JP2013543376A - Dna内のrna相互作用領域の検出 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、全ての目的のため参照により組み入れられる、2010年9月10日に出願された米国仮特許出願第61/381,835号に基づく優先権の恩典を主張する。
ゲノムDNAとRNAの相互作用は、DNAの転写に影響を及ぼし、それを調節することができる。マイクロRNA(miRNA)のような非コードRNAは、DNA修飾の媒介、およびクロマチン構造の変化、例えば、活性状態から不活性状態へのクロマチンの変化により、転写を調節することが示されているが、多くの場合、RNAがDNA転写を調節する機序は未知である。
RNA分解剤およびDNA分解剤を核へ導入する工程であって、それによりゲノムDNA内の少なくとも1個のDNA領域が、RNA分解剤の存在のためDNA分解剤により分解される、工程;ならびに
該DNA分解剤によって分解される、ゲノムDNA内の少なくとも1個のDNA領域を検出する工程であって、DNA領域の非存在またはDNA領域のコピー量の低下が、該DNA領域が該DNA分解剤によって分解されることを示し;それにより、RNA相互作用領域を検出する、工程
を含む。
RNA分解剤;
DNA分解剤;および
細胞膜を透過処理するかまたは破壊する剤
を含むキットも提供する。
本明細書において使用される「RNA相互作用領域」とは、RNAが直接的に(例えば、正準ワトソンクリック塩基対合によってゲノムDNA配列とハイブリダイズすることにより、もしくは三重ヘリックス様構造でゲノムDNAの主溝もしくは副溝と会合することにより)、または間接的に(例えば、タンパク質のようなメディエーターを通して)相互作用する、ゲノムDNAの配列をさす。いくつかの態様において、RNA相互作用領域は、RNA:DNA二重鎖が形成された領域である。本明細書において使用される「RNA」とは、コードRNA(mRNA)および非コードRNAの両方をさす。非コードRNAの非限定的な例には、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、および長鎖非コードRNAが含まれる。
I. 序論
RNAと相互作用するゲノムDNA領域を検出する方法が提供される。方法は、RNA分解剤およびDNA分解剤を核へ導入する工程、ならびに、次いで、DNA分解剤により分解される、ゲノムDNA内の1個または複数個の領域を検出する工程を含み、ゲノムDNAの1個または複数個の領域は、RNA分解剤の存在のためDNA分解剤により分解される。DNA領域の非存在もしくはDNA領域のコピー数の低下によりまたはPCRによって増幅され得ないことにより検出され得るゲノムDNA分解の領域は、RNAと相互作用するゲノムDNA領域に相当する可能性が高い。
本発明の方法は、RNA分解剤およびDNA分解剤を核へ導入する工程であって、それにより核内のゲノムDNAの少なくとも1個のDNA領域が、RNA分解剤の存在のためDNA分解剤により分解される、工程、ならびに、次いで、DNA分解剤により分解されるゲノムDNAの少なくとも1個のDNA領域を検出する工程を含む。
本発明の方法によると、RNA分解剤およびDNA分解剤が、核、または核を有する細胞へ導入され、核内のゲノムDNA内の少なくとも1個のDNA領域が、RNA分解剤の存在のためDNA分解剤により分解される。RNA-DNA相互作用の部位、例えば、RNA:DNA二重鎖において、RNA分解剤の存在は、RNA(例えば、RNA:DNA二重鎖内のRNA鎖)の分解をもたらし、DNA分解剤の存在は、DNA(例えば、RNA:DNA二重鎖内のDNA鎖、またはDNAと相互作用していたRNAの消化後の一本鎖DNA)の分解をもたらすと考えられる。塩基対合によらないRNA:DNA相互作用の部位、またはRNAがタンパク質中間体を通してクロマチンと会合しているが、DNAと物理的には接触していない部位においては、RNAの分解は、局所的なクロマチン構造を改変し、クロマチンのDNA成分へのDNA分解剤のアクセス可能性を変化させ得る。
本発明のRNA分解剤は、RNA:DNA二重鎖内のRNA、または直接的もしくは間接的なRNA-DNA相互作用の部位のRNA、例えば、クロマチン内のRNA-DNA相互作用の部位のRNAを切るか、消化するか、または分解することができる任意の試薬である。いくつかの態様において、RNA分解剤は酵素である。いくつかの態様において、RNA分解剤は化学的または薬学的な化合物である。
本発明のDNA分解剤は、一本鎖DNA、二本鎖DNA、RNA:DNA二重鎖内のDNA、または直接的もしくは間接的なRNA-DNA相互作用の部位のDNAを切るか、消化するか、または分解することができる任意の試薬である。いくつかの態様において、DNA分解剤は酵素である。いくつかの態様において、DNA分解剤は化学的または薬学的な化合物である。
細胞膜は、当技術分野において公知の任意の方式で、透過処理されるかまたは破壊されることができる。本発明の方法によると、細胞の膜は、RNA分解剤および/またはDNA分解剤を細胞へ導入する工程の前または途中に、透過処理されるかまたは破壊されることができる。
いくつかの態様において、RNA分解およびDNA分解の後、当技術分野において公知の任意の方法によって、細胞からゲノムDNAが単離される。本質的に任意のDNA精製法が、その後の検出工程のために許容される純度のDNAをもたらす限り、使用され得る。例えば、標準的な細胞溶解試薬を、細胞を溶解するために使用することができる。任意で、(プロテイナーゼKを含むが、これに限定されない)プロテアーゼを使用してもよい。当技術分野において公知のようにして、混合物からDNAを単離することができる。いくつかの態様において、フェノール/クロロホルム抽出を使用し、その後、(例えば、エタノールにより)DNAを沈殿させ、精製することができる。あるいは、核酸結合カラムでDNAを単離してもよい。
DNAの検出は、ゲノムDNA内の少なくとも1個のDNA領域の存在または非存在を検出することを含む。DNA領域とは、ゲノムDNA内の関心対象の標的配列である。いくつかの態様において、標的DNA領域は、RNAが結合するかまたはハイブリダイズするゲノムDNAの領域である。細胞のゲノムDNA内の任意のDNA配列を、本明細書に記載されるように、RNA相互作用について評価することができる。
1個または複数個の標的DNA領域とRNAの相互作用を検出し、その程度を定量化するため、多様な方法を使用することができる。いくつかの態様において、RNA相互作用のための1個または複数個の標的DNA領域の検出は、存在する標的DNA領域を検出し、その量を定量化することを含む。いくつかの態様において、RNA相互作用のための1個または複数個の標的DNA領域の検出は、標的DNA領域のコピー数の減少を検出し定量化すること、または標的DNA領域のコピーの非存在を検出することを含む。
本発明は、ゲノムDNA内のRNA相互作用領域の検出に基づき、疾患もしくは状態を診断するか、疾患もしくは状態についての予後判定を提供するか、または疾患もしくは状態のための処置の課程を決定する方法も提供する。
本発明は、本発明のRNA相互作用アッセイを実施するためのキットも提供する。キットは、任意で、書面の説明書または(例えば、CD-ROM上もしくはDVD上の)電子的な説明書を含み得る。本発明のキットは、例えば、RNA分解剤、DNA分解剤を含み得る。いくつかの態様において、キットは、細胞透過処理剤および/または細胞破壊剤をさらに含む。RNA分解剤およびDNA分解剤には、本明細書に詳細に記載されたもの、例えば、RNA:DNA二重鎖内のRNAもしくはDNAまたは一本鎖DNAを分解する、酵素、タンパク質、化学物質、薬学的化合物、および低分子が含まれ得る。いくつかの態様において、RNA分解剤は、RNアーゼ、例えば、RNアーゼHである。いくつかの態様において、DNA分解剤は、DNアーゼ、例えば、S1ヌクレアーゼである。本発明のキットは、RNA分解剤、DNA分解剤、および透過処理剤を、同一のバイアル/容器内に(従って、同一の緩衝液中に)含んでいてもよい。あるいは、RNA分解剤、DNA分解剤、および透過処理剤のうちの一つまたは複数が、別々のバイアル/容器内にあってもよい。
(i)細胞膜を透過処理するかまたは破壊する剤;
(ii)RNA分解剤;
(iii)DNA分解剤;
(iv)RNA分解剤および/またはDNA分解剤によるさらなる分解を防止することができる「停止」溶液;
(v)核酸の単離のための材料(例えば、スピンカラム)
(vi)DNAのPCR/qPCR増幅のための試薬、任意で、鋳型および/またはポリメラーゼに加えて、PCRまたはqPCRのために必要な全ての成分を含有している一つの混合物;
(vii)特定の標的DNA領域のPCR/qPCR増幅のためのプライマーセット。
Claims (27)
- 以下の工程を含む、ゲノムDNA内のRNA相互作用領域を検出する方法:
RNA分解剤およびDNA分解剤を核へ導入する工程であって、それによりゲノムDNA内の少なくとも1個のDNA領域が、RNA分解剤の存在のためDNA分解剤により分解される、工程;ならびに
該DNA分解剤によって分解される、ゲノムDNA内の少なくとも1個のDNA領域を検出する工程であって、DNA領域の非存在またはDNA領域のコピー量の低下が、該DNA領域が該DNA分解剤によって分解されることを示し;それにより、RNA相互作用領域を検出する、工程。 - 前記DNA分解剤が一本鎖DNA分解剤である、請求項1記載の方法。
- 前記DNA分解剤が二本鎖DNA分解剤である、請求項1記載の方法。
- 前記DNA分解剤がRNA:DNA二重鎖を分解する剤である、請求項1記載の方法。
- 核が細胞内にあり、前記RNA分解剤およびDNA分解剤が該細胞へ導入される、請求項1記載の方法。
- 前記導入工程の前または途中に前記細胞の細胞膜を透過処理するかまたは破壊し、それにより、前記RNA分解剤および/またはDNA分解剤の該細胞への導入を増強する工程を含む、請求項5記載の方法。
- 前記RNA分解剤および/またはDNA分解剤がタンパク質である、請求項1記載の方法。
- 前記RNA分解剤および/またはDNA分解剤が前記細胞内で異種発現カセットによってコードされており、前記導入工程が該細胞内で該剤を発現させることを含む、請求項7記載の方法。
- 核が、単離された核であり、前記導入工程が、前記RNA分解剤およびDNA分解剤を、該単離された核へ導入することを含む、請求項1記載の方法。
- 前記RNA分解剤が、前記DNA分解剤が核へ導入される前に、該核へ導入される、請求項1記載の方法。
- 前記RNA分解剤およびDNA分解剤が同時に核へ導入される、請求項1記載の方法。
- 前記RNA分解剤がRNアーゼである、請求項1記載の方法。
- 前記RNアーゼがRNアーゼHである、請求項12記載の方法。
- 前記DNA分解剤がDNアーゼである、請求項1記載の方法。
- 前記DNアーゼがS1ヌクレアーゼである、請求項14記載の方法。
- 前記検出工程が、ヌクレオチド配列決定、または、分解されていないゲノムDNA内の前記少なくとも1個のDNA領域への核酸のハイブリダイゼーションを含む、請求項1記載の方法。
- 前記検出工程が、前記少なくとも1個のDNA領域のDNA増幅を含み、増幅に不応性である領域は、前記DNA分解剤により分解される可能性がある、請求項1記載の方法。
- 前記DNA増幅がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、請求項17記載の方法。
- 前記ゲノムDNAが前記DNA分解剤により断片化されており、前記方法が、インタクトなDNAもしくは断片化されたDNAのいずれかについてDNAを濃縮し、かつ/または該DNAをサイズ選択する工程であって、インタクトなまたは比較的大きなDNA断片が該DNA内のRNA相互作用領域の相対的な非存在を示し、断片化されたまたは比較的小さなDNA断片が該DNA内のRNA相互作用領域の存在を示す工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- RNA分解剤;
DNA分解剤;および
細胞膜を透過処理するかまたは破壊する剤
を含む、キット。 - 前記RNA分解剤および/またはDNA分解剤がタンパク質である、請求項20記載のキット。
- 前記RNA分解剤がRNアーゼである、請求項20記載のキット。
- 前記RNアーゼがRNアーゼHである、請求項22記載のキット。
- 前記DNA分解剤がDNアーゼである、請求項20記載のキット。
- 前記DNアーゼがS1ヌクレアーゼである、請求項24記載のキット。
- リゾ脂質細胞膜透過処理剤を含む、請求項20記載のキット。
- DNAを単離するための材料をさらに含む、請求項20記載のキット。
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