KR20220054434A - 신규한 crispr dna 표적화 효소 및 시스템 - Google Patents

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KR20220054434A
KR20220054434A KR1020227011364A KR20227011364A KR20220054434A KR 20220054434 A KR20220054434 A KR 20220054434A KR 1020227011364 A KR1020227011364 A KR 1020227011364A KR 20227011364 A KR20227011364 A KR 20227011364A KR 20220054434 A KR20220054434 A KR 20220054434A
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crispr
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nucleic acid
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KR1020227011364A
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데이비드 에이. 스콧
데이비드 알. 쳉
윈스톤 엑스. 얀
티아 엠. 디토마소
Original Assignee
아버 바이오테크놀로지스, 인크.
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Abstract

본 개시는 표적화된 방식으로 핵산의 조작을 위한 신규한 시스템, 방법, 및 조성물을 기술한다. 본 개시는 핵산의 표적화된 변형을 위한 비-자연 발생의 조작된 CRISPR 시스템, 구성 요소, 및 방법을 기술한다. 각 시스템은 표적 핵산과 함께 하나 이상의 단백질 구성 요소 및 하나 이상의 핵산 구성 요소를 포함한다.

Description

신규한 CRISPR DNA 표적화 효소 및 시스템
관련 출원
본 출원은 2019년 9월 9일에 출원된 미국 가출원 제62/897,859호의 우선권을 주장하고, 상기 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 2020년 9월 9일자로 만들어진 상기 ASCII 사본은 A2186-7028WO_SL.txt로 명명되며 그 크기가 475,511 바이트이다.
발명의 분야
본 개시는 신규한 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 회문 반복부(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat; CRISPR) 및 CRISPR-연관(Cas) 유전자를 사용한 게놈 편집 및 유전자 발현 조절을 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.
최근 게놈 시퀀싱 기술 및 분석의 진보는 원핵 생합성 경로에서 인간 병리에 이르기까지 수많은 다양한 자연 영역에서 생물학적 활성의 유전적 기초에 대한 중요한 통찰력을 제공했다. 제공된 방대한 양의 정보를 충분히 이해하고 평가하기 위해서는 게놈 및 에피게놈 조작을 위한 서열 기술의 규모, 효능 및 용이성에서 등가의 증가가 요구된다. 이러한 신규한 기술은 생명공학, 농업 및 인간 치료제를 포함한 수많은 영역에서 신규한 적용의 개발을 가속화할 것이다.
총괄하여 CRISPR-Cas 또는 CRISPR/Cas 시스템으로 알려져 있는 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 회문 반복부(CRISPR) 및 CRISPR-연관(Cas) 유전자는 외래 유전 요소에 대항하여 특정 종을 방어하는 고세균 및 세균에서 적응 면역 시스템이다. CRISPR-Cas 시스템은 매우 다양한 그룹의 단백질 이펙터, 비-코딩 요소 및 유전자좌 구조를 포함하며, 이들의 일부 예는 중요한 생명공학적 진보를 야기하도록 조작되고 구성되었다.
숙주 방어에 관여하는 시스템의 구성 요소는 핵산을 변형시킬 수 있는 하나 이상의 이펙터 단백질 및 이펙터 단백질(들)을 파지 핵산 상의 특정 서열로 표적화하는 역할을 하는 RNA 가이드 요소를 포함한다. RNA 가이드는 CRISPR RNA(crRNA)로 구성되며, 이펙터 단백질(들)에 의해 표적화된 핵산 조작을 가능하게 하기 위해 추가적인 트랜스-활성화 RNA(tracrRNA)가 요구될 수 있다. crRNA는 crRNA에 대한 단백질 결합을 담당하는 직접 반복부 및 요망되는 핵산 표적 서열에 상보적인 스페이서 서열로 이루어진다. CRISPR 시스템은 crRNA의 스페이서 서열을 변형시킴으로써 대체 DNA 또는 RNA 표적을 표적화하도록 재프로그래밍될 수 있다.
CRISPR-Cas 시스템은 광범위하게 두 가지 클래스로 분류될 수 있다: 클래스 1 시스템은 함께 crRNA 주위에 복합체를 형성하는 다중 이펙터 단백질로 구성되고, 클래스 2 시스템은 RNA 가이드와 표적 핵산 기질로 복합되는 하나의 이펙터 단백질로 이루어진다. 클래스 2 시스템의 단일-서브유닛 이펙터 조성물은 조작 및 적용 번역을 위한 더 간단한 구성 요소 세트를 제공하며, 이에 따라 지금까지 프로그래밍 가능한 이펙터의 중요한 소스였다. 그럼에도 불구하고, 이들의 고유한 성질을 통해 신규한 적용을 가능하게 하는, 더 작은 이펙터 및/또는 고유한 PAM 서열 요건을 갖는 이펙터와 같이, 현재의 CRISPR-Cas 시스템을 넘어서 핵산 및 폴리뉴클레오티드(즉, DNA, RNA, 또는 임의의 혼성체, 유도체 또는 변형)를 변형시키기 위한 추가적인 프로그래밍 가능한 이펙터 및 시스템에 대한 필요성이 남아 있다.
본 개시는, 먼저 게놈 데이터베이스로부터 계산적으로 동정되고 이후에 조작되고 실험적으로 검증된, 신규한 단일-이펙터 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템을 위한 비-자연-발생의 조작된 시스템 및 조성물을 제공한다. 특히, 이들 CRISPR-Cas 시스템의 구성 요소의 동정은 비-자연 환경, 예를 들어, 시스템이 처음 발견된 것들 이외의 세균에서 또는 포유류 세포와 같은 진핵 세포에서 이들의 사용을 가능하게 한다. 이들 새로운 이펙터는 기존의 클래스 2 CRISPR 이펙터의 오솔로그 및 동족체와 비교하여 기능 및 서열이 다르다.
일 양태에서, 본 개시는 CRISPR-연관 단백질(여기서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 56 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함함), 및 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 직접 반복부 서열 및 스페이서 서열을 포함하는 RNA 가이드를 포함하는, CLUST.091979의 조작된 비-자연 발생 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 회문 반복부(CRISPR) - Cas 시스템을 제공하고, 여기서 CRISPR-연관 단백질은 RNA 가이드에 결합하고 스페이서 서열에 상보적인 표적 핵산 서열을 변형시킬 수 있다. 일 양태에서, 본 개시는 CRISPR-연관 단백질 또는 CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산(여기서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 56 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함함), 및 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 직접 반복부 서열 및 스페이서 서열을 포함하는 RNA 가이드, 또는 RNA 가이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는, CLUST.091979의 조작된 비-자연 발생 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 회문 반복부(CRISPR) - Cas 시스템을 제공하고, 여기서 CRISPR-연관 단백질은 RNA 가이드에 결합하고 스페이서 서열에 상보적인 표적 핵산 서열을 변형시킬 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시는 CRISPR-연관 단백질 또는 CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산(여기서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 241의 아미노산 서열을 포함함); 및 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 직접 반복부 서열 및 스페이서 서열을 포함하는 RNA 가이드를 포함하는, CLUST.091979의 조작된 비-자연 발생 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 회문 반복부(CRISPR) - Cas 시스템을 제공하고, 여기서 CRISPR-연관 단백질은 RNA 가이드에 결합하고 스페이서 서열에 상보적인 표적 핵산 서열을 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, 또는 SEQ ID NO: 14에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 적어도 1 개(예를 들어, 1 개, 2 개, 또는 3 개)의 RuvC 도메인 또는 적어도 1 개의 스플릿 RuvC 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 다음 서열들 중 하나 이상을 포함한다: (a) PX1X2X3X4F(SEQ ID NO: 216)(여기서, X1은 L 또는 M 또는 I 또는 C 또는 F이고, X2는 Y 또는 W 또는 F이고, X3는 K 또는 T 또는 C 또는 R 또는 W 또는 Y 또는 H 또는 V이고, X4는 I 또는 L 또는 M임); (b) RX1X2X3L(SEQ ID NO: 217)(여기서, X1은 I 또는 L 또는 M 또는 Y 또는 T 또는 F이고, X2는 R 또는 Q 또는 K 또는 E 또는 S 또는 T이고, X3는 L 또는 I 또는 T 또는 C 또는 M 또는 K임); (c) NX1YX2(SEQ ID NO: 218)(여기서, X1은 I 또는 L 또는 F이고, X2는 K 또는 R 또는 V 또는 E임); (d) KX1X2X3FAX4X5KD(SEQ ID NO: 219)(여기서, X1은 T 또는 I 또는 N 또는 A 또는 S 또는 F 또는 V이고, X2는 I 또는 V 또는 L 또는 S이고, X3는 H 또는 S 또는 G 또는 R이고, X4는 D 또는 S 또는 E이고, X5는 I 또는 V 또는 M 또는 T 또는 N임); (e) LX1NX2(SEQ ID NO: 220)(여기서, X1은 G 또는 S 또는 C 또는 T이고, X2는 N 또는 Y 또는 K 또는 S임); (f) PX1X2X3X4SQX5DS(SEQ ID NO: 221)(여기서, X1은 S 또는 P 또는 A이고, X2는 Y 또는 S 또는 A 또는 P 또는 E 또는 Y 또는 Q 또는 N이고, X3는 F 또는 Y 또는 H이고, X4는 T 또는 S이고, X5는 M 또는 T 또는 I임); (g) KX1X2VRX3X4QEX5H(SEQ ID NO: 222)(여기서, X1은 N 또는 K 또는 W 또는 R 또는 E 또는 T 또는 Y이고, X2는 M 또는 R 또는 L 또는 S 또는 K 또는 V 또는 E 또는 T 또는 I 또는 D이고, X3는 L 또는 R 또는 H 또는 P 또는 T 또는 K 또는 Q 또는 P 또는 S 또는 A이고, X4는 G 또는 Q 또는 N 또는 R 또는 K 또는 E 또는 I 또는 T 또는 S 또는 C이고, X5는 R 또는 W 또는 Y 또는 K 또는 T 또는 F 또는 S 또는 Q임); 및 (h) X1NGX2X3X4DX5NX6X7X8N(SEQ ID NO: 223)(여기서, X1은 I 또는 K 또는 V 또는 L이고, X2는 L 또는 M이고, X3는 N 또는 H 또는 P이고, X4는 A 또는 S 또는 C이고, X5는 V 또는 Y 또는 I 또는 F 또는 T 또는 N이고, X6는 A 또는 S이고, X7은 S 또는 A 또는 P이고, X8은 M 또는 C 또는 L 또는 R 또는 N 또는 S 또는 K 또는 L임). 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 216의 서열은 N-말단 서열이다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 219의 서열은 C-말단 서열이다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 220의 서열은 C-말단 서열이다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 221의 서열은 C-말단 서열이다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 222의 서열은 C-말단 서열이다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 223의 서열은 C-말단 서열이다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 다음 서열들 중 하나 이상을 포함한다: (a) ECPITKDVINEYK(SEQ ID NO: 290); (b) NLTSITIG(SEQ ID NO: 231); (c) NYRTKIRTLN(SEQ ID NO: 232); (d) ISYIENVEN(SEQ ID NO: 233); (e) ELLSVEQLK(SEQ ID NO: 234);(f) HINSMTINIQDFKIE(SEQ ID NO: 235); (g) KENSLGFIL(SEQ ID NO: 236); (h) GNRQIKKG(SEQ ID NO: 237); (i) DVNFKHA(SEQ ID NO: 238); (j) GYINLYKYLLEH(SEQ ID NO: 239); (k) KEQVLSKLLY(SEQ ID NO: 240); (l) EYIYVSCVNKLRAKYVSYFILKEKYYEKQKEYDIEMGF(SEQ ID NO: 241); (m) DDSTESKESMDKRR(SEQ ID NO: 242); (n) NVQQDINGCLKNIINY(SEQ ID NO: 243); (o) ALENLENSNFEK(SEQ ID NO: 244); (p) QVLPTIKSLL(SEQ ID NO: 245); (q) YHKLENQN(SEQ ID NO: 246); (r) ASDKVKEYIE(SEQ ID NO: 247); (s) TNENNEIVDAKYT(SEQ ID NO: 248); (t) ANFFNLMMKSLHFAS(SEQ ID NO: 249); (u) LLSNNGKTQIALVPSE(SEQ ID NO: 250); (v) HINGLNADFNAANNIKYI(SEQ ID NO: 251), 또는 임의의 상기에 대해 1 개, 2 개, 또는 3 개 이하의 서열 차이(예를 들어, 치환)을 갖는 서열. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4와 적어도 70% 동일한 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10과 적어도 70% 동일한 서열을 갖는다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57 내지 90, SEQ ID NO: 118 내지 151, 또는 SEQ ID NO: 213 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열에 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57 내지 90, SEQ ID NO: 118 내지 151, 또는 SEQ ID NO: 213 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열에 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 직접 반복부 서열은 다음 서열들 중 하나 이상을 포함한다: (a) X1X2TX3X4X5X6X7X8(SEQ ID NO: 224)(여기서, X1은 A 또는 C 또는 G이고, X2는 T 또는 C 또는 A이고, X3는 T 또는 G 또는 A이고, X4는 T 또는 G이고, X5는 T 또는 G 또는 A이고, X6는 G 또는 T 또는 A이고, X7은 T 또는 G 또는 A이고, X8은 A 또는 G 또는 T임)(예를 들어, ATTGTTGDA(SEQ ID NO: 225)); (b) X1X2X3X4X5X6X7X8X9(SEQ ID NO: 226)(여기서, X1은 T 또는 C 또는 A이고, X2는 T 또는 A 또는 G이고, X3는 T 또는 C 또는 A이고, X4는 T 또는 A이고, X5는 T 또는 A 또는 G이고, X6는 T 또는 A이고, X7은 A 또는 T이고, X8은 A 또는 G 또는 C 또는 T이고, X9은 G 또는 A 또는 C임)(예를 들어, TTTTWTARG(SEQ ID NO: 227)); 및 (c) X1X2X3AC(SEQ ID NO: 228)(여기서, X1은 A 또는 C 또는 G이고, X2는 C 또는 A이고, X3는 A 또는 C임)(예를 들어, ACAAC(SEQ ID NO: 229)). 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 224는 직접 반복부의 5' 말단에 근접한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 228은 직접 반복부의 3' 말단에 근접한다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 인식할 수 있고, 여기서 PAM은 5'-NTTN-3', 5'-NTTR-3', 5'-RTTR-3', 5'-TNNT-3', 5'-TNRT-3', 5'-TSRT-3', 5'-TGRT-3', 5'-TNRY-3', 5'-TTNR-3', 5'-TTYR-3', 5'-TTTR-3', 5'-TTCV-3', 5'-DTYR-3', 5'-WTTR-3', 5'-NNR-3', 5'-NYR-3', 5'-YYR-3', 5'-TYR-3', 5'-TTN-3', 5'-TTR-3', 5'-CNT-3', 5'-NGG-3', 5'-BGG-3', 또는 5'-R-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함한 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "B"는 C 또는 G 또는 T이고, "D"는 A 또는 G 또는 T이고, "R"은 A 또는 G이고, "S"는 G 또는 C이고, "V"는 A 또는 C 또는 G이고, "W"는 A 또는 T이고, "Y"는 C 또는 T이다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 여기서 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 여기서 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 인식할 수 있고, 여기서 PAM 서열은 5'-TNNT-3' 또는 5'-TNRT-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G이다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 여기서 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 60에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 여기서 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 60에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 인식할 수 있고, 여기서 PAM 서열은 5'-NTTN-3', 5'-NTTR-3'(예를 들어, 5'-TTTG-3'), 또는 5'-NNR-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G이다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 여기서 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 213에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 여기서 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 213에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 인식할 수 있고, 여기서 PAM 서열은 5'-NTTN-3' 또는 5'-RTTR-3'(예를 들어, 5'-ATTG-3' 또는 5'-GTTA-3')로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, 여기서, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G이다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, RNA 가이드의 스페이서 서열은 약 15 개 뉴클레오티드 내지 약 55 개 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, RNA 가이드의 스페이서 서열은 20 개 뉴클레오티드 내지 45 개 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 촉매 잔기(예를 들어, 아스파트산 또는 글루탐산)을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 표적 핵산을 절단한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 펩티드 태그, 형광 단백질, 염기-편집 도메인, DNA 메틸화 도메인, 히스톤 잔기 변형 도메인, 국재화 인자, 전사 조절 인자, 광-개폐 제어 인자, 화학적 유도성 인자, 또는 염색질 시각화 인자를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산은 세포, 예를 들어, 진핵 세포, 예를 들어, 포유류 세포, 예를 들어, 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산은 벡터에 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 벡터, 또는 단순 포진 벡터를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 표적 핵산은 DNA 분자이다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 표적 핵산은 PAM 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 비-특이적 뉴클레오티드 활성을 갖는다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질 및 RNA 가이드에 의한 표적 핵산의 인식은 표적 핵산의 변형을 일으킨다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 이중-가닥 절단 사건이다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 단일-가닥 절단 사건이다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 삽입 사건을 일으킨다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 결실 사건을 일으킨다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 세포 독성 또는 세포 사멸을 일으킨다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 시스템은 도너 주형 핵산을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 도너 주형 핵산은 DNA 분자이다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 도너 주형 핵산은 RNA 분자이다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, RNA 가이드는 선택적으로 tracrRNA 및/또는 조절자 RNA를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 시스템은 tracrRNA를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 시스템은 tracrRNA를 포함하지 않는다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 자가-가공이다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 시스템은 조절자 RNA를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, 또는 SEQ ID NO: 154의 뉴클레오티드와 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 시스템은 나노입자, 리포좀, 엑소좀, 미세소포체, 또는 유전자-총을 포함하는 전달 조성물에 존재한다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 시스템은 세포 내에 있다. 일부 구현예에서, 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 포유류 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 원핵 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 세포로서, CRISPR-연관 단백질; 및 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 직접 반복부 서열 및 스페이서 서열을 포함하는 RNA 가이드를 포함하는 세포를 제공하고, 여기서 CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 56 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 세포로서, CRISPR-연관 단백질 또는 CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산; 및 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 직접 반복부 서열 및 스페이서 서열을 포함하는 RNA 가이드, 또는 RNA 가이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하고, 여기서 CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 56 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 적어도 1 개(예를 들어, 1 개, 2 개, 또는 3 개)의 RuvC 도메인 또는 적어도 1 개의 스플릿 RuvC 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 다음 서열들 중 하나 이상을 포함한다: (a) PX1X2X3X4F(SEQ ID NO: 216)(여기서, X1은 L 또는 M 또는 I 또는 C 또는 F이고, X2는 Y 또는 W 또는 F이고, X3는 K 또는 T 또는 C 또는 R 또는 W 또는 Y 또는 H 또는 V이고, X4는 I 또는 L 또는 M임); (b) RX1X2X3L(SEQ ID NO: 217)(여기서, X1은 I 또는 L 또는 M 또는 Y 또는 T 또는 F이고, X2는 R 또는 Q 또는 K 또는 E 또는 S 또는 T이고, X3는 L 또는 I 또는 T 또는 C 또는 M 또는 K임); (c) NX1YX2(SEQ ID NO: 218)(여기서, X1은 I 또는 L 또는 F이고, X2는 K 또는 R 또는 V 또는 E임); (d) KX1X2X3FAX4X5KD(SEQ ID NO: 219)(여기서, X1은 T 또는 I 또는 N 또는 A 또는 S 또는 F 또는 V이고, X2는 I 또는 V 또는 L 또는 S이고, X3는 H 또는 S 또는 G 또는 R이고, X4는 D 또는 S 또는 E이고, X5는 I 또는 V 또는 M 또는 T 또는 N임); (e) LX1NX2(SEQ ID NO: 220)(여기서, X1은 G 또는 S 또는 C 또는 T이고, X2는 N 또는 Y 또는 K 또는 S임); (f) PX1X2X3X4SQX5DS(SEQ ID NO: 221)(여기서, X1은 S 또는 P 또는 A이고, X2는 Y 또는 S 또는 A 또는 P 또는 E 또는 Y 또는 Q 또는 N이고, X3는 F 또는 Y 또는 H이고, X4는 T 또는 S이고, X5는 M 또는 T 또는 I임); (g) KX1X2VRX3X4QEX5H(SEQ ID NO: 222)(여기서, X1은 N 또는 K 또는 W 또는 R 또는 E 또는 T 또는 Y이고, X2는 M 또는 R 또는 L 또는 S 또는 K 또는 V 또는 E 또는 T 또는 I 또는 D이고, X3는 L 또는 R 또는 H 또는 P 또는 T 또는 K 또는 Q 또는 P 또는 S 또는 A이고, X4는 G 또는 Q 또는 N 또는 R 또는 K 또는 E 또는 I 또는 T 또는 S 또는 C이고, X5는 R 또는 W 또는 Y 또는 K 또는 T 또는 F 또는 S 또는 Q임); 및 (h) X1NGX2X3X4DX5NX6X7X8N(SEQ ID NO: 223)(여기서, X1은 I 또는 K 또는 V 또는 L이고, X2는 L 또는 M이고, X3는 N 또는 H 또는 P이고, X4는 A 또는 S 또는 C이고, X5는 V 또는 Y 또는 I 또는 F 또는 T 또는 N이고, X6는 A 또는 S이고, X7은 S 또는 A 또는 P이고, X8은 M 또는 C 또는 L 또는 R 또는 N 또는 S 또는 K 또는 L임). 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 216의 서열은 N-말단 서열이다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 219의 서열은 C-말단 서열이다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 220의 서열은 C-말단 서열이다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 221의 서열은 C-말단 서열이다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 222의 서열은 C-말단 서열이다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 223의 서열은 C-말단 서열이다.
본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57 내지 90, SEQ ID NO: 118 내지 151, 또는 SEQ ID NO: 213 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57 내지 90, SEQ ID NO: 118 내지 151, 또는 SEQ ID NO: 213 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 직접 반복부 서열은 다음 서열들 중 하나 이상을 포함한다: (a) X1X2TX3X4X5X6X7X8(SEQ ID NO: 224)(여기서, X1은 A 또는 C 또는 G이고, X2는 T 또는 C 또는 A이고, X3는 T 또는 G 또는 A이고, X4는 T 또는 G이고, X5는 T 또는 G 또는 A이고, X6는 G 또는 T 또는 A이고, X7은 T 또는 G 또는 A이고, X8은 A 또는 G 또는 T임)(예를 들어, ATTGTTGDA(SEQ ID NO: 225)); (b) X1X2X3X4X5X6X7X8X9(SEQ ID NO: 226)(여기서, X1은 T 또는 C 또는 A이고, X2는 T 또는 A 또는 G이고, X3는 T 또는 C 또는 A이고, X4는 T 또는 A이고, X5는 T 또는 A 또는 G이고, X6는 T 또는 A이고, X7은 A 또는 T이고, X8은 A 또는 G 또는 C 또는 T이고, X9은 G 또는 A 또는 C임)(예를 들어, TTTTWTARG(SEQ ID NO: 227)); 및 (c) X1X2X3AC(SEQ ID NO: 228)(여기서, X1은 A 또는 C 또는 G이고, X2는 C 또는 A이고, X3는 A 또는 C임)(예를 들어, ACAAC(SEQ ID NO: 229)). 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 224는 직접 반복부의 5' 말단에 근접한다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 228은 직접 반복부의 3' 말단에 근접한다.
본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 여기서 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 여기서 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 인식할 수 있고, 여기서 PAM 서열은 5'-TNNT-3' 또는 5'-TNRT-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G이다.
본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 여기서 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 60에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 여기서 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 60에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 인식할 수 있고, 여기서 PAM 서열은 5'-NTTN-3', 5'-NTTR-3'(예를 들어, 5'-TTTG-3'), 또는 5'-NNR-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G이다.
본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 여기서 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 213에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 여기서 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 213에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 인식할 수 있고, 여기서 PAM 서열은 5'-NTTN-3' 또는 5'-RTTR-3'(예를 들어, 5'-ATTG-3' 또는 5'-GTTA-3')로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G이다.
본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 약 15 개 뉴클레오티드 내지 약 55 개 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 20 개 뉴클레오티드 내지 45 개 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 촉매 잔기(예를 들어, 아스파트산 또는 글루탐산)을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 표적 핵산을 절단한다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 펩티드 태그, 형광 단백질, 염기-편집 도메인, DNA 메틸화 도메인, 히스톤 잔기 변형 도메인, 국재화 인자, 전사 조절 인자, 광-개폐 제어 인자, 화학적 유도성 인자, 또는 염색질 시각화 인자를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산은 세포, 예를 들어, 진핵 세포, 예를 들어, 포유류 세포, 예를 들어, 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산은 벡터에 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 벡터, 또는 단순 포진 벡터를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, RNA 가이드는 선택적으로 tracrRNA 및/또는 조절자 RNA를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 세포는 tracrRNA를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 세포는 tracrRNA를 포함하지 않는다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 자가-가공이다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 세포는 조절자 RNA를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 세포는 진핵 세포이다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 세포는 포유류 세포이다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 세포는 원핵 세포이다.
본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 표적 핵산은 DNA 분자이다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 표적 핵산은 PAM 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 비-특이적 뉴클레아제 활성을 갖는다.
본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질 및 RNA 가이드에 의한 표적 핵산의 인식은 표적 핵산의 변형을 일으킨다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 이중-가닥 절단 사건이다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 단일-가닥 절단 사건이다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 삽입 사건을 일으킨다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 결실 사건을 일으킨다. 본원에 기재된 임의의 세포의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 세포 독성 또는 세포 사멸을 일으킨다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 세포에서 표적 핵산에 본원에 기재된 시스템을 결합하는 방법으로서, (a) 시스템을 제공하는 단계; 및 (b) 시스템을 세포에 전달하는 단계를 포함하고, 세포는 표적 핵산을 포함하고, CRISPR-연관-단백질은 RNA 가이드에 결합하고, 스페이서 서열은 표적 핵산에 결합하는, 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 진핵 세포, 예를 들어, 포유류 세포, 예를 들어, 인간 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 표적 핵산을 변형시키는 방법으로서, 상기 방법은 CRISPR-연관 단백질(여기서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 56 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함함); 및 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 직접 반복부 서열 및 스페이서 서열을 포함하는 RNA 가이드를 포함하는 조작된 비-자연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 표적 핵산에 전달하는 단계를 포함하고, CRISPR-연관 단백질은 RNA 가이드에 결합할 수 있고; CRISPR-연관 단백질 및 RNA 가이드에 의한 표적 핵산의 인식은 표적 핵산의 변형을 일으키는, 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 표적 핵산을 변형시키는 방법으로서, 상기 방법이 CRISPR-연관 단백질 또는 CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산, 및 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 직접 반복부 서열 및 스페이서 서열을 포함하는 RNA 가이드를 포함하는 조작된 비-자연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 표적 핵산에 전달하는 단계를 포함하고, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 56 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, CRISPR-연관 단백질은 RNA 가이드에 결합할 수 있고, CRISPR-연관 단백질 및 RNA 가이드에 의한 표적 핵산의 인식은 표적 핵산의 변형을 일으키는, 방법을 제공한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 다음 서열들 중 하나 이상을 포함한다: (a) PX1X2X3X4F(SEQ ID NO: 216)(여기서, X1은 L 또는 M 또는 I 또는 C 또는 F이고, X2는 Y 또는 W 또는 F이고, X3는 K 또는 T 또는 C 또는 R 또는 W 또는 Y 또는 H 또는 V이고, X4는 I 또는 L 또는 M임); (b) RX1X2X3L(SEQ ID NO: 217)(여기서, X1은 I 또는 L 또는 M 또는 Y 또는 T 또는 F이고, X2는 R 또는 Q 또는 K 또는 E 또는 S 또는 T이고, X3는 L 또는 I 또는 T 또는 C 또는 M 또는 K임); (c) NX1YX2(SEQ ID NO: 218)(여기서, X1은 I 또는 L 또는 F이고, X2는 K 또는 R 또는 V 또는 E임); (d) KX1X2X3FAX4X5KD(SEQ ID NO: 219)(여기서, X1은 T 또는 I 또는 N 또는 A 또는 S 또는 F 또는 V이고, X2는 I 또는 V 또는 L 또는 S이고, X3는 H 또는 S 또는 G 또는 R이고, X4는 D 또는 S 또는 E이고, X5는 I 또는 V 또는 M 또는 T 또는 N임); (e) LX1NX2(SEQ ID NO: 220)(여기서, X1은 G 또는 S 또는 C 또는 T이고, X2는 N 또는 Y 또는 K 또는 S임); (f) PX1X2X3X4SQX5DS(SEQ ID NO: 221)(여기서, X1은 S 또는 P 또는 A이고, X2는 Y 또는 S 또는 A 또는 P 또는 E 또는 Y 또는 Q 또는 N이고, X3는 F 또는 Y 또는 H이고, X4는 T 또는 S이고, X5는 M 또는 T 또는 I임); (g) KX1X2VRX3X4QEX5H(SEQ ID NO: 222)(여기서, X1은 N 또는 K 또는 W 또는 R 또는 E 또는 T 또는 Y이고, X2는 M 또는 R 또는 L 또는 S 또는 K 또는 V 또는 E 또는 T 또는 I 또는 D이고, X3는 L 또는 R 또는 H 또는 P 또는 T 또는 K 또는 Q 또는 P 또는 S 또는 A이고, X4는 G 또는 Q 또는 N 또는 R 또는 K 또는 E 또는 I 또는 T 또는 S 또는 C이고, X5는 R 또는 W 또는 Y 또는 K 또는 T 또는 F 또는 S 또는 Q임); 및 (h) X1NGX2X3X4DX5NX6X7X8N(SEQ ID NO: 223)(여기서, X1은 I 또는 K 또는 V 또는 L이고, X2는 L 또는 M이고, X3는 N 또는 H 또는 P이고, X4는 A 또는 S 또는 C이고, X5는 V 또는 Y 또는 I 또는 F 또는 T 또는 N이고, X6는 A 또는 S이고, X7은 S 또는 A 또는 P이고, X8은 M 또는 C 또는 L 또는 R 또는 N 또는 S 또는 K 또는 L임). 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 216의 서열은 N-말단 서열이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 219의 서열은 C-말단 서열이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 220의 서열은 C-말단 서열이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 221의 서열은 C-말단 서열이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 222의 서열은 C-말단 서열이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 223의 서열은 C-말단 서열이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57 내지 90, SEQ ID NO: 118 내지 151, 또는 SEQ ID NO: 213 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57 내지 90, SEQ ID NO: 118 내지 151, 또는 SEQ ID NO: 213 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 직접 반복부 서열은 다음 서열들 중 하나 이상을 포함한다: (a) X1X2TX3X4X5X6X7X8(SEQ ID NO: 224)(여기서, X1은 A 또는 C 또는 G이고, X2는 T 또는 C 또는 A이고, X3는 T 또는 G 또는 A이고, X4는 T 또는 G이고, X5는 T 또는 G 또는 A이고, X6는 G 또는 T 또는 A이고, X7은 T 또는 G 또는 A이고, X8은 A 또는 G 또는 T임)(예를 들어, ATTGTTGDA(SEQ ID NO: 225)); (b) X1X2X3X4X5X6X7X8X9(SEQ ID NO: 226)(여기서, X1은 T 또는 C 또는 A이고, X2는 T 또는 A 또는 G이고, X3는 T 또는 C 또는 A이고, X4는 T 또는 A이고, X5는 T 또는 A 또는 G이고, X6는 T 또는 A이고, X7은 A 또는 T이고, X8은 A 또는 G 또는 C 또는 T이고, X9은 G 또는 A 또는 C임)(예를 들어, TTTTWTARG (SEQ ID NO: 227)); 및 (c) X1X2X3AC(SEQ ID NO: 228)(여기서, X1은 A 또는 C 또는 G이고, X2는 C 또는 A이고, X3는 A 또는 C임)(예를 들어, ACAAC(SEQ ID NO: 229)). 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 224는 직접 반복부의 5' 말단에 근접한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 228는 직접 반복부의 3' 말단에 근접한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 여기서 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 여기서 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 인식할 수 있고, 여기서 PAM 서열은 5'-TNNT-3' 또는 5'-TNRT-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 여기서 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 60에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 여기서 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 60에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 인식할 수 있고, 여기서 PAM 서열은 5'-NTTN-3', 5'-NTTR-3'(예를 들어, 5'-TTTG-3') 또는 5'-NNR-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 여기서 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 213에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 여기서 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 213에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 인식할 수 있고, 여기서 PAM 서열은 5'-NTTN-3' 또는 5'-RTTR-3'(예를 들어, 5'-ATTG-3' 또는 5'-GTTA-3')로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 약 15 개 뉴클레오티드 내지 약 55 개 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 20 개 뉴클레오티드 내지 45 개 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, RNA 가이드는 선택적으로 tracrRNA 및/또는 조절자 RNA를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 시스템은 tracrRNA를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 시스템은 tracrRNA를 포함하지 않는다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 자가-가공이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 시스템은 조절자 RNA를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 표적 핵산은 DNA 분자이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 표적 핵산은 PAM 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 비-특이적 뉴클레아제 활성을 갖는다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 이중-가닥 절단 사건이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 단일-가닥 절단 사건이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 삽입 사건을 일으킨다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 결실 사건을 일으킨다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 세포 독성 또는 세포 사멸을 일으킨다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 표적 핵산을 편집하는 방법으로서, 본원에 기재된 시스템과 표적 핵산을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 표적 핵산의 발현을 변형시키는 방법으로서, 본원에 기재된 시스템과 표적 핵산을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 표적 핵산에서의 부위에서 페이로드 핵산의 삽입을 표적화하는 방법으로서, 본원에 기재된 시스템과 표적 핵산을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 표적 핵산의 부위로부터 페이로드 핵산의 절제를 표적화하는 방법으로서, 본원에 기재된 시스템과 표적 핵산을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 DNA 표적 핵산의 인식 시 단일-가닥 DNA를 비-특이적으로 분해하는 방법으로서, 본원에 기재된 시스템과 표적 핵산을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
본원에 제공된 임의의 시스템 또는 방법의 일부 구현예에서, 접촉은 직접 접촉 또는 간접 접촉을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 시스템 또는 방법의 일부 구현예에서, 간접 접촉은 RNA 가이드 및/또는 CRISPR-관련 단백질의 생성을 가능하게 하는 조건 하에 본원에 기재된 RNA 가이드 또는 CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 투여하는 것을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 시스템 또는 방법의 일부 구현예에서, 접촉은 생체내 접촉 또는 시험관내 접촉을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 시스템 또는 방법의 일부 구현예에서, 표적 핵산을 시스템과 접촉시키는 것은 CRISPR-관련 단백질 및 가이드 RNA가 표적 핵산에 도달하게 하는 조건 하에 시스템과 핵산을 포함하는 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 시스템 또는 방법의 일부 구현예에서, 시스템과 생체내 세포를 접촉시키는 것은 CRISPR-관련 단백질 및 가이드 RNA가 세포에 도달하거나 세포에서 생성되게 하는 조건 하에 세포를 포함하는 대상체에 시스템을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 (a) 표적 핵산의 표적화 및 편집; (b) 핵산의 인식 시 단일-가닥 핵산의 비-특이적 분해; (c) 이중-가닥 표적의 스페이서 상보적 가닥의 인식 시 이중-가닥 표적의 비-스페이서 상보적 가닥의 표적화 및 닉킹; (d) 이중-가닥 표적 핵산의 표적화 및 절단; (e) 샘플 내 표적 핵산의 검출; (f) 이중-가닥 핵산의 특이적 편집; (g) 이중-가닥 핵산의 염기 편집; (h) 세포에서 유전자형-특이적 또는 전사-상태-특이적 세포 사멸 또는 휴면 유도; (i) 이중-가닥 핵산 표적 내 인델 형성; (j) 이중-가닥 핵산 표적 내 서열 삽입; 또는 (k) 이중-가닥 핵산 표적 내 서열 결실 또는 역위의, 시험관내 또는 생체외 방법에서 사용하기 위한 본원에 제공된 시스템을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 (a) CRISPR-연관 단백질(여기서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 56 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함함); 및 (b) 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 직접 반복부 서열 및 스페이서 서열을 포함하는 RNA 가이드(또는 RNA 가이드를 인코딩하는 핵산)의 형질감염을 포함하는, 포유류 세포에서 표적 핵산으로의 삽입 또는 결실을 도입하는 방법으로서, CRISPR-연관 단백질은 RNA 가이드에 결합할 수 있고; CRISPR-연관 단백질 및 RNA 가이드에 의한 표적 핵산의 인식은 표적 핵산의 변형을 일으키는, 방법을 제공한다.
본원에 제공된 임의의 방법의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 직접 반복부는 SEQ ID NO: 60에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 직접 반복부는 SEQ ID NO: 60에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 표적 핵산은 PAM 서열에 인접하고, PAM 서열은 5'-NTTN-3', 5'-NTTR-3'(예를 들어, 5'-TTTG-3'), 또는 5'-NNR-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, 여기서 "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G이다.
본원에 제공된 임의의 방법의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 직접 반복부는 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 213에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 직접 반복부는 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 213에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 표적 핵산은 PAM 서열에 인접하고, PAM 서열은 5'-NTTN-3' 또는 5'-RTTR-3'(예를 들어, 5'-ATTG-3' 또는 5'-GTTA-3')로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, 여기서 "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G이다.
본원에 제공된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 형질전환은 일시적 형질전환이다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 (a) CRISPR-연관 단백질 또는 CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산, 및 (b) 직접 반복부 서열 및 스페이서 서열을 포함하는 RNA 가이드를 포함하는 조성물로서; CRISPR-연관 단백질은 다음 아미노산 서열들 중 하나 이상을 포함하고: (i) PX1X2X3X4F(SEQ ID NO: 216)(여기서, X1은 L 또는 M 또는 I 또는 C 또는 F이고, X2는 Y 또는 W 또는 F이고, X3는 K 또는 T 또는 C 또는 R 또는 W 또는 Y 또는 H 또는 V이고, X4는 I 또는 L 또는 M임); (ii) RX1X2X3L(SEQ ID NO: 217)(여기서, X1은 I 또는 L 또는 M 또는 Y 또는 T 또는 F이고, X2는 R 또는 Q 또는 K 또는 E 또는 S 또는 T이고, X3는 L 또는 I 또는 T 또는 C 또는 M 또는 K임); (iii) NX1YX2(SEQ ID NO: 218)(여기서, X1은 I 또는 L 또는 F이고, X2는 K 또는 R 또는 V 또는 E임); (iv) KX1X2X3FAX4X5KD(SEQ ID NO: 219)(여기서, X1은 T 또는 I 또는 N 또는 A 또는 S 또는 F 또는 V이고, X2는 I 또는 V 또는 L 또는 S이고, X3는 H 또는 S 또는 G 또는 R이고, X4는 D 또는 S 또는 E이고, X5는 I 또는 V 또는 M 또는 T 또는 N임); (v) LX1NX2 (SEQ ID NO: 220)(여기서, X1은 G 또는 S 또는 C 또는 T이고, X2는 N 또는 Y 또는 K 또는 S임); (vi) PX1X2X3X4SQX5DS(SEQ ID NO: 221)(여기서, X1은 S 또는 P 또는 A이고, X2는 Y 또는 S 또는 A 또는 P 또는 E 또는 Y 또는 Q 또는 N이고, X3는 F 또는 Y 또는 H이고, X4는 T 또는 S이고, X5는 M 또는 T 또는 I임); (vii) KX1X2VRX3X4QEX5H(SEQ ID NO: 222)(여기서, X1은 N 또는 K 또는 W 또는 R 또는 E 또는 T 또는 Y이고, X2는 M 또는 R 또는 L 또는 S 또는 K 또는 V 또는 E 또는 T 또는 I 또는 D이고, X3는 L 또는 R 또는 H 또는 P 또는 T 또는 K 또는 Q 또는 P 또는 S 또는 A이고, X4는 G 또는 Q 또는 N 또는 R 또는 K 또는 E 또는 I 또는 T 또는 S 또는 C이고, X5는 R 또는 W 또는 Y 또는 K 또는 T 또는 F 또는 S 또는 Q임); 및 (viii) X1NGX2X3X4DX5NX6X7X8N(SEQ ID NO: 223)(여기서, X1은 I 또는 K 또는 V 또는 L이고, X2는 L 또는 M이고, X3는 N 또는 H 또는 P이고, X4는 A 또는 S 또는 C이고, X5는 V 또는 Y 또는 I 또는 F 또는 T 또는 N이고, X6는 A 또는 S이고, X7은 S 또는 A 또는 P이고, X8은 M 또는 C 또는 L 또는 R 또는 N 또는 S 또는 K 또는 L임); CRISPR-연관 단백질은 RNA 가이드에 결합하고 스페이서 서열에 상보적인 표적 핵산 서열을 변형시킬 수 있는, 조성물을 제공한다.
본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 직접 반복부 서열은 다음 서열들 중 하나 이상을 포함한다: (a) X1X2TX3X4X5X6X7X8(SEQ ID NO: 224)(여기서, X1은 A 또는 C 또는 G이고, X2는 T 또는 C 또는 A이고, X3는 T 또는 G 또는 A이고, X4는 T 또는 G이고, X5는 T 또는 G 또는 A이고, X6는 G 또는 T 또는 A이고, X7은 T 또는 G 또는 A이고, X8은 A 또는 G 또는 T임)(예를 들어, ATTGTTGDA(SEQ ID NO: 225)); (b) X1X2X3X4X5X6X7X8X9(SEQ ID NO: 226)(여기서, X1은 T 또는 C 또는 A이고, X2는 T 또는 A 또는 G이고, X3는 T 또는 C 또는 A이고, X4는 T 또는 A이고, X5는 T 또는 A 또는 G이고, X6는 T 또는 A이고, X7는 A 또는 T이고, X8은 A 또는 G 또는 C 또는 T이고, X9은 G 또는 A 또는 C임)(예를 들어, TTTTWTARG(SEQ ID NO: 227)); 및 (c) X1X2X3AC(SEQ ID NO: 228)(여기서, X1은 A 또는 C 또는 G이고, X2는 C 또는 A이고, X3는 A 또는 C임)(예를 들어, ACAAC(SEQ ID NO: 229)). 본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 224는 직접 반복부의 5' 말단에 근접한다. 본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 228는 직접 반복부의 3' 말단에 근접한다.
본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 적어도 1 개(예를 들어, 1 개, 2 개, 또는 3 개)의 RuvC 도메인 또는 적어도 1 개의 스플릿 RuvC 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, RNA 가이드의 스페이서 서열은 약 15 개 뉴클레오티드 내지 약 55 개 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, RNA 가이드의 스페이서 서열은 20 개 뉴클레오티드 내지 45 개 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 촉매 잔기(예를 들어, 아스파트산 또는 글루탐산)를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 표적 핵산을 절단한다. 본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 펩티드 태그, 형광 단백질, 염기-편집 도메인, DNA 메틸화 도메인, 히스톤 잔기 변형 도메인, 국재화 인자, 전사 조절 인자, 광-개폐 제어 인자, 화학적 유도성 인자, 또는 염색질 시각화 인자를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산은 세포, 예를 들어, 진핵 세포, 예를 들어, 포유류 세포, 예를 들어, 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산은 벡터에 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 벡터, 또는 단순 포진 벡터를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 표적 핵산은 DNA 분자이다. 본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 표적 핵산은 PAM 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 비-특이적 뉴클레아제 활성을 갖는다.
본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질 및 RNA 가이드에 의한 표적 핵산의 인식은 표적 핵산의 변형을 일으킨다. 본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 이중-가닥 절단 사건이다. 본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 단일-가닥 절단 사건이다. 본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 삽입 사건을 일으킨다. 본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 결실 사건을 일으킨다. 본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 표적 핵산의 변형은 세포 독성 또는 세포 사멸을 일으킨다.
본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 시스템은 도너 주형 핵산을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 도너 주형 핵산은 DNA 분자이다. 본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 도너 주형 핵산은 RNA 분자이다.
본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, RNA 가이드는 선택적으로 tracrRNA를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 시스템은 tracrRNA를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 시스템은 tracrRNA를 포함하지 않는다. 본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 자가-가공이다.
본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 시스템은 나노입자, 리포좀, 엑소좀, 미세소포체, 또는 유전자-총을 포함하는 전달 조성물에 존재한다.
본원에 기재된 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 조성물은 세포 내에 있다. 일부 구현예에서, 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 포유류 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 원핵 세포이다.
본원에 기재된 이펙터는 1) 신규한 핵산 편집 성질 및 제어 메커니즘, 2) 전달 전략에서 더 큰 다양성을 위한 더 작은 크기, 3) 세포 사멸과 같은 유전자형 촉발 세포 과정, 및 4) 프로그래밍 가능한 RNA-가이드 DNA 삽입, 절제 및 동원, 및 5) 비-인간 공생원을 통한 기존 면역의 분화된 프로파일을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 추가 특징들을 제공한다. 예를 들어, 실시예 1, 실시예 4, 및 실시예 5 및 도 1 내지 도 3 및 도 5 내지 도 11d를 참조한다. 게놈 및 에피게놈 조작을 위한 기법의 툴박스에 본원에 기재된 신규한 DNA-표적화 시스템을 추가하면, 특정 프로그래밍된 섭동에 대한 광범위한 적용이 가능해진다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.
도면은 CLUST.091979로 지칭되는 단백질 클러스터의 분석 결과를 나타내는 일련의 개략도이다.
도 1a, 도 1b, 도 1c, 도 1d, 도 1e, 도 1f, 도 1g, 도 1h, 도 1i, 도 1j, 도 1k, 및 도 1l은 SEQ ID NO: 1 내지 4, 14, 15, 17 내지 19, 21 내지 25, 27 내지 33, 35 내지 49, 51 내지 56의 이펙터의 정렬을 총괄적으로 나타낸 것이다.
도 2는 표 6에 나타낸 서열의 컨센서스 서열에 기초한 CLUST.091979 이펙터의 RuvC 도메인을 나타내는 개략도이다.
도 3은 SEQ ID NO: 57, 58, 60, 62, 63, 70, 72 내지 74, 76, 77, 80, 83, 84, 86 내지 88, 90, 128, 130, 139, 및 213의 직접 반복부 서열의 정렬을 나타낸 것이다. 컨센서스 서열(SEQ ID NO: 230)은 정렬의 상부에 나타나 있다.
도 4a는 실시예 4에 기재된 생체내 음성 선별 스크리닝 검정의 구성 요소의 개략도이다. 2 개의 DR이 측접하고 J23119에 의해 발현되는 pACYC184 또는 이. 콜라이(E. coli) 필수 유전자의 둘 모두의 가닥으로부터 균일하게 샘플링된 비-대표적 스페이서를 포함하는 CRISPR 어레이 라이브러리가 설계되었다.
도 4b는 실시예 4에 기재된 생체내 음성 선별 스크리닝 흐름도의 개략도이다. CRISPR 어레이 라이브러리는 이펙터 플라스미드로 클로닝되었다. 이펙터 플라스미드 및 비-코딩 플라스미드는 이. 콜라이로 형질전환되고, 이어서 pACYC184 또는 이. 콜라이 필수 유전자로부터의 전사체에 대한 간섭을 부여하는 CRISPR 어레이의 음성 선별에 대한 파생물로 형질전환되었다. 이펙터 플라스미드의 표적화된 시퀀싱은 고갈된 CRISPR 어레이를 동정하는 데 사용되었다. 성숙한 crRNA 및 잠재적인 tracrRNA 요건을 동정하기 위해 작은 RNAseq가 추가로 수행되었다.
도 5는 비-코딩 서열이 있는, pACYC184를 표적화하는 스페이서 및 직접 반복부 전사 방향에 대한 조작된 조성물의 고갈 활성도를 나타내는 CLUST.091979 AUXO013988882(SEQ ID NO: 1에 기재된 이펙터)에 대한 그래프이다. "정" 방향(5'-ACTA…AACT-[스페이서]-3')에서 직접 반복부 및 "역" 방향(5'-AGTT…TAGT-[스페이서]-3')에서 직접 반복부로의 고갈 정도가 도시되어 있다.
도 6a는 pACYC184 플라스미드 상의 위치에 따른, 비-코딩 서열이 있는 CLUST.091979 AUXO013988882에 대한 고갈 및 비-고갈 표적의 밀도를 나타내는 그래프 도식이다. 도 6b는 이. 콜라이 균주, 이. 클로니(E. Cloni) 상의 위치에 따른, 비-코딩 서열이 있는 CLUST.091979 AUXO013988882에 대한 고갈 및 비-고갈 표적의 밀도를 나타내는 그래프 도식이다. 상부 가닥 및 하부 가닥의 표적은 주석이 달린 유전자의 방향과 관련하여 별도로 나타나 있다. 밴드의 크기는 고갈 정도를 지시하며, 더 밝은 밴드는 3의 히트 임계치에 가깝다. 구배는 상대 전사체 존재비를 보여주는 RNA 시퀀싱의 히트맵이다.
도 7은 CLUST.091979 AUXO013988882(비-코딩 서열 있음)에 대한 PAM 서열의 예측으로서 이. 클로니에서 고갈된 표적이 측접한 서열의 WebLogo이다.
도 8은 비-코딩 서열이 있는 pACYC184를 표적화하는 스페이서 및 직접 반복부 전사 방향에 대한 조작된 조성물의 고갈 활성도를 나타내는 CLUST.091979 SRR3181151(SEQ ID NO: 4에 기재된 이펙터)에 대한 그래프이다. "정" 방향(5'-GTTG…CAGG-[스페이서]-3')에서 직접 반복부 및 "역" 방향(5'-CCTG…CAAC-[스페이서]-3')에서 직접 반복부로의 고갈 정도가 나타나 있다.
도 9a는 pACYC184 플라스미드 상의 위치에 따른, 비-코딩 서열이 있는 CLUST.091979 SRR3181151에 대한 고갈 및 비-고갈 표적의 밀도를 나타내는 그래프 도식이다. 도 9b는 이. 콜라이 균주, 이. 클로니 상의 위치에 따른, 비-코딩 서열이 있는 CLUST.091979 SRR3181151에 대한 고갈 및 비-고갈 표적의 밀도를 나타내는 그래프 도식이다. 상부 가닥 및 하부 가닥의 표적은 주석이 달린 유전자의 방향과 관련하여 별도로 나타나 있다. 밴드의 크기는 고갈도를 지시하며, 여기서 밴드가 밝을수록 3의 히트 임계치에 가깝다. 구배는 상대 전사체 존재비를 보여주는 RNA 시퀀싱의 히트맵이다.
도 10은 CLUST.091979 SRR3181151(비-코딩 서열 있음)에 대한 PAM 서열의 예측으로서 이. 클로니에서 고갈된 표적이 측접한 서열의 WebLogo이다.
도 11a는 HEK293 세포에서 SEQ ID NO: 206의 AAVS1 표적 유전자좌 및 SEQ ID NO: 208의 VEGFA 표적 유전자좌에서 SEQ ID NO: 4의 이펙터에 의해 유도된 인델을 나타낸다. 도 11b는 HEK293 세포에서 SEQ ID NO: 253, 255, 257, 259, 및 275의 AAVS1 표적 유전자좌, SEQ ID NO: 263, 265, 267, 269, 271, 273, 및 277의 VEGFA 표적 유전자좌, 및 SEQ ID NO: 261의 EMX1 표적 유전자좌에서 SEQ ID NO: 4의 이펙터에 의해 유도된 인델을 나타낸다. 도 11c는 HEK293 세포에서 SEQ ID NO: 210의 AAVS1 표적 유전자좌, SEQ ID NO: 212의 AAVS1 표적 유전자좌, 및 SEQ ID NO: 215의 VEGFA 표적 유전자좌에서 SEQ ID NO: 10의 이펙터에 의해 유도된 인델을 나타낸다. 도 11d는 HEK293 세포에서 SEQ ID NO: 279, 281, 285, 및 287의 AAVS1 표적 유전자좌, SEQ ID NO: 283의 VEGFA 표적 유전자좌, 및 SEQ ID NO: 289의 EMX1 표적 유전자좌에서 SEQ ID NO: 10의 이펙터에 의해 유도된 인델을 나타낸다.
자연적으로 다양한 CRISPR-Cas 시스템은 프로그래밍 가능한 생명공학에 이용될 수 있는 광범위한 활성 메커니즘 및 기능적 요소를 포함한다. 본질적으로, 이들 시스템은 자기-표적화를 피하기 위해 자기 대 비-자기 차별을 제공하면서 외래 DNA 및 바이러스에 대한 효율적인 방어를 가능하게 한다. 조작된 환경에서, 이들 시스템은 분자 기술의 다양한 툴박스를 제공하고, 표적화 공간의 경계를 규정한다. 본원에 기재된 방법은 RNA-프로그래밍 가능한 핵산 조작의 능력을 확장시키는 단일 서브유닛 클래스 2 이펙터 시스템 내에서 추가적인 메커니즘 및 매개변수를 발견하는 데 사용되었다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 후술된다. 본원에서 언급되는 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고문헌은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 본 명세서가 정의를 포함하여 우선될 것이다. 또한, 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 제한하려고 의도된 것이 아니다. 본 출원인은 특허법의 표준 관행에 따라 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 또는 "이루어진"이라는 연결어를 사용하여 임의의 개시된 발명을 대안적으로 청구할 권리를 보유한다.
본원에서 사용되는 단수 형태인 부정관사 및 정관사는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 예를 들어, "핵산"에 대한 언급은 하나 이상의 핵산을 의미한다.
"바람직하게", "적합하게", "일반적으로", 및 "전형적으로"와 같은 용어는 청구된 발명의 범위를 제한하거나 특정 특징이 청구된 발명의 구조 또는 기능에 중대하거나, 필수적이거나, 심지어 중요하다는 것을 암시하기 위해 본원에서 사용된 것이 아님이 주지된다. 오히려, 이들 용어는 단지 본 발명의 특정 구현예에서 사용될 수 있거나 사용될 수 없는 대안적인 또는 추가적인 특징을 강조하기 위해 의도된 것이다.
본 발명을 기술하고 정의할 목적으로, 용어 "실질적으로"는 임의의 정량적 비교, 값, 측정, 또는 다른 표현에 기인할 수 있는 고유한 불확실성 정도를 나타내기 위해 본원에서 사용된다는 점이 주지된다. 용어 "실질적으로"는 또한 정량적 표현이 쟁점 주제의 기본 기능의 변화를 초래하지 않으면서 명시된 참조로부터 달라질 수 있는 정도를 나타내기 위해 본원에서 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "CRISPR-Cas 시스템"은 CRISPR 이펙터를 인코딩하는 서열을 비롯하여 CRISPR 이펙터, RNA 가이드, 및 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사체의 발현에 관여하거나 이의 활성을 유도하는 핵산 및/또는 단백질을 지칭한다.
본원에서 상호교환 가능하게 사용되는 용어 "CRISPR-연관 단백질", "CRISPR-Cas 이펙터", "CRISPR 이펙터", "이펙터", "이펙터 단백질", "CRISPR 효소" 등은 효소 활성을 수행하거나 RNA 가이드에 의해 지정된 핵산에 대한 표적 부위에 결합하는 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터는 엔도뉴클레아제 활성, 닉카제 활성, 및/또는 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "RNA 가이드", "가이드 RNA", "gRNA", 및 "가이드 서열"은 DNA 및/또는 RNA와 같이 표적 핵산에 대한 본원에 기재된 이펙터의 표적화를 용이하게 하는 임의의 RNA 분자를 지칭한다. 예시적인 "RNA 가이드"는 crRNA, 뿐만 아니라 tracrRNA 및/또는 조절자 RNA에 혼성화되거나 융합되는 crRNA를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 단일 RNA 분자에 융합된 또는 개별 RNA 분자로서의 crRNA와 tracrRNA 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 단일 RNA 분자에 융합된 또는 개별 RNA 분자로서의 crRNA 및 조절자 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 단일 RNA 분자에 융합된 또는 개별 RNA 분자로서의 crRNA, tracrRNA 및 조절자 RNA를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "CRISPR 이펙터 복합체", "이펙터 복합체" 또는 "감시 복합체"는 CRISPR 이펙터 및 RNA 가이드를 함유하는 복합체를 지칭한다. CRISPR 이펙터 복합체는 하나 이상의 보조 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 보조 단백질은 비-촉매 및/또는 비-표적 결합일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "CRISPR RNA" 및 "crRNA"는 핵산 서열을 특이적으로 인식하기 위해 CRISPR 이펙터에 의해 사용되는 가이드 서열을 포함하는 RNA 분자를 지칭한다. crRNA "스페이서" 서열은 핵산 표적 서열에 상보적이고 부분적으로 또는 완전히 결합할 수 있다. crRNA는 tracrRNA에 혼성화하는 서열을 포함할 수 있다. 다음으로, crRNA : tracrRNA 이중체는 CRISPR 이펙터에 결합할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "pre-crRNA"는 DR-스페이서-DR 서열을 포함하는 미가공 RNA 분자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "성숙 crRNA"는 가공된 형태의 pre-crRNA를 지칭하고; 성숙 crRNA는 DR-스페이서 서열을 포함할 수 있고, 여기서 DR은 pre-crRNA의 절두된 형태의 DR이고/이거나 스페이서는 pre-crRNA의 절두된 형태의 스페이서이다.
본원에서 사용되는 용어 "전사-활성화 crRNA" 또는 "tracrRNA"는 특정 표적 핵산에 결합하기 위해 CRISPR 이펙터에 필요한 구조 및/또는 서열 모티프를 형성하는 서열을 포함하는 RNA 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "CRISPR 어레이"는 제1 CRISPR 반복부의 첫 뉴클레오티드로 시작하여 마지막(말단) CRISPR 반복부의 마지막 뉴클레오티드로 종결되는, CRISPR 반복부 및 스페이서를 포함하는 핵산(예를 들어, DNA) 세그먼트를 지칭한다. 전형적으로, CRISPR 어레이에서 각각의 스페이서는 두 반복부 사이에 위치한다. 본원에서 사용되는 용어 "CRISPR 반복부", "CRISPR 직접 반복부" 및 "직접 반복부"는 CRISPR 어레이 내에서 서열 변이를 거의 또는 전혀 나타내지 않는 다수의 짧은 직접 반복부 서열을 지칭한다.
본원에 기재된 바와 같은 용어 "조절자 RNA"는 CRISPR 이펙터 또는 CRISPR 이펙터를 포함하는 핵단백질 복합체의 활성을 조절(예를 들어, 증가 또는 감소)하는 임의의 RNA 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 조절자 RNA는 CRISPR 이펙터 또는 CRISPR 이펙터를 포함하는 핵단백질 복합체의 뉴클레아제 활성을 조절한다.
본원에서 사용되는 용어 "표적 핵산"은 RNA 가이드에서 스페이서의 전체 또는 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 지칭한다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 비-코딩 영역(예를 들어, 프로모터)을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 단일-가닥이다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 이중-가닥이다. 본원에서 사용되는 "전사-활성 부위"는 활성적으로 번역되는 핵산 서열 내 부위를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "프로토스페이서 인접 모티프" 또는 "PAM"은 이펙터 및 RNA 가이드를 포함하는 복합체가 결합하는 표적 서열에 인접한 DNA 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 효소 활성을 위해서는 PAM이 필요하다. 본원에서 사용되는 용어 "인접한"은 복합체의 RNA 가이드가 PAM에 바로 인접한 표적 서열과 특이적으로 결합하거나, 상호 작용하거나, 회합하는 경우를 포함한다. 그러한 경우, 표적 서열과 PAM 사이에는 뉴클레오티드가 존재하지 않는다. 용어 "인접한"은 또한 표적화 모이어티가 결합하는 표적 서열과 PAM 사이에 소수(예를 들어, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개)의 뉴클레오티드가 있는 경우를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "PAM 서열을 인식하는"은 CRISPR-연관 단백질 및 crRNA를 포함하는 복합체가 표적 핵산에 결합하는 것을 지칭하며, 여기서 표적 핵산은 PAM 서열에 인접하다.
본원에서 사용되는 용어 "활성화된 CRISPR 복합체", "활성화된 CRISPR 복합체", 및 "활성화된 복합체"는 표적 핵산을 변형시킬 수 있는 CRISPR 이펙터 복합체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 활성화된 CRISPR 복합체는 표적 핵산에 대한 활성화된 CRISPR 복합체의 결합 후에 표적 핵산을 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 활성화된 CRISPR 복합체의 표적 핵산에의 결합은 부가적인 절단 사건, 예컨대, 부수적 절단을 초래한다.
본원에서 사용되는 용어 "절단 사건"은 DNA 및/또는 RNA와 같은 핵산 내 파손을 지칭한다. 일부 구현예에서, 절단 사건은 본원에 기재된 CRISPR 시스템의 뉴클레아제에 의해 생성된 표적 핵산 내 파손을 지칭한다. 일부 구현예에서, 절단 사건은 이중-가닥 DNA 파손이다. 일부 구현예에서, 절단 사건은 단일-가닥 DNA 파손이다. 일부 구현예에서, 절단 사건은 부수적 핵산 내 파손을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "부수적 핵산"은 활성화된 CRISPR 복합체에 의해 비-특이적으로 절단되는 핵산 기질을 지칭한다. CRISPR 이펙터와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "부수적 DNase 활성"은 활성화된 CRISPR 복합체의 비-특이적 DNase 활성을 지칭한다. CRISPR 이펙터와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "부수적 RNase 활성"은 활성화된 CRISPR 복합체의 비-특이적 RNase 활성을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "도너 주형 핵산"은 본원에 기재된 CRISPR 이펙터가 변형된 표적 핵산을 갖은 후 표적 서열 또는 표적-근위 서열에 주형화된 변화를 일으키는 데 사용될 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 도너 주형 핵산은 이중-가닥 핵산이다. 일부 구현예에서, 도너 주형 핵산은 단일-가닥 핵산이다. 일부 구현예에서, 도너 주형 핵산은 선형이다. 일부 구현예에서, 도너 주형 핵산은 원형이다(예를 들어, 플라스미드). 일부 구현예에서, 도너 주형 핵산은 외인성 핵산 분자이다. 일부 구현예에서, 도너 주형 핵산은 내인성 핵산 분자(예를 들어, 염색체)이다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"은 DNA, RNA, 이들의 유도체, 또는 이들의 조합을 포함하는 핵산을 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 방법은 본 발명에 따른 유전자 발현 작제물 및 재조합 세포를 구축하기 위해 사용될 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 생체내 재조합 기법, 및 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기법을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Maniatis et al., 1989, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Ausubel et al., 1989, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York, and PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., 1990, Academic Press, San Diego, Calif.)]에 기재된 바와 같은 기법을 참조한다.
용어 "유전적 변형" 또는 "유전적 조작"은 광범위하게 세포의 게놈 또는 핵산의 조작을 지칭한다. 마찬가지로, 용어 "유전적으로 조작된" 및 "조작된"은 조작된 게놈 또는 핵산을 포함하는 세포를 지칭한다. 유전적 변형의 방법은, 예를 들어, 이종 유전자 발현, 유전자 또는 프로모터 삽입 또는 결실, 핵산 돌연변이, 변경된 유전자 발현 또는 불활성화, 효소 조작, 유도 진화, 지식-기반 설계, 무작위 돌연변이유발법, 유전자 셔플링, 및 코돈 최적화를 포함한다.
용어 "재조합"은 핵산, 단백질 또는 세포가 유전적 변형, 조작 또는 재조합의 산물임을 지시한다. 일반적으로, 용어 "재조합"은 다중 공급원으로부터 유래된 유전 물질을 함유하거나 이에 의해 인코딩되는 핵산, 단백질, 또는 세포를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "재조합"은 또한 내인성 핵산 또는 단백질의 돌연변이된 형태를 포함하여, 돌연변이된 핵산 또는 단백질을 포함하는 세포를 기술하는 데 사용될 수 있다. 용어 "재조합 세포" 및 "재조합 숙주"는 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 본원에 개시된 CRISPR 이펙터를 포함한다. CRISPR 이펙터는 재조합 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 세포는 RNA 가이드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 세포의 RNA 가이드는 tracrRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 세포는 조절자 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 원핵 세포, 예컨대, 이. 콜라이 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 진핵 세포, 예컨대, 인간 세포를 비롯한 포유류 세포이다.
CLUST.091979의 동정
본 출원은 본원에서 "CLUST.091979"로 지칭되는 신규한 단백질 패밀리의 동정, 조작 및 용도에 관한 것이다. 도 2에 도시된 바와 같이, CLUST.091979의 단백질은 RuvC 도메인(RuvC I, RuvC II, 및 RuvC III로 표시됨)을 포함한다. 표 5에 도시된 바와 같이, CLUST.091979의 이펙터는 약 700 개 아미노산 내지 약 800 개 아미노산 크기의 범위이다. 따라서, CLUST.091979의 이펙터는 하기 나타낸 바와 같이 당업계에 공지된 이펙터보다 작다. 예를 들어, 표 1을 참조한다.
[표 1]
공지된 CRISPR-Cas 시스템 이펙터의 크기.
Figure pct00001
CLUST.091979의 이펙터는 특정 다른 특징과 강한 동시-발생 패턴을 나타내는 단백질을 검색하고 동정하기 위한 계산 방법 및 알고리즘을 사용하여 동정되었다. 특정 구현예에서, 이들 계산 방법은 CRISPR 어레이에 매우 근접하여 동시-발생 단백질을 동정하는 것과 관련되었다. 본원에 개시된 방법은 또한 비-코딩과 단백질-코딩 둘 모두(예를 들어, 박테리아 유전자좌 또는 CRISPR Cas1 단백질의 비-코딩 영역에서 파지 서열의 단편)에서 다른 특징에 매우 근접하여 자연 발생하는 단백질을 동정하는 데 유용하다. 본원에 기재된 방법 및 계산은 하나 이상의 계산 장치에서 수행될 수 있음이 이해된다.
게놈 서열의 세트는 게놈 또는 메타게놈 데이터베이스로부터 얻어졌다. 데이터베이스는 짧은 판독, 또는 콘티그 수준 데이터, 또는 조립된 스캐폴드, 또는 유기체의 완전한 게놈 서열을 포함하였다. 마찬가지로, 데이터베이스는 원핵 유기체 또는 진핵 유기체로부터의 게놈 서열 데이터를 포함할 수 있거나, 메타게놈 환경 샘플로부터의 데이터를 포함할 수 있다. 데이터베이스 리포지토리의 예는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) RefSeq, NCBI GenBank, NCBI 전체 게놈 샷건(Whole Genome Shotgun; WGS), 및 공동 게놈 연구소(Joint Genome Institute; JGI) 통합 미생물 게놈(Integrated Microbial Genome; IMG)을 포함한다.
일부 구현예에서, 지정된 최소 길이의 게놈 서열 데이터를 선택하기 위해 최소 크기 요건이 부과된다. 특정의 예시적인 구현예에서, 최소 콘티그 길이는 100 개 뉴클레오티드, 500 nt, 1 kb, 1.5 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 10 kb, 20 kb, 40 kb, 또는 50 kb일 수 있다.
일부 구현예에서, 공지되거나 예측된 단백질은 완전한 또는 선택된 게놈 서열 데이터 세트로부터 추출된다. 일부 구현예에서, 공지되거나 예측된 단백질은 소스 데이터베이스에 의해 제공되는 주석의 코딩 서열(CDS) 추출로부터 취해진다. 일부 구현예에서, 예측된 단백질은 뉴클레오티드 서열로부터 단백질을 동정하기 위해 계산 방법을 적용함으로써 결정된다. 일부 구현예에서, GeneMark Suite는 게놈 서열로부터 단백질을 예측하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, Prodigal은 게놈 서열로부터 단백질을 예측하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 다중 단백질 예측 알고리즘은 중복제거된 얻어진 단백질 세트와 함께 동일한 서열 데이터 세트에 걸쳐 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR 어레이는 게놈 서열 데이터로부터 동정된다. 일부 구현예에서, PILER-CR은 CRISPR 어레이를 동정하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, CRISPR 어레이를 동정하기 위해 CRISPR 인식 툴(CRT)이 사용된다. 일부 구현예에서, CRISPR 어레이는 최소 횟수(예를 들어, 2 회, 3 회 또는 4 회) 반복된 뉴클레오티드 모티프를 동정하는 휴리스틱에 의해 동정되며, 여기서 반복되는 모티프의 연속 발생 사이의 간격은 지정된 길이(예를 들어, 50 개, 100 개, 또는 150 개 뉴클레오티드)를 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 다중 CRISPR 어레이 동정 툴은 중복제거된 얻어진 CRISPR 어레이 세트와 함께 동일한 서열 데이터 세트에 걸쳐 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR 어레이에 매우 근접한 단백질(본원에서 "CRISPR-근위 단백질 클러스터"로 지칭됨)이 동정된다. 일부 구현예에서, 근접성은 뉴클레오티드 거리로 규정되며, 20 kb, 15 kb 또는 5 kb 이내 일 수 있다. 일부 구현예에서, 근접성은 단백질과 CRISPR 어레이 사이의 개방형 해독 틀(ORF)의 수로 규정되고, 특정의 예시적인 거리는 10 개, 5 개, 4 개, 3 개, 2 개, 1 개, 또는 0 개 ORF일 수 있다. 그 후에, CRISPR 어레이에 매우 근접한 것으로 동정된 단백질은 상동성 단백질의 클러스터로 그룹화된다. 일부 구현예에서, 블라스트클러스트는 CRISPR-근위 단백질 클러스터를 형성하는 데 사용된다. 특정의 다른 구현예에서, mmseqs2는 CRISPR-근위 단백질 클러스터를 형성하는 데 사용된다.
CRISPR-근위 단백질 클러스터의 구성원들 사이에 강한 공동-발생 패턴을 확립하기 위해, 단백질 클러스터의 각 구성원의 BLAST 검색이 이전에 컴파일링된 완전한 공지된 및 예측된 단백질 세트에 대해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, UBLAST 또는 mmseqs2는 유사한 단백질을 검색하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 검색은 패밀리 내의 대표적인 단백질 서브세트에 대해서만 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR-근위 단백질 클러스터는 동시-발생을 결정하기 위해 메트릭에 의해 순위가 매겨지거나 필터링된다. 하나의 예시적인 메트릭은 특정 E 값 임계치까지의 BLAST 매칭 수에 대한 단백질 클러스터 내 요소 수의 비율이다. 일부 구현예에서, 일정한 E 값 임계치가 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, E 값 임계치는 단백질 클러스터의 가장 먼 구성원에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질의 글로벌 세트는 클러스터링되고 공동-발생 메트릭은 함유하는 글로벌 클러스터(들)의 요소 수에 대한 CRISPR-근위 단백질 클러스터의 요소 수의 비율이다.
일부 구현예에서, 수동 검토 프로세스는 클러스터에서 단백질의 자연 발생 유전자좌 구조에 기초하여 조작된 시스템의 잠재적인 기능 및 최소 구성 요소 세트를 평가하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 단백질 클러스터의 그래프 표현은 수동 검토에 도움이 될 수 있으며, 쌍별 서열 유사성, 계통수, 근원 유기체/환경, 예측된 기능 도메인, 및 유전자좌 구조의 그래프 도식을 포함하는 정보를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자좌 구조의 그래프 도식은 높은 표현을 갖는 인근 단백질 패밀리에 대해 필터링할 수 있다. 일부 구현예에서, 표현은 함유하는 전체 클러스터(들)의 크기(들)에 대한 관련된 주변 단백질의 수의 비율에 의해 계산될 수 있다. 특정의 예시적인 구현예에서, 단백질 클러스터의 그래프 표현은 자연 발생 유전자좌의 CRISPR 어레이 구조의 도식을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 클러스터의 그래프 표현은 추정 CRISPR 어레이의 길이 대비 보존된 직접 반복부의 수 또는 추정 CRISPR 어레이의 길이 대비 고유한 스페이서 서열의 수에 대한 도식을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 클러스터의 그래프 표현은 새로운 CRISPR-Cas 시스템을 예측하고 이들의 구성 요소를 동정하는 추정 이펙터와 CRISPR 어레이의 동시-발생에 대한 다양한 메트릭의 도식을 함유할 수 있다.
CLUST.091979의 풀링-스크리닝
본원에서 동정된 조작된 CLUST.091979 CRISPR-Cas 시스템의 활성, 메커니즘, 및 기능적 매개변수를 효율적으로 검증하기 위해, 이. 콜라이에서 풀링-스크리닝 접근법을 실시예 4에 기재된 바와 같이 사용하였다. 첫째로, CLUST.091979 CRISPR-Cas 시스템의 보존된 단백질 및 비코딩 요소의 계산적 동정으로부터, DNA 합성 및 분자 클로닝이 일 구현예에서 pET-28a+ 백본을 기반으로 한 단일 인공 발현 벡터로 개별 구성 요소를 조립하는 데 사용되었다. 두 번째 구현예에서, 이펙터 및 비코딩 요소는 mRNA 전사체에 전사되고, 상이한 리보솜 결합 부위는 개별 이펙터를 번역하는 데 사용된다.
둘째로, 천연 crRNA 및 표적화 스페이서는 제2 플라스미드인 pACYC184를 표적화하는 비-천연 스페이서를 함유하는 미가공 crRNA의 라이브러리로 대체되었다. 이러한 crRNA 라이브러리는 이펙터 및 비코딩 요소(예를 들어, pET-28a+)를 포함하는 벡터 백본으로 클로닝되고, 이어서 라이브러리가 pACYC184 플라스미드 표적과 함께 이. 콜라이로 형질전환되었다. 결과적으로, 각각의 생성된 이. 콜라이 세포는 1 개 이하의 표적화 어레이를 함유한다. 대안적인 구현예에서, 비-천연 스페이서를 함유하는 미가공 crRNA의 라이브러리는 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Baba et al. (2006) Mol. Syst. Biol. 2: 2006.0008; 및 Gerdes et al. (2003) J. Bacteriol. 185(19): 5673-84]에 기재된 것들과 같은 공급원으로부터 유래된 이. 콜라이 필수 유전자를 추가적으로 표적화한다. 이러한 구현예에서, 필수 유전자 기능을 파괴하는 신규한 CRISPR-Cas 시스템의 양성의 표적화된 활성은 세포 사멸 또는 성장 정지를 초래한다. 일부 구현예에서, 필수 유전자 표적화 스페이서는 pACYC184 표적과 조합될 수 있다.
셋째로, 이. 콜라이는 항생제 선별 하에 성장되었다. 일 구현예에서, 삼중 항생제 선택이 사용된다: 조작된 CRISPR 이펙터 시스템을 함유하는 pET-28a+ 벡터의 성공적인 형질전환을 보장하기 위한 카나마이신 및 pACYC184 표적 벡터의 성공적인 공동-형질전환을 보장하기 위한 클로람페니콜 및 테트라사이클린. pACYC184는 일반적으로 클로람페니콜 및 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하기 때문에, 항생제 선별 하에서, 플라스미드를 표적화하는 신규한 CRISPR-Cas 시스템의 양성 활성은 이펙터, 비코딩 요소 및 crRNA 라이브러리의 특정 활성 요소를 능동적으로 발현하는 세포를 제거할 것이다. 전형적으로, 생존 세포의 집단은 형질전환 후 12 시간 내지 14 시간에 분석된다. 일부 구현예에서, 생존 세포의 분석은 형질전환 후 6 시간 내지 8 시간, 형질전환 후 8 시간 내지 12 시간, 형질전환 후 24 시간 이하, 또는 형질전환 후 24 시간 초과에 실시된다. 초기 시점과 비교하여 후기 시점에 생존 세포의 집단을 조사하면 비활성 crRNA에 비해 고갈된 신호가 생성된다.
일부 구현예에서, 이중 항생제 선별이 사용된다. 선택적 압력을 제거하기 위한 클로람페니콜 또는 테트라사이클린의 회수는 표적화 기질, 서열 특이성 및 효능에 관한 새로운 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 선별되거나 선별되지 않은 유전자에서 dsDNA의 절단은 이. 콜라이에서 음성 선별을 초래할 수 있고, 여기서 선별된 유전자와 선별되지 않은 유전자 둘 모두의 고갈이 관찰된다. CRISPR-Cas 시스템이 전사 또는 번역을 간섭하는 경우(예를 들어, 결합 또는 전사체 절단에 의해), 선별은 표적에 대해, 선별되지 않은 내성 유전자에서가 아니라, 선별된 내성 유전자에서만 관찰될 것이다.
일부 구현예에서, 조작된 CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 pET-28a+ 벡터의 성공적인 형질전환을 보장하기 위해 카나마이신만이 사용된다. 이러한 구현예는 이. 콜라이 필수 유전자를 표적화하는 스페이서를 함유하는 라이브러리에 적합한데, 그 이유는 성장 변화를 관찰하기 위해 카나마이신 이외에 추가 선별이 필요하지 않기 때문이다. 이러한 구현예에서, 클로람페니콜 및 테트라사이클린 의존성이 없어지고, 라이브러리에서의 이들의 표적(존재 시)은 표적화 기질, 서열 특이성, 및 역가에 관한 추가의 음성 또는 양성 정보 소스를 제공한다.
pACYC184 플라스미드는 CRISPR-Cas 시스템의 활성에 영향을 미칠 수 있는 다양한 특징 및 서열 세트를 함유하기 때문에, 풀링된 스크린으로부터 pACYC184 상에 활성 crRNA를 맵핑하면 상이한 활성 메커니즘 및 기능적 매개변수를 암시할 수 있는 활성 패턴이 제공된다. 이러한 방식으로, 이종 원핵 생물 종에서 신규한 CRISPR-Cas 시스템을 재구성하는 데 필요한 특징은 보다 포괄적으로 시험되고 연구될 수 있다.
본원에 기재된 생체내 풀링-스크린의 주요 이점은 하기를 포함한다:
(1) 다양성 - 플라스미드 설계에 의해 다중 이펙터 및/또는 비코딩 요소 발현 가능; 라이브러리 클로닝 전략에 의해 계산적으로 예측된 crRNA의 두 가지 전사 방향이 모두 발현 가능;
(2) 활성 메커니즘 및 기능적 매개변수의 포괄적 시험 - 핵산 절단을 포함하여 다양한 간섭 메커니즘 평가; 전사, 플라스미드 DNA 복제와 같은 특징의 동시-발생 조사; 및 crRNA 라이브러리에 대한 측접 서열의 사용으로 4N의 복합 등가성을 갖는 PAM이 신뢰성 있게 결정;
(3) 민감도 - pACYC184는 낮은 카피 플라스미드이므로, 적당한 간섭률조차도 플라스미드에 의해 인코딩된 항생제 내성을 없앨 수 있기 때문에 CRISPR-Cas 활성에 대해 높은 민감성 가능; 및
(4) 효율 - 더 빠른 속도 및 처리량의 RNA-시퀀싱을 가능하게 하는 최적화된 분자 생물학 단계로 단백질 발현 샘플이 스크린에서 생존 세포로부터 바로 채취 가능.
본원에 기재된 신규한 CLUST.091979 CRISPR-Cas 패밀리는 작동 요소, 메커니즘, 및 매개변수뿐만 아니라 이의 내인성 세포 환경 외부의 조작된 시스템에서 활성이고 재프로그래밍되는 이의 능력을 평가하기 위해 이러한 생체내 풀링-스크린을 사용하여 평가되었다.
CRISPR 이펙터 활성 및 변형
일부 구현예에서, CLUST.091979의 CRISPR 이펙터 및 RNA 가이드는 다른 구성 요소를 포함할 수 있는 "이원" 복합체를 형성한다. 이원 복합체는 RNA 가이드에서 스페이서 서열에 상보적인 핵산 기질(즉, 서열-특이적 기질 또는 표적 핵산)에 결합할 때 활성화된다. 일부 구현예에서, 서열-특이적 기질은 이중-가닥 DNA이다. 일부 구현예에서, 서열-특이적 기질은 단일-가닥 DNA이다. 일부 구현예에서, 서열-특이적 기질은 단일-가닥 RNA이다. 일부 구현예에서, 서열-특이적 기질은 이중-가닥 RNA이다. 일부 구현예에서, 서열-특이성은 표적 기질에 대해 RNA 가이드(예를 들어, crRNA) 내 스페이서 서열의 완전 매칭을 요구한다. 다른 구현예에서, 서열 특이성은 표적 기질에 대해 RNA 가이드(예를 들어, crRNA) 내 스페이서 서열의 부분(인접 또는 비-인접) 매칭을 요구한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CRISPR 이펙터는 광범위한 pH 조건에 걸쳐 효소 활성, 예를 들어, 뉴클레아제 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 약 3.0 내지 약 12.0의 pH에서 효소 활성, 예를 들어, 뉴클레아제 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터는 약 4.0 내지 약 10.5의 pH에서 효소 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터는 약 5.5 내지 약 8.5의 pH에서 효소 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터는 약 6.0 내지 약 8.0의 pH에서 효소 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터는 약 7.0의 pH에서 효소 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CRISPR 이펙터는 약 10℃ 내지 약 100℃의 온도 범위에서 효소 활성, 예를 들어, 뉴클레아제 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CRISPR 이펙터는 약 20℃ 내지 약 90℃의 온도 범위에서 효소 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CRISPR 이펙터는 약 20℃ 내지 약 25℃의 온도 또는 약 37℃의 온도에서 효소 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, 이원 복합체는 표적 기질에 결합할 때 활성화된다. 일부 구현예에서, 활성화된 복합체는 "다중 턴오버" 활성을 나타내며, 이에 의해 표적 기질에 작용(예를 들어, 절단) 시 활성화된 복합체가 활성화된 상태로 유지된다. 일부 구현예에서, 활성화된 이원 복합체는 "단일 턴오버" 활성을 나타내며, 이에 의해 표적 기질 상에 작용할 때 이원 복합체가 비활성 상태로 되돌아간다. 일부 구현예에서, 활성화된 이원 복합체는 비-특이적(즉, "부수적") 절단 활성을 나타내며, 이에 의해 복합체가 비-표적 핵산을 절단한다. 일부 구현예에서, 비-표적 핵산은 DNA 분자(예를 들어, 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA)이다. 일부 구현예에서, 비-표적 핵산은 RNA 분자(예를 들어, 단일-가닥 또는 이중-가닥 RNA)이다.
본 발명의 CRISPR 이펙터가 표적 핵산(예를 들어, 게놈 DNA)에서 이중-가닥 파손 또는 단일-가닥 파손을 유도하는 일부 구현예에서, 이중-가닥 파손은 상동성 직접 수선(HDR), 비-상동성 말단 접합(NHEJ), 또는 대체 비-상동성 말단-결합(A-NHEJ)을 포함하여 세포 내인성 DNA-수복 경로를 자극할 수 있다. NHEJ는 상동성 주형에 대한 필요 없이도 절단된 표적 핵산을 수복할 수 있다. 이는 표적 유전자좌에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실 또는 삽입을 초래할 수 있다. HDR은 도너 DNA와 같은 상동성 주형으로 발생할 수 있다. 상동성 주형은 표적 핵산 절단 부위에 측접한 서열에 상동성인 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, HDR은 절단 표적 유전자좌에 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입할 수 있다. NHEJ 및/또는 HDR로 인한 표적 DNA의 변형은, 예를 들어, 돌연변이, 결실, 변경, 통합, 유전자 교정, 유전자 대체, 유전자 태깅, 트랜스진 녹-인, 유전자 파괴, 및/또는 유전자 녹-아웃을 초래할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CRISPR 이펙터는 His-태그, GST-태그, FLAG-태그, 또는 myc-태그를 포함하는 하나 이상의 펩티드 태그에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CRISPR 이펙터는 형광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질 또는 황색 형광 단백질)과 같은 검출 가능한 모이어티에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 CRISPR 이펙터 및/또는 보조 단백질은 단백질이 조직, 세포, 또는 세포의 영역에 들어가거나 국재화되게 하는 펩티드 또는 비-펩티드 모이어티에 융합된다. 예를 들어, 본 개시의 CRISPR 이펙터는 SV40(시미안 바이러스 40) NLS, c-Myc NLS, 또는 다른 적합한 단립형 NLS와 같은 핵 국재화 서열(NLS)을 포함할 수 있다. NLS는 CRISPR 이펙터의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합될 수 있고, 단일로 융합되거나(즉, 단일 NLS) 또는 연결될 수 있다(예를 들어, 2 개, 3 개, 4 개 등의 NLS 사슬).
일부 구현예에서, 적어도 하나의 핵 외수송 신호(NES)는 CRISPR 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열에 부착된다. 일부 구현예에서, C-말단 및/또는 N-말단 NLS 또는 NES는 진핵 세포, 예를 들어, 인간 세포에서 최적의 발현 및 핵 표적화를 위해 부착된다.
태그가 CRISPR 이펙터에 융합된 구현예에서, 이러한 태그는, 예를 들어, 고정된 친화성 또는 이온-교환 시약을 사용하는 액체 크로마토그래피 또는 비드 분리에 의해 CRISPR 이펙터의 친화성 기반 또는 전하-기반 정제를 용이하게 할 수 있다. 비-제한적 예로서, 본 개시의 재조합 CRISPR 이펙터는 폴리히스티딘(His) 태그를 포함하고, 정제를 위해 고정된 금속 이온(예를 들어, 수지 상에 고정된 킬레이트 리간드에 의해 킬레이트화된 Zn2+, Ni2+, Cu2+ 이온)을 포함하는 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩되고, 상기 수지는 개별적으로 제조된 수지 또는 상업적으로 입수 가능한 수지 또는 GE Healthcare Life Sciences(말버러, 매사추세츠)에 의해 상업화된 HisTrap FF 컬럼과 같은 즉시 사용 가능한 컬럼일 수 있다. 로딩 단계 후에, 컬럼은, 예를 들어, 하나 이상의 적합한 완충액을 사용하여 선택적으로 세정되고, 이어서 His-태그 단백질이 적합한 용리 완충액을 사용하여 용리된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 개시의 재조합 CRISPR 이펙터가 FLAG-태그를 사용하는 경우, 이러한 단백질은 업계에 공지된 면역 침전법을 사용하여 정제될 수 있다. 본 개시의 태깅된 CRISPR 이펙터 또는 보조 단백질에 대한 다른 적합한 정제 방법은 당업자에게 자명할 것이다.
본원에 기재된 단백질(예를 들어, CRISPR 이펙터 또는 보조 단백질)은 핵산 분자 또는 폴리펩티드로서 전달되거나 사용될 수 있다. 핵산 분자를 사용하는 경우, CRISPR 이펙터를 인코딩하는 핵산 분자는 코돈-최적화될 수 있다. 핵산은 임의의 관심 유기체, 특히 인간 세포 또는 박테리아에서 사용하기 위해 코돈-최적화될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 마우스, 랫트, 토끼, 개, 가축, 또는 비-인간 영장류를 포함하는 임의의 비-인간 진핵 생물에 대해 코돈-최적화될 수 있다. 코돈 사용 표는, 예를 들어, "코돈 사용 데이터베이스"(www.kazusa.orjp/codon/에서 이용 가능함)에서 용이하게 이용 가능하며, 이들 표는 다수의 방식으로 적용될 수 있다. 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Nakamura et al. Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)]을 참조한다. 특정 숙주 세포에서의 발현을 위해 특정 서열을 코돈 최적화시키는 컴퓨터 알고리즘도 또한 이용 가능하며, 예를 들어, Gene Forge(Aptagen; 야코부스, PA)도 또한 이용 가능하다.
일부 예에서, 진핵 세포(예를 들어, 인간 또는 다른 포유류 세포)에서의 발현을 위해 CRISPR 이펙터를 인코딩하는 본 개시의 핵산은 하나 이상의 인트론, 즉, 제1 말단(예를 들어, 5' 말단)에서 스플라이스-도너 서열 및 제2 말단(예를 들어, 3' 말단)에서 스플라이스 억셉터 서열을 포함하는 하나 이상의 비-코딩 서열을 포함한다. 제한 없이, 시미안 바이러스 40(SV40) 인트론, 베타-글로빈 인트론, 및 합성 인트론을 포함하는 임의의 적합한 스플라이스 도너/스플라이스 억셉터가 본 개시의 다양한 구현예에서 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, CRISPR 이펙터 또는 보조 단백질을 인코딩하는 본 개시의 핵산은 DNA 코딩 서열의 3' 말단에서 폴리아데닐화(polyA) 신호와 같은 전사 정지 신호를 포함할 수 있다. 일부 예에서, polyA 신호는 SV40 인트론과 같은 인트론에 매우 근접하거나 인접하게 위치한다.
탈활성화/비활성화 CRISPR 이펙터
본원에 기재된 CRISPR 이펙터는 감소된 뉴클레아제 활성, 예를 들어, 야생형 CRISPR 이펙터와 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100%의 뉴클레아제 비활성화를 갖도록 변형될 수 있다. 뉴클레아제 활성은 당업계에 공지된 여러 방법, 예를 들어, 단백질의 뉴클레아제 도메인으로 돌연변이를 도입함으로써 감소될 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제 활성에 대한 촉매 잔기가 동정되고, 이들 아미노산 잔기는 뉴클레아제 활성을 감소시키기 위해 상이한 아미노산 잔기(예를 들어, 글리신 또는 알라닌)로 치환될 수 있다.
비활성화된 CRISPR 이펙터는 하나 이상의 기능적 도메인(예를 들어, 융합 단백질, 링커 펩티드, "GS" 링커 등을 통해)을 포함하거나 이와 관련될 수 있다. 이들 기능적 도메인은 다양한 활성, 예를 들어, 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성, DNA 절단 활성, 핵산 결합 활성, 및 스위치 활성(예를 들어, 광 유도성)을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 기능적 도메인은 크루펠 관련 박스(Kr
Figure pct00002
ppel associated box; KRAB), VP64, VP16, Fok1, P65, HSF1, MyoD1, 및 비오틴-APEX이다.
비활성화된 CRISPR 이펙터 상에 하나 이상의 기능적 도메인의 위치 선정은 기능적 도메인이 귀속된 기능적 효과로 표적에 작용하도록 정확한 공간 방향을 가능하게 하는 것이다. 예를 들어, 기능적 도메인이 전자 활성화제(예를 들어, VP16, VP64, 또는 p65)인 경우, 전사 활성화제는, 표적의 전사에 작용하도록 하는 공간 방향으로 위치된다. 마찬가지로, 전사 억제제는 표적의 전사에 작용하도록 위치되고, 뉴클레아제(예를 들어, Fok1)는 표적을 절단 또는 부분 절단하도록 위치된다. 일부 구현예에서, 기능적 도메인은 CRISPR 이펙터의 N-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 기능적 도메인은 CRISPR 이펙터의 C-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 비활성화된 CRISPR 이펙터는 N-말단에서 제1 기능적 도메인을 포함하도록 변형되고, C-말단에 제2 기능적 도메인을 포함하도록 변형된다.
분할 효소
본 개시는 또한 본원에 기재된 CRISPR 이펙터의 분할 버전을 제공한다. CRISPR 이펙터의 분할 버전은 전달에 유리할 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터는 기능하는 CRISPR 이펙터를 실질적으로 함께 포함하는 효소의 두 부분으로 분할된다.
분할은 촉매 도메인(들)이 영향을 받지 않는 방식으로 이루어질 수 있다. CRISPR 이펙터는 뉴클레아제로서 기능할 수 있거나 비활성화된 효소일 수 있으며, 이는 본질적으로 촉매 활성이 거의 없는 또는 전혀 없는 RNA-결합 단백질이다(예를 들어, 이의 촉매 도메인에서의 돌연변이(들)로 인해).
일부 구현예에서, 뉴클레아제 로브 및 α-나선 로브는 별도의 폴리펩티드로서 발현된다. 로브가 자체적으로 상호 작용하지는 않지만, RNA 가이드는 이들을 삼원 복합체로 모집하여 전장 CRISPR 이펙터의 활성을 재현(recapitulate)하고 부위-지정 DNA 절단을 촉매작용한다. 변형된 RNA 가이드의 사용은 이량체화를 방지함으로써 분할 효소 활성을 없애서, 유도성 이량체화 시스템의 발달을 가능하게 한다. 분할 효소는, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Wright et al. "Rational design of a split-Cas9 enzyme complex," Proc. Natl. Acad. Sci., 112.10 (2015): 2984-2989]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 분할 효소는, 예를 들어, 라파마이신 민감성 이량체화 도메인을 사용함으로써 이량체화 파트너에 융합될 수 있다. 이는 CRISPR 이펙터 활성의 일시적 제어를 위해 화학적으로 유도 가능한 CRISPR 이펙터의 생성을 가능하게 한다. 따라서, CRISPR 이펙터는 2 개의 단편으로 분할됨으로써 화학적으로 유도 가능하게 될 수 있고, 라파마이신-민감성 이량체화 도메인은 CRISPR 이펙터의 제어된 재조립에 사용될 수 있다.
분할 지점은 전형적으로 인 실리코로 설계되고 작제물에 클로닝된다. 이 과정에서, 돌연변이가 분할 효소에 도입될 수 있고 비-기능적 도메인이 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, 분할 CRISPR 이펙터(즉, N-말단 및 C-말단 단편)의 두 부분 또는 단편은, 예를 들어, 야생형 CRISPR 이펙터의 서열의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%를 포함하는 전체 CRISPR 이펙터를 형성할 수 있다.
자가-활성화 또는 비활성화 효소
본원에 기재된 CRISPR 이펙터는 자가-활성화 또는 자가-비활성화하도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터는 자가-비활성화한다. 예를 들어, 표적 서열은 CRISPR 이펙터 코딩 작제물에 도입될 수 있다. 따라서, CRISPR 이펙터는 효소를 인코딩하는 작제물뿐만 아니라 표적 서열을 절단하여 이들의 발현을 자가-비활성화할 수 있다. 자가-비활성화 CRISPR 시스템을 구축하는 방법은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Epstein et al., "Engineering a Self-Inactivating CRISPR System for AAV Vectors," Mol. Ther., 24 (2016): S50]에 기재되어 있다.
일부 다른 구현예에서, 약한 프로모터(예를 들어, 7SK 프로모터)의 제어 하에 발현된 추가적인 RNA 가이드는 CRISPR 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열을 표적화하여 이의 발현을 방지 및/또는 차단할 수 있다(예를 들어, 핵산의 전사 및/또는 번역을 방지함으로써). CRISPR 이펙터, RNA 가이드, 및 CRISPR 이펙터를 인코딩하는 핵산을 표적화하는 RNA 가이드를 발현하는 벡터로 세포를 형질감염시키면 CRISPR 이펙터를 인코딩하는 핵산의 효율적인 파괴를 야기하고, CRISPR 이펙터의 수준을 감소시켜서, 게놈 편집 활성을 제한할 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR 이펙터의 게놈 편집 활성은 포유류 세포에서 내인성 RNA 시그니처(예를 들어, miRNA)를 통해 조절될 수 있다. CRISPR 이펙터 스위치는 CRISPR 이펙터를 인코딩하는 mRNA의 5'-UTR에서 miRNA-상보적 서열을 사용함으로써 이루어질 수 있다. 스위치는 표적 세포에서 miRNA에 선택적이고 효율적으로 반응한다. 따라서, 스위치는 이종 세포 집단 내에서 내인성 miRNA 활성을 감지함으로써 게놈 편집을 차별적으로 제어할 수 있다. 따라서, 스위치 시스템은 세포내 miRNA 정보에 기초한 세포-유형 선택적 게놈 편집 및 세포 조작을 위한 프레임워크를 제공할 수 있다(Hirosawa et al. "Cell-type-specific genome editing with a microRNA-responsive CRISPR-Cas9 switch," Nucl. Acids Res., 2017 Jul 27; 45(13): e118).
유도성 CRISPR 이펙터
CRISPR 이펙터는 유도성, 예를 들어, 광유도성 또는 화학적 유도성일 수 있다. 이러한 메커니즘은 CRISPR 이펙터에서 기능적 도메인의 활성화를 가능하게 한다. 광유도성은, 예를 들어, CRY2PHR/CIBN 쌍이 분할 CRISPR 이펙터에서 사용되는 융합 복합체를 설계함으로써 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Konermann et al., "Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states," Nature, 500.7463 (2013): 472] 참조). 화학적 유도성은, 예를 들어, FKBP/FRB(FK506 결합 단백질/FKBP 라파마이신 결합 도메인) 쌍이 분할 CRISPR 이펙터에서 사용되는 융합 복합체를 설계함으로써 달성될 수 있다. 라파마이신은 융합 복합체를 형성시키고, 이에 따라 CRISPR 이펙터를 활성화시키기 위해 필요하다(예를 들어, 문헌[Zetsche et al., "A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation," Nature Biotech., 33.2 (2015): 139-142] 참조).
또한, CRISPR 이펙터의 발현은 유도성 프로모터, 예를 들어, 테트라사이클린 또는 독시사이클린 제어 전사 활성화(Tet-On 및 Tet-Off 발현 시스템), 호르몬 유도성 유전자 발현 시스템(예를 들어, 엑디손 유도성 유전자 발현 시스템), 및 아라비노스-유도성 발현 시스템에 의해 조절될 수 있다. RNA로서 전달될 때, RNA 표적화 이펙터 단백질의 발현은 테트라사이클린과 같은 소분자를 감지할 수 있는 리보스위치를 통해 조절될 수 있다(예를 들어, 문헌[Goldfless et al., "Direct and specific chemical control of eukaryotic translation with a synthetic RNA-protein interaction," Nucl. Acids Res., 40.9 (2012): e64-e64] 참조).
유도성 CRISPR 이펙터 및 유도성 CRISPR 시스템의 다양한 구현예는, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 US 8871445, US 20160208243, 및 WO 2016205764에 기재되어 있다.
기능적 돌연변이
특이성 및/또는 견고성을 개선하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 다양한 돌연변이 또는 변형이 CRISPR 이펙터에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 인식하는 아미노산 잔기가 동정된다. 본원에 기재된 CRISPR 이펙터는 추가로, 예를 들어, PAM을 인식하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체함으로써 상이한 PAM을 인식하도록 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터는, 예를 들어, 5'-NTTN-3', 5'-NTTR-3', 5'-RTTR-3', 5'-TNNT-3', 5'-TNRT-3', 5'-TSRT-3', 5'-TGRT-3', 5'-TNRY-3', 5'-TTNR-3', 5'-TTYR-3', 5'-TTTR-3', 5'-TTCV-3', 5'-DTYR-3', 5'-WTTR-3', 5'-NNR-3', 5'-NYR-3', 5'-YYR-3', 5'-TYR-3', 5'-TTN-3', 5'-TTR-3', 5'-CNT-3', 5'-NGG-3', 5'-BGG-3', 또는 5'-R-3'를 인식할 수 있고, 여기서 "N"는 임의의 뉴클레오티드이고, "B"는 C 또는 G 또는 T이고, "D"는 A 또는 G 또는 T이고, "R"은 A 또는 G이고, "S"는 G 또는 C이고, "V"는 A 또는 C 또는 G이고, "W"는 A 또는 T이고, "Y"는 C 또는 T이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CRISPR 이펙터는 하나 이상의 기능적 활성을 변형시키도록 하나 이상의 아미노산 잔기에서 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터는 이의 헬리카제 활성을 변형시키도록 하나 이상의 아미노산 잔기에서 돌연변이된다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터는 하나 이상의 아미노산 잔기에서 이의 뉴클레아제 활성(예를 들어, 엔도뉴클레아제 활성 또는 엑소뉴클레아제 활성)을 변형시키도록 돌연변이된다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터는 RNA 가이드와 기능적으로 회합되는 이의 능력을 변형시키도록 하나 이상의 아미노산 잔기에서 돌연변이된다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터는 표적 핵산과 기능적으로 회합되는 이의 능력을 변형시키도록 하나 이상의 아미노산 잔기에서 돌연변이된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CRISPR 이펙터는 표적 핵산 분자를 절단할 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터는 표적 핵산 분자의 양 가닥을 절단한다. 그러나, 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터는 이의 절단 활성을 변형시키도록 하나 이상의 아미노산 잔기에서 돌연변이된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터는 표적 핵산을 절단하는 CRISPR 이펙터의 능력을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터는 효소가 표적 핵산을 절단할 수 없게 만드는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, CRISPR 이펙터는 효소가 표적 핵산의 가닥을 절단할 수 있도록(즉, 닉카제 활성) 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터는 RNA 가이드가 혼성화하는 가닥에 상보적인 표적 핵산의 가닥을 절단할 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터는 RNA 가이드가 혼성화하는 표적 핵산의 가닥을 절단할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 CRISPR 이펙터의 하나 이상의 잔기는 아르기닌 모이어티로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CRISPR 이펙터의 하나 이상의 잔기는 글리신 모이어티로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CRISPR 이펙터의 하나 이상의 잔기는 본원에 개시된 CRISPR 이펙터의 계통발생학적 정렬의 콘센서스 잔기에 기초하여 돌연변이된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CRISPR 이펙터는 하나 이상의 요망되는 기능적 활성(예를 들어, 뉴클레아제 활성 및 RNA 가이드와 상호작용하는 능력)을 보유하면서 효소의 크기를 감소시키기 위해 하나 이상의 아미노산 잔기에 결실을 포함하도록 조작될 수 있다. 절두된 CRISPR 이펙터는 부하 제한을 갖는 전달 시스템과 조합하여 유리하게 사용될 수 있다.
일 양태에서, 본 개시는 도 2에 나타낸 도메인 구조를 유지하면서 본원에 기재된 핵산 서열과 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 또한 도 2에 나타낸 도메인 구조를 유지하면서 본원에 기재된 아미노산 서열과 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 제공한다.
일부 구현예에서, 핵산 서열은 본원에 기재된 서열과 동일한 적어도 일부(예를 들어, 적어도 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 20 개, 30 개, 40 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 또는 100 개 뉴클레오티드, 예를 들어, 인접 또는 비-인접 뉴클레오티드)를 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 본원에 기재된 서열과 상이한 적어도 일부(예를 들어, 적어도 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 20 개, 30 개, 40 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 또는 100 개 뉴클레오티드, 예를 들어, 인접 또는 비-인접 뉴클레오티드)를 갖는다.
일부 구현예에서, 아미노산 서열은 본원에 기재된 서열과 동일한 적어도 일부(예를 들어, 적어도 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 20 개, 30 개, 40 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 또는 100 개 아미노산 잔기, 예를 들어, 인접 또는 비-인접 아미노산 잔기)를 갖는다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 본원에 기재된 서열과 상이한 적어도 일부(예를 들어, 적어도 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 20 개, 30 개, 40 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 또는 100 개 아미노산 잔기, 예를 들어, 인접 또는 비-인접 아미노산 잔기)를 갖는다.
두 개의 아미노산 서열, 또는 두 개의 핵산 서열의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열들 중 하나 또는 이 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고, 비-상동성 서열이 비교 목적으로 무시될 수 있음). 일반적으로, 비교 목적으로 정렬된 참조 서열 길이는 참조 서열 길이의 적어도 80%여야 하고, 일부 구현예에서 참조 서열의 길이의 적어도 90%, 95%, 또는 100%여야 한다. 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 이후 비교된다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 분자는 그러한 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 동일성 퍼센트는 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수, 및 각 갭의 길이를 고려하여 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다. 본 개시의 목적 상, 서열의 비교 및 두 서열 간의 동일성 퍼센트의 결정은 12의 갭 페널티, 4의 갭 확장 페널티, 및 5의 프레임시프트 갭 페널티를 갖는 Blossum 62 스코어링 매트릭스를 사용하여 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레아제는 PX1X2X3X4F(SEQ ID NO: 216)로서 기재된 서열을 포함하고, 여기서 X1은 L 또는 M 또는 I 또는 C 또는 F이고, X2는 Y 또는 W 또는 F이고, X3는 K 또는 T 또는 C 또는 R 또는 W 또는 Y 또는 H 또는 V이고, X4는 I 또는 L 또는 M이다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 216에 기재된 서열은 N-말단 서열이다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 RX1X2X3L(SEQ ID NO: 217)로서 기재된 서열을 포함하고, 여기서 X1은 I 또는 L 또는 M 또는 Y 또는 T 또는 F이고, X2는 R 또는 Q 또는 K 또는 E 또는 S 또는 T이고, X3는 L 또는 I 또는 T 또는 C 또는 M 또는 K이다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 NX1YX2(SEQ ID NO: 218)로서 기재된 서열을 포함하고, 여기서 X1은 I 또는 L 또는 F이고, X2는 K 또는 R 또는 V 또는 E이다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 KX1X2X3FAX4X5KD(SEQ ID NO: 219)로서 기재된 서열을 포함하고, 여기서 X1은 T 또는 I 또는 N 또는 A 또는 S 또는 F 또는 V이고, X2는 I 또는 V 또는 L 또는 S이고, X3는 H 또는 S 또는 G 또는 R이고, X4는 D 또는 S 또는 E이고, X5는 I 또는 V 또는 M 또는 T 또는 N이다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 219의 서열은 C-말단 서열이다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 LX1NX2(SEQ ID NO: 220)로서 기재된 서열을 포함하고, 여기서 X1는 G 또는 S 또는 C 또는 T이고, X2는 N 또는 Y 또는 K 또는 S이다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 220의 서열은 C-말단 서열이다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 PX1X2X3X4SQX5DS(SEQ ID NO: 221)로서 기재된 서열을 포함하고, 여기서 X1는 S 또는 P 또는 A이고, X2는 Y 또는 S 또는 A 또는 P 또는 E 또는 Y 또는 Q 또는 N이고, X3는 F 또는 Y 또는 H이고, X4는 T 또는 S이고, X5는 M 또는 T 또는 I이다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 221의 서열은 C-말단 서열이다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 KX1X2VRX3X4QEX5H(SEQ ID NO: 222)로서 기재된 서열을 포함하고, 여기서 X1은 N 또는 K 또는 W 또는 R 또는 E 또는 T 또는 Y이고, X2는 M 또는 R 또는 L 또는 S 또는 K 또는 V 또는 E 또는 T 또는 I 또는 D이고, X3는 L 또는 R 또는 H 또는 P 또는 T 또는 K 또는 Q 또는 P 또는 S 또는 A이고, X4는 G 또는 Q 또는 N 또는 R 또는 K 또는 E 또는 I 또는 T 또는 S 또는 C이고, X5는 R 또는 W 또는 Y 또는 K 또는 T 또는 F 또는 S 또는 Q이다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 222의 서열은 C-말단 서열이다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 X1NGX2X3X4DX5NX6X7X8N(SEQ ID NO: 223)로서 기재된 서열을 포함하고, 여기서 X1은 I 또는 K 또는 V 또는 L이고, X2는 L 또는 M이고, X3는 N 또는 H 또는 P이고, X4는 A 또는 S 또는 C이고, X5는 V 또는 Y 또는 I 또는 F 또는 T 또는 N이고, X6는 A 또는 S이고, X7은 S 또는 A 또는 P이고, X8은 M 또는 C 또는 L 또는 R 또는 N 또는 S 또는 K 또는 L이다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 223의 서열은 C-말단 서열이다.
RNA 및 RNA 가이드 변형
일부 구현예에서, 본원에 기재된 RNA 가이드는 우라실(U)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 RNA 가이드는 티민(T)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 RNA 가이드의 직접 반복부 서열은 우라실(U)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 RNA 가이드의 직접 반복부 서열은 티민(T)을 포함한다. 일부 구현예에서, 표 2 또는 표 8에 따른 직접 반복부 서열은 표 2 또는 표 8의 상응하는 서열에서 티민으로서 지시된 하나 이상의 위치에 우라실을 포함하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 직접 반복부는 내인성 CRISPR 어레이에서 반복되는 서열의 하나의 카피만을 포함한다. 일부 구현예에서, 직접 반복부는 내인성 CRISPR 어레이에서 발견되는 하나 이상의 스페이서 서열에 인접한(예를 들어, 측접한) 전장 서열이다. 일부 구현예에서, 직접 반복부는 내인성 CRISPR 어레이에서 발견되는 하나 이상의 스페이서 서열에 인접한(예를 들어, 측접한) 전장 서열의 일부(예를 들어, 가공된 부분)이다.
스페이서 및 직접 반복부
RNA 가이드의 스페이서 길이는 약 15 개 내지 55 개 뉴클레오티드의 범위일 수 있다. RNA 가이드의 스페이서 길이는 약 20 개 내지 45 개 뉴클레오티드의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 가이드의 스페이서 길이는 적어도 15 개 뉴클레오티드, 적어도 16 개 뉴클레오티드, 적어도 17 개 뉴클레오티드, 적어도 18 개 뉴클레오티드, 적어도 19 개 뉴클레오티드, 적어도 20 개 뉴클레오티드, 적어도 21 개 뉴클레오티드, 또는 적어도 22 개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 스페이서 길이는 15 개 내지 17 개 뉴클레오티드, 15 개 내지 23 개 뉴클레오티드, 16 개 내지 22 개 뉴클레오티드, 17 개 내지 20 개 뉴클레오티드, 20 개 내지 24 개 뉴클레오티드(예를 들어, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 또는 24 개 뉴클레오티드), 23 개 내지 25 개 뉴클레오티드(예를 들어, 23 개, 24 개, 또는 25 개 뉴클레오티드), 24 개 내지 27 개 뉴클레오티드, 27 개 내지 30 개 뉴클레오티드, 30 개 내지 45 개 뉴클레오티드(예를 들어, 30 개, 31 개, 32 개, 33 개, 34 개, 35 개, 40 개, 또는 45 개 뉴클레오티드), 30 개 또는 35 개 내지 40 개 뉴클레오티드, 41 개 내지 45 개 뉴클레오티드, 45 개 내지 50 개 뉴클레오티드, 또는 그 초과이다.
일부 구현예에서, RNA 가이드의 직접 반복부 길이는 적어도 16 개 뉴클레오티드, 또는 16 개 내지 20 개 뉴클레오티드(예를 들어, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 또는 20 개 뉴클레오티드)이다. 일부 구현예에서, RNA 가이드의 직접 반복부 길이는 약 19 개 내지 약 40 개 뉴클레오티드이다.
예시적인 직접 반복부 서열(예를 들어, pre-crRNA의 직접 반복부 서열(예를 들어, 미가공 crRNA) 또는 성숙 crRNA(예를 들어, 가공 crRNA의 직접 반복부 서열)은 표 2에 나타나 있다. 또한, 표 8을 참조한다.
[표 2]
crRNA 서열의 예시적인 직접 반복부 서열.
Figure pct00003
일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 58의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 59의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 60의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 213의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 128의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 63의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 130의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 70의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 72의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 73의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 74의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 63의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 76의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 77의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 139의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 58의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 80의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 77의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 139의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 80의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 39의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 58의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 83의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 84의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 86의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 45의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 130의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 84의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 87의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 88의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 51의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 84의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 53의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 84의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 55의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 88의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 56의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 90의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 가이드는 도 3에 나타낸 직접 반복부 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, RNA 가이드는 도 3에 나타낸 컨센서스 서열의 직접 반복부 또는 도 3에 나타낸 컨센서스 서열의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 X1X2TX3X4X5X6X7X8(SEQ ID NO: 224)로서 기재된 서열을 갖는 직접 반복부를 포함하고, 여기서 X1은 A 또는 C 또는 G이고, X2는 T 또는 C 또는 A이고, X3는 T 또는 G 또는 A이고, X4는 T 또는 G이고, X5는 T 또는 G 또는 A이고, X6는 G 또는 T 또는 A이고, X7은 T 또는 G 또는 A이고, X8은 A 또는 G 또는 T이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, RNA 가이드는 ATTGTTGDA(SEQ ID NO: 225)로서 기재된 서열을 갖는 직접 반복부를 포함한다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 224는 직접 반복부의 5' 말단에 근접한다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 225는 직접 반복부의 5' 말단에 근접한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9(SEQ ID NO: 226)로서 기재된 서열을 갖는 직접 반복부를 포함하고, 여기서 X1은 T 또는 C 또는 A이고, X2는 T 또는 A 또는 G이고, X3는 T 또는 C 또는 A이고, X4는 T 또는 A이고, X5는 T 또는 A 또는 G이고, X6는 T 또는 A이고, X7은 A 또는 T이고, X8은 A 또는 G 또는 C 또는 T이고, X9은 G 또는 A 또는 C이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, RNA 가이드는 TTTTWTARG(SEQ ID NO: 227)로서 기재된 서열을 갖는 직접 반복부를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 X1X2X3AC(SEQ ID NO: 228)로서 기재된 서열을 갖는 직접 반복부를 포함하고, 여기서 X1은 A 또는 C 또는 G이고, X2는 C 또는 A이고, X3는 A 또는 C이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, RNA 가이드는 ACAAC(SEQ ID NO: 229)로서 기재된 서열을 갖는 직접 반복부를 포함한다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 228는 직접 반복부의 3' 말단에 근접한다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 229는 직접 반복부의 3' 말단에 근접한다.
일부 구현예에서, RNA 가이드의 스페이서는 표 3의 PAM 서열에 인접한 표적 핵산에 결합된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 RNA 가이드와 이펙터의 복합체는 표 3에 지시된 바와 같은 PAM 서열에 인접한 표적 핵산에 결합된다.
[표 3]
CLUST.091979 이펙터에 상응하는 PAM 서열.
Figure pct00004
Figure pct00005
일부 구현예에서, RNA 가이드는 tracrRNA를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, tracrRNA는 필요하지 않다(예를 들어, tracrRNA는 선택적임). 일부 구현예에서, tracrRNA는 표 9에 나타낸 비-코딩 서열의 일부이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, tracrRNA는 표 4의 서열이다.
[표 4] 예시적인 tracrRNA 서열.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, 또는 SEQ ID NO: 154의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, 또는 SEQ ID NO: 158의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, 또는 SEQ ID NO: 161의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 162의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, 또는 SEQ ID NO: 166의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 167 또는 SEQ ID NO: 168의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, 또는 SEQ ID NO: 171의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, 또는 SEQ ID NO: 175의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, 또는 SEQ ID NO: 179의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 180 또는 SEQ ID NO: 181의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, 또는 SEQ ID NO: 184의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, 또는 SEQ ID NO: 188의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 189 또는 SEQ ID NO: 190의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, 또는 SEQ ID NO: 184의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 189 또는 SEQ ID NO: 190의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 39의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, 또는 SEQ ID NO: 188의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, 또는 SEQ ID NO: 194의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, 또는 SEQ ID NO: 199의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 195 또는 SEQ ID NO: 196의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 45의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, 또는 SEQ ID NO: 166의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, 또는 SEQ ID NO: 202의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 52의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, 또는 SEQ ID NO: 199의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 55의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, 또는 SEQ ID NO: 202의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 56의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, tracrRNA 서열은 SEQ ID NO: 203 또는 SEQ ID NO: 204의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
RNA 가이드 서열은 CRISPR 복합체의 형성 및 표적에 대한 성공적인 결합을 허용하는 동시에 성공적인 뉴클레아제 활성을 허용하지 않는(즉, 뉴클레아제 활성 없는/인델 유발 없는) 방식으로 변형될 수 있다. 이들 변형된 가이드 서열은 "데드 가이드" 또는 "데드 가이드 서열"로 지칭된다. 이들 데드 가이드 또는 데드 가이드 서열은 뉴클레아제 활성과 관련하여 촉매적으로 비활성이거나 입체적으로 비활성일 수 있다. 데드 가이드 서열은 전형적으로 활성 RNA 절단을 초래하는 각각의 가이드서열보다 짧다. 일부 구현예에서, 데드 가이드는 뉴클레아제 활성을 갖는 각각의 RNA 가이드보다 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 더 짧다. RNA 가이드의 데드 가이드 서열은 13 개 내지 15 개 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 13 개, 14 개, 또는 15 개 뉴클레오티드 길이), 15 개 내지 19 개 뉴클레오티드 길이, 또는 17 개 내지 18 개 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 17 개 뉴클레오티드 길이)일 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 기능적 CLUST.091979 CRISPR 이펙터 및 RNA 가이드를 포함하는 비-자연 발생 또는 조작된 CRISPR 시스템을 제공하고, 여기서 RNA 가이드는 데드 가이드 서열을 포함하고, 이에 의해 RNA 가이드는 CRISPR 시스템이 검출 가능한 절단 활성 없이 세포에서 관심 게놈 유전자좌로 유도되도록 표적 서열에 혼성화될 수 있다. 데드 가이드에 대한 상세한 설명은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO 2016094872에 기재되어 있다.
유도성 RNA 가이드
RNA 가이드는 유도성 시스템의 구성 요소로 생성될 수 있다. 시스템의 유도성 성질은 유전자 편집 또는 유전자 발현의 시공간적 제어를 허용한다. 일부 구현예에서, 유도성 시스템에 대한 자극은, 예를 들어, 전자기 복사, 음향 에너지, 화학적 에너지 및/또는 열 에너지를 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 가이드의 전사는 유도성 프로모터, 예를 들어, 테트라사이클린 또는 독시사이클린 제어 전사 활성화(Tet-On 및 Tet-Off 발현 시스템), 호르몬 유도성 유전자 발현 시스템(예를 들어, 엑디손 유도성 유전자 발현 시스템), 및 아라비노스-유도성 유전자 발현 시스템에 의해 조절될 수 있다. 유도성 시스템의 다른 예는, 예를 들어, 소분자 2-하이브리드 전사 활성화 시스템(FKBP, ABA 등), 광 유도성 시스템(피토크롬, LOV 도메인, 또는 크립토크롬), 또는 광 유도성 전사 이펙터(LITE)를 포함한다. 이들 유도성 시스템은, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO 2016205764 및 US 8795965에 기재되어 있다.
화학적 변형
화학적 변형은 RNA 가이드의 포스페이트 백본, 당, 및/또는 염기에 적용될 수 있다. 포스포로티오에이트와 같은 백본 변형은 포스페이트 백본에 대한 전하를 변형시키고, 올리고뉴클레오티드의 전달 및 뉴클레아제 내성(예를 들어, 문헌[Eckstein, "Phosphorothioates, essential components of therapeutic oligonucleotides," Nucl. Acid Ther., 24 (2014), pp. 374-387] 참조); 당, 예컨대, 2'-O-메틸(2'-OMe), 2'-F, 및 잠금 핵산(LNA)의 변형을 돕고, 염기 쌍형성과 뉴클레아제 내성 둘 모두를 향상시킨다(예를 들어, 문헌[Allerson et al. "Fully 2 '-modified oligonucleotide duplexes with improved in vitro potency and stability compared to unmodified small interfering RNA," J. Med. Chem., 48.4 (2005): 901-904] 참조). 특히, 2-티오우리딘 또는 N6-메틸아데노신과 같은 화학적 변형 염기는 더 강하거나 더 약한 염기 쌍형성을 가능하게 할 수 있다(예를 들어, 문헌[Bramsen et al., "Development of therapeutic-grade small interfering RNAs by chemical engineering," Front. Genet., 2012 Aug 20; 3:154] 참조). 추가로, RNA는 형광 염료, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 단백질을 포함하는 다양한 기능적 모이어티와 5' 말단 접합과 3' 말단 접합 둘 모두에 적합하다.
매우 다양한 변형이 화학적으로 합성된 RNA 가이드 분자에 적용될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 내성을 개선하기 위해 2'-OMe로 올리고뉴클레오티드를 변형시키는 것은 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍형성의 결합 에너지를 변경할 수 있다. 또한, 2'-OMe 변형은 올리고뉴클레오티드가 세포에서 형질감염 시약, 단백질 또는 임의의 다른 분자와 상호작용하는 방식에 영향을 미칠 수 있다. 이들 변형의 효과는 경험적 시험에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 가이드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 염기 쌍형성을 향상시키고/향상시키거나 뉴클레아제 내성을 증가시키기 위한 목적으로 하나 이상의 잠금 핵산을 포함한다.
이들 화학적 변형의 요약은, 예를 들어, 각각 그 전체가 참조로 포함되는 문헌[Kelley et al., "Versatility of chemically synthesized guide RNAs for CRISPR-Cas9 genome editing," J. Biotechnol. 2016 Sep 10; 233:74-83; WO 2016205764]; 및 US 8795965에서 찾아볼 수 있다.
서열 변형
본원에 기재된 RNA 가이드, tracrRNA, 및 crRNA의 서열 및 길이는 최적화될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 가이드의 최적화된 길이는 가공된 형태의 tracrRNA 및/또는 crRNA를 동정함으로써, 또는 RNA 가이드, tracrRNA, crRNA, 및 tracrRNA 테트라루프에 대한 경험적 길이 연구에 의해 결정될 수 있다.
RNA 가이드는 또한 하나 이상의 압타머 서열을 포함할 수 있다. 압타머는 특정 표적 분자에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드 분자이다. 압타머는 유전자 이펙터, 유전자 활성화제, 또는 유전자 억제자에 특이적일 수 있다. 일부 구현예에서, 압타머는 단백질에 특이적일 수 있으며, 이는 차례로 특정 유전자 이펙터, 유전자 활성화제 또는 유전자 억제자에 특이적이고 동원/결합한다. 이펙터, 활성화제, 또는 억제자는 융합 단백질의 형태로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 가이드는 동일한 어댑터 단백질에 특이적인 둘 이상의 압타머 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 압타머 서열은 상이한 어댑터 단백질에 특이적이다. 어댑터 단백질은, 예를 들어, MS2, PP7, Qβ, F2, GA, fr, JP501, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, M11, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, φCb5, φCb8r, φCb12r, φCb23r, 7s, 및 PRR1을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 압타머는 본원에 기재된 바와 같은 어댑터 단백질 중 어느 하나를 특이적으로 결합하는 결합 단백질로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 압타머 서열은 MS2 루프이다. 압타머의 상세한 설명은, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Nowak et al., "Guide RNA engineering for versatile Cas9 functionality," Nucl. Acid. Res., 2016 Nov 16;44(20):9555-9564]; 및 WO 2016205764에서 찾아볼 수 있다.
가이드: 표적 서열 매칭 요건
CRISPR 시스템에서, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 표적 외 상호작용을 감소시키기 위해, 예를 들어, 낮은 상보성을 갖는 표적 서열과 상호작용하는 가이드를 감소시키기 위해, CRISPR 시스템이 80%, 85%, 90%, 또는 95% 초과의 상보성을 갖는 표적 서열과 표적 외 서열 사이를 구별할 수 있도록 돌연변이가 CRISPR 시스템에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 상보성 정도는 80% 내지 95%, 예를 들어, 약 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95%이다(예를 들어, 1 개, 2 개, 또는 3 개 미스매치를 갖는 18 개 뉴클레오티드의 표적 외로부터 18 개 뉴클레오티드를 갖는 표적 사이를 구별하는). 따라서, 일부 구현예에서, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5%, 또는 99.9% 초과이다. 일부 구현예에서, 상보성 정도는 100%이다.
기능적이기에 충분한 상보성이 있는 한 완전한 상보성이 필요하지 않다는 것은 당 분야에서 알려져 있다. 절단 효율의 조절은 스페이서/표적에 따른 미스매치의 위치를 포함하여 스페이서 서열과 표적 서열 사이의 미스매치, 예를 들어, 하나 이상의 미스매치, 예컨대, 1 개 또는 2 개의 미스매치의 도입에 의해 이루어질 수 있다. 더 중심적인(즉, 3' 말단 또는 5' 말단이 아님) 미스매치, 예를 들어, 이중 미스매치가 위치하며; 더 큰 절단 효율이 영향을 받는다. 따라서, 스페이서 서열에 따라 미스매치 위치를 선택함으로써, 절단 효율이 조절될 수 있다. 예를 들어, 표적의 100% 미만의 절단이 요망된다면(예를 들어, 세포 집단에서), 스페이서와 표적 서열 사이에 1 개 또는 2 개의 미스매치가 스페이서 서열에 도입될 수 있다.
CRISPR 시스템의 사용 방법
본원에 기재된 CRISPR 시스템은 다수의 세포 유형에서 표적 폴리뉴클레오티드를 변형(예를 들어, 결실, 삽입, 전위, 비활성화 또는 활성화)시키는 것을 포함하는 매우 다양한 용도를 갖는다. CRISPR 시스템은, 예를 들어, DNA/RNA 검출(예를 들어, 특정 고감도 효소 리포터 잠금 해제(SHERLOCK)), 핵산의 추적 및 표지, 존재비 검정(배경으로부터 요망되는 서열 추출), 순환하는 종양 DNA 검출, 차세대 라이브러리 제조, 약물 스크리닝, 질병 진단 및 예후, 및 다양한 유전 장애 치료에 광범위한 적용을 갖는다.
DNA/RNA 검출
일 양태에서, 본원에 기재된 CRISPR 시스템은 DNA/RNA 검출에 사용될 수 있다. 단일 이펙터 RNA-가이드 DNase는 CRISPR RNA(crRNA)로 재프로그래밍되어 특정 단일 가닥 DNA(ssDNA) 감지를 위한 플랫폼을 제공할 수 있다. 이의 DNA 표적이 인식되면, 활성화된 V형 단일 이펙터 DNA-가이드 DNase는 부근의 비-표적 ssDNA의 "부수적" 절단에 관여한다. 이러한 crRNA-프로그래밍된 부수적 절단 활성은 CRISPR 시스템이 표지된 ssDNA의 비특이적 분해에 의해 특정 DNA의 존재를 검출할 수 있게 한다.
부수적 ssDNA 활성은 DNA 검출을 위한 아토몰 감도를 달성하는, DNA 엔도뉴클레아제-표적화 CRISPR 트랜스 리포터(DNA Endonuclease-Targeted CRISPR trans reporter; DETECTR) 방법이라 불리는 방법과 같은 DNA 검출 적용에서 리포터와 조합될 수 있다(예를 들어, 그 전체가 참조로 본원에 포함되는 문헌[Chen et al., Science, 360(6387):436-439, 2018] 참조). 본원에 기재된 효소를 사용하는 한 가지 적용은 시험관내 환경에서 비-특이적 ssDNA를 분해하는 것이다. 형광단과 소광제를 연결하는 "리포터" ssDNA 분자는 또한 미지의 DNA(단일-가닥 또는 이중-가닥) 샘플과 함께 시험관내 시스템에 첨가될 수 있다. 미지의 DNA 조각에서 표적 서열을 인식하면, 이펙터 복합체는 리포터 ssDNA를 절단하여 형광 판독을 한다.
다른 구현예에서, SHERLOCK 방법(특정 고감도 효소 리포터 잠금해제)은 또한 표적의 실시간 검출을 가능하게 하는 리포터 ssDNA의 부수적 절단 및 핵산 증폭에 기초한 아토몰(또는 단일-분자) 감도를 갖는 시험관내 핵산 검출 플랫폼을 제공한다. SHERLOCK에서 CRISPR를 사용하는 방법은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Gootenberg, et al. "Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2," Science, 356(6336):438-442 (2017)]에 상세히 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CRISPR 시스템은 다중 오류-강성 형광 인 시튜 혼성화(MERFISH)에 사용될 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Chen et al., "Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells," Science, 2015 Apr 24; 348(6233):aaa6090]에 기재되어 있다.
핵산의 추적 및 표지
세포 과정은 단백질, RNA 및 DNA 간의 분자 상호작용 네트워크에 좌우된다. 단백질-DNA 및 단백질-RNA 상호작용의 정확한 검출은 이러한 과정을 이해하는 데 중요하다. 시험관내 근접 표지 기법은 리포터 그룹, 예를 들어, 광활성 기와 조합된 친화성 태그를 사용하여 시험관내에서 관심 단백질 또는 RNA의 부근에 있는 폴리펩티드 및 RNA를 표지한다. UV 조사 후, 광활성 기는 태그가 있는 분자에 매우 근접한 단백질 및 다른 분자와 반응하여 이들을 표지한다. 표지된 상호작용 분자는 후속적으로 회수되고 동정될 수 있다. 예를 들어, RNA 표적화 이펙터 단백질은 선택된 RNA 서열에 대해 프로브를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 이들 적용은 또한 질환 또는 배양하기 어려운 세포 유형의 생체내 영상화를 위한 동물 모델에 적용될 수 있다. 핵산의 추적 및 표지 방법은, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 US 8795965; WO 2016205764; 및 WO 2017070605에 기재되어 있다.
고처리량 스크리닝
본원에 기재된 CRISPR 시스템은 차세대 시퀀싱(NGS) 라이브러리를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 비용-효과적인 NGS 라이브러리를 생성하기 위해, CRISPR 시스템을 사용하여 표적 유전자의 코딩 서열을 방해할 수 있으며, CRISPR 이펙터 형질감염된 클론은 차세대 시퀀싱(예를 들어, Ion Torrent PGM 시스템에서)에 의해 동시에 스크리닝될 수 있다. NGS 라이브러리를 제조하는 방법에 관한 상세한 설명은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Bell et al., "A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mutations using next-generation sequencing," BMC Genomics, 15.1 (2014): 1002]에서 찾아볼 수 있다.
조작된 세포
미생물(예를 들어, 이. 콜라이, 효모 및 미세조류)은 합성 생물학에 널리 사용된다. 합성 생물학의 발전은 다양한 임상적 적용을 포함하여 광범위한 유용성을 갖는다. 예를 들어, 프로그래밍 가능한 CRISPR 시스템은, 예를 들어, 표적 전사체로서 암-연결된 RNA를 사용하여 표적화된 세포 사멸을 위한 독성 도메인의 단백질을 분할하는 데 사용될 수 있다. 또한, 단백질-단백질 상호작용을 포함하는 경로는, 예를 들어, 키나제 또는 효소와 같은 적절한 이펙터와의 융합 복합체가 있는 합성 생물학적 시스템에서 영향을 받을 수 있다.
일부 구현예에서, 파지 서열을 표적화하는 RNA 가이드 서열은 미생물에 도입될 수 있다. 따라서, 본 개시는 또한 파지 감염에 대항하여 미생물(예를 들어, 생산 균주)을 "백신접종"하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 CRISPR 시스템은, 예를 들어, 수율을 향상시키거나 발효 효율을 향상시키기 위해 미생물을 조작하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 CRISPR 시스템은 효모와 같은 미생물을 조작하여 발효 가능한 당으로부터 바이오연료 또는 바이오폴리머를 생산하거나, 발효 가능한 당의 공급원으로서 농업 폐기물로부터 유래된 식물-유래 리그노셀룰로스를 분해하는 데 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 방법은 바이오연료 생산에 필요한 내인성 유전자의 발현을 변형시키고/변형시키거나 바이오연료 합성을 방해할 수 있는 내인성 유전자를 변형시키는 데 사용될 수 있다. 미생물을 조작하는 이들 방법은, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Verwaal et al., "CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae," Yeast, 2017 Sep 8. doi: 10.1002/yea.3278; 및 Hlavova et al., "Improving microalgae for biotechnology―from genetics to synthetic biology," Biotechnol. Adv., 2015 Nov 1; 33:1194-203]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 CRISPR 시스템은 진핵 세포 또는 진핵 유기체를 조작하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 CRISPR 시스템은 식물 세포, 진균 세포, 포유류 세포, 파충류 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 어류 세포, 기생충 세포, 절지 동물 세포, 무척추 동물 세포, 척추 동물 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포, 또는 인간 세포로 국한되지 않는 진핵 세포를 조작하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 진핵 세포는 시험관내 배양이다. 일부 구현예에서, 진핵 세포는 생체내이다. 일부 구현예에서, 진핵 세포는 생체외이다.
일부 구현예에서, 세포는 세포주로부터 유래된다. 조직 배양을 위한 매우 다양한 세포주가 당업계에 공지되어 있다. 세포주의 예는 293T, MF7, K562, HeLa 및 이들의 트랜스제닉 변종을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 세포주는 당업자에게 공지된 다양한 공급원으로부터 입수 가능하다(예를 들어, 미국형 배양물 보관소(American Type Culture Collection; ATCC)(Manassas, Va.) 참조). 일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산(예컨대, 뉴클레아제 폴리펩티드 인코딩 벡터 및 RNA 가이드)으로 형질감염된 세포는 표적 핵산 또는 표적 유전자좌에 대한 변형을 포함하는 새로운 세포주를 확립하기 위해 하나 이상의 벡터-유래된 서열을 포함하는 새로운 세포주를 확립하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 세포는 불멸 또는 불멸화된 세포이다.
일부 구현예에서, 세포는 일차 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 전능성 줄기 세포(예를 들어, 전능성), 다능성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 과소능성 줄기 세포, 또는 단능성 줄기 세포와 같은 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)이거나 iPSC로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 분화된 세포이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 분화된 세포는 근육 세포(예를 들어, 근세포), 지방 세포(예를 들어, 지방세포(adipocyte)), 골 세포(예를 들어, 조골세포, 골세포, 파골세포), 혈액 세포(예를 들어, 단핵구, 림프구, 호중구, 호산구, 호염기구, 대식세포, 적혈구 또는 혈소판), 신경 세포(예를 들어, 뉴런), 상피 세포, 면역 세포(예를 들어, 림프구, 호중구, 단핵구, 또는 대식세포), 간 세포(예를 들어, 간세포(hepatocyte)), 섬유아세포, 또는 성세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 말단 분화된 세포이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 말단 분화 세포는 신경 세포, 지방 세포, 심근 세포, 골격근 세포, 표피 세포 또는 장 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 포유류 세포, 예를 들어, 인간 세포 또는 뮤린 세포이다. 일부 구현예에서, 뮤린 세포는 야생형 마우스, 면역억제된 마우스, 또는 질병-특이적 마우스 모델로부터 유래된다.
유전자 드라이브
유전자 드라이브는 특정 유전자 또는 유전자 세트의 유전이 유리하게 편향되는 현상이다. 본원에 기재된 CRISPR 시스템은 유전자 드라이브를 구축하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 시스템은 유전자의 특정 대립유전자를 표적화하고 파괴하여 세포가 두 번째 대립유전자를 복제하여 서열을 고정시키도록 설계될 수 있다. 복제로 인해, 제1 대립유전자가 제2 대립유전자로 전환되어 제2 대립유전자가 자손에게 전파될 가능성이 증가할 것이다. 유전자 드라이브를 구축하기 위해 본원에 기재된 CRISPR 시스템을 어떻게 사용하는 지에 관한 상세한 방법은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Hammond et al., "A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae," Nat. Biotechnol., 2016 Jan; 34(1):78-83]에 기재되어 있다.
풀링-스크리닝
본원에 기재된 바와 같이, 풀링된 CRISPR 스크리닝은 세포 증식, 약물 내성, 및 바이러스 감염과 같은 생물학적 메커니즘에 관여하는 유전자를 동정하기 위한 강력한 도구이다. 세포는 본원에 기재된 RNA 가이드-인코딩 벡터의 라이브러리로 대량으로 형질도입되고, gRNA의 분포는 선택적 공격을 적용하기 전 및 후에 측정된다. 풀링된 CRISPR 스크린은 세포 생존 및 증식에 영향을 미치는 메커니즘에 대해 잘 작동하며, 이들은 개별 유전자의 활성을 측정하도록 확장될 수 있다(예를 들어, 조작된 리포터 세포주를 사용함으로써). 단지 하나의 유전자만 한 번에 표적화되는 배열된 CRISPR 스크린은 판독 값으로서 RNA-seq를 사용할 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 CRISPR 시스템은 단일-세포 CRISPR 스크린에서 사용될 수 있다. 풀링된 CRISPR 스크리닝에 관한 상세한 설명은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Datlinger et al., "Pooled CRISPR screening with single-cell transcriptome read-out," Nat. Methods., 2017 Mar; 14(3):297-301]에서 찾아볼 수 있다.
포화 돌연변이유발("바싱(Bashing)")
본원에 기재된 CRISPR 시스템은 인 시튜 포화 돌연변이유발에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 풀링된 RNA 가이드 라이브러리는 특정 유전자 또는 조절 요소에 대한 인 시튜 포화 돌연변이유발을 수행하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 이들 유전자 또는 조절 요소(예를 들어, 인핸서)의 중요한 최소 특징 및 별개의 취약성을 나타낼 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Canver et al., "BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis," Nature, 2015 Nov 12; 527(7577):192-7]에 기재되어 있다.
치료적 적용
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CRISPR 시스템은 표적 핵산을 변형시키도록(예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기를 삽입, 결실, 또는 돌연변이시킴으로써) 표적 핵산을 편집하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CRISPR 시스템은 바람직한 핵산 서열을 포함하는 외인성 도너 주형 핵산(예를 들어, DNA 분자 또는 RNA 분자)을 포함한다. 본원에 기재된 CRISPR 시스템으로 유도된 절단 사건의 해결 시, 세포의 분자 기구는 절단 사건을 수복 및/또는 해결하는 데 외인성 도너 주형 핵산을 이용할 수 있다. 대안적으로, 세포의 분자 기구는 절단 사건을 수복 및/또는 해결하는 데 내인성 주형을 이용할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CRISPR 시스템은 표적 핵산을 변형시켜 삽입, 결실, 및/또는 점 돌연변이를 야기하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 삽입은 흔적이 없는 삽입(즉, 절단 사건의 해결 시 추가적인 의도하지 않은 핵산 서열을 생성하지 않는 표적 핵산으로 의도된 핵산 서열의 삽입)이다. 도너 주형 핵산은 이중-가닥 또는 단일-가닥 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 RNA)일 수 있다. 외인성 도너 주형 핵산을 설계하는 방법은, 예를 들어, 전체 내용이 참조로 본원에 분명히 포함되는 WO 2016094874에 기재되어 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 RNA 서열 특이적 간섭; RNA 서열-특이적 유전자 조절; RNA, RNA 산물, lncRNA, 비-코딩 RNA, 핵 RNA, 또는 mRNA의 스크리닝; 돌연변이유발; RNA 스플라이싱의 억제; 형광 인 시튜 혼성화; 번식; 세포 휴면 유도; 세포 주기 정지 유도; 세포 성장 및/또는 세포 증식의 감소; 세포 무반응 유도; 세포 아폽토시스 유도; 세포 괴사 유도; 세포 사멸 유도; 또는 세포 예정사의 유도로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에서 본원에 기재된 시스템의 용도를 제공한다.
본원에 기재된 CRISPR 시스템은 다양한 치료적 적용을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 새로운 CRISPR 시스템은 다양한 질환 및 장애, 예를 들어, 유전적 장애(예를 들어, 단성생성 질환) 또는 뉴클레아제 활성에 의해 치료될 수 있는 질환(예를 들어, Pcsk9 표적화 또는 BCL11a 표적화)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 대상체, 예를 들어, 인간 환자와 같은 포유류를 치료하는 데 사용된다. 포유류 대상체는 또한 개, 고양이, 말, 원숭이, 토끼, 래트, 마우스, 소, 염소 또는 양과 같은 가축일 수 있다.
방법은 감염성 병태 또는 질환을 포함할 수 있고, 여기서 감염제는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 단순 포진 바이러스-1(HSV1), 및 단순 포진 바이러스-2(HSV2)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본원에 기재된 CRISPR 시스템은 RNA, 독성 RNA 및/또는 돌연변이된 RNA의 과발현(예를 들어, 스플라이싱 결함 또는 절두)에 의해 초래된 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 독성 RNA의 발현은 핵 내포물의 형성 및 뇌, 심장, 또는 골격근의 후기 발병 퇴행성 변화와 관련이 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 장애는 근이영양증이다. 근이영양증에서, 독성 RNA의 주요 병원성 효과는 결합 단백질을 격리하고 대체 스플라이싱의 조절을 손상시키는 것이다(예를 들어, 문헌[Osborne et al., "RNA-dominant diseases," Hum. Mol. Genet., 2009 Apr 15; 18(8):1471-81] 참조). 근이영양증(근긴장성 영양증(DM))은 매우 광범위한 임상적 특징을 생성하기 때문에 유전학자에게 특히 관심의 대상이 된다. 현재 1형 DM(DM1)으로 불리는 고전적인 형태의 DM은 세포질 단백질 키나제를 인코딩하는 유전자인 DMPK의 3'-비번역 영역(UTR)에서 CTG 반복부의 확장에 의해 초래된다. 본원에 기재된 바와 같은 CRISPR 시스템은 DM1 골격근, 심장 또는 뇌에서 과발현된 RNA 또는 독성 RNA, 예를 들어, DMPK 유전자 또는 임의의 잘못조절된 대체 스플라이싱을 표적화할 수 있다.
본원에 기재된 CRISPR 시스템은 또한, 예를 들어, 프라더 윌리 증후군(Prader Willi syndrome), 척추 근위축증(SMA), 및 선천성 각화증과 같은 다양한 질환을 유발하는 RNA-의존적 기능에 영향을 미치는 트랜스-작용 돌연변이를 표적화할 수 있다. 본원에 기재된 CRISPR 시스템을 사용하여 치료될 수 있는 질환의 목록은 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Cooper et al., "RNA and disease," Cell, 136.4 (2009): 777-793], 및 WO 2016205764에 요약되어 있다.
본원에 기재된 CRISPR 시스템은 또한, 예를 들어, 일차 및 이차 타우병증, 예컨대, 일차 연령-관련 타우병증(PART)/신경섬유 엉킴증(NFT)-우세 노인성 치매(알츠하이머 병(AD)에서 보이지만 플라크는 없는 것들과 유사한 NFT가 있는), 권투선수 치매(만성 외상성 뇌병증), 및 진행성 핵상 마비를 포함하는 다양한 타우병증의 치료에 사용될 수 있다. 타우병증 및 이들 질환을 치료하는 방법의 유용한 목록은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO 2016205764에 기재되어 있다.
본원에 기재된 CRISPR 시스템은 또한 스플라이싱 결손 및 질환을 일으킬 수 있는 시스-작용 스플라이싱 코드를 파괴하는 돌연변이를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 이들 질환은, 예를 들어, SMN1 유전자의 결실로부터 기인한 운동 뉴런 퇴행성 질환(예를 들어, 척수성 근위축증), 뒤센 근이영양증(DMD), 전두측두엽 치매, 17 번 염색체에 연결된 파킨슨병(FTDP-17), 및 낭포성 섬유증을 포함한다.
본원에 기재된 CRISPR 시스템은 추가로 특히 RNA 바이러스에 대항하는 항바이러스 활성을 위해 사용될 수 있다. 이펙터 단백질은 바이러스 RNA를 표적화하도록 선택된 적합한 RNA 가이드를 사용하여 바이러스 RNA 서열을 표적화할 수 있다.
또한, 시험관내 RNA 감지 분석은 특정 RNA 기질을 검출하는 데 사용될 수 있다. RNA 표적화 이펙터 단백질은 살아 있는 세포에서 RNA-기반 감지에 사용될 수 있다. 적용의 예는, 예를 들어, 질환-특이적 RNA를 감지하여 진단하는 것이다.
본원에 기재된 CRISPR 시스템의 치료 용도의 상세한 설명은, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 US 8795965, EP 3009511, WO 2016205764, 및 WO 2017070605에서 찾아볼 수 있다.
식물에서의 적용
본원에 기재된 CRISPR 시스템은 식물에서 매우 다양한 유용성을 갖는다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템은 식물의 게놈을 조작하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 생산 개선, 요망되는 번역후 변형을 갖는 제품 제조, 또는 산업적 제품 생산을 위한 유전자 도입). 일부 구현예에서, CRISPR 시스템은 식물에 요망되는 형질을 도입하거나(예를 들어, 게놈에 대해 유전적 변형을 갖거나 갖지 않는), 식물 세포 또는 전체 식물에서 내인성 유전자의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR 시스템은 특정 단백질, 예를 들어, 알레르겐 단백질(예를 들어, 땅콩, 대두, 편두, 완두, 녹두, 및 길두에서의 알레르겐 단백질)을 인코딩하는 유전자를 동정, 편집 및/또는 침묵시키기 위해 사용될 수 있다. 단백질을 인코딩하는 유전자를 동정, 편집 및/또는 침묵시키는 방법에 관한 상세한 설명은, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Nicolaou et al., "Molecular diagnosis of peanut and legume allergy," Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 11(3):222-8 (2011)] 및 WO 2016205764에 기재되어 있다.
CRISPR 시스템의 전달
본 개시 및 당 분야의 지식을 통해, 본원에 기재된 CRISPR 시스템, 이의 구성 요소, 이의 핵산 분자, 또는 이의 구성 요소를 인코딩하거나 제공하는 핵산 분자는 벡터, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 전달 벡터와 같은 다양한 전달 시스템에 의해 전달될 수 있다. 본원에 개시된 CRISPR 이펙터 및/또는 임의의 RNA(예를 들어, RNA 가이드)는 적합한 벡터, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노-관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스, 아데노바이러스, 및 기타 바이러스 벡터, 또는 이들의 조합을 이용하여 전달될 수 있다. 이펙터 및 하나 이상의 RNA 가이드는 하나 이상의 벡터, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 패키징될 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터는, 예를 들어, 근육내 주사, 정맥내 투여, 경피 투여, 비강내 투여, 경구 투여 또는 점막 투여에 의해 관심 조직으로 전달된다. 이러한 전달은 1 회 용량 또는 다중 용량을 통해 이루어질 수 있다. 당업자는 본원의 전달될 실제 투여량이 벡터 선택, 표적 세포, 유기체, 조직, 치료하고자 하는 대상체의 전반적인 상태, 추구되는 형질전환/변형의 정도, 투여 경로, 투여 방식, 및 추구되는 형질전환/변형의 유형을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 다양한 인자들에 좌우하여 크게 달라질 수 있음을 이해한다.
특정의 구현예에서, 전달은 아데노바이러스를 통해 이루어지며, 이는 아데노바이러스의 적어도 1 × 105 개 입자(입자 단위, pu로도 지칭됨)를 함유하는 1 회 용량일 수 있다. 일부 구현예에서, 용량은 바람직하게는 아데노바이러스의 적어도 약 1 × 106 개 입자, 적어도 약 1 × 107 개 입자, 적어도 약 1 × 108 개 입자, 및 적어도 약 1 × 109 개 입자이다. 전달 방법 및 용량은, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO 2016205764 및 US 8454972에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 전달은 플라스미드를 통해 이루어진다. 투여량은 반응을 유발하기에 충분한 수의 플라스미드일 수 있다. 일부 경우에, 플라스미드 조성물 중 플라스미드 DNA의 적합한 양은 약 0.1 mg 내지 약 2 mg일 수 있다. 플라스미드는 일반적으로 (i) 프로모터; (ii) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산-표적화 CRISPR 이펙터를 인코딩하는 서열; (iii) 선택 가능한 마커; (iv) 복제 기점; 및 (v) (ii)의 하류이며 또한 (ii)에 작동 가능하게 연결된 전사 종결자를 포함할 것이다. 플라스미드는 또한 CRISPR 복합체의 RNA 구성 요소를 인코딩할 수 있지만, 이들 중 하나 이상은 대신에 상이한 벡터에서 인코딩될 수 있다. 투여 빈도는 의학 또는 수의학 전문의(예를 들어, 의사, 수의사) 또는 당업자의 범위 내에 있다.
또 다른 구현예에서, 전달은 리포좀 또는 리포펙틴 제형 등을 통해 이루어지며, 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO 2016205764, US 5593972, US 5589466, 및 US 5580859에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 전달은 나노입자 또는 엑소좀을 통해 이루어진다. 예를 들어, 엑소좀은 전달 RNA에 특히 유용한 것으로 나타났다.
본원에 기재된 CRISPR 시스템의 하나 이상의 구성 요소를 세포에 도입하는 추가 수단은 세포-침투 펩티드(CPP)를 사용하는 것이다. 일부 구현예에서, 세포 침투 펩티드는 CRISPR 이펙터에 연결된다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터 및/또는 RNA 가이드는 세포(예를 들어, 식물 원형질체)로의 수송을 위해 하나 이상의 CPP에 커플링된다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터 및/또는 RNA 가이드(들)는 세포 전달을 위해 하나 이상의 CPP에 커플링된 하나 이상의 원형 또는 비-원형 DNA 분자에 의해 인코딩된다.
CPP는 수용체 독립적 방식으로 세포막을 가로 질러 생물분자를 수송할 수 있는 단백질로부터 또는 키메라 서열로부터 유래된 35 개 미만의 아미노산의 짧은 펩티드이다. CPP는 양이온성 펩티드, 소수성 서열을 갖는 펩티드, 양극성 펩타이드, 프롤린-풍부 및 항-미생물 서열을 갖는 펩티드, 및 키메라 또는 이분 펩티드일 수 있다. CPP의 예는, 예를 들어, Tat(1형 HIV에 의한 바이러스 복제에 필요한 핵 전사 활성자 단백질임), 페네트라틴, 카포시 섬유아세포 성장 인자(FGF) 신호 펩티드 서열, 인테그린 β3 신호 펩티드 서열, 폴리알기닌 펩티드 Arg 서열, 구아닌 풍부-분자 수송체, 및 스윗 애로우 펩티드(sweet arrow peptide)를 포함한다. CPP 및 이들을 사용하는 방법은, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[H
Figure pct00012
llbrink et al., "Prediction of cell-penetrating peptides," Methods Mol. Biol., 2015; 1324:39-58; Ramakrishna et al., "Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA," Genome Res., 2014 Jun;24(6):1020-7]; 및 WO 2016205764에 기재되어 있다.
본원에 기재된 CRISPR 시스템에 대한 다양한 전달 방법은 또한, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 US 8795965, EP 3009511, WO 2016205764, 및 WO 2017070605에 기재되어 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 기술되며, 하기 실시예는 청구항에 기재된 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1 - CLUST.091979 CRISPR-Cas 시스템의 구성 요소 동정
이러한 단백질 패밀리를 상술된 계산 방법을 사용하여 동정하였다. CLUST.091979 시스템은 장, 소의 장, 인간의 장, 양의 장, 지상, 분변 및 포유류의 소화계 환경에 국한되지 않는 환경으로부터 수집된 비배양 메타게놈 서열에서 발견되는 CRISPR 시스템과 관련된 단일 이펙터를 포함한다(표 5). 예시적인 CLUST.091979 이펙터는 하기 표 5 및 표 6에 나타낸 것들을 포함한다. SEQ ID NO: 1 내지 4, 14, 15, 17 내지 19, 21 내지 25, 27 내지 33, 35 내지 49, 51 내지 56에 기재된 이펙터 서열을 도 1a 내지 도 1l에 나타낸 바와 같이 서열 유사성의 영역을 동정하도록 정렬하였다. 막대 그래프는 서열 유사성을 도시한 것이고, 가장 큰 막대는 가장 높은 유사성을 갖는 잔류물을 나타낸다. 서열 유사성의 비-제한적 영역은 표 7에 나타나 있다. 서열 유사성의 영역은 본원에 개시된 이펙터가 뉴클레아제를 나타내는 보존된 C-말단 RuvC 도메인이 있는 패밀리라는 것을 지시한다.
[표 51] 대표적인 CLUST.091979 이펙터 단백질
Figure pct00013
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[표 62] 대표적인 CLUST.091979 이펙터 단백질의 아미노산 서열
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[표 73] CLUST.091979 이펙터의 보존된 서열.
Figure pct00027
Figure pct00028
이들 시스템에 대한 직접 반복부 서열 및 스페이서 길이의 예는 표 8에 나타나 있다.
[표 84] 대표적인 CLUST.091979 직접 반복부의 뉴클레오티드 서열 및 스페이서 길이
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
실시예 2 - 전사활성화 RNA 요소의 동정
이펙터 단백질 및 crRNA 이외에, 본원에 기재된 일부 CRISPR 시스템은 또한 전사활성화 RNA(tracrRNA)로 지칭되는 강력한 효소 활성을 활성화하는 추가의 소형 RNA를 포함할 수 있다. 이러한 tracrRNA는 전형적으로 crRNA에 혼성화하는 상보적 영역을 포함한다. crRNA-tracrRNA 혼성체는 이펙터와 함께 복합체를 형성하여 프로그래밍 가능한 효소 활성을 활성화시킨다.
● tracrRNA 서열은 crRNA의 직접 반복부 부분과 상동성인 짧은 서열 모티프에 대해 CRISPR 어레이에 측접한 게놈 서열을 검색함으로써 동정될 수 있다. 검색 방법은 완전 직접 반복부(DR) 또는 DR 서브서열에 대한 정확한 또는 수정된 서열 매칭을 포함한다. 예를 들어, n 개 뉴클레오티드 길이의 DR은 중첩되는 일련의 6 nt kmer 내지 10 nt kmer로 분해될 수 있다. 이들 kmer는 CRISPR 유전자좌에 측접한 서열에 정렬될 수 있으며, 1 kmer 이상의 정렬을 갖는 상동성 영역은 tracrRNA로서 실험적 검증을 위한 DR 상동성 영역으로 동정될 수 있다. 대안적으로, RNA 코폴드 자유 에너지는 CRISPR 시스템의 요소에 측접한 게놈 서열로부터 짧은 kmer 서열 및 완전 DR 또는 DR 서브서열에 대해 계산될 수 있다. 낮은 최소 자유 에너지 구조를 갖는 측접 서열 요소는 tracrRNA로서 실험적 검증을 위한 DR 상동성 영역으로 동정될 수 있다.
● tracrRNA 요소는 종종 CRISPR 관련 유전자 또는 CRISPR 어레이에 매우 근접하여 발생한다. tracrRNA 요소를 동정하기 위해 DR 상동성 영역을 검색하는 것에 대한 대안으로서, tracrRNA의 직접적인 실험적 검증을 위해 클로닝 또는 유전자 합성에 의해 CRISPR 이펙터 또는 CRISPR 어레이에 측접한 비-코딩 서열이 단리될 수 있다.
● tracrRNA 요소의 실험적 검증은 CRISPR 시스템에 대한 숙주 유기체의 작은 RNA 시퀀싱 또는 비-천연 종에서 이종으로 발현된 합성 서열을 사용하여 수행될 수 있다. 기원한 게놈 유전자좌로부터의 작은 RNA 서열의 정렬은 완전 tracrRNA 요소에 전형적인 DR 상동성 영역 및 스테로타이핑된 가공을 함유하는 발현된 RNA 산물을 동정하는 데 사용될 수 있다.
● RNA 시퀀싱에 의해 동정된 완전 tracrRNA 후보는 tracrRNA 후보와 조합하여 또는 tracrRNA 후보 없이 crRNA 및 이펙터를 발현하고 이펙터 효소 활성의 활성화를 모니터링함으로써 시험관내 또는 생체내에서 검증될 수 있다.
● 조작된 작제물에서, tracrRNA의 발현은 포유류 세포에서의 발현을 위한 U6, U1, 및 H1 프로모터 또는 박테리아에서의 발현을 위한 J23119 프로모터를 포함하지만 이로 제한되지 않는 프로모터에 의해 유발될 수 있다.
● 일부 예에서, tracrRNA는 crRNA와 융합되고 단일 RNA 가이드로서 발현될 수 있다.
● 시스템은 표 9에 열거된 비-코딩 서열 내에 함유된 tracrRNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 시스템은 SEQ ID NO: 152 내지 204 중 어느 하나에 기재된 tracrRNA를 포함한다.
[표 95] 대표적인 CLUST.091979 시스템의 비-코딩 서열
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
실시예 3 - 효소 활성의 신규한 RNA 조절자의 동정
이펙터 단백질 및 crRNA 이외에, 본원에 기재된 일부 CRISPR 시스템은 또한 본원에서 RNA 조절자로 지칭되는 이펙터 활성을 활성화시키거나 조절하는 추가의 소형 RNA를 포함할 수 있다.
● RNA 조절자는 CRISPR-연관 유전자 또는 CRISPR 어레이에 매우 근접하여 발생할 것으로 예상된다. RNA 조절자를 동정하거나 검증하기 위해, CRISPR 이펙터 또는 CRISPR 어레이에 측접한 비-코딩 서열은 직접적인 실험적 검증을 위해 클로닝 또는 유전자 합성에 의해 단리될 수 있다.
● RNA 조절자의 실험적 검증은 CRISPR 시스템에 대한 숙주 유기체의 작은 RNA 시퀀싱 또는 비-천연 종에서 이종으로 발현된 합성 서열을 사용하여 수행될 수 있다. 기원한 게놈 유전자좌로의 작은 RNA 서열의 정렬은 DR 상동성 영역 및 스테로타이핑된 가공을 함유하는 발현된 RNA 산물을 동정하는 데 사용될 수 있다.
● RNA 시퀀싱에 의해 동정된 후보 RNA 조절자는 후보 RNA 조절자와 조합하여 또는 RNA 조절자 없이 crRNA 및 이펙터를 발현하고 이펙터 효소 활성의 변경을 모니터링함으로써 시험관내 또는 생체내에서 검증될 수 있다.
● 조작된 작제물에서, RNA 조절자는 포유류 세포에서의 발현을 위한 U6, U1, 및 H1 프로모터, 또는 박테리아에서의 발현을 위한 J23119 프로모터를 포함하는 프로모터에 의해 유발될 수 있다.
● 일부 예에서, RNA 조절자는 crRNA, tracrRNA, 또는 이 둘 모두와 인공적으로 융합되고 단일 RNA 요소로서 발현될 수 있다.
실시예 4 - 조작된 CLUST.091979 CRISPR-Cas 시스템의 기능 검증
CLUST.091979 CRISPR-Cas 시스템의 구성 요소를 동정한 후, AUXO013988882(SEQ ID NO: 1)로 명명된 메타게놈 소스로부터 및 SRR3181151(SEQ ID NO: 4)로 명명된 메타게놈 소스로부터의 유전자좌를 기능 검증을 위해 선택하였다.
DNA 합성 및 이펙터 라이브러리 클로닝
예시적인 CLUST.091979 CRISPR-Cas 시스템의 활성을 시험하기 위해, pET28a(+) 벡터를 사용하여 시스템을 설계하고 합성하였다. 간략히, CLUST.091979 AUXO013988882 이펙터를 인코딩하는 이. 콜라이 코돈-최적화된 핵산 서열(표 6에 나타낸 SEQ ID NO: 1) 및 CLUST.091979 SRR3181151 이펙터를 인코딩하는 이. 콜라이 코돈-최적화된 핵산 서열(표 6에 나타낸 SEQ ID NO: 4)을 합성하고(Genscript), pET-28a(+) (EMD-Millipore)로부터 유래된 커스텀 발현 시스템으로 개별적으로 클로닝하였다. 벡터는 lac 프로모터 및 이. 콜라이 리보솜 결합 서열의 제어 하에 CLUST.091979 이펙터를 인코딩하는 핵산을 포함하였다. 벡터는 또한 CLUST.091979 이펙터에 대한 개방형 해독 틀에 따라 J23119 프로모터에 의해 유발되는 CRISPR 어레이 라이브러리에 대한 억셉터 부위를 포함하였다. CLUST.091979 AUXO013988882 이펙터에 사용된 비-코딩 서열(SEQ ID NO: 1)은 SEQ ID NO: 98에 기재되고, CLUST.091979 SRR3181151 이펙터에 사용된 비-코딩 서열(SEQ ID NO: 4)은 표 9에 나타낸 바와 같이 SEQ ID NO: 99에 기재된다. CLUST.091979 이펙터를 비-코딩 서열 없이 개별적으로 pET28a(+)에 클로닝한 추가 조건을 시험하였다. 도 4a를 참조한다.
"반복부-스페이서-반복부" 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드 라이브러리 합성(OLS) 풀을 계산적으로 설계하였고, 여기서 "반복부"는 이펙터와 관련된 CRISPR 어레이에서 확인되는 콘센서스 직접 반복부 서열을 나타내고, "스페이서"는 pACYC184 플라스미드 또는 이. 콜라이 필수 유전자를 타일링(tiling)하는 서열을 나타낸다. 특히, 표 8에 나타낸 바와 같이, CLUST.091979 AUXO013988882 이펙터에 사용된 반복부 서열(SEQ ID NO: 1)은 SEQ ID NO: 57에 기재되고, CLUST.091979 SRR3181151 이펙터에 사용된 반복부 서열(SEQ ID NO: 4)은 SEQ ID NO: 60에 기재된다. 스페이서 길이는 내인성 CRISPR 어레이에서 확인되는 스페이서 길이의 모드에 의해 결정되었다. 반복부-스페이서-반복부 서열은 상기 언급된 CRISPR 어레이 라이브러리 억셉터 부위로 단편의 양방향 클로닝을 가능하게 하는 제한 부위, 뿐만 아니라 더 큰 풀로부터 특정 반복부-스페이서-반복부 라이브러리의 특정 증폭을 가능하게 하는 고유한 PCR 프라이밍 부위가 추가되었다.
다음으로, 반복부-스페이서-반복부 라이브러리를 Golden Gate 조립법을 사용하여 플라스미드로 클로닝하였다. 간략히, 각각의 반복부-스페이서-반복부를 고유한 PCR 프라이머를 사용하여 OLS 풀(Agilent Genomics)로부터 먼저 증폭시키고, 잠재적인 배경을 감소시키기 위해 BsaI를 사용하여 플라스미드 백본을 예비-선형화시켰다. 둘 모두의 DNA 단편을 골든 게이트 어셈블리 마스터 믹스(New England Biolabs)에 첨가하기 전에 Ampure XP(Beckman Coulter)로 정제하고, 제조업체의 지침에 따라 인큐베이션하였다. 골든 게이트 반응을 박테리아 스크린의 후속 단계에서 최대 형질전환 효율을 가능하게 하기 위해 추가로 정제하고 농축시켰다.
별개의 반복부-스페이서-반복부 요소 및 CRISPR 이펙터를 함유하는 플라스미드 라이브러리를 Lucigen에서 권장하는 프로토콜에 따라 Gene Pulser Xcell®(Bio-rad)을 사용하여 이. 클로니 전기적격 이. 콜라이(Lucigen)로 전기천공하였다. 라이브러리를 정제된 pACYC184 플라스미드로 공동-형질전환시키거나 pACYC184-함유 이. 클로니 전기적격 이. 콜라이(Lucigen)로 바로 형질전환시키고, BioAssay® 디쉬(Thermo Fisher)에 클로람페니콜(Fisher), 테트라사이클린(Alfa Aesar) 및 카나마이신(Alfa Aesar)을 함유한 한천 상에 플레이팅하고, 37℃에서 10 시간 내지 12 시간 동안 인큐베이션하였다. 박테리아 플레이트에서 충분한 라이브러리 표현을 보장하기 위해 대략적인 콜로니 수를 추정한 후, 박테리아를 수확하고, "출력 라이브러리"를 생성하기 위해 QIAprep Spin Miniprep® 키트(Qiagen)를 사용하여 플라스미드 DNA WAS를 추출하였다. Illumina 시퀀싱 화학과 상용성인 바코드 및 부위를 함유하는 맞춤형 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써, 바코드화된 차세대 시퀀싱 라이브러리를 형질전환 전 "입력 라이브러리"와 수확 후 "출력 라이브러리" 둘 모두에서 생성한 다음, 풀링하고, Nextseq 550(Illumina) 상에 로딩하여 이펙터를 평가하였다. 일관성을 보장하기 위해 각 스크린에 대해 적어도 2 회의 독립적인 생물학적 복제를 수행하였다. 도 4b를 참조한다.
박테리아 스크린 시퀀싱 분석
스크린 입력 및 출력 라이브러리에 대한 차세대 시퀀싱 데이터를 Illumina bcl2fastq를 사용하여 역다중화시켰다. 스크리닝 플라스미드 라이브러리에 대한 CRISPR 어레이 요소를 함유한 각 샘플에 대하여 생성된 fastq 파일을 판독하였다. CRISPR 어레이의 직접 반복부 서열을 사용하여 어레이 방향을 결정하고, 스페이서 서열을 소스(pACYC184 또는 이. 클로니) 또는 음성 대조군 서열(GFP)에 맵핑하여 상응하는 표적을 결정하였다. 각 샘플에 대해, 주어진 플라스미드 라이브러리에서 각각의 고유한 어레이 요소(ra)에 대한 총 판독수를 계산하고, 다음과 같이 정규화하였다: (ra+1)/모든 라이브러리 어레이 요소에 대한 총 판독 수. 주어진 어레이 요소에 대한 정규화된 출력 판독치를 정규화된 입력 판독치로 나눔으로써 고갈 점수를 계산하였다.
효소 활성 및 박테리아 세포 사멸을 야기하는 특정 매개변수를 확인하기 위해, 차세대 시퀀싱(NGS)을 사용하여 입력 및 출력 플라스미드 라이브러리의 PCR 산물에서 개별 CRISPR 어레이(즉, 반복부-스페이서-반복부)의 표현을 정량화하고 비교하였다. 정규화된 출력 판독치를 정규화된 입력 판독치로 나눈 값으로 어레이 고갈 비율을 규정하였다. 고갈 비율이 0.3 미만인 경우 어레이는 "강하게 고갈된"것으로 간주되며(3 배가 넘는 고갈), 이는 도 5 및 도 8에서 점선으로 표시되어 있다. 생물학적 복제물에 걸친 어레이 고갈 비율을 계산할 때, 모든 실험에 걸쳐 주어진 CRISPR 어레이에 대한 최대 고갈 비율 값을 얻었다(즉, 강하게 고갈된 어레이는 모든 생물학적 복제물에서 강하게 고갈되어야 함). 어레이 고갈 비율을 포함하는 매트릭스 및 다음 특징을 각 스페이서 표적에 대해 생성하였다: 표적 가닥, 전사체 표적화, ORI 표적화, 표적 서열 모티프, 측접 서열 모티프, 및 표적 이차 구조. 이러한 매트릭스의 상이한 특징이 CLUST.091979 시스템에 대한 표적 고갈을 설명한 정도를 조사하였다.
도 5 및 도 8은 주어진 표적에 대해, 스크린 입력 대비 스크린 출력에서 시퀀싱 판독치의 정규화된 비율을 플롯팅함으로써, 비-코딩 서열을 갖는 조작된 CLUST.091979 조성물의 간섭 활성도를 나타낸 것이다. 결과는 각 DR 전사 방향에 대해 플롯팅된 것이다. 상기 조성물에 대한 기능적 스크리닝에서, 활성 RNA 가이드와 복합된 활성 이펙터는 클로람페니콜 및 테트라사이클린에 대한 이. 콜라이 내성을 부여하는 pACYC184의 능력을 방해하여 풀 내에서 스페이서 요소 고갈 및 세포 사멸을 초래할 것이다. 살아 있는 형질전환된 이. 콜라이(스크린 출력) 대비 초기 DNA 라이브러리(스크린 입력)을 딥 시퀀싱한 결과의 비교는 활성의 프로그래밍 가능한 CRISPR 시스템을 가능하게 하는 특정 표적 서열 및 DR 전사 방향을 시사한다. 스크린은 또한 이펙터 복합체가 DR의 한 방향에서만 활성이라는 것을 지시한다. 따라서, 스크린은 CLUST.091979 AUXO013988882 이펙터가 DR의 "정" 방향(5'-ACTA…AACT-[스페이서]-3')으로 활성이었고(도 5), CLUST.091979 SRR3181151 이펙터가 DR의 "역" 방향(5'-CCTG…CAAC-[스페이서]-3')에서 활성이었다(도 8)는 것을 지시하였다.
도 6a 및 도 6b는 각각 pACYC184 및 이. 콜라이 이. 클로니 필수 유전자를 표적화하는 CLUST.091979 AUXO013988882 이펙터(비-코딩 서열과 함께)에 대한 강하게 고갈된 표적의 위치를 도시한 것이다. 마찬가지로, 도 9a 및 도 9b는 각각 pACYC184 및 이. 콜라이 이. 클로니 필수 유전자를 표적화하는 CLUST.091979 SRR3181151 이펙터에 대한 강하게 고갈된 표적의 위치를 도시한 것이다. 고갈된 표적의 측접 서열을 분석하여 CLUST.091979 AUXO013988882 및 CLUST.091979 SRR3181151에 대한 PAM 서열을 결정하였다. CLUST.091979 AUXO013988882 및 CLUST.091979 SRR3181151에 대한 PAM 서열의 WebLogo 표현(Crooks et al., Genome Research 14: 1188-90, 2004)은 각각 도 7 및 도 10에 나타나 있으며, 여기서 "20" 위치는 표적의 5' 말단에 인접한 뉴클레오티드에 상응한다.
따라서, CLUST.091979 CRISPR-Cas의 다중 이펙터는 생체내 활성을 나타낸다.
실시예 5 - CLUST.091979에 의한 포유류 유전자의 표적화
본 실시예는 일시적 형질감염에 의해 포유류 세포에 도입된 CLUST.091979로부터의 뉴클레아제를 사용한 다중 표적에 대한 인델 평가를 기술한 것이다.
SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 10의 이펙터를 pcda3.1 백본(Invitrogen)에 클로닝하였다. 플라스미드를 이후 맥시-프렙핑하고, 1 μg/μL로 희석하였다. RNA 가이드 제조를 위해, crRNA를 인코딩하는 dsDNA 단편을 표적 서열 스캐폴드를 함유하는 울트라머, 및 U6 프로모터에 의해 유발하였다. 울트라머를 7.5의 pH에서 100 μM의 최종 스톡 농도로 10 mM Tris·HCl에 재현탁시켰다. 이후 작업 스톡을 다시 10 mM Tris·HCl을 사용함으로써 10 μM로 희석하여 PCR 반응을 위한 주형으로 사용하였다. crRNA의 증폭을 다음 성분들을 사용하여 50 μL 반응으로 수행하였다: 0.02 μl의 상기 언급된 주형, 2.5 μl의 정방향 프라이머, 2.5 μl의 역방향 프라이머, 25 μL의 NEB HiFi 중합 효소, 및 20 μl의 물. 사이클링 조건은 다음과 같았다: 1 × (98℃에서 30s), 30 × (98℃에서 10s, 67℃에서 15s), 1 × (72℃에서 2min). PCR 산물을 1.8X SPRI 처리로 세정하고, 25 ng/μL로 정규화하였다. 제조된 crRNA 서열 및 이들의 상응하는 표적 서열은 표 10에 나타나 있다. SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 274, 및 SEQ ID NO: 276의 성숙 crRNA의 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 60에 기재된다. SEQ ID NO: 209 및 SEQ ID NO: 214의 성숙 crRNA의 직접 반복부는 SEQ ID NO: 62에 기재된다. SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 286, 및 SEQ ID NO: 288의 성숙 crRNA의 직접 반복부는 SEQ ID NO: 213에 기재된다.
[표 10]
일시적 형질감염 검정에 대한 RNA 가이드 및 표적 서열.
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
형질감염 약 16 시간 전에, DMEM/10% FBS+Pen/Strep 중 100 μl의 25,000 개 HEK293T 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅하였다. 형질감염 당일, 세포는 70% 내지 90% 융합성이었다. 형질감염될 각 웰에 대해, 0.5 μl의 리포펙타민 2000 및 9.5 μl의 Opti-MEM의 혼합물을 제조한 다음 실온에서 5 분 내지 20 분 동안 인큐베이션하였다(용액 1). 인큐베이션 후, 리포펙타민:OptiMEM 혼합물을 182 ng의 이펙터 플라스미드 및 14 ng의 crRNA 및 최대 10 μL의 물을 함유하는 별개의 혼합물에 첨가하였다(용액 2). 음성 대조군의 경우, crRNA는 용액 2에 포함되지 않았다. 용액 1 및 용액 2 혼합물을 위아래로 피펫팅하여 혼합한 다음 실온에서 25 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 20 μL의 용액 1 및 용액 2 혼합물을 세포를 함유하는 96 웰 플레이트의 각 웰에 적가하였다. 형질감염 72 시간 후, 세포를 각 웰의 중앙에 10 μL의 TrypLE을 첨가하여 트립신화하고, 약 5 분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 100 μL의 D10 배지를 각 웰에 첨가하고, 혼합하여 세포를 재현탁시켰다. 그 후에, 세포를 500 g에서 10 분 동안 회전시키고, 상청액을 폐기하였다. QuickExtract 완충액을 본래의 세포 현탁액 부피의 1/5 양으로 첨가하였다. 세포를 65℃에서 15 분, 68℃에서 15 분, 및 98℃에서 10 분 동안 인큐베이션하였다.
차세대 시퀀싱을 위한 샘플을 2 라운드의 PCR에 의해 제조하였다. 제1 라운드(PCR1)를 사용하여 표적에 좌우하여 특정 게놈 영역을 증폭시켰다. PCR1 산물을 컬럼 정제에 의해 정제하였다. Illumina 어댑터 및 인덱스를 추가하기 위해 라운드 2 PCR(PCR2)을 수행하였다. 그 후에, 반응을 풀링하고, 컬럼 정제에 의해 정제하였다. 150 사이클 NextSeq v2.5 중 또는 고 출력 키트로 시퀀싱 실행을 수행하였다.
도 11a, 도 11b, 도 11c, 및 도 11d는 각각 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 10의 이펙터로 형질감염 후 HEK293T 세포에서 AAVS1, VEGFA, 및 EMX1 표적 유전자좌 중 인델 퍼센트를 나타낸다. 막대는 2 개의 생물복제물에서 측정된 평균 인델 퍼센트를 반영한다. SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 10의 이펙터에 대해, 인델 퍼센트는 각각의 표적에서 음성 대조군의 인델 퍼센트보다 높았다.
도 11a에 도시된 바와 같이, SEQ ID NO: 4의 이펙터와 SEQ ID NO: 205의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 206의 AAVS1 표적에서 활성이고, SEQ ID NO: 4의 이펙터와 SEQ ID NO: 207의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 208의 VEGFA 표적에서 활성이었다. 도 11b에 도시된 바와 같이, SEQ ID NO: 4의 이펙터와 SEQ ID NO: 252의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 253의 AAVS1 표적에서 활성이고, SEQ ID NO: 4의 이펙터와 SEQ ID NO: 254의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 255의 AAVS1 표적에서 활성이고, SEQ ID NO: 4의 이펙터와 SEQ ID NO: 256의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 257의 AAVS1 표적에서 활성이고, SEQ ID NO: 4의 이펙터와 SEQ ID NO: 258의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 259의 AAVS1 표적에서 활성이고, SEQ ID NO: 4의 이펙터와 SEQ ID NO: 274의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 275의 AAVS1 표적에서 활성이었다. 또한, 도 11b에 나타낸 바와 같이, SEQ ID NO: 4의 이펙터와 SEQ ID NO: 260의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 261의 EMX1 표적에서 활성이었다. 또한, 도 11b에 나타낸 바와 같이, SEQ ID NO: 4의 이펙터와 SEQ ID NO: 262의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 263의 VEGFA1 표적에서 활성이고, SEQ ID NO: 4의 이펙터와 SEQ ID NO: 264의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 265의 VEGFA1 표적에서 활성이고, SEQ ID NO: 4의 이펙터와 SEQ ID NO: 266의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 267의 VEGFA1 표적에서 활성이고, SEQ ID NO: 4의 이펙터와 SEQ ID NO: 268의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 269의 VEGFA1 표적에서 활성이고, SEQ ID NO: 4의 이펙터와 SEQ ID NO: 270의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 271의 VEGFA1 표적에서 활성이고, SEQ ID NO: 4의 이펙터와 SEQ ID NO: 272의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 273의 VEGFA1 표적에서 활성이고, SEQ ID NO: 4의 이펙터와 SEQ ID NO: 274의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 275의 VEGFA1 표적에서 활성이었다. SEQ ID NO: 4의 이펙터는 도 11a 및 도 11b에서 각 표적에 대하여 5'-TTTG-3' PAM을 사용하였다.
도 11c에 나타낸 바와 같이, SEQ ID NO: 10의 이펙터와 SEQ ID NO: 209의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 210의 AAVS1 표적에서 활성이고, SEQ ID NO: 10의 이펙터와 SEQ ID NO: 211의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 212의 AAVS1 표적에서 활성이고, SEQ ID NO: 10의 이펙터와 SEQ ID NO: 214의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 215의 VEGFA 표적에서 활성이었다. 도 11d에 나타낸 바와 같이, SEQ ID NO: 10의 이펙터와 SEQ ID NO: 278의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 279의 AAVS1 표적에서 활성이고, SEQ ID NO: 10의 이펙터와 SEQ ID NO: 280의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 281의 AAVS1 표적에서 활성이고, SEQ ID NO: 10의 이펙터와 SEQ ID NO: 284의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 285의 AAVS1 표적에서 활성이고, SEQ ID NO: 10의 이펙터와 SEQ ID NO: 286의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 287의 AAVS1 표적에서 활성이었다. 또한, 도 11d에 나타낸 바와 같이, SEQ ID NO: 10의 이펙터와 SEQ ID NO: 288의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 289의 EMX1 표적에서 활성이고, SEQ ID NO: 10의 이펙터와 SEQ ID NO: 282의 crRNA에 의해 형성된 복합체는 SEQ ID NO: 283의 VEGFA 표적에서 활성이었다. SEQ ID NO: 10의 이펙터는 도 11c 및 도 11d에서 표적에 대하여 5'-ATTG-3' PAM 및 5'-GTTA-3' PAM을 사용하였다.
본 실시예는 CLUST.091979 패밀리에서 뉴클레아제가 포유류 세포에서 활성을 갖는다는 것을 시사한다.
기타 구현예
본 발명은 발명의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 상기 설명은 본 발명을 예시하려고 의도된 것이고 본 발명의 범위를 제한하려고 의도된 것이 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항의 범위에 의해 규정된다는 것을 이해해야 한다. 기타 양태, 이점, 및 변형은 하기 청구항의 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ARBOR BIOTECHNOLOGIES, INC. <120> NOVEL CRISPR DNA TARGETING ENZYMES AND SYSTEMS <130> A2186-7028WO <140> <141> <150> 62/897,859 <151> 2019-09-09 <160> 290 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 775 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: gut metagenome sequence <400> 1 Met Gly Asn Thr Thr Lys Lys Gly Asn Leu Thr Lys Thr Tyr Leu Phe 1 5 10 15 Lys Ala Asn Leu Ser Glu Gln Asp Phe Lys Leu Trp Arg Ser Ile Val 20 25 30 Glu Glu Tyr Gln Arg Tyr Lys Glu Val Leu Ser Lys Trp Val Cys Asp 35 40 45 His Leu Thr Thr Met Lys Ile Gly Asp Ile Leu Pro Tyr Ile Asp Arg 50 55 60 Tyr Ser Lys Lys Ile Asp Asn Lys Thr Gly Glu Tyr Pro Glu Asn Thr 65 70 75 80 Tyr Tyr Ser Leu Cys Glu Glu His Lys Asp Glu Pro Leu Tyr Lys Ile 85 90 95 Phe Gln Phe Asp Ser Asn Cys Arg Asn Asn Ala Leu Tyr Glu Val Ile 100 105 110 Arg Lys Ile Asn Cys Asp Leu Tyr Thr Gly Asn Ile Leu Asn Leu Gly 115 120 125 Glu Thr Tyr Tyr Arg Arg Asn Gly Phe Val Lys Arg Val Leu Ala Asn 130 135 140 Tyr Ala Thr 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 61 attgttgtaa ctcttatttt gtatggagta aacaac 36 <210> 62 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 62 attgttgtag acaccttttt ataaggattg aacaac 36 <210> 63 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 63 cttgttgtat atactctttt ataggtatta aacaac 36 <210> 64 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 64 cttgttgtat atgtcctttt ataggtatt 29 <210> 65 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 65 cttgttgtat atgtcttttt ataggtattg aacaac 36 <210> 66 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 tactcttttt taggtaatga acaac 25 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 72 attgttgtac gaaccatttt atatggtaat aacaac 36 <210> 73 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 73 actgtaaaac ccctgcagat gaaaggaaag tacaacagt 39 <210> 74 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 74 atcatgttgt acatactatt ttttaagtat taaacaacta 40 <210> 75 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 75 attgttgaat ggctatgttt gtatgctatt tacaac 36 <210> 76 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 76 attgttgggg tacttctttt atagggtact cacaac 36 <210> 77 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 77 attgttgtag accttgtgtt ttaggggtct aacaacg 37 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Synthetic oligonucleotide <400> 83 attgtgttgg gatacacttt tataggtatt tacaac 36 <210> 84 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 tattgttgaa tacctttctt ataaaggtaa ttacaac 37 <210> 85 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 tgttgtaaat ggctttttat gggcaacgaa caactc 36 <210> 86 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 86 attgttgaat gtattctttt ttaggacaga tacaac 36 <210> 87 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 87 attgttgaat ggtatctttt atagactgat tacaact 37 <210> 88 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 88 attgttggat aataggtttt ttatcttaat tacaac 36 <210> 89 <211> 36 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cgtttcgtga gcttggcaat gtgaaatacg gcaaaatcaa 480 caatgaaggg ctttttgtcg aagacgatgt gtaaacatta agatttccat acgacaggat 540 tcaaaaaaac gttctttgaa atattggatt ggtggcaaga ggctgttttt tttaggctaa 600 aaagttgtgt aaatagcaga aacacagaac ataacataaa atct 644 <210> 92 <211> 264 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: mammals-digestive system-rumen-bos taurus sequence <400> 92 aactgctaca attctgccga gtttatgatt cagacaaaat tcaaaaaaag acttccgcaa 60 gcaaccgttt ttggtgaatt gaacagaaac gggtatgtta aagtattgac ccaagaagaa 120 tatgacgaac tcacaaaatc agcaaaataa tttattactg attgaaaaat aaagcgttct 180 ttgacatatt gtataacaaa caagcatttt tgtaagagat aacccatttc attttattga 240 tatacaatga aatgaaaaga atat 264 <210> 93 <211> 614 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: bovine gut metagenome sequence <400> 93 gataaatttg cccgtaatgt tatcgggttc aagtcatatc acgaactgct tgataatgct 60 atcataaaag aaaaattaca acgggaattt ggttatgaag atgctccgaa aacgtggttg 120 ttcggacaac aaaaaaatga atgtttctaa tgtattaaaa caataattca attacaattt 180 taagattatg gcacaacaca aatcaaacaa cgaagaatca gcaatcaaca agactttcat 240 tttcaaggca aaatgcgata agaacgatgt catatcgtta tgggaaccag cggcaaagga 300 atactgcgac tattataaca aagtgagcaa gtggattaaa actatgtata acatacccgc 360 atataacatt aagtccaatt tcaagaaaaa tttgagcgcc aaaacaattc aaacttttag 420 agaacttgga cactaccgtg acggaaaaat aaatgaggat ggtatgtttg ttgaaaactt 480 ggaataattc tgtatatacc aattagaatt gaaaaaaaaa cgctctttga catattgttt 540 tctacataaa aacaagattt tacacaacgc aatacatcat aaagtgttgc gttataacaa 600 ataacaaaaa ttct 614 <210> 94 <211> 1041 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: mammals-digestive system-cattle and sheep rumen sequence <400> 94 tttattcaat gcgaaccaga ggtcttgacg catgaatctg gctatacata tcgttatgcg 60 accgacgaag agaaaatatt gattaaaaga tgcaaatatt gaataggcaa ttttaaattg 120 tgaaaaaaaa aatgattgaa tataagttta cgtttgaact ggatggacat ctatcggcgt 180 acgattttgt tacgttgcaa gaacggtttg aaagggaatt gaatccttat tttgatgatg 240 ggagcatatc tggtactctt tcttatgcaa atgatgatta atatgcaaat aatatggcac 300 atgtaagaac aaaaaatgaa ggaaacatgg caaaaacata ttcttttaag gtcagagaaa 360 caaaccttaa aaaggatgtg atgattgaat ataacgaata ttataacagg ttatccgatt 420 ggatatgtgg caatttaacc aaaatctcgg aaaatgaaga atggaggaat gccttatgca 480 aaccaacaga aaacatgtac aacgaaccga tttacgttcc cttggttaaa tcacagaacg 540 gaatgttcaa ggcaattaaa aaattgggcg caacgaagat atggcaagaa tagaaagacc 600 gatttttaaa tctgaaatca cttctaacga attgtatact aaagaaatat aaagaatata 660 catcttttat gacattatga tattgttgta tgcatcattt cacatggtaa taacaacgaa 720 gagaaacacc gagcgaccca caaacctatt gtcgtacgca tcatttcaca tgataataac 780 aacgaatatt cctgcaagca tgatttaaca atttttaaga acctggtggt ttctccgttg 840 ggttcttttt agtatctttg ccttgttgaa acaaataaaa caaattgaat tatgatttat 900 aaaggcaaag aaatagacga aagttaccac atcaataaat gggaagatga agagatttac 960 tctggtccaa cccattatga atcattcgaa gccgatgaaa taaaagagtt ctacctcaag 1020 gcacttgcaa aggaaaagga a 1041 <210> 95 <211> 1545 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: gut metagenome sequence <400> 95 gtgcgcatat acactcaatt cgccgatgac cgtgtgtacg cgaaggattg tatcgacgga 60 ttctttagta taagacaaga taccgaaatg cgcctcgtgt ataaaaatga gatagcacgc 120 gggcttgagt gtatcaatat tgtaagatag tagttttctg ttattttaca tattgatgtg 180 ttttggcatg gtttttgtta aaatataatc tagcagtatt gagactgcgg agtaacgtgt 240 ctaactgttt cattataagc agtaaagact aatattttta tatcttaaac ttatttttat 300 tatggctggt cacagcaaaa tcaaagaaaa tcacattatg aaggcgtttc ttatgaaagt 360 aaaagaaacg cgaaaaaaac agtggcaatc aaattttatt agaagtgaga ttgctaagtt 420 tacaaattat tacaatgggc tgtcaaagtt ccttcttgga agcccgactg gagggacata 480 tgacactgca tattttgata caaagattca aggctccaag ggggtatatg ataagattaa 540 agaaaacgga gaaacttata ttgcagtatt aagtgatgac gttattacgg cagaggtgta 600 aaatcctctg ccaacatcgc aagtaactca ttgaaaatta gttaaatgcg aatgccaaca 660 aaagtgaacg aactgacttg taaagcagga tgttgttata tctttttgta gataataagc 720 aacaagatac aatcaatcgc gagtttatac tgaaatgttg ttacactgtt tttgtaagtg 780 ttaaacaacc ttgcacaaat gtcatctacc agtacaatag atgttgttat actgttttgt 840 aggtattaaa caaccattgc gcagactgac agagtaacct ttcctgatat gttgttacac 900 atttttgtaa gtgttaaaca actgacgcat tgatattgcc ttgtctatta agaatgttgt 960 tatgctcttt ttattggtat aaacaaccga gcaactggta ctcaaatttt aaatactgtc 1020 gcgctatgtt atgtacatcg aacagctacc actcaatggc tttgtttgca accgtgatta 1080 attcaatcgc ggttgcattt gttttatgat gtgtttttgt atatattatg tatatatgga 1140 aaaggaaaac agggtatcgg agttatggag caagttctct gatattgact tgcgccgaag 1200 ccaaatgaca tatatgccaa taagaggtag taaaagatac ggcagaagaa taaaacgtag 1260 tgacatcgag tacgagtaca gatatctgta tagagcaaac aaacattggt aatatgaccg 1320 tagctaaatt atcaagtaat cataagccag cgtgccttgg acgaatctca gctttaaaca 1380 ccccgattag atttgagtgt cgggctggta atagtataag gcctggcaac atagagtata 1440 gctataaaag atggaaaacg tcgtaatttc aactatgcac aacccgcata cgctggctta 1500 ttaccaaggt aagctggctc ctatgcattt cagacaagat acagg 1545 <210> 96 <211> 1380 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: mammals-digestive system-cattle and sheep rumen sequence <400> 96 agcctgtata cagggacaag gttaagtaca acaccaaggc tgaggcaaag aagagggctg 60 atgatatgaa caaacagaat agggtcatac accagctgtc tgtttatttg tgtcctaaat 120 gtcataagtg gcatataggt aggagcagtg tggagagtgt gcgcagggaa gggtacttta 180 gtcagatttg aaattaattg ttatatggcg catagaaata aaaacctagc agaaaactgc 240 attaacaaaa cattcagttt taaagtcaaa gccgaaaaag aggagataaa ttcaaaatgg 300 attccagcca ttaaagaata tactgcttat tataacagga taagtgactg gataaacctg 360 tattcacagc ctacttatga tattaaggaa gtttataaga aaaacgctgg ttgcaaagtg 420 ataaacgact tcattaaaaa cggtaacgcc gttatatgtt gtatcgaaaa taacaaacta 480 attgagacaa atggaagaca atagttcaaa ttttaaatgt aaaacagtca ttaatgtatt 540 aatatataat acatagcaaa aatccagatg ttgaatacat ttcttttaag tgtacttaca 600 acgcggtggc attgctaaaa tatagtcctg tggatgttga atacatttct tttaagtgta 660 cttacaacca acgctgtaca cattgctaat ggatgatgac gatatagagg tgttgaacta 720 ccttaatgaa aactacacca atgaaaacat tgagtatata cgcggttggt ggatggatga 780 cgacgataaa ctccagacac ttgacaggtt tttgaaaaat ttttcaatat agacctgtca 840 ctgttgcggc tataagaaga ccgatttgac actgaaagac cgatactggg tttgccccga 900 atgcggtgca aaactagacc gcgataccaa tgcaggaata aacattaaga atgagacaat 960 tagactgata aacaaagaat aatgagaact ataataggga ggtgtacccc cgaatttaag 1020 ccagtggaga accatacaaa cctatcatat aggggttcaa tgaatctgga atttctgaca 1080 aaaacagggt ttaacagcca gtgtaccaat gactaacaca ggacatataa agacaaatct 1140 aacaataaaa aaaaatattg accaattctg cagaaaaaac aggttggttt cggttatgtt 1200 ggtgaataaa gacagttaga ttaattttat atggaaatga aaatagagac aaaagacgag 1260 aacatctacg tattcatcta tgccaagtcc gcctacttcg gcaatacatt tgaatatggc 1320 ggcacatttt ccgtcggcaa ggacgacaac tggaacgatg tgagaggcca cgttaccgaa 1380 <210> 97 <211> 853 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: mammals-digestive system-rumen-ovis aries sequence <400> 97 gacaacatcc tggtcaagac cgaggttaac agaaggtact gccgccttat gaccgacgag 60 aacggagtgt ggctcctgag gaaaaacgac aaacatccaa catattttat ctaccagaac 120 ggaacactct atcaatatga ggaagattga ttagttgatg ttttcataat aattttatct 180 ggaatttgaa aagattccag attttttttt tatttcgact gtacaaaaaa caggttccgt 240 tgcgttatat aggtgtaaat taaaaattca gtcaaacaaa aattggaata aaatatggct 300 aacaagagaa cagacacaac aatcaacctt aacaaaaccg ttataatgtt aacgaacatg 360 ctgccagaag tacgggcaat gtttcaggcg ggaatacgcc aggctcaagt ttatgcagac 420 ttggtgaaca agtggatatg ttcacaggaa atgagagagg ttatgtgtct ccatccgtca 480 aaaaaggacg gggtgtacga ccaaccgttc ctgaaagcta caaccaaata cccagccacg 540 gtagctggta tcctgcttaa gatgggaaaa acaaccaatt ggggtgagaa ataataccca 600 cccgccccat ttttttacac tgattagttc tttgacttat tgatttatat tggtttacac 660 aaattatcga cacaataaat aaaaaaaatt gtatattagt agtatgatga cagaagaaac 720 acggaagaca atagagagcg tcatagtggt tctcggcata gcaatcatgc tggcagccgc 780 cgtccgaata atgacgcaga acaaagcaat tgtgaaatat gatgaacagg ttgaaaccat 840 gcaaacttgc ata 853 <210> 98 <211> 795 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: gut metagenome sequence <400> 98 atggaagttg tacgtggtgg aaatcaatgg gaggtttatg acaattacga tgagactatg 60 aaagcatcaa aaaatgtaag gtctgtattg ggacttccgg aagtaaaata tccacctgag 120 gattttagga catataattt ctaataaaaa tgaacggaaa aatttccgtt catttttttt 180 ttgtttattg gtgaaaaaat agtatctttg taaaaaataa atgttaaaat attttttatg 240 ggaaatacta caaaaaaagg aaatttgacg aagacttatt tattcaaagc caatctttca 300 gaacaagact ttaaattatg gaggtctatt gttgaagagt atcaaagata taaggaagtg 360 ttgagtaaat gggtatgtga ccatcttaga aatgcaatgt gtacgaaccc gaaaagtgag 420 actggatatt ctgtaccgtt cttgacttca agaatcaaga aacagaacat tatggttgta 480 gaattgaaaa aaatgggcat ggttgaagtc ttgaatgaaa aatcaacaga aatttaagaa 540 aaaaatattt atataatgta ctgaaaataa gtaaataata aatattgtgt aaaaaacttg 600 atattttttt tttgttatct ttataatata aaataaaatg taaatatgaa aaatctgtta 660 aaactcaaag aacaaatcaa ggattacaaa catcttcagt ttgtgttgga gaaagaagat 720 gaatctgaac tccattatag atgtatgact gaagattttt cgttcaaggt atctgaagaa 780 aaagacggaa cactt 795 <210> 99 <211> 420 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: bovine gut metagenome sequence <400> 99 ttataaacat ctaaaaagaa agacttatga caacaaaaca agttaaatca atcgttttaa 60 aagtaaaaaa cactaatgaa tgccctatta caaaagatgt aataaatgaa tataaaaaat 120 attataatat atgtagtgaa tggattaaag ataatctaac aagtattact attggaaacg 180 aaaatttacg aaaattattt tgtggtaaac ttaaagtaag tggatataat acaccaatat 240 tagacgcaac aaaaaaaggt caatttaata tattggcaga attaaaaaaa cagaataaaa 300 ttaaaatatt tgaaatagaa aaataagtct tatgattaca aaaataatag atttcaaaca 360 ttttttttaa ttctatttta ttgactaatt cattgaaata taaataatta caaataaccc 420 <210> 100 <211> 1058 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: mammals-digestive system-rumen-ovis aries sequence <400> 100 gatagatata gtattgcagc atttctggct tgcgaatcat cagcaatgca aaaatgtgac 60 tattggaaca atgatgatgc ccaagattac ataagaaact acaaagaggc ttatagtaat 120 gcagtaagac ttgcgttttt taatgattaa gcaacacgct taacattgtc aaatgtaacg 180 acattaagtg cgtgtttcat aagggcagcg aacctttcgc cgcccttctt tttttgttgc 240 tgtaacggaa ttatgtttac ttttgtgcca tcaagtatat agttccctta ataaattgta 300 tattaattaa aagtttggca caatatttga tgcgtacaaa ttaaaataaa aacattttga 360 attttaaaat ttaatttgta attttaaata agaaagtttt atttaactaa aataaaaaaa 420 atgaataaat cttatgtttt taagtcgaat gtggctattg atgacattat gtctttattt 480 gaaccggcaa ttgaagagta cataaactat tacaatagaa ccagcgattt catttgtgat 540 aatcttacat caatgaaaat cggagatttg ttgcttctaa caatgtgtac taagacaaaa 600 gaaaataata gatacggtaa ccccctctat aatatcaaag atacttttaa aaagaaaata 660 ccatcttcaa tacttaatat attcaaaaaa aaggatatgt atcaaataat atgtgattaa 720 ttatgccttt ttttaataaa aaattgttaa ataatacttt gtttattaat aaattataaa 780 tatcacagta aactattagg gatttgtaaa atttatggaa attatataca tgatggcact 840 aagatttggt tattaagaaa tttttctgta taagtataat aacctattta taattataat 900 tgaataaaat gtataatatg gaaaacacag gcttttatac agtttcaaat attgaaactt 960 ctcataagcc aaccgaaaat tctaatgacg aaattcttag gattttcaat aaaagaaggc 1020 cttattgccc ttcagacttt aagaagcaac attttatt 1058 <210> 101 <211> 554 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: mammals-digestive system-rumen-ovis aries sequence <400> 101 aggctcaacc tcctcaaccc gatttatctt gagatcgcca agtacggaca cttcgggagg 60 aagagctatg tgaaggacgg catcaagtac ttcccgtggg aggatttgga tttggttgaa 120 gacatcagaa aaattttcga aatggaatag agggaaccgg aattttttcc ggtttttctt 180 tgtcctttcg aaaataaata gtatctttgt aaaaaaacaa cagattatgt acaatagtaa 240 gaagaagggg gagggtgaca ttcagaagtc gttcaagttc aaggtcaaaa cggacaagga 300 gacggtcgaa ttattcagaa aggccgcagt cgaatactcg gaatactaca agaggctgac 360 aacattcctc tgtgagatgt ataacagacc agcgtttgac ttgaaggagt gctacaagaa 420 aaattccaat gtaagtgtct tcaacacatt gaagaaaact ctcggtgcaa tatatggaaa 480 gctcgatgaa aacggaaatt ttattgagaa tgaatgtaat aagtaactgg aataaaagaa 540 attagacaga gtaa 554 <210> 102 <211> 1039 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: mammals-digestive system-rumen-bos taurus sequence <400> 102 ttgtattggt tgctgtatgg cgacggaagt gacatatatg atgacgggtg gtttgactgt 60 gttcataatt ttgcccgtaa tgttatcggg tttcagtcat atcacgaact gcttgataat 120 gctattataa aagaaaaatt acaacggtaa tttggttatg aagatgctcc gaaaacgtgg 180 ttgttcggac aacaaaaaaa tgaatgtttc taatgtatta 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1560 aatcggtaac ataacaatat ccgaaaagtt taaaccatac acccgacgat tatttttatt 1620 cattgttagc gaccgccgtg aggcggacgc aggctggcgg tcggataatg acgcataatg 1680 gcggttgtga aagccgacgg aaagcactac atcgttaagt gccagccacc ataataggca 1740 gccgtactgc cgaatttaag cctgtggaga acccaaccgt ggatgaccgt tgcgtaagca 1800 acctaaaaag cgatggttct gcgaagcagg aaggaaatgc ccaatttatt aggtttttcc 1860 atacggtatg acagcctcta actgtagcgc attacaaaac aaacgctacc attacataaa 1920 tggtcagagg cataacgccg agcgcaggta tggtatgcgt tcaagtcgca gtcacggaag 1980 ccccagataa aaatgggagg tgcttgcggt caagcgagtg gtcagcgggc ttgcactcgg 2040 tgtggcaaca atggtcgttt ccgaacttac gaccattcaa aaagataagg tagtggcttg 2100 tgagtgaaaa gaaactctcg atacgctcct ttcgtctaac ggtcaggacg cgagattctc 2160 aatctcgtaa tgcgggttcg attcccgcag ggagtacaat ggcgaacaca cgacaatcca 2220 aactgaaggg gaactggaaa accctcgctc cgagataaca tcagcgcaga gaggttggtg 2280 aggcaaccgt aaaagtaatc ctgtgtgcaa gcaagaagga agttcgggtt caagtcccga 2340 tgaggattat tgttgaagag ggatatgatt caaccatagc acttatggtg ctgtgcaagg 2400 gttataggca gccgtactgc cgaatacaag cctgtggaga acccaacagt ggatgaccgt 2460 tgcctatgca acctaaaaag cggtggttct gcgaagcagg aaggaaatgc ccaatttatt 2520 aggtttttcc atacggtatc actactcgcg gtggatgtgg aaataaccgc gatttggtca 2580 gttggtgaag ttggttatca tacctgcctg tcacgcaggt gttcacgagt tcgagcctcg 2640 tactgaccgc agacaaagac aaagaacgag aggacttgta tgacttgcaa atgtcacgga 2700 ctcaaacaag aaaagtttat aggctattag aggatgactg tttctttaat ttgttttctt 2760 gtactgaagg tcatcactgc cgtgccacca agccgtgcaa gtccaaatgg tgcgttagtt 2820 cagttggtta gaatgccagc ctgtcacgct ggaggtcgcg ggttcgattc ccgcacgcac 2880 cgcaataatc tggatatagg caaattacac atatcatatg tcgccccgcg taatcataga 2940 cgacactgcg gacgacagcg gcgagaatgt cgaaaggctc gacagcataa tgacattcga 3000 catcaccgac accccgatat acgaaggcgg ggaggaactt gagataaacg caaaattcaa 3060 cagatagaaa taattaaaac aaacggcaat ggcacacaga aaaaagaaag atgacgaagc 3120 aacgctatcg tacaagttca aggtaaaggt catagagggc gacctgacgg cagacgacat 3180 aacgaagtgt atcgcggaaa acgcggagca gggcaaccat ttctccgagt tcatacacga 3240 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attacaaaac attaacaaca tttattaaac aattaaacaa attttaatta tggcgcacaa 360 aaagaacgta ggagcagaga tagtaaaaac ttactctttt aaggtaaaga ataccaatgg 420 tatcacaatg gaaaaattga tgaacgccat tgacgagttt cagtcatact ataacctttg 480 tagcgattgg atatgcaagg gtcttgacga aacaatgagg aacacttttc tgaaaaaagc 540 aaatagcaat aaatcattgt ataatcagcc aatctacgat acgggtatca agaagaccgc 600 aggtgtgttt tccagaatga aaaaattaaa gagatatgaa attatctaaa ataaaatatg 660 aatttttctt tgcggaaata ccttttaata gattgatttc taataagtta taagaaatac 720 aatagatact gaaggaaaat caaagtgtaa tcaaaaattt gtttgtgttg aggaagcagt 780 gaagaaattt cattgtttcc tcaattttta tttgcataat ccaaaaagtt ttttatttta 840 taggataata agactaacaa atctcaacga ctattaaaac gatttatata aaaaaagttt 900 tgcagttcca atcttttttg ctatctttgc agtgttgaaa gacaacaaag atttaagttt 960 aacaaacaaa tactttttat tacatatttt aatttttttg tattatgaca atagaagaaa 1020 aagcaaggga agaataccct tatataaccc catctgatgg gtatgaatgc catgattata 1080 atgaagccgc taaagacggt tttattgagg gggcaaaatg gatgcttgaa aaagccgctg 1140 aatggtttaa gaat 1154 <210> 109 <211> 1048 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: mammals-digestive system-rumen-ovis aries sequence <400> 109 atatgggcaa agcgtgataa aattgaaaac aaatatgtca aagaaccatt aaaacgagtc 60 aatgaagata tgtggtggat gtactatgtt tatgaatgga atgtgtttta tgtgcttgaa 120 gaaaatgtcc atccatatat gaaaaaataa attttaccac acatattatt attcgtgtca 180 tgccgatgag gtttggcacg atttttgttt atatggagag acataatgtc agtcaataca 240 tgacaacttg tcacaataac tgacattaaa agtttggcac aatatttgct tataagaaaa 300 acgaacaagt aaaattaaaa ttttatagat tatggcacac aaaacaaaca acggagaaaa 360 caccatcaac aaaactttca tcttcaaagc aaaatgcgag aagaacgata ttatatcgtt 420 atggaaaccc gcagcagaag agtattgcaa ctattataac aaattgagca aatggattgg 480 taaaacaatg tacggcattc ctgcatataa catcaaaaga ggttttaaga agaatttaag 540 tgccaaaact ataaacacat ttagaaaact tggacactat cgtgatggaa aaataaatga 600 ggatggcatg tttgttgaaa ctttggcata gaatttgcat ataccaatta gaattgaaaa 660 aatcgctctt tgacacactg aaacatacaa aaacaccaca attttttaat ccttttctat 720 ttgtatttta 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tacaaatcat 420 gcaatttttg atttttaaca aaaattaaga aatagggtat tattgtgtat tgttttttgt 480 tatatatttg tcctgttagg ttaaatcacc gcgcctgatg acgaagtcgg tggtagaatt 540 agactaatat taaatatgtc tcatgaattt aacaagaata aaggtgagaa tgagattagc 600 aagaccttta ttttcaaaac aaaatgcggg aagaatgata ttacatcatt atgggttccc 660 gcgatggagg agtattgcac gtattacaac agggtaagca aatgggggaa aggtatgtac 720 aacaagccgt catatgacat acggaagaaa ttcaagaaga acttgagtgc ggctactttg 780 aaaactttca ttaagttggg aaacacggtg aaagggatga ttgtcaacgg acagtttgtt 840 gaaatggaat cataggttga cagaaacgga aaatcggttt gtttgttaga agaatatttg 900 ttgaaattca tttttctttt gctaacgtat atacaaataa ctgtaataga atatcttata 960 taagatat 968 <210> 111 <211> 1542 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: mammals-digestive system-fecal sequence <400> 111 acaaatgaaa ttatgggaca agtaaaactt aataaacctc ttctgtatat caaaatattg 60 actatcttta gacataacct tgtcaaataa taaatctaaa ttactctttt ccttttcttt 120 tttaaataat ttcatattaa atattcccat aatttattaa tatatttttt tttcattact 180 tatttctctg ttatataaat agttacataa aaaaattaaa actatttttt aaaaagtctt 240 gtgtatataa aaaaaatata gtacctttgc acccgaaatc aagatttaat cctgttttca 300 tattatattt atcaatttta tactaattaa taaacttatg gcaaataaaa aatttaaact 360 tacaaaaaat gaagtcgtga aatcattcgt actcaaagtt gctaaccaaa aaaaatgtgc 420 tatcactaac gaaacacttc aagaatataa aaactattat aataaggtaa gtcagtggat 480 taataacatc gtacaaaatg aaacgtggag aaatctattt actaacaaaa ccaataatac 540 atatggatta cctatactaa caccttcaaa aaaaggacaa tctaatatca ttacacaatt 600 aatgaaaatt aatgcaacac aagaacttgt tgtataatat aatctatttt taaatttata 660 atactaatat aattcattga taattaaata attatataaa attcctatat acaatagaaa 720 gactttccac agacatgttg tacatacatt tttttaagta ttaaacaacg catacccacc 780 aatggtacac gaaaattttc atgttgtaca tactattttt aggtattaaa caactcactg 840 ttttgacgat taatataggc atgttgtaca tactcttttt agatattaac aacctgtaaa 900 caataacaat atttacaaca ataatccatt tttgaaataa tgaaaaattt tctggaaaaa 960 ttttttaaca agtctgtttt tgaaataatg aaaaaatttc tggaaaaatt tttttaacaa 1020 acccattttt gattggttca ttttttattg gaaaattagt gtgtggaact acccacccgt 1080 atatgagcaa gtgttatggg gtgtaacgtg gggagggtta catagggggg tctttggtag 1140 ggggtacata ggtagggtaa taatggggtc tttggtaggg ggtacatagg tagtccccat 1200 atattattat aaaaagtaaa ataaatgata tatgcaagag tttttgaaaa tttattttta 1260 ttttgctact tagactttac aaaaagtaga tatatagtat tttcttttca aaatattttg 1320 tagtttggaa aaaaagcagt acctttgcac acggaaacga aaaacaagtt taacctatta 1380 aatttttagt ttatggcaat aaacattttg acttattctg ctatggcaga aaaatcttgg 1440 gaaaatttta tgcgtgaaaa ttgcggttac gagcgcatta gtacatttta tagtgatttc 1500 actattgcag accattgtgg tggtgtaaac gcaataaaag ac 1542 <210> 112 <211> 920 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: mammals-digestive system-fecal sequence <400> 112 gatgtgaatg aagaatttct tggtggcttg cgaagcacta tgacatatct tggagcaaag 60 agattgaaag atattccgaa atgttgcgtt ttctatcgtg taaatcatca gttgaataca 120 atttatgaga atacaacgat aggaaaataa tataaatttt atattatttt gagaaaaaga 180 gtctaaattt gggctctttt ttcgtttttt atgaaaaaat atgaaaaaag tttgtaaaaa 240 atttgtaata ttgaaaaaat agtattatat ttgtatcaaa tttaaaaata aaatataaat 300 atggcaaaat caataatgaa aaaatcaatt aaattcaaag taaaaggaaa tagtccaata 360 aacgaagata ttataaatga gtataaaggt tattataata cctgtagtaa ttggattaat 420 aataatttaa caagcataac tattggtgaa aatgaagact ggagaaaagt gttttgtatc 480 aaaccaaaaa aagaagatta caatacacct ttattggatg ctacgaaaaa tggtcaattt 540 agaatacttg acaagttgaa aaaattaaat gctactaaat tattagaaat ggaaaaataa 600 taaatatata caataaattt atataatttt gtctattttt aattttagtt cattagataa 660 tatgttcata aattcattga catataatta taaataaata tatatgcaat aaaattcgag 720 agacatttca tcagagatgt ctctttttta ttttttgtta tatttatatt atgaatatta 780 gattggaact cataaagaca aaggataaac agaacattgc aaagcgtata gtggaaagca 840 atcactcata tgttccaacc tggcgtagtg taggacgaag gatagattat cttatttatt 900 tggataatga tgttgtcgga 920 <210> 113 <211> 1217 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: mammals-digestive system-rumen-ovis aries sequence <400> 113 gtgaactata tctacgaatc aatcgaagga atattgacaa aaacaatgaa tccaaccact 60 ttacaggata tcatccttaa cggaatcaca tatacaccag tggaagacaa cacaacaaca 120 tgcgacggat gtgaatttaa agacacataa ggccaatgta tgctaacaca cctattcgat 180 aacgacatgg tccaaaactg cctcaaggaa aaaaacggcg ttgcagatat catatatgtc 240 aaaaaagaaa attaatcgga atcttgattt ggattttaat attatttgtt gtataattac 300 aatagaaaga aaattttgta tattttaaaa tttgtaaatt aaaatttaga aaaatggcac 360 acaaaacaaa caacggagaa aatacaatca ataaaacttt tattttcaaa gcaaagtgcg 420 ataataacga tattatatcg ttatggaaac ccgcaatgga agagtattgt acttattaca 480 ataaattaag ccaatggatt tgcaagacaa tgtatggagt accagcttac aacattaaaa 540 acggtttcaa aaaaaatctg agcacaaaga caatcaatac gtttagaacg cttggccact 600 atcgtgacgg aaaaataaac gaagacggcg tattcgttga aaacctggca taataaggag 660 taaaaaaatg ttctttgata ttctgacaca aatgaaaaaa caatcaaaaa tttatttctg 720 ttttgcttgt aatttattga aataaaatgt attatataga aatatgtcgg tggataatag 780 tcaaatagtc tgttgactgt tgaatagtaa gttttttact ctattgacaa caggtgatgt 840 ggatggaaca tacaaagttt attgttgagt aataggtttt acacttttac cacaacttta 900 gtgattttat gtataaaata attaaaatca tatataaaaa tttttccaga aagtagtact 960 tattgaatta aaattatatt gtgaaaaatg gtttttgatt ttaattttat ttgttgtata 1020 attgaaatgt aatttaattt agaattgtat aaataaaaaa cgtaaaaatg agactgccaa 1080 cagaaattta tgagtcaggc acaatggtta gtaagatatc ggaaaaacca tttaaatcag 1140 gtttaagggt taatactgta aagtctgtag ttgaacatcc acataagatt gacccgaata 1200 ctaataaggg tgttcca 1217 <210> 114 <211> 930 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: mammals-digestive system-rumen-bos taurus sequence <400> 114 gactacgact ggttctcaaa tgtgtacggc gccatcaggg aggaacgtga gaaaatgaga 60 agggaagagg aggaacgcag gaagaacgaa cccaagacgg tgaaaaccaa agaggttgac 120 ttgttcgggg atgatgacct gccgttctaa taaaaaaaaa aacaaacctc tccgaaattg 180 aacgtatcaa cttcggagag gttatatagg gtgatggaaa tgttaaataa aaagtttaaa 240 aataactatg ggaaacaaag tacaaagtaa tgaaacaata gttaagactt atacatttaa 300 agtgcgtgga ttcataagtg gtgctaccca cgaaataatg aaatcagcca taaaacaata 360 tatagaagat tctaacaatc tatcagattg gattaatgta 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tgcctgcctg ctgagcattg tagcatatat 1080 cagacag 1087 <210> 116 <211> 1064 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: gut metagenome sequence <400> 116 agaatgcttt ccccaattga atgtgaaaga ctacagacac tgccagataa ctataccgaa 60 ggtgttagca aatgcgcaag atataaggca atcggaaacg gatggacagt tgatgtaatt 120 tcacatattt ttaagaattt gaaaaattaa tttggtattt tgaaatattt gacttatttt 180 tgcaacataa aatttaaaac aaatttatat ggcacacgcg aaaaaaaaat tttgacaaag 240 gaaagcaaat aacaaaaacg ttctctttca aggtgttaaa tattaagaac aatggcgaat 300 cagttgatat gaatactata gaattagcca tgaaagagta caataggtat tataacattt 360 gtagtgattg gatttgcaac aatctaatga cgccaattgg ttccctatat caatacatag 420 atgatgagaa atggagaaaa aaatttgttc gcccaacaaa cactaataaa ccgttgtata 480 actctccagt tttctcccct gctgtaaaat ctgaaggtgg tactattaaa aatctccaaa 540 ttttaagcgc aacaaagacc ataattcttt gatttaatta ttaatacata tatcgttcgt 600 aaatttaata caaccacaac caaatatgat aatttgcata attaaaaaaa ttcacatatc 660 tttgtagcat aaaaacaaat agagaaaaaa tgacacttta cagatttaca cttttaggca 720 atacacaaat ttatgtatat gctggcacgt ttgaagatgc tctcaggaca tttcgtaaat 780 catatggaga tacgggattc aagtcaattg aagagcttcc tgaatttaga gataacatac 840 ttatacaact agattgattg aaacaaacgt caattaccca ccactgaagt agtgggtttc 900 tttgcagtga ttttatgaaa acgatagaag acagagcaga catagcaagc gatattgcta 960 aaagagaatt tgaagaagat agttattgga gtcattacgc agacgatatg gtaacatctg 1020 cttttgttga aggatgctat aaaggctata tttcaggtgc gaca 1064 <210> 117 <211> 1617 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: terrestrial metagenome sequence <400> 117 aaggagatag attatgacag ggaaggtaat atcacaaata tatatcttta ctatgagtca 60 gatagtttat ggaatgaaaa atttgaattt atattaacat tagatggtta tgaattaaag 120 atacctattt ttatagtaag tgtaagatag ttttggcacg gaaattgcag taatgttttc 180 ctgtcaagaa caaataaaat aaaaaatatg aaaaaatcaa ttaaattcaa agtaaaagga 240 aattgtccaa taaccaaaga tgttataaat gaatataaag aatattataa taaatgcagt 300 gattggatta agaataattt aacaagcata actattgggg aaatggcaaa atttctcaat 360 gaagtgtgga gagaaatatt ttgtacaagg cctaaaaagg cagaatataa cgttccatcg 420 ttggatacaa caaaaaaagg accatctgca atattgcata tgttgaaaaa aatcgaggca 480 attaaaatat tagaaacaga aaagtagtga ctatagatat aaacttctat gatagatatc 540 tgttttttaa ttctattatg caatataata tattgaaata taaacaatta taaataaaac 600 gggtgtatac aacaagtttt ttgtttttct tattcattat ctgtatattt gtattataaa 660 caaatacaaa tatgtataat gaatcaggaa tatattgcta taaaaacaaa ataaacggaa 720 aattatatat tggacaggcg ctaaatctta aaagaagata tttaaacttt ttaaatatca 780 accacagata tgcgggtcaa gtaatagaaa acgcacgtaa aaaatatggt gtagataact 840 ttgaatattc aatccttact cactgtccag tagacgaatt aaattattgg gaagcatttt 900 atgtagaaag attaaattgt gtcacacccc acggttataa tatgactaat gggggcgatt 960 cagtatatac ttctacacaa gcatttaaag atgcacaaac tgaaaagttg aagcaaacta 1020 ttctatctaa gaatcctaat cttaatgtca gcaaagtaaa atatgaaggt aatagaattt 1080 cagttataat tacttgccca atacatggca catttaaaaa aacgcctgat tactttagaa 1140 atccagaaat aaatgatttg tgttgtccta aatgtgtgag ggaagatata agacaaaaga 1200 ctgaagatag tttctttaaa caagcaacaa agaaatgggg agataagtat gattattcta 1260 aaactataat agtagataga attaccccag ttacaattac ttgccctata cacggagatt 1320 ttacagtatt accagggaac catgtgtgta aagataaaaa tactggagga tgccaacaat 1380 gtagtgaaga aagacaacat attgaatcat tagaaaaagg tagcgtgaag gtcattaaga 1440 tgataaagaa aaagtttgga aacaaatatt cattagataa attcgaatat aggggagata 1500 aagaaaaagt aattcttatt tgccctattc atggagaatt ttcaatgacg ccaggtaatt 1560 taagatatag caacggttgt ccacaatgca ctttagaaaa tgcttatcgt ataaaat 1617 <210> 118 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 118 agttgtaaat acctataaaa atgtattcca acatagt 37 <210> 119 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 119 gttgtgaata ccctacaaaa gtgatattcc aacaat 36 <210> 120 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 120 aaaaagggtg aacaacatt 19 <210> 121 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 121 gttgtttgat acctataaaa gagtattcac aacagg 36 <210> 122 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 122 gttgtttact ccatacaaaa taagagttac aacaat 36 <210> 123 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 123 gttgttcaat ccttataaaa aggtgtctac aacaat 36 <210> 124 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 124 gttgtttaat acctataaaa gagtatatac aacaag 36 <210> 125 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 125 aatacctata aaaggacata tacaacaag 29 <210> 126 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 126 gttgttcaat acctataaaa agacatatac aacaag 36 <210> 127 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 gttgttcatt acctaaaaaa gagta 25 <210> 128 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 gttgtttaat acctataaaa gaatatatac aacaag 36 <210> 129 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 129 gttgtttaat acttaaaaaa tagtatgtac aacatg 36 <210> 130 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 130 gttgtatcca ccgtataaaa catagtgtcc aacatc 36 <210> 131 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 131 gttgtttatt acttacaaaa acagcataac aacatc 36 <210> 132 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 gttgttcaat ccttataaaa agaggtctac aacaat 36 <210> 133 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 gttgttatta ccatataaaa tggttcgtac aacaat 36 <210> 134 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 actgttgtac tttcctttca tctgcagggg ttttacagt 39 <210> 135 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 135 tagttgttta atacttaaaa aatagtatgt acaacatgat 40 <210> 136 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 136 gttgtaaata gcatacaaac atagccattc aacaat 36 <210> 137 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 137 gttgtgagta ccctataaaa gaagtacccc aacaat 36 <210> 138 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 cgttgttaga cccctaaaac acaaggtcta caacaat 37 <210> 139 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 139 gttgtaaata catctcatat tgtattccaa cacagt 36 <210> 140 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 gttgtcagca tccgccttgc ggtatgccac aacaat 36 <210> 141 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 141 gttgccaata ccataaaaaa cggtatctca acaatt 36 <210> 142 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 ttgtcagcac ccgtaatacg gtatgccaca acaat 35 <210> 143 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 143 gttgtcagca cccgtaatac ggtatgccac aacaat 36 <210> 144 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 144 gttgtaaata cctataaaag tgtatcccaa cacaat 36 <210> 145 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 145 gttgtaatta cctttataag aaaggtattc aacaata 37 <210> 146 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 146 gagttgttcg ttgcccataa aaagccattt acaaca 36 <210> 147 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 147 gttgtatctg tcctaaaaaa gaatacattc aacaat 36 <210> 148 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 148 agttgtaatc agtctataaa agataccatt caacaat 37 <210> 149 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 149 gttgtaatta agataaaaaa cctattatcc aacaat 36 <210> 150 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 gttgtaaata ggatataaaa tcaactattc aacagt 36 <210> 151 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 151 gttgttcaat ccttacaaaa aggtatctac aacaat 36 <210> 152 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 152 attgggactt ccggaagtaa aatatccacc tgaggatttt aggacatata atttctaata 60 aaaatgaacg gaaaaatttc cgttcatttt ttttttgttt att 103 <210> 153 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 203 acaaattttt gattatggca cacaaaaaga acataggagc agagatagta aaaacttact 60 cttttaaggt gaaga 75 <210> 204 <211> 136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 204 ttattttata ggataataga gctaacaagc attaacaatt attaaaacga tttatattga 60 aaataaattt tgtgggaata tttattttta ctacctttgc atcgtaatac aattaaacaa 120 atttttgatt atggca 136 <210> 205 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 205 cctgttgtga atactctttt ataggtatca aacaacggaa gtggttggtc agcatggatt 60 a 61 <210> 206 <211> 25 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: target sequence <400> 206 ggaagtggtt ggtcagcatg gatta 25 <210> 207 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 207 cctgttgtga atactctttt ataggtatca aacaactgtg aagtgacctg ggagctaact 60 g 61 <210> 208 <211> 25 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: target sequence <400> 208 tgtgaagtga cctgggagct aactg 25 <210> 209 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 209 attgttgtag acaccttttt ataaggattg aacaacaacc cccgtctacc tgcccacagg 60 g 61 <210> 210 <211> 25 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: target sequence <400> 210 aacccccgtc tacctgccca caggg 25 <210> 211 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 211 cttgttgtat atgtcctttt ataggtatta aacaacgtag agggagaaat ggaatccata 60 t 61 <210> 212 <211> 25 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: target sequence <400> 212 gtagagggag aaatggaatc catat 25 <210> 213 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 213 cttgttgtat atgtcctttt ataggtatta aacaac 36 <210> 214 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 214 attgttgtag acaccttttt ataaggattg aacaacgcac caacgggtag atttggtggt 60 g 61 <210> 215 <211> 25 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: target sequence <400> 215 gcaccaacgg gtagatttgg tggtg 25 <210> 216 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> L, M, I, C, or F <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Y, W, or F <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> K, T, C, R, W, Y, H, or V <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> I, L, or M <400> 216 Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Phe 1 5 <210> 217 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> I, L, M, Y, T, or F <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> R, Q, K, E, S, or T <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> L, I, T, C, M, or K <400> 217 Arg Xaa Xaa Xaa Leu 1 5 <210> 218 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> I, L, or F <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> K, R, V, or E <400> 218 Asn Xaa Tyr Xaa 1 <210> 219 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> T, I, N, A, S, F, or V <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> I, V, L, or S <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> H, S, G, or R <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> D, S, or E <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> I, V, M, T, or N <400> 219 Lys Xaa Xaa Xaa Phe Ala Xaa Xaa Lys Asp 1 5 10 <210> 220 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> G, S, C, or T <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> N, Y, K, or S <400> 220 Leu Xaa Asn Xaa 1 <210> 221 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> S, P, or A <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Y, S, A, P, E, Y, Q, or N <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> F, Y, or H <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> T or S <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> M, T, or I <400> 221 Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Gln Xaa Asp Ser 1 5 10 <210> 222 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> N, K, W, R, E, T, or Y <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> M, R, L, S, K, V, E, T, I, or D <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> L, R, H, P, T, K, Q, P, S, or A <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> G, Q, N, R, K, E, I, T, S, or C <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> R, W, Y, K, T, F, S, or Q <400> 222 Lys Xaa Xaa Val Arg Xaa Xaa Gln Glu Xaa His 1 5 10 <210> 223 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> I, K, V, or L <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> L or M <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> N, H, or P <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> A, S, or C <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> V, Y, I, F, T, N, or Y <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> A or S <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> S, A, or P <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> M, C, L, R, N, S, K, or L <400> 223 Xaa Asn Gly Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Asn 1 5 10 <210> 224 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 224 vhtdkdddd 9 <210> 225 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 225 attgttgda 9 <210> 226 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 226 hdhwdwwnv 9 <210> 227 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 227 ttttwtarg 9 <210> 228 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 228 vmmac 5 <210> 229 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 229 acaac 5 <210> 230 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 230 atattgttgd akrwwyyntt ttwtargkww wwwacaacwr b 41 <210> 231 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 231 Asn Leu Thr Ser Ile Thr Ile Gly 1 5 <210> 232 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 232 Asn Tyr Arg Thr Lys Ile Arg Thr Leu Asn 1 5 10 <210> 233 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 233 Ile Ser Tyr Ile Glu Asn Val Glu Asn 1 5 <210> 234 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 234 Glu Leu Leu Ser Val Glu Gln Leu Lys 1 5 <210> 235 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 235 His Ile Asn Ser Met Thr Ile Asn Ile Gln Asp Phe Lys Ile Glu 1 5 10 15 <210> 236 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 236 Lys Glu Asn Ser Leu Gly Phe Ile Leu 1 5 <210> 237 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 237 Gly Asn Arg Gln Ile Lys Lys Gly 1 5 <210> 238 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 238 Asp Val Asn Phe Lys His Ala 1 5 <210> 239 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 239 Gly Tyr Ile Asn Leu Tyr Lys Tyr Leu Leu Glu His 1 5 10 <210> 240 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 240 Lys Glu Gln Val Leu Ser Lys Leu Leu Tyr 1 5 10 <210> 241 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 241 Glu Tyr Ile Tyr Val Ser Cys Val Asn Lys Leu Arg Ala Lys Tyr Val 1 5 10 15 Ser Tyr Phe Ile Leu Lys Glu Lys Tyr Tyr Glu Lys Gln Lys Glu Tyr 20 25 30 Asp Ile Glu Met Gly Phe 35 <210> 242 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 242 Asp Asp Ser Thr Glu Ser Lys Glu Ser Met Asp Lys Arg Arg 1 5 10 <210> 243 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 243 Asn Val Gln Gln Asp Ile Asn Gly Cys Leu Lys Asn Ile Ile Asn Tyr 1 5 10 15 <210> 244 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 244 Ala Leu Glu Asn Leu Glu Asn Ser Asn Phe Glu Lys 1 5 10 <210> 245 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 245 Gln Val Leu Pro Thr Ile Lys Ser Leu Leu 1 5 10 <210> 246 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 246 Tyr His Lys Leu Glu Asn Gln Asn 1 5 <210> 247 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 247 Ala Ser Asp Lys Val Lys Glu Tyr Ile Glu 1 5 10 <210> 248 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 248 Thr Asn Glu Asn Asn Glu Ile Val Asp Ala Lys Tyr Thr 1 5 10 <210> 249 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 249 Ala Asn Phe Phe Asn Leu Met Met Lys Ser Leu His Phe Ala Ser 1 5 10 15 <210> 250 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 250 Leu Leu Ser Asn Asn Gly Lys Thr Gln Ile Ala Leu Val Pro Ser Glu 1 5 10 15 <210> 251 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 251 His Ile Asn Gly Leu Asn Ala Asp Phe Asn Ala Ala Asn Asn Ile Lys 1 5 10 15 Tyr Ile <210> 252 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 252 cctgttgtga atactctttt ataggtatca aacaacgaga ggtgagggac ttggggggta 60 a 61 <210> 253 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 253 gagaggtgag ggacttgggg ggtaa 25 <210> 254 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 254 cctgttgtga atactctttt ataggtatca aacaactgag aatggtgcgt cctaggtgtt 60 c 61 <210> 255 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 255 tgagaatggt gcgtcctagg tgttc 25 <210> 256 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 256 cctgttgtga atactctttt ataggtatca aacaacgcag cctgtgctga cccatgcagt 60 c 61 <210> 257 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 257 gcagcctgtg ctgacccatg cagtc 25 <210> 258 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 258 cctgttgtga atactctttt ataggtatca aacaacggaa gtggttggtc agcatggatt 60 a 61 <210> 259 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 259 ggaagtggtt ggtcagcatg gatta 25 <210> 260 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 260 cctgttgtga atactctttt ataggtatca aacaacagcc agtgttgcta gtcaagggca 60 g 61 <210> 261 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 261 agccagtgtt gctagtcaag ggcag 25 <210> 262 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 262 cctgttgtga atactctttt ataggtatca aacaacttga cattgtccac acctggaatc 60 g 61 <210> 263 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 263 ttgacattgt ccacacctgg aatcg 25 <210> 264 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 264 cctgttgtga atactctttt ataggtatca aacaacgaaa tctattgagg ctctggagag 60 a 61 <210> 265 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 265 gaaatctatt gaggctctgg agaga 25 <210> 266 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 266 cctgttgtga atactctttt ataggtatca aacaacggaa gctggatgag cctggtccat 60 g 61 <210> 267 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 267 ggaagctgga tgagcctggt ccatg 25 <210> 268 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 268 cctgttgtga atactctttt ataggtatca aacaacccca tactggggac caaggaagtg 60 t 61 <210> 269 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 269 cccatactgg ggaccaagga agtgt 25 <210> 270 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 270 cctgttgtga atactctttt ataggtatca aacaacatga tgctttgccg taacccttcg 60 t 61 <210> 271 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 271 atgatgcttt gccgtaaccc ttcgt 25 <210> 272 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 272 cctgttgtga atactctttt ataggtatca aacaacaaga gtcattgccc cactttaccc 60 t 61 <210> 273 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 273 aagagtcatt gccccacttt accct 25 <210> 274 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 274 cctgttgtga atactctttt ataggtatca aacaacgaga ggtgagggac ttggggggta 60 a 61 <210> 275 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 275 gagaggtgag ggacttgggg ggtaa 25 <210> 276 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 276 cctgttgtga atactctttt ataggtatca aacaacgtga agttctaaac ttcatattac 60 c 61 <210> 277 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 277 gtgaagttct aaacttcata ttacc 25 <210> 278 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 278 cttgttgtat atgtcctttt ataggtatta aacaacgtag agggagaaat ggaatccata 60 t 61 <210> 279 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 279 gtagagggag aaatggaatc catat 25 <210> 280 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 280 cttgttgtat atgtcctttt ataggtatta aacaacgagt cgctttaact ggccctggct 60 t 61 <210> 281 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 281 gagtcgcttt aactggccct ggctt 25 <210> 282 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 282 cttgttgtat atgtcctttt ataggtatta aacaactcca cacctggaat cggctttcag 60 c 61 <210> 283 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 283 tccacacctg gaatcggctt tcagc 25 <210> 284 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 284 cttgttgtat atgtcctttt ataggtatta aacaacaacc cccgtctacc tgcccacagg 60 g 61 <210> 285 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 285 aacccccgtc tacctgccca caggg 25 <210> 286 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 286 cttgttgtat atgtcctttt ataggtatta aacaacgtag agggagaaat ggaatccata 60 t 61 <210> 287 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 287 gtagagggag aaatggaatc catat 25 <210> 288 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 288 cttgttgtat atgtcctttt ataggtatta aacaacgacc catgggagca gctggtcaga 60 g 61 <210> 289 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 289 gacccatggg agcagctggt cagag 25 <210> 290 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 290 Glu Cys Pro Ile Thr Lys Asp Val Ile Asn Glu Tyr Lys 1 5 10

Claims (121)

  1. CLUST.091979의 조작된 비-자연 발생 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 회문 반복부(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat; CRISPR) - Cas 시스템으로서,
    (a) CRISPR-연관 단백질 또는 CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산; 및
    (b) 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 직접 반복부 서열 및 스페이서 서열을 포함하는 RNA 가이드를 포함하고,
    CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 241의 아미노산 서열을 포함하고,
    CRISPR-연관 단백질은 RNA 가이드에 결합하고, 스페이서 서열에 상보적인 표적 핵산 서열을 변형시킬 수 있는, 시스템.
  2. 제1항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, 또는 SEQ ID NO: 14에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 시스템.
  3. CLUST.091979의 조작된 비-자연 발생 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 회문 반복부(CRISPR) - Cas 시스템으로서,
    (a) CRISPR-연관 단백질 또는 CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산; 및
    (b) 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 직접 반복부 서열 및 스페이서 서열을 포함하는 RNA 가이드를 포함하고,
    CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 56 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고,
    CRISPR-연관 단백질은 RNA 가이드에 결합하고, 스페이서 서열에 상보적인 표적 핵산 서열을 변형시킬 수 있는, 시스템.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 적어도 하나의 RuvC 도메인 또는 적어도 하나의 스플릿 RuvC 도메인을 포함하는, 시스템.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 하기 서열들 중 하나 이상을 포함하는, 시스템:
    (a) PX1X2X3X4F(SEQ ID NO: 216)(여기서, X1은 L 또는 M 또는 I 또는 C 또는 F이고, X2는 Y 또는 W 또는 F이고, X3는 K 또는 T 또는 C 또는 R 또는 W 또는 Y 또는 H 또는 V이고, X4는 I 또는 L 또는 M임);
    (b) RX1X2X3L(SEQ ID NO: 217)(여기서, X1은 I 또는 L 또는 M 또는 Y 또는 T 또는 F이고, X2는 R 또는 Q 또는 K 또는 E 또는 S 또는 T이고, X3는 L 또는 I 또는 T 또는 C 또는 M 또는 K임);
    (c) NX1YX2(SEQ ID NO: 218)(여기서, X1은 I 또는 L 또는 F이고, X2는 K 또는 R 또는 V 또는 E임);
    (d) KX1X2X3FAX4X5KD(SEQ ID NO: 219)(여기서, X1은 T 또는 I 또는 N 또는 A 또는 S 또는 F 또는 V이고, X2는 I 또는 V 또는 L 또는 S이고, X3는 H 또는 S 또는 G 또는 R이고, X4는 D 또는 S 또는 E이고, X5는 I 또는 V 또는 M 또는 T 또는 N임);
    (e) LX1NX2(SEQ ID NO: 220)(여기서, X1은 G 또는 S 또는 C 또는 T이고, X2는 N 또는 Y 또는 K 또는 S임);
    (f) PX1X2X3X4SQX5DS(SEQ ID NO: 221)(여기서, X1은 S 또는 P 또는 A이고, X2는 Y 또는 S 또는 A 또는 P 또는 E 또는 Y 또는 Q 또는 N이고, X3는 F 또는 Y 또는 H이고, X4는 T 또는 S이고, X5는 M 또는 T 또는 I임);
    (g) KX1X2VRX3X4QEX5H(SEQ ID NO: 222)(여기서, X1은 N 또는 K 또는 W 또는 R 또는 E 또는 T 또는 Y이고, X2는 M 또는 R 또는 L 또는 S 또는 K 또는 V 또는 E 또는 T 또는 I 또는 D이고, X3는 L 또는 R 또는 H 또는 P 또는 T 또는 K 또는 Q 또는 P 또는 S 또는 A이고, X4는 G 또는 Q 또는 N 또는 R 또는 K 또는 E 또는 I 또는 T 또는 S 또는 C이고, X5는 R 또는 W 또는 Y 또는 K 또는 T 또는 F 또는 S 또는 Q임); 및
    (h) X1NGX2X3X4DX5NX6X7X8N(SEQ ID NO: 223)(여기서, X1은 I 또는 K 또는 V 또는 L이고, X2는 L 또는 M이고, X3는 N 또는 H 또는 P이고, X4는 A 또는 S 또는 C이고, X5는 V 또는 Y 또는 I 또는 F 또는 T 또는 N이고, X6는 A 또는 S이고, X7은 S 또는 A 또는 P이고, X8은 M 또는 C 또는 L 또는 R 또는 N 또는 S 또는 K 또는 L임).
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57 내지 90, SEQ ID NO: 118 내지 151, 또는 SEQ ID NO: 213 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 시스템.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57 내지 90, SEQ ID NO: 118 내지 151, 또는 SEQ ID NO: 213 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 시스템.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 직접 반복부 서열은 하기 서열들 중 하나 이상을 포함하는, 시스템:
    (a) X1X2TX3X4X5X6X7X8(SEQ ID NO: 224)(여기서, X1은 A 또는 C 또는 G이고, X2는 T 또는 C 또는 A이고, X3는 T 또는 G 또는 A이고, X4는 T 또는 G이고, X5는 T 또는 G 또는 A이고, X6는 G 또는 T 또는 A이고, X7은 T 또는 G 또는 A이고, X8은 A 또는 G 또는 T임);
    (b) X1X2X3X4X5X6X7X8X9(SEQ ID NO: 226)(여기서, X1은 T 또는 C 또는 A이고, X2는 T 또는 A 또는 G이고, X3는 T 또는 C 또는 A이고, X4는 T 또는 A이고, X5는 T 또는 A 또는 G이고, X6는 T 또는 A이고, X7은 A 또는 T이고, X8은 A 또는 G 또는 C 또는 T이고, X9은 G 또는 A 또는 C임); 및
    (c) X1X2X3AC(SEQ ID NO: 228)(여기서, X1은 A 또는 C 또는 G이고, X2는 C 또는 A이고, X3는 A 또는 C임).
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 시스템.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 시스템.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, CRISPR-연관 단백질은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 인식할 수 있고, PAM 서열은 5'-TNNT-3' 또는 5'-TNRT-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 시스템.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, CRISPR-연관 단백질은 PAM 서열을 인식할 수 있고, PAM 서열은 5'-TNNT-3' 또는 5'-TNRT-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 시스템.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 60에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 시스템.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 60에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 시스템.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, CRISPR-연관 단백질은 PAM 서열을 인식할 수 있고, PAM 서열은 5'-NTTN-3', 5'-NTTR-3'(예를 들어, 5'-TTTG-3'), 또는 5'-NNR-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 시스템.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, CRISPR-연관 단백질은 PAM 서열을 인식할 수 있고, PAM 서열은 5'-NTTN-3', 5'-NTTR-3'(예를 들어, 5'-TTTG-3'), 또는 5'-NNR-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 시스템.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 213에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 시스템.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 213에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 시스템.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, CRISPR-연관 단백질은 PAM 서열을 인식할 수 있고, PAM 서열은 5'-NTTN-3' 또는 5'-RTTR-3'(예를 들어, 5'-ATTG-3' 또는 5'-GTTA-3')로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 시스템.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, CRISPR-연관 단백질은 PAM 서열을 인식할 수 있고, PAM 서열은 5'-NTTN-3' 또는 5'-RTTR-3'(예를 들어, 5'-ATTG-3' 또는 5'-GTTA-3')로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 시스템.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 가이드의 스페이서 서열은 약 15 개 뉴클레오티드 내지 약 55 개 뉴클레오티드를 포함하는, 시스템.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 가이드의 스페이서 서열은 20 개 뉴클레오티드 내지 45 개 뉴클레오티드를 포함하는, 시스템.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 촉매 잔기(예를 들어, 아스파트산 또는 글루탐산)를 포함하는, 시스템.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 표적 핵산을 절단하는, 시스템.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 펩티드 태그, 형광 단백질, 염기-편집 도메인, DNA 메틸화 도메인, 히스톤 잔기 변형 도메인, 국재화 인자, 전사 조절 인자, 광-개폐 제어 인자, 화학적 유도성 인자, 또는 염색질 시각화 인자를 추가로 포함하는, 시스템.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산은 세포에서 발현을 위해 코돈-최적화되는, 시스템.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 시스템.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산은 벡터에 있는, 시스템.
  29. 제28항에 있어서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 벡터, 또는 단순 포진 벡터를 포함하는, 시스템.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산은 DNA 분자인, 시스템.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 비-특이적 뉴클레아제 활성을 포함하는, 시스템.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질 및 RNA 가이드에 의한 표적 핵산의 인식은 표적 핵산의 변형을 일으키는, 시스템.
  33. 제32항에 있어서, 표적 핵산의 변형은 이중-가닥 절단 사건인, 시스템.
  34. 제32항에 있어서, 표적 핵산의 변형은 단일-가닥 절단 사건인, 시스템.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산의 변형은 삽입 사건을 일으키는, 시스템.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산의 변형은 결실 사건을 일으키는, 시스템.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산의 변형은 세포 독성 또는 세포 사멸을 일으키는, 시스템.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 도너 주형 핵산을 추가로 포함하는, 시스템.
  39. 제38항에 있어서, 도너 주형 핵산은 DNA 분자인, 시스템.
  40. 제38항에 있어서, 도너 주형 핵산은 RNA 분자인, 시스템.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 가이드는 선택적으로 tracrRNA를 포함하는, 시스템.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 시스템은 tracrRNA를 포함하지 않는, 시스템.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 자가-가공인, 시스템.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 시스템은 나노입자, 리포좀, 엑소좀, 미세소포체, 또는 유전자-총을 포함하는 전달 조성물에 존재하는, 시스템.
  45. 제1항 내지 제 44항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내에 있는, 시스템.
  46. 제45항에 있어서, 세포는 진핵 세포인, 시스템.
  47. 제45항에 있어서, 세포는 원핵 세포인, 시스템.
  48. 세포로서, 세포는
    (a) CRISPR-연관 단백질 또는 CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산; 및
    (b) 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 직접 반복부 서열 및 스페이서 서열을 포함하는 RNA 가이드를 포함하고,
    CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 56 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 세포.
  49. 제48항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 하기 서열들 중 하나 이상을 포함하는, 세포:
    (a) PX1X2X3X4F(SEQ ID NO: 216)(여기서, X1은 L 또는 M 또는 I 또는 C 또는 F이고, X2는 Y 또는 W 또는 F이고, X3는 K 또는 T 또는 C 또는 R 또는 W 또는 Y 또는 H 또는 V이고, X4는 I 또는 L 또는 M임);
    (b) RX1X2X3L(SEQ ID NO: 217)(여기서, X1은 I 또는 L 또는 M 또는 Y 또는 T 또는 F이고, X2는 R 또는 Q 또는 K 또는 E 또는 S 또는 T이고, X3는 L 또는 I 또는 T 또는 C 또는 M 또는 K임);
    (c) NX1YX2(SEQ ID NO: 218)(여기서, X1은 I 또는 L 또는 F이고, X2는 K 또는 R 또는 V 또는 E임);
    (d) KX1X2X3FAX4X5KD(SEQ ID NO: 219)(여기서, X1은 T 또는 I 또는 N 또는 A 또는 S 또는 F 또는 V이고, X2는 I 또는 V 또는 L 또는 S이고, X3는 H 또는 S 또는 G 또는 R이고, X4는 D 또는 S 또는 E이고, X5는 I 또는 V 또는 M 또는 T 또는 N임);
    (e) LX1NX2(SEQ ID NO: 220)(여기서, X1은 G 또는 S 또는 C 또는 T이고, X2는 N 또는 Y 또는 K 또는 S임);
    (f) PX1X2X3X4SQX5DS(SEQ ID NO: 221)(여기서, X1은 S 또는 P 또는 A이고, X2는 Y 또는 S 또는 A 또는 P 또는 E 또는 Y 또는 Q 또는 N이고, X3는 F 또는 Y 또는 H이고, X4는 T 또는 S이고, X5는 M 또는 T 또는 I임);
    (g) KX1X2VRX3X4QEX5H(SEQ ID NO: 222)(여기서, X1은 N 또는 K 또는 W 또는 R 또는 E 또는 T 또는 Y이고, X2는 M 또는 R 또는 L 또는 S 또는 K 또는 V 또는 E 또는 T 또는 I 또는 D이고, X3는 L 또는 R 또는 H 또는 P 또는 T 또는 K 또는 Q 또는 P 또는 S 또는 A이고, X4는 G 또는 Q 또는 N 또는 R 또는 K 또는 E 또는 I 또는 T 또는 S 또는 C이고, X5는 R 또는 W 또는 Y 또는 K 또는 T 또는 F 또는 S 또는 Q임); 및
    (h) X1NGX2X3X4DX5NX6X7X8N(SEQ ID NO: 223)(여기서, X1은 I 또는 K 또는 V 또는 L이고, X2는 L 또는 M이고, X3는 N 또는 H 또는 P이고, X4는 A 또는 S 또는 C이고, X5는 V 또는 Y 또는 I 또는 F 또는 T 또는 N이고, X6는 A 또는 S이고, X7은 S 또는 A 또는 P이고, X8은 M 또는 C 또는 L 또는 R 또는 N 또는 S 또는 K 또는 L임).
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57 내지 90, SEQ ID NO: 118 내지 151, 또는 SEQ ID NO: 213 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 세포.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57 내지 90, SEQ ID NO: 118 내지 151, 또는 SEQ ID NO: 213 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 세포.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 직접 반복부 서열은 하기 서열들 중 하나 이상을 포함하는, 세포:
    (a) X1X2TX3X4X5X6X7X8(SEQ ID NO: 224)(여기서, X1은 A 또는 C 또는 G이고, X2는 T 또는 C 또는 A이고, X3는 T 또는 G 또는 A이고, X4는 T 또는 G이고, X5는 T 또는 G 또는 A이고, X6는 G 또는 T 또는 A이고, X7은 T 또는 G 또는 A이고, X8은 A 또는 G 또는 T임);
    (b) X1X2X3X4X5X6X7X8X9(SEQ ID NO: 226)(여기서, X1은 T 또는 C 또는 A이고, X2는 T 또는 A 또는 G이고, X3는 T 또는 C 또는 A이고, X4는 T 또는 A이고, X5는 T 또는 A 또는 G이고, X6는 T 또는 A이고, X7은 A 또는 T이고, X8은 A 또는 G 또는 C 또는 T이고, X9은 G 또는 A 또는 C임); 및
    (c) X1X2X3AC(SEQ ID NO: 228)(여기서, X1은 A 또는 C 또는 G이고, X2는 C 또는 A이고, X3는 A 또는 C임).
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 세포.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 세포.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, CRISPR-연관 단백질은 PAM 서열을 인식할 수 있고, PAM 서열은 5'-TNNT-3' 또는 5'-TNRT-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 세포.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, CRISPR-연관 단백질은 PAM 서열을 인식할 수 있고, PAM 서열은 5'-TNNT-3' 또는 5'-TNRT-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 세포.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 60에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 세포.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 60에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 세포.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, CRISPR-연관 단백질은 PAM 서열을 인식할 수 있고, PAM 서열은 5'-NTTN-3', 5'-NTTR-3'(예를 들어, 5'-TTTG-3'), 또는 5'-NNR-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 세포.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, CRISPR-연관 단백질은 PAM 서열을 인식할 수 있고, PAM 서열은 5'-NTTN-3', 5'-NTTR-3'(예를 들어, 5'-TTTG-3'), 또는 5'-NNR-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 세포.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 213에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 세포.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 213에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 세포.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, CRISPR-연관 단백질은 PAM 서열을 인식할 수 있고, PAM 서열은 5'-NTTN-3' 또는 5'-RTTR-3'(예를 들어, 5'-ATTG-3' 또는 5'-GTTA-3')로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 세포.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, CRISPR-연관 단백질은 PAM 서열을 인식할 수 있고, PAM 서열은 5'-NTTN-3' 또는 5'-RTTR-3'(예를 들어, 5'-ATTG-3' 또는 5'-GTTA-3')로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 세포.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 서열은 약 15 개 뉴클레오티드 내지 약 55 개 뉴클레오티드를 포함하는, 세포.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 서열은 20 개 뉴클레오티드 내지 45 개 뉴클레오티드를 포함하는, 세포.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 tracrRNA를 추가로 포함하는, 세포.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 시스템은 tracrRNA를 포함하지 않는, 세포.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵 세포, 예를 들어, 포유류 세포, 예를 들어, 인간 세포인, 세포.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 원핵 세포인, 세포.
  71. 세포에서 표적 핵산에 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항의 시스템을 결합하는 방법으로서,
    (a) 시스템을 제공하는 단계; 및
    (b) 시스템을 세포에 전달하는 단계를 포함하고,
    세포는 표적 핵산을 포함하고, CRISPR-연관-단백질은 RNA 가이드에 결합하고, 스페이서 서열은 표적 핵산에 결합하는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 세포는 진핵 세포, 예를 들어, 포유류 세포, 예를 들어, 인간 세포인, 방법.
  73. 표적 핵산을 변형시키는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) CRISPR-연관 단백질 또는 CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산; 및
    (b) 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 직접 반복부 서열 및 스페이서 서열을 포함하는 RNA 가이드
    를 포함하는 조작된 비-자연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 표적 핵산에 전달하는 단계를 포함하고,
    CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 56 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고,
    CRISPR-연관 단백질은 RNA 가이드에 결합할 수 있고,
    CRISPR-연관 단백질 및 RNA 가이드에 의한 표적 핵산의 인식은 표적 핵산의 변형을 일으키는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 하기 서열들 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    (a) PX1X2X3X4F(SEQ ID NO: 216)(여기서, X1은 L 또는 M 또는 I 또는 C 또는 F이고, X2는 Y 또는 W 또는 F이고, X3는 K 또는 T 또는 C 또는 R 또는 W 또는 Y 또는 H 또는 V이고, X4는 I 또는 L 또는 M임);
    (b) RX1X2X3L(SEQ ID NO: 217)(여기서, X1은 I 또는 L 또는 M 또는 Y 또는 T 또는 F이고, X2는 R 또는 Q 또는 K 또는 E 또는 S 또는 T이고, X3는 L 또는 I 또는 T 또는 C 또는 M 또는 K임);
    (c) NX1YX2(SEQ ID NO: 218)(여기서, X1은 I 또는 L 또는 F이고, X2는 K 또는 R 또는 V 또는 E임);
    (d) KX1X2X3FAX4X5KD(SEQ ID NO: 219)(여기서, X1은 T 또는 I 또는 N 또는 A 또는 S 또는 F 또는 V이고, X2는 I 또는 V 또는 L 또는 S이고, X3는 H 또는 S 또는 G 또는 R이고, X4는 D 또는 S 또는 E이고, X5는 I 또는 V 또는 M 또는 T 또는 N임);
    (e) LX1NX2(SEQ ID NO: 220)(여기서, X1은 G 또는 S 또는 C 또는 T이고, X2는 N 또는 Y 또는 K 또는 S임);
    (f) PX1X2X3X4SQX5DS(SEQ ID NO: 221)(여기서, X1은 S 또는 P 또는 A이고, X2는 Y 또는 S 또는 A 또는 P 또는 E 또는 Y 또는 Q 또는 N이고, X3는 F 또는 Y 또는 H이고, X4는 T 또는 S이고, X5는 M 또는 T 또는 I임);
    (g) KX1X2VRX3X4QEX5H(SEQ ID NO: 222)(여기서, X1은 N 또는 K 또는 W 또는 R 또는 E 또는 T 또는 Y이고, X2는 M 또는 R 또는 L 또는 S 또는 K 또는 V 또는 E 또는 T 또는 I 또는 D이고, X3는 L 또는 R 또는 H 또는 P 또는 T 또는 K 또는 Q 또는 P 또는 S 또는 A이고, X4는 G 또는 Q 또는 N 또는 R 또는 K 또는 E 또는 I 또는 T 또는 S 또는 C이고, X5는 R 또는 W 또는 Y 또는 K 또는 T 또는 F 또는 S 또는 Q임); 및
    (h) X1NGX2X3X4DX5NX6X7X8N(SEQ ID NO: 223)(여기서, X1은 I 또는 K 또는 V 또는 L이고, X2는 L 또는 M이고, X3는 N 또는 H 또는 P이고, X4는 A 또는 S 또는 C이고, X5는 V 또는 Y 또는 I 또는 F 또는 T 또는 N이고, X6는 A 또는 S이고, X7은 S 또는 A 또는 P이고, X8은 M 또는 C 또는 L 또는 R 또는 N 또는 S 또는 K 또는 L임).
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57 내지 90, SEQ ID NO: 118 내지 151, 또는 SEQ ID NO: 213 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57 내지 90, SEQ ID NO: 118 내지 151, 또는 SEQ ID NO: 213 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 직접 반복부 서열은 하기 서열들 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    (a) X1X2TX3X4X5X6X7X8(SEQ ID NO: 224)(여기서, X1은 A 또는 C 또는 G이고, X2는 T 또는 C 또는 A이고, X3는 T 또는 G 또는 A이고, X4는 T 또는 G이고, X5는 T 또는 G 또는 A이고, X6는 G 또는 T 또는 A이고, X7은 T 또는 G 또는 A이고, X8은 A 또는 G 또는 T임);
    (b) X1X2X3X4X5X6X7X8X9(SEQ ID NO: 226)(여기서, X1은 T 또는 C 또는 A이고, X2는 T 또는 A 또는 G이고, X3는 T 또는 C 또는 A이고, X4는 T 또는 A이고, X5는 T 또는 A 또는 G이고, X6는 T 또는 A이고, X7은 A 또는 T이고, X8은 A 또는 G 또는 C 또는 T이고, X9은 G 또는 A 또는 C임); 및
    (c) X1X2X3AC(SEQ ID NO: 228)(여기서, X1은 A 또는 C 또는 G이고, X2는 C 또는 A이고, X3는 A 또는 C임).
  78. 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 57에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, CRISPR-연관 단백질은 PAM 서열을 인식할 수 있고, PAM 서열은 5'-TNNT-3' 또는 5'-TNRT-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 방법.
  81. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, CRISPR-연관 단백질은 PAM 서열을 인식할 수 있고, PAM 서열은 5'-TNNT-3' 또는 5'-TNRT-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 방법.
  82. 제1항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 60에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 60에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  84. 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, CRISPR-연관 단백질은 PAM 서열을 인식할 수 있고, PAM 서열은 5'-NTTN-3', 5'-NTTR-3'(예를 들어, 5'-TTTG-3'), 또는 5'-NNR-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 방법.
  85. 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, CRISPR-연관 단백질은 PAM 서열을 인식할 수 있고, PAM 서열은 5'-NTTN-3', 5'-NTTR-3'(예를 들어, 5'-TTTG-3'), 또는 5'-NNR-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 방법.
  86. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 213에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, 직접 반복부 서열은 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 213에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  88. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, CRISPR-연관 단백질은 PAM 서열을 인식할 수 있고, PAM 서열은 5'-NTTN-3' 또는 5'-RTTR-3'(예를 들어, 5'-ATTG-3' 또는 5'-GTTA-3')로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 방법.
  89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 단백질이고, CRISPR-연관 단백질은 PAM 서열을 인식할 수 있고, PAM 서열은 5'-NTTN-3' 또는 5'-RTTR-3'(예를 들어, 5'-ATTG-3' 또는 5'-GTTA-3')로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 방법.
  90. 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 서열은 약 15 개 뉴클레오티드 내지 약 55 개 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  91. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 서열은 20 개 뉴클레오티드 내지 45 개 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  92. 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 시스템은 tracrRNA를 추가로 포함하는, 방법.
  93. 제1항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 시스템은 tracrRNA를 포함하지 않는, 방법.
  94. 제1항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산은 DNA 분자인, 방법.
  95. 제1항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 비-특이적 뉴클레아제 활성을 포함하는, 방법.
  96. 제1항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산의 변형은 이중-가닥 절단 사건인, 방법.
  97. 제1항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산의 변형은 단일-가닥 절단 사건인, 방법.
  98. 제1항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산의 변형은 삽입 사건을 일으키는, 방법.
  99. 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산의 변형은 결실 사건을 일으키는, 방법.
  100. 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산의 변형은 세포 독성 또는 세포 사멸을 일으키는, 방법.
  101. 표적 핵산을 편집하는 방법으로서, 제1항 내지 제100항 중 어느 한 항의 시스템과 표적 핵산을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  102. 표적 핵산의 발현을 변형시키는 방법으로서, 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항의 시스템과 표적 핵산을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  103. 표적 핵산의 부위에서 페이로드 핵산의 삽입을 표적화하는 방법으로서, 제1항 내지 제102항 중 어느 한 항의 시스템과 표적 핵산을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  104. 표적 핵산에서의 부위로부터 페이로드 핵산의 절제를 표적화하는 방법으로서, 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항의 시스템과 표적 핵산을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  105. DNA 표적 핵산의 인식 시 단일-가닥 DNA를 비-특이적으로 분해하는 방법으로서, 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항의 시스템과 표적 핵산을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  106. 샘플에서 표적 핵산을 검출하는 방법으로서,
    (a) 샘플을 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항의 시스템 및 표지된 리포터 핵산과 접촉시키는 단계로서, 표적 핵산에 대한 스페이서 서열의 혼성화가 표지된 리포터 핵산의 절단을 일으키는 단계; 및
    (b) 표지된 리포터 핵산의 절단에 의해 생성된 검출 가능한 신호를 측정함으로써 샘플에서 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  107. (a) 표적 핵산의 표적화 및 편집;
    (b) 핵산의 인식 시 단일-가닥 핵산의 비-특이적 분해;
    (c) 이중-가닥 표적의 스페이서 상보적 가닥의 인식 시 이중-가닥 표적의 비-스페이서 상보적 가닥의 표적화 및 닉킹;
    (d) 이중-가닥 표적 핵산의 표적화 및 절단;
    (e) 샘플 내 표적 핵산의 검출;
    (f) 이중-가닥 핵산의 특이적 편집;
    (g) 이중-가닥 핵산의 염기 편집;
    (h) 세포에서 유전자형-특이적 또는 전사-상태-특이적 세포 사멸 또는 휴면 유도;
    (i) 이중-가닥 핵산 표적 내 인델 형성;
    (j) 이중-가닥 핵산 표적 내 서열 삽입; 또는
    (k) 이중-가닥 핵산 표적 내 서열 결실 또는 역위
    의 시험관내 또는 생체외 방법에서 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항의 시스템의 용도.
  108. 포유류 세포에서 표적 핵산으로 삽입 또는 결실을 도입하는 방법으로서,
    (a) CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산 서열; 및
    (b) 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 직접 반복부 서열 및 스페이서 서열을 포함하는 RNA 가이드(또는 RNA 가이드를 인코딩하는 핵산)의 형질감염을 포함하고,
    CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 56 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고,
    CRISPR-연관 단백질은 RNA 가이드에 결합할 수 있고;
    CRISPR-연관 단백질 및 RNA 가이드에 의한 표적 핵산의 인식은 표적 핵산의 변형을 일으키는, 방법.
  109. 제108항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  110. 제1항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  111. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 직접 반복부는 SEQ ID NO: 60에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  112. 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 직접 반복부는 SEQ ID NO: 60에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  113. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산은 PAM 서열에 인접하고, PAM 서열은 5'-NTTN-3', 5'-NTTR-3'(예를 들어, 5'-TTTG-3'), 또는 5'-NNR-3'로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 방법.
  114. 제108항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  115. 제1항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-연관 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  116. 제1항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 직접 반복부는 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 213에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  117. 제1항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 직접 반복부는 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 213에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  118. 제1항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산은 PAM 서열에 인접하고, PAM 서열은 5'-NTTN-3' 또는 5'-RTTR-3'(예를 들어, 5'-ATTG-3' 또는 5'-GTTA-3')로서 기재된 핵산 서열을 포함하고, "N"은 임의의 뉴클레오티드이고, "R"은 A 또는 G인, 방법.
  119. 제1항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염은 일시적 형질감염인, 방법.
  120. 제1항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 인간 세포인, 방법.
  121. (a) CRISPR-연관 단백질 또는 CRISPR-연관 단백질을 인코딩하는 핵산, 및
    (b) 직접 반복부 서열 및 스페이서 서열을 포함하는 RNA 가이드
    를 포함하는, 조성물로서,
    CRISPR-연관 단백질은 하기 아미노산 서열들
    (i) PX1X2X3X4F(SEQ ID NO: 216)(여기서, X1은 L 또는 M 또는 I 또는 C 또는 F이고, X2는 Y 또는 W 또는 F이고, X3는 K 또는 T 또는 C 또는 R 또는 W 또는 Y 또는 H 또는 V이고, X4는 I 또는 L 또는 M임);
    (ii) RX1X2X3L(SEQ ID NO: 217)(여기서, X1은 I 또는 L 또는 M 또는 Y 또는 T 또는 F이고, X2는 R 또는 Q 또는 K 또는 E 또는 S 또는 T이고, X3는 L 또는 I 또는 T 또는 C 또는 M 또는 K임);
    (iii) NX1YX2(SEQ ID NO: 218)(여기서, X1은 I 또는 L 또는 F이고, X2는 K 또는 R 또는 V 또는 E임);
    (iv) KX1X2X3FAX4X5KD(SEQ ID NO: 219)(여기서, X1은 T 또는 I 또는 N 또는 A 또는 S 또는 F 또는 V이고, X2는 I 또는 V 또는 L 또는 S이고, X3는 H 또는 S 또는 G 또는 R이고, X4는 D 또는 S 또는 E이고, X5는 I 또는 V 또는 M 또는 T 또는 N임);
    (v) LX1NX2(SEQ ID NO: 220)(여기서, X1은 G 또는 S 또는 C 또는 T이고, X2는 N 또는 Y 또는 K 또는 S임);
    (vi) PX1X2X3X4SQX5DS(SEQ ID NO: 221)(여기서, X1은 S 또는 P 또는 A이고, X2는 Y 또는 S 또는 A 또는 P 또는 E 또는 Y 또는 Q 또는 N이고, X3는 F 또는 Y 또는 H이고, X4는 T 또는 S이고, X5는 M 또는 T 또는 I임);
    (vii) KX1X2VRX3X4QEX5H(SEQ ID NO: 222)(여기서, X1은 N 또는 K 또는 W 또는 R 또는 E 또는 T 또는 Y이고, X2는 M 또는 R 또는 L 또는 S 또는 K 또는 V 또는 E 또는 T 또는 I 또는 D이고, X3는 L 또는 R 또는 H 또는 P 또는 T 또는 K 또는 Q 또는 P 또는 S 또는 A이고, X4는 G 또는 Q 또는 N 또는 R 또는 K 또는 E 또는 I 또는 T 또는 S 또는 C이고, X5는 R 또는 W 또는 Y 또는 K 또는 T 또는 F 또는 S 또는 Q임);
    (viii) X1NGX2X3X4DX5NX6X7X8N(SEQ ID NO: 223)(여기서, X1은 I 또는 K 또는 V 또는 L이고, X2는 L 또는 M이고, X3는 N 또는 H 또는 P이고, X4는 A 또는 S 또는 C이고, X5는 V 또는 Y 또는 I 또는 F 또는 T 또는 N이고, X6는 A 또는 S이고, X7은 S 또는 A 또는 P이고, X8은 M 또는 C 또는 L 또는 R 또는 N 또는 S 또는 K 또는 L임) 중 하나 이상을 포함하고,
    CRISPR-연관 단백질은 RNA 가이드에 결합하고, 스페이서는 표적 핵산에 결합하는, 조성물.
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