JP2013540420A - 血管内皮増殖因子2(vegfr−2/kdr)に結合し、その活性を遮断する組換え抗体構造 - Google Patents
血管内皮増殖因子2(vegfr−2/kdr)に結合し、その活性を遮断する組換え抗体構造 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013540420A JP2013540420A JP2013517561A JP2013517561A JP2013540420A JP 2013540420 A JP2013540420 A JP 2013540420A JP 2013517561 A JP2013517561 A JP 2013517561A JP 2013517561 A JP2013517561 A JP 2013517561A JP 2013540420 A JP2013540420 A JP 2013540420A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- acid sequence
- recombinant antibody
- sequence shown
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
- A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
- A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
- A61K49/10—Organic compounds
- A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
- A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
Abstract
ファージディスプレイによる組換え抗体ライブラリーが開発され、ライブラリーはVEGFR−2に対してスクリーニングされた。スクリーニングおよびELISA実験の後、VEGFR−2への結合特性を示す2個の組換え抗体が得られた。2個の組換え抗体と既に開発された組換え抗体との差異が、DNA配列分析により明示された。2個の組換え抗体の内皮細胞増殖への阻害効果は、細胞アッセイにより明示された。その結果、これらの組換え抗体は、VEGF関連血管新生阻害物質として使用され得る。
Description
本発明の第一の目的は、VEGFR2(細胞外ドメイン)との相互作用を通じて、腫瘍成長において極めて重要な役割を果たす血管新生における阻害剤として関与でき、その結果血管新生に関する疾患メカニズムに関与することができる組換え型の一本鎖可変断片抗体を得ることである。
生存組織の成長に必要である酸素および栄養物は、血管を通して組織まで運搬され、一方で廃棄物もまた、血管を通して組織から搬出される。血管新生、既に存在する血管からの新たな血管の成長、は胚形成、傷治癒および雌の生殖器官における月経期間での生理的現象である一方で、関節炎、慢性炎症、炎症性腸疾患および乾癬などの炎症性疾患、および胸、膀胱、大腸、肺、神経芽腫、黒色腫、腎臓、すい臓、子宮、頸部および膠芽腫などの様々な組織のがん、さらに加齢性黄斑変性症などの眼科疾患において病理学的に現れる。
固形腫瘍のin vivoでの形成、増殖、および転移における血管新生の重要性は、1971年に最初に主張された。(Folkman J.,1971,N Eng J Med,285,1182−1186)。血管新生は毛細血管内皮細胞の増殖を通して現れる(Risau W, 1997, Nature, 386, 671−674)。全ての生物学的事象と同様に、有機体は、抗血管新生因子を分泌することによって、血管新生の刺激に応じる。血管新生促成因子(proangiogenic factor)および抗血管新生因子は正常な条件では均衡にあり、そして、この均衡が抗血管新生因子に対して攪乱されるとき、血管新生が開始する。血管内皮増殖因子(VEGF)は1989年にFerraraらによって定義された(Ferrara and Henzel, 1989 Biochem Biophys Res Commun 161, 851−858)。VEGFは血管新生で重要な役割を果たす(Ferrara N et al., 1996, Nature, 380: 439−442)。マウスでの実験が、VEGFに関する対立遺伝子座の欠損のみで、重大な血管の問題による早期の胚死率をもたらしたことを示した(Carmilet P. et al.,1996, Nature, 380, 435−439)。VEGFは45kDaの重さで、ジスルフィド結合で結合するヘパリン結合性ホモ二量体型塩基性蛋白である。これまで、VEGF−A、VEGF−B、VEGF−C、VEGF−DおよびVEGF−Eなどの様々なサブグループが定義されている。哺乳動物において、VEGF−Aはアミノ酸の数を基に、VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206およびVEGF145などのアイソフォームを有する。これらのアイソフォームのうち、VEGF165は主要な一つである(Ferrara N., et al.,2009, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 29, 789−791,)。
VEGFは、細胞膜中のチロシンキナーゼ受容体に結合することにより、細胞内効果を示す。VEGF受容体は2個の部分を含む。第一の部分は、チロシンキナーゼを含む細胞内領域部分である。第二の部分は、リガンド結合領域を含む5から7個の免疫グロブリン様構造を含む細胞外領域である(Ferrara N. et al.,2003,Nat. Med.9:669−676)。VEGF受容体としてのFlt−1(VEGFR−1)、flk−1/KDR(VEGFR−2)、およびFlt−4(VEGFR−3)の同定に加えて、内皮細胞表面で発現され、VEGF−Aに低い結合特性を有する、ニューロピリン−1およびニューロピリン−2と呼ばれる受容体構造が最近定義された。KDR(キナーゼ挿入ドメイン含有受容体)はTerman et. al.により1991年に特許番号PCT/US92/01300によって定義された(Terman et al., 1991,. Oncogene 6: 1677−1683)。Flk−1配列は1991年に配列決定法により明らかにされた(Mathhews W et al.,1991, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A, 88:9026−9030)。これらの研究は、KDRがFLK−1受容体のヒトアナログであることを示した。また、KDRおよびFLK−1受容体はまたVEGFR2としても知られる。
最も重要なVEGF受容体は、KDR(VEGFR−2)であり、内皮細胞増殖および走化性に関与する(Ferrara N et al.,2003, Nat Med., 9, 669−676,)。VEGFR−2(キナーゼ挿入ドメイン受容体/KDR)は高レベルで血管内皮細胞および造血性細胞で発現される(Asahara T., et al.,1997, Science, 275, 964−967; Ziegler Bl. et al.,1999, Science, 285,1553−1558; Peichev M., et al.,2000, Blood, 95,952−958)。KDRの細胞外部に存在する7免疫グロブリン様ドメインは、環境からのシグナルが細胞の細胞質に伝達されることを可能にする。KDRの細胞内部は細胞質内のシグナル伝達を仲介する。それゆえ、KDRとVEGFの相互作用を阻害することを目的とするいかなる分子も、受容体の1〜7免疫グロブリン様細胞外ドメインをを標的とするはずである(LU D. ve ark., 2000, JBC , 275, 14321−14330)。
今までのところ行われているいくつかの研究により、VEGFが、膠芽腫、結腸直腸癌、非小細胞肺、すい臓、卵巣、急性骨髄白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病および非ホジキン、および骨髄腫など多くのタイプの癌で増加することが見いだされた(Ranieri G et al., 2006, Curr Med Chem., 13, 1845−1857)。したがって、血管新生の抑制における優先目標の中にVEGFおよびVEGF受容体がある。VEGFおよびVEGF受容体に対して生じた構造での、VEGFの内皮細胞上の膜貫通チロシンキナーゼ受容体との結合によって作動されるシグナル経路という異なる角度の阻害によってVEGFの機能を阻止することが可能である。
VEGFのVEGFR−1(Flt−1)に対する結合親和性は、VEGFR−2(KDR)と比較して50倍以上であるが、VEGFの血管新生因子の特徴、内皮細胞増殖および走化性へのその効果、は、KDRとの関連により起こる(Cross M. et al. ,2003,Trends in Biochemical Sciences; 28.488−494)。VEGFR2をコードするプラスミドが、VEGFR2を欠失する豚の大動脈内皮細胞に与えられるとき、これらの細胞が有糸***を起こし、走化性に関与することが示された(Shibuya M et al. ,1990,Oncogene,8:519−524)。マウスに関するいくつかの研究が、これらの動物が、VEGFR2の不十分であるか欠失された発現において、組織化された血管を欠いていたことを示した。Shalaby et al.は、VEGFR−2発現を欠いているマウス胚が、内皮の、および造血の前駆細胞の発生における欠如のため、初期胚期の間に死ぬことを示した(Shalaby F et al.,1995, Nature. 376 (6535):62−6)。この実験で、VEGFとKDRの間の関係を遮断することが血管新生の抑制の点で重要であることが示されている。
1971年に、J.Folkmanは腫瘍の増殖が腫瘍の近くに位置する血管から生じた新たな毛細血管から運ばれる酸素およびエネルギー源に依存すると断言し、抗血管新生についての試みががんの増殖を防ぐことに関して有効なアプローチであり得ると主張した。腫瘍の増殖と血管形成活性の密接な関連は、がんの治療における、治療の追加オプションとしての血管形成剤の調査へとつながった。VEGFに対して生じた抗体がin vivoで腫瘍増殖を抑えたという事実の実証(Kim KJ et al.,1993, Nature 362: 841−844)が、VEGFアンタゴニストが腫瘍の血管新生の抑制剤として治療において使用され得ることを示した。今日、VEGFおよびVEGF受容体は、腫瘍学において血管新生とその結果の抑制における優先的な目的である(Ferrara N and Kerbel R.S. ,2005, Nature.438: 967−974)。
近年、VEGF/受容体の関係の遮断を基にしたいくつかの抗血管新生の戦略が開発された。この枠組みの中では、血管新生および腫瘍を阻害するための、VEGF/KDR相互作用を防ぎ、かつ/またはKDRシグナル伝達を抑制する抗VEGF抗体(Kanai et al., 1998, J. Cancer 77, 933−936; Margolin et al., 2001, J. Clin. Oncol. 19, 851−856);抗KDR抗体(Zhu et al., 1998, Cancer Res. 58, 3209−3214; Zhu et al., 2003, Leukemia 17, 604−61 1; Prewett et al., 1999, Cancer Res. 59, 10 5209−5218);抗VEGF抗毒素(Olson et al. 1997, Int. J. Cancer 73, 865−870);リボザイム(Pavco et al., 2000, Clin. Cancer Res. 6, 2094−2103);可溶性受容体(Holash et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 11393−11398);チロシンキナーゼ阻害剤(Fong et al., 1999, Cancer Res 59, 99−106; Wood et al., 2000, Cancer Res 60, 2178−2189; Grosios et al., 2004, Inflamm. Res. 53(4):133−42);抗VEGFアンチセンス(Forster et al. 2004, Cancer 15 Lett. 20;212(1):95−103);およびRNA干渉(Takei et al. 2004, Cancer Res. 64 (10):3365−70; Reich et al., 2003, Mol Vis 9:210−6)などの、様々な構造がある。
VEGFおよび受容体を標的とする血管新生の抑制に焦点を合わせる研究が、高まった。多くの戦略がこの目的を達成するために開発された。rhuMab VEGF(ベバシズマブ)、抗血管新生および抗腫瘍活性をもつ組換えヒトモノクローナルVEGF抗体(Monk B.J. et al., 2005, Gynecologic Oncology, 96, 902−905,)およびVEGFR−1’eに対するWu Yらによって2006年に開発されたモノクローナルヒト抗体(Wu Y, et al., 2006 Clin. Cancer Res.,12(21), 6573−84)が最も重要なものの一つである。ヒトIgG1定常領域と組み合わせられたVEGFR1およびVEGFR2ハイブリッド構造をもつVEGF−Trap神経膠腫動物モデルが初期および進行期における腫瘍の治療に用いることができることを示す結果がある。(Gomez−Manzano C. et al., 2008, Neuro−Oncology, 10, 940.)。ラニビズマブ、48kDa、抗VEGFモノクローナル抗体のFab(抗原結合)部に含まれる、は、それに由来するモノクローナル抗体ベバシズマブ(148kDa)よりも軽くて薄く、その結果、硝子体内適用において細胞内膜を通り抜けることができ、すべてのVEGFアイソフォームを阻害する(Gaudreault J. et al.,1999,Am Assoc Pharm Sci Pharm Sci Suppl, 1, 2142)。今日、加齢黄斑変性症における治療のためのラニビズマブの使用において有望な結果を得た(Rosenfeld P.J., et al.,2006, N Engl J Med., 355, 1419−1431)。
モノクローナル抗体構造に加えて、VEGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤として働くVEGFアンタゴニストのような小分子の使用もまた可能である。Bainbridge J.W.B. et al.によって2003年に行われた、VEGF分子とKDRの相互作用が起こるところの、エクソン6領域から開始されて作成されたペプチド構造の研究において、VEGFとその受容体の相互作用を遮断することによって血管新生を阻害する7アミノ酸構造がin vivoで同定された。最近、スニチニブおよびソラフェニブ、2個の小分子VEGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ががん治療において使用され始めた(KO J.S et al., 2009, Clin. Cancer Res., 15(6), 2148−2157,; Jilaveanu L. et al., 2009, Clinical Cancer Research, 15, 1076)。
近年の遺伝子工学における発展に沿って、抗体分子の抗原認識を模擬する機能的な組換え抗体断片の形成が可能である。抗体断片として発現された、一本鎖可変断片が、ペプチド結合を介した重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)の結合により構成された。これらの抗体断片は一本鎖可変断片(scFv)と呼ばれる(米国特許番号4,946778 Lander et al.;W088/09344,Huston et al.)。ScFv構造が抗原結合可変領域(Fv)を含むように、それらは最小構造で抗体分子の結合特性を提供する特徴を有する。他方で、単一領域抗体構造は標的抗原構造に結合するのに有効であり得る。
1993年に、Jeffreyらは、重鎖がジゴキシンに対して生じた抗体のジゴキシン結合において必須であることを示した(Jeffrey, P.D. et al. Proc.Nat.Acad.Sci.,USA 1993, 90:10310−103149)。最近の研究において、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)に対して生じた抗体の重鎖可変断片からなる「ナノボディ」構造が、上皮細胞増殖因子(EGF)のEGFRへの結合を妨げることが示された(Roovers R. et al., 2007, Cancer Immunology 15:303−317)。ファージディスプレイ技術において、線状ファージの表面上にScFvが存在する(WO 92/01047 Mc Cafferty et al.)。このアプローチで、VEGFRに対するナノ抗体構造を開発することが可能である。しかしながら、およそ15kDのナノ抗体構造の血液循環からの迅速な除去は治療用途の制限につながる。しかしながら、これらのナノ抗体構造は、アルブミンへの結合の特性を提供されることを確実にする50kDの多価としてそれらを再構築することにより、より長い期間血液循環中に滞在することが可能となった(Tijink B et al.2008, Mol Cancer Therapy. 7(8):2288−2297)。
ファージディスプレイ技術における線状ファージの使用は様々な利点をもたらした。培養上清からのファージ粒子の簡単な精製、遺伝子と系列データへのアクセシビリティ、および、「バイオパニング」法を使用する、多くの抗原から標的抗原を同定できる少数のファージクローンを選択する機会はこれらの利点のいくつかである。バクテリオファージ複製起点およびプラスミド複製起点の両方を含むファージミドベクターは、ファージディスプレイ技術におけるこの利便性を活用するために好ましい。これらのファージミドベクターにおける多重クローニング部位(MCS)はファージミド(例えば、gIII)のシース構造タンパク質に属する遺伝子の開始点に位置する。したがって、シースタンパク質でなされた融合の結果として得られた産物が、正常な環境における免疫系で存在するBリンパ球の表面に位置する抗体を模擬できる。しかしながら、この工程は抗体遺伝子とgIIIの間に位置するアンバー終止コドンが宿主細菌によってどのように読まれるかによる。ファージsupEが抑制性宿主(例えば、大腸菌TG1)で増殖するならば、抗体断片は、マイナーなシースタンパク質に融合し、ファージ表面に残る。ファージ表面のこの構造はB表面抗体のような、異物構造(foreign structure)を検出する受容体として作用できる。ファージが(HB2151などの)非抑制性(sup−)大腸菌株で増殖すると、その後アンバーコドンが終止コドンとして読まれ、抗体粒子が可溶型で細菌から分泌されるであろう。そのようなものとして、ファージミドベクターで形質細胞から合成された抗体の模擬が可能となる。非抑制性細菌に溶解されるような多重クローニング部位へのクローン化された遺伝子断片の発現に続く、ファージミドベクター上の6個のヒスチジンを含む領域は、Zn++、Ni++またはCo++で帯電されたアフィニティーカラムを用いる環境からこの組み換えタンパク質の容易な精製を可能にする(Weiner L.M, 1996, J.Mol.Biol., 255(1), 28−43)。
ファージディスプレイ技術の技術的な利点により、scFv構造は多くの領域において、広い範囲の利用の機会を反映する。約150kDaサイズの全抗体分子と対照的に、抗体のscFv構造、それは約30kDaのサイズであり、抗体の定常領域およびFc部位を欠いている、が今日の診断と治療に焦点を合わせる医学の研究に増加する数で使用されている(Bradbury A.R.M. et al., 2004, Journal of Immunological Methods, 290, 29−49)。
本発明で述べられるKDR1.3および2.6scFv抗体構造は、VEGFR−2の細胞内シグナル伝達活性を遮断することにより、細胞表面のVEGFR2(1−7 免疫グロブリンドメイン)の細胞外部分に結合することにより、およびVEGF依存性細胞増殖を阻害することにより、抗血管新生特性を示す。
1971年に、J.Folkmanは腫瘍の増殖が腫瘍の近くに位置する血管から生じた新たな毛細血管から運ばれる酸素およびエネルギー源に依存すると断言し、抗血管新生についての試みががんの増殖を防ぐことに関して有効なアプローチであり得ると主張した(Folkman J., 1971 N Eng J Med., 285, 1182−6)。様々な研究が、抗血管新生アプローチが癌の治療で有望であると立証した(Kim KJ et al., 1993 Nature 362: 841−844)。血管形成活性の、がん発生、高い死亡率による最も重要な病理学的現象、との密接な関連は、がん治療の新しいオプションとしての抗血管新生剤の調査への道を特に導いた。
近年、血管新生において重要な役割をはたすVEGFおよびVEGF受容体が、抗血管新生構造の開発における標的として注目されている。VEGFに対して生じた構造ががん治療において有用であり得ることを示す最初の兆候は、中和抗体を用いて作出されたマウス神経芽腫モデルから得られた(Mordenti J、 1999Toxicol Pathol.27(1):14−21)。この研究は、抗VEGF中和抗体構造が、腫瘍増殖を阻止することを示した。この研究の結果は、腫瘍増殖を阻止するためのVEGFおよびその受容体を遮断する構造の開発を目的とした研究を奨励した。これらの研究は、抗HIF(抗低酸素誘導性因子)剤、VEGFアンチセンス・オリゴヌクレオチド、VEGFリボソーム、可溶性VEGF受容体、抗VEGF受容体抗体、およびVEGF DNAワクチンなどの抗がん治療活動に用いられる新しい構造を入手することを可能にした(Ferrara N., et al.., 2003, Nat Med., 9, 669−676)。
VEGFに対して生じた抗体は、腫瘍増殖を遅らせることがわかっている(Hicklin et al. ,2001,DTT 6: 517−528)。マウス・モノクローナル抗体は臨床検査診断で広く使われるが、それらの成功はヒトにおける治療用途においては制限される。この第一の理由は、マウス抗体で治療された約80%の患者における、反復投与に続いて、マウス抗体に対して生じる免疫反応の活性化である。さらに、マウス抗体のFc部分は人間の免疫系においてそれほど有効でない役割を果たし、マウス抗体は治療用途においてヒト抗体と比べて、より短い半減期を有する。これらの理由は治療用途におけるマウス抗体の使用を制限する。
Genetech Inc.は、2000年に組換えヒト化抗VEGFモノクローナル抗体構造(ベバシズマブ;米国特許番号US6054297)を立ち上げた。この抗体構造は今日直腸癌の治療で使用され、それは他の型の腫瘍細胞で試験されている。ベバシズマブに基づく治療は、1患者あたり42.800〜55.000米ドルの追加治療費を引き起こし、その結果、進行結腸癌治療のために米国だけで15億米ドルの臨時支出が作られるであろうと見積もられている。したがって、細菌において高容量でより安く生産し、その結果治療コストを減少させるであろう組換え抗体のような、代替手段としての新規な抗血管新生構造の開発の必要性がある。
今までのところ行われている様々な研究は、ファージディスプレイ技術が血管新生を阻止できる新しい組換え抗体構造の同定において有効な手段となり得ることを示した。一本鎖可変断片形の抗体構造は、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ融合を通じて作成されたKDR(KDR−AP)の細胞外ドメインでのBalb/cマウスの免疫付与に続いて得られた(WO00/44777、Zhu Z、2000)。ファージディスプレイ技術を利用し、ヒトの抗体ライブラリーを用いて、Fabとキメラ抗体の形の、KDRに対する抗血管新生アプリケーションの候補である抗体構造を開発した(PCT/US03/06459、Zhu Z、2003)。
ここで示された特許研究における、上記に概説された標的抗血管新生アプリケーションを開発する研究と異なり、約150kDaのサイズの抗体の代わりに、組換え型KDR(1−7)でのBALB/c Jマウスに誘導された免疫付与の後に開発された組換え抗体ライブラリーからのKDR(1−7)に対しての選択に次いで、33kDaのサイズの組換え一本鎖可変断片抗体を得るためにファージディスプレイ技術が用いられた。これらの抗体構造の開発に用いられた抗原および選択の後に得られた組換え抗体の相補性決定領域(CDR)の配列は、上記の研究および特許におけるものと異なる。
表1:sKDR1−7に結合できるscFvの選択および濃縮のためのバイオパニング段階。
発明の詳細な説明
本発明は、細胞表面のVEGFR2(1−7 免疫グロブリンドメイン)の細胞外部に結合することにより、およびVEGF依存細胞増殖を抑制することにより、VEGFR−2の細胞内シグナル伝達活性を遮断して抗血管新生特性がある組換え抗体構造を提示する。
本発明は、細胞表面のVEGFR2(1−7 免疫グロブリンドメイン)の細胞外部に結合することにより、およびVEGF依存細胞増殖を抑制することにより、VEGFR−2の細胞内シグナル伝達活性を遮断して抗血管新生特性がある組換え抗体構造を提示する。
血管新生は抗体で阻止された。抗血管新生実施に対して開発された市場における抗VEGF抗体は、網膜に入ることができず、その148kDA分子量のために血管内皮を通過することがほとんどできない。しかしながら、低分子量の小さい組換え抗体構造には、それらの欠点がない。上記の研究により、ファージディスプレイ技術が血管新生を阻害する新しい抗体断片を定義するための有効な手段であり得ることが示されている。しかしながら、今日までに分離された抗血管新生抗体断片は、ヒト抗VEGF組換え抗体(Zhihua et al Appl Biochem Biotechnol (2008) 144:15−26)、VEGR2−Fc融合タンパク質、二価抗体に対して解析された抗VEGFR2 Fab断片(Shen et al: the journal of biological chemistry vol (2006). 281, 16:. 10706−10714)、またはKDR−AP免疫付与で得られた一本鎖マウス抗体(Zhu et al, 1998, Cancer Res. 58, 3209−3214)などである。VEGFの血管由来の特徴、内皮細胞増殖および走化性へのその効果、は、KDRの細胞外1−7ドメインとの関係によって起こる。本発明では、VEGFR2の可溶性細胞外1−7ドメインは免疫およびファージディスプレイ抗体ライブラリーの選別に使用された。その結果、VEGFの活性を阻止する組換え抗体を発見すること、この抗体構造をコードするヌクレオチド配列を決定すること、これらの配列をコードする新たなファージの定義、VEGFとその受容体の相互作用の廃棄を経た内皮細胞増殖を抑制する抗体構造の血管新生の阻害のための新たな方法の開発は、提示された発見の目的である。
用語「組換え抗体」は完全抗体および抗原結合断片(すなわち、「抗原結合タンパク質」、「抗原結合ポリペプチド」または「免疫結合剤(immuno−binder)」)またはその一本鎖のことをいう。
用語「抗原結合」は抗原に特異的に結合する能力のことをいう。抗体の抗原結合機能は完全長抗体の断片、抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFv断片、(v)VHドメインからなる単一ドメインまたはdAb断片(Ward et al., (1989) Nature 341:544−546);および(vi)単離された相補性決定領域(CDR)または(vii)合成リンカーにより任意に接続され得る2以上の単離CDRの組み合わせ、により機能できることが示されている。さらに、Fv断片の2個のドメイン、VLおよびVH、は離れた、しかしそれらを、一価の分子を形成するためのVLおよびVH領域を含む単一のタンパク質鎖(一本鎖Fv(scFv)として知られる;例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423−426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879−5883を参照)として作成されることを可能とする合成リンカーにより、組換え方法を用いて接続できる遺伝子、によりコードされる。これらの抗体断片は当業者に慣用の技術を用いて得られ、断片は完全な抗体と同様の方法で、実用性のために選別される。
本発明の範囲において用いられる抗体なる用語は、選択された抗原に結合するscFv抗体または抗体断片をいう。したがって、本発明のscFv抗体は、配列GGGSGGGGSGGGGSSGGGS(配列番号33)のリンカーを含む短いリンカーペプチドにより連結されたVLおよびVHドメインを含む完全scFvであることもできる。VLおよびVHの連結は両方の順序、VL−リンカー−VHまたはVH−リンカー−VLをとることができる。本発明において、scFv構造はVH−リンカー−VLの順序である。
VHおよびVL領域は、さらに相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変領域、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存された点在する領域にさらに分割できる。各々のVHおよびVLは3個のCDRと4個のFRで構成され、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
本発明のポリペプチドは1個以上の非必須アミノ酸残基にて保存アミノ酸置換を含み得る。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されており、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分枝側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。したがって、ポリペプチド中の非必須アミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えられる。他の実施形態において、アミノ酸の鎖を、順序および/または側鎖ファミリーの構成において異なる、構造的に類似の鎖に置き換えることができる。あるいは、他の実施形態において、飽和突然変異誘発などにより、変異は免疫グロブリンコード配列の全てまたは一部に無作為に導入され得、得られた変異体を本発明のポリペプチドに組み込み、それらの所望の標的に結合する能力により選別することができる。
本発明のさらなる態様において、KDR1.3およびKDR2.6scFvは79%のアライメントスコアを有する。本発明で述べられる2個のscFvの軽鎖可変ドメイン(VL)は、90%のアライメントスコアを示し、重鎖可変ドメインは60%のアライメントを示す。
相補性決定領域(CDR)は、KDR1.3およびKDR2.6scFvと、Zhu et. al.により2000年に特許化されたscfvのCDR領域(WO00/44777)とで比較された。完全なアライメントがKDR1.3およびKDR2.6のCDRL1領域(配列番号:4および配列番号:20)の間で見いだされ、ZhuのscFvのCDRL1領域の一部が配列番号:4および配列番号:20と同じ配列を含むことがわかった。ZhuのscFvのCDRL2領域は、KDR2.6 CDRL2領域(配列番号:21)と75%のアライメントスコアを有し、KDR1.3 CDRL2領域(配列番号:5)と66%のアライメントスコアを有する。CDRL2領域のKDR1.3およびKDR2.6 scFvsのアライメントスコアは66%であった。KDR1.3およびKDR2.6のCDRL3領域は、ZhuのCDRL3領域scFvと55%のスコアでに整列されていた(align)が、KDR1.3およびKDR2.6の間の同じ領域でのアライメントスコアは22%だけであった。3個のCDRL3領域は、すべて9個のアミノ酸を有し、コンセンサス配列(−Q−S−−−−T)を有し、これは、scFvのKDRへの相互作用に、グルタミン、セリン、およびトレオニンアミノ酸が重要であることを意味し得る。KDR1.3およびZhuのscFvのCDRH3領域間で50%の類似性だけが見いだされた。これらの結果は、KDR分子認識のための重鎖可変領域と比較して、軽鎖可変領域およびそのCDR領域の高い配列保存を示す。
本発明は標的結合特異性が維持される限り、開示されたVH配列のいずれか、および組み合わせて開示されたVL配列のいずれか、も包含する。VEGFR−2に結合するファージは、VEGFと、VEGF受容体をその表面(HUVEC)で発現するヒト臍帯内皮細胞との相互作用についてのそれらの遮断特性に関する予備的認定を評価するためにELISA法で主に試験された。ELISAの結果、KDR1.3およびKDR1.6は定義された。細胞増殖へのそれらの効果が評価され、これら組換え型の両方が、細胞増殖に悪影響を及ぼすことが示された。
本発明の一の態様において、VEGFR−2に特異的に結合し、in vitroでのVEGF誘導内皮細胞増殖およびin vivoでの血管新生を阻害する、組換え抗体(KDR1.3およびKDR2.6)が提供された。それらのラット角膜in vivoモデルでの抗血管新生効果が確認された。このアッセイは、通常は角膜の血管において本質的に新たに形成された血管であるに違いない新生血管が容易に検出されるという利点を有する。統計学的評価は、KDR1.3およびKDR2.6抗体の抗血管新生活性が統計的に有意であることを(KDR1.3;p<0.05およびKDR2.6;p<0.05)明らかにした。しかし、KDR2.6抗体が使用されたとき、ラットの死が起こった。in vivoの実験は、KDR1.3抗体がin vivoで使用する中で最も効果的な抗血管新生分子であることを示した。
結論として、両方の組換え抗体がVEGF活性に対してアンタゴニスト効果を有し、それらは血管新生阻害剤として認められた。
実施例の項は、発明の理解を助けるための、組換え抗体構造の生成、発現、量的統制および細胞増殖への抗体構造の効果の検査を含む。実施例は、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、遺伝子のベクターへの伝達、宿主細菌への組換えベクターの移入のような、発明の間に使用される慣用(既知)の方法を含む。これらの方法は様々な刊行物(Samsbrook,J.,Fritsch,E.F and Maniatis,T.(1989) Molecular Cloning:2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載されており、それは実施例の項においてその目的のために記載されないであろう。
免疫
免疫研究のために、3匹の7週齢雄Balb/cJマウスが使用された。初回注射は、各々のマウスの脇の下の皮膚にPBS150μl、および10μgのsKDR1−7(組換えヒト(sVEGFR2)sKDR D1−7、Research Diagnostics Inc.)を含む完全フロイントアジュバント150μlを含む300μlの溶液を注射することにより行われた。最初の免疫に続いて3週で、同量の混合物が調製され、不完全フロイントアジュバントを用いてマウスに注射された。2番目の免疫に続く1カ月の休息の期間の後に、2匹のマウスが尾静脈から10μgのsKDRD1−7を含む150μlのPBS溶液の注射に供された。4日後にこれらのマウスの脾臓が取り出され、総RNAを得た。
免疫研究のために、3匹の7週齢雄Balb/cJマウスが使用された。初回注射は、各々のマウスの脇の下の皮膚にPBS150μl、および10μgのsKDR1−7(組換えヒト(sVEGFR2)sKDR D1−7、Research Diagnostics Inc.)を含む完全フロイントアジュバント150μlを含む300μlの溶液を注射することにより行われた。最初の免疫に続いて3週で、同量の混合物が調製され、不完全フロイントアジュバントを用いてマウスに注射された。2番目の免疫に続く1カ月の休息の期間の後に、2匹のマウスが尾静脈から10μgのsKDRD1−7を含む150μlのPBS溶液の注射に供された。4日後にこれらのマウスの脾臓が取り出され、総RNAを得た。
RNA単離
EZ−RNA総RNA単離キット(Biological Industries,Israel)は脾臓からの総RNAの単離に使用された。マウスの脾臓は1mlの「変性溶液」で均質化された(Janke & Kunkel Ika Werk RW20)。均質化された組織の、室温での5分間の培養の後に、1mlの「抽出溶液」が加えられ、試料は15秒間、完全に混合された。この後、試料は10分間室温で培養され、次に、それらは15分間、12000g、+4℃で遠心分離された。遠心後、上清が新しいチューブに移され、1mlのイソプロパノール(Merck)が添加され、試料が混合された。室温で10分間の試料の培養後に、試料は8分間、12000g、+4℃で遠心分離された。上清が除去され、RNAペレットが2mlの%75エタノール(Merck、カタログ番号1009862500)でボルテックスにより洗浄された。RNA含有チューブが7500g、+4℃で5分間遠心分離され、ペレットを室温で放置して乾燥した。100μlのDEPC処理dH2Oを添加した後、チューブは55℃で15分間培養され、RNAを溶解した。
EZ−RNA総RNA単離キット(Biological Industries,Israel)は脾臓からの総RNAの単離に使用された。マウスの脾臓は1mlの「変性溶液」で均質化された(Janke & Kunkel Ika Werk RW20)。均質化された組織の、室温での5分間の培養の後に、1mlの「抽出溶液」が加えられ、試料は15秒間、完全に混合された。この後、試料は10分間室温で培養され、次に、それらは15分間、12000g、+4℃で遠心分離された。遠心後、上清が新しいチューブに移され、1mlのイソプロパノール(Merck)が添加され、試料が混合された。室温で10分間の試料の培養後に、試料は8分間、12000g、+4℃で遠心分離された。上清が除去され、RNAペレットが2mlの%75エタノール(Merck、カタログ番号1009862500)でボルテックスにより洗浄された。RNA含有チューブが7500g、+4℃で5分間遠心分離され、ペレットを室温で放置して乾燥した。100μlのDEPC処理dH2Oを添加した後、チューブは55℃で15分間培養され、RNAを溶解した。
VHおよびVLライブラリー構築
標的分子、sKDR1−7での免疫の後に、Balbc/Jマウス脾臓を取り出し、総RNA単離を実施した。RNAは分光光度法で検査され、OD260/OD280比は1.9と計算された。六量体プライマーを基にした標準方法(Samsbrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, second edition)は、得られた総RNAからcDNAを作成するために用いられた。作成されたcDNAはPCRによる免疫グロブリン重鎖(VH、340bp)および軽鎖(VL、325bp)可変領域の増幅のためのテンプレートとして用いられた。
標的分子、sKDR1−7での免疫の後に、Balbc/Jマウス脾臓を取り出し、総RNA単離を実施した。RNAは分光光度法で検査され、OD260/OD280比は1.9と計算された。六量体プライマーを基にした標準方法(Samsbrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, second edition)は、得られた総RNAからcDNAを作成するために用いられた。作成されたcDNAはPCRによる免疫グロブリン重鎖(VH、340bp)および軽鎖(VL、325bp)可変領域の増幅のためのテンプレートとして用いられた。
重鎖(VH)可変領域増幅は、5μlのTaqポリメラーゼバッファー(10×);3μlのMgCl2(25mM);1μlのdNTP/各10mM、1μlの重鎖プライマー1(Amersham Pharmacia,27−1586−01)、1μlの重鎖プライマー2(Amersham Pharmacia,27−1586−01)、2μlのテンプレートcDNA、1μlのTaqポリメラーゼ酵素(1U/μl)(Fermentas)を含む50μlの総容量で実施された。
軽鎖(VL)可変領域増幅は、5μlのTaqポリメラーゼバッファー(10×);3μlのMgCl2(25mM);1μlのdNTP/各10mM、1μlの軽鎖プライマーミックス(Amersham Pharmacia,27−1583−01)、2μlのテンプレートcDNA、1μlのTaqポリメラーゼ酵素(1U/μl)(Fermentas)を含む50μlの総容量で実施された。
重鎖(VH)および軽鎖(VL)可変領域の増幅のためのPCRプログラムは、94℃で5分間の培養および30サイクル、各サイクルは94℃で1分間、55℃で2分間および72℃で2分間であった。PCR反応は72℃で10分間の培養で完了した。PCR産物は1.5%アガロースゲルで検査した。DNA変性またはDNA破壊はBioRad Gel Doc 2000画像システムで分析された(図1)。
一本鎖可変断片(SCFV)ライブラリー構築
アガロースゲルからのバンド分離は、340bpのVHおよび325bpのVLの純粋なPCR産物の入手のため、「Roche Agarose Gel DNA Extraction」キット(ROCHE AGAROSE GEL DNA Extraction KIT、カタログ番号:1 696 505)を使用することによりなされた。一本鎖可変断片(scFv)の構築が2段階のPCR反応で実施された。
アガロースゲルからのバンド分離は、340bpのVHおよび325bpのVLの純粋なPCR産物の入手のため、「Roche Agarose Gel DNA Extraction」キット(ROCHE AGAROSE GEL DNA Extraction KIT、カタログ番号:1 696 505)を使用することによりなされた。一本鎖可変断片(scFv)の構築が2段階のPCR反応で実施された。
第一の段階は、5μlのTaqポリメラーゼバッファー(10×);3μlのMgCl2(25mM);1μlのdNTP/各10mM、3μlのVHPCR産物(100ng/μl)、3μlのVLPCR産物(100ng/μl)、4μlのリンカープライマー(Amersham Pharmacia,27−1588−01)、1μlのTaqポリメラーゼ酵素(1U/μl)(Fermentas)を含む全量50μlの反応混合物において行われた。反応混合物を含むチューブは、Biometra Trioblock Thermoblock装置に置かれ、(94℃、1分間、63℃、4分間)で7サイクルの反応プログラムに供された。第二の段階において、50μlの混合物(34μldH2O、5μlのTaqポリメラーゼバッファー(10×)、3μlのMgCl2(25mM)、1μlのdNTP/各10mM、4μlのRSプライマーミックス(Amersham Pharmacia,27−1589−01)、1μlのTaqポリメラーゼ酵素(1U/μl)(Fermentas))が、7サイクル終了の反応混合物に添加された。その後、25サイクル(94℃1分間、55℃2分間、72℃2分間)の反応プログラムに供された。scFv PCR産物は1.2%アガロースゲル上で制御された(図2)。scFv構造およびpDUCKベクターはSfiIおよびNotIでそれぞれ消化され、互いにライゲートされた。
ライゲーションの後、ライゲーション産物は70℃で10分間培養され、E.Coli TG1細菌に移入された。
感染性ファージ生産
scFvライブラリーを含む細菌が、5mlのLB培地(1リットルの2XTY:10gのバクトトリプトン、5gの酵母エキス、10gのNaCl)に接種され、37℃および220rpmで一晩培養された(振とう培養器(incubator shaker)、Innova)。翌日、一晩おいた培養物は、1:100の希釈係数で50mlの2XTY/Amp培地に接種され、OD600値が0.5に達するまで、培養物は37℃および220rpmで培養された(振とう培養器、Innova)。培養物のOD600値が0.5に達したとき、10mlの細菌培養物は1011cfu M13K07ヘルパーファージを含む50mlの新しい2XTY/Amp媒地に移され、振とうなしで37℃45分間、次いで、220rpmで振とうしながら37℃45分間培養された。培養の後、細菌培養物は室温にて3000gで10分間遠心分離され(Sorvall RC5C+)、上清は廃棄された。ペレットは、30mlの2XTY/Amp/Kan媒地(1リットルの2XTY:100mgのアンピシリンおよび50mgのカナマイシン)に再懸濁され、37℃、220rpmで一晩培養された。翌日、細菌培養物は7000g(冷凍遠心器、Sorvall RC5C+)、4℃で10分間遠心分離された。上清はその後新しい遠心チューブの中に移され、再度同じ条件で遠心分離された。20mlの上清が新しい遠心チューブの中に移され、5mlのPEG/NaCl(20%(w/v)ポリエチレングリコール6000、2.5MのNaCl)が添加された。混合物はファージ沈殿のために氷上で2時間培養された。次いで、ファージは45分間+4℃、7000rpm(冷凍遠心器、Sorvall RC5C)で遠心分離され、上清は廃棄された。ペレットは、1mlのPBS(3.2mM Na2HPO4x2H2O、1.4mM KH2PO4、2.7mM KCl、137mM NaCl)に溶解され、滅菌マイクロ遠心チューブの中に移された。懸濁液は250μlのPEG/NaCl(20%(w/v)ポリエチレングリコール6000、2.5MのNaCl)と混合され、その後氷上で30分間培養された。懸濁液は20分間、+4℃、7000rpmで遠心分離(Microsantrifuge、Eppendorf、5415C)され、上清は廃棄された。ペレットは200μlのPBS(3.2mM Na2HPO4x2H2O、1.4mM KH2PO4、2.7mM KCl、137mM NaCl)に溶解され、ファージ滴定はファージ量の決定のために実施された。
scFvライブラリーを含む細菌が、5mlのLB培地(1リットルの2XTY:10gのバクトトリプトン、5gの酵母エキス、10gのNaCl)に接種され、37℃および220rpmで一晩培養された(振とう培養器(incubator shaker)、Innova)。翌日、一晩おいた培養物は、1:100の希釈係数で50mlの2XTY/Amp培地に接種され、OD600値が0.5に達するまで、培養物は37℃および220rpmで培養された(振とう培養器、Innova)。培養物のOD600値が0.5に達したとき、10mlの細菌培養物は1011cfu M13K07ヘルパーファージを含む50mlの新しい2XTY/Amp媒地に移され、振とうなしで37℃45分間、次いで、220rpmで振とうしながら37℃45分間培養された。培養の後、細菌培養物は室温にて3000gで10分間遠心分離され(Sorvall RC5C+)、上清は廃棄された。ペレットは、30mlの2XTY/Amp/Kan媒地(1リットルの2XTY:100mgのアンピシリンおよび50mgのカナマイシン)に再懸濁され、37℃、220rpmで一晩培養された。翌日、細菌培養物は7000g(冷凍遠心器、Sorvall RC5C+)、4℃で10分間遠心分離された。上清はその後新しい遠心チューブの中に移され、再度同じ条件で遠心分離された。20mlの上清が新しい遠心チューブの中に移され、5mlのPEG/NaCl(20%(w/v)ポリエチレングリコール6000、2.5MのNaCl)が添加された。混合物はファージ沈殿のために氷上で2時間培養された。次いで、ファージは45分間+4℃、7000rpm(冷凍遠心器、Sorvall RC5C)で遠心分離され、上清は廃棄された。ペレットは、1mlのPBS(3.2mM Na2HPO4x2H2O、1.4mM KH2PO4、2.7mM KCl、137mM NaCl)に溶解され、滅菌マイクロ遠心チューブの中に移された。懸濁液は250μlのPEG/NaCl(20%(w/v)ポリエチレングリコール6000、2.5MのNaCl)と混合され、その後氷上で30分間培養された。懸濁液は20分間、+4℃、7000rpmで遠心分離(Microsantrifuge、Eppendorf、5415C)され、上清は廃棄された。ペレットは200μlのPBS(3.2mM Na2HPO4x2H2O、1.4mM KH2PO4、2.7mM KCl、137mM NaCl)に溶解され、ファージ滴定はファージ量の決定のために実施された。
ファージ滴定
ファージ滴定のために、最初に、最小量のプレート(minimal plate)が調製された。100mlの最少培地のために:50mlの2×M9培地(12g Na2HPO4.2H2O、6g KH2HPO4、1g NaCl、2g NH4Cl、1リットルに仕上げ、20分間121℃でオートクレーブされた)を50mlの溶解した3%寒天、200μlの1M MgSO4、および10μlの1M CaCl2と混合した。混合物が冷却されたとき、2mlの濾過滅菌(0.22μm TPP、cat no:99522)されたブドウ糖(20%)および100μlの濾過滅菌(0.22μm TPP、cat no: 99522)されたチアミン(Sigma T4625;10mg/ml)が添加され、培地はペトリ皿に置かれた。F’雄性菌(F’ male bacteria)(E.coli TG1)は、最少培地を含むプレートに広げられ、37℃で一晩培養された。翌日、F’雄性菌(E.coli TG1)コロニーが採取され、LB培地(1リットルに対して:10g バクトトリプトン(BD、cat no:21705)、5g酵母エキス(BD、cat no211929)、10g NaCl(Applichem、cat no:A2942)に接種された。細菌は振とう培養器(Innova、4230)で37℃にてOD600値が0.5(Smart Spec登録商標 3000 BioRad)に達するまで培養された。待機段階の間、適切なファージ希釈物(10−2;10−4;10−6;10−8 10−10)が、PBS(8mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、2.7mM KCl、および137mM NaCl)で調製された。細菌のOD600値が0.5(Smart Spec登録商標 3000 BioRad)に達したとき、100μlの菌培養物は滅菌マイクロ遠心チューブに移された。10μlの各々希釈されたファージは、細菌と混合され、37℃で30分間培養された。培養の終わりに、感染した細菌はLB/Ampプレート(100mgのアンプリコンと混合された、1リットルの溶解したLB/寒天)上に広げられ、プレートは37℃で一晩、逆さの状態で恒温器(Nuve EN500)に置かれた。翌日、形成された細菌コロニーの数が数えられ、原液のファージ濃度が決定された。
ファージ滴定のために、最初に、最小量のプレート(minimal plate)が調製された。100mlの最少培地のために:50mlの2×M9培地(12g Na2HPO4.2H2O、6g KH2HPO4、1g NaCl、2g NH4Cl、1リットルに仕上げ、20分間121℃でオートクレーブされた)を50mlの溶解した3%寒天、200μlの1M MgSO4、および10μlの1M CaCl2と混合した。混合物が冷却されたとき、2mlの濾過滅菌(0.22μm TPP、cat no:99522)されたブドウ糖(20%)および100μlの濾過滅菌(0.22μm TPP、cat no: 99522)されたチアミン(Sigma T4625;10mg/ml)が添加され、培地はペトリ皿に置かれた。F’雄性菌(F’ male bacteria)(E.coli TG1)は、最少培地を含むプレートに広げられ、37℃で一晩培養された。翌日、F’雄性菌(E.coli TG1)コロニーが採取され、LB培地(1リットルに対して:10g バクトトリプトン(BD、cat no:21705)、5g酵母エキス(BD、cat no211929)、10g NaCl(Applichem、cat no:A2942)に接種された。細菌は振とう培養器(Innova、4230)で37℃にてOD600値が0.5(Smart Spec登録商標 3000 BioRad)に達するまで培養された。待機段階の間、適切なファージ希釈物(10−2;10−4;10−6;10−8 10−10)が、PBS(8mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、2.7mM KCl、および137mM NaCl)で調製された。細菌のOD600値が0.5(Smart Spec登録商標 3000 BioRad)に達したとき、100μlの菌培養物は滅菌マイクロ遠心チューブに移された。10μlの各々希釈されたファージは、細菌と混合され、37℃で30分間培養された。培養の終わりに、感染した細菌はLB/Ampプレート(100mgのアンプリコンと混合された、1リットルの溶解したLB/寒天)上に広げられ、プレートは37℃で一晩、逆さの状態で恒温器(Nuve EN500)に置かれた。翌日、形成された細菌コロニーの数が数えられ、原液のファージ濃度が決定された。
バイオパニングでのKDRに特異的な組換えファージの選択
VEGFR−2結合組換え抗体の選択は、1993年のSmith et al.(Smith,G.P., and Scott,J.K.1993,Libraries of peptides and proteins displayed on fiamentous phage. In methods in Enzymology 217:228−257)に従って行われた。
VEGFR−2結合組換え抗体の選択は、1993年のSmith et al.(Smith,G.P., and Scott,J.K.1993,Libraries of peptides and proteins displayed on fiamentous phage. In methods in Enzymology 217:228−257)に従って行われた。
この作業において、250ngのsKDR1−7を含む500μlのコーティング溶液(0.1M NaHCO3、pH8.6)は、バイオパニングチューブ(75mmX12mmイムノチューブ、Nunc、Maxisorb)にコートされた。次の日に、コーティング溶液は廃棄され、イムノチューブは遮断バッファー(PBS+1%BSA)で1時間遮断された。培養の終わりに、イムノチューブは6回TPBS(PBS+0.1%(v/v)Tween−20)溶液で洗浄された。そして、500μlのTPBS(PBS+0.1%(v/v)Tween−20)中の1011cfuのファージディスプレイされたscFvライブラリーが添加された。2時間の室温での培養の後に、非結合性ファージはTPBS(PBS+0.1%(v/v)Tween−20)で30回、次いでPBSで30回洗浄することにより廃棄された。洗浄段階の後に、標的分子に結合したファージは、500μlの溶離液(グリシン(0.2M pH:2.2)、1mg/ml BSA)(Roche、cat no:735086)を添加することによって、溶出された。ファージを含む溶離液は、75μlの1M Tris−HCl(pH9.1)で中和された。溶出したファージの量は1μl、10μl、および1/10μlの溶出ファージの滴定により得られた。残りのファージは第2のバイオパニング段階のために増幅された(表1)。
第2のバイオパニング段階の後に、sKDR結合ファージの増加は全く観察されなかったが、第3段階の後に濃縮が観察された。第3のバイオパニング溶出段階の後に、E.coli TG1細菌は37℃で30分培養され、細菌はLB/Amp/寒天プレート上に置かれた。翌日、細菌コロニー中のscFv遺伝子の存在がコロニーPCR法で制御された。
コロニーPCR
細菌コロニー中のscFv遺伝子の存在がコロニーPCR法で制御された。コロニーから採取された細菌は15μlの蒸留水を含有する0.5mlエッペンドルフ遠心チューブ内で可溶化された。チューブは、95℃で3分間培養され、遠心分離され、上部の流体はポリメラーゼ連鎖反応のテンプレートとして使用された。プライマー458:5’ttt tgt cgt ctt tcc aga cgt t3’およびプライマー459:5’tat gac cat gat tac gcc aag3’は、それぞれフォワーおよびリバースプライマーとして使用された。PCRプログラムは94℃で5分、次いで94℃で1分、55℃で2分、72℃で2分を30サイクル、次いで72℃で10分の延長段階に設定された。
細菌コロニー中のscFv遺伝子の存在がコロニーPCR法で制御された。コロニーから採取された細菌は15μlの蒸留水を含有する0.5mlエッペンドルフ遠心チューブ内で可溶化された。チューブは、95℃で3分間培養され、遠心分離され、上部の流体はポリメラーゼ連鎖反応のテンプレートとして使用された。プライマー458:5’ttt tgt cgt ctt tcc aga cgt t3’およびプライマー459:5’tat gac cat gat tac gcc aag3’は、それぞれフォワーおよびリバースプライマーとして使用された。PCRプログラムは94℃で5分、次いで94℃で1分、55℃で2分、72℃で2分を30サイクル、次いで72℃で10分の延長段階に設定された。
PCR後に、産物はアガロースゲルで1.2%で検査され(図3、4)、2個のscFvクローン(KDR1.3およびKDR2.6)が同定された。2つのクローンの違いはscFvPCR産物をBstnI酵素で消化するDNAフィンガープリンティングで検査され、DNAフィンガープリンティング研究が実施された(図5)。
ファージELISA法によるVEGFR−2に結合できるファージディスプレイ組換え抗体の選択
2個の異なるクローンとして同定されたKDR1.3およびKDR2.6の結合特性を同定するため、ファージELISAが行われた。KDR1.3およびKDR2.6を提示するファージを得るため、scFv遺伝子を含む細菌が感染ファージを生成するために用いられた。感染ファージはファージELISA試験に用いられた。96ウェルELISAプレート(Falcon,cat no:353912)の各々のウェルは500nglのsKDR1−7を含むコーティングバッファー(0.1M NaHCO3 pH:8.6)で+4℃にて一晩コートされた。翌日、ウェルは200μlのTPBS(PBS(3.2mM Na2HPO4x2H2O、1.4mM KH2PO4、2.7mM KCl、137mM NaCl)を含む0.1%Tween 20)で3回洗浄され、200μlの遮断バッファー(1%BSA+TPBS)がウェルに加えられ、プレートは室温にて1時間培養された。ウェルはその後TPBSで3回洗浄され、VEGFR−2特異的組換え抗体(1011pfu)を提示するファージを含む100μlの遮断バッファー(PBS+2%脱脂乳)が添加され、室温にて2時間培養された。培養の後、ウェルはTPBSで6回洗浄され、その後、1:1000希釈の抗M13ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合(conjugate)抗体(Pharmacia)を含む100μlの遮断バッファーが各ウェルに添加された。室温での1時間の培養後、ウェルはTPBSで6回洗浄された。100μlのABTS(Pharmacia Biotech,cat no27−9402−1)基質溶液が酵素的検出のために各々のウェルに添加された。室温での1時間の培養の後、各々のウェルのOD405値がELISAリーダー(Bio−Tech ELISA Reader)で読み取られた。
2個の異なるクローンとして同定されたKDR1.3およびKDR2.6の結合特性を同定するため、ファージELISAが行われた。KDR1.3およびKDR2.6を提示するファージを得るため、scFv遺伝子を含む細菌が感染ファージを生成するために用いられた。感染ファージはファージELISA試験に用いられた。96ウェルELISAプレート(Falcon,cat no:353912)の各々のウェルは500nglのsKDR1−7を含むコーティングバッファー(0.1M NaHCO3 pH:8.6)で+4℃にて一晩コートされた。翌日、ウェルは200μlのTPBS(PBS(3.2mM Na2HPO4x2H2O、1.4mM KH2PO4、2.7mM KCl、137mM NaCl)を含む0.1%Tween 20)で3回洗浄され、200μlの遮断バッファー(1%BSA+TPBS)がウェルに加えられ、プレートは室温にて1時間培養された。ウェルはその後TPBSで3回洗浄され、VEGFR−2特異的組換え抗体(1011pfu)を提示するファージを含む100μlの遮断バッファー(PBS+2%脱脂乳)が添加され、室温にて2時間培養された。培養の後、ウェルはTPBSで6回洗浄され、その後、1:1000希釈の抗M13ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合(conjugate)抗体(Pharmacia)を含む100μlの遮断バッファーが各ウェルに添加された。室温での1時間の培養後、ウェルはTPBSで6回洗浄された。100μlのABTS(Pharmacia Biotech,cat no27−9402−1)基質溶液が酵素的検出のために各々のウェルに添加された。室温での1時間の培養の後、各々のウェルのOD405値がELISAリーダー(Bio−Tech ELISA Reader)で読み取られた。
組換え抗体の配列解析
KDR1.3およびKDR2.6のDNA配列解析反応はBeckman coulter GenomeLab Methods Development kit (608000)のプロトコルに基づいて行われた。プライマー459および458はそれぞフォワードおよびリバース読み込みに用いられた。配列解析反応は配列解析システムCEQ800で自動化されたCEQ800 Dye Terminator cycle sequencingで分析された。
KDR1.3およびKDR2.6のDNA配列解析反応はBeckman coulter GenomeLab Methods Development kit (608000)のプロトコルに基づいて行われた。プライマー459および458はそれぞフォワードおよびリバース読み込みに用いられた。配列解析反応は配列解析システムCEQ800で自動化されたCEQ800 Dye Terminator cycle sequencingで分析された。
KDR1.3およびKDR2.6クローンに属するDNA配列は、互いにWorkbench 「CLUSTALW−Multiple Sequence Aligment」プログラム(http://workbench.sdsc.edu)で比較され、配列の違いはBstnI酵素消化結果で確認された。KDR1.3およびKDR2.6のDNA配列は図6および図7に示される。配列解析の結果によると、KDR1.3およびKDR2.6scFvはそれぞれ747bpおよび762bp長である。
細菌でのSCFVの生成、発現SCFVの再生、フォールディングおよび精製
E.coli細胞での組換え抗体の生成
組換え抗体を生産するため、pDUCKファージミドベクター中のKDR1.3およびKDR2.6クローンを含む各E.coli HB2151株が、100μg/mlのアンプリコンを含む50mlの2xYTに接種され、30℃にて一晩増殖させられた。翌日、一晩おいた培養物は100μg/mlのアンプリコンおよび2%グルコースを含む新鮮な500mlの2xYT培地に接種(OD600 0.05)された。培養物はOD600が0.5〜0.6に達するまで37℃、250rpmにて増殖された。その後、細菌は3500rpmで10分間、室温にて遠心分離された。得られたペレットは、1mM IPTG(イソプロピル β−D−1−チオガラクトピラノシド)およびアンプリコン(100μg/ml)を含む500mlの新鮮な2XTY培地に溶解され、さらに4時間、30℃、250rpmにて増殖させられた(SANCHEZ L, et al .. J Biotechnol., 72 (1−2), 13−20, (1999)。培養物は4000rpmで10分間遠心分離され、上清は廃棄された。ScFv生産を制御するため、誘導直前(T0)および誘導の4時間後(T4)の試料がSDS−PAGEにロードされた。
E.coli細胞での組換え抗体の生成
組換え抗体を生産するため、pDUCKファージミドベクター中のKDR1.3およびKDR2.6クローンを含む各E.coli HB2151株が、100μg/mlのアンプリコンを含む50mlの2xYTに接種され、30℃にて一晩増殖させられた。翌日、一晩おいた培養物は100μg/mlのアンプリコンおよび2%グルコースを含む新鮮な500mlの2xYT培地に接種(OD600 0.05)された。培養物はOD600が0.5〜0.6に達するまで37℃、250rpmにて増殖された。その後、細菌は3500rpmで10分間、室温にて遠心分離された。得られたペレットは、1mM IPTG(イソプロピル β−D−1−チオガラクトピラノシド)およびアンプリコン(100μg/ml)を含む500mlの新鮮な2XTY培地に溶解され、さらに4時間、30℃、250rpmにて増殖させられた(SANCHEZ L, et al .. J Biotechnol., 72 (1−2), 13−20, (1999)。培養物は4000rpmで10分間遠心分離され、上清は廃棄された。ScFv生産を制御するため、誘導直前(T0)および誘導の4時間後(T4)の試料がSDS−PAGEにロードされた。
細菌培養物からの組換え抗体構造の精製
培養の後、ペリプラズム抽出(periplasmic extraction)がタンパク質精製のためになされた(Sanchez, 1999)。細菌ペレットは5.3mlのTES(Tris−HClおよびEDTA)中に再懸濁され、氷上で5分間培養された。その後、6mlの1/3希釈ペリプラズム抽出バッファーが添加され、細菌は時折振動させながら20分間氷上で培養された。細胞抽出物は14000rpm、+4℃にて10分間遠心分離された。上清にscFvが全く観察されなかったので、ペレットは封入体抽出プロトコル(DAS, 2004)に供された。まず、ペレットは、0.2mg/mlのリゾチームを含む5mlの溶解(lysis)バッファー(50mM Tris pH8.0、200mM NaCl、1mM EDTA)に溶解され、氷上で30分間培養された。懸濁液は氷上で10秒間、6回の超音波処理に供された。その後、細菌性懸濁液は12,000rpm、+4℃にて15分間遠心分離された。第一の上清は+4℃で保管された。
培養の後、ペリプラズム抽出(periplasmic extraction)がタンパク質精製のためになされた(Sanchez, 1999)。細菌ペレットは5.3mlのTES(Tris−HClおよびEDTA)中に再懸濁され、氷上で5分間培養された。その後、6mlの1/3希釈ペリプラズム抽出バッファーが添加され、細菌は時折振動させながら20分間氷上で培養された。細胞抽出物は14000rpm、+4℃にて10分間遠心分離された。上清にscFvが全く観察されなかったので、ペレットは封入体抽出プロトコル(DAS, 2004)に供された。まず、ペレットは、0.2mg/mlのリゾチームを含む5mlの溶解(lysis)バッファー(50mM Tris pH8.0、200mM NaCl、1mM EDTA)に溶解され、氷上で30分間培養された。懸濁液は氷上で10秒間、6回の超音波処理に供された。その後、細菌性懸濁液は12,000rpm、+4℃にて15分間遠心分離された。第一の上清は+4℃で保管された。
ペレットは0.2mg/mlリゾチームを含む12mlの溶解バッファーに再懸濁された。室温での15分間の培養の後、第二の超音波処理がなされた(6回、10秒間)。細菌性懸濁液は12000rpm、+4℃にて30分間遠心分離された。第二の上清は+4℃で保管された。
ペレットは12mlの溶解バッファーに再懸濁され、室温にて15分間培養された。その後、細菌性懸濁液は各回10秒間、6回超音波処理された。超音波処理の後、SDSが最終濃度1%で添加され、懸濁液が室温にて30分間培養され、その後12000rpm、+4℃にて30分間遠心分離された。第三の上清は+4℃で保管された。ペレットは12mlの溶解バッファーに再懸濁され、12000rpm、+4℃にて20分間遠心分離された。第四の上清は+4℃で保管された。ペレットは6M尿素を含む50mM TrisバッファーpH8.0に再懸濁され、氷上で45分間培養された。その後、試料は12000rpmで30分間遠心分離された(DASA D., et al. 2004, J Virol Methods, 117 (2), 169−77)。
精製工程の間に得られた全ての上清はSDS PAGEおよびウエスタンブロット分析により制御された。KDR1.3scFvおよびKDR2.6のSDS−PAGEおよびウエスタンブロット分析の結果はそれぞれ図8および図9に示す。
第六の上清が両方のクローン(KDR1.3およびKDR2.6)で最も精製されたscFvを含んでおり、それゆえこれらの上清はさらなる精製工程のために選ばれた。これらの上清はL−アルギニンを含む再フォールディングバッファーに対して+4℃、二晩透析された。上清はその後超音波処理バッファー(sonication buffer)に対してさらに二晩透析された。透析の後、試料精製は金属アフィニティーカラム(TALON−BD Bioscience)で実施された。この研究のために、樹脂は50mlチューブにおいて1300rpm、5分間遠心分離され、上清は除去された。樹脂は10樹脂容量の超音波処理バッファーで平衡化され、室温にて1300rpm、3分間遠心分離された。上清は廃棄され、透析された試料がチューブに添加された。混合物は30分間培養され、その後室温にて1300rpm、5分間遠心分離された。上清は廃棄され、樹脂は10樹脂容量の超音波処理バッファーで10分間、2回洗浄された。その後、樹脂は1容量の超音波処理バッファーで再懸濁され、懸濁液はエンドキャップカラムに移された。樹脂のデカンテーションの後、カラムは1樹脂容量の超音波処理バッファーで3回洗浄された。その後、組換え抗体は5樹脂容量の1X溶出バッファーでカラムから溶出された。溶出した試料は、SDS−PAGEおよびウエスタンブロットで分析された。KDR1.3およびKDR2.6クローンのTALON精製結果は図10および図11に示された。
B型肝炎ウイルス表面抗原に対して開発されたLig7組換え抗体は、VEGF関連HUVE細胞増殖アッセイでのKDR1.3およびKDR2.6組換え抗体の効果分析のための陰性対照として用いられた。
第二溶出チューブのTALON精製KDR1.3およびKDR2.6scFv、およびLig7溶出試料はPBSに対して一晩透析され、濾過滅菌の後、細胞培養物アッセイに用いられた。scFv濃度はBCA法(Pierce 23225)で測定された。
500mlの培地中の組換え抗体処理の誘導の後に、500μlのTALON精製scfvが得られた。精製KDR1.3scFvの量は85ng/μlから156ng/μの間、平均120ng/μで変化し、KDR2.6については、scFvの量は88ng/μlから125ng/μlの間、平均105ng/μlで変化した。組換え抗体精製産物の量および活性の間の違いは、精製工程の間の抗体構造のフォールディングにおける違いに起因し得る(Wulfing, C. And Plunckthun, A., 1994, J. Mol. Biol., 242, 655−669,); Dasa D., et al . 2004, J Virol Methods, 117 (2), 169−77)。これらのフォールディングの変化は、宿主細胞の遺伝的安定性もまた妨げ得る配列の違いによるであろう(Knappik, A., et al. 1993, Bio/Technology, 11, 77−83)。
ELISAによる可溶性KDR1.3およびKDR2.6SCFVの可溶性KDRへの結合特性の測定
KDR1.3およびKDR2.6scFvの結合特性はELISA法により測定された。ELISAウェルプレートの各々のウェルは+4℃にて一晩100μlの標的抗原(0.5μg)でコートされた。翌日、ウェルは200μlのTPBS(PBSを含む0.1%Tween 20)で3回洗浄され、200μlの遮断バッファー(PBS+1%BSA)で室温にて1時間遮断された。ウェルはTPBSで3回洗浄され、抗KDR組換え抗体(〜1μg)を含むかまたは陰性対照としての組換え抗体を含まない100μlの遮断バッファーがウェルに添加され、室温にて2時間培養された。培養の後、ウェルはTPBSで6回洗浄され、その後1:5000抗Mycタグホースラディッシュペルオキシダーゼ結合(conjugate)抗体(Sigma)を含む100μlの遮断バッファーが各々のウェルに添加され、室温にて1時間培養された。TPBSでの6回の洗浄の後、100μlのABTS基質溶液(Pharmacia Biotech, cat no 27−9402−01)が各々のウェルに添加された。室温での1時間の培養の後、各々のウェルのOD405値がELISAリーダー(Bio−Tech ELISA Reader)で検出された。ELISAの結果は図12に示された。陰性対照のOD405値が約0.09である一方で、第二の溶出チューブのKDR1.3、KDR2.6およびLig7のOD405値は、0.250、0.512および0.605であった。可溶性的に発現されたKDR1.3およびKDR2.6scFvでもKDRに結合し、細胞培養実験に使用可能であった。
KDR1.3およびKDR2.6scFvの結合特性はELISA法により測定された。ELISAウェルプレートの各々のウェルは+4℃にて一晩100μlの標的抗原(0.5μg)でコートされた。翌日、ウェルは200μlのTPBS(PBSを含む0.1%Tween 20)で3回洗浄され、200μlの遮断バッファー(PBS+1%BSA)で室温にて1時間遮断された。ウェルはTPBSで3回洗浄され、抗KDR組換え抗体(〜1μg)を含むかまたは陰性対照としての組換え抗体を含まない100μlの遮断バッファーがウェルに添加され、室温にて2時間培養された。培養の後、ウェルはTPBSで6回洗浄され、その後1:5000抗Mycタグホースラディッシュペルオキシダーゼ結合(conjugate)抗体(Sigma)を含む100μlの遮断バッファーが各々のウェルに添加され、室温にて1時間培養された。TPBSでの6回の洗浄の後、100μlのABTS基質溶液(Pharmacia Biotech, cat no 27−9402−01)が各々のウェルに添加された。室温での1時間の培養の後、各々のウェルのOD405値がELISAリーダー(Bio−Tech ELISA Reader)で検出された。ELISAの結果は図12に示された。陰性対照のOD405値が約0.09である一方で、第二の溶出チューブのKDR1.3、KDR2.6およびLig7のOD405値は、0.250、0.512および0.605であった。可溶性的に発現されたKDR1.3およびKDR2.6scFvでもKDRに結合し、細胞培養実験に使用可能であった。
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)単離およびin vitro培養
上記によって得られた組換え抗体の期待される特性は、VEGFR−2の活性を遮断することによる細胞増殖阻害である。HUVEC増殖の阻害のために必要な組換え抗体の濃度および阻害割合の決定というこの目的のために、in vitro細胞増殖アッセイが実施された。
上記によって得られた組換え抗体の期待される特性は、VEGFR−2の活性を遮断することによる細胞増殖阻害である。HUVEC増殖の阻害のために必要な組換え抗体の濃度および阻害割合の決定というこの目的のために、in vitro細胞増殖アッセイが実施された。
HUVE細胞は、Jaffe et al.(Jaffe et al. J Clin Invest. 1973; 52:2745−56)に記載された手段を改変したものを使用して精製および培養された。細胞は、ヒト血漿フィブロネクチン(40μg/ml)でコートされた組織培養プレート中で、20%ウシ胎仔血清、20mM HEPES pH:7.4、ペニシリン(100μg/mL)、ストレプトマイシン(100μg/mL)およびヘパリン(5μ/mL)を含むM199内皮細胞増殖培地(Biological Industries, Israel)内で維持された。
HUVEC BRBU 増殖アッセイ
組換え抗体の細胞増殖に対するKDR遮断活性の検出のため、ヌクレオチドアナログ(BrdU)の複製DNAへの組込みの測定を可能にするキットが使用された。
組換え抗体の細胞増殖に対するKDR遮断活性の検出のため、ヌクレオチドアナログ(BrdU)の複製DNAへの組込みの測定を可能にするキットが使用された。
この目的のため、Roche BRDUキットが用いられた(Roche, Kat. No.144611)。BrdUは細胞***の間に複製DNAに組込まれるヌクレオチドアナログである。その後、BrdUの細胞への取込みは、抗BrdU抗体に結合(conjugate)された蛍光マーカーにより測定された。
BRDUアッセイのため、HUVE細胞は96ウェル組織培養プレートに置かれ、上記のように培養された。実験のため、HUVE細胞は1%ゼラチンでコートされた96ウェル組織培養プレートに5000細胞/ウェルの密度で播種された。細胞を3時間おいた後、培地は2%FBSを含むM199培地に置き換えられ、細胞は16時間培養された。
抗体は、5または10ng/mlのVEGFを含む培地に室温で希釈され、これらの調製したての抗体希釈物を2日間の各日、細胞培養物に添加した。
実験の16時間前に、BrdUは細胞に最終濃度10μMで添加された。実験の終わりに、細胞は洗浄され、固定された。BrdUラベリングは製造者の指示書に従って行われた。各々の細胞のBrdU組込み量405nmでの分光光度読み取りで測定された。490nmでの吸収値は各々の試料について、405nmの吸収値から引かれた。
次の実験で、異なる時間での異なるKDR1.3およびKDR2.6組換え抗体濃度のHUVE細胞増殖への効果が分析された(図13)。1μg/ml濃度の組換え抗体HUVE細胞増殖阻害の百分率は、4個の異なる増殖アッセイの平均によって算出した。
Ab293:84±20.1%
KDR1.3:60±23.7%
KDR2.6:40±17.4%
Ab293:84±20.1%
KDR1.3:60±23.7%
KDR2.6:40±17.4%
角膜血管新生モデルにおける組換え可溶性抗体の抗血管新生効果のin vivoでの検証
角膜血管新生モデルで用いられる動静脈奇形(AVM)組織はMarmara University, Neurological Sciences Instituteでの手術により入手し、KDR1.3、KDR2.6およびLig7組換え抗体はこれらのモデルにおいて試験された。
角膜血管新生モデルで用いられる動静脈奇形(AVM)組織はMarmara University, Neurological Sciences Instituteでの手術により入手し、KDR1.3、KDR2.6およびLig7組換え抗体はこれらのモデルにおいて試験された。
角膜血管新生モデル
角膜は、通常血管を含まない、無血管の組織である。血管新生で活性な組織(angiogenically active tissue)が角膜の表面のマイクロポケットに置かれると、3または4週で角膜の血管新生が開始する。角膜のこの特徴は、in vivoでの血管新生を研究するための手段を維持する(Barbel M et al, Inv. Ophthalmology & Vis. Sci., 1996, Vol:37, No:8 p.1625−1632)。各組織試料(187℃での液体窒素中のAVM)は、角膜に接種され、室温にされ、ジメチルスルホキシドで洗浄され、顕微鏡下で適当な大きさ(約2〜3mmの直径)の小片に切断される。
角膜は、通常血管を含まない、無血管の組織である。血管新生で活性な組織(angiogenically active tissue)が角膜の表面のマイクロポケットに置かれると、3または4週で角膜の血管新生が開始する。角膜のこの特徴は、in vivoでの血管新生を研究するための手段を維持する(Barbel M et al, Inv. Ophthalmology & Vis. Sci., 1996, Vol:37, No:8 p.1625−1632)。各組織試料(187℃での液体窒素中のAVM)は、角膜に接種され、室温にされ、ジメチルスルホキシドで洗浄され、顕微鏡下で適当な大きさ(約2〜3mmの直径)の小片に切断される。
10匹のSprague−Dawleyラットが本実験で用いられた。ラットの内の1匹は感染のため本実験から除外した。角膜移植の手順における段階は、過去に刊行された文献(Polverini PJ, et al, Lab. Invest., 1984, 51, 635−642)に従って行われ、図14に示される。各々のラットは、ケタミンの腹腔内投与で麻酔させられ、すべての操作(manipulation)が顕微鏡下で無菌条件のもとで実行された。それぞれの動物の両方の角膜は、局所の0.5%プロパラカインで麻酔され、各々の眼球は宝石用ピンセット(jeweler’s forceps)で静かに突出させた。手術用顕微鏡下で、傍中心の基質内の線状角膜切開(paracentral intrastromal linker keratotomy)(約4mm長、縁に対して直角に)が、くも膜用刃(arachnoid blade)で実施された。その後、角膜組織でマイクロポケットを形成するためにマイクロフックが用いられた。均一な量の組織が角膜の2個の上皮層間のマイクロポケットに移植された。手順が実行された日を0日とした。
ラット角膜血管新生アッセイにおける組換え抗体の抗血管新生効果の研究
体重300から400グラムのSprague−Dawleyラットが全ての実験で用いられた。9匹のラットが角膜血管新生アッセイに用いられた。KDR1.3、KDR2.6およびLig7抗体(25ng/μl)が、ラットが角膜でAVMにさらされると同時に静脈注射によって投与され、群は10日間続けられた。この研究においてLig7は陰性対照として用いられ、各々の角膜は3、5、7および9日で撮影され、新規に形成された血管を評価のために数えた。10日間で観察されたラット角膜は撮影され、画像は図15に示された。KDR1.3が用いられた群は対照群と比較されるとき、血管新生の軽減が視覚化された。血管新生軽減はまたKDR2.6群でも視覚化されたが、衰弱によるラットの死亡が9日で起こった。
体重300から400グラムのSprague−Dawleyラットが全ての実験で用いられた。9匹のラットが角膜血管新生アッセイに用いられた。KDR1.3、KDR2.6およびLig7抗体(25ng/μl)が、ラットが角膜でAVMにさらされると同時に静脈注射によって投与され、群は10日間続けられた。この研究においてLig7は陰性対照として用いられ、各々の角膜は3、5、7および9日で撮影され、新規に形成された血管を評価のために数えた。10日間で観察されたラット角膜は撮影され、画像は図15に示された。KDR1.3が用いられた群は対照群と比較されるとき、血管新生の軽減が視覚化された。血管新生軽減はまたKDR2.6群でも視覚化されたが、衰弱によるラットの死亡が9日で起こった。
血管新生活性測定はKDR1.3、KDR2.6および対照群で実施され、次いで3、5、7、および9日の血管数の統計的な比較のために一般線形モード(General Linear Mode)(GLM)、単変量差異分析試験がSPSS15.0版で実施され、Tukey HSDおよびStudent−Newman−Keulテストが事後の比較のために用いられた。統計学的評価は、KDR1.3およびKDR2.6抗体の抗血管新生活性が統計的に有意である(KDR1.3;p<0.05およびKDR2.6;p<0.05)ことを明らかにした。しかし、KDR2.6抗体が使用されたとき、ラットの死亡が起こった。in vivoでの実験は、KDR1.3抗体がin vivoで使用する中で最も有効な抗血管新生分子であることを示した。
本発明で言及された2個の組換え抗体(KDR1.3およびKDR2.6)のHUVE細胞増殖の遮断能力およびラット角膜in vivoモデルでのそれらの抗血管新生効果が示された。1998年に、Zhu et al.はKDR−APでマウスに免疫を与えることにより、2.1nMの親和性でKDRに対するscFv(p1C11)を生産し、1μg/mlの濃度のKDRでHUVC細胞増殖の48%の阻害を得た(Zhu et al, 1998, Cancer Res. 58, 3209−3214)。さらに、Flk1に対して開発されたモノクローナル抗体がG55細胞で25%の阻害効果を示した(Kunkel P ve ark.2001,Cancer Research 61, 6624−6628)。KDR IgドメインIIIに対して開発されたモノクローナル抗体(YcomB3)は0.5mg/Lの濃度でHUVE細胞に50%の阻害効果を示し、この抗体は抗血管新生への応用の候補として提案された(Li R et al. 2004; ActaPharmacol Sin 25 (10): 1292−1298)。
抗体構造の親和性増加に関する研究がある。1996年に、DaviesおよびRiechmannは、重鎖可変領域での変異がCDR1親和性に関与したことを示した。抗体親和性は160nMから25nMに減少した(Daves and Rechmann, 1996 Immunotechnology, 2, 169−79, (1996)。Lippow et al.は2007年に、リゾチームに対する抗体の軽鎖領域の4アミノ酸の変更が親和性を140倍(30pM)増加させたことを示した(Lippow S.M et al. 2007,Nat. Biotechnol., 25, 1171−1176)。今日、血管新生阻害剤として使用されるラニビズマブは、ベバシズマブの可変領域の5アミノ酸変更および定常領域の1アミノ酸変更による誘導体である。これらの変更は、VEGF(192pM)に対する抗体の親和性を100倍増加させた。要約すれば、KDR1.3および2.6組換え抗体構造の親和性は、それらの配列を修飾することにより、結果としてその抗血管新生特性を増加させることができる。
Claims (31)
- 組換え抗体ライブラリーを通してVEGFR−2活性を遮断する組換え抗体を得ることを特徴とする、VEGF受容体2(VEGFR−2)を発現する細胞の増殖および細胞内シグナル伝達を阻害する、ファージディスプレイ技術を基にした組換え抗体の選択方法。
- ファージ構造がその表面に融合タンパク質として組換え抗体を提示する、請求項1に記載のscFvライブラリー。
- VEGFR−2の1−7免疫グロブリンドメインに特異的に結合するマウス組換え抗体である、請求項1に記載の組換え抗体。
- 請求項2に記載のVEGFR−2に対する選択に続いて得られる構造である、請求項1に記載のVEGFR−2活性を遮断する組換え抗体構造。
- 一本鎖可変断片、Fab、一本鎖抗体、二特異性抗体、三特異性抗体などの組換え抗体を含む、請求項4に記載のマウス組換え抗体。
- がん細胞を含む、細胞表面にVEGFR−2を発現する全ての細胞型の1−7免疫グロブリンドメインに特異的に結合する、請求項4に記載の組換え抗体。
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するCDRH1、
配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するCDRH2、
配列番号3で示されるアミノ酸配列を有するCDRH3、
配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するCDRL1、
配列番号5で示されるアミノ酸配列を有するCDRL2、
配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するCDRL3、
を含む請求項4に記載の組換え抗体。 - a.配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5および配列番号6の少なくとも1つのアミノ酸配列、
b.配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5および配列番号6の少なくとも3つの連続するアミノ酸配列、
を含む請求項4に記載の組換え抗体。 - 可変重鎖または可変軽鎖をコードする配列番号7または配列番号8の少なくとも1つの配列を含む請求項4に記載の組換え抗体。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5および配列番号6のいずれかの組み合わせを含む請求項4に記載の組換え抗体。
- 配列番号9で示される核酸配列を有するCDRH1、
配列番号10で示される核酸配列を有するCDRH2、
配列番号11で示される核酸配列を有するCDRH3、
配列番号12で示される核酸配列を有するCDRL1、
配列番号13で示される核酸配列を有するCDRL2、
配列番号14で示される核酸配列を有するCDRL3、
を含む請求項4に記載の組換え抗体。 - 配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13および配列番号14の少なくとも1つの核酸配列を含む請求項4に記載の組換え抗体。
- 配列番号15に示される可変重鎖核酸配列または配列番号16に示される可変軽鎖核酸配列またはその両方を含む請求項4に記載の組換え抗体。
- 配列番号33に示されるアミノ酸配列および配列番号34に示される核酸配列をもつ少なくとも14アミノ酸の軽および重可変鎖を接続するリンカーを含む請求項4に記載の組換え抗体。
- a.配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5および配列番号6のいずれかのアミノ酸配列のキメラまたはヒト化抗体の一部としてまたはペプチドとしての使用、
b.配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5および配列番号6のいずれか3つの連続するアミノ酸配列のキメラまたはヒト化抗体の一部としてまたはペプチドとしての使用、
c.配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13および配列番号14のいずれかの核酸配列のペプチドの合成またはキメラまたはヒト化抗体の産生のための使用、
を含む請求項4に記載の組換え抗体。 - 配列番号17で示されるアミノ酸配列を有するCDRH1、
配列番号18で示されるアミノ酸配列を有するCDRH2、
配列番号19で示されるアミノ酸配列を有するCDRH3、
配列番号20で示されるアミノ酸配列を有するCDRL1、
配列番号21で示されるアミノ酸配列を有するCDRL2、
配列番号22で示されるアミノ酸配列を有するCDRL3、
を含む請求項4に記載の組換え抗体。 - a.配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21および配列番号22の少なくとも1つのアミノ酸配列、
b.配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21および配列番号22の少なくとも3つの連続するアミノ酸配列、
を含む請求項4に記載の組換え抗体。 - 配列番号23に示される可変重鎖アミノ酸配列または配列番号24に示される可変軽鎖アミノ酸配列またはその両方を含む請求項4に記載の組換え抗体。
- 配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21および配列番号22のいずれかの組み合わせを含む請求項4に記載の組換え抗体。
- 配列番号25で示される核酸配列を有するCDRH1、
配列番号26で示される核酸配列を有するCDRH2、
配列番号27で示される核酸配列を有するCDRH3、
配列番号28で示される核酸配列を有するCDRL1、
配列番号29で示される核酸配列を有するCDRL2、
配列番号30で示される核酸配列を有するCDRL3、
を含む請求項4に記載の組換え抗体。 - 配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29および配列番号30の少なくとも1つの核酸配列を含む請求項4に記載の組換え抗体。
- 配列番号31に示される可変重鎖核酸配列または配列番号32に示される可変軽鎖核酸配列またはその両方を含む請求項4に記載の組換え抗体。
- a.配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29および配列番号30のいずれかのアミノ酸配列のキメラまたはヒト化抗体の一部としてまたはペプチドとしての使用、
b.配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29および配列番号30のいずれか3つの連続するアミノ酸配列のキメラまたはヒト化抗体の一部としてまたはペプチドとしての使用、
c.配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29および配列番号30のいずれかの核酸配列のペプチドの合成またはキメラまたはヒト化抗体の産生のための使用、
を含む請求項4に記載の組換え抗体。 - 配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29および配列番号30の核酸配列を含む組換えベクター。
- 下記の核酸配列:配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29および配列番号30、の少なくとも1つを含む、細菌、ほ乳類細胞および酵母ベクターを含む組換えベクター。
- 下記のタンパク質またはDNA配列:配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29および配列番号30を含む医薬組成物および医薬上許容できる担体としてのそれらの使用。
- VEGFおよびVEGFR−2の相互作用、VEGF介在血管内皮細胞増殖、血管新生、環境枝の制御された放出を提供する血管新生を阻害するための、請求項4に記載の組換え抗体の使用。
- がんなどの血管新生関連疾患、糖尿病性網膜症、血液系腫瘍および血管新生症候群において血管新生を阻害するための請求項4に記載の組換え抗体を含む医薬化合物の製造。
- 請求項4に記載のペプチドを含むVEGF標識試薬または捕捉試薬の開発。
- 治療目的の標識薬剤と結合した請求項4の組換え抗体の使用。
- 放射性および蛍光化合物、酵素(例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ)、ビオチン、ストレプトアビジン、ナノ粒子(例えば金および磁性粒子、ナノチューブ、量子ドット)の、請求項4に記載の組換え抗体の標識のための標識薬剤としての使用。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/IB2010/053109 WO2012004631A2 (en) | 2010-07-07 | 2010-07-07 | Recombinant antibody structures binding to and blocking the activity of vascular endothelial growth factor 2 (vegfr- 2 /kdr) |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013540420A true JP2013540420A (ja) | 2013-11-07 |
Family
ID=45441588
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013517561A Pending JP2013540420A (ja) | 2010-07-07 | 2010-07-07 | 血管内皮増殖因子2(vegfr−2/kdr)に結合し、その活性を遮断する組換え抗体構造 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9193792B2 (ja) |
EP (1) | EP2591002A2 (ja) |
JP (1) | JP2013540420A (ja) |
KR (1) | KR102007045B1 (ja) |
CN (1) | CN103119063B8 (ja) |
BR (1) | BR112013000341A2 (ja) |
WO (1) | WO2012004631A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017531434A (ja) * | 2014-10-07 | 2017-10-26 | カドモン コーポレイション,リミティド ライアビリティ カンパニー | ヒト 抗vegfr−2/kdr 抗体s |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102076844B (zh) * | 2008-06-30 | 2013-08-07 | 成血管细胞***公司 | 采用组合疗法的眼病和过度血管新生的治疗 |
PL3685855T3 (pl) * | 2012-10-05 | 2024-04-08 | Kadmon Corporation, Llc | Ludzkie przeciwciała anty-vegfr-2/kdr |
EP2903645A2 (en) * | 2012-10-05 | 2015-08-12 | Kadmon Corporation, LLC | Treatment of ocular disorders |
CN105330739B (zh) * | 2014-08-12 | 2020-12-25 | 中美华世通生物医药科技(武汉)有限公司 | 与人血管内皮生长因子特异性结合的抗体或其抗原结合片段及其用途 |
CN105628910A (zh) * | 2014-11-07 | 2016-06-01 | 上海中信国健药业股份有限公司 | 一种针对vegf靶向治疗药物的生物学活性检测方法 |
WO2016201282A2 (en) * | 2015-06-12 | 2016-12-15 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd | TGF-β3 SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS AND USES THEREOF |
CN109195990A (zh) * | 2016-03-30 | 2019-01-11 | Musc研究发展基金会 | 通过靶向糖蛋白a重复优势蛋白(garp)治疗和诊断癌症以及单独或联合提供有效免疫疗法的方法 |
SG11201810779PA (en) * | 2016-06-03 | 2019-01-30 | Samsung Life Public Welfare Foundation | Method for screening antibody using patient-derived tumor spheroids |
CN106892980B (zh) * | 2017-01-25 | 2020-08-04 | 长春金赛药业有限责任公司 | 抗vegfr2单克隆抗体及其应用 |
EP3898959A4 (en) * | 2018-12-21 | 2023-01-11 | Board of Regents, The University of Texas System | PHOSPHORYLATED DICER ANTIBODY AND METHODS OF USE THEREOF |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002536968A (ja) * | 1999-01-29 | 2002-11-05 | イムクローン システムズ インコーポレイティド | Kdrに特異的な抗体およびその使用 |
WO2009066655A1 (ja) * | 2007-11-19 | 2009-05-28 | Kagoshima University | アポトーシス誘導能を有するヒト抗体 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
JPH02500329A (ja) | 1987-05-21 | 1990-02-08 | クリエイテイブ・バイオマリキユールズ・インコーポレーテツド | ターゲット化多機能蛋白質 |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
WO1994004679A1 (en) | 1991-06-14 | 1994-03-03 | Genentech, Inc. | Method for making humanized antibodies |
US20020064528A1 (en) * | 2000-01-28 | 2002-05-30 | Zhenping Zhu | Antibodies specific to KDR and uses thereof |
WO2000047713A2 (en) * | 1999-02-09 | 2000-08-17 | Arch Development Corporation | Genes encoding the 5h7 antibody and methods for conferring programmed cell death properties to cells |
ES2223705T3 (es) * | 1999-04-28 | 2005-03-01 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Composiciones y metodos para el tratamiento de cancer mediante inhibi cion selectiva del vegf. |
US7414111B2 (en) * | 2001-09-19 | 2008-08-19 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Engineered templates and their use in single primer amplification |
CN101245106B (zh) * | 2007-12-04 | 2011-07-20 | 澳赛尔斯生物技术(上海)有限公司 | 抗vegf受体单克隆抗体及其制备方法和应用 |
US9487592B2 (en) * | 2008-10-24 | 2016-11-08 | Fujifilm Corporation | Immobilization substrate and method for producing the same |
JP5835204B2 (ja) | 2012-12-20 | 2015-12-24 | 信越化学工業株式会社 | レジスト材料及びこれを用いたパターン形成方法 |
-
2010
- 2010-07-07 WO PCT/IB2010/053109 patent/WO2012004631A2/en active Application Filing
- 2010-07-07 JP JP2013517561A patent/JP2013540420A/ja active Pending
- 2010-07-07 CN CN201080069006.4A patent/CN103119063B8/zh active Active
- 2010-07-07 BR BR112013000341A patent/BR112013000341A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2010-07-07 KR KR1020137002847A patent/KR102007045B1/ko active IP Right Grant
- 2010-07-07 US US13/808,295 patent/US9193792B2/en active Active
- 2010-07-07 EP EP10854375.2A patent/EP2591002A2/en not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002536968A (ja) * | 1999-01-29 | 2002-11-05 | イムクローン システムズ インコーポレイティド | Kdrに特異的な抗体およびその使用 |
WO2009066655A1 (ja) * | 2007-11-19 | 2009-05-28 | Kagoshima University | アポトーシス誘導能を有するヒト抗体 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6014038315; Cancer Research 58, 1998, p.3209-3214 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017531434A (ja) * | 2014-10-07 | 2017-10-26 | カドモン コーポレイション,リミティド ライアビリティ カンパニー | ヒト 抗vegfr−2/kdr 抗体s |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103119063B (zh) | 2016-06-29 |
US9193792B2 (en) | 2015-11-24 |
BR112013000341A2 (pt) | 2017-09-26 |
KR102007045B1 (ko) | 2019-08-05 |
EP2591002A2 (en) | 2013-05-15 |
CN103119063B8 (zh) | 2016-10-12 |
WO2012004631A2 (en) | 2012-01-12 |
CN103119063A (zh) | 2013-05-22 |
KR20130132739A (ko) | 2013-12-05 |
US20140199301A1 (en) | 2014-07-17 |
WO2012004631A3 (en) | 2012-07-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6678627B2 (ja) | 治療的低密度リポタンパク質関連タンパク質6(lrp6)多価抗体の組成物および使用方法 | |
US9193792B2 (en) | Recombinant antibody structures binding to and blocking the activity of vascular endothelial growth factor 2 (VEGFR—2/KDR) | |
US10118961B2 (en) | Modified antibody containing the cleavable peptide with the amino acid sequence TGRGPSWV | |
JP2023527927A (ja) | 新型コロナウイルス(sars-cov-2)スパイクタンパク質結合分子及びその使用 | |
CA2562604C (en) | Preparation of scfv antibody fragments | |
JP2005518336A (ja) | Vegf受容体に結合する二重特異性抗体 | |
JP6328231B2 (ja) | 抗vegf抗体およびそれを含む癌または血管新生関連疾患を予防、診断、または治療するための医薬組成物 | |
JP2017008060A (ja) | 治療的低密度リポタンパク質関連タンパク質6(lrp6)抗体の組成物および使用方法 | |
JP2002536968A (ja) | Kdrに特異的な抗体およびその使用 | |
MX2007012569A (es) | Neutralizadores de anticuerpos del factor estimulante de la colonia de macrofagos-granulocitos humanos. | |
JP2022526487A (ja) | Vegf及びang2に特異的に結合する二重特異性抗体 | |
JP2019531762A (ja) | Vegfに対する合成の抗体およびそれらの使用 | |
TWI555757B (zh) | 藉變異區突變獲得的抗血管內皮生長因子(vegf)之重組抗體 | |
Erdag et al. | Identification of novel neutralizing single‐chain antibodies against vascular endothelial growth factor receptor 2 | |
Vostakolaei et al. | Isolation and characterization of a novel scFv antibody fragments specific for Hsp70 as a tumor biomarker | |
CN116940599A (zh) | 抗体融合蛋白及其应用 | |
WO2023273595A1 (zh) | 一种结合trop2的抗体及靶向trop2和cd3的双特异性抗体及其制备方法与应用 | |
WO2016059057A1 (en) | Vegfr-2 binding polypeptides | |
WO2016059068A1 (en) | Vegfr-2 binding polypeptides | |
CN112830968B (zh) | 抗VEGF单域抗体及其人源化、单域抗体和IgG1-Fc构建的融合蛋白和应用 | |
WO2023092327A1 (en) | Vegf-binding protein and use thereof | |
PL234874B1 (pl) | Przeciwciało formatu scFv, stanowiące inhibitor białka VEGF-C oraz jego zastosowanie | |
JP2024506664A (ja) | 抗vegf抗体およびその使用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140909 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141205 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20150407 |