JP2013544263A - Hsp70の細胞内活性を上昇させる方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図12
Description
ファブリー病(Fabry disease)、およびサポシン欠損症(saposin−deficiency)からなる群から選択されないリソソーム蓄積症の治療に使用するため、Hsp70の細胞内濃度および/または活性を上昇させることができる生理活性を提供することが、本発明のさらなる一つの態様である。
リソソーム蓄積障害(LSD):用語「リソソーム蓄積障害」と「リソソーム蓄積症」は同義語として使用される。
(i)極性側鎖を有するアミノ酸(Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr、およびCys)
(ii)非極性側鎖を有するアミノ酸(Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、およびMet)
(iii)脂肪族側鎖を有するアミノ酸(Gly、Ala、Val、Leu、Ile)
(iv)環側鎖を有するアミノ酸(Phe、Tyr、Trp、His、Pro)
(v)芳香族側鎖を有するアミノ酸(Phe、Tyr、Trp)
(vi)酸性側鎖を有するアミノ酸(Asp、Glu)
(vii)塩基性側鎖を有するアミノ酸(Lys、Arg、His)
(viii)アミド側鎖を有するアミノ酸(Asn、Gln)
(ix)ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸(Ser、Thr)
(x)硫黄(sulphor)含有側鎖を有するアミノ酸(Cys、Met)
(xi)中性の弱い疎水性アミノ酸(Pro、Ala、Gly、Ser、Thr)
(xii)親水性酸性アミノ酸(Gln、Asn、Glu、Asp)
(xiii)疎水性アミノ酸(Leu、Ile、Val)
1955年のde Duveによるリソソームの発見以来、この細胞小器官の見方は、単に動物細胞におけるエンドサイトーシス経路の終点、すなわち細胞質ゾル内に放出されると壊死おび組織の炎症を引き起こす様々な加水分解酵素を収容する区画であるというドグマによって支配されてきた。良くてもゴミ箱、悪いと曖昧な「自殺バッグ」というリソソームに対する見方は、リソソームおよびその内容物の様々なより明確な役割についての証拠を提供する最近の発見によって劇的に変化した。
細胞内の分解およびそれに続く細胞成分の再利用のための主な区画として、リソソームは、この細胞小器官の内腔で最終目的地を見つける異種および自己貪食カーゴの両方を受け取る。分解は、全ての主な細胞巨大分子を消化することができる多数の酸性加水分解酵素(ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、スルファターゼ、リパーゼなど)によって行われる。この中で最も研究されたリソソームプロテアーゼは、カテプシンプロテアーゼのファミリーである。カテプシンは、それらの活性部位のアミノ酸によって3つのサブグループ、すなわちシステイン(B、C、H、F、K、L、O、S、V、W、およびX/Z)、アスパラギン酸(DおよびE)、およびセリン(G)カテプシンに分けられる。カテプシンは、リソソームの酸性pH(pH4〜5)で最適に機能し、中性pHのリソソームの外部でも、安定性の低下および/または特異性の変更があるがなお機能することができる。
細胞内膜の輸送は、膜構成成分、様々な溶質分子、および受容体結合リガンドの様々な細胞内区画への送達によって哺乳動物細胞に必須の役割を果たす。主な経路がリソソームで1つになり、そこで分解され場合によっては原形質膜に戻り再利用が行われるため、様々なエンドサイトーシス経路が最近まで単純であると思われていたが、最近の証拠は、これらの経路が初めに考えられていたよりも複雑であることを示している。
エンドサイトーシスは、クラスリン被覆ピットの形成による分子の受容体媒介エンドサイトーシスに関して最もよく理解されているが、様々な非クラスリン媒介エンドサイトーシス経路(例えば、マクロピノサイトーシス、食作用、カベオラ形成および非クラスリン被覆ピット形成による取り込み)も同定された。エンドサイトーシス系の命名法は、完全に標準化されているものではなく、一般的に使用される用語「初期エンドソーム」は、実際は、ソーティングエンドソーム区画およびエンドサイトーシス再利用区画(ERC)の2つの異なるエンドソーム区画を表す。従来の受容体媒介エンドサイトーシス経路では、トランスフェリン受容体、低密度リポタンパク質受容体、およびマンノース6−リン酸受容体(MPR)などの受容体は、それらの細胞質尾部の配列モチーフとクラスリン被覆の要素との間の相互作用によって原形質膜の表面におけるクラスリン被覆ピット内に集中する。クラスリン被覆の脱落後、新規に形成されたエンドソームが、他のエンドソームおよび既存のソーティングエンドソームに融合してソーティングエンドソームになる。この名称が示唆するように、その主な役割は、新規に得た構成成分を正しい位置に振り分けることである。3つの既知の目的地には、原形質膜、後期エンドソーム、およびERCが含まれる。ソーティングエンドソームが成熟すると、そのpHが低下し、これにより受容体結合リガンドのエンドソームの内腔内への放出が促進される。しかし、ソーティングエンドソームが後期エンドソームに完全に成熟する前に、再利用される運命の分子は選別されなければならない。このプロセスは、微細管の表面積と容積の比が小胞ソーティングエンドソームの表面積と容積の比よりも大きいため、膜タンパク質の溶質分子からの選別を好むプロセスである微細管の締め付けによって起こると考えられている。締め付けられた微細管は、膜タンパク質を原形質膜に直接戻す(直接戻し経路)かまたはERCに送ることができる。ERCは、主に、細胞型間で局在化が異なる管状細胞小器官の集まりである。ERCは、分子をいくつかの異なる目的地に振り分けることができるが、ERCを介して送られる分子の殆どは原形質膜に戻る。
エンドサイトーシスとは別に、後期エンドソームも、トランスゴルジネットワーク(TGN)からMPR経路を介してカーゴを受け取る(生合成経路)。陽イオン依存性MPRおよび陽イオン非依存性MPR/インスリン様成長因子II(IGF−II)受容体は、新規に合成された酸性加水分解酵素のTGNからリソソームへの送達の役割を共有する。MPRによる酸性加水分解酵素の認識には、小胞体における糖の付加およびこれに続く修飾、ならびにシスゴルジにおけるマンノース6−リン酸部分に対する糖残基のリン酸化が必要である。MPR結合加水分解酵素は、まずエンドソームに送達され、そこで内腔pHの低下により受容体から解離し、これにより受容体がTGNに戻り再利用可能となる。TGNにおけるクラスリン被覆ピットにMPRをふるい分けることに主に関与するこのタンパク質は、アダプタータンパク質−1(AP−1)であるが、ゴルジ局在性γ−ear含有ADPリボシル化因子結合タンパク質(GGA)も役割を果たす。AP−1およびGGAが、協働するか、または実際に2つのMPRを細胞内の異なる場所に局在化させるか否かは、現在は未知である。AP−1は、4つのメンバーからなるアダプタータンパク質ファミリーの一部であり、メンバーのすべては、分泌経路およびエンドサイトーシス経路で広範に利用されているヘテロ四量体タンパク質である。TGNで形成されるクラスリン被覆ピットにおけるAP−1の上述の役割に加えて、AP−1およびAP−2は、原形質膜でのエンドサイトーシス中にクラスリン被覆ピットで使用される一方、AP−3およびAP−4は、リソソーム関連膜タンパク質(LAMP)の輸送において機能する。
自己貪食は、巨大分子をリソソームに到達させる第3の十分に特徴付けられた経路である。自己貪食は、長寿のタンパク質および細胞小器官の代謝回転に関与する進化的に保存された経路である。自己貪食は、通常は低い基礎レベルで機能するが、例えば、栄養飢餓の条件下で誘導され得る。これらの条件下では、マクロオートファジーは、物質のリソソームへの送達に関与する主経路である。マクロオートファジーは、細胞質小器官および/または細胞質ゾルの一部の回りを覆って閉じた二重膜結合液胞、すなわちオートファゴソームを形成する平坦な膜の槽によって特徴付けられる。オートファゴソームは、最終的にリソソームに融合して、飲み込まれた巨大分子の分解および再利用が行われるオートファゴリソソーム/オートリソソームを形成する。オートファゴソーム膜の起源は、いまだ解明されていない。小胞体、ゴルジ、デノボ合成と同様、ファーゴフォア(phagophore)と呼ばれる十分には特徴付けられていない膜画分は、すべて、オートファゴソーム膜の起源として提唱された。酵母遺伝学による最近の進歩および続く哺乳動物相同体の発見により、自己貪食プロセスの理解が急速に深まり、近い将来、オートファゴソーム膜の起源が明らかになることが望まれる。
リソソームの後期エンドソームまたはオートファゴソームとの融合後、リソソームは、膜タンパク質の隔離および内腔内容物の凝縮によって得られるハイブリッド細胞小器官から再構築される。ハイブリッド細胞小器官から除去または再利用される必要がある膜タンパク質のうち、最も明白なものは、定義によるとMPRはリソソームに存在しないためMPRである。しかし、リソソームは、造血起源の分泌細胞で最初に認められたCa2+依存性のプロセスである、分泌顆粒との融合によって分泌リソソームを形成することもできるため、エンドサイトーシス経路の終点として見ることができない。しかし、非分泌細胞でエキソサイトーシスに関与するCa2+調節膜−近位リソソーム画分の証拠も存在する。エキソサイトーシスのプロセスは、60を超えるメンバーを数えるRabタンパク質ファミリーのメンバーであるタンパク質Rab27aに依存する。Rabは、小胞形成、運動性、ドッキング、および融合を含む殆どの膜−輸送ステップにおいて重要な調節の役割を有する低分子量GTPアーゼである。少なくとも13のRabタンパク質が、様々なエンドサイトーシスされた分子およびそれらの小胞の運命を決定するためにエンドサイトーシス経路で利用される。
全細胞数および様々な組織を構成する細胞の量の調節は、不要な細胞を除去する機構の必要性と共に、多細胞生物において根本的に重要である。プログラム細胞死は、この目的を達成するための手段であり、細胞成分を漏らさず、このためプログラム細胞死に対する概念的な対応物であるネクローシスに関連した炎症をおこさせることなく、不要な細胞を除去する潜在能力を多細胞生物に付与する。
アポトーシスという語は、花から花弁または樹木から葉の「脱落」または「落下」を表現するためにギリシャ語で使用されており、多数の組織および細胞型で観察した一般的なタイプのプログラム細胞死を表現するために1972年にCurrieおよび同僚らによって最初に作成された。作成者らは、観察した事象が、病理学的なネクローシスで死ぬ細胞を特徴付ける形態学的特徴とは異なる有意な形態学的類似性を有することに気付き、これらの一般的な形態学的特徴が同一の基本的なプロセスによるものであり得ることを提唱した。
プログラム細胞死(PCD)はアポトーシスと同義ではないが、これらを区別しないで使用する大量の文献に基づいて、これらを同義と見なす傾向にある。用語PCDは、徐々に取って代わってきているが、用語アポトーシスは今なお、カスパーゼ、特にカスパーゼ3の活性化によって構成される細胞死プログラムを表現するために使用されている。しかし、カスパーゼ活性化が全く存在しないPCDおよび非アポトーシスPCDをもたらすカスパーゼ活性化はもちろん、プロアポトーシスカスパーゼの活性化から生き延びる特定の細胞の能力が、細胞死プログラム(複数可)の顕著な柔軟性を明らかにしたため、PCDは、死ぬ細胞内のシグナルまたは活性化に依存する細胞死としてより正確に定義され得る。それぞれの定義が固有の形態学的特徴によって作られた死ぬ細胞の核の形態、クロマチン凝縮の形状である主な特徴、またはクロマチン凝縮の非存在に従って、PCDをアポトーシス、アポトーシス様PCD、およびネクローシス様PCDに細かく分類され得ることが提唱されたが、PCDに導く所与のセットの条件下で関与するシグナル伝達経路に基づいてPCDを区別することが好ましいであろう。しかし、PCDの異なるモデル間でのこの区別の方法は、なお適切ではなく、様々な種類の細胞死に導く経路は、まだ判明していない。
ネクローシスは、ネクローシスをもたらす刺激を除去する以外の他の手段によって防止することができないため、PCDに対する概念的な対応物である。通常、この細胞死のモデルは、生物体に対する病理学的傷害の際に見られる。
アポトーシス
前節で述べたように、アポトーシスは、カスパーゼとして知られているシステインエンドペプチダーゼのファミリーのメンバーの活性化およびその活性化に関連した形態学によって定義される。カスパーゼは、タンパク質分解プロセシングによって急速に活性化され得る不活性のチモーゲンとして細胞内に存在する。このプロセシングは、階層カスケードに進み、そこでアポトーシス刺激がイニシエーターカスパーゼ(例えば、カスパーゼ8および9)を活性化させ、次にこのイニシエーターカスパーゼが、次のレベルの階層でエフェクターカスパーゼ(例えば、カスパーゼ3、6、および7)を活性化させる。後者は、多数の基質を切断するためアポトーシスの実行者と見なされ、このプロセシングが、最終的にアポトーシスに関連した表現型をもたらす。アポトーシスプログラムは、細胞外刺激および細胞内刺激に大きく分類され得る様々な刺激によって活性化され得、細胞内刺激は、ミトコンドリアを必須のプレーヤーとしている。細胞外刺激およびこれに続くアポトーシスをもたらす応答は、外因性シグナル伝達経路とも呼ばれ、Fas/Apo−1/CD95、TNFR、またはTRAILなどの様々な死受容体の1つの活性化で始まる一連の事象からなる。それらの適切なリガンドの結合時に、これらの受容体が、受容体内に存在する死ドメイン(DD)との相互作用によって、TRADD(TNFR1−関連死ドメインタンパク質)およびFADD(死ドメインを持つFas関連タンパク質)などのDD含有アダプター分子を補充する。次いで、これらのアダプター分子は、受容体複合体にカスパーゼ8を補充し、カスパーゼが、場合によっては近接誘導自己触媒プロセシングによって活性化される。次いで、特定の細胞(いわゆるI型細胞)では、カスパーゼ8がプロカスパーゼ3を直接切断して活性化する一方、II型細胞では、カスパーゼ8の基層(substratum)が、細胞質タンパク質Bidである。Bidの切断により、断片(切断型Bid(tBid))が形成され、この断片が、2つのプロアポトーシスBcl−2ファミリーメンバー、BaxおよびBakのオリゴマー化、転位置、および外側ミトコンドリア膜への挿入を誘導する。この挿入は、多数の他のタンパク質と共に電子キャリアシトクロムc(CytC)のミトコンドリア内膜空間からの放出を媒介し、これらのタンパク質の最も顕著なものには、アポトーシス誘導因子(AIF)、アポトーシス阻害(IAP)タンパク質として知られるタンパク質の効果を無効にするSmac/DIABLO、およびデオキシリボヌクレアーゼであるエンドヌクレアーゼGが含まれる。これは、ミトコンドリアによるカスパーゼ活性化の理論において極めて重要な点であるが、BaxおよびBakの挿入がどのようにシトクロムcの放出を促進するかについての決定的な証拠は提示されていないことに留意されたい。ミトコンドリアからの放出時に、CytCが細胞質内に蓄積し、そこでCtyCがタンパク質Apaf−1(アポトーシスプロテアーゼ−活性化因子1)に結合し、Apaf−1のオリゴマー化を促進する構造変化が起こる。次いで、このオリゴマーが、カスパーゼリクルートメントドメイン(CARD)間の同型相互作用によってプロカスパーゼ9に結合し、アポトソーム(apoptosome)と呼ばれる複合体が形成される。この複合体の形成により、プロカスパーゼ9の酵素活性が大幅に上昇し、この活性がカスパーゼ3のタンパク質分解活性をもたらす。
過去10年間、PCDの実行者としてのカスパーゼの独占的な役割に疑問が持たれ、多くの証拠が、カスパーゼのみに帰するのではなく、細胞の生命、特に細胞の死にはもっと多くが存在することを示唆している。
PCDの除去段階、すなわちアポトーシス細胞およびアポトーシス小体の近接細胞または貪食細胞による飲み込みにおけるリソソームおよびその加水分解酵素の役割は十分に確立されているが、PCDの直近の事象でのリソソームおよびリソソーム加水分解酵素の重要性を認識するには長い時間がかかった。この遅れの1つの理由は、PCDにおけるカスパーゼの役割を評価するために一般的に使用されるメチルケトンペプチド阻害剤(例えば、zVAD−fmk、Ac−DEVD−fmk、Boc−D−fmkなど)も、いくつかのシステインカテプシンを含む他のシステインプロテアーゼを阻害するという事実によるものであり得る。この交差反応の認識から9年経っても、非カスパーゼプロテアーゼを阻害できる濃度でのこれらの阻害剤による保護効果は、しばしば、カスパーゼ媒介死経路の証拠としてなお理解され、従ってPCDにおける他のシステインプロテアーゼの役割が、過小評価され続けている。リソソームPCDの発見は、リソソームの超微細構造が、電子顕微鏡法によって分析されたアポトーシス細胞で無傷であるように見えたためにさらに遅れたのであろう。したがって、リソソーム破裂は、制御されていないネクローシス細胞死および組織自己分解の後期段階中の全か無かのスイッチとして最近まで見なされていた。しかし、リソソーム膜完全性のより正確な評価を可能にする新規な技術は、正常な超微細構造を持つリソソームが、その酵素の一部を漏洩させ得ること、および部分的なリソソーム膜透過化(LMP)が多くの死プログラムの初期で起こるだけではなく、実際にアポトーシスおよびアポトーシス様PCDを引き起こし得るということを明らかにした。
リソソーム膜の完全性を直接標的とする様々な複合物、例えば、H2O2、L−ロイシル−L−ロイシンメチルエステル、浸透ストレス、スフィンゴシン、リソソーム向性抗生物質(lysosomotropic antibiotics)ノルフロキサシンおよびシプロフロキサン、ならびに光酸化リソソーム損傷(光分解)を用いた研究が、適度なリソソーム透過化がPCDをもたらし得ることを納得できるように証明した。リソソーム破裂の量と細胞死のモデルとの間の量的関係が、LMPの後の大きく異なる形態学的結果を説明すると提唱された。このモデルによると、低いストレス強度が、リソソーム内容物の細胞質への限定的な放出を引き起こし、アポトーシスまたはアポトーシス様細胞死が起こるが、高強度ストレスは、全体的なリソソーム破裂および急速な細胞ネクローシスをもたらす。したがって、低いpHで界面活性剤様の特性を持つセラミドの酸性セラミダーゼによって生成される代謝産物である、低濃度のスフィンゴシンは、部分的なLMPおよびカスパーゼ媒介アポトーシスを誘導する一方、高濃度では、広範囲のLMPおよびカスパーゼ非依存性ネクローシス細胞死となる。このモデルでは、部分的なLMPによって引き起こされる細胞死は、システインカテプシンおよびアスパラギン酸カテプシンの薬理学的阻害剤によって阻害することができ、細胞質ゾルカテプシン活性の上昇により、カスパーゼの活性化、および細胞死プロセスにおける細胞質ゾルカテプシンの直接的な役割を示唆するミトコンドリア膜電位の変化が起こる。重要なことに、細胞死におけるLMPおよびカテプシンの役割は、直接のリソソーム破裂物質を利用する実験的なモデルに限定されるものではない。LMPはまた、様々な古典的なアポトーシス刺激、例えば、腫瘍壊死因子(TNF)受容体ファミリー、インターロイキン1の死受容体の活性化、p53の活性化、成長因子飢餓、微小管安定化剤、エトポシド、σ−2受容体の活性化、合成レチノイドCD437、B細胞受容体の活性化、スタウロスポリン、浸透ストレス、およびp53非依存性アポトーシスを誘導する新規な抗癌剤のスクリーニングで同定された小分子に応答した細胞死の実行に寄与する。
LMPの細胞傷害効果は、しばしば、ミトコンドリア死経路の活性化に少なくとも部分的に依存する。的確な微量注入研究により、細胞質ゾルに局在すると、1つのリソソーム加水分解酵素、カテプシンDは、全細胞カテプシンD活性の半分に相当する細胞用量でヒト線維芽細胞におけるミトコンドリア外膜透過化およびアポトーシスを引き起こすのに十分であることが実証された。しかし、カテプシンDは、LMPが関与するすべての細胞死モデルにおいてPCDを引き起こすには十分でない。文書で十分に立証された他のLMP誘発PCDのメディエーターには、活性酸素種はもちろん、システインカテプシンBおよびLが含まれる。しかし、他のリソソーム加水分解酵素、リソソーム由来の第2のメッセンジャー、および細胞質ゾルのLMP誘発酸性化の役割がこれまで適切に除外されていないことを重視されたい。カテプシンとミトコンドリア膜透過化との間の関連の1つは、細胞質ゾルpHで、いくつかのシステインカテプシンによって処理および活性化され得るがカテプシンDによっては処理および活性化されないBcl−2ファミリーのプロアポトーシスBH3−onlyタンパク質、Bidであり得る。しかし、カテプシンDは、TNF受容体1(TNF−R1)の内在化の後にエンドリソソーム画分の酸性環境でBidを切断し活性化させることが示唆された。このモデルによると、リガンド活性化TNF−R1のエンドサイトーシスが、酸性スフィンゴミエリナーゼを介したセラミドの産生をもたらし、このセラミドが、不活性カテプシンDに結合し、不活性カテプシンDを自己触媒的プロセシングによって活性化させる。カテプシンDはまた、スタウロスポリン処理T細胞で実証されたように、Bidに依存しないでBaxを活性化させ得る。また、シプロフロキサシンで処理した線維芽細胞でも、LMPが、BaxおよびBakのBidに依存しない活性化によってミトコンドリア膜透過化を引き起こす。このモデル系では、Baxの活性化は、カテプシンDに依存しないが、代わりに活性酸素種に依存する。シプロフロキサシン誘導ミトコンドリア膜透過化が、BaxおよびBakの両方が欠如している細胞で完全には阻害されないことに留意されたい。LMPをミトコンドリア膜透過化につなげる代替機構には、活性酸素種および/またはカテプシンB依存的に生成され得るアラキドン酸などの脂質メディエーターの直接の効果が含まれ得る。
重要なことに、LMPおよび細胞質カテプシンの致死効果は、内因性アポトーシス経路の活性化に限定されるものではない。微小管安定化剤(パクリタキセル、エポチロンB(epothilone B)、およびディスコデルモライド(discodermolide))で処理した小細胞性肺癌細胞では、LMPは、死プロセスの初期で起こり、システインカテプシンが、カスパーゼ非依存的に微小核生成および細胞死を媒介する。TNF処理ヒト癌細胞系では、LMPは、ミトコンドリア外膜透過化の下流で起こる。しかし、システインカテプシンの活性または発現の阻害は、エフェクターカスパーゼの活性化を有意に阻害することなく、TNF誘導細胞死に対して優位な防御を与える。さらに、カテプシンBは、TNF処理マウスWEHI−S線維肉腫細胞において、カスパーゼ活性の非存在下で、クロマチン凝縮、ホスファチジルセリン曝露、および原形質膜小疱形成などのアポトーシス様変化に関与する。さらに、T細胞の最適上の活性化はもちろん、様々なヒト癌細胞における熱ショックタンパク質70(Hsp70)の欠乏は、内因性アポトーシス経路を活性化することなく、LMPおよびカテプシン媒介アポトーシス様PCDを引き起こす。これらのデータに一致して、カテプシンBは、単離された核で核アポトーシスを誘導し得る。したがって、カテプシンは、刺激および細胞の状況に依存するプログラム細胞死のイニシエータープロテアーゼおよびエフェクタープロテアーゼの両方として機能する能力を有するようである。特に、ミトコンドリア死経路が、例えば、Bcl−2の過剰発現によって遮断される癌細胞においてPCDを媒介するカテプシンの能力は、LMPを誘導する治療が、古典的なアポトーシスの誘導物質に対して耐性がある癌の治療で有効性を証明できるという希望をもたらす。この考えは、不死化および形質転換が、リソソーム細胞死に対して感作させ得ることを示すデータによってさらに裏付けられる。
上記したように、リソソーム内容物、特にカテプシンの細胞質への放出の前のLMPは、リソソーム死経路の重要な活性化ステップであると見なされる。しかし、LMPをもたらすシグナル伝達経路は、出現の始まりに過ぎない。最も良く研究された機構の1つは、腫瘍壊死因子受容体1からのシグナル伝達であるが、このLMPへのシグナル伝達経路の解明は、異なる標的細胞での多様な応答により非常に複雑である。
LMPの潜在的な致死的結果から、LMP自体を阻害することによって、またはLMPの結果として細胞質ゾルに漏れる酸性加水分解酵素から細胞を保護することによって、細胞がLMPに対抗する様々な戦略を立てることは驚きではない。
リソソーム蓄積症(LSD)は、リソソーム機能の異常から起こる約40の稀な一群の遺伝性代謝障害である。LSDは、通常は、脂質、糖タンパク質、またはムコ多糖の代謝に必要な1つの酵素の欠損の結果としてのリソソーム機能不全によって引き起こされる。それぞれの障害は、酵素活性の欠損に翻訳される様々な遺伝子の突然変異から生じるが、これらはすべて、共通の生化学的特徴を共有する、すなわちすべてのリソソーム障害は、リソソーム内の物質の異常な蓄積に起因する。
−脂質蓄積障害(またはリピドーシス)
・スフィンゴリピドーシス(ゴーシェ病およびニーマンピック病を含む)
・ガングリオシドーシス(gangliosidosis)(テイサックス病を含む)
・白質ジストロフィー(leukodystrophies)
−ムコ多糖症(ハンター症候群(Hunter syndrome)およびハーラー病(Hurler disease)を含む)
−ムコリピドーシス
−糖タンパク質蓄積障害(糖タンパク質異常症)
・マンノシドーシス
・フコシド蓄積症
−グリコーゲン蓄積症(glycogen storage diseases)
多数の酵素が、スフィンゴ脂質(またはフィンゴ糖脂質(glycophingolipid))のリソソーム異化作用に関与する(図1を参照)。これらの酵素、より具体的には加水分解酵素はそれぞれ、特定のスフィンゴ脂質の分解に関与する。
サポシンは、様々なリソソーム脂質分解酵素の活性化因子として機能する低分子リソソームタンパク質である。サポシンは、恐らく、脂質基質を膜周囲から分離することによって機能するため、可溶性分解酵素にアクセスしやすくする。すべての哺乳動物サポシンは、タンパク質分解による切断後に活性化サポシンを生成する4つのサポシンBドメイン、および活性化反応で除去される2つのサポシンAドメインを含む1つの前駆体分子(プロサポシン)として合成される。サポシンBドメインは、他のタンパク質でも生じ、それらの多くは、膜の溶解に活性がある。
リゾビスホスファチジン酸としても知られるビス(モノアシルグリセロ)リン酸(BMP)は、後期エンドソーム区画およびリソソーム区画の脂質組成の主な部分である。BMPは、負に帯電したリン脂質、より具体的にはグリセロール−リン脂質である。
脂質蓄積障害(またはリピドーシス)は、脂質を代謝するために必要な酵素の発現または機能の低下によって有害な量の脂質が細胞内空間に蓄積するリソソーム蓄積障害のサブグループである。時間が経つと、この過剰な脂質の蓄積が、特に、脳、末梢神経系、肝臓、脾臓、および骨髄で永久的な細胞および組織の損傷を引き起こし得る。
ガングリオシドーシスの治療に使用するための、Hsp70の細胞内の濃度および/または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
。
GM2活性化因子と呼ばれる、β−ヘキソサミニダーゼの酵素補助因子を生成する遺伝子の不全によって引き起こされる。
MCOLN1遺伝子の変異によって引き起こされる。ムコリピン1は、エンドソームに局在化すると考えられている。ムコリピン1の重要な特性は、PHを下げること(酸性化)によってタンパク質の非活性化を生じ、タンパク質の構築阻害などをを引き起こすことである。MCOLN1遺伝子の至る所に位置する、少なくとも29のMCOLN1の変異が知られている。この既知の変異はムコリピン1の発現を抑制するものが多いが、一方、陽イオンチャンネルの機能不全形を産生するようなより軽度の変異も存在する。タンパク質のC末端のみを変える変異は、この障害の軽度の表現型を生じ、通常脳は保護される。ML IVでは、罹患した細胞に、異常型リソソームと考えられている自己蛍光性液胞の蓄積が生じる。
神経セロイドリポフスチン症の治療に使用するための、Hsp70の細胞内の濃度および/または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
− 小児NCL(Santavuori−Haltia病、INCLまたはI型)は、パルミトイル−タンパク質 チオエステラーゼ(palmitoyl−protein thioesterase)に関連する。
− 後期小児NCL(ビールショスキー−ヤンスキー病またはヤンスキー−ビールショスキー病、LINCLあるいはII型)は、トリペプチジルぺプチダーゼIの欠損に関連する。
− 若年性NCL(バッテン病、JNCLまたはIII型、シュピールマイアー−フォークト−シェーグレン−バッテン病、またはシュピールマイアー−フォークト病としても知られる)は、CLN3遺伝子の変異に関連づけられている。この疾患が、もっとも一般的な型である。
− 成人NCL(クーフス病、ANCLまたはIV型)については、関連遺伝子は同定されていない。
脳腱コレステローシス(cerebrotendinous cholesterosis)、ウォルマン病(Wolman’s disease)、およびコレステリルエステル蓄積症(cholesteryl ester storage disease)からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、Hsp70の細胞内の濃度および/または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
ムコ多糖症の治療に使用するための、Hsp70の細胞内の濃度および/または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
− デルマタン硫酸は、L−イズロン酸およびN−アセチルガラクトサミンの繰り返しユニットからなり、通常、多くの異なる結合組織の基質に認められる。
− ヘパラン硫酸は、ウロン酸(D−グルクロン酸またはL−イズロン酸)とN−アセチルグルコサミンの結合の繰り返しによって形成され、ほぼすべての細胞の原形質膜に関連する。
− ケラタン硫酸は、D−ガラクトース残基とN−アセチルグルコサミンとの繰り返しよって形成され、主として、軟骨、髄核、および角膜に認められる。
− コンドロイチン硫酸は、D−グルクロン酸とN−アセチルガラクトサミンから構成され、主として軟骨および角膜に認められる。
グリコーゲン蓄積症(GSD)の治療に使用するための、Hsp70の細胞内の濃度および/または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
ムコリピドーシスII(I−セル病)およびムコリピドーシスIII(偽ハーラー多発性ジストロフィー)(pseudo−Hurler polydystrophy)からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、Hsp70の細胞内の濃度および/または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、α−マンノシド症、α−マンノシド症I型、α−マンノシド症II型、β−マンノシド症、およびシアリドーシスII型(ムコリピドーシスI)からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、Hsp70の細胞内の濃度および/または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
としても知られる)の治療に使用するための、Hsp70の細胞内の濃度および/または活性を上昇させることができる生理活性剤が提供される。
酵素の翻訳後修飾における欠陥、非酵素タンパク質の欠陥、膜輸送タンパク質の欠陥、酵素保護タンパク質の欠陥、膜貫通タンパク質の欠陥、および/または膜貫通型でないタンパク質の欠陥といった、酵素の欠陥を伴う疾患からなる群から選択されるリソソーム蓄積症の治療に使用するための、Hsp70の細胞内の濃度および/または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
リソソーム蓄積症の治癒法は存在せず、骨髄移植および酵素補充療法(ERT)が試され、ある程度の成功を収めているが、治療は殆どが対症である。加えて、臍帯血移植は、多数のこれらの疾患用の専門センターで行われている。しかし、移植療法は、大きな副作用を伴い、しばしば、患者に合併症をもたらす。加えて、基質抑制療法、すなわち貯蔵物質の蓄積を減少させるために使用される方法は、現在、これらの一部の疾患に対して評価されている。
DNAの遺伝子コードをまず転写し、次いで翻訳する際に大量のエネルギーを消費して、細胞は、その時点で細胞の生存に必要と推定される機能を持つポリペプチドを最終的に産生する。しかし、これらの1つがこの未完成ポリペプチド鎖の正しい折り畳みである最終的な障害の一部を、完全に機能的なタンパク質を得るために乗り越えなければならない。正しい折り畳みを達成するための進化的な指令は、疑う余地がないほど明白である。なぜなら、適切な構造、従って機能を持たないペプチドを合成するためにはエネルギーをひどく無駄に浪費するだけではなく、細胞の内腔内でのこのようなタンパク質の凝集が細胞に有害であることを証明できるからである。この凝集は、実際、高いタンパク質濃度の細胞内環境を考慮すると、非常に起こりそうな結果であるため、タンパク質の複雑かつ高度な機構が、タンパク質の折り畳みを助けるために存在し、このような条件下でタンパク質の機能的な状態を維持可能であることは驚きではない。これらのタンパク質は、人間の場合と同様に、未成熟のクライアント(client)間の不所望の相互作用を防止するため、まとめて分子シャペロンと呼ばれる。
Hsp70タンパク質は、タンパク質の折り畳み、不安定な細胞タンパク質の分解、および他の細胞防御の役割を果たすことを含め、多様な細胞プロセスに関与する。これらのプロセスにおけるHsp70の一般的な機能は、部分的に折り畳まれたポリペプチドの短い疎水性セグメントを結合して、これにより適切な折り畳みを促進し、凝集を防止することであると思われる。真核生物では、Hsp70シャペロンは、それらの機能的なサイクルの重要なステップを調節する働きをする異なるクラスのタンパク質;特にJドメインファミリータンパク質Hsp40とin vivoで相互作用する。さらに、別のパートナータンパク質も同定され、その一部は、Hsp70をHSP90系などの他のシャペロン系に結合している。
分子シャペロンによる重要な機能の一部には、タンパク質の細胞区画内への輸入、細胞質ゾル、小胞体、およびミトコンドリア内でのタンパク質の折り畳み、タンパク質凝集の防止、ならびに誤って折り畳まれたタンパク質の再折り畳みが含まれる。現在、ヒトHsp70ファミリーには、異なる遺伝子によってコードされる10のメンバーが含まれ、この節は、機能、発現パターン、および相同性/配列同一性に関するこれらのファミリーメンバーの概略を説明するものとする。異なるヒトHsp70ファミリーメンバーの命名法にはある種の混同が存在するが、遺伝子座名、遺伝子、およびタンパク質の間の論理的な関連性を提供する一連の一般ガイドラインがTavariaらによって示されている。しかし、一部の種間の混同がなお存在するため、Hsp70遺伝子およびタンパク質は、本明細書では遺伝子座名で呼ばれる。名称Hsp70は、遺伝子座名がHSPA1AおよびHSPA1Bである2つの誘導性Hsp70ファミリーメンバー、またはテキストの一致から明らかなように、一般にHsp70ファミリー全般を指すことがある。しかし、本発明中で用いられる場合は、Hsp70は、遺伝子座名がHSPA1AおよびHSPA1Bである2つの誘導性Hsp70ファミリーメンバーのいずれかを指すこと意味する。
遺伝子座HSPA1AおよびHSPA1Bから転写される遺伝子は、2つの熱/ストレス誘導性Hsp70遺伝子であり、ヒトHsp70に関する文献の殆どは、それらの2つの遺伝子によってコードされるタンパク質に言及する。これらの遺伝子は、互いに99%の同一性を有し、かつ最初にクローニングされ特徴付けられたヒトHsp70ファミリーメンバーである、641のアミノ酸からなるタンパク質を産生する。これらの遺伝子は、6p21.3でMHCクラスIII複合体に結合され、イントロンが無く、プロモーター領域がHSEを含み、これにより遺伝子をHSFへ結合することが可能であり、様々な細胞攻撃に応答して転写を誘導する。
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MAKAAAIGIDLGTTYSCVGVFQHGKVEI IANDQGNRTTPSYVAFTDTERLIGDAAKNQVALNPQNTVFDA KRLIGRKFGDPVVQSDMKHWPFQVINDGDKPKVQVSYKGETKAFYPEEISSMVLTKMKEIAEAYLGYPVT NAVITVPAYFNDSQRQATKDAGVIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDRTGKGERNVLIFDLGGGTFDVSIL TIDDGIFEVKATAGDTHLGGEDFDNRLVNHFVEEFKRKHKKDISQNKRAVRRLRTACERAKRTLSSSTQA SLEIDSLFEGIDFYTSITRARFEELCSDLFRSTLEPVEKALRDAKLDKAQIHDLVLVGGSTRIPKVQKLL QDFFNGRDLNKSINPDEAVAYGAAVQAAILMGDKSENVQDLLLLDVAPLSLGLETAGGVMTALIKRNSTI PTKQTQIFTTYSDNQPGVLIQVYEGERAMTKDNNLLGRFELSGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVTA TDKSTGKANKITITNDKGRLSKEEIERMVQEAEKYKAEDEVQRERVSAKNALESYAFNMKSAVEDEGLKG KISEADKKKVLDKCQEVISWLDANTLAEKDEFEHKRKELEQVCNPI ISGLYQGAGGPGPGGFGAQGPKGG SGSGPTIEEVD
1 ggaaaacggc cagcctgagg agctgctgcg agggtccgct tcgtctttcg agagtgactc
61 ccgcggtccc aaggctttcc agagcgaacc tgtgcggctg caggcaccgg cgtgttgagt
121 ttccggcgtt ccgaaggact gagctcttgt cgcggatccc gtccgccgtt tccagccccc
181 agtctcagag cggagcccac agagcagggc accggcatgg ccaaagccgc ggcgatcggc
241 atcgacctgg gcaccaccta ctcctgcgtg ggggtgttcc aacacggcaa ggtggagatc
301 atcgccaacg accagggcaa ccgcaccacc cccagctacg tggccttcac ggacaccgag
361 cggctcatcg gggatgcggc caagaaccag gtggcgctga acccgcagaa caccgtgttt
421 gacgcgaagc ggctgatcgg ccgcaagttc ggcgacccgg tggtgcagtc ggacatgaag
481 cactggcctt tccaggtgat caacgacgga gacaagccca aggtgcaggt gagctacaag
541 ggggagacca aggcattcta ccccgaggag atctcgtcca tggtgctgac caagatgaag
601 gagatcgccg aggcgtacct gggctacccg gtgaccaacg cggtgatcac cgtgccggcc
661 tacttcaacg actcgcagcg ccaggccacc aaggatgcgg gtgtgatcgc ggggctcaac
721 gtgctgcgga tcatcaacga gcccacggcc gccgccatcg cctacggcct ggacagaacg
781 ggcaaggggg agcgcaacgt gctcatcttt gacctgggcg ggggcacctt cgacgtgtcc
841 atcctgacga tcgacgacgg catcttcgag gtgaaggcca cggccgggga cacccacctg
901 ggtggggagg actttgacaa caggctggtg aaccacttcg tggaggagtt caagagaaaa
961 cacaagaagg acatcagcca gaacaagcga gccgtgaggc ggctgcgcac cgcctgcgag
1021 agggccaaga ggaccctgtc gtccagcacc caggccagcc tggagatcga ctccctgttt
1081 gagggcatcg acttctacac gtccatcacc agggcgaggt tcgaggagct gtgctccgac
1141 ctgttccgaa gcaccctgga gcccgtggag aaggctctgc gcgacgccaa gctggacaag
1201 gcccagattc acgacctggt cctggtcggg ggctccaccc gcatccccaa ggtgcagaag
1261 ctgctgcagg acttcttcaa cgggcgcgac ctgaacaaga gcatcaaccc cgacgaggct
1321 gtggcctacg gggcggcggt gcaggcggcc atcctgatgg gggacaagtc cgagaacgtg
1381 caggacctgc tgctgctgga cgtggctccc ctgtcgctgg ggctggagac ggccggaggc
1441 gtgatgactg ccctgatcaa gcgcaactcc accatcccca ccaagcagac gcagatcttc
1501 accacctact ccgacaacca acccggggtg ctgatccagg tgtacgaggg cgagagggcc
1561 atgacgaaag acaacaatct gttggggcgc ttcgagctga gcggcatccc tccggccccc
1621 aggggcgtgc cccagatcga ggtgaccttc gacatcgatg ccaacggcat cctgaacgtc
1681 acggccacgg acaagagcac cggcaaggcc aacaagatca ccatcaccaa cgacaagggc
1741 cgcctgagca aggaggagat cgagcgcatg gtgcaggagg cggagaagta caaagcggag
1801 gacgaggtgc agcgcgagag ggtgtcagcc aagaacgccc tggagtccta cgccttcaac
1861 atgaagagcg ccgtggagga tgaggggctc aagggcaaga tcagcgaggc ggacaagaag
1921 aaggttctgg acaagtgtca agaggtcatc tcgtggctgg acgccaacac cttggccgag
1981 aaggacgagt ttgagcacaa gaggaaggag ctggagcagg tgtgtaaccc catcatcagc
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2161 atgtttgtct ttgaggtgga ctgttgggac tcaaggactt tgctgctgtt ttcctatgtc
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2401 cgagtttgtt tgtttttttt tttttttttt ttttttgctt ggcgaaaaca ctacaaaggc
2461 tgggaatgta tgtttttata atttgtttat ttaaatatga aaaataaaat gttaaacttt
2521 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a
2つのHsp70ファミリーメンバーは、雄生殖細胞が強い偏見でそれらの発現を優先するため、「優越主義遺伝子(chauvinist gene)」と呼ばれる。hspA1L遺伝子は、第6染色体上の同じMHCクラスIII複合体におけるHSPA1A遺伝子座の4kbテロメア側に位置する、恒常的に発現される無イントロンHsp70ファミリーメンバーである。hspA1L遺伝子は、熱ショックの前後で低量発現されるが、その発現パターンが、マウス、ラット、およびヒトの精巣に有利に働き、その641のアミノ酸(aa)タンパク質が、HspA1Aに対して90%同一である。hspA2遺伝子は、マウスゲノムライブラリーから最初に単離され、骨格筋、卵巣、小腸、結腸、脳、胎盤、および腎臓を含むヒトの体の様々な組織で低レベルであるが、精巣では高レベルで恒常的に発現されることが後に示された。その発現または逆にその欠如は、異常なヒト***形成と関連があり、雄hspA2(−/−)マウスは、生殖不能である。この遺伝子は、第14染色体に位置し、HspA1Aに対して84%同一の639aaのタンパク質を産生するが、正確な位置は、2つの研究論文が異なる遺伝子座位置14q24.1と14q22を示しているため議論が必要である。
hspA6およびhspA7遺伝子は、マウスには明確な対応物がないHsp70ファミリーの熱誘導性メンバーである。hspA6およびhspA7遺伝子は、プロモーター部位にHSEを含み、これらの遺伝子はイントロンが無い。hspA6およびhspA7遺伝子は、第1染色体上に共局在化し、互いにヌクレオチド配列が94%同一である。しかし、hspA7遺伝子が、+1324に中途終止コドンを生成する1つのヌクレオチド挿入を有するため、HspA6のみが機能的である。HspA6タンパク質は、643aaの長さであり、HspA1AおよびHspA1Bに対して77%の同一性を示す。
hspA5およびhspA9遺伝子は、Hsp70ファミリーの2つの区画特異的メンバーである。655aaのHspA5タンパク質は、小胞体(ER)内に位置し、この区画内で新規に合成されたタンパク質の折り畳みおよび輸送を促進する。このタンパク質は、HspA1Aに対して64%同一であり、この遺伝子は、9q34に位置している。679aaのHspA9タンパク質は、ミトコンドリア内に位置し、ミトコンドリア膜を渡って輸送されたタンパク質の折り畳みを助ける。HspA9は、5q31.1に位置し、このタンパク質は、HspA1Aに対して52%同一である。
Hsc70として知られる同種Hsp70メンバーは、HspA1Aに対して86%同一の646aaのタンパク質を産生する、11q24にあるhspA8という名称の遺伝子によってコードされ、すべての組織および細胞系で恒常的に発現される。このタンパク質は、細胞機能がHsp70に類似し、通常の状況下で必要なシャペロン機能を提供するが、クラスリン被覆小胞の脱被覆およびシャペロン媒介自己貪食における役割も果たす。
HSPA4がHsp110ファミリーのメンバーである可能性が高く、これまでのところ、その染色体の位置が5q31.1−2であることを除き何も知られておらず、HSPA3がそもそも存在するかさえも疑わしいため、これらは本明細書では説明しない。
ヒトHsp70プロモーターのゲノムフットプリント法により、熱ショック/ストレスが、熱ショック要素(HSE)という名称のnGAAn配列を含む領域への熱ショック転写因子(HSF)の迅速な結合を誘導することが明らかにされた。通常の条件下では、Hsp70は、細胞質ゾル内に存在するHSFに結合するが、ストレスの間は、HSFは、Hsp70から分離し、PKCまたは他のセリン/トレオニンキナーゼによってリン酸化されてホモ三量体構造をとる。このHSF三量体は、核内に侵入して、そこで、Hsp70遺伝子のプロモーター領域に位置するHSEに結合し、HSFキナーゼによってさらにリン酸化される。
Hsp70系の構造および機能は、真正細菌Hsp70、DnaK、そのHsp40コシャペロンDnaJ、およびヌクレオチド交換因子GrpEに関して最もよく理解されている。しかし、その機構は、一般的に真核生物では類似していると考えられるが、証拠がGrpEの分離を示唆している。この節は、真核生物Hsp70系に焦点を当てるが、適切であると考えられる場合は、真正細菌系に対する論評も含む。
分子シャペロンであることの結果としてのHsp70の抗アポトーシス能力、すなわち通常であれば変性する条件下でタンパク質の折り畳みを促進することは別として、Hsp70は、虚血再灌流傷害後のミトコンドリア機能の保護、初代線維芽細胞のTNFでの刺激時にストレスキナーゼc−jun N末端キナーゼ(JNK)の活性化の阻害を含む様々な他の方法で細胞の生存に影響を与えることもでき、Hsp70/Bag−1複合体が、細胞ストレスの状態の際に細胞増殖および有糸***誘発を調節することが示されている。TNF、TRAIL、酸化ストレス、UV照射、ならびに抗癌剤ドキソルビシン、エトポシド、およびタキソールなどの様々な刺激によって誘導される細胞死から細胞を保護するHsp70の能力は、その抗アポトーシス特性をさらに強める。最後に、研究報告により、Hsp70がアポトーシス誘導因子(AIF)をアンタゴナイズし、カスパーゼ3の下流の抗アポトーシス機能を働かせるため、Hsp70とアポトーシス機構との間のより直接的な相互作用の証拠も示された。
前の段落から明らかなように、Hsp70の細胞内機能は、適切な細胞恒常性、特に有害な攻撃の際に必須である。しかし、特に、免疫および炎症応答に関して、細胞外Hsp70(eHsp70)の興味深い役割も浮上し、eHsp70は、癌細胞の除去に重要な役割を有するであろう。さらに、ストレスおよび細胞損傷に対する保護への一般的な生理学的適応への関与も、eHsp70の新しいテーマである。
eHsp70の存在についての最初の証拠は、温度の上昇が、一連の熱ショックタンパク質を、軸索内に移送される軸索を取り囲んでいるグリア鞘に誘導したことを示すイカ巨大軸索の研究からもたらされた。これらの知見は、培養ラット胚細胞ですぐに再現され、そして重要なことに既にこの時点で、共に古典的な分泌経路の阻害剤であるモネンジンもコルヒチンもHsp70の分泌を阻害できないため、Hsp70の放出に関与するエキソサイトーシスの非古典的経路に関する証拠が示された。これらが公表されてから、他の研究報告が、カエル、ザリガニ、およびラットなどの様々な動物モデル系におけるグリアによるHspsの放出およびニューロンによる取り込みの例を提供した。ヒトにおけるeHsp70の源としてのグリア細胞の役割の裏づけが、培養ヒトグリア芽細胞腫細胞の研究によって示された。この研究は、コントロール条件下で、細胞が、24時間の期間に100万細胞当たり約10pgのHsp70を培地に放出したことを示した。この放出は、この期間の初めに20分間の熱ショックを与えられると2.5〜5倍に増加した。重要なことに、この研究は、eHsp70の放出が細胞死によって説明できる放出よりも多いことも示した。これらのデータはすべて、Hspsのグリア放出が、代謝ストレス中のニューロンの機能を支持する方法であり得るというTytellらによって初めに提唱された仮説を裏付ける。
細胞保護の役割に加えて、原形質膜結合eHsp70および遊離全身eHsp70の両方が、免疫において役割を果たすことが立証された。Hsp70の主な機能の1つが、細胞内タンパク質をシャペロンすることを考慮すると、Hsp70が、免疫原性ペプチドの結合に関与し、主要組織適合複合体(MHC)クラス1分子によるこれらの提示を助け得ることは驚きではない。さらに、腫瘍由来eHsp70は、免疫原性ペプチドをシャペロンし、抗原提示細胞(APC)に選択的に結合することが示された。受容体媒介エンドサイトーシスの後、これらのHsp70−ペプチド複合体が、MHCクラス1分子に提示され、細胞傷害性T細胞の応答がもたらされる。自己抗原のシャペロニング(chaperoning)に加えて、Hsp70は、微生物ペプチドと細菌DNAの非メチル化CpGモチーフを結合させることもできる。
グリア/軸索モデルなどにおける隣接細胞間のeHsp70の転移を実証するデータとは別に、いくつかの研究報告が、循環中における遊離eHsp70の存在を立証している。この区画内に存在するHsp70の場合、Hsp70は、器官/細胞から放出されなければならない。通常は、これを達成する2つの主な経路が考えられる。1つは、末梢循環中のeHsp70の観察が、細胞溶解または細胞死によるHsp70の細胞内プールからの放出の結果である受動経路である。あるいは、または場合によってはこれに加えて、Hsp70は、非古典的なエキソサイトーシス経路によって能動的に放出される。
本発明は、一実施形態では、Hsp70の細胞内の濃度および/または活性を上昇させることができる生理活性剤の使用に関する。
−Hsp70またはその機能的断片もしくは機能的変異体
−Hsp70誘導物質およびHsp70共誘導物質(co−inducer)
・ビモクロモル(Bimoclomol)およびアリモクロモル(Arimoclomol)などの低分子薬物
・ベンジルアルコールなどの膜流動化剤
・亜致死温熱療法(sub−lethal heat−therapy)(≦42℃)または温熱療法
・抗炎症薬および抗腫瘍薬からなる特定の薬物
・細胞ストレス
・活性酸素種(ROS)、アドレナリン、ノルアドレナリン、UV光、放射線療法
薬剤として使用するための、Hsp70またはその機能的断片もしくは機能的変異体を提供することが本発明の態様である。
Hsp70の断片または変異体は、一実施形態では、野生型タンパク質に対して100%の同一性を有する。別の実施形態では、Hsp70の断片または変異体は、野生型タンパク質に対して100%未満の同一性、例えば、99.9〜95%の同一性、例えば、95〜90%の同一性、例えば、90〜85%の同一性、例えば、85〜80%の同一性、例えば、80〜75%の同一性、例えば、75〜60%の同一性を有するHsp70の変異体とすることもできる。
上記したように、リソソーム蓄積症の治癒法は存在せず、治療は、ゴーシェ病およびファブリー病に対する酵素補充療法(ERT)の開発を除き、殆どが対症療法である。上述したように、ERTは、1つの特定の疾患のみに対して有効な非常に高価な形態の療法である。
一実施形態では、Hsp70またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、ベクターから発現させることができる。したがって、本発明は、一実施形態では、Hsp70またはその機能的断片もしくは機能的変異体をコードするベクターに関する。
一実施形態では、本発明による生理活性剤は、Hsp70誘導物質またはHsp70共誘導物質である。
一実施形態では、本発明による生理活性剤は、Hsp70共誘導物質である。さらなる実施形態では、前記Hsp70共誘導物質は低分子薬物である。
一実施形態では、本発明による生理活性剤は、Hsp70誘導物質である。さらなる実施形態では、前記Hsp70誘導物質は、膜流動化剤である。
以下に一部の概要を説明するHsp70の発現を誘導するためのどの手段も、本発明に包含されるものとする。
本発明は、Hsp70の濃度および/または活性を上昇させることができる生理活性剤の使用により、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の患者に恩恵をもたらすことに関する。
本発明による有効量の生理活性剤を哺乳動物、好ましくはヒトに送達するために投与のあらゆる適当な経路を利用することができ、前記生理活性剤は、一実施形態では、Hsp70またはその機能的断片もしくは機能的変異体することができる。
他の治療方式と共に、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、Hsp70の細胞内の濃度および/または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の態様である。
本発明者らは、Hsp70が他の分子のエンドサイトーシスによる取り込みを増加させることをさらに示した(図4)。この取り込みの増加は、Hsp70の存在下で化合物が細胞により容易に取り込まれるようにする受動機構によってHsp70に依存しないで起こり得る、またはHsp70との直接的な関連によってHsp70に依存して起こり得る。
本発明は、一態様では、それを必要とする個体を治療するための方法に関する。
実施例1:Hsp70とビス(モノアシルグリセロ)リン酸との間の相互作用が、酸性スフィンゴミエリナーゼを活性化し、リソソーム膜を安定させ、細胞の生存を向上させる
WT−MEFおよびHsp70−MEFは、当技術分野で述べられているように作製し、不死化し、そして維持した。ヒトNPDA線維芽細胞(83/24)は、生後5ヶ月の肝脾腫の患者の皮膚生検に由来する。組換えタンパク質は、pET−16bベクター系およびNi2+アフィニティ精製(Novagen)を用いて作製し、製造業者(Molecular Probes)のプロトコルに従ってAlexa Fluor488で標識した。リソソーム完全性を分析するために、我々は、リソソームを赤色に染色して光酸化に対して感作させる細胞の酸性区画内に蓄積する異染性弱塩基であるアクリジンオレンジで染色した細胞のリアルタイムイメージング法を開発した。リソソームpH勾配の光酸化に誘導された消失およびアクリジンオレンジの個々のリソソームから細胞質ゾルへの漏出を、U2−O−S細胞における「赤色点の消失」として、および線維芽細胞におけるZeiss LSM DUOソフトウエアによる赤色蛍光の減少および緑色蛍光の増加として視覚的に定量した。全カテプシン活性および細胞質(ジギトニン抽出)カテプシン活性を、当技術分野で述べられているようにzFR−AFC(Enzyme System Products)プローブを用いてジギトニン処理サンプルで測定した。トリプトファン蛍光スペクトルおよびリポソーム90度光散乱を、本質的に当技術分野で述べられているようにHEPES緩衝液(20mM HEPES、0.1mM EDTA、示されているpH)で分析した。表面プラズモン共鳴測定を、当技術分野で述べられているようにBIAcore2000システムを用いて固定したLUVで行った。Hsp70 siRNA(5’−GCCAUGACGAAAGACAACAAUCUGU−3’)およびコントロールHsp70 siRNAをOligofectamine(Invitrogen)を用いてトランスフェクトした。標準的なプロトコルで免疫検出を行った。アポトーシス様細胞死およびリソソーム膜透過化を、本質的に当技術分野で述べられているように分析した。当技術分野で述べられているように変更を加えたMolecular ProbesからのAmplex Red Sphingomyelinase Assay Kit(A12220)によってASM活性を分析した。対応のあるスチューデントの両側t検定を用いて統計分析を行い、すべての群のデータを、F検定を用いてそれらの分散の比較可能性について調べた。
細胞培養および試薬。ヒトU−2−OS骨肉腫細胞を、6%熱不活化ウシ血清およびペニシリン−ストレプトマイシンを添加したRPMI1640(Invitrogen)で培養した。Hsp70トランスジェニックMEFおよび適切なコントロールMEFを、当技術分野で述べられているように作製し維持した。ヒト一次NPDA線維芽細胞を、1%Na−Pyruvate、1%HEPES、1%L−グルタミンをさらに添加したMEF培地で増殖させた。すべての細胞を、CO2が5%の加湿大気中で、37℃で増殖させ、マイコプラズマについて繰り返し試験し、陰性であることを確認した。特に明記されていない限り、すべての化学種は、Sigma−Aldrich(Sigma−Aldrich Denmark A/S)から購入した。
目的
in vivo におけるHsp70治療効果を、NPC病理学の以下の基準で判定する。
・身体的成果(体重、臓器重量、および生存時間)
・振戦、歩行、および養育における行動変化
・脂質蓄積(コレステロール、GSL、およびスフィンゴシン)の生化学的変化
・小脳の病理の免疫組織学的分析(プルキンエ細胞の減少程度)
治療計画
8匹のNPC−/−コントロール(PBSのみ)に対して、8匹の処理(rHsp70)NPC−/−を使用した。生後3週間から、それぞれ10mg/kgのrHsp70またはビヒクルのみ(PBS)を一週間に3回、マウスに腹腔内投与処理した。3匹のコントロールおよび3匹の処理マウスを生後7週間または9週間で(すなわち、処理後それぞれ4週間または6週間で)屠殺した。臓器を潅流し(PBS)、重量測定後、生化学的分析および免疫組織学的分析のため凍結した。
行動に関する実験は、前述のとおり、生後3週間から行った。暫時、自動振戦モニター(San Diego Instruments製)を用いて、振戦分析を行った。歩行分析は、マウスの前足および後足に無毒性の塗料を塗り、Whatman 3M 紙の上を歩かせて行った。足の配置を測定して、前足と後足の重なり具合、一歩きの長さ、および歩行の幅を決定した。
臓器に緩衝液を加えずにすりつぶし、10μlずつ凍結した。新鮮な資料にPBSを加えて100μlとし、生化学的分析に供した。それぞれの資料の蛋白定量はBCAタンパク質アッセイにより行った。コレステロールアッセイは、Invitrogen製のAmplex Red コレステロールアッセイを用いて行った。スフィンゴシンは、スフィンゴイド塩基抽出によって単離され、HPLCによって分析された。GSLは、抽出後、蛍光HPLCによって分析した。すべての結果は、タンパク質量で標準化した。
潅流した脳は、OCT用に包埋され、ドライアイスで冷却したイソペンタンで凍結した。脳はゼラチン被覆スライド上で切片とし、−80℃保存した後、抗体染色した。
成長曲線(図12を参照)
コントロール動物(上図)は浅めの成長曲線を示し、処理動物は着実に体重が増加し、より重量となる。
臓器重量に違いは認められなかった。
7週間および9週間後の時点で残っている個体数が少なかったため、生存時間の延長という結論は得られなかった。9週間または10週間目のマウスを記録した映像によると、Hsp70処理動物は、毛並みがよく、体も大きい。加えて、より活動的であり、より強い振戦を示し、随意運動については悪化するようにみえた。
Hsp70処理マウスは、処理の3週目から振戦の増加が認められ、末期に至るまで増加したままであった。この振戦は、明確に最低の頻度範囲ではあったが、裸眼ではっきりと確認できるものであった。
7週時点において(図14A)、Hsp70処理マウスは、コントロールに比べて、末梢組織における有意な減少が認められる(各グループ個体数は3、二重試験、*=p<0.05、**=p<0.01、***=p<0.001)。
実験の1つの繰り返しでのみ生じたものであるが、脳コレステロールは減少を示した。他の二匹の処理マウスでは、コントロールと正に同じレベルを示した(各グループ個体数は3、三重試験)。
7週目で、肝臓ではHsp70処理マウスにおいてGSLの有意な減少が認められる(p<0.05、*)(図15A)。また、脾臓および脳においても減少が認められるが、統計学上有意な差ではない(恐らく個体数が少ないためである)。
スフィンゴシン分析は、すべての臓器においてまだ終了していない。7週目から9週目の脳におけるデータでは、7週目の処理マウスおよびコントロールマウスの間に、有意な差は認められない。9週目の時点では両グループにおいて全体的な減少が認められるが、処理動物の脳におけるスフィンゴシンの量は、わずかであるものの有意に(p<0.005、**)増加したままである。
成長曲線
特に初期においては、通常のマウスの一般的な増加を示す。
振戦の増加は、中枢神経系(CNS)で生じ得る効果を指し示すものとして興味深い(患者に高容量で投与された場合のミグルスタット(Miglustat)が、極端な効果ではないが、同様の効果を示す)。
Hsp70処理は、7週目のコントロールマウスに比べて、コレステロールの末梢部における蓄積を減少させる。ただし、脳においては、3回の繰り返しのうち1回で減少を示しただけであるので、まだ検討中である。一方、9週目までに、コレステロール値は処理マウスおよびコントロールマウスにおいて同等になる。これには、複数の要因が関連しているのかもしれない。本マウスでは、まず、当該タンパク質に対する抗体が作られ、薬剤の効果を阻害し、さらには薬剤の初期効果を弱めていることが考えられる。次に、高容量の投与によって、慢性毒性を引き起こし、コレステロール代謝およびマウスの全体的な健康状態に有害な影響を与えていることが考えられる。
Claims (74)
- グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、Hsp70の細胞内濃度および/または活性を上昇させることができる、
生理活性剤。 - 活性が補助因子のリソソームBMPの存在とは直接には関連しない酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症の治療に使用するための、Hsp70の細胞内濃度および/または活性を上昇させることができる、
生理活性剤。 - 前記リソソーム蓄積症が、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、シアリドーシスI型、異染性白質ジストロフィー、ゴーシェ病、ファブリー病、およびサポシン欠損症からなる群から選択されない、
請求項2に記載の生理活性剤。 - 前記生理活性剤が、Hsp70またはその機能的断片もしくは機能的変異体、アリモクロモル、およびイロキサナジンからなる群から選択される、
前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。 - 前記Hsp70またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、ヒトHsp70またはその機能的断片もしくは機能的変異体である、
請求項4に記載の生理活性剤。 - 前記Hsp70またはその機能的断片もしくは機能的変異体が、ヒト野生型Hsp70に対して、少なくとも60%の同一性、好ましくは少なくとも70%の同一性、より好ましくは少なくとも75%の同一性、より好ましくは少なくとも80%の同一性、より好ましくは少なくとも85%の同一性、より好ましくは少なくとも90%の同一性、より好ましくは少なくとも91%の同一性、より好ましくは少なくとも92%の同一性、より好ましくは少なくとも93%の同一性、より好ましくは少なくとも94%の同一性、より好ましくは少なくとも95%の同一性、より好ましくは少なくとも96%の同一性、より好ましくは少なくとも97%の同一性、より好ましくは少なくとも98%の同一性、より好ましくは少なくとも99%の同一性、より好ましくは少なくとも99.5%の同一性、より好ましくは少なくとも99.9%の同一性を有する、
請求項4又は請求項5に記載の生理活性剤。 - 前記野生型Hsp70は、配列番号1および配列番号3からなる群から選択される配列を有する、請求項5又は請求項6に記載の生理活性剤。
- 前記生理活性剤が、完全長Hsp70、およびHsp70の機能的断片もしくは機能的変異体を含むHsp70からなる群から選択される、
前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。 - Hsp70の前記機能的断片もしくは機能的変異体が、641未満のアミノ酸、例えば、625未満のアミノ酸、例えば、600未満のアミノ酸、例えば、575未満のアミノ酸、例えば、550未満のアミノ酸、例えば、525未満のアミノ酸、例えば、500未満のアミノ酸、例えば、475未満のアミノ酸、例えば、450未満のアミノ酸、例えば、425未満のアミノ酸、例えば、400未満のアミノ酸、例えば、375未満のアミノ酸、例えば、350未満のアミノ酸、例えば、325未満のアミノ酸、例えば、300未満のアミノ酸、例えば、275未満のアミノ酸、例えば、250未満のアミノ酸、例えば、225未満のアミノ酸、例えば、200未満のアミノ酸、例えば、175未満のアミノ酸、例えば、150未満のアミノ酸、例えば、125未満のアミノ酸、例えば、100未満のアミノ酸、例えば、75未満のアミノ酸、例えば、50未満のアミノ酸、例えば、25未満のアミノ酸の全長を有する、
前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。 - Hsp70の前記機能的断片または機能的変異体が、10超のアミノ酸、例えば、26以上のアミノ酸、例えば、51以上のアミノ酸、例えば、76以上のアミノ酸、例えば、101以上のアミノ酸、例えば、126以上のアミノ酸、例えば、151以上のアミノ酸、例えば、176以上のアミノ酸、例えば、201以上のアミノ酸、例えば、226以上のアミノ酸、例えば、251以上のアミノ酸、例えば、276以上のアミノ酸、例えば、301以上のアミノ酸、例えば、326以上のアミノ酸、例えば、351以上のアミノ酸、例えば、376以上のアミノ酸、例えば、401以上のアミノ酸、例えば、426以上のアミノ酸、例えば、451以上のアミノ酸、例えば、476以上のアミノ酸、例えば、501以上のアミノ酸、例えば、526以上のアミノ酸、例えば、551以上のアミノ酸、例えば、576以上のアミノ酸、例えば、601以上のアミノ酸、例えば、626以上のアミノ酸の全長を有する、
前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。 - Hsp70の前記機能的断片または機能的変異体が、Hsp70のアミノ酸残基の0.1〜1%、例えば、アミノ酸残基の1〜2%、例えば、アミノ酸残基の2〜3%、例えば、アミノ酸残基の3〜4%、例えば、アミノ酸残基の4〜5%、例えば、アミノ酸残基の5〜10%、例えば、アミノ酸残基の10〜15%、例えば、アミノ酸残基の15〜20%、例えば、アミノ酸残基の20〜30%、例えば、アミノ酸残基の30〜40%、例えば、アミノ酸残基の40〜50%、例えば、アミノ酸残基の50〜60%、例えば、アミノ酸残基の60〜70%、例えば、アミノ酸残基の70〜80%、例えば、アミノ酸残基の80〜90%、例えば、アミノ酸残基の90〜100%のアミノ酸の置換を有する、
前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。 - Hsp70の前記機能的断片または機能的変異体が、5〜25のアミノ酸、例えば、25〜50のアミノ酸、例えば、50〜75のアミノ酸、例えば、75〜100のアミノ酸、例えば、100〜125のアミノ酸、例えば、125〜150のアミノ酸、例えば、150〜175のアミノ酸、例えば、175〜200のアミノ酸、例えば、200〜225のアミノ酸、例えば、225〜250のアミノ酸、例えば、250〜275のアミノ酸、例えば、275〜300のアミノ酸、例えば、300〜325のアミノ酸、例えば、325〜350のアミノ酸、例えば、350〜375のアミノ酸、例えば、375〜400のアミノ酸、例えば、400〜425のアミノ酸、例えば、425〜450のアミノ酸、例えば、450〜475のアミノ酸、例えば、475〜500のアミノ酸、例えば、500〜525のアミノ酸、例えば、525〜550のアミノ酸、例えば、550〜575のアミノ酸、例えば、575〜600のアミノ酸、例えば、600〜625のアミノ酸、例えば、625〜640のアミノ酸の範囲の全長を有する、
前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。 - Hsp70の前記機能的断片または機能的変異体が、Hsp70のATPアーゼドメインのすべてまたは一部を含む、
前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。 - Hsp70の前記機能的断片または機能的変異体が、Hsp70のATPアーゼドメインのアミノ酸位置90にトリプトファンを含む、前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。
- 前記Hsp70またはその機能的断片もしくは機能的変異体が、組換えHsp70(rHsp70)である、
前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。 - 前記Hsp70が、ヒト(ホモサピエンス)、マウス(ハツカネズミ)、ウシ、イヌ、ラット、フェレット、ブタ、ヒツジ、およびサルからなる群から選択される哺乳動物に由来する、
前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。 - 前記生理活性剤が、Hsp70誘導物質またはHsp70共誘導物質である、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤。 - 前記生理活性剤が、Hsp70誘導物質である、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤。 - 前記生理活性剤が、Hsp70共誘導物質である、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤。 - 前記Hsp70共誘導物質が、ヒドロキシルアミン誘導体である、
請求項19に記載の生理活性剤。 - 前記ヒドロキシルアミン誘導体が、ビモクロモル(BRLP−42)、アリモクロモル(BRX−220)、BRX−345、およびBGP−15からなる群から選択される、
請求項20に記載の生理活性剤。 - 前記ヒドロキシルアミン誘導体が、アリモクロモル(BRX−220)である、
請求項20に記載の生理活性剤。 - 前記生理活性剤が、イロキサナジン(iroxanadine)(5−(ピペリジン−1−イルメチル)−3−ピリジン−3−イル−5,6−ジヒドロ−2H−1,2,4−オキサジアジン)(5−(piperidin−1−ylmethyl)−3−pyridin−3−yl−5,6−dihydro−2H−1,2,4−oxadiazine)である、
請求項17に記載の生理活性剤。 - 前記Hsp70誘導物質が、膜流動化剤である、
請求項18に記載の生理活性剤。 - 前記膜流動化剤が、ベンジルアルコール、ヘプタノール、AL721、ドコサヘキサエン酸、脂肪族アルコール、オレイルアルコール、ジメチルアミノエタノール、A2C、ファルネソール、リドカイン、ロピバカイン、ブピバカイン、およびメピバカインからなる群から選択される、
請求項24に記載の生理活性剤。 - 前記Hsp70誘導物質または前記Hsp70共誘導物質が、エデルホシン(ET−18−OCH3または1−オクタデシル−2−メチル−rac−グリセロ−3−ホスホコリン)、セレコキシブ、ロフェコキシブ、アセチル−サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、インドメタシン、PGA1、PGj2 2−シクロペンテン−1−オン、ペルオキシダーゼ増殖因子活性化受容体−γ作動薬、ビンクリスチン、パクリタキセル、ピオグリタゾン、カルボプラチン、ドキソルビシン、フルダラビン、イホスファミド シタラビン、ゲルダナマイシン、17−AAG、17−DMAG、ラジシコール、ハービマイシン−A、アラキドン酸、MG132、ラクタシスチン、DCIC、TLCK、TPCK、ゲラニルゲラニルアセトン(GGA)、レバミピド、カルベノキソロン、ポラプレジンク(亜鉛L−カルノシン)、デキサメタゾン、コカイン、ニコチン、アルコール、α−アドレナリン作動薬、シクロペンテノンプロスタノイド、ペオニフロリン、グリチルリジン、セラストロール、ジヒドロセラストロール、2酢酸ジヒドロセラストロール、およびクルクミンからなる群から選択される、
請求項17に記載の生理活性剤。 - 前記生理活性剤が、亜致死温熱療法である、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤。 - 前記亜致死温熱療法が、個体の温度を、約38℃、例えば、約39℃、例えば、約40℃、例えば、約41℃、例えば、約42℃、例えば、約43℃の中核体温まで上昇させるステップを含む、
請求項27に記載の生理活性剤。 - 前記生理活性剤が、Hsp70またはその機能的断片もしくは機能的変異体とHsp70誘導物質またはHsp70共誘導物質との組合せを含む、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤。 - 前記治療が、予防、治癒、または改善である、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤。 - 前記生理活性剤が、それを必要とする個体に非経口投与される、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤。 - 前記非経口投与が、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、動脈内注射、皮下注射、または腹膜内注射である、
請求項31に記載の生理活性剤。 - 前記非経口投与が、静脈内注入である、
請求項31に記載の生理活性剤。 - 前記静脈内注入が、10〜20分、例えば、20〜30分、例えば、30〜40分、例えば、40〜50分、例えば、50〜60分、例えば、60〜90分、例えば、90〜120分、例えば、2〜3時間、例えば、3〜4時間、例えば、4〜5時間、例えば、5〜6時間、例えば、6〜7時間、例えば、7〜8時間の期間に渡って行われる、
請求項33に記載の生理活性剤。 - 前記非経口投与が経粘膜送達である、
請求項31に記載の生理活性剤。 - 前記経粘膜送達が舌下送達である、
請求項35に記載の生理活性剤。 - 前記経粘膜送達が口腔送達である、
請求項35に記載の生理活性剤。 - 前記経粘膜送達が吸入である、
請求項35に記載の生理活性剤。 - 前記経粘膜送達が鼻腔内送達である、
請求項35に記載の生理活性剤。 - 請求項1から請求項39のいずれか一項に記載の生理活性剤を、それを必要とする個体に投与することを含む、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療方法。
- 請求項1から請求項39のいずれか一項に記載の生理活性剤を、それを必要とする個体に投与することを含む、酵素活性が補助因子のリソソームBMPの存在とは直接には関連しない、前記酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症の治療方法。
- 前記リソソーム蓄積症が、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、シアリドーシスI型、異染性白質ジストロフィー、ゴーシェ病、ファブリー病、およびサポシン欠損症からなる群から選択されない、
請求項41に記載の方法。 - 前記治療が、予防、治癒、および/または改善である、
請求項41又は請求項42に記載の方法。 - 前記治療が、コントロールに比べて前記個体の寿命を延ばす、
請求項41又は請求項42に記載の方法。 - 前記寿命が、6ヶ月〜1年、例えば、1〜2年、例えば、2〜3年、例えば、3〜4年、例えば、4〜5年、例えば、5〜6年、例えば、6〜7年、例えば、7〜8年、例えば、8〜9年、例えば、9〜10年、例えば、10〜12年、例えば、12〜14年、例えば、14〜16年、例えば、16〜18年、例えば、18〜20年、例えば、20〜25年、例えば、25〜30年、例えば、30〜40年、例えば、40〜50年、例えば、50〜60年、例えば、60〜70年、例えば、70〜80年、例えば、80〜90年、例えば、90〜100年延長される、
請求項44に記載の方法。 - 前記生理活性剤が、医薬組成物として調製される、
請求項440又は請求項41に記載の方法。 - 前記疾患が、心臓グリコーゲン蓄積症(cardiac glycogenosis)、アンダーセン病(Andersen disease)、コーリ病(Cori disease)(フォーブス病(Forbes disease))、ハース病(Hers disease)、マックアードル病(McArdle disease)、ポンぺ病(Pompe disease)、Tauri病(垂井病(Tarui disease))、およびフォンギールケ病(von Gierke disease)からなる群から選択される、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤、あるいは、請求項40又は請求項41に記載の方法。 - 前記疾患が、サンドホフ病(またはGM2ガングリオシドーシスII型)、古典的な小児サンドホフ病、若年性サンドホフ病、成人/後期発症サンドホフ病、テイ・サックス病(またはGM2ガングリオシドーシスI型)、小児テイ・サックス病、若年性テイ・サックス病、成人/後期発症テイ・サックス病、GM2−ガングリオシドーシスABバリアント、GM1ガングリオシドーシス、初期小児GM1ガングリオシドーシス、後期小児GM1ガングリオシドーシス、成人GM1ガングリオシドーシス、GM3ガングリオシドーシス、およびムコリピドーシスIV型からなる群から選択される、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤、あるいは、請求項40又は請求項41に記載の方法。 - 前記疾患が、バッテン病(Batten disease)(シュピールマイアー−フォークト病(Spielmeyer−Vogt disease))、ビールショスキー−ヤンスキー病(Bielschowsky−Jansky disease)、クーフス病(Kufs disease)、およびSantavuori−Haltia病からなる群から選択される、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤、あるいは、請求項40又は請求項41に記載の方法。 - 前記疾患が、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、およびコレステリルエステル蓄積症からなる群から選択される、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤、あるいは、請求項40又は請求項41に記載の方法。 - 前記疾患が、I型ムコ多糖症、II型ムコ多糖症、、III型ムコ多糖症、、IV型ムコ多糖症、VI型ムコ多糖症、VII型ムコ多糖症、VIII型ムコ多糖症、およびIX型ムコ多糖症からなる群から選択される、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤、あるいは、請求項40又は請求項41に記載の方法。 - 前記疾患が、ハーラー症候群(Hurler syndrome)、ハーラー−シャイエ症候群(Hurler−Scheie syndrome)、シャイエ症候群(Scheie syndrome)、ハンター症候群(Hunter’s syndrome)、DiFerrante症候群、マロト−ラミー症候群(Maroteaux−Lamy syndrome)(軽度または重篤)、モルキオ症候群(Morquio syndrome)(古典的またはモルキオ様)、およびサンフィリッポ症候群(Sanfilippo syndrome)(A、B、C、またはD型)からなる群から選択される、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤、あるいは、請求項40又は請求項41に記載の方法。 - 前記疾患が、ムコリピドーシスII(I−セル病)およびムコリピドーシスIII(偽ハーラー多発性ジストロフィー)(pseudo−Hurler polydystrophy)からなる群から選択される、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤、あるいは、請求項40又は請求項41に記載の方法。 - 前記疾患が、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、α−マンノシド症、α−マンノシド症I型、α−マンノシド症II型、β−マンノシド症、およびシアリドーシスII型(ムコリピドーシスI)からなる群から選択される、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤、あるいは、請求項40又は請求項41に記載の方法。 - 前記疾患が、酵素の欠陥を含む、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤、あるいは、請求項40又は請求項41に記載の方法。 - 前記疾患が、酵素の翻訳後修飾における欠陥を含む、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤、あるいは、請求項40又は請求項41に記載の方法。 - 前記疾患が、非酵素タンパク質における欠陥を含む、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤、あるいは、請求項40又は請求項41に記載の方法。 - 前記疾患が、膜輸送タンパク質における欠陥を含む、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤、あるいは、請求項40又は請求項41に記載の方法。 - 前記疾患が、酵素保護タンパク質における欠陥を含む、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤、あるいは、請求項40又は請求項41に記載の方法。 - 前記疾患が、膜貫通タンパク質における欠陥を含む、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤、あるいは、請求項40又は請求項41に記載の方法。 - 前記疾患が、膜貫通型でないタンパク質における欠陥を含む、
請求項1又は請求項2に記載の生理活性剤、あるいは、請求項40又は請求項41に記載の方法。 - 請求項1から請求項39のいずれか一項に記載の生理活性剤を、少なくとも1つの他の治療方式と併用して投与することを含む、
グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療方法。 - 請求項1から請求項39のいずれか一項に記載の生理活性剤を、少なくとも1つの他の治療方式と併用して投与することを含む、
活性が補助因子のリソソームBMPの存在とは直接には関連しない酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症の治療方法。 - 前記リソソーム蓄積症が、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、シアリドーシスI型、異染性白質ジストロフィー、ゴーシェ病、ファブリー病、およびサポシン欠損症からなる群から選択されない、
請求項63に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの他の治療方式が、同時または連続的に実施される、
請求項62又は請求項63に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの他の治療方式が、酵素補充療法(ERT)である、
請求項62又は請求項63に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの他の治療方式が、鎮痛剤である、
請求項62又は請求項63に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの他の治療方式が、コルチコステロイドである、
請求項62又は請求項63に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの他の治療方式が、移植である、
請求項62又は請求項63のに記載の方法。 - 前記移植が、骨髄移植、臍帯血移植、および幹細胞移植からなる群から選択される、
請求項62又は請求項63に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの他の治療方式が、基質抑制療法である、
請求項62又は請求項63に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの他の治療方式が、理学療法などの対症および支持療法である、
請求項62又は請求項63に記載の方法。 - Hsp70の細胞内濃度および/または活性を高める方法であって、
前記方法が、治療上有効量のアリモクロモルおよび/またはイロキサナジンを細胞に投与することを含む方法。 - Hsp70の細胞内濃度および/または活性を高める in vitro の方法であって、
前記方法が、治療上有効量のアリモクロモルおよび/またはイロキサナジンを細胞に投与することを含む方法。
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