチップ
11 誘電体プレート
12 金属層(金属膜)
12’ 金属層(金属微細構造体)
16 材料
19 金属被膜
20、20’ 励起光照射光学系
21 光源
22 プリズム
30 光検出器
35 磁界印加手段
50、50A、50B、61 試料セル
51 誘電体プレート
52 流路
53 スペーサ
54 上板
57 蛍光物質吸着エリア
58、59 検出エリア
60 検出用キット
63 検出用標識溶液
A 抗原(被検出物質)
B1、C1 1次抗体(第1の結合物質)
B2 2次抗体(第2の結合物質)
BF、CF 標識2次抗体(蛍光標識結合物質)
C3 2次抗体(第3の結合物質)
F 蛍光物質
f 蛍光色素分子
Lo 励起光
Lf 蛍光
Lp 放射光
M 磁性微粒子
Claims (10)
- 誘電体プレートと、該プレートの一面に少なくとも金属層が設けられてなるセンサ部とからなるセンサチップを用意し、
前記センサ部に試料を接触させることにより、該センサ部上に、該試料に含有される被検出物質の量に応じた量の蛍光標識結合物質を結合させ、
前記センサ部に励起光を照射し、該励起光の照射により該センサ部上に増強された電場を生じさせ、該増強された電場内における、前記蛍光標識結合物質の蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する検出方法において、
前記蛍光標識結合物質に磁性微粒子を付与し、
前記誘電体プレートの前記一面と対向する他面側に配置された磁界印加手段により、前記磁性微粒子が修飾された前記蛍光標識結合物質を前記誘電体プレートの前記センサ部近傍に引き寄せた状態で前記被検出物質の量を検出するものであり、
前記センサ部上に前記被検出物質の量に応じた量の蛍光標識結合物質を結合させる際にも前記磁界印加手段により磁界を印加し、
前記センサ部上に前記被検出物質の量に応じた量の蛍光標識結合物質を結合させた後、前記被検出物質の量を検出する前に、未反応の蛍光標識結合物質を洗い流す際には、前記磁界の印加を停止し、
前記未反応の蛍光標識結合物質を洗い流した後、前記磁界印加手段により再度磁界を印加して、前記被検出物質の量を検出することを特徴とする検出方法。 - 前記蛍光標識として、複数の蛍光色素分子を、該複数の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する材料により包含してなる蛍光物質を用いることを特徴とする請求項1記載の検出方法。
- 前記材料が、前記蛍光色素分子が金属層に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料であり、前記蛍光物質が消光防止性蛍光物質であることを特徴とする請求項2記載の検出方法。
- 前記センサ部に前記被検出物質と特異的に結合する第1の結合物質が固定されてなるセンサチップを用い、
前記蛍光標識結合物質として、前記被検出物質と特異的に結合する第2の結合物質、および前記被検出物質と競合して前記第1の結合物質と特異的に結合する第3の結合物質のうちのいずれか一方の結合物質と、該一方の結合物質が修飾された蛍光標識とからなるものを用い、
前記磁性微粒子を、前記いずれか一方の結合物質に修飾することを特徴とする請求項1から3いずれか1項記載の検出方法。 - 前記磁性微粒子を、前記蛍光物質に修飾することを特徴とする請求項2または3記載の検出方法。
- 前記磁性微粒子を、前記蛍光物質の前記材料に内包させることを特徴とする請求項2または3記載の検出方法。
- 前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンにより前記増強した電場を生じさせ、
前記蛍光標識が励起されて生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光を検出することにより前記被検出物質の量を検出することを特徴とする請求項1から6いずれか1項記載の検出方法。 - 前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンにより前記増強した電場を生じさせ、
前記蛍光標識が励起されて生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートの前記他面から放射される、前記新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出することにより前記被検出物質の量を検出することを特徴とする請求項1から6いずれか1項記載の検出方法。 - 前記センサチップとして、前記金属層上に光導波層を備えたものを用い、
前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードにより前記増強した電場を生じさせ、
前記蛍光標識が励起されて生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光を検出することにより前記被検出物質の量を検出することを特徴とする請求項1から6いずれか1項記載の検出方法。 - 前記センサチップとして、前記金属層上に光導波層を備えたものを用い、
前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードにより前記増強した電場を生じさせ、
前記蛍光標識が励起されて生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートの前記他面から放射される、前記新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出することにより前記被検出物質の量を検出することを特徴とする請求項1から6いずれか1項記載の検出方法。
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