JP2013542726A - 新規クラスの4s−イオタ−カラギーナンスルファターゼを用いたイオタ−カラギーナンのアルファ−カラギーナン変換方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規クラスの4S−イオタ−カラギーナンスルファターゼを用いたイオタ−カラギーナンのアルファ−カラギーナン変換方法に関する。本発明は更に、前記変換方法によって得られたカラギーナンに関する。本発明は特に農産食品、医薬、及び美容産業に応用される。
Description
本発明は、新規クラスの4S−イオタ−カラギーナンスルファターゼを用いたイオタ−カラギーナンのアルファ−カラギーナン変換方法に関する。本発明は更に、前記変換方法によって得られたカラギーナンに関する。
本発明は特に農産食品、医薬、及び美容産業に応用される。
以下の説明中、角括弧([])中の参照は本文の最後に提示した参考文献一覧への参照である。
カラギーナンは、海洋紅藻類の細胞壁から抽出される硫酸化ガラクタンである。カラギーナンは、アルファ(1−3)結合及びベータ(1−4)結合で交互に連結されたひと続きのD−ガラクトシドで構成される。これらのアニオン性多糖は主に、アルファ(1−3)位で連結されたガラクトース残基上の3,6アンヒドロ架橋の有無によって及びそれらの硫酸化の程度によって識別される。例えば、産業的に最も利用されているカラギーナンに見られる3種類の二糖繰り返し単位(カラビオースモチーフと呼ばれる)は、1個(カッパ−カラビオース)、2個(イオタ−カラビオース)、又は3個の硫酸基(ラムダ−カラビオース)が存在することによって特徴付けられる(図1)。カラギーナンは主にカラビオースモチーフで構成され得、例えば、藻類のカッパフィカス・アルベレッチー(Kappaphycus alvarezzi)から得られるカッパ−カラギーナンは約90%のカッパ−カラビオースモチーフ及び10%のイオタ−カラビオースで構成される。ユーシューマ・デンチキュラタム(Eucheuma denticulatum)から抽出されるイオタ−カラギーナンは、85%のイオタ−カラビオース単位及び15%のカッパ−カラビオース単位で構成される。
カラビオース単位に関する組成は、非常に変化に富み得、藻類の植物学的起源に主に依存し得る。カッパ−カラギーナンという用語は、多糖にカッパ−カラビオースモチーフが豊富である場合及び基準としてしばしば用いられるK.アルベレッチー(K.alvarezzi)のカッパ−カラギーナン(非特許文献1)[1]にその物理化学的特性が類似している場合に用いられる。
カッパ/イオタ−ハイブリッドカラギーナンの中間構造の全範囲が、多糖の植物学的起源に従って記載されている(図2;前述の非特許文献1)[1]。また、藻類の細胞壁に存在するカラギーナンの種類は藻類の成長段階にも関連し得る。実際、コンドラス・クリスプス(Chondrus crispus)の場合、配偶体にはカッパ/イオタ−カラギーナンが豊富だが、胞子体は主にラムダ−カラギーナンを含む。時期及び藻類の生長に影響を与え得る全ての環境的要因(照明、温度、塩等)もカラギーナンの構造及び組成に影響する。したがって、起源及び/又は抽出手順に応じて、カッパ−、イオタ−、及びラムダ−カラギーナンタイプの幅広い構造が観察され得る。
これらの多糖は固有の流体力学的特性を有し、農産食品、医薬、及び美容産業において、テクスチャリング剤(texturing agent)として用いられている。これらの多糖は、その高い構造多様性によって説明することができる幅広い機能的特性を有する。カッパ−及びイオタ−カラギーナンはイオン依存性及び熱依存性ゲルを形成する特性を有する。カッパ−カラギーナンはカリウムの存在下で強固なゲルを形成し、イオタ−カラギーナンはカルシウムの存在下で、柔軟で弾力のあるゲルを形成する。カラギーナンの
化学構造の高い多様性及びそれらの天然のハイブリッド性が、各藻類抽出物に特徴的な機能的特性を付与している。
化学構造の高い多様性及びそれらの天然のハイブリッド性が、各藻類抽出物に特徴的な機能的特性を付与している。
年間に約50000トンのカラギーナンが販売されている(非特許文献2)[2]。しかし、利用されるカラギーナンのトン数は、利用可能な紅藻類の量に制限されている。現在、2種の紅藻類、すなわちカッパフィカス・アルベレッチー(Kappaphycus alvarezzi)及びユーシューマ・デンチキュラタム(Eucheuma denticulatum)が広く培養されており、これらから、それぞれカッパ−及びイオタ−カラギーナンが抽出される。多数の野生の藻類(培養されたものではない)も、それらのカッパ/イオタ−ハイブリッド性カラギーナンが非常に有利な機能的特性を示すため、大量に収集されている。しかし、これらの藻類1トンは、1トンの培養藻類の2倍又は10倍も高価である。
更に、各産業的応用は、1種又は複数種の紅藻類から得られるカラギーナンの抽出物に対応している。あらゆる分野の産業上のニーズを満足する解決策は主にカラギーナンの調合(混合)にある(前述の非特許文献2)[2]。
したがって、培養藻類からハイブリッドカラギーナンを得ることを可能にする生物工学的プロセスは経済的収益性が高い。藻類供給源への依存がより少ないという利点があり、紅藻類のバイオマスの利用及び品質向上の新たな展望を開くものである。
そこで、カラギーナンの化学構造、ひいては物理化学的特性を制御するために、本発明者らは、カラギーナンの構造を修飾及び修正できる酵素の精製及び生産に着手した。所望の修飾は、イオタ−カラギーナンを、カッパ−若しくはアルファ−カラギーナン又はカッパ/イオタ型若しくはイオタ/アルファ型カラギーナンのハイブリッド構造に変換するスルファターゼと呼ばれる酵素による、カラギーナンの脱硫酸化からなる(図3)。そこで、彼らは、カラギナーゼを先に作用させることなくポリマーに直接作用できるカラギーナンスルファターゼの存在を実証した。彼らは、アミドヒドラーゼのファミリーに属し、イオタ−カラギーナンの4位での特異的脱硫酸化(SO3 −基の除去)によりイオタ−カラギーナンをアルファ−カラギーナンに変換する、最初の4S−イオタ−カラギーナンスルファターゼをシュードアルテロモナス・カラゲーノボラ(Pseudoalteromonas carrageenovora)の細菌集団から精製することに成功した(特許文献1)[3]。最初の4S−イオタ−カラギーナンスルファターゼに対する戦略と同じ戦略を用いて、本発明者らは、シュードアルテロモナス・アトランティカ(Pseudoalteromonas atlantica)から、ホルミルグリシン依存性スルファターゼのファミリーに属する第2の4S−イオタ−カラギーナンスルファターゼを精製することに成功した。彼らはまず、前記タンパク質の3つのペプチド、NGQFDNTVIVFTSDNGGK(配列番号1)、FDQTFQVGDNTR(配列番号2)、及びETEYITDGLSR(配列番号3)を決定することに成功した。これらは、TrEMBLライブラリーとの比較により、その遺伝子(Patl_0889)がスルファターゼに分類されるP.アトランティカ(P. atlantica)T6cのQ15XH3タンパク質(Protein JD ABG39415.1;非特許文献3)[4]との対応を示した。
したがって、4S−イオタ−カラギーナンスルファターゼは、カラギーナンの「ハイブリッド性」を調整することを可能にし得る。したがって、イオタ−カラギーナンに作用するスルファターゼはいずれも、ペプチド配列の点だけでなく生化学的特性の点でも異なる天然には非常に少ないアルファ−及びイオタ/アルファ−カラギーナンの製造を可能にするため、重要な技術革新となり得る。しかし、最も広く研究されているスルファターゼは動物起源の多糖であるヘパリンに作用する酵素であるため、カラギーナンに作用するスルファターゼは公知のその他のスルファターゼに対して相同性を示さない可能性があると考えられていた。
Bixler et al., Food Hydocolloids, 15: 619-630, 2001
Bixler and Porse, J. Appl. Phycol., 2010, online
Copeland et al., Protein JD ABG 39415. 1,2006
したがって、先行技術の欠陥、欠点、及び障害を克服するためにカラギーナンの硫酸化のモチーフを修飾する酵素を精製すること、特に、前記酵素を用いてカラギーナンの「ハイブリッド性」を制御することにより、コストを下げ、そのようにして得られるカラギーナンの供給及び機能的特性を制御できるようにする方法に対する現実のニーズが存在する。
本発明者らは、全く予期されなかったことに、同定された第2の4S−イオタ−カラギーナンスルファターゼ(Q15XH3)がイオタ−カラビオースモチーフをアルファ−カラビオースモチーフに変換できることを実証した。イオタ−カラビオースモチーフは、他のカラビオースモチーフも含み得るオリゴ糖又は多糖中に存在し得る。
したがって、本発明の主題は、以下のペプチド配列:
NGQFDNTVIVFTSDNGGK(配列番号1)、
FDQTFQVGDNTR(配列番号2)、及び
ETEYITDGLSR(配列番号3)
を有するペプチドを含む酵素により、イオタ−カラビオースモチーフをアルファ−カラビオースモチーフに変換する酵素触媒作用を含む、イオタ−カラギーナンのアルファ−カラギーナン変換方法である。
NGQFDNTVIVFTSDNGGK(配列番号1)、
FDQTFQVGDNTR(配列番号2)、及び
ETEYITDGLSR(配列番号3)
を有するペプチドを含む酵素により、イオタ−カラビオースモチーフをアルファ−カラビオースモチーフに変換する酵素触媒作用を含む、イオタ−カラギーナンのアルファ−カラギーナン変換方法である。
「イオタ−及びアルファ−カラギーナン」という表現は、本発明では、例えば溶液、部分的ゲル化溶液、又はゲルに含まれる、イオタ−及びアルファ−カラギーナン並びに/又はイオタ−及びアルファ−ハイブリッドカラギーナンを意味すると理解される。したがって、純粋なイオタ−カラギーナンは自身の電荷でゲル化するが、イオタ−ニュー−カラギーナン及びオリゴ−イオタ−カラギーナン等のハイブリッドカラギーナンはあまりゲル形成しない。
本発明の方法の特定の実施形態によれば、前記酵素は以下のペプチド配列を有する:
MTFNKKVSTLLWGTLIAISVGNASAADAGQSKADESNEKPNILFVLADDLGYNDVGFNGSTDIKTPNLDGLAKNGMTFDAAYVAHPFCGPSRAAIMTGRYPHKIGAQFNLPEDNSNVGVSADELFIAQTMKSAGYFTGAMGKWHLGEASEYHPNKHGFDEFYGFLGGGHNYFPEQFEAAYNKRVAQGMTNINMYLTPLEHNGKEVRETEYITDGLSREAVNFVDKAAAKKKPFFLYLAYNAPHVPLQAKEEDMAMFSQIKDKKRRTYAGMVYAVDRGVGRIVEQLKKNGQFDNTVIVFTSDNGGKLGQGANNYPLKEGKGSVQEGGFRTPMLVHWPKHMKAGSRFSHPVLALDLYPTFAGLGGAVLPEDKKLDGKDIWADIQANTAPHKDEFIYVLRHRNGYSDAAARRNQFKAVKNHNDDWKLYNIAQDISEDNDISAQHPDILRDMVSSMESWSWNNQQPKWFHQSAEGAQWRLKAMP
RFDQTFQVGDNTRSNSKKGH(配列番号4)。
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RFDQTFQVGDNTRSNSKKGH(配列番号4)。
本発明の方法の特定の実施形態によれば、前記酵素は4S−イオタ−カラギーナンスルファターゼである。例えば、これは、配列番号4と少なくとも30%の配列同一性、好ましくは配列番号4と少なくとも50%の配列同一性、最も好ましくは配列番号4と少なくとも80%の配列同一性を示す配列を有する4S−イオタ−カラギーナンスルファターゼであり得る。
本発明の方法の特定の実施形態によれば、酵素は、前記酵素をコードする核酸及び/又は前記酵素をコードする核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞によって産生される。
「宿主細胞」という表現は、本発明では、原核細胞又は真核細胞を意味すると理解される。組換え細胞の発現に一般的に用いられる宿主細胞としては、特に、大腸菌又はバチルス等の細菌の細胞、サッカロミセス・セレビシエ等の酵母の細胞、アスペルギルス・ニガー等の真菌の細胞、昆虫の細胞、CHO、HEK293、PER−C6細胞株等の哺乳動物(特にヒト)の細胞が含まれる。原核細胞及び真核細胞の形質転換、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、ヒートショック、又は化学的方法は、当業者に周知の技術である。当業者であれば、形質転換する細胞に応じて、選択された宿主細胞中に核酸を導入して発現させるのに必要な手段を容易に決定することができる。したがって、発現ベクター及び宿主細胞への発現ベクターの導入方法は、選択された宿主細胞に従って選択される。発現ベクター又は核酸で形質転換される宿主細胞は、対応するポリペプチドを安定的に発現する。当業者は、例えばウェスタンブロット法を用いて、宿主細胞がポリペプチドを安定的に発現していることを容易に調べることができる。
「ベクター」という表現は、本発明では、所定の宿主細胞中における核酸配列の発現及び/又は分泌のためのベクターを意味すると理解される。これらは、例えば、核酸配列に加えて発現に必要な手段を含むプラスミド又はウイルス起源のベクターであり得る。これらの手段には、例えば、プロモーター、翻訳の開始及び終結のシグナル、並びに転写制御のための適切な領域が含まれ得る。発現ベクターは更に、複製オリジン、マルチクローニングサイト、エンハンサー、クローニング中に産生されるポリペプチドと同時性で(in phase)融合され得るシグナルペプチド、及び1又は複数の選択マーカー等のその他のエレメントも含み得る。
「核酸」という表現は、本発明では、特にcDNA分子及びmRNA分子を含むDNA分子及びRNA分子の両方を意味すると理解される。核酸は、二本鎖形態であってもよく、(例えば発現ベクターに含まれる核酸の場合)、一本鎖形態であってもよい(例えばプローブ又はプライマーの場合)。
本発明の方法によって得られ得るカラギーナンも本発明の主題である。
本発明の方法の特定の実施形態によれば、出発カラギーナンがその構造中にイオタ−カラビオースモチーフを有していれば、得られるカラギーナンはアルファ−カラビオースモチーフを有する。例えば、E.デンチキュラタム(E. denticulatum)から抽出されたカラギーナンのイオタ−カラビオースモチーフ(85%イオタ−カラビオース及び15%カッパ−カラビオース)は、85%アルファ−カラビオース及び15%カッパ−カラビオースを有するカラギーナンに変換され得る。この酵素反応は制御され得、イオタ−カラビオースからアルファ−カラビオースへの変換率は0〜100%で異なり得る。得られるカラギーナンの流体力学的特性は変換率によって異なる。
手引きとして提供する添付の図面により図解される以下の実施例を読むことで、その他
の利点も当業者に明らかであろう。
の利点も当業者に明らかであろう。
実施例1:シュードアルテロモナス・アトランティカ(Pseudoalteromonas atlantica)から得られた新規4S−イオタ−カラギーナンスルファターゼの同定
シュードアルテロモナス・アトランティカ(Pseudoalteromonas atlantica)のカラギーナンスルファターゼ活性のスクリーニング
ゲノムが完全に解読されている(http://genome.jgi-psf.org/finished_microbes/pseat/pseat.home.html)海洋細菌シュードアルテロモナス・アトランティカ(Pseudoalteromonas atlantica) T6c(ATCC T6c/BAA−1087株)を用いてスクリーニングを行った。
シュードアルテロモナス・アトランティカ(Pseudoalteromonas atlantica)のカラギーナンスルファターゼ活性のスクリーニング
ゲノムが完全に解読されている(http://genome.jgi-psf.org/finished_microbes/pseat/pseat.home.html)海洋細菌シュードアルテロモナス・アトランティカ(Pseudoalteromonas atlantica) T6c(ATCC T6c/BAA−1087株)を用いてスクリーニングを行った。
細菌培養
カッパ−カラギーナン(カッパフィカス・アルベレッチー(Kappaphycus alvarezii)、CPケルコ社製、X6913、1g/l)、イオタ−カラギーナン(ユーシューマ・デンチキュラタム(Eucheuma denticulatum)、H030058−534、1g/l)、又はラムダ−カラギーナン(ギガルチナ・スコッツベルギイ(Gigartina skottsbergii)の胞子体、CPケルコ社製、X7055)の存在下、ゾベル(Zobell)培地[バクトペプトン(Bactopeptone)(アムレスコ社(Amresco)製)5g/l、酵母エキス(BD、自己消化酵母細胞エキス(Extract of Autolysed Yeast cells))1g/l、脱塩水で1lに調製したろ過海水800ml]中で培養した海洋細菌シュードアルテロモナス・アトランティカ(Pseudoalteromonas atlantica)を用いて細菌抽出物を調製した。
カッパ−カラギーナン(カッパフィカス・アルベレッチー(Kappaphycus alvarezii)、CPケルコ社製、X6913、1g/l)、イオタ−カラギーナン(ユーシューマ・デンチキュラタム(Eucheuma denticulatum)、H030058−534、1g/l)、又はラムダ−カラギーナン(ギガルチナ・スコッツベルギイ(Gigartina skottsbergii)の胞子体、CPケルコ社製、X7055)の存在下、ゾベル(Zobell)培地[バクトペプトン(Bactopeptone)(アムレスコ社(Amresco)製)5g/l、酵母エキス(BD、自己消化酵母細胞エキス(Extract of Autolysed Yeast cells))1g/l、脱塩水で1lに調製したろ過海水800ml]中で培養した海洋細菌シュードアルテロモナス・アトランティカ(Pseudoalteromonas atlantica)を用いて細菌抽出物を調製した。
一次前培養では、−80℃で保存したP.アトランティカ(P. atlantica)のグリセロールから10mlのゾベル(Zobell)培地を接種した。ニューブランズウィック(New Brunswick)型のシェーカーを用いて18℃、180rpmで36時間インキュベートした。二次前培養では、カラギーナンの1つ(カッパ、イオタ、又はラム
ダ)を50mg含む50mlのゾベル(Zobell)培地を、660nmでの吸光度が0.1になるように約1mlの一次前培養を接種した。この二次前培養を660nmでの光学濃度が1〜1.2に達するまで、すなわち約8時間、18℃でインキュベートした。最後の培養では、前と同じカラギーナンを含む950mlのゾベル(Zobell)培地に二次前培養液50mlを接種し、18℃で36時間インキュベートした。
ダ)を50mg含む50mlのゾベル(Zobell)培地を、660nmでの吸光度が0.1になるように約1mlの一次前培養を接種した。この二次前培養を660nmでの光学濃度が1〜1.2に達するまで、すなわち約8時間、18℃でインキュベートした。最後の培養では、前と同じカラギーナンを含む950mlのゾベル(Zobell)培地に二次前培養液50mlを接種し、18℃で36時間インキュベートした。
培養上清から細菌ペレットを分離するために、細菌培養液を6200g、4℃で20分間遠心分離した。
細菌抽出物の調製
硫酸アンモニウムで90%飽和させて沈殿させることにより、培養上清を濃縮する(サンプル100ml当たり硫酸アンモニウム61.5g)。遠心(25分間、10000rpm)後に得られたペレットを、50mM トリス−HClバッファー(pH8.3)溶液中に戻す。次いで、これを膜(スペクトラ/ポア、MWCO 3500Da)を用いて50mM トリス−HClバッファー(pH8.3)に対して透析する。
硫酸アンモニウムで90%飽和させて沈殿させることにより、培養上清を濃縮する(サンプル100ml当たり硫酸アンモニウム61.5g)。遠心(25分間、10000rpm)後に得られたペレットを、50mM トリス−HClバッファー(pH8.3)溶液中に戻す。次いで、これを膜(スペクトラ/ポア、MWCO 3500Da)を用いて50mM トリス−HClバッファー(pH8.3)に対して透析する。
pH8.3の50mM トリス−HClバッファー(シグマ社製)に細菌ペレットを再懸濁した。次いで、細胞をフレンチプレス中で溶解させ、得られた溶解物を27000gで2時間45分間超遠心した。得られた上清にアンチプロテアーゼ(コンプリート、EDTAフリー、ロシュ社製)の錠剤の半分を加えた。
次いで、4℃で一晩撹拌しながらpH8.5の50mM トリス−HClバッファーに対して抽出物を透析した(スペクトラ/ポア、MWCO 3500Da)。
放出された硫酸塩のアッセイ
細菌抽出物存在下で種々のカラギーナンをインキュベートした後に放出された硫酸塩の量を測定することにより、スルファターゼ活性の産生を評価した。アッセイは、濃縮した培養上清及び細菌ペレットを用いて行った。分析した各サンプルについて、酵素抽出物を予め100℃で約15分間失活させた後、同様な方法でブランクを用意した。
細菌抽出物存在下で種々のカラギーナンをインキュベートした後に放出された硫酸塩の量を測定することにより、スルファターゼ活性の産生を評価した。アッセイは、濃縮した培養上清及び細菌ペレットを用いて行った。分析した各サンプルについて、酵素抽出物を予め100℃で約15分間失活させた後、同様な方法でブランクを用意した。
ミリQ水(ミリポア社製)で反応培地を2倍希釈した後、カットオフが10kDaのマイクロコン(アミコン)中で遠心した。この遠心は、3300g、室温で90分間行った。次いで、得られたろ液を、ダイオネクス社(Dionex)のシステムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC:高性能陰イオン交換クロマトグラフィー)でアッセイした。20μlのサンプルを自動インジェクター(AS3000、サーモ社製)を用いて注入した。AG−1 1プレカラム(4×50mm、ダイオネクス社製)を取り付けたイオン−パックAS1 1カラム(4×200mm、ダイオネクス社製)を用いて、サンプル中に存在する陰イオンの分離を行った。12mM NaOHに関してシステムを平衡化した。流速1ml/分(GP40ポンプ、ダイオネクス社製)でNaOH均一濃度勾配を用いて溶出を行った。電流198mAで作動するASRS ウルトラ−IIサプレッサー(4mm、ダイオネクス社製)を取り付けたED40検出器(ダイオネクス社製)を用いた電気伝導度測定により、陰イオンの検出を行った。データの取得及び処理に用いたソフトウェアはクロメレオン(Chromeleon)6.8ソフトウェアである。較正曲線を用い、硫酸塩ピークの面積を百万分率(ppm)に変換した。サンプルとブランクの値の間の差から、酵素による脱硫酸化反応中に放出された硫酸塩の量(ppm)が得られた。結果を以下の表1に示す。
新規4S−イオタ−カラギーナンスルファターゼの精製及びタンパク質配列
細菌抽出物の調製
スルファターゼ活性を有する、イオタ−カラギーナンで誘導した培養液から得られた及び前述したように得られた細菌ペレットを、pH7.5の50mM トリス−HClバッファー(シグマ社製)に再懸濁した。次いで、フレンチプレスを用いて細胞を溶解し、得られた溶解物を27200gで2時間45分間超遠心した。タンパク質の分解を抑えるために、得られた上清にアンチプロテアーゼ(コンプリート、EDTAフリー、ロシュ社製)の錠剤の半分を加えた。
細菌抽出物の調製
スルファターゼ活性を有する、イオタ−カラギーナンで誘導した培養液から得られた及び前述したように得られた細菌ペレットを、pH7.5の50mM トリス−HClバッファー(シグマ社製)に再懸濁した。次いで、フレンチプレスを用いて細胞を溶解し、得られた溶解物を27200gで2時間45分間超遠心した。タンパク質の分解を抑えるために、得られた上清にアンチプロテアーゼ(コンプリート、EDTAフリー、ロシュ社製)の錠剤の半分を加えた。
抽出物から小サイズ分子(特に遊離硫酸塩)を除去するために、抽出物を4℃で一晩撹拌しながら50mM トリス−HClバッファー(pH7.5)に対して透析した(スペクトラ/ポア、MWCO 3500Da)。
精製
イオタ−カラギーナンに作用するスルファターゼの精製実験を行った。精製ステップはアクタ精製システム(Akta Purifier System)を用いて行った。
イオタ−カラギーナンに作用するスルファターゼの精製実験を行った。精製ステップはアクタ精製システム(Akta Purifier System)を用いて行った。
溶解物を、50mM トリス−HClバッファー(pH7.5)で事前に平衡化した弱陰イオン交換クロマトグラフィーカラム DEAEセファロース ファスト フロー(Sepharose Fast Flow)(GEヘルスケア社製−45×1cm)に入れた。スーパーループ(又はインジェクションループ)を用いてサンプル(約35ml)を流速2ml/分でロードした。次いで、280nmでの吸光度が無視できるほど小さくなるまで、樹脂をこの同じバッファーで洗浄した。タンパク質の溶出は分割した漸増する0〜1MのNaCl勾配(10カラム体積の0〜500mM NaCl及び2カラム体積の500mM〜1M NaCl)で流速2ml/分にて行った。体積5.5mlの回収画分を、イオタ−カラギーナンを脱硫酸化する能力について試験した。
次いで、最大のスルファターゼ活性を含む画分を、4℃で撹拌しながら50mM トリス−HClバッファー(pH7.5)に対して48時間透析した(スペクトラ/ポア膜、MWCO 3500Da)。この画分1mlを、50mM トリス−HClバッファー(pH7.5)で予め平衡化した強陰イオン交換樹脂Qファストフロー(Q Fast Flow)(GEヘルスケア社製−ハイトラップ(Hitrap) 1ml)に入れた。樹脂をこの同じバッファーで洗浄し、以下のようにした0〜1Mの漸増NaCl勾配でタンパク質を溶出した:15カラム体積の0〜500mM NaCl及び5カラム体積の500mM〜1M NaCl、流速1ml/分。スルファターゼ活性を測定するために、回収画分1mlをイオタ−カラギーナン存在下でインキュベートした。SDS−PAGEポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で画分の純度の程度を可視化した。
アクリルアミドゲル電気泳動で画分の純度の程度を可視化した。
SDS−PAGEポリアクリルアミドゲル電気泳動(バイオラッド社製、クライテリオン(Criterion)XT 12%ビス−トリス)で活性画分の純度を分析した。15μlのサンプルに、2%SDS(アムレスコ社製)と、5%β−メルカプトエタノール(98%、シグマ社製)と、20%グリセロール(カルロエルバ社(CarloErba)製)と、62.5mM トリス−HCl(pH6.8)と、0.5%ブロモフェノールブルー(シグマ社製)とを含む5μlのローディングバッファーを加えた。次いで、タンパク質を変性させるためにサンプルを沸騰温度で3分間加熱した。次いで、混合物20μlをゲルにアプライした。サイズマーカー(バイオラッド社製、プレシジョン プラス プロテイン(Precision Plus Protein))5μlをアプライして、10〜250kDaのタンパク質分子量を評価できるようにした。200mM MOPS(シグマ社製)と、250mM トリス(pH8.1)と、5g/l SDSとで構成される泳動バッファー中で、室温、(1つのゲルにつき)110ボルトで、2時間泳動を行った。コロイドクーマシーブルー染色を用いてゲルの可視化を行った(Candiano et al., Electrophoresis, 25(9): 1327-1333, 2004)[5]。精製タンパク質の分子量は約55kDaと推定された(図4)。
タンパク質及び核酸配列
ゲルからタンパク質バンドを切り出し、トリプシンで消化して、得られたペプチドを、ナント(Nantes)のINRAにある「バイオポリマー(Biopolymers)」RIOプラットフォームで質量分析法によりシークエンシングした。決定された3つの配列[NGQFDNTVIVFTSDNGGK(配列番号1)、FDQTFQVGDNTR(配列番号2)、及びETEYITDGLSR(配列番号3)]をTrEMBLライブラリーと比較した。3つのペプチドは、その遺伝子(Patl_0889)がスルファターゼに分類されるシュードアルテロモナス・アトランティカ(Pseudoalteromonas atlantica) T6c(Copeland et al., 2006、前述)[4]のQ15XH3タンパク質(図5、配列番号4)に100%対応する。このタンパク質は、システインをホルミルグリシン(FGly)に変換するために必要な12アミノ酸のコンセンサス配列(C/S−X−P−S/X−R−XXX−L/X−G/X−R/X、配列番号5)及び保存配列(G−Y/V−X−S/T−XXX−G−K−X−X−H、配列番号6)中に存在する触媒アミノ酸を有する。新規スルファターゼの遺伝子のゲノム環境は、このタンパク質がイオタ−カラギーナンの分解に関与することを示している(図6)。実際、Q15XH3の遺伝子は、他のスルファターゼ(Q15XH3に41%の同一性を有するQ15XG7を含む)を含む遺伝子クラスター中に位置し、クラスター中、2個は未知のタンパク質であるが、特にクエン酸回路(糖の酸化)及びD−ガラクトース代謝のための複数の遺伝子が明確に同定されている。このクラスター中に存在するスルファターゼの機能は、おそらく、イオタ−及び/又はアルファ−カラギーナンの脱硫酸化に関連付けられる。
ゲルからタンパク質バンドを切り出し、トリプシンで消化して、得られたペプチドを、ナント(Nantes)のINRAにある「バイオポリマー(Biopolymers)」RIOプラットフォームで質量分析法によりシークエンシングした。決定された3つの配列[NGQFDNTVIVFTSDNGGK(配列番号1)、FDQTFQVGDNTR(配列番号2)、及びETEYITDGLSR(配列番号3)]をTrEMBLライブラリーと比較した。3つのペプチドは、その遺伝子(Patl_0889)がスルファターゼに分類されるシュードアルテロモナス・アトランティカ(Pseudoalteromonas atlantica) T6c(Copeland et al., 2006、前述)[4]のQ15XH3タンパク質(図5、配列番号4)に100%対応する。このタンパク質は、システインをホルミルグリシン(FGly)に変換するために必要な12アミノ酸のコンセンサス配列(C/S−X−P−S/X−R−XXX−L/X−G/X−R/X、配列番号5)及び保存配列(G−Y/V−X−S/T−XXX−G−K−X−X−H、配列番号6)中に存在する触媒アミノ酸を有する。新規スルファターゼの遺伝子のゲノム環境は、このタンパク質がイオタ−カラギーナンの分解に関与することを示している(図6)。実際、Q15XH3の遺伝子は、他のスルファターゼ(Q15XH3に41%の同一性を有するQ15XG7を含む)を含む遺伝子クラスター中に位置し、クラスター中、2個は未知のタンパク質であるが、特にクエン酸回路(糖の酸化)及びD−ガラクトース代謝のための複数の遺伝子が明確に同定されている。このクラスター中に存在するスルファターゼの機能は、おそらく、イオタ−及び/又はアルファ−カラギーナンの脱硫酸化に関連付けられる。
スルファターゼ活性
スルファターゼ活性を測定するために、アッセイする100μlのサンプルを、50mM トリス−HClバッファー(pH7.5)中1%のイオタ−カラギーナン(CPケルコ社製、No.1256)溶液100μlに接触させた。酵素反応はウォーターバス中で34℃にて48時間行った。各サンプルについて、酵素抽出物を予め100℃で15分間失活させ、同様な条件でブランクを用意した。
スルファターゼ活性を測定するために、アッセイする100μlのサンプルを、50mM トリス−HClバッファー(pH7.5)中1%のイオタ−カラギーナン(CPケルコ社製、No.1256)溶液100μlに接触させた。酵素反応はウォーターバス中で34℃にて48時間行った。各サンプルについて、酵素抽出物を予め100℃で15分間失活させ、同様な条件でブランクを用意した。
切断された硫酸基の位置、及び、結果として酵素加水分解中に形成された生成物の同定をNMRで行った。この分析では、300μlの細菌抽出物の存在下で700μlの1%イオタ−カラギーナン(CPケルコ社製、No.1256)をインキュベートすることにより脱硫酸化反応を行った。反応混合物をウォーターバス中で34℃にて72時間インキ
ュベートした後、凍結乾燥した。次いで、サンプルをD2O中で2回交換した後、700μlの99.97%D2Oに再度溶解し、適切な濃度である10mg/mlにした。NMR部門(ブレストのブルターニュ・オクシダンタル大学)により、ブルカー アバンセ(Bruker Avance)DRX 500分光光度計を用いて1H NMRスペクトルが70℃で記録された。カラギーナンのアノマープロトンはおよそ5〜5.6ppmに特徴的な化学シフト(d)を示す。結果は、純粋なタンパク質によるイオタ−カラギーナンの脱硫酸化によってアルファ−カラギーナンが生成することを示しており(図7A)、これは最初の精製4S−イオタ−カラギーナンスルファターゼの場合と同様であるが、最初の精製4S−イオタ−カラギーナンスルファターゼの分子量は115kDaであった(仏国特許出願第09/52642号、前述)[3]。
ュベートした後、凍結乾燥した。次いで、サンプルをD2O中で2回交換した後、700μlの99.97%D2Oに再度溶解し、適切な濃度である10mg/mlにした。NMR部門(ブレストのブルターニュ・オクシダンタル大学)により、ブルカー アバンセ(Bruker Avance)DRX 500分光光度計を用いて1H NMRスペクトルが70℃で記録された。カラギーナンのアノマープロトンはおよそ5〜5.6ppmに特徴的な化学シフト(d)を示す。結果は、純粋なタンパク質によるイオタ−カラギーナンの脱硫酸化によってアルファ−カラギーナンが生成することを示しており(図7A)、これは最初の精製4S−イオタ−カラギーナンスルファターゼの場合と同様であるが、最初の精製4S−イオタ−カラギーナンスルファターゼの分子量は115kDaであった(仏国特許出願第09/52642号、前述)[3]。
したがって、イオタ−カラギーナンをアルファ−カラギーナンに変換できる新規スルファターゼが同定された。これは、アミドヒドラーゼのファミリーに属する、これまでに公知の唯一の4S−イオタ−カラギーナンスルファターゼとは識別可能である。
新規カラギーナンスルファターゼ(Q15XH3)の配列は、これがFGly−スルファターゼのファミリーに属することを示している。このFGly−スルファターゼは、炭水化物に作用する他の酵素を含むこのファミリーの最初のカラギーナンスルファターゼである。グリコサミノグリカン(すなわちヘパリン)及びセレブロシドに作用するスルファターゼを説明した。
参照文献一覧
1. Bixler et al., Food Hydocolloids, 15: 619-630, 2001
2. Bixler and Porse, J. Appl. Phycol., 2010, online
3. French patent application FR 09/52642
4. Copeland et al., “Complete sequence of Pseudoalteromonas atlantica T6c”, EMBL ACCESSION No. CP000388, PROTEINJD ABG39415.1, 2006
5. Candiano et al., Electrophoresis, 25(9): 1327-1333, 2004
1. Bixler et al., Food Hydocolloids, 15: 619-630, 2001
2. Bixler and Porse, J. Appl. Phycol., 2010, online
3. French patent application FR 09/52642
4. Copeland et al., “Complete sequence of Pseudoalteromonas atlantica T6c”, EMBL ACCESSION No. CP000388, PROTEINJD ABG39415.1, 2006
5. Candiano et al., Electrophoresis, 25(9): 1327-1333, 2004
Claims (4)
- 以下のペプチド配列:
NGQFDNTVIVFTSDNGGK(配列番号1)、
FDQTFQVGDNTR(配列番号2)、及び
ETEYITDGLSR(配列番号3)
を有するペプチドを含む酵素により、イオタ−カラビオースモチーフをアルファ−カラビオースモチーフに変換する酵素触媒作用を含む、イオタ−カラギーナンのアルファ−カラギーナン変換方法。 - 前記酵素のペプチド配列が、
MTFNKKVSTLLWGTLIAISVGNASAADAGQSKADESNEKPNILFVLADDLGYNDVGFNGSTDIKTPNLDGLAKNGMTFDAAYVAHPFCGPSRAAIMTGRYPHKIGAQFNLPEDNSNVGVSADELFIAQTMKSAGYFTGAMGKWHLGEASEYHPNKHGFDEFYGFLGGGHNYFPEQFEAAYNKRVAQGMTNINMYLTPLEHNGKEVRETEYITDGLSREAVNFVDKAAAKKKPFFLYLAYNAPHVPLQAKEEDMAMFSQIKDKKRRTYAGMVYAVDRGVGRIVEQLKKNGQFDNTVIVFTSDNGGKLGQGANNYPLKEGKGSVQEGGFRTPMLVHWPKHMKAGSRFSHPVLALDLYPTFAGLGGAVLPEDKKLDGKDIWADIQANTAPHKDEFIYVLRHRNGYSDAAARRNQFKAVKNHNDDWKLYNIAQDISEDNDISAQHPDILRDMVSSMESWSWNNQQPKWFHQSAEGAQWRLKAMPRFDQTFQVGDNTRSNSKKGH(配列番号4)である、請求項1に記載の方法。 - 前記酵素が4S−イオタ−カラギーナンスルファターゼである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記酵素が、前記酵素をコードする核酸及び/又は前記酵素をコードする核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞により産生される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
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- 2011-10-17 WO PCT/FR2011/052421 patent/WO2012049437A2/fr active Application Filing
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