本発明は、トルエン、ベンゼン、スチレン、2,4−ペンタジエノエートおよび1,3−ブタジエンについての生合成生産能を有する細胞および生物の設計および生産に部分的に関する。トルエンおよびベンゼンの経路、図1および2は、天然のアミノ酸であるフェニルアラニンで開始するので、ほとんどの生物は、トルエンおよびベンゼンを生産するための非天然の生物の構築のための宿主として機能できる。フェニルアラニン生産を向上させるためのストラテジーは当該技術分野において公知である(Yakandawalaら,App.Microbiol.Biotech.78:283−291(2008);Leeら,米国特許第5,008,190号)。
スチレンの経路は、図3Aに示すように、ベンゾイル−CoAを生成するための生物に依存する。ベンゾイル−CoAは、多くの生合成および分解経路の重要な代謝中間体である。ベンゾイル−CoAは、抗生物質、芳香族および防御シグナルなどの芳香族天然産物の重要な前駆体である。ベンゾイル−CoA生合成の生物学的経路が当該技術分野において公知である(Boatrightら,Plant Physiol 135:1993−2011(2004);Xiangら,J Bacteriol.185:399−404(2003);Mooreら,J Nat.Prod 65:1956−1962(2002))。ベンゾイル−CoAはまた、嫌気性および好気性芳香族化合物分解経路の共通の中間体である(Gescherら,J Bacteriol. 184:6301−6315(2002);Philippら,FEMS Microbiol Lett.212:139−143(2002);Kochら,Eur.J Biochem.205:195−202(1992))。
本発明はまた、図4に示すように、1,3−ブタジエン生産を触媒する酵素をコードする遺伝子を発現する非天然の微生物に部分的に関する。一部の実施形態において、ムコネートを生産するための経路は、主要な代謝前駆体から誘導される。ムコネートは、微生物における種々の芳香族化合物の共通の分解産物である。cis,cis−ムコネートを生成するためのいくつかの生体触媒ストラテジーが開発されている。シキメート経路酵素を介してグルコースからムコネートを生産する遺伝子操作した大腸菌株がFrostの研究室において開発されている(米国特許第5,487,987号(1996);Niuら,Biotechnol Prog.,18:201−211(2002))。これらの株は、供給バッチ発酵槽条件下で48時間の培養後、36.8g/Lのcic,cis−ムコネートを生産できる(グルコールから22%の最大理論収率)。ムコネートはまた、トルエン、安息香酸およびカテコールなどの芳香族開始物質から生体触媒的に生産される。ベンゾエートからムコネートを生産する株は、13.5g/Lの力価および5.5g/L/hrの生産性を達成した(Choiら,J.Ferment.Bioeng.84:70−76(1997))。ムコネートはまた、スチレンモノマー生産プラントの流出物から生成される(Wuら,Enzyme and Microbiology Technology 35:598−604(2004))。
本発明はまた、図12〜15に示すように、2,4−ペンタジエノエート生産を触媒する酵素をコードする遺伝子を発現する非天然の微生物に部分的に関する。これらの経路のいずれも、必要な2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼの包含によりさらに1,3−ブタジエン経路に供給され得る。図12は、3つの経路によるピルベートの2,4−ペンタジエノエートへの全体の変換を示す。図13は、共通の中間体である2−アミノ−4−ケトペンタノエート(AKP)を介するオルニチンまたはアラニンの2,4−ペンタジエノエートへの全体の変換を示す。図13は、AKPから2,4−ペンタジエノエートへの6つの経路を示し、そのうちの3つは図12に示した中間体を阻害する。図14は、オルニチンから2,4−ペンタジエノエートへの4つのさらなる経路を示す。図15は、3−ヒドロキシプロパノイル−CoA(3−HP−CoA)およびアクリロイル−CoAから2,4−ペンタジエノエートへの多くの経路を示す。
本発明はまた、図16〜17および19〜21に示したように、1,3−ブタジエン生産を触媒する酵素をコードする遺伝子を発現する非天然の微生物に部分的に関する。図16は、3−ヒドロキシペント−4−エノエート(3HP4)の1,3−ブタジエンへの脱カルボキシル脱水(decarboxylative dehydration)を示し、ここで、3HP4は図15および19に示した経路により利用可能である。それ自体で重要である3HP4は、水和による中間体2,4−ペンタジエノエートにより図18に示し、ならびに図15、19および20の経路により示す。同様に、図17は、それ自体、図15、19および21に示した経路により利用可能である、中間体3,5−ジヒドロキシペンタノエートのタンデム脱カルボキシ脱水および排出(さらなる脱水)を示す。
図19は、3−HP−CoAおよびアクリリル−CoAから1,3−ブタジエンおよび1,3−ブタジエン中間体への経路を示す。図20は、スクシニル−CoAから1,3−ブタジエンおよび1,3−ブタジエン中間体への経路を示す。必要なスクシニル−CoAは主要な代謝中間体であり、その収率は、本明細書にさらに記載するように還元的TCAサイクルにより向上され得る。最後に、図21は、マロニル−CoAおよびアセチル−CoAの濃縮物から1,3−ブタジエンおよび1,3−ブタジエン中間体への経路を示し、アセチル−CoAはまた、本明細書に記載される還元的TCA経路による高スループットから利益を受ける。
本発明はまた、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスフェート、トルエン、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、またはベンゼンについての生合成生産能を有する細胞および生物の設計および生産に関する。本明細書に記載した結果は、代謝経路が、大腸菌(Escherichia coli)および他の細胞または生物においてp−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、トルエン、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、またはベンゼンの生合成を達成するように設計され、組み換え的に操作され得ることを示す。p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、トルエン、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、またはベンゼンの生合成生産は、設計された代謝遺伝子型を有する株を構築することにより確認され得る。これらの代謝的に遺伝子操作された細胞または生物はまた、理論的最大増殖に近づく条件下を含む、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、トルエン、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、またはベンゼン生合成をさらに増大させるように適応進化に供され得る。
大腸菌におけるシキメート生合成経路は、エリトロース−4−ホスホネートを、4−ヒドロキシベンゾエートを含む多くの必須の代謝産物の生合成を導く重要な中間体である、コリスメートに変換する。4−ヒドロキシベンゾエートは、テレフタル酸およびベンゼンの工業的前駆体である、p−トルエートに構造的に類似している。本明細書に開示されるように、シキメート経路酵素は、代替の基質、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート(2H3M4OP)を受け取り、それを、p−トルエートまたはトルエン、あるいは代替の基質、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート(2H4OP)に変換し、それをベンゾエートまたはベンゼンに変換するために利用される。さらに、経路は、イソプレノイド生合成のための非メバロネート経路からの酵素を用いて2H3M4OPまたは2H4OP前駆体を合成するために使用される。
本明細書に開示されるのは、炭水化物原料から再生可能なp−トルエート、テレフタレート(PTA)、トルエン、ベンゾエート、またはベンゼンを産生するための微生物を遺伝子操作するためのストラテジーである。トルエンシリーズにおいて、グリセルアルデヒド−3−ホスフェート(G3P)およびピルベートは、3つの酵素的工程において2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート(2H3M4OP)に変換される(実施例IIIおよび図5を参照のこと)。2H3M4OP中間体は、続いて、シキメート経路において酵素によりp−トルエートに変換される(実施例IVおよび図6を参照のこと)。p−トルエートは、微生物によりPTAにさらに変換され得る(実施例Vおよび図7を参照のこと)。ベンゼンシリーズにおいて、2H4OPは、エリトロース−4−ホスフェートの脱水および還元により調製される(実施例VIおよび図8を参照のこと)。2H4OP中間体は、続いて、シキメート経路において酵素によりベンゾエートに変換される(実施例VIおよび図9を参照のこと)。ベンゾエートおよびp−トルエートは、それぞれベンゼンおよびトルエンに変換される(実施例VII、ならびに図10および11を参照のこと)。
G3Pのp−トルエートへの変換は、以下の正味の反応に従って、1つのATP、2つの還元当量の(NAD(P)H)、および2分子のホスホエノールピルベートを必要とする。
G3P+2PEP+ATP+2NAD(P)H+2H+→p−トルエート+4Pi+ADP+2NAD(P)++CO2+H2O
さらなるATPがグルコースからG3Pを合成するために必要とされる。最大の理論的p−トルエート収率は、エネルギーに必要なグルコースマイナス炭素から0.67mol/mol(0.51g/g)である。2ATPが合成されるp−トルエート分子ごとに消費されるという仮定の下で、グルコースからの予測されるp−トルエート収量は、0.62mol/mol(0.46g/g)p−トルエートである。
p−トルエートが、実施例IIIに記載した酵素によりPTAにさらに変換される場合、グルコースから予測されるPTA収量は0.64mol/mol(0.58g/g)である。この場合、p−トルエートのPTAへの酸化は、正味の反応に従ってさらなる正味の還元当量を生じる:
p−トルエート+O2+NAD+→PTA+NADH+2H+
上記の経路の各工程を触媒するための酵素候補を以下の段落に記載する。トルエン、ベンゼン、スチレン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエートまたは1,3−ブタジエンを生産するための首尾よい遺伝子操作経路は、十分な活性および特異性を有する適切な酵素のセットの識別、生産宿主内でのそれらの対応する遺伝子のクローニング、生産宿主におけるそれらの遺伝子の発現の最適化、発酵条件の最適化、および発酵後の生産物形成についての評価を必要とする。
本発明の微生物または微生物を参照して使用する場合、本明細書で使用される、「非天然に生じる」という用語は、微生物が、参照とした種の野生型株を含む、参照とした種の天然に生じる株に通常見出されない少なくとも1つの遺伝子変化を意味すると意図する。遺伝子変化としては、例えば、代謝ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を組み込む修飾、他の核酸付加、核酸欠失および/または微生物の遺伝物質の他の機能的崩壊が挙げられる。このような修飾としては、例えば、参照とする種についての異種、同種または異種および同種の両方のポリペプチドについてのコード領域およびその機能的断片が挙げられる。さらなる修飾としては、例えば、修飾が遺伝子またはオペロンの発現を変化させる非コード調節領域が挙げられる。例示的な代謝ポリペプチドとしては、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、トルエン、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、または1,3−ブタジエン生合成経路内の酵素またはタンパク質が挙げられる。
代謝修飾とは、その天然に生じる状態から変化される生合成反応を指す。従って、非天然に生じる微生物は、代謝ポリペプチドまたはその機能的断片をコードする核酸に対して遺伝的修飾を有し得る。例示的な代謝修飾は本明細書に開示されている。
微生物に対する参照として使用する場合、本明細書で使用する、「単離された」という用語は、参照とする微生物が天然に見出されるような少なくとも1つの成分を実質的に含まない生物を意味する。この用語は、微生物がその天然の環境に見出されるような一部または全ての成分から除去される微生物を含む。この用語はまた、微生物が非天然に生じる環境で見出されるような一部または全ての成分から除去される微生物を含む。従って、単離された微生物は、天然に見出されるか、または非天然に生じる環境で増殖、保存または維持されるような他の物質から部分的または完全に分離される。単離された微生物の特定の例としては、部分的に純粋な微生物、実質的に純粋な微生物および非天然に生じる培地中で培養される微生物が挙げられる。
本明細書で使用される、「微生物(microbail)」、「微生物(microbail organism)」、または「微生物(microorganism)」という用語は、古細菌、細菌または真核生物の領域内に含まれる微小細胞として存在する任意の生物を意味すると意図される。従って、この用語は、微小サイズを有する原核もしくは真核細胞または生物を包含し、全ての種の細菌、古細菌および真正細菌ならびに酵母および真菌などの真核微生物を含むと意図される。この用語はまた、生化学物質を生産するために培養され得る任意の種の細胞培養物を含む。
本明細書で使用する、「CoA」または「補酵素A」という用語は、有機補因子または活性化酵素系を形成するために多くの酵素(アポ酵素)の活性化にその存在が必要とされる補欠分子族(酵素の非タンパク質部分)を意味すると意図する。補酵素Aは、特定の縮合酵素において機能し、アセチルまたは他のアシル基転移において、ならびに脂肪酸合成および酸化、ピルベート酸化ならびに他のアセチル化において作用する。
本明細書で使用する、「(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート」という用語は、本明細書において2H3M4OPと省略され、図5に示す化学式を有する。このような化合物はまた、3−ヒドロキシ−2−メチルブタナール−4−ホスフェートと記載され得る。
本明細書で使用する、「(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート」という用語は、本明細書において2H4OPと省略され、図8に示す化学式(化合物3)を有する。このような化合物はまた、3−ヒドロキシブタナール−4−ホスフェートと記載され得る。
分子式C8H7O2 −(図6、化合物9を参照のこと)(IUPAC名4−メチルベンゾエート)を有する、本明細書で使用する、「p−トルエート」という用語は、p−トルイル酸のイオン化形態であり、p−トルエートおよびp−トルイル酸は、その任意の塩形態を含む、その天然またはイオン化形態のいずれかの化合物を示すために全体にわたって交換可能に使用され得ると理解される。特定の形態はpHに依存することは当業者により理解される。
分子式C7H6O2(図9、化合物9を参照のこと)を有する、本明細書で使用する、「ベンゾエート」という用語は、安息香酸のイオン化形態であり、ベンゾエートおよび安息香酸は、その任意の塩形態を含む、その天然またはイオン化形態のいずれかの化合物を示すために全体にわたって交換可能に使用され得ると理解される。特定の形態はpHに依存することは当業者により理解される。
分子式C8H4O4 −2(図7、化合物4を参照のこと)(IUPAC名テレフタレート)を有する、本明細書で使用する、「テレフタレート」という用語は、テレフタル酸のイオン化形態であり、p−フタル酸またはPTAとも称され、テレフタレートおよびテレフタル酸は、その任意の塩形態を含む、その天然またはイオン化形態のいずれかの化合物を示すために全体にわたって交換可能に使用され得ると理解される。特定の形態はpHに依存することは当業者により理解される。
培養または増殖条件を参照して使用する場合、本明細書で使用する、「実質的に嫌気性」という用語は、液体培地に溶解した酸素について酸素の量が飽和の約10%未満であることを意味すると意図する。この用語はまた、約1%未満の酸素の雰囲気で維持される液体または固体培地の密閉チャンバを含むことが意図される。
本明細書で使用する、「外因性」は、参照分子または参照活性が宿主微生物に組み込まれることを意味すると意図する。分子は、例えば、宿主染色体内に、またはプラスミドなどの非染色体遺伝物質として融合することによって、コード核酸を宿主遺伝物質に組み込むことによって組み込まれ得る。従って、この用語は、コード核酸の発現を参照して使用される場合、発現可能な形態のコード核酸の微生物への組み込みを指す。生合成活性を参照して使用する場合、この用語は、宿主参照生物へ組み込まれる活性を指す。その起源は、例えば、宿主微生物への組み込み後に参照活性を発現する同種または異種コード核酸であってもよい。従って、「内因性」という用語は、宿主に存在する参照分子または活性を指す。同様に、この用語は、コード核酸の発現に対する参照として使用する場合、微生物内に含まれるコード核酸の発現を指す。「異種」という用語は、参照種以外の起源由来の分子または活性を指すのに対して、「同種」は、宿主微生物由来の分子または活性を指す。従って、本発明のコード核酸の外因性発現は、異種または同種コード核酸のいずれかまたは両方を利用し得る。
1つより多い外因性核酸が微生物に含まれる場合、その1つより多い外因性核酸は、上記で議論した参照コード核酸または生合成活性を指すと理解される。本明細書に開示されるように、このような1つより多い外因性核酸は、別の核酸分子、多シストロン性核酸分子、またはそれらの組み合わせにおいて宿主微生物に組み込まれ得、それはなお、1つより多い外因性核酸とみなされることがさらに理解される。例えば、本明細書に開示されるように、微生物は、所望の経路の酵素またはタンパク質をコードする2つ以上の外因性核酸を発現するように遺伝子操作され得る。所望の活性をコードする2つの外因性核酸が宿主微生物に組み込まれる場合、2つの外因性核酸は、例えば、単一のプラスミド、別のプラスミドにおいて単一の核酸として組み込まれ得、単一部位または複数部位において宿主染色体に融合され得、それはなお、2つの外因性核酸とみなされることは理解される。同様に、2つより多い外因性核酸が、任意の所望の組み合わせ、例えば、単一のプラスミド上、別のプラスミド上で宿主生物内に導入されてもよく、単一部位または複数部位において宿主染色体に導入されてもよく、それはなお、2つ以上の外因性核酸、例えば3つの外因性核酸とみなされることは理解される。従って、参照外因性核酸または生合成活性の数は、宿主生物に導入される別の核酸の数ではなく、コード核酸の数または生合成活性の数を指す。
本発明の非天然に生じる微生物は、変化を損失させずに5つより多い世代に培養され得る微生物を指す、安定な遺伝的変化を含み得る。一般に、安定な遺伝的変化は、10より多い世代で存続する修飾を含み、特に安定な修飾は、約25より多い世代で存続し、より特に安定な遺伝的修飾は、永久的を含む、50より多い世代である。
当業者は、本明細書に例示された代謝的修飾を含む、遺伝的変化が、大腸菌などの適切な宿主生物およびそれらの対応する代謝反応または所望の代謝経路のための遺伝子などの所望の遺伝物質のための適切な起源生物を参照して記載されていることを理解するだろう。しかしながら、広範な種類の生物の完全なゲノム配列およびゲノム分野における高いレベルの技術を考慮して、当業者は、本明細書に提供される教示および指針を本質的に全ての他の生物に容易に適用できるだろう。例えば、本明細書に例示した大腸菌の代謝変化は、参照種以外の種から同じまたは類似のコード核酸を導入することにより、他の種に容易に適用できるだろう。このような遺伝的変化としては、例えば、種ホモログの遺伝的変化、および特に、オルソログ、パラログまたは非オルソロガスな遺伝子置換が挙げられる。
オルソログは、垂直の系統に関連する遺伝子(複数も含む)であり、異なる生物において実質的に同じまたは同一の機能に関与する。例えば、マウスエポキシドヒドロラーゼおよびヒトエポキシドヒドロラーゼは、エポキシドの加水分解の生物学的機能のためのオルソログとみなされ得る。例えば、遺伝子が、ホモログであることを示すために十分な量の配列相同性を共有する場合、遺伝子は垂直の系統に関連するか、または共通の祖先からの進化に関連する。遺伝子はまた、それらが、一次配列相同性が識別できない範囲まで共通の祖先から進化したかを示すために、必ずしも配列相同性でないが、十分な量の三次元構造を共有する場合、オルソログとみなされ得る。オルソログである遺伝子は、約25%〜100%のアミノ酸配列同一性の配列相同性を有するタンパク質をコードできる。25%未満のアミノ酸相同性を共有するタンパク質をコードする遺伝子はまた、それらの三次元構造もまた、相同性を有する場合、垂直の系統により生じるとみなされ得る。組織プラスミノーゲン活性化因子およびエラスターゼを含む、酵素のセリンプロテアーゼファミリのメンバーは、共通の祖先から垂直の系統により生じるとみなされる。
オルソログは、例えば、進化により、構造または全体の活性において分岐している、遺伝子またはそれらのコードされた遺伝子産物を含む。例えば、1つの種が、2つの機能を示す遺伝子産物をコードする場合、およびこのような機能が第2の種における別個の遺伝子に分けられる場合、3つの遺伝子およびそれらの対応する産物はオルソログとみなされる。生化学的産物の生産に関して、当業者は、導入または***される代謝活性を保有するオルソログ遺伝子が、非天然に生じる微生物の構築のために選択されることを理解するだろう。分離可能な活性を示すオルソログの例は、別個の活性が、2つ以上の種の間、または単一種内の別個の遺伝子産物に分離される場合である。特定の例は、エラスターゼタンパク質分解およびプラスミノーゲンタンパク質分解、2種のセリンプロテアーゼ活性の、プラスミノーゲン活性化因子またはエラスターゼとしての別個の分子への分離である。第2の例は、マイコプラズマ5’−3’エキソヌクレアーゼおよびショウジョウバエ(Drosophila)DNAポリメラーゼIII活性の分離である。第1の種由来のDNAポリメラーゼは、第2の種由来のエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼのいずれかまたは両方に対するオルソログ、およびその逆とみなされ得る。
対照的に、パラログは、例えば、複製後の進化的分岐に関連するホモログであり、同一ではないが、類似または共通の機能を有する。パラログは、例えば、同じ種を起源としてもよいか、または同じ種由来であってもよく、あるいは異なる種を起源としてもよいか、または異なる種由来であってもよい。例えば、ミクロソームエポキシドヒドロラーゼ(エポキシドヒドロラーゼI)および可溶性エポキシドヒドロラーゼ(エポキシドヒドロラーゼII)は、それらが、共通の祖先から共進化した、2つの別個の酵素を表し、別個の反応を触媒し、同じ種において別個の機能を有するため、パラログとみなされ得る。パラログは、それらがホモログであるか、または共通の祖先から共進化を介して関連することを示唆する、互いに対して有意な配列相同性を有する同じ種由来のタンパク質である。パラログタンパク質ファミリーのグループとしては、HipAホモログ、ルシフェラーゼ遺伝子、ペプチダーゼ、および他のものが挙げられる。
非オルソロガス遺伝子置換は、異なる種において参照遺伝子機能に置換し得る1つの種由来の非オルソロガス遺伝子である。置換は例えば、異なる種における参照機能と比べて元の種において実質的に同一または類似の機能を実施できることを含む。一般的に、非オルソロガス遺伝子置換は、参照機能をコードする既知の遺伝子に構造的に関連すると識別可能であるが、ほとんど構造的に関連しないが、本明細書で使用される場合、機能的に類似の遺伝子およびそれらの対応する遺伝子産物は、それにも関わらず、なお、この用語の意味の範囲内である。機能的相同性は、例えば、置換しようとする機能をコードする遺伝子と比べて非オルソロガス遺伝子産物の活性部位または結合領域において少なくとも一部の構造的相同性を必要とする。従って、非オルソロガス遺伝子は、例えば、パラログまたは関連しない遺伝子を含む。
従って、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成能を有する本発明の非天然に生じる微生物を識別および構築する際に、当業者は、本明細書に提供される教示および指針を特定の種に適用して、代謝修飾の識別が、オルソログの識別および包含または不活性化を含み得ることを理解するだろう。パラログおよび/または非オルソロガス遺伝子置換が、類似または実質的に類似の代謝反応触媒する酵素をコードする参照微生物に存在する範囲まで、当業者は、それらの進化に関連した遺伝子を利用できる。
オルソログ、パラログおよび非オルソロガス遺伝子置換は、当業者に周知の方法により決定され得る。例えば、2つのポリペプチドについての核酸またはアミノ酸配列の検査は、比較配列の間の配列同一性および類似性を明らかにする。このような類似性に基づいて、当業者は、類似性が、タンパク質が共通の祖先からの進化に関連することを示すのに十分に高いか否かを決定できる。Align、BLAST、Clustal Wおよび他のものなどの当業者に周知のアルゴリズムは、生の配列類似性または識別性を比較し、決定し、また、質量またはスコアを割り当てられ得る配列の存在またはギャップの有意性を決定する。このようなアルゴリズムはまた、当該技術分野において公知であり、ヌクレオチド配列類似性または同一性を決定するのに同様に適用可能である。関連性を決定するのに十分な類似性に関するパラメータは、統計的類似性を計算するための周知の方法、またはランダムポリペプチドにおいて類似性一致を発見する機会、および決定された一致の有意性に基づいてコンピューターで計算される。2つ以上の配列のコンピューター比較は、所望の場合、また、当業者により視覚的に最適化され得る。関連する遺伝子産物またはタンパク質は、高い類似性、例えば25%〜100%配列同一性を有すると予想され得る。関連しないタンパク質は、十分なサイズのデータベースが走査される場合、偶然に起こると予想されるものと本質的に同じ同一性を有し得る(約5%)。5%〜24%の間の配列は、比較した配列が関連すると結論付けるのに十分な相同性を表わしてもよいし、または表わさなくてもよい。データセットのサイズを考慮してこのような一致の有意性を決定するためのさらなる統計的解析が、これらの配列の関連性を決定するために実施され得る。
例えば、BLASTアルゴリズムを用いる2つ以上の配列の関連性を決定するための例示的なパラメータが以下に記載され得る。手短に述べると、アミノ酸配列アラインメントは、BLASTPバージョン2.0.8(Jan−05−1999)および以下のパラメータ:マトリクス:0 BLOSUM62;ギャップ開口:11;ギャップ伸長:1;x_dropoff:50;予想:10.0;ワールドサイズ:3;フィルター:オンを用いて実施され得る。核酸配列アラインメントは、BLASTNバージョン2.0.6(Sept−16−1998)および以下のパラメータ:一致:1;不一致:−2:ギャップ開口:5;ギャップ伸長:2;x_dropoff:50;予想:10.0;ワールドサイズ:11;フィルター:オフを用いて実施され得る。当業者は、比較の厳密性を増加または減少させるため、および2つ以上の配列の関連性を決定するために、どの修飾が上記パラメータになされ得るかを知るだろう。
一部の実施形態において、本発明は、トルエンを生産するのに十分な量で発現されるトルエン経路酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含むトルエン経路を有する微生物を含む非天然に生じる微生物を提供する。トルエン経路は、図1の代替の経路に示すように、(A)1)フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)の1つまたは両方、2)フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、および3)フェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼ、(B)1)フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)の1つ以上、2)フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、3)フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびフェニルアセトアルデヒドオキシダーゼの1つ以上、ならびに4)フェニルアセテートデカルボキシラーゼの1つ以上;ならびに(C)フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンオキシドレダクターゼ(脱アミン化)の1つ以上、2)フェニルピルベートオキシダーゼ、ならびに3)フェニルアセテートデカルボキシラーゼから選択される。
トルエン経路を有する非天然に生じる微生物は、トルエン経路酵素を各々コードする2つの外因性核酸、トルエン経路酵素を各々コードする3つの外因性核酸、トルエン経路酵素を各々コードする4つの外因性核酸、またはトルエン経路酵素を各々コードする5つの外因性核酸を含み得る。3つの外因性核酸を有する例示的な非天然に生じる微生物は、1)フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよび/またはオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、3)フェニルピルベートオキシダーゼ、ならびに5)フェニルアセテートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子を有する生物を含み得る。4つの外因性核酸を有する例示的な非天然に生じる生物は、1)フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ、2)フェニルアラニンオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、3)フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、および4)フェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼをコードする外因性遺伝子を有する生物を含み得る。5つの外因性核酸を有する例示的な非天然に生じる微生物は、1)フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ、2)フェニルアラニンオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、3)フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、4)フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび/またはオキシダーゼ、ならびに5)フェニルアセテートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子を有する微生物を含み得る。このように、特定の実施形態において、非天然に生じる微生物は、完全なトルエン経路においてあらゆる酵素をコードする完全なトルエン経路のあらゆる遺伝子を有し得る。一部の実施形態において、トルエン経路を有する非天然に生じる微生物は、異種核酸である少なくとも1つの外因性核酸を含み得る。最後に、トルエン経路を有する非天然に生じる微生物は、実質的に嫌気性培地に存在し得る。
一部の実施形態において、本発明は、ベンゼンを生産するのに十分な量で発現されるベンゼン経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含むベンゼン経路を有する微生物を含む非天然に生じる微生物を提供する。ベンゼン経路は、図2に示すように、フェニルアラニンベンゼン−リアーゼを含んでもよい。少なくとも1つの外因性核酸は、フェニルアラニンベンゼン−リアーゼ自体またはその前駆体フェニルアラニンの生産に影響を与える核酸であってもよい。一部の実施形態において、ベンゼン経路を有する非天然に生じる微生物は、異種核酸である少なくとも1つの外因性核酸を有する。一部の実施形態において、ベンゼン経路を有する非天然に生じる微生物は、実質的に嫌気性培地に存在する。
一部の実施形態において、本発明は、スチレンを生産するのに十分な量で発現されるスチレン経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含むスチレン経路を有する微生物を含む非天然に生じる微生物を提供する。スチレン経路は、図3における代替の経路により示すように、(A)1)ベンゾイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、2)3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼ、およびヒドロラーゼの1つ以上、3)ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、4)アセトフェノンレダクターゼ、ならびに5)1−フェニルエタノールデヒドラターゼ;ならびに(B)1)ベンゾイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、2)ホスホトランス−3−オキソ−3−フェニルプロピオニラーゼ、3)ベンゾイル−アセテートキナーゼ、4)ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、5)アセトフェノンレダクターゼ、ならびに6)1−フェニルエタノールデヒドラターゼから選択され得る。
一部の実施形態において、スチレン経路を有する非天然に生じる微生物は、スチレン経路の酵素を各々コードする2つの外因性核酸、スチレン経路の酵素を各々コードする3つの外因性核酸、スチレン経路の酵素を各々コードする4つの外因性核酸、スチレン経路の酵素を各々コードする5つの外因性核酸、スチレン経路の酵素を各々コードする6つの外因性核酸などを含み得る。5つの外因性核酸を有する例示的な非天然に生じる生物は、1)ベンゾイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、2)3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼ、およびヒドロラーゼの1つ、3)ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、4)アセトフェノンレダクターゼ、ならびに5)1−フェニルエタノールデヒドラターゼをコードする外因性遺伝子を有する生物を含み得る。6つの外因性核酸を有する例示的な非天然に生じる生物は、1)ベンゾイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、2)ホスホトランス−3−オキソ−3−フェニルプロピオニラーゼ、3)ベンゾイル−アセテートキナーゼ、4)ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、5)アセトフェノンレダクターゼ、ならびに6)1−フェニルエタノールデヒドラターゼをコードする外因性遺伝子を有する生物を含み得る。一部の実施形態において、スチレン経路を有する非天然に生じる微生物は、異種核酸である少なくとも1つの外因性核酸を有する。一部の実施形態において、スチレン経路を有する非天然に生じる微生物は、実質的に嫌気性培地に存在する。
一部の実施形態において、本発明は、1,3−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される1,3−ブタジエン経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む1,3−ブタジエン経路を有する微生物を含む非天然に生じる微生物を提供する。1,3−ブタジエン経路は、図4における代替の経路に示されるように、(A)1)trans,trans−ムコネートデカルボキシラーゼおよび2)trans−2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ;(B)1)cis,trans−ムコネートcis−デカルボキシラーゼおよび2)trans−2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ;(C)1)cis,trans−ムコネートtrans−デカルボキシラーゼ2)cis−2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ;ならびに(D)1)cis,cis−ムコネートデカルボキシラーゼおよび2)cis−2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼから選択され得る。
一部の実施形態において、1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、1,3−ブタジエン経路の酵素を各々コードする2つの外因性核酸を含み得る。このように、2つの外因性核酸は、図4に示す完全な経路に対応する、(A)1)trans,trans−ムコネートデカルボキシラーゼおよび2)trans−2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ;(B)1)cis,trans−ムコネートcis−デカルボキシラーゼおよび2)trans−2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ;(C)1)cis,trans−ムコネートtrans−デカルボキシラーゼ2)cis−2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ;ならびに(D)1)cis,cis−ムコネートデカルボキシラーゼおよび2)cis−2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼから選択されるセットをコードできる。一部の実施形態において、1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、異種核酸である少なくとも1つの外因性核酸を有する。一部の実施形態において、1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、実質的に嫌気性培地に存在する。
一部の実施形態において、本発明は、2,4−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される2,4−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む2,4−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。2,4−ペンタジエノエート経路は、図12の工程A〜Dに示すように、(A)1)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートアルドラーゼ、2)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートデヒドラターゼ、3)2−オキソペンテノエートレダクターゼ、および4)2−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼ、図13の工程B〜Dに示すように、(B)(1)AKPデアミナーゼ、2)アセチルアクリラートレダクターゼ、および3)4−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ、図13の工程E、H、F、CおよびDに示すように、(C)1)AKPアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、2)2,4−ジオキソペンタノエート−2−レダクターゼ、3)2−ヒドロキシ−4−オキソペンタノエートデヒドラターゼ、4)アセチルアクリラートレダクターゼ、および5)4−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ、図12の工程B〜Dと共に、図13の工程EおよびKに示すように、(D)1)AKPアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、2)2,4−ジオキソペンタノエート−4−レダクターゼ、3)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートデヒドラターゼ、4)2−オキソペンタノエートレダクターゼ、ならびに5)2−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼ、ならびに図12の工程B〜Dと共に、図13の工程JおよびLにも示す、(E)1)AKPレダクターゼ、2)2−アミノ−4−ヒドロキシペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、3)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートデヒドラターゼ、4)2−オキソペンタノエートレダクターゼ、ならびに5)2−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼから選択される2,4−ペンタジエノエートにAKPを変換できる酵素のセットを有する。一部の実施形態において、図12に示す中間体4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートを含む図13の経路もまた、図12に示す2,4−ジヒドロキシペンタノエート経路により方向付けされ得て、2,4−ペンタジエノエートを得る。例えば、4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートから、2,4−ペンタジエノエートまでの経路は、図12における工程E、H、およびDまたは工程E、F、およびGにおける酵素を含み得る。
一部の実施形態において、本発明はまた、2,4−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される2,4−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む2,4−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。2,4−ペンタジエノエート経路は、図12の工程A、E、F、およびGに示すように、(A)1)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートアルドラーゼ、2)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートレダクターゼ、3)2,4−ジヒドロキシペンタノエート2−デヒドラターゼ、および4)4−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼならびに図12の工程A、E、H、およびDに示すように、(B)1)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートアルドラーゼ、2)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートレダクターゼ、3)2,4−ジヒドロキシペンタノエート4−デヒドラターゼおよび4)2−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼから選択される酵素のセットを有する。
一部の実施形態において、本発明はまた、2,4−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される2,4−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む2,4−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。2,4−ペンタジエノエート経路は、図13の工程E、H、I、G、およびDに示すように、(A)1)AKPアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、2)2,4−ジオキソペンタノエート2−レダクターゼ、3)2−ヒドロキシ−4−オキソペンタノエートレダクターゼ、4)2,4−ジヒドロキシペンタノエート2−デヒドラターゼ、および5)4−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼならびに図12の工程FおよびGまたはHおよびDと共に、図13の工程E、HおよびIにそれぞれ示すように、(B)1)AKPアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、2)2,4−ジオキソペンタノエート2−レダクターゼ、4)2,4−ジヒドロキシペンタノエート−2−デヒドラターゼと共に、3)2−ヒドロキシ−4−オキソペンタノエートレダクターゼ、ならびに5)4−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼまたは4)2,4−ジヒドロキシペンタノエート−4−デヒドラターゼならびに5)2−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼから選択される酵素のセットを有する。すなわち、2,4−ジヒドロキシペンタノエートの二重脱水が任意の順序で実施され得る。
一部の実施形態において、本発明はまた、AKPを生産するのに十分な量で発現されるAKP経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含むAKP経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。AKP経路は、図13の工程MおよびNに示すように、オルニチン4,5−アミノムターゼおよび2,4−ジアミノペンタノエート4−アミノトランスフェラーゼおよび/または4−デヒドロゲナーゼを含む。一部の実施形態において、AKP経路を有する微生物は、オルニチン4,5−アミノムターゼおよび2,4−ジアミノペンタノエート4−アミノトランスフェラーゼまたは2,4−ジアミノペンタノエート4−デヒドロゲナーゼをコードする2つの外因性酵素を含む。一部の実施形態において、このAKP経路は、上述の2,4−ペンタジエノエート経路および図13に示したもののいずれかに加えられ得る。代替として、AKPは、図13の工程Aに示すように、AKPチオラーゼを付加することによってアラニンから入手でき、種々の2,4−ペンタジエノエート経路に供給され、図12と共に図13に示される。
一部の実施形態において、本発明はまた、2,4−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される2,4−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む2,4−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。2,4−ペンタジエノエート経路は、図14の工程A〜Cに示すように、(A)1)オルニチン2,3−アミノムターゼ、2)3,5−ジアミノペンタノエートデアミナーゼ、ならびに3)5−アミノペント−2−エノエートデアミナーゼ、図14の工程A、B、H、F、およびGに示すように、(B)1)オルニチン2,3−アミノムターゼ、2)3,5−ジアミノペンタノエートデアミナーゼ、3)5−アミノペント−2−エノエートアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、4)5−オキソペント−2−エノエートレダクターゼ、ならびに5)5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ、図14の工程A、D、E、F、およびGに示すように、(C)1)オルニチン2,3−アミノムターゼ、2)3,5−ジアミノペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、3)3−アミノ−5−オキソペンタノエートデアミナーゼ、4)5−オキソペント−2−エノエートレダクターゼ、ならびに5)5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ、ならびに図14の工程A、D、I、J、およびGに示すように、(D)1)オルニチン2,3−アミノムターゼ、2)3,5−ジアミノペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、3)3−アミノ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ、ならびに4)3−アミノ−5−ヒドロキシペンタノエートデアミナーゼ、ならびに5)5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼから選択される酵素のセットを有する。
一部の実施形態において、本発明はまた、2,4−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される2,4−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む2,4−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。2,4−ペンタジエノエート経路は、3−HP−CoAまたはアクリロイル−CoAから開始して図15に示す多くの経路のいずれかから選択される酵素のセットを有する。
3−HP−CoAからの例示的な経路は、以下の酵素セット、図15の工程A〜Eに示すように、(A)1)3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、2)3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、3)3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、4)5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼ、ならびに5)ペント−2,4−ジエノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、ならびに図15の工程A、F、I、J、およびQに示すように、(B)1)3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、2)3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、3)3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、4)3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、ならびに5)5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼを含む。当業者は、3−HP−CoAからの経路(A)および(B)を定義する酵素セットが、図15の工程Gに示すように、可逆的酵素3,5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、ならびに図15の工程Hに示すように、5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼにより混合され得ることを認識するだろう。このように、3−HP−CoAから2,4−ペンタジエノエート経路は、図15に各々示すように、工程A、B、G、JおよびQ、または工程A、B、C、HおよびQ、または工程A、B、G、J、H、D、およびE、または工程A、F、I、G、C、D、およびE、または工程A、F、I、G、C、HおよびQ、または工程A、F、I、J、H、D、およびEにおける酵素を含み得る。
アクリロイル−CoAからの例示的な経路は、以下の酵素セット、図15の工程M、O、P、およびSに示すように、(C)1)アクリロイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、2)3−オキソペント−4−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、3)3−オキソペント−4−エノエートレダクターゼ、4)3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼならびに工程M、N、R、およびEに示すように、(D)、1)アクリロイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、2)3−オキソペント−4−エノイル−CoAレダクターゼ、3)3−ヒドロキシペント−4−エノイル−CoAデヒドラターゼ、ならびに4)ペント−2,4−ジエノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはデヒドラーゼを含む。当業者は、3−HP−CoAから経路(A)および(B)ならびにアクリロイル−CoAから(C)および(D)を定義する酵素セットが、図15の工程Kに示すように、可逆的酵素3−ヒドロキシプロパノイル−CoAデヒドラターゼ、ならびに図15の工程Lに示すように、3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼにより混合され得ることを認識するだろう。このように、工程Kは、アクリロイル−CoAから、工程K、M、N、R、およびEまたは工程K、M、O、PおよびSなどの2,4−ペンタジエノエート経路を提供する、2,4−ペンタジエノエートまでの列挙された経路のいずれかに加えられ得る。工程Kはまた、工程K、M、およびLにより3−HP−CoAから3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAを提供するために工程Aまで往復の代替物を使用され得る。このように、工程Aの酵素を利用する上述の経路のいずれかは、その所定の位置において工程K、M、およびLの酵素を利用できる。同じ3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoA中間体は、図15の工程KおよびAまたはMおよびLの酵素による経路によりアクリロイル−CoAから入手できる。このように、アクリロイル−CoAは、3−HP−CoAから入手可能な全ての列挙された経路を入手するために使用され得る。このように、例えば、アクリロイル−CoAから2,4−ペンタジエノエート経路は、図15に全て示すように、工程K、A、B、C、D、およびE、または工程K、A、F、I、JおよびQ、または工程K、A、B、G、J、およびQ、または工程K、A、B、G、J、H、D、およびE、または工程K、A、B、C、H、およびQ、または工程K、A、F、I、G、C、D、およびE、または工程K、A、F、I、G、C、H、Q、または工程K、A、F、I、J、H、DおよびE、または工程M、L、B、C、D、およびE、または工程M、L、F、I、JおよびQ、または工程M、L、B、G、J、およびQ、または工程M、L、B、G、J、H、D、およびE、または工程M、L、B、C、H、およびQ、または工程M、L、F、I、G、C、D、およびE、または工程M、L、F、I、G、C、H、Q、または工程M、L、F、I、J、H、DおよびEからの酵素を含み得る。同様に、3−HP−CoAは、工程Lの酵素を用いて中間体3−オキソペント−4−エノイル−CoAにより列挙されたアクリロイル−CoA経路に供給され得る。このように、3−HP−CoAから2,4−ペンタジエノエート経路は、工程A、L、N、R、およびEまたは工程A、L、O、P、およびSからの酵素を含み得、各々の経路は図15に示される。
一部の実施形態において、本発明は、2,4−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される2,4−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む2,4−ペンタジエノエート経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物を提供する。2,4−ペンタジエノエート経路は、以下から選択される酵素のセットを有する:
1)A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、B.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、C.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、D.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼ、E.ペント−2,4−ジエノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ;
2)A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、B.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、G.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、J.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、H.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、D.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼ、E.ペント−2,4−ジエノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ;
3)A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、F.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、I.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、G.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、C.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、D.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼ、E.ペント−2,4−ジエノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ;
4)A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、F.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、I.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、J.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、H.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、D.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼ、E.ペント−2,4−ジエノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ;
5)K.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAデヒドラターゼ、A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、B.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、C.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、D.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼ、E.ペント−2,4−ジエノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ;
6)K.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAデヒドラターゼ、A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、B.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、G.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、J.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、H.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、D.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼ、E.ペント−2,4−ジエノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ;
7)K.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAデヒドラターゼ、A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、F.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、I.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、G.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、C.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、D.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼ、E.ペント−2,4−ジエノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ;
8)K.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAデヒドラターゼ、A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、F.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、I.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、J.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、H.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、D.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼ、E.ペント−2,4−ジエノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ;
9)M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、B.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、C.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、D.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼ、E.ペント−2,4−ジエノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ;
10)M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、B.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、G.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、J.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、H.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、D.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼ、E.ペント−2,4−ジエノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ;
11)M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、F.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、I.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、G.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、C.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、D.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼ、E.ペント−2,4−ジエノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ;
12)M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、F.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、I.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、J.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、H.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、D.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAデヒドラターゼ、E.ペント−2,4−ジエノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ;
13)M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、N.3−オキソペント−4−エノイル−CoAレダクターゼ、R.3−ヒドロキシペント−4−エノイル−CoAデヒドラターゼ、E.ペント−2,4−ジエノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ;
14)M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、N.3−オキソペント−4−エノイル−CoAレダクターゼ、T.3−ヒドロキシペント−4−エノイル−CoAトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、S.3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ;ならびに
15)M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、O.3−オキソペント−4−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、P.3−オキソペント−4−エノエートレダクターゼ、S.3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ;
16)A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、N.3−オキソペント−4−エノイル−CoAレダクターゼ、R.3−ヒドロキシペント−4−エノイル−CoAデヒドラターゼ、E.ペント−2,4−ジエノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ;
17)A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、N.3−オキソペント−4−エノイル−CoAレダクターゼ、T.3−ヒドロキシペント−4−エノイル−CoAトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、S.3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ;ならびに
18)A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、O.3−オキソペント−4−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、P.3−オキソペント−4−エノエートレダクターゼ、S.3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ。
一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、2,4−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする2、3、4、5、6、7、または8つの外因性核酸を含む。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、異種核酸である少なくとも1つの外因性核酸を有する。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、実質的に嫌気性の培地に存在する。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物はさらに、2,4−ペンタジエノエートを1,3−ブタジエンに変換するために2,4−ペンタジエンデカルボキシラーゼを含む。
一部の実施形態において、非天然に生じる微生物は、1,3−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される1,3−ブタジエン経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む1,3−ブタジエン経路を有する微生物を含む。1,3−ブタジエン経路は、以下から選択される酵素のセットを有する:
1)M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、N.3−オキソペント−4−エノイル−CoAレダクターゼ、T.3−ヒドロキシペント−4−エノイル−CoAトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、Y.3−ヒドロキシペント−4−エノエートデカルボキシラーゼ;
2)M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、O.3−オキソペント−4−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、P.3−オキソペント−4−エノエートレダクターゼ、Y.3−ヒドロキシペント−4−エノエートデカルボキシラーゼ;
3)K.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAデヒドラターゼ、M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、N.3−オキソペント−4−エノイル−CoAレダクターゼ、T.3−ヒドロキシペント−4−エノイル−CoAトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、Y.3−ヒドロキシペント−4−エノエートデカルボキシラーゼ;
4)K.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAデヒドラターゼ、M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、O.3−オキソペント−4−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、P.3−オキソペント−4−エノエートレダクターゼ、Y.3−ヒドロキシペント−4−エノエートデカルボキシラーゼ;
5)A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、N.3−オキソペント−4−エノイル−CoAレダクターゼ、T.3−ヒドロキシペント−4−エノイル−CoAトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、Y.3−ヒドロキシペント−4−エノエートデカルボキシラーゼ;
6)A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、O.3−オキソペント−4−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、P.3−オキソペント−4−エノエートレダクターゼ、Y.3−ヒドロキシペント−4−エノエートデカルボキシラーゼ。
一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、1,3−ブタジエン経路の酵素を各々コードする2、3、4、または5つの外因性核酸を含む。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、異種核酸である少なくとも1つの外因性核酸を含む。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は実質的に嫌気性培地に存在する。
一部の実施形態において、本発明は、3−ブテン−1−オールを生産するのに十分な量で発現される3−ブテン−1−オール経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む1,3−ブタジエン経路を有する微生物を含む非天然に生じる微生物を提供する。3−ブテン−1−オール経路は、以下から選択される酵素のセットを有する:
1)A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、F.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、I.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、U.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;
2)A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、F.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、I.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、J.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、V.5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;
3)A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、B.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、G.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、U.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;
4)A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、B.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、G.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、J.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、V.5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;
5)A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、B.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、C.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、H.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、V.5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;
6)M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、F.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、I.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、U.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;
7)M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、F.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、I.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、J.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、V.5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;
8)M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、B.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、G.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、U.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;
9)M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、B.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、G.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、J.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、V.5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;
10)M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、B.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、C.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、H.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、V.5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;
11)K.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAデヒドラターゼ、A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、F.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、I.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、U.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;
12)K.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAデヒドラターゼ、A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、F.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、I.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、J.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、V.5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;
13)K.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAデヒドラターゼ、A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、B.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、G.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、U.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;
14)K.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAデヒドラターゼ、A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、B.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、G.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、J.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、V.5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;
15)K.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAデヒドラターゼ、A.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、B.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、C.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、H.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、V.5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;
16)K.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAデヒドラターゼ、M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、F.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、I.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、U.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;
17)K.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAデヒドラターゼ、M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、F.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、I.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、J.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、V.5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;
18)K.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAデヒドラターゼ、M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、B.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、G.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、U.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;
19)K.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAデヒドラターゼ、M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、B.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、G.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、J.3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、V.5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;
20)K.3−ヒドロキシプロパノイル−CoAデヒドラターゼ、M.アクリリル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、L.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、B.3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、C.3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、H.5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、V.5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ。
一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、3−ブテン−1−オール経路の酵素を各々コードする2、3、4、5、6または7つの外因性核酸を含む。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、異種核酸である少なくとも1つの外因性核酸を有する。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、実質的に嫌気性培地に存在する。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物はさらに、3−ブテン−1−オールを1,3−ブタジエンに変換するための3−ブテン−1−オールデヒドラターゼを含む。
一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、2,4−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする2つの外因性核酸を含み得る。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、2,4−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする3つの外因性核酸を含み得る。例えば、本発明の非天然に生じる微生物は、i)AKPデアミナーゼ、ii)アセチルアクリレートレダクターゼ、およびiii)4−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼをコードする3つの外因性核酸を含み得るので、AKPを介する2,4−ペンタジエノエートへのアラニンまたはオルニチンが利用可能な経路を提供する。当業者は、これは単に例示的であり、3つの外因性核酸は、図12〜15の列挙した経路のいずれかにおいて任意の2,4−ペンタジエノエートを生産する非天然に生じる生物に基づき得ることを認識するだろう。
一部の実施形態において、本発明の微生物の非天然に生じる微生物は、2,4−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする任意の4つの外因性核酸を含み得る。例えば、非天然に生じる微生物は、i)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートアルドラーゼ、ii)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートデヒドラーゼ、iii)2−オキソペンタノエートレダクターゼ、およびiv)2−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼをコードする4つの外因性核酸を含み得るので、図12に示すように、ピルベートから2,4−ペンタジエノエートまでの完全な経路を定義する。当業者は、これは単に例示であり、4つの外因性核酸は、図12〜15の列挙した経路のいずれかにおいて任意の2,4−ペンタジエノエートを生産する非天然に生じる生物に基づき得ることを認識するだろう。
なおさらなる実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、2,4−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする5つの外因性核酸を含み得る。5つの外因性核酸を有する本発明の例示的な非天然に生じる微生物は、図13の工程E、H、F、C、およびDに示すように、(A)i)AKPアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、ii)2,4−ジオキソペンタノエート−2−レダクターゼ、iii)2−ヒドロキシ−4−オキソペンタノエートデヒドラターゼ、iv)アセトアクリレートレダクターゼ、ならびにv)4−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ、あるいは(B)図12の工程B、C、およびDと共に、図13の工程EおよびKに示すように、i)AKPアミノトランスフェラーゼおよび/もしくはデヒドロゲナーゼ、ii)2,4−ジオキソペンタノエート−4−レダクターゼ、iii)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートデヒドラターゼ、iv)2−オキソペンテノエートレダクターゼ、ならびにv)2−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼ、または図12の工程B、C、およびDと共に、図13の工程JおよびLに示すように、i)AKPレダクターゼ、ii)2−アミノ−4−ヒドロキシペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび/もしくはデヒドロゲナーゼ、iii)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートデヒドラターゼ、iv)2−オキソペンタノエートレダクターゼ、ならびにv)2−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼをコードする酵素を含み得る。当業者は、これは単に例示であり、5つの外因性核酸は、図12〜15の列挙された経路のいずれかにおいて任意の2,4−ペンタジエノエートを生産する非天然に生じる生物に基づき得ることを認識するだろう。このように、一部の実施形態において、2,4−ペンタジエノエート経路における2、3、4、5、6以下の全ての酵素は外因性核酸の挿入を提供できる。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、異種核酸である少なくとも1つの外因性核酸を有する。さらに、一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、実質的に嫌気性培地中で提供され得る。
一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物はさらに、2,4−ペンタジエノエートの1,3−ブタジエンへの変換により1,3−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼを含み得る。このように、図12の任意の2,4−ペンタジエノエート経路は、図4におけるcisまたはtrans2,4−ペンタジエノエートの1,3−ブタジエンへの変換により示されるように、1,3−ブタジエンのさらなる生産に基づいて形成できる。
一部の実施形態において、本発明は、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物を提供し、ここで、その非天然に生じる微生物は、基質を生産物に変換する酵素またはタンパク質をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む。例えば、トルエン経路(図1)において、そのような基質から生産物は、フェニルアラニンからフェニルピルベート、フェニルピルベートからフェニルアセトアルデヒド、フェニルピルベートからフェニルアセテート、フェニルアセトアルデヒドからフェニルアセテート、フェニルアセトアルデヒドからトルエン、およびフェニルアセテートからトルエンからなる群から選択される。スチレン経路(図3)において、そのような基質から生産物は、ベンゾイル−CoAから3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoA、3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAから[(3−オキソ−3−フェニルプロピオニル)オキシ]ホスホネート、[(3−オキソ−3−フェニルプロピオニル)オキシ]ホスホネートからベンゾイル−アセテート、3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAからベンゾイル−アセテート、ベンゾイル−アセテートからアセトフェノン、アセトフェノンから1−フェニルエタノール、および1−フェニルエタノールからスチレンからなる群から選択される。1,3−ブタジエン経路(図4)において、そのような基質から生産物は、trans,trans−ムコネートからtrans−2,4−ペンタジエノエート、cis,transムコネートからtrans−2,4−ペンタジエノエート、cis,trans−ムコネートからcis−2,4−ペンタジエノエート、cis,cis−ムコネートからcis−2,4−ペンタジエノエート、trans−2,4−ペンタジエノエートから1,3−ブタジエン、およびcis−2,4−ペンタジエノエートから1,3−ブタジエンから選択される。当業者は、これらは単に例示であり、所望の生産物を生産するのに好適である本明細書に開示される基質−生産物対およびそれに関して基質から生産物の変換に利用可能である適切な活性のいずれかは、本明細書の教示に基づいて当業者により容易に決定できることを理解するだろう。
2,4−ペンタジエノエート経路において、そのような基質から生産物は、ピルベートから4−ヒドロキシ−2−オキソバレレート、4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートから2−オキソペンテノエート、2−オキソペンテノエートから2−ヒドロキシペンテノエート、2−ヒドロキシペンテノエートから2,4−ペンタジエノエート、AKPからアセチルアクリレート、アセチルアクリレートから4−ヒドロキシペント−2−エノエート、4−ヒドロキシペント−2−エノエートから2,4−ペンタジエノエート、AKPから2,4−ジオキソペンタノエート、2,4−ジオキソペンタノエートから4−ヒドロキシ−2−オキソバレレート、AKPから2−アミノ−4−ヒドロキシペンタノエート、2−アミノ−4−ヒドロキシペンタノエートから4−ヒドロキシ−2−オキソバレレート、オルニチンから2,4−ジアミノペンタノエート、2,4−ジアミノペンタノエートからAKP、アラニンからAKPなどから選択される。
本発明はまた、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネートを生産するのに十分な量で発現される(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物を提供し、その(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路は2−C−メチル−D−エリトリトール−4−ホスフェートデヒドラターゼを含む(実施例IIIおよび図5、工程Cを参照のこと)。(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路を含む非天然に生じる微生物はさらに、1−デオキシキシルロース−5−ホスフェートシンターゼまたは1−デオキシ−D−キシルロース−5−ホスフェートレダクトイソメラーゼ(実施例IIIおよび図5、工程AおよびBを参照のこと)を含み得る。このように、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネートは、52−C−メチル−D−エリトリトール−4−ホスフェートデヒドラターゼ、1−デオキシキシルロース−5−ホスフェートシンターゼおよび1−デオキシ−D−キシルロース−5−ホスフェートレダクトイソメラーゼを含み得る。
本発明はまた、p−トルエートを生産するのに十分な量で発現されるp−トルエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含むp−トルエート経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物を提供し、そのp−トルエート経路は、2−デヒドロ−3−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ;3−デヒドロキネートシンターゼ;3−デヒドロキネートデヒドラターゼ;シキメートデヒドロゲナーゼ;シキメートキナーゼ;3−ホスホシキメート−2−カルボキシビニルトランスフェラーゼ;コリスメートシンターゼ;またはコリスメートリアーゼを含む(実施例IVおよび図6、工程A〜Hを参照のこと)。p−トルエート経路を有する非天然に生じる微生物はさらに、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路を含み得る(図5)。(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路は、例えば、2−C−メチル−D−エリトリトール−4−ホスフェートデヒドラターゼ、1−デオキシキシルロース−5−ホスフェートシンターゼまたは1−デオキシ−D−キシルロース−5−ホスフェートレダクトイソメラーゼを含み得る(図5)。
本発明はさらに、テレフタレートを生産するのに十分な量で発現されるテレフタレート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含むテレフタレート経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物を提供し、そのテレフタレート経路は、p−トルエートメチル−モノオキシゲナーゼレダクターゼ;4−カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ;または4−カルボキシベンジルアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む(実施例Vおよび図7を参照のこと)。テレフタレート経路を含むこのような生物はさらに、p−トルエート経路を含み得、ここで、そのp−トルエート経路は、2−デヒドロ−3−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ;3−デヒドロキネートシンターゼ;3−デヒドロキネートデヒドラターゼ;シキメートデヒドロゲナーゼ;シキメートキナーゼ;3−ホスホシキメート−2−カルボキシビニルトランスフェラーゼ;コリスメートシンターゼ;またはコリスメートリアーゼを含む(実施例IVおよびVならびに図6および7を参照のこと)。テレフタレート経路およびp−トルエート経路を有するこのような非天然に生じる微生物はさらに、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路を含み得る(実施例IIIおよび図5を参照のこと)。(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路は、例えば、2−C−メチル−D−エリトリトール−4−ホスフェートデヒドラターゼ、1−デオキシキシルロース−5−ホスフェートシンターゼまたは1−デオキシ−D−キシルロース−5−ホスフェートレダクトイソメラーゼを含み得る(実施例IIIおよび図5を参照のこと)。
一部の実施形態において、本発明は、トルエンを生産するのに十分な量で発現されるトルエン経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含むトルエン経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。トルエン経路は、a)p−トルエートデカルボキシラーゼ;b)p−トルエートレダクターゼおよびp−メチルベンズアルデヒドデカルボキシラーゼ;c)p−トルエートキナーゼ、(p−メチルベンゾイルオキシ)ホスホネートレダクターゼ、およびp−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ;d)(p−メチルベンゾイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ)、ホスホトランス−p−メチルベンゾイラーゼ(methylbenzoylase)、(p−メチルベンゾイルオキシ)ホスホネートレダクターゼ、ならびにp−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ;ならびにe)(p−メチルベンゾイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ)、p−メチルベンゾイル−CoAレダクターゼおよびp−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼから選択される経路の酵素のセットから選択される。
一部の実施形態において、本発明は、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネートを生産するのに十分な量で発現される(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路は、エリトロース−4−ホスフェートデヒドラターゼおよび(2,4−ジオキソブトキシ)ホスホネートレダクターゼを含む。
一部の実施形態において、本発明は、ベンゾエートを生産するのに十分な量で発現されるベンゾエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含むベンゾエート経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。ベンゾエート経路は、2−デヒドロ−3−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ;3−デヒドロキネートシンターゼ;3−デヒドロキネートデヒドラターゼ;シキメートデヒドロゲナーゼ;シキメートキナーゼ;3−ホスホシキメート−2−カルボキシビニルトランスフェラーゼ;コリスメートシンターゼ;およびコリスメートリアーゼを含む。
一部の実施形態において、本発明は、ベンゼンを生産するのに十分な量で発現されるベンゼン経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含むベンゼン経路を有する非天然に生じる微生物を提供する。ベンゼン経路は、a)ベンゾエートデカルボキシラーゼ;b)ベンゾエートレダクターゼおよびベンズアルデヒドデカルボニラーゼ;c)ベンゾエートキナーゼ、(ベンゾイルオキシ)ホスホネートレダクターゼ、およびベンズアルデヒドデカルボニラーゼ;d)(ベンゾイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ)、ホスホトランスベンゾイラーゼ(phosphotransbenzoylase)、(ベンゾイルオキシ)ホスホネートレダクターゼ、およびベンズアルデヒドデカルボニラーゼ;ならびにe)(ベンゾイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ)、ベンゾイル−CoAレダクターゼおよびベンズアルデヒドデカルボニラーゼから選択される経路の酵素のセットから選択される。
さらなる実施形態において、本発明は、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、p−トルエート、テレフタレート、トルエン、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、またはベンゼン経路を有する非天然に生じる微生物を提供し、ここで、その非天然に生じる微生物は、基質から生産物に変換する酵素またはタンパク質をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む。例えば、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路において、基質および生産物は、グリセルアルデヒド−3−ホスフェートおよびピルベートから1−デオキシ−D−キシルロース−5−ホスフェート;1−デオキシ−D−キシルロース−5−ホスフェートからC−メチル−D−エリトリトール−4−ホスフェート;ならびにC−メチル−D−エリトリトール−4−ホスフェートから(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネートからなる群から選択され得る(実施例IIIおよび図5を参照のこと)。別の実施形態において、p−トルエート経路は、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネートから2,4−ジヒドロキシ−5−メチル−6−[(ホスホノオキシ)メチル]オキサン−2−カルボキシレート;2,4−ジヒドロキシ−5−メチル−6−[(ホスホノオキシ)メチル]オキサン−2−カルボキシレートから1,3−ジヒドロキシ−4−メチル−5−オキソシクロヘキサン−1−カルボキシレート;1,3−ジヒドロキシ−4−メチル−5−オキソシクロヘキサン−1−カルボキシレートから5−ヒドロキシ−4−メチル−3−オキソシクロヘキサ−1−エン−1−カルボン酸;5−ヒドロキシ−4−メチル−3−オキソシクロヘキサ−1−エン−1−カルボン酸から3,5−ジヒドロキシ−4−メチルシクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート;3,5−ジヒドロキシ−4−メチルシクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレートから5−ヒドロキシ−4−メチル−3−(ホスホノオキシ)シクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート;5−ヒドロキシ−4−メチル−3−(ホスホノオキシ)シクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレートから5−[(1−カルボキシエト−1−エン−1−イル)オキシ]−4−メチル−3−(ホスホノオキシ)シクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート;5−[(1−カルボキシエト−1−エン−1−イル)オキシ]−4−メチル−3−(ホスホノオキシ)シクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレートから3−[(1−カルボキシエト−1−エン−1−イル)オキシ]−4−メチルシクロヘキサ−1,5−ジエン−1−カルボキシレート;および3−[(1−カルボキシエト−1−エン−1−イル)オキシ]−4−メチルシクロヘキサ−1,5−ジエン−1−カルボキシレートからp−トルエートから選択される基質および生産物を含み得る(実施例IVおよび図6を参照のこと)。なおさらに別の実施形態において、テレフタレート経路は、p−トルエートから4−カルボキシベンジルアルコール;4−カルボキシベンジルアルコールから4−カルボキシベンズアルデヒド;および4−カルボキシベンズアルデヒドからテレフタル酸から選択される基質および生産物を含み得る(実施例Vおよび図7を参照のこと)。別の実施形態において、トルエン経路は、p−トルエートからトルエン;p−トルエートからp−メチルベンゾイル−CoA;p−メチルベンゾイル−CoAからp−メチルベンゾイルオキシホスフェートからp−メチルベンズアルデヒド;p−メチルベンゾイルオキシホスホネートからp−メチルベンズアルデヒド;およびp−メチルベンズアルデヒドからトルエンから選択される置換および生産物を含み得る(実施例VIIおよび図11を参照のこと)。別の実施形態において、2H4OP経路は、エリトロース−4−ホスフェートから(2,4−ジオキソブトキシ)ホスホネート;および(2,4−ジオキソブトキシ)ホスホネートから2H4OPから選択される置換および生産物を含み得る(実施例VIおよび図8を参照のこと)。別の実施形態において、ベンゾエート経路は、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネートから2,4−ジヒドロキシ−6−[(ホスホノオキシ)メチル]オキサン−2−カルボキシレート;2,4−ジヒドロキシ−6−[(ホスホノオキシ)メチル]オキサン−2−カルボキシレートから1,3−ジヒドロキシ−5−オキソシクロヘキサン−1−カルボキシレート;1,3−ジヒドロキシ−5−オキソシクロヘキサン−1−カルボキシレートから5−ヒドロキシ−3−オキソシクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート;5−ヒドロキシ−3−オキソシクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレートから3,5−ジヒドロキシシクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート、3,5−ジヒドロキシシクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレートから5−ヒドロキシ−3−(ホスホノオキシ)シクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート;5−ヒドロキシ−3−(ホスホノオキシ)シクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレートから5−[(1−カルボキシエト−1−エン−1−イル)オキシ]−3−(ホスホノオキシ)シクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート;5−[(1−カルボキシエト−1−エン−1−イル)オキシ]−3−(ホスホノオキシ)シクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレートから3−[(1−カルボキシエト−1−エン−1−イル)オキシ]シクロヘキサ−1,5−ジエン−1−カルボキシレート;および3−[(1−カルボキシエト−1−エン−1−イル)オキシ]シクロヘキサ−1,5−ジエン−1−カルボキシレートからベンゾエートから選択される基質および生産物を含み得る(実施例VIおよび図9を参照のこと)。別の実施形態において、ベンゼン経路は、ベンゾエートからベンゼン;ベンゾエートからベンゾイル−CoA、(ベンゾイルオキシ)ホスホネートまたはベンズアルデヒド;ベンゾイル−CoAから(ベンゾイルオキシ)ホスホネートまたはベンズアルデヒド;(ベンゾイルオキシ)ホスホネートからベンズアルデヒド;およびベンズアルデヒドからベンゼンから選択される基質および生産物を含み得る。当業者は、これらは単に例示であり、所望の生産物を生産するのに好適である本明細書に開示される基質−生産物対およびそれに関して基質から生産物の変換に利用可能である適切な活性のいずれかは、本明細書の教示に基づいて当業者により容易に決定できることを理解するだろう。
本明細書に開示されるように、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路を図5に例示する(実施例IIIを参照のこと)。従って、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート生産する(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路を含む微生物に加えて、本発明はさらに、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む非天然に生じる微生物を提供し、ここで、その微生物は、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路中間体、例えば、1−デオキシ−D−キシルロース−5−ホスフェートまたはC−メチル−D−エリトルトール−4−ホスフェートを生産する。同様に、本発明はまた、p−トルエートを生産するp−トルエート経路を含む非天然に生じる微生物を提供し、ここで、その非天然に生じる微生物は、p−トルエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含み、その微生物は、p−トルエート経路中間体、例えば、2,4−ジヒドロキシ−5−メチル−6−[(ホスホノオキシ)メチル]オキサン−2−カルボキシレート、1,3−ジヒドロキシ−4−メチル−5−オキソシクロヘキサン−1−カルボキシレート、5−ヒドロキシ−4−メチル−3−オキソシクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート、3,5−ジヒドロキシ−4−メチルシクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート、5−ヒドロキシ−4−メチル−3−(ホスホノオキシ)シクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート、5−[(1−カルボキシエト−1−エン−1−イル)オキシ]−4−メチル−3−(ホスホノオキシ)シクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート、または3−[(1−カルボキシエト−1−エン−1−イル)オキシ]−4−メチルシクロヘキサ−1,5−ジエン−1−カルボキシレートを生産する。さらに、本発明は、テレフタレート経路の酵素を含む非天然に生じる微生物をさらに提供し、ここで、その微生物は、テレフタレート経路中間体、例えば、4−カルボキシベンジルアルコールまたは4−カルボキシベンズアルデヒドを生産する。
同様に、本発明はまた、トルエンを生産するトルエン経路を含む非天然に生じる微生物を提供し、ここで、その非天然に生じる微生物は、トルエン経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含み、ここで、その微生物は、トルエン経路の中間体、例えば、p−メチルベンゾイル−CoA、(p−メチルベンゾイルオキシ)ホスホネート、またはp−メチルベンズアルデヒドを生産する。
同様に、本発明はまた、ベンゼンを産生するベンゼン経路を含む非天然に生じる微生物を提供し、ここで、その非天然に生じる微生物は、ベンゼン経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含み、ここで、その微生物は、ベンゼン経路の中間体、例えば、ベンゾイル−CoA、(ベンゾイルオキシ)ホスホネート、およびベンズアルデヒドを生産する(図10)。
同様に、本発明はまた、ベンゾエートを生産するベンゾエート経路を含む非天然に生じる微生物を提供し、ここで、その非天然に生じる微生物は、ベンゾエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含み、その微生物は、ベンゾエート経路中間体、例えば、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、2,4−ジヒドロキシ−6−[(ホスホノオキシ)メチル]オキサン−2−カルボキシレート、1,3−ジヒドロキシ−5−オキソシクロヘキサン−1−カルボキシレート、5−ヒドロキシ−3−オキソシクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート、3,5−ジヒドロキシシクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート、5−ヒドロキシ−3−(ホスホノオキシ)シクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート、5−[(1−カルボキシエト−1−エン−1−イル)オキシ]−3−(ホスホノオキシ)シクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート、および3−[(1−カルボキシエト−1−エン−1−イル)オキシ]シクロヘキサ−1,5−ジエン−1−カルボキシレートを生産する(図9)。
このように、本発明は、酵素またはタンパク質をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む非天然に生じる微生物を提供し、ここで、その酵素またはタンパク質は、図1〜11に示すものなどの、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の基質および生産物を変換する。
全体的に、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路を含む微生物として本明細書に記載されているが、本発明はさらに、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の中間体を生産するのに十分な量で発現されるトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む非天然に生じる微生物を提供することが理解される。例えば、本明細書に開示されるように、トルエン、ベンゼン、スチレン、および1,3−ブタジエン経路は、図1〜23に例示される。従って、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを生産するトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路を含む微生物に加えて、本発明はさらに、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む非天然に生じる微生物を提供し、ここで、その微生物は、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の中間体、例えば、フェニルピルベート、フェニルアセトアルデヒド、フェニルアセテート、3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoA、[(3−オキソ−3−フェニルプロピオニル)オキシ]ホスホネート、ベンゾイル−アセテート、アセトフェノン、1−フェニルエタノール、DXP、2ME4P、ベンゾイル−CoA、(ベンゾイルオキシ)ホスホネート、ベンズアルデヒド、trans−2,4−ペンタジエノエート、およびcis−2,4−ペンタジエノエート、ならびに図6および9に示したいずれかのシキメート経路の中間体を生産する。
実施例に記載し、図1〜11の経路を含む、図面に例示したように、本明細書に開示される経路のいずれかは、所望の場合、任意の経路の中間体またはタンパク質を生産する非天然に生じる微生物を生成するために利用できることは理解される。本明細書に開示されるように、中間体を産生するそのような微生物は、所望のタンパク質を生産するために下流の経路の酵素を発現する別の微生物と組み合わせて使用されてもよい。しかしながら、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の中間体を生産する非天然に生じる微生物は、所望のタンパク質として中間体を生産するために利用され得ることは理解される。
本発明は、代謝反応、反応物もしくはその生産物に対する一般的参照と共に、あるいは参照する代謝反応、反応物もしくは生産物と関連するか、もしくはそれらを触媒する酵素、またはそれらに関連するタンパク質をコードする1つ以上の核酸もしくは遺伝子に対する特定の参照と共に本明細書に記載される。本明細書において他に明確に記載されない限り、当業者は、反応に対する参照はまた、その反応の反応物および生産物に対する参照を構成することも理解するだろう。同様に、本明細書において明確に記載されない限り、反応物または生産物に対する参照はまた、その反応を参照し、それらの代謝構成物質のいずれかに対する参照はまた、触媒する酵素または参照した反応、反応物もしくは生産物に関連するタンパク質をコードする遺伝子(複数も含む)を参照する。同様に、代謝生化学、酵素学およびゲノムの周知の分野を考慮して、遺伝子またはコード核酸に対する本明細書の参照はまた、対応するコードされた酵素およびそれが触媒する反応、またはその反応に関連するタンパク質ならびにその反応の反応物および生産物に対する参照を構成する。
本発明の非天然に生じる微生物は、1つ以上のトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成経路に関与する1つ以上の酵素またはタンパク質をコードする発現可能な核酸を導入することによって生産され得る。生合成のために選択される宿主微生物に応じて、特定のトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成経路の一部または全てについての核酸が発現され得る。例えば、選択された宿主が、所望の生合成経路についての1つ以上の酵素またはタンパク質において異なる場合、異なる酵素(複数も含む)またはタンパク質(複数も含む)についての発現可能な核酸が、後の外因性発現のために宿主に導入される。代替として、選択された宿主が一部の経路遺伝子の外因性発現を示すが、他が異なる場合、コード核酸が、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成を達成するために、欠失した酵素(複数も含む)またはタンパク質(複数も含む)に必要とされる。このように、本発明の非天然に生じる微生物は、所望の生合成経路を得るために、外因性酵素もしくはタンパク質活性を導入することにより生産され得るか、または所望の生合成経路は、1つ以上の外因性酵素またはタンパク質と共に、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンなどの所望のタンパク質を生産する、1つ以上の外因性酵素もしくはタンパク質活性を導入することにより得られ得る。
宿主微生物は、例えば、細菌、酵母、真菌または発光プロセスに適用可能な種々の他の微生物のいずれかから選択され得、非天然に生じる微生物は、それらにおいて生成される。例示的な細菌としては、大腸菌(Escherichia coli)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、アネロビオスピリウム・サクシニシプロデュセンス(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、アクチノバチルス・サクシノゲネス(Actinobacillus succinogens)、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス(Mannheimia succiniciproducens)、リゾビウム・エトリ(Rhizobium etli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)、グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans)、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)、乳酸連鎖球菌(Lactococcus lactis)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)、およびシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)から選択される種が挙げられる。例示的な酵母または真菌としては、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、クルイベロミセス・マルキシアナス(Kluyveromyces marxianus)、アスペルギウス・テレウス(Aspergillus terreus)、クロコウジカビ(Aspergillus niger)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、リゾプス・アリズス(Rhizopus arrhizus)、リゾブス・オリゼ(Rhizobus oryzae)から選択される種が挙げられる。大腸菌が遺伝子操作に好適な十分に特徴付けられている微生物であるため、大腸菌が特に有用な宿主生物である。他の特に有用な宿主微生物としては、サッカロマイセス・セレビシエなどの酵母が挙げられる。任意の好適な微生物宿主生物が、所望の生産物を生産するために代謝的および/または遺伝的修飾を導入するために使用され得ることが理解される。
選択された宿主微生物を構成するトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成経路に応じて、本発明の非天然に生じる微生物は、少なくとも1つの外因的に発現されたトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路をコードする核酸および1つ以上のトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成経路についての最大で全てのコード核酸を含む。例えば、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成経路は、対応するコード核酸の外因性発現を介する経路の酵素またはタンパク質を欠損した宿主において確立され得る。トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の全ての酵素またはタンパク質を欠損した宿主において、経路の全ての酵素またはタンパク質が発現され得ると理解されるが、たとえ宿主がその経路の酵素またはタンパク質の少なくとも1つを含んでいたとしても、その経路における全ての酵素またはタンパク質の外因性発現が含まれ得る。例えば、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを産生するための経路における全ての酵素またはタンパク質、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよび/またはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび/またはオキシダーゼ、フェニルピルベートオキシダーゼ、フェニルアセテートデカルボキシラーゼ、フェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼ、フェニルアラニンベンゼン−リアーゼ、ベンゾイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、アセトフェノンレダクターゼ、1−フェニルエタノールデヒドラターゼ、ホスホトランス−3−オキソ−3−フェニルプロピオニラーゼ、ベンゾイル−アセテートキナーゼ、trans,trans−ムコネートデカルボキシラーゼ、cis,trans−ムコネートcis−デカルボキシラーゼ、cis,trans−ムコネートtrans−デカルボキシラーゼ、cis,cis−ムコネートデカルボキシラーゼ、trans−2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ、ならびにcis−2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼなどの外因性発現が含まれ得る。
例えば、p−トルエート経路における全ての酵素には、2−デヒドロ−3−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ;3−デヒドロキネートシンターゼ;3−デヒドロキネートデヒドラターゼ;シキメートデヒドロゲナーゼ;シキメートキナーゼ;3−ホスホシキメート−2−カルボキシビニルトランスフェラーゼ;コリスメートシンターゼ;およびコリスメートリアーゼなどが含まれ得る。加えて、テレフタレート経路における全ての酵素には、p−トルエートメチル−モノオキシゲナーゼレダクターゼ;4−カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ;および4−カルボキシベンジルアルデヒドデヒドロゲナーゼなどが含まれ得る。さらに、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路における全ての酵素には、2−C−メチル−D−エリトリトール−4−ホスフェートデヒドラターゼ、1−デオキシキシルロース−5−ホスフェートシンターゼおよび1−デオキシ−D−キシルロース−5−ホスフェートレダクトイソメラーゼなどが含まれ得る。同様に、トルエン経路における全ての酵素には、p−メチルベンゾイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、p−トルエートレダクターゼ、p−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ、p−メチルベンゾイル−CoAレダクターゼ、p−トルエートデカルボキシラーゼ、ホスホトランス−p−メチルベンゾイラーゼ、(p−メチルベンゾイルオキシ)ホスホネートレダクターゼ(脱リン酸化)、およびp−トルエートキナーゼなどが含まれ得る。
同様に、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路における全ての酵素には、エリトロース−4−ホスフェートデヒドラターゼおよび(2,4−ジオキソブトキシ)ホスホネートレダクターゼなどが含まれ得る。
同様に、ベンゾエート経路における全ての酵素には、2−デヒドロ−3−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ、3−デヒドロキネートシンターゼ、3−デヒドロキネートデヒドラターゼ、シキメートデヒドロゲナーゼ、シキメートキナーゼ、3−ホスホシキメート−2−カルボキシビニルトランスフェラーゼ、コリスメートシンターゼ、およびコリスメートリアーゼなどが含まれ得る。
同様に、ベンゼン経路における全ての酵素には、ベンゾイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、ベンゾエートレダクターゼ、ベンズアルデヒドデカルボニラーゼ、ベンゾイル−CoAレダクターゼ、ベンゾエートデカルボキシラーゼ、ホスホトランスベンゾイラーゼ、(ベンゾイルオキシ)ホスホネートレダクターゼ(脱リン酸化)、ならびにベンゾエートキナーゼなどが含まれ得る。
本明細書に提供される教示および指針を考慮して、当業者は、発現可能な形態に導入するためのコード核酸の数は、少なくとも、選択された宿主微生物のトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の欠損に対応することを理解するだろう。従って、本発明の非天然に生じる微生物は、1、2、3、4、5、6、7、8、すなわち全てまでの、本明細書に開示されるトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成経路を構成する酵素またはタンパク質をコードする核酸を有し得る。一部の実施形態において、非天然に生じる微生物はまた、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成を促進または最適化するか、あるいは宿主微生物に他の有用な機能を与える他の遺伝的修飾を含み得る。1つのこのような他の機能性には、例えば、フェニルアラニン、フェニルピルベート、フェニルアセトアルデヒド、フェニルアセテート、ベンゾイル−CoA、3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoA、[(3−オキソ−3−フェニルプロピオニル)オキシ]ホスホネート、ベンゾイルアセテート、アセトフェノン、1−フェニルエタノール、trans,trans−ムコネート、cis,trans−ムコネート、cis,cis−ムコネート、trans−2,4−ペンタジエノエート、cis−2,4−ペンタジエノエート、4−ヒドロキシ−2−オキソバレレート、2−オキソペンテノエート、2−ヒドロキシペンテノエート、2,4−ジヒドロキシペンタノエート、4−ヒドロキシペント−2−エノエート、2,4−ジアミノペンタノエート、AKP、アセチルアクリレート、2,4−ジオキソペンタノエート、2−ヒドロキシ−4−オキソ−ペンタノエート、2−アミノ−4−ヒドロキシペンタノエート、3,5−ジアミノペンタノエート、5−アミノペント−2−エノエート、3−アミノ−5−オキソペンタノエート、5−オキソペント−2−エノエート、5−ヒドロキシペント−2−エノエート、3−アミノ−5−ヒドロキシペンタノエート、3−HP−CoA、アクリロイル−CoA、3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoA、3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノエート、3,5−ジヒドロキシペンタノエート、3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoA、5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoA、2,4−ペンタジエノイル−CoA、3−オキソペント−4−エノイル−CoA、3−ヒドロキシペント−4−エノイル−CoA、3−オキソペント−4−エノエート、および3−ヒドロキシペント−4−エノエートグリセルアルデヒド−3−ホスフェート、ピルベート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネートまたはp−トルエートなどのトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の前駆体の1つ以上の合成の増加が含まれ得る。さらに、本明細書に開示されるように、複数の経路は、所望の場合、p−トルエート(図6)、テレフタレート(図7)、トルエン(図11)および(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート(図5)、または2H4OP(図8)、ベンゾエート(図9)およびベンゼン(図10)を生産するための経路などの単一の生物に含まれ得る。
一般に、宿主微生物は、それが、所望の前駆体のデノボ生産または宿主微生物により天然に生産された前駆体の増加した生産のいずれかを提供する天然に生産された分子または遺伝子操作された生産物のいずれかとして、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の前駆体を生産するように選択される。例えば、cis,cis−ムコネートは、大腸菌などの宿主微生物中で天然に生産される。さらなる例として、グリセルアルデヒド−3−ホスフェートおよびホスホエノールピルベートが、大腸菌などの宿主微生物中で天然に産生される。宿主生物は、本明細書に開示される、前駆体の生産を増加させるように遺伝子操作され得る。加えて、所望の前駆体を生産するように遺伝子操作されている微生物は、宿主微生物として使用され得、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の酵素またはタンパク質を発現するようにさらに遺伝子操作される。
一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを合成する酵素能力を含む宿主から生成される。この特定の実施形態において、それは、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生産に対する、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の反応を誘導するために、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の生産物の合成または蓄積を増加させるのに有用であり得る。増加した合成または蓄積は、例えば、上記のトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の酵素またはタンパク質の1つ以上をコードする核酸の過剰発現により達成され得る。トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の酵素(複数も含む)および/またはタンパク質(複数も含む)の過剰発現は、例えば、内因性遺伝子(複数も含む)の外因性発現により、または異種遺伝子(複数も含む)の外因性発現により生じ得る。従って、天然に生じる生物は、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、すなわち全てまでの、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成経路の酵素またはタンパク質をコードする核酸の過剰発現により、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを生産する、本発明の非天然に生じる微生物になるように容易に生成され得る。加えて、非天然に生じる生物は、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成経路において酵素の活性の増加を生じる内因性遺伝子の突然変異により生成され得る。
特に有用な実施形態において、コード核酸の外因性発現が利用される。外因性発現は、発現および/または調節要素を、使用者により制御される所望の発現レベルを達成するための宿主および用途に特別に変更できる能力を与える。しかしながら、外因性発現はまた、負の調節エフェクターの除去または誘導可能なプロモーターもしくは他の調節要素に結合される場合、遺伝子のプロモーターの挿入などにより、他の実施形態においても利用できる。このように、天然に生じる誘導可能なプロモーターを有する内因性遺伝子は、適切な誘導剤を提供することによって上方制御され得るか、または内因性遺伝子の調節領域は、誘発可能な調節要素を導入するために遺伝子操作され得、それにより、所望の時間にて内因性遺伝子の増加した発現の調節を可能にする。同様に、誘発可能なプロモーターは、非天然に生じる微生物に導入される外因性遺伝子のための調節要素として含まれ得る。
本発明の方法において、1つ以上の外因性核酸のいずれかは、本発明の非天然に生じる微生物を生産するために微生物に導入され得ることは理解される。核酸は、例えば、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成経路を微生物に与えるように導入され得る。代替として、コード核酸が、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成能を与えるのに必要な反応の一部を触媒する生合成能を有する中間微生物を生産するために導入されてもよい。例えば、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成経路を有する非天然に生じる微生物は、トルエン経路において、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよび/またはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)およびフェニルピルベートデカルボキシラーゼ、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよび/またはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)ならびにフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび/またはオキシダーゼ、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよび/またはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)ならびにフェニルピルベートオキシダーゼ、フェニルピルベートオキシダーゼならびにフェニルアセテートデカルボキシラーゼ、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよび/またはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)ならびにフェニルアセテートデカルボキシラーゼ、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよび/またはフェニルアラニンオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)ならびにフェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼ、フェニルピルベートデカルボキシラーゼならびにフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、フェニルピルベートデカルボキシラーゼならびにフェニルアセテートデカルボキシラーゼ、フェニルピルベートデカルボキシラーゼならびにフェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼ、ならびにフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび/またはオキシダーゼならびにフェニルアセテートデカルボキシラーゼの組み合わせなどの所望の酵素またはタンパク質をコードする少なくとも2つの外因性核酸を含み得る。
同様に、スチレン経路において、少なくとも2つの外因性核酸の組み合わせは、ベンゾイル−CoAアセチルトランスフェラーゼおよび3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAシンテターゼ、ベンゾイル−CoAアセチルトランスフェラーゼおよびベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、ベンゾイル−CoAアセチルトランスフェラーゼおよびアセトフェノンレダクターゼ、ベンゾイル−CoAアセチルトランスフェラーゼおよび1−フェニルエタノールデヒドラターゼ、ベンゾイル−CoAアセチルトランスフェラーゼおよびホスホトランス−3−オキソ−3−フェニルプロピオニラーゼ、ベンゾイル−CoAアセチルトランスフェラーゼおよびベンゾイル−アセテートキナーゼ、3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAシンテターゼおよびベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAシンテターゼおよびアセトフェノンレダクターゼ、3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAシンテターゼおよび1−フェニルエタノールデヒドラターゼなどを含み得る。
同様に、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路において、発現される酵素の組み合わせは、2−C−メチル−D−エリトリトール−4−ホスフェートデヒドラターゼおよび1−デオキシキシルロース−5−ホスフェートシンターゼ、または2−C−メチル−D−エリトリトール−4−ホスフェートデヒドラターゼおよび1−デオキシ−D−キシルロース−5−ホスフェートレダクトイソメラーゼの組み合わせであり得る。p−トルエート経路において、発現される酵素の組み合わせは、2−デヒドロ−3−デオキシホスホヘプトネートシンターゼおよび3−デヒドロキネートデヒドラターゼ;シキメートキナーゼおよび3−ホスホシキメート−2−カルボキシビニルトランスフェラーゼ;シキメートキナーゼおよびシキメートデヒドロゲナーゼなどの組み合わせであり得る。同様に、テレフタレート経路において、発現される酵素の組み合わせは、p−トルエートメチル−モノオキシゲナーゼレダクターゼおよび4−カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ;または4−カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼおよび4−カルボキシベンジルアルデヒドデヒドロゲナーゼなどであり得る。このように、生合成経路の2つ以上の酵素またはタンパク質のいずれかの組み合わせは、本発明の非天然に生じる微生物に含まれ得ることが理解される。
同様に、所望の生合成経路の酵素および/またはタンパク質の組み合わせが対応する所望の生産物の生産を生じる限り、生合成経路の3つ以上の酵素またはタンパク質のいずれかの組み合わせは、本発明の非天然に生じる微生物に含まれ得ることなどが理解される。3つの酵素のそのような組み合わせには、所望の生合成経路の酵素および/またはタンパク質の組み合わせが対応する所望の生産物の生産を生じる限り、例えば、所望の場合、3−デヒドロキネートシンターゼ、シキメートデヒドロゲナーゼおよびシキメートキナーゼ;シキメートキナーゼ、コリスメートシンターゼおよびコリスメートリアーゼ;3−デヒドロキネートデヒドラターゼ、コリスメートシンターゼおよびコリスメートリアーゼなどが含まれ得る。
同様に、本明細書に開示される生合成経路の4、5、6またはそれ以上の酵素またはタンパク質のいずれかの組み合わせは、所望の生合成経路の酵素および/またはタンパク質の組み合わせが対応する所望の生産物の生産を生じる限り、所望の場合、本発明の非天然に生じる微生物に含まれ得る。
本明細書に開示される、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの生合成経路に加えて、本発明の非天然に生じる微生物および方法はまた、互いに、および他の微生物と共に種々の組み合わせで、ならびに他の経路による生産物の生合成を達成するために当該技術分野において周知の方法に利用され得る。例えば、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生産物の使用以外のトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを生産する1つの代替法は、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の中間体を、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンに変換できる別の微生物の添加による。1つのこのような生産物は、例えば、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の中間体を含む。トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の中間体は、次いで、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の中間体を、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンに変換する第2の微生物のための基質として使用され得る。トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の中間体は、第2の微生物の別の培養物に直接加えられてもよいか、あるいはトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の中間体の生産物の元の培養物は、例えば、細胞分離によりこれらの微生物から枯渇され得、次いでその後、第2の微生物の発酵ブロスの添加が、中間体の精製工程を必要とせずに最終生産物を生産するために利用され得る。
他の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物および方法は、例えば、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの生合成を達成するために広範なサブ経路に集合されてもよい。これらの実施形態において、本発明の所望の生産物のための生合成経路は、異なる微生物に分離され得、その異なる微生物は最終生産物を生産するために共培養され得る。このような生合成経路において、1つの微生物の生産物は、最終生産物が合成されるまで、第2の微生物のための基質である。例えば、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの生合成は、1つの経路の中間体を別の経路の中間体または生産物に変換するための生合成経路を含む微生物を構築することによって達成され得る。代替として、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンもまた、同じ容器内の2つの生物を用いて共培養または共発酵により微生物から生合成として生産され得、ここで、第1の微生物は、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン中間体を生産し、第2の微生物は、中間体を、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンに変換する。
本明細書に提供される教示および指針を考慮して、当業者は、広範な組み合わせおよび置換が、他の微生物と一緒に、サブ経路を有する他の非天然に生じる微生物の共培養と共に、ならびにトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを生産するための当該技術分野において周知の他の化学および/または生化学生産物の組み合わせと共に、本発明の非天然に生じる微生物および方法に対して存在することを理解するだろう。
トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の酵素またはタンパク質についてのコード核酸の起源は、例えば、コードされた遺伝子産物が、参照反応を触媒できる任意の種を含み得る。そのような種は、限定されないが、古細菌および真正細菌を含む細菌を含む、原核生物および真核生物の両方、ならびに酵母、植物、昆虫、動物、およびヒトを含む哺乳動物を含む、真核生物を含む。このような起源についての例示的な種は、例えば、大腸菌(Escherichia coli)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、枯草菌(Bacillus subtilis)、クロオコッカス種(Synechocystis species)、シロイロナズナ(Arabidopsis thaliana)、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、腸チフス菌(Salmonella typhi)、ラクトバキュラス・コリノイド(Lactobacullus collinoides)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、クロストリジウム・パステウラナム(Clostridium pasteuranum)、シトロバクター・フロインディイ(Citrobacter freundii)、クロストリジウム・ブチリクム(Clostridium butyricum)、ロゼブリア・イヌリニボランス(Roseburia inulinivorans)、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)、アパカンカビ(Neurospora crassa)、シノリゾビウム・フレディ(Sinorhizobium fredii)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、黒脚病菌(Erwinia chrysanthemi)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、ドナリエラ(Dunaliella salina)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、ニューモシスティスカリニ(Pneumocystis carinii)、ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)、バークホルデリア(Burkholderia)属、アルカリゲネス(Alcaligenes)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、シンゴモナス(Shingomonas)属およびコマモナス(Comamonas)属、例えばコマモナス・テストステローニ(Comamonas testosteroni)からの種ならびに本明細書に開示されるか、または対応する遺伝子についての起源微生物として利用可能な他の例示的な種を含む。しかしながら、395の微生物ゲノムおよび種々の酵母、真菌、植物、および哺乳動物ゲノムを含む、新規の550より多くの種(NCBIなどの公開データベースに利用可能なそれらの半分より多くを含む)に利用可能な完全なゲノム配列に関して、例えば、既知の遺伝子のホモログ、オルソログ、パラログおよび非オルソロガス遺伝子置換を含む、関連または遠い種における1つ以上の遺伝子についての必要なトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成活性をコードする遺伝子の識別、ならびに遺伝子変化の交換は、当該技術分野において慣用的であり、周知である。従って、大腸菌などの特定に微生物に対する参照と共に本明細書に記載されるトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの生合成を可能にする代謝変化は、原核生物および真核生物などを含む、他の微生物に容易に適用できる。本明細書に提供される教示および指針を考慮して、当業者は、1つの微生物に例示される代謝変化が、他の微生物に等しく提供¥され得ることを知るだろう。
一部の例において、代替のトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成経路が、非関連種に存在する場合のように、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成は、例えば、参照反応を置換するために、同様のまだ識別されていない代謝反応を触媒する非関連種由来のパラログ(複数も含む)の外因性発現により宿主種に与えられ得る。代謝ネットワーク間の特定の相違が異なる生物の間に存在するため、当業者は、異なる微生物間の実際の遺伝子の使用が異なり得ることを理解するだろう。しかしながら、本明細書に提供される教示および指針を考慮して、当業者はまた、本発明の教示および方法が、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを合成する対象の種において微生物を構築するために本明細書に例示されるものに対する同族の代謝変化を用いて全ての微生物に適用され得ることを理解するだろう。
非天然に生じるトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを生産する宿主の発現レベルを構築し、試験するための方法は、例えば、当該技術分野において周知の組換えおよび検出方法により実施され得る。このような方法は、例えば、Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001);ならびにAusubelら,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)に記載され、見出され得る。
トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを生産するための経路に関連する外因性核酸配列は、限定されないが、共役、エレクトロポレーション、化学変換、形質導入、トランスフェクション、および超音波形質転換を含む、当該技術分野において周知の技術を用いて宿主細胞内に安定または一時的に導入され得る。大腸菌または他の原核細胞における外因性発現に関して、真核生物の核酸の遺伝子またはcDNAにおける一部の核酸配列は、所望の場合、原核生物宿主細胞への形質転換前に除去され得る、N末端ミトコンドリアなどの標的シグナルまたは他の標的シグナルをコードできる。例えば、removal of a mitochondrial leader sequence led to increased expression in E.coli(Hoffmeisterら,J.Biol.Chem.280:4329−4338 (2005))。酵母または他の真核細胞における外因性発現に関して、遺伝子は、リーダー配列を添加せずにサイトゾルにおいて発現され得るか、またはミトコンドリアもしくは他の細胞小器官に対して標的化され得るか、または宿主細胞に好適なミトコンドリア標的もしくは分泌シグナルなどの適切な標的配列を付加することによって分泌のために標的化され得る。このように、標的配列を除去または含むための核酸配列に対する適切な修飾は、所望の特性を与えるために外因性核酸配列内に導入され得ることは理解される。さらに、遺伝子は、タンパク質の最適化した発現を達成するために当該技術分野において周知の技術を用いてコドン最適化に供され得る。
発現ベクター(複数も含む)は、宿主生物における制御配列機能を発現するように作動可能に連結される本明細書に例示される核酸をコードする1つ以上のトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成経路を含むように構築され得る。本発明の微生物宿主生物の使用に適用可能な発現ベクターには、例えば、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソームならびに宿主染色体への安定な融合に作動可能なベクターおよび選択配列またはマーカーを含む人工染色体が含まれる。加えて、発現ベクターは、1つ以上の選択可能なマーカー遺伝子および適切な発現制御配列を含み得る。選択可能なマーカー遺伝子はまた、例えば、抗生物質または毒素に対する耐性の提供、補足的栄養要求性欠損、あるいは培地中に存在しない重要な栄養素の供給を含み得る。発現制御配列は、当該技術分野において周知の構成的および誘導的プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含み得る。2つ以上の外因性コード核酸が共発現される場合、両方の核酸は、例えば、単一の発現ベクターまたは別個の発現ベクターに挿入されてもよい。単一の発現ベクターに関して、コード核酸は、1つの共通発現制御配列に作動可能に連結され得るか、または1つの誘導的プロモーターおよび1つの構成的プロモーターなどの異なる発現制御配列に連結され得る。代謝または合成経路に関連する外因性核酸配列の形質転換は、当該技術分野において周知の方法を用いて確認され得る。このような方法には、例えば、ノーザンブロットもしくはmRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、または遺伝子産物を発現するための免疫ブロット法、または誘導的核酸配列もしくはその対応する遺伝子産物の発現を試験するための他の好適な分析法などの核酸分析が含まれる。外因性核酸が、所望の生産物を生産するのに十分な量で発現されることは当業者により理解され、さらに、発現レベルは、当該技術分野において周知および本明細書に開示される方法を用いて十分な発現を得るように最適化され得ることは理解される。
一部の実施形態において、本発明は、トルエン経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、トルエンを生産する方法を提供する。トルエン経路は、トルエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、トルエンを生産するのに十分な量で発現されるトルエン経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む。トルエン経路は、図1に示した代替の経路に示されるように、(A)1)フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)の1つまたは両方、2)フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、ならびに3)フェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼ;(B)1)フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、2)フェニルピルベートデカルボキシラーゼの1つ以上、3)フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびフェニルアセトアルデヒドオキシダーゼの1つ以上、ならびに4)フェニルアセテートデカルボキシラーゼ;ならびに(C)1)フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)の1つ以上、2)フェニルピルベートオキシダーゼ、ならびに3)フェニルアセテートデカルボキシラーゼから選択され得る。一部の実施形態において、この方法は、実質的に嫌気性培地に存在する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む。
一部の実施形態において、トルエンを生産する本発明の方法は、トルエン経路の酵素を各々コードする2つの外因性核酸、トルエン経路の酵素を各々コードする3つの外因性核酸、トルエン経路の酵素を各々コードする4つの外因性核酸、トルエン経路の酵素を各々コードする5つの外因性核酸などを含む、非天然に生じる微生物を培養する工程を含む。4つの外因性核酸を有する例示的な生物は、1)フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ、2)フェニルアラニンオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、3)フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、および4)フェニルアセトアルデヒドデカルボニラーゼをコードできる。5つの外因性核酸を有する例示的な生物は、1)フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ、2)フェニルアラニンオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、3)フェニルピルベートデカルボキシラーゼ、4)フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび/またはオキシダーゼ、ならびに5)フェニルアセテートデカルボキシラーゼをコードできる。一部の実施形態において、トルエンを生産する本発明の方法は、異種核酸である少なくとも1つの外因性核酸を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含み得る。
一部の実施形態において、本発明は、ベンゼン経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含むベンゼンを生産する方法を提供する。ベンゼン経路は、ベンゼンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、ベンゼンを生産するのに十分な量で発現されるベンゼン経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含み得る。ベンゼン経路は、図2に示すように、フェニルアラニンベンゼン−リアーゼを含み得る。一部の実施形態において、少なくとも1つの外因性核酸はフェニルアラニンベンゼン−リアーゼ自体であり、一方、代替の実施形態において、少なくとも1つの外因性核酸は前駆体の代謝産物フェニルアラニンの生産に影響を及ぼし得る。一部の実施形態において、ベンゼン経路の少なくとも1つの外因性核酸は異種核酸である。一部の実施形態において、ベンゼンを生産する本発明の方法は、実質的に嫌気性培地に存在する非天然に生じる微生物を培養する工程を含み得る。
一部の実施形態において、本発明は、スチレン経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含むスチレンを生産する方法を提供する。スチレン経路は、スチレンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、スチレンを生産するのに十分な量で発現されるスチレン経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含み得る。スチレン経路は、図3における代替経路に示すように、(A)1)ベンゾイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、2)3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼ、およびヒドロラーゼの1つ以上、3)ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、4)アセトフェノンレダクターゼ、ならびに5)1−フェニルエタノールデヒドラターゼ;ならびに(B)1)ベンゾイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、2)ホスホトランス−3−オキソ−3−フェニルプロピオニラーゼ、3)ベンゾイル−アセテートキナーゼ、4)ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、5)アセトフェノンレダクターゼ、ならびに6)1−フェニルエタノールデヒドラターゼから選択され得る。一部の実施形態において、スチレンを生産する本発明の方法は、実質的に嫌気性培地に存在する非天然に生じる微生物を培養する工程を含み得る。
一部の実施形態において、スチレンを生産する本発明の方法は、スチレン経路の酵素を各々コードする2つの外因性核酸、スチレン経路の酵素を各々コードする3つの外因性核酸、スチレン経路の酵素を各々コードする4つの外因性核酸、スチレン経路の酵素を各々コードする5つの外因性核酸、スチレン経路の酵素を各々コードする6つの外因性核酸などを含む、非天然に生じる微生物を培養する工程を含む。5つの外因性核酸を有する例示的な生物は、1)ベンジル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、2)3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼ、およびヒドロラーゼの1つ、3)ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、4)アセトフェノンレダクターゼ、ならびに5)1−フェニルエタノールデヒドラターゼをコードできる。6つの外因性核酸を有する例示的な生物は、1)ベンゾイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、2)ホスホトランス−3−オキソ−3−フェニルプロピオニラーゼ、3)ベンゾイル−アセテートキナーゼ、4)ベンゾイル−アセテートデカルボキシラーゼ、5)アセトフェノンレダクターゼ、および6)1−フェニルエタノールデヒドラターゼをコードする。一部の実施形態において、スチレンを生産する本発明の方法は、少なくとも1つの外因性核酸が異種核酸である、非天然に生じる微生物を培養する工程を含み得る。
一部の実施形態において、本発明は、1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む1,3−ブタジエンを生産する方法を提供する。1,3−ブタジエン経路は、1,3−ブタジエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、1,3−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される1,3−ブタジエンの経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む。1,3−ブタジエン経路は、図4における代替の経路により示されるように、(A)1)trans,trans−ムコネートデカルボキシラーゼおよび2)trans−2,4−ペンタジエンデカルボキシラーゼ;(B)1)cis,trans−ムコネートcis−デカルボキシラーゼおよび2)trans−2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ;(C)1)cis,trans−ムコネートtrans−デカルボキシラーゼ2)cis−2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ;ならびに(D)1)cis,cis−ムコネートデカルボキシラーゼおよび2)cis−2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼから選択され得る。一部の実施形態において、1,3−ブタジエンを生産する方法は、実質的に嫌気性培地に存在する非天然に生じる微生物を培養する工程を含みできる。
一部の実施形態において、本発明の方法は、1,3−ブタジエン経路の酵素を各々コードする2つの外因性核酸を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含み得る。2つの外因性核酸を有する例示的な微生物は、(A)1)trans,trans−ムコネートデカルボキシラーゼおよび2)trans−2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ;(B)1)cis,trans−ムコネートcis−デカルボキシラーゼおよび2)trans−2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ;(C)1)cis,trans−ムコネートtrans−デカルボキシラーゼ2)cis−2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ;ならびに(D)1)cis,cis−ムコネートデカルボキシラーゼおよび2)cis−2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼから選択される酵素のセットをコードする遺伝子を含み得る。一部の実施形態において、本発明の方法は、異種核酸である少なくとも1つの外因性核酸を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含み得る。
本発明はさらに、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネートを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路を含む非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネートを生産する方法を提供する。このような微生物は、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネートを生産するのに十分な量で発現される(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路を有し得、その(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路は、2−C−メチル−D−エリトリトール−4−ホスフェートデヒドラターゼを含む(実施例IIIおよび図5、工程Cを参照のこと)。(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路は、必要に応じて、1−デオキシキシルロース−5−ホスフェートシンターゼおよび/または1−デオキシ−D−キシルロース−5−ホスフェートレダクトイソメラーゼをさらに含み得る(実施例IIIならびに図5、工程AおよびBを参照のこと)。
別の実施形態において、本発明は、p−トルエートを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、p−トルエート経路を含む非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、p−トルエートを生産する方法を提供する。p−トルエート経路は、p−トルエートを生産するのに十分な量で発現されるp−トルエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含み得、p−トルエート経路は、2−デヒドロ−3−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ;3−デヒドロキネートシンターゼ:3−デヒドロキネートデヒドラターゼ;シキメートデヒドロゲナーゼ;シキメートキナーゼ;3−ホスホシキメート−2−カルボキシビニルトランスフェラーゼ;コリスメートシンターゼ;および/またはコリスメートリアーゼを含む(実施例IVおよび図6、工程A〜Hを参照のこと)。別の実施形態において、本発明の方法は、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路をさらに含む非天然に生じる微生物を利用できる(実施例IIIおよび図5を参照のこと)。このような(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路は、2−C−メチル−D−エリトリトール−4−ホスフェートデヒドラターゼ、1−デオキシキシルロース−5−ホスフェートシンターゼおよび/または1−デオキシ−D−キシルロース−5−ホスフェートレダクトイソメラーゼを含み得る(実施例IIIおよび図5を参照のこと)。
本発明はさらに、テレフタレートを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、テレフタレート経路を含む非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、テレフタレートを生産する方法を提供する。このようなテレフタレート経路は、テレフタレートを生産するのに十分な量で発現されるテレフタレート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含み得、そのテレフタレート経路は、p−トルエートメチル−モノオキシゲナーゼレダクターゼ;4−カルボキシルベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ;および/または4−カルボキシルベンジルアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む。このような微生物はさらにp−トルエート経路を含み得、そのp−トルエート経路は、2−デヒドロ−3−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ;3−デヒドロキネートシンターゼ;3−デヒドロキネートデヒドラターゼ;シキメートデヒドロゲナーゼ;シキメートキナーゼ;3−ホスホシキメート−2−カルボキシビニルトランスフェラーゼ;コリスメートシンターゼ;および/またはコリスメートリアーゼを含む(実施例IVおよびVならびに図6および7を参照のこと)。別の実施形態において、非天然に生じる微生物はさらに、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路を含み得る(実施例IIIおよび図5を参照のこと)。一部の実施形態において、本発明は、トルエンを生産するのに十分な量で発現されるトルエン経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含むトルエン経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、トルエンを生産する方法を提供する。トルエン経路は、a)p−トルエートデカルボキシラーゼ;b)p−トルエートレダクターゼおよびp−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ;c)p−トルエートキナーゼ、(p−メチルベンゾイルオキシ)ホスホネートレダクターゼ、およびp−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ;d)(p−メチルベンゾイル−CoAシンターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ)、ホスホトランス−p−メチルベンゾイラーゼ、(p−メチルベンゾイルオキシ)ホスホネートレダクターゼ、およびp−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼ;ならびにe)(p−メチルベンゾイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ)、p−メチルベンゾイル−CoAレダクターゼおよびp−メチルベンズアルデヒドデカルボニラーゼから選択される経路の酵素のセットから選択され得る。非天然に生じる微生物は、トルエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、培養され得る。特定の実施形態において、本発明は、非天然に生じる微生物および使用方法を提供し、その微生物は、p−トルエート、テレフタレートまたはトルエン、および(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路を含む。
一部の実施形態において、本発明は、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネートを生産するのに十分な量で発現される(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネートを生産する方法を提供する。(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路は、エリトロース−4−ホスフェートデヒドラターゼおよび(2,4−ジオキソブトキシ)ホスホネートレダクターゼを含み得る。
一部の実施形態において、本発明は、ベンゾエートを生産するのに十分な量で発現されるベンゾエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含むベンゾエート経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、ベンゾエートを生産する方法を提供する。ベンゾエート経路は、2−デヒドロ−3−デオキシホスホヘプトネートシンターゼ;3−デヒドロキネートシンターゼ;3−デヒドロキネートデヒドラターゼ;シキメートデヒドロゲナーゼ;シキメートキナーゼ;3−ホスホシキメート−2−カルボキシビニルトランスフェラーゼシンターゼ;およびコリスメートリアーゼを含む。その方法は、ベンゼンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、非天然に生じる微生物を培養する工程を含む。
一部の実施形態において、本発明は、ベンゼンを生産するのに十分な量で発現されるベンゼン経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含むベンゼン経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含むベンゼンを生産する方法を提供する。ベンゼン経路は、a)ベンゾエートデカルボキシラーゼ;b)ベンゾエートレダクターゼおよびベンズアルデヒドデカルボニラーゼ;c)ベンゾエートキナーゼ、(ベンゾイルオキシ)ホスホネートレダクターゼ、およびベンズアルデヒドデカルボニラーゼ;d)(ベンゾイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ)、ホスホトランスベンゾイラーゼ、(ベンゾイルオキシ)ホスホネートレダクターゼ、およびベンズアルデヒドデカルボニラーゼ;ならびにe)(ベンゾイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ)、ベンゾイル−CoAレダクターゼおよびベンズアルデヒドデカルボニラーゼから選択される経路の酵素のセットから選択される。非天然に生じる微生物は、ベンゼンを生産するための条件下で、かつ、十分な時間、培養され得る。特定の実施形態において、本発明は、非天然に生じる微生物および使用方法を提供し、その微生物は(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、およびベンゼン経路を有する。
一部の実施形態において、本発明は、2,4−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、2,4−ペンタジエノエートを生産する方法を提供する。その経路は、2,4−ペンタジエノエートを生産するための条件下で、かつ、十分な時間、2,4−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される2,4−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む。2,4−ペンタジエノエート経路は、A)i)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートアルドラーゼ、ii)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートデヒドラターゼ、iii)2−オキソペンテノエートレダクターゼ、およびiv)2−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼ;B)i)AKPデアミナーゼ、ii)アセチルアクリレートレダクターゼ、およびiii)4−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;C)i)AKPアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、ii)2,4−ジオキソペンタノエート−2−レダクターゼ、iii)2−ヒドロキシ−4−オキソペンタノエートデヒドラターゼ、iv)アセチルアクリレートレダクターゼ、およびv)4−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;D)i)AKPアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、ii)2,4−ジオキソペンタノエート−4−レダクターゼ、iii)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートデヒドラターゼ、iv)2−オキソペンテノエートレダクターゼ、およびv)2−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼ;ならびにE)i)AKPレダクターゼ、ii)2−アミノ−4−ヒドロキシペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、iii)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートデヒドラターゼ、iv)2−オキソペンテノエートレダクターゼ、ならびにv)2−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼから選択される。
一部の実施形態において、本発明の方法は、2,4−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される2,4−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む2,4−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を利用する。2,4−ペンタジエノエート経路は、図12の工程A、E、F、およびGに示されるように、(A)1)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートアルドラーゼ、2)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートレダクターゼ、3)2,4−ジヒドロキシペンタノエート2−デヒドラターゼ、および4)4−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼならびに図12の工程A、E、H、およびDに示されるように、(B)1)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートアルドラーゼ、2)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートレダクターゼ、3)2,4−ジヒドロキシペンタノエート4−デヒドラターゼおよび4)2−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼから選択される酵素のセットを有する。
一部の実施形態において、本発明の方法は、2,4−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される2,4−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む2,4−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を利用する。2,4−ペンタジエノエート経路は、図13の工程E、H、I、G、およびDに示すように、(A)1)AKPアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、2)2,4−ジオキソペンタノエート2−レダクターゼ、3)2−ヒドロキシ−4−オキソペンタノエートレダクターゼ、4)2,4−ジヒドロキシペンタノエート2−デヒドラターゼ、ならびに5)4−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ、ならびに(B)図12の工程FおよびGまたはHおよびDと共に、図13の工程E、H、およびIに示されるように、1)AKPアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、2)2,4−ジオキソペンタノエート2−レダクターゼ、4)2,4−ジヒドロオキシペンタノエート−2−デヒドラターゼと共に、3)2−ヒドロキシ−4−オキソペンタノエートレダクターゼならびに5)4−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼまたは4)2,4−ジヒドロキシペンタノエート−4−デヒドラターゼならびに5)2−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼから選択される酵素のセットを有する。すなわち、2,4−ジヒドロキシペンタノエートの二重脱水は、任意の順序で実施され得る。
一部の実施形態において、本発明の方法は、AKPを生産するのに十分な量で発現されるAKP経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含むAKP経路を有する非天然に生じる微生物を利用する。AKP経路は、図13の工程MおよびNに示されるように、オルニチン4,5−アミノムターゼおよび2,4−ジアミノペンタノエート4−アミノトランスフェラーゼおよび/または4−デヒドロゲナーゼを含む。一部の実施形態において、AKP経路を有する微生物は、オルニチン4,5−アミノムターゼおよび2,4−ジアミノペンタノエート4−アミノトランスフェラーゼまたは2,4−ジアミノペンタノエート4−デヒドロゲナーゼをコードする2つの外因性酵素を含む。一部の実施形態において、このAKP経路は、図13に示されるように、上述の2,4−ペンタジエノエート経路のいずれかに加えられ得る。代替として、AKPは、図13の工程Aに示されるように、AKPチオラーゼを添加することによりアラニンから入手され得、本明細書に記載され、図12と共に図13に示される種々の2,4−ペンタジエノエート経路に供給され得る。
一部の実施形態は、本発明の方法は、2,4−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される2,4−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む2,4−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を利用する。2,4−ペンタジエノエート経路は、図14の工程A〜Cに示されるように、(A)1)オルニチン2,3−アミノムターゼ、2)3,5−ジアミノペンタノエートデアミナーゼ、および3)5−アミノペント−2−エノエートデアミナーゼ、図14の工程A、B、H、F、およびGに示されるように、(B)1)オルニチン2,3−アミノムターゼ、2)3,5−ジアミノペンタノエートデアミナーゼ、3)5−アミノペント−2−エノエートアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、4)5−オキソペント−2−エノエートレダクターゼ、ならびに5)5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ、図14の工程A、D、E、FおよびGに示されるように、(C)1)オルニチン2,3−アミノムターゼ、2)3,5−ジアミノペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、3)3−アミノ−オキソペンタノエートデアミナーゼ、4)5−オキソペント−2−エノエートレダクターゼ、ならびに5)5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼならびに図14の工程A、D、I、J、およびGに示されるように、(D)1)オルニチン2,3−アミノムターゼ、2)3,5−ジアミノペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、3)3−アミノ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ、ならびに4)3−アミノ−5−ヒドロキシペンタノエートデアミナーゼ、および5)5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼから選択される酵素のセットを有する。
一部の実施形態において、本発明の方法は、2,4−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される2,4−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む2,4−ペンタジエノエート経路を有する非天然に生じる微生物を利用する。2,4−ペンタジエノエート経路は、3−HP−CoAまたはアクリロイル−CoAから開始して図15に示される多くの経路のいずれかから選択される酵素のセットを有する。
3−HPからの例示的な経路は、以下の酵素のセット、図15の工程A〜Eに示されるように、(A)1)3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、2)3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAレダクターゼ、3)3,5−ジヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼ、4)5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAレダクターゼ、ならびに5)ペント−2,4−ジエノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、ならびに図15の工程A、F、I、J、およびQに示されるように、(B)1)3−ヒドロキシプロパノイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、2)3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、3)3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノエートレダクターゼ、4)3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ、および5 5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ含む。当業者は、3−HP−CoAから経路(A)および(B)を定義する酵素のセットは、図15の工程Gにより示されるように、可逆的酵素3,5−ヒドロキシペンタノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、ならびに図15の工程Hにより示されるように、5−ヒドロキシペント−2−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼにより混合され得ることを認識するだろう。このように、3−HP−CoAから2,4−ペンタジエノエートへの経路は、図15に各々示される、工程A、B、G、JおよびQ、または工程A、B、C、H、およびQ、または工程A、B、G、J、H、D、およびE、または工程A、F、I、G、C、D、およびE、または工程A、F、I、G、C、H、およびQまたは工程A、F、I、J、H、DおよびEにおける酵素を含み得る。
アクリロイル−CoAからの例示的な経路は、以下の酵素のセット、図15の工程M、O、P、およびSに示されるように、(C)1)アクリロイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、2)3−オキソペント−4−エノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼ、3)3−オキソペント−4−エノエートレダクターゼ、4)3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ、ならびに工程M、N、E、およびEに示されるように、(D)1)アクリロイル−CoAアセチルトランスフェラーゼ、2)3−オキソペント−4−エノイル−CoAレダクターゼ、3)3−ヒドロキシペント−4−エノイル−CoAデヒドラターゼ、ならびに4)ペント−2,4−ジエノイル−CoAシンテターゼ、トランスフェラーゼおよび/またはヒドロラーゼを含む。当業者は、3−HP−CoAからの経路(A)および(B)ならびにアクリロイル−CoAからの(C)および(D)を定義する酵素のセットは、図15の工程Kに示されるように、可逆的酵素3−ヒドロキシプロパノイル−CoAデヒドラターゼならびに図15の工程Lに示されるように、3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAデヒドラターゼにより混合され得ることを認識するだろう。このように、工程Kは、工程K、M、N、R、およびEまたは工程K、M、O、PおよびSなどの2,4−ペンタジエノエート経路を提供するアクリロイル−CoAから2,4−ペンタジエノエートまでの列挙した経路のいずれかに加えられ得る。工程Kはまた、工程K、M、およびLにより3−HP−CoAから3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoAを提供するために工程Aに対する往復の代替物を使用され得る。このように、工程Aの酵素を利用する上述の経路のいずれかは、その所定の位置において工程K、M、およびLの酵素を利用できる。同じ3−オキソ−5−ヒドロキシペンタノイル−CoA中間体は、図15の工程KおよびAまたはMおよびLの酵素を介する経路によりアクリロイル−CoAから入手され得る。このように、アクリロイル−CoAは、3−HP−CoAから入手可能な全ての列挙された経路を入手するために使用され得る。このように、例えば、アクリロイル−CoAから2,4−ペンタジエノエートへの経路は、図15に全て示されるように、工程K、A、B、C、D、およびE、または工程K、A、F、I、JおよびQ、または工程K、A、B、G、J、およびQ、または工程K、A、B、G、J、H、D、およびE、または工程K、A、B、C、H、およびQ、または工程K、A、F、I、G、C、D、およびE、または工程K、A、F、I、G、C、H、Q、または工程K、A、F、I、J、H、DおよびE、または工程M、L、B、C、D、およびE、または工程M、L、F、I、JおよびQ、または工程M、L、B、G、J、およびQ、または工程M、L、B、G、J、H、D、およびE、または工程M、L、B、C、H、およびQ、または工程M、L、F、I、G、C、D、およびE、または工程M、L、F、I、G、C、H、Q、または工程M、L、F、I、J、H、DおよびEからの酵素を含み得る。同様に、3−HP−CoAは、工程Lの酵素を用いて中間体3−オキソペント−4−エノイル−CoAにより列挙されたアクリロイル−CoA経路に供給され得る。このように、3−HP−CoAから2,4−ペンタジエノエートへの経路は、工程A、L、N、R、およびEまたは工程A、L、O、P、およびSからの酵素を含み得、各々の経路は図15に示される。
一部の実施形態において、本発明の方法に使用される非天然に生じる微生物は、2,4−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする2つの外因性核酸を含み得る。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、2,4−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする3つの外因性核酸を含み得る。例えば、本発明の非天然に生じる微生物は、i)AKPデアミナーゼ、ii)アセチルアクリレートレダクターゼ、およびiii)4−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼをコードする3つの外因性核酸を含み得るので、AKPにより2,4−ペンタジエノエートへのアラニンまたはオルニチンの入手可能な経路を提供する。当業者は、これは単に例示であり、3つの外因性核酸は、図12〜15の列挙した経路のいずれかにおける任意の2,4−ペンタジエノエートを生産する非天然に生じる微生物に基づき得ることを認識するだろう。
一部の実施形態において、本発明の方法に使用される非天然に生じる微生物は、2,4−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする4つの外因性核酸を含み得る。例えば、非天然に生じる微生物は、i)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートアルドラーゼ、ii)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートデヒドラターゼ、iii)2−オキソペンタノエートレダクターゼ、およびiv)2−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼをコードする4つの外因性核酸を含み得るので、図12に示されるように、ピルベートから2,4−ペンタジエノエートまでの完全な経路を定義する。当業者は、これは単に例示であり、4つの外因性核酸は、図12〜15の列挙された経路のいずれかにおける任意の2,4−ペンタジエノエートを生産する非天然に生じる微生物に基づき得ることを認識するだろう。
なおさらなる実施形態において、本発明の方法に使用される非天然に生じる微生物は、2,4−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする5つの外因性核酸を含み得る。5つの外因性核酸を有する本発明の例示的な非天然に生じる微生物は、図13における工程E、H、F、CおよびDに示されるように、(A)i)AKPアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、ii)2,4−ジオキソペンタノエート−2−レダクターゼ、iii)2−ヒドロキシ−4−オキソペンタノエートデヒドラターゼ、iv)アセチルアクリレートレダクターゼ、ならびにv)4−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ、あるいは図12の工程B、C、およびDと共に図13の工程EおよびKに示されるように、(B)i)AKPアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、ii)2,4−ジオキソペンタノエート−4−レダクターゼ、iii)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートデヒドラターゼ、iv)2−オキソペンタノエートレダクターゼ、ならびに図12の工程B、C、およびDと共に、図13の工程JおよびLに示されるように、v)2−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼ、あるいはi)AKPレダクターゼ、ii)2−アミノ−4−ヒドロキシペンタノエートアミノトランスフェラーゼおよび/またはデヒドロゲナーゼ、iii)4−ヒドロキシ−2−オキソバレレートデヒドラターゼ、iv)2−オキソペンテノエートレダクターゼ、およびv)2−ヒドロキシペンテノエートデヒドラターゼをコードする酵素を含み得る。当業者は、これは単に例示であり、5つの外因性核酸は、図12〜15の列挙された経路の任意におけるいずれかの2,4−ペンタジエノエートを生産する非天然に生じる微生物に基づき得ることを認識するだろう。
このように、一部の実施形態において、2,4−ペンタジエノエート経路における2、3、4、5、6、全てまでの酵素は外因性核酸の挿入を提供され得る。一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、異種核酸である少なくとも1つの外因性核酸を有する。さらに、一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物を利用する方法は、実質的に嫌気性の培地を利用できる。
一部の実施形態において、本発明の方法に使用される非天然に生じる微生物はさらに、2,4−ペンタジエノエートの1,3−ブタジエンへの変換により1,3−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼを含み得る。このように、図12のいずれかの2,4−ペンタジエノエートは、図4におけるcisまたはtrans2,4−ペンタジエノエートの1,3−ブタジエンへの変換により示されるように、1,3−ブタジエンのさらなる生産物の主成分を形成できる。
一部の実施形態において、本発明は、2,4−ペンタジエノエートを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、本明細書に記載される上述の経路に係る非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、2,4−ペンタジエノエートを生産する方法を提供する。一部の実施形態において、微生物は、2,4−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする2、3、4、5、6、7、または8つの外因性核酸を含む。一部のこのような実施形態において、少なくとも1つの外因性核酸は異種核酸である。一部のこのような実施形態において、非天然に生じる微生物は実質的に嫌気性培地に存在する。
一部の実施形態において、本発明は、1,3−ブタジエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、本明細書に記載される上述の経路に係る非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、1,3−ブタジエンを生産する方法を提供する。一部のこのような実施形態において、微生物は、1,3−ブタジエン経路の酵素を各々コードする2、3、4、5、6、7または8つの外因性核酸を含む。一部のこのような実施形態において、少なくとも1つの外因性核酸は異種核酸である。一部のこのような実施形態において、非天然に生じる微生物は、実質的に嫌気性培地に存在する。
一部の実施形態において、本発明は、3−ブテン−1オールを生産するための条件下で、かつ、十分な時間、本明細書に記載される上述の経路に係る非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、3−ブテン−1−オールを生産する方法を提供する。一部の実施形態において、微生物は、3−ブテン−1−オール経路の酵素を各々コードする2、3、4、5、6または7つの外因性核酸を含む。一部の実施形態において、少なくとも1つの外因性核酸は異種核酸である。一部のこのような実施形態において、非天然に生じる微生物は、実質的に嫌気性培地に存在する。一部のこのような実施形態において、本発明の方法はさらに、1,3−ブタジエンを提供するために3−ブテン−1−オールの化学的脱水を含む。
3−ブテン−1−オールは、発酵溶液から単離された純粋な3−ブテン−1−オールで開始して、または発酵溶液のワークアップにおいて単離された3−ブテン−1−オールの水溶液もしくは有機溶液で開始して、1,3−ブタジエンの形成と共に化学的に脱水され得る。このような3−ブテン−1−オール溶液はまた、例えば、必要に応じて、適切な添加溶剤の存在下で蒸留によって脱水工程前に濃縮され得る。
脱水反応は、液相または気相で実施され得る。脱水反応は、触媒の存在下で実施され得、利用される触媒の性質は、気相または液相反応が実施されるかどうかに依存する。
適切な脱水触媒は、酸性触媒およびアルカリ性触媒の両方を含む。酸性触媒は特に、オリゴマーを形成する低い傾向を示し得る。脱水触媒は、同種触媒、異種触媒、またはそれらの組み合わせとして利用され得る。異種触媒は、適切な支持材と併せて使用され得る。そのような支持材自体は、酸性であっても、アルカリ性であってもよく、酸性またはアルカリ性の脱水触媒を提供するか、あるいは触媒は不活性支持材に適用され得る。
脱水触媒として機能する適切な支持材は、モルデナイト、モンモリナイト、酸性ゼオライトなどの天然または合成ケイ酸塩を含み;支持材は、一塩基、二塩基または多塩基無機酸、例えばリン酸で、あるいは酸化物またはケイ酸塩などの無機酸の酸性塩、例えばAl2O3、TiO2でコーティングされ;酸化物およびγ−Al2O3およびZnO−Al2O3などの混合酸化物は、ヘテロポリ酸の酸化物と混合される。アルカリ性物質は、脱水触媒および支持材の両方として作用し、支持材は、それらの酸化物として、アルカリ、アルカリ土類、ランタン、ラントイド(lanthoid)またはそれらの組み合わせを含む。脱水を作用し得る材料のさらなる分類は、アルカリ性または酸性形態のいずれかで使用され得るイオン交換体である。
適切な同種脱水触媒は、リン酸を含有する酸、例えばリン酸などの無機酸を含む。無機酸は、浸漬または含浸により支持材上に固定され得る。
一部の実施形態において、脱水反応は、当該技術分野において公知の従来の装置、例えば管型反応装置、シェルアンドチューブ熱交換器および熱交換器としてサーモプレートを備える反応器を用いて気相で実施される。一部の実施形態において、気相脱水は、単離された3−ブテン−1−オールまたはブテン−1−オールの溶液を利用でき、ブテン−1−オールは固定床触媒と共に反応器に導入される。液相における加熱脱水は、200℃〜350℃、一部の実施形態において250〜300℃の温度範囲で実施され得る。
トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの生産を試験するための適切な精製および/またはアッセイは周知の方法を用いて実施され得る。三連培養などの適切な反復が、試験される各々の遺伝子操作された株について行われ得る。例えば、遺伝子操作された生産宿主における生産物および副産物形成がモニターされ得る。最終生産物および中間体、ならびに他の有機化合物は、HPLC(高速液体クロマトグラフィー)、GC−MS(ガスクロマトグラフィー−質量分析)およびLC−MS(液体クロマトグラフィー−質量分析)などの方法または当該技術分野において周知の慣用的な手順を用いる他の適切な分析的方法により分析され得る。発酵ブロス中の生産物の放出もまた、培養物の上清を用いて試験されてもよい。副産物および残留グルコースは、例えば、グルコースおよびアルコールのための屈折率検出器、ならびに有機酸のためのUV検出器を用いてHPLC(Linら,Biotechnol.Bioeng.90:775−779(2005))、または当該技術分野において周知の他の適切なアッセイおよび検出方法により定量され得る。外因性DNA配列由来の個々の酵素またはタンパク質活性もまた、当該技術分野において周知の方法を用いてアッセイされ得る。例えば、フェニルピルベートデカルボキシラーゼの活性が、Weissら(Weissら,Biochem,27:2197−2205(1988))に記載されているように、補助酵素としてアルコールデヒドロゲナーゼを用いる結合光度アッセイ(coupled photometric assay)を用いて測定され得る。アセトフェノンレダクターゼなどのNADHおよびNADPH依存性酵素は、Schliebenら(Schliebenら,J.Mol.Biol.,349:801−813(2005))に記載されているように、340nmにて分光光学的に供され得る。典型的な炭化水素アッセイ法に関しては、炭化水素分析のマニュアルを参照のこと(ASTM Manula Series,A.W. Drews,ed.,第6版,1998,American Society for Testing and Materials,Baltimore,Maryland。p−トルエートメチル−モノオキシゲナーゼ活性は、タンパク質の沈殿により反応を停止して、水浴中で、精製した酵素をNADH、FeSO4およびp−トルエート基質とインキュベートすることによってアッセイされ得、HPLCにより上清中の生産物を分析される(Locherら,J.Bacteriol.173:3741−3748(1991))。
トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンは、当該技術分野において周知の種々の方法を用いて培地中で他の成分から分離され得る。このような分離法には、例えば、抽出処理および連続液液抽出を含む方法、パーベーパレーション、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出物濾過、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、および限外濾過が含まれる。上記の方法の全ては当該技術分野において周知である。
本明細書に記載される非天然に生じる微生物のいずれかは、本発明の生合成生産物を生産および/または分泌するために培養され得る。例えば、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生産物は、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの生合成生産のために培養され得る。
トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの生産に関して、組換え株は、炭素源および他の必須栄養素を含む培地中で培養される。全プロセスのコストを減少させるために発酵槽において嫌気性条件を維持することが、時々望まれ、非常に望まれる場合もある。そのような条件は、例えば、最初に培地に窒素を散布し、次に隔膜およびクリンプキャップでフラスコを密閉することにより得られ得る。増殖が嫌気性で観察されない菌について、嫌気的または実質的に嫌気的条件が、限られた通気のために隔膜に小さな穴を開けることにより適用されてもよい。例示的な嫌気的条件は以前に記載されており、当該技術分野において周知である。例示的な好気的および嫌気的条件は、例えば、2007年8月10日に出願された米国特許出願公開第2009/0047719号に記載されている。発酵は、本明細書に開示されるように、バッチ、供給バッチまたは連続方式で実施され得る。
所望の場合、所望のpHに培地を維持することが必要な場合、培地のpHは、所望のpH、特に中性pH、例えばNaOHまたは他の塩基などの塩基あるいは酸を添加することによりpH7付近に維持され得る。増殖速度は、 分光光度計(600nm)を用いて光学濃度、および時間にわたって炭素源枯渇をモニターすることによるグルコース摂取速度を測定することにより決定され得る。
増殖速度は、例えば、炭素源を非天然に生じる微生物に供給できる任意の炭水化物源を含み得る。そのような源には、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロースおよびデンプンなどの糖が含まれる。他の炭水化物源には、例えば、再生可能な原料およびバイオマスが含まれる。本発明の方法における原料として使用され得る例示的な種類のバイオマスには、セルロース性バイオマス、ヘミセルロース性バイオマスおよびリグニン原料または原料の一部が含まれる。そのようなバイオマス原料は、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトースおよびデンプンなどの炭素源として有用な炭水化物物質を含む。本明細書に提供される教示および指針を考慮して、当業者は、上記に例示したもの以外の再生可能な原料およびバイオマスもまた、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを生産するための本発明の微生物を培養するために使用できることを理解するだろう。
上記に例示したものなどの再生可能な原料に加えて、本発明のトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン微生物はまた、その炭素源として合成ガスにおける増殖のために修飾されてもよい。この特定の実施形態において、1つ以上のタンパク質または酵素は、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを生産する微生物において発現されて、合成ガスまたは他のガス炭素源を利用するための代謝経路を提供する。
合成ガスまたは生産ガスとしても知られている合成ガスは、石炭ならびに農作物および残留物を含む、バイオマス材料などの炭素材料のガス化の主な生産物である。合成ガスは、主にH2およびCOの混合物であり、限定されないが、石炭、石油、天然ガス、バイオマス、および有機性廃棄物を含む、いずれかの有機原料のガス化から得られ得る。ガス化は一般的に、高燃料対酸素比の下で実施される。大部分はH2およびCOであるが、合成ガスはまた、少量でCO2および他のガスを含んでもよい。このように、合成ガスは、費用効率が高い気体炭素、例えばCOおよびさらにCO2の源を提供する。
Wood−Ljungdahl経路は、COおよびH2のアセチル−CoAおよびアセトンなどの他の生産物への変換を触媒する。COおよび合成ガスを利用できる生物はまた一般に、Wood−Ljungdahl経路に含まれる酵素および形質転換の同じ基本セットを介してCO2およびCO2/H2混合物を利用する能力を有する。微生物によるCO2のアセトンへのH2依存性変換は、以前から認識されており、COはまた、同じ微生物により使用され得ることおよび同じ経路が関連することを表していた。多くのアセトゲンは、CO2の存在下で増加し、必要な還元等価物を供給するために水素が存在する限り、アセトンなどの化合物を生成することが示されている(例えば、Drake,Acetogenesis,pp.3−60ChapmanおよびHall,New York,(1994)を参照のこと)。これは以下の式にまとめられる:
2CO2+4H2+nADP+nPi→CH3COOH+2H2O+nATP
それ故、Wood−Ljungdahl経路を保有する非天然に生じる微生物は、アセチル−CoAおよび他の所望の生産物の生産と同様にCO2およびH2混合物を利用できる。
Wood−Ljungdahl経路は、当該技術分野において周知であり、2つの分岐:(1)メチル分岐および(2)カルボニル分岐に分離され得る12の反応からなる。メチル分岐は、合成ガスをメチル−テトラヒドロホレート(メチル−THF)に変換するのに対して、カルボニル分岐はメチル−THFをアセチル−CoAに変換する。メチル分岐における反応は、以下の酵素またはタンパク質:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホルメートデヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロフレートシンテターゼ、メテニルテトラヒドロホレートシクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロホレートデヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロホレートレダクターゼにより触媒される。カルボニル分岐における反応は、以下の酵素またはタンパク質:メチルテトラヒドロホレート:コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ(例えば、AcsE)、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質集合タンパク質(例えば、AcsF)、フェレドキシン、アセチル−CoAシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびニッケル−タンパク質集合タンパク質(例えば、CooC)により順に触媒される。トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路を生成するための十分な数のコード核酸を導入するために本明細書に提供される教示および指針に従って、当業者は、同じ遺伝子操作設計もまた、宿主生物に存在しないWood−Ljungdahl酵素またはタンパク質をコードする少なくとも核酸を導入することに対して実施され得ることを理解するだろう。従って、修飾された生物が完全なWood−Ljungdahl経路を含むような1つ以上のコード核酸の本発明の微生物への導入は合成ガス利用能を与える。
さらに、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよび/またはヒドロゲナーゼ活性と関連した還元的(可逆的)トリカルボン酸サイクルもまた、CO、CO2および/またはH2をアセチル−CoAおよび酢酸塩などの他の生産物に変換するために使用され得る。還元的TCA経路により炭素を固定できる生物は、1つ以上の以下の酵素:ATPクエン酸塩−リアーゼ、クエン酸塩リアーゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、アルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマレートレダクターゼ、フマラーゼ、マレエートデヒドロゲナーゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、およびヒドロゲナーゼを利用できる。具体的には、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびヒドロゲナーゼによりCOおよび/またはH2から抽出される還元当量は、アセチル−CoAまたは酢酸塩への還元的TCAサイクルによりCO2を固定するために利用される。酢酸塩は、アセチル−CoAトランスフェラーゼ、アセテートキナーゼ/ホスホトランスアセチラーゼ、およびアセチル−CoAシンテターゼなどの酵素によりアセチル−CoAに変換され得る。アセチル−CoAは、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン前駆体、グリセルアルデヒド−3−ホスフェート、ホスホエノールピルベート、およびピルベート、ピルベートにより:フェレドキシンオキシドレタクターゼおよびグルコネオゲネシスの酵素に変換され得る。トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路を生成するための十分な数のコード核酸を導入するための本明細書に提供される教示および指針に従って、当業者は、同じ遺伝子操作設計もまた、宿主生物に存在しない還元的TCA経路の酵素またはタンパク質をコードする少なくとも核酸を導入することに対して実施され得ることを理解するだろう。従って、修飾された微生物が完全な還元的TCA経路を含むような1つ以上のコード核酸の本発明の微生物への導入は、合成ガス利用能を与える。
一部の実施形態において、本発明は、1,3−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される1,3−ブタジエン経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む1,3−ブタジエン経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物を提供し、前記1,3−ブタジエン経路は、(A)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAシンテターゼまたは3−オキソアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ;2−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ;3−オキソペント−4−エノエートレダクターゼ;および3−ヒドロキシペント−4−エノエートデカルボキシラーゼ;(B)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAシンテターゼまたは3−オキソアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ;2−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ;3−オキソペント−4−エノエートレダクターゼ;3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ;および2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ;(C)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAシンテターゼまたは3−オキソアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ;2−フマリルアセテートレダクターゼ;3−ヒドロキシヘキサ−4−エネジオエートデカルボキシラーゼ;および3−ヒドロキシペント−4−エノエートデカルボキシラーゼ;(D)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAシンテターゼまたは3−オキソアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ;2−フマリルアセテートレダクターゼ;3−ヒドロキシヘキサ−4−エネジオエートデカルボキシラーゼ;3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ;および2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ;(E)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAシンテターゼまたは3−オキソアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−オキソアジペートレダクターゼ;3−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ;3−ヒドロキシヘキサ−4−エネジオエートデカルボキシラーゼ;および3−ヒドロキシペント−4−エノエートデカルボキシラーゼ;(F)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAシンテターゼまたは3−オキソアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−オキソアジペートレダクターゼ;3−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ;3−ヒドロキシヘキサ−4−エネジオエートデカルボキシラーゼ;3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ;および2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ;(G)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAレダクターゼ;3−ヒドロキシアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−ヒドロキシアジピル−CoAシンテターゼまたは3−ヒドロキシアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ;3−ヒドロキシヘキサ−4−エネジオエートデカルボキシラーゼ;および3−ヒドロキシペント−4−エノエートデカルボキシラーゼ;および(H)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAレダクターゼ;3−ヒドロキシアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−ヒドロキシアジピル−CoAシンテターゼまたは3−ヒドロキシアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ;3−ヒドロキシヘキサ−4−エネジオエートデカルボキシラーゼ;3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ;および2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼから選択される。
一部の態様において、非天然に生じる微生物は、1,3−ブタジエン経路の酵素を各々コードする2、3、4、5、6または7つの外因性核酸を含む。例えば、微生物は、以下:(A)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAシンテターゼまたは3−オキソアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ;2−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ;3−オキソペント−4−エノエートレダクターゼ;および3−ヒドロキシペント−4−エノエートデカルボキシラーゼ;(B)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAシンテターゼまたは3−オキソアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ;2−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ;3−オキソペント−4−エノエートレダクターゼ;3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ;および2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ;(C)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAシンテターゼまたは3−オキソアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ;2−フマリルアセテートレダクターゼ;3−ヒドロキシヘキサ−4−エネジオエートデカルボキシラーゼ;および3−ヒドロキシペント−4−エノエートデカルボキシラーゼ;(D)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAシンテターゼまたは3−オキソアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ;2−フマリルアセテートレダクターゼ;3−ヒドロキシヘキサ−4−エネジオエートデカルボキシラーゼ;3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ;および2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ;(E)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAシンテターゼまたは3−オキソアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−オキソアジペートレダクターゼ;3−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ;3−ヒドロキシヘキサ−4−エネジオエートデカルボキシラーゼ;および3−ヒドロキシペント−4−エノエートデカルボキシラーゼ;(F)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAシンテターゼまたは3−オキソアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−オキソアジペートレダクターゼ;3−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ;3−ヒドロキシヘキサ−4−エネジオエートデカルボキシラーゼ;3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ;および2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼ;(G)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAレダクターゼ;3−ヒドロキシアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−ヒドロキシアジピル−CoAシンテターゼまたは3−ヒドロキシアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ;3−ヒドロキシヘキサ−4−エネジオエートデカルボキシラーゼ;および3−ヒドロキシペント−4−エノエートデカルボキシラーゼ;および(H)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAレダクターゼ;3−ヒドロキシアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−ヒドロキシアジピル−CoAシンテターゼまたは3−ヒドロキシアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ;3−ヒドロキシヘキサ−4−エネジオエートデカルボキシラーゼ;3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ;および2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼから選択される酵素のセットの各々をコードする外因性核酸を含み得る。
一部の実施形態において、本発明は、上記のような非天然に生じる微生物を提供し、前記微生物はさらに、以下:(i)還元的TCA経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む還元的TCA経路であって、前記少なくとも1つの外因性核酸は、ATP−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルターゼ:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的TCA経路;(ii)還元的TCA経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む還元的TCA経路であって、前記少なくとも1つの外因性核酸は、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼ、およびH2ヒドロゲナーゼから選択される、還元的TCA経路;または(iii)COデヒドロゲナーゼ、H2ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸、から選択される。本発明の一部の態様において、(i)を含む微生物は、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。本発明の一部の態様において、(ii)を含む微生物は、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。
一部の実施形態において、本発明は、上記のような非天然に生じる微生物を提供し、前記(i)を含む微生物は、ATP−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする4つの外因性核酸を含み;前記(ii)を含む微生物は、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼ、およびH2ヒドロゲナーゼをコードする5つの外因性核酸を含み;または(iii)を含む微生物はCOデヒドロゲナーゼおよびH2ヒドロゲナーゼをコードする2つの外因性核酸を含む。
一部の態様において、本発明は、前記少なくとも1つの外因性核酸が異種核酸である、本明細書に記載されるような非天然に生じる微生物を提供する。別の態様において、非天然に生じる微生物は実質的に嫌気性培地に存在する。一部の実施形態において、本発明は、非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、1,3−ブタジエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、本明細書に記載されるような非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、1,3−ブタジエンを生産する方法を提供する。
一部の実施形態において、本発明は、2,4−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される2,4−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む2,4−ペンタジエノエート経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物を提供し、前記2,4−ペンタジエノエート経路は、以下:(A)スクシニルーCoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAシンテターゼまたは3−オキソアジピルーCoAヒドロラーゼ;3−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ;2−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ;3−オキソペント−4−エノエートレダクターゼ;および3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ;(B)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAシンテターゼまたは3−オキソアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ;2−フマリルアセテートレダクターゼ;3−ヒドロキシヘキサ−4−エネジオエートデカルボキシラーゼ;および3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ;(C)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAシンテターゼまたは3−オキソアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−オキソアジペートレダクターゼ;3−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ;3−ヒドロキシヘキサ−4−エネジオエートデカルボキシラーゼ;および3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ;および(D)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAレダクターゼ;3−ヒドロキシアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−ヒドロキシアジピル−CoAシンテターゼまたは3−ヒドロキシアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ;3−ヒドロキシヘキサ−4−エネジオエートデカルボキシラーゼ;および3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼから選択される。
一部の態様において、微生物は、2,4−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする2、3、4、5、または6つの外因性核酸を含む。例えば、微生物は、以下:(A)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピルCoA−トランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAシンテターゼまたは3−オキソアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ;2−フマリルアセテートデカルボキシラーゼ;3−オキソペント−4−エノエートレダクターゼ;および3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ;(B)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAシンテターゼまたは3−オキソアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−オキソアジペートデヒドロゲナーゼ;2−フマリルアセテートレダクターゼ;3−ヒドロキシヘキサ−4−エネジオエートデカルボキシラーゼ;および3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ;(C)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAシンテターゼまたは3−オキソアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−オキソアジペートレダクターゼ;3−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ;3−ヒドロキシヘキサ−4−エネジオエートデカルボキシラーゼ;および3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼ;および(D)スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソアジピル−CoAレダクターゼ;3−ヒドロキシアジピル−CoAトランスフェラーゼ、3−ヒドロキシアジピル−CoAシンテターゼまたは3−ヒドロキシアジピル−CoAヒドロラーゼ;3−ヒドロキシアジペートデヒドロゲナーゼ;3−ヒドロキシヘキサ−4−エネジオエートデカルボキシラーゼ;および3−ヒドロキシペント−4−エノエートデヒドラターゼから選択される酵素の各々をコードする外因性核酸を含み得る。
一部の実施形態において、本発明は、上記のような非天然に生じる微生物を提供し、前記微生物はさらに、(i)還元的TCA経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む還元的TCA経路であって、前記少なくとも1つの外因性核酸は、ATP−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレタクターゼから選択される、還元的TCA経路;(ii)還元的TCA経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む還元的TCA経路であって、前記少なくとも1つの外因性核酸は、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホネートピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼ、およびH2ヒドロゲナーゼから選択される、還元的TCA経路;または(iii)COデヒドロゲナーゼ、H2ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸、を含む。一部の態様において、(i)を含む微生物は、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。一部の態様において、(ii)を含む微生物は、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。
一部の態様において、(i)を含む非天然に生じる微生物は、ATP−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする4つの外因性核酸を含み;前記(ii)を含む微生物は、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼ、およびH2ヒドロゲナーゼをコードする5つの外因性核酸を含み;または前記(iii)を含む微生物は、COデヒドロゲナーゼおよびH2ヒドロゲナーゼをコードする2つの外因性核酸を含む。
一部の態様において、本発明は、上記のような非天然に生じる微生物を提供し、前記少なくとも1つの外因性核酸は異種核酸である。一部の態様において、非天然に生じる微生物は実質的に嫌気性培地である。
一部の実施形態において、本発明は、2,4−ペンタジエノエートを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、本明細書に記載されるような非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、2,4−ペンタジエノエートを生産する方法を提供する。
一部の実施形態において、本発明は、1,3−ブタジエンを生産するのに十分な量で発現される1,3−ブタジエン経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む1,3−ブタジエン経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物を提供し、前記1,3−ブタジエン経路は、以下:(A)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(アルデヒド還元);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;および2,4−ペンタジエンデカルボキシラーゼ;(B)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(アルデヒド還元);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ;(C)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(アルデヒド還元);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ;(D)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(CoA還元およびアルコール形成);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;および2,4−ペンタジエンデカルボキシラーゼ;(E)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(CoA還元およびアルコール形成);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ;(F)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(CoA還元およびアルコール形成);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ;(G)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;および2,4−ペンタジエンデカルボキシラーゼ;(H)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ;(I)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ;(J)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;および2,4−ペンタジエンデカルボキシラーゼ;(K)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ;(L)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ;(M)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成);3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;および2,4−ペンタジエンデカルボキシラーゼ;(N)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成);3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ;ならびに(O)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成);3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼから選択される。
一部の実施形態において、本発明は、上記のような非天然に生じる微生物を提供し、前記微生物は、1,3−ブタジエン経路の酵素を各々コードする2、3、4、4、6または7つの外因性核酸を含む。例えば、一部の態様において、微生物は、以下:(A)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(アルデヒド還元);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;および2,4−ペンタジエンデカルボキシラーゼ;(B)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(アルデヒド還元);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ;(C)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(アルデヒド還元);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ;(D)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(CoA還元およびアルコール形成);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;および2,4−ペンタジエンデカルボキシラーゼ;(E)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(CoA還元およびアルコール形成);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ;(F)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(CoA還元およびアルコール形成);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ;(G)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;および2,4−ペンタジエンデカルボキシラーゼ;(H)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ;(I)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ;(J)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;および2,4−ペンタジエンデカルボキシラーゼ;(K)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ;(L)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ;(M)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成);3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;および2,4−ペンタジエンデカルボキシラーゼ;(N)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成);3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ;ならびに(O)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成);3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;および3−ブテン−1−オールデヒドラターゼから選択される酵素の各々をコードする外因性核酸を含む。
一部の実施形態において、本発明は、上記のような非天然に生じる微生物を提供し、前記微生物はさらに、(i)還元的TCA経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む還元的TCA経路であって、前記少なくとも1つの外因性核酸は、ATP−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的TCA経路;(ii)還元的TCA経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む還元的TCA経路であって、前記少なくとも1つの外因性核酸は、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼ、H2ヒドロゲナーゼから選択される、還元的TCA経路;または(iii)COデヒドロゲナーゼ、H2ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸、を含む。一部の態様において、(i)を含む非天然に生じる微生物は、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。一部の態様において、(ii)を含む微生物は、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。一部の態様において、(i)を含む微生物は、ATP−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする4つの外因性核酸を含み;前記(ii)を含む微生物は、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシレート、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼ、およびH2ヒドロゲナーゼをコードする5つの外因性核酸を含み;または前記(iii)を含む微生物は、COデヒドロゲナーゼおよびH2ヒドロゲナーゼをコードする2つの外因性核酸を含む。
一部の態様において、前記少なくとも1つの外因性核酸が異種核酸である、本明細書に開示されるような非天然に生じる微生物を含む。一部の態様において、非天然に生じる微生物は実質的に嫌気性培地に存在する。
一部の実施形態において、本発明は、1,3−ブタジエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、本明細書に記載されるような非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、1,3−ブタジエンを生産する方法を提供する。
一部の実施形態において、本発明は、2,4−ペンタジエノエートを生産するのに十分な量で発現される2,4−ペンタジエノエート経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む2,4−ペンタジエノエート経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物を提供し、前記2,4−ペンタジエノエート経路は、以下:(A)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(アルデヒド還元);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;(B)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(CoA還元およびアルコール形成);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;(C)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;(D)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;ならびに(E)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成);3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼから選択される。
一部の態様において、上記のような非天然に生じる微生物は、2,4−ペンタジエノエート経路の酵素を各々コードする2、3、4、5または6つの外因性核酸を含む。例えば、微生物は、以下:(A)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(アルデヒド還元);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;(B)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(CoA還元およびアルコール形成);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;(C)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;(D)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼ;ならびに(E)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成);3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデヒドラターゼから選択される酵素の各々をコードする外因性核酸を含む。
一部の実施形態において、本発明は、上記に開示されるような非天然に生じる微生物を提供し、前記微生物はさらに、(i)還元的TCA経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む還元的TCA経路であって、前記少なくとも1つの外因性核酸は、ATP−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的TCA経路;(ii)還元的TCA経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む還元的TCA経路であって、前記少なくとも1つの外因性核酸は、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼ、およびH2ヒドロゲナーゼから選択される、還元的TCA経路;または(iii)COデヒドロゲナーゼ、H2ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸、を含む。一部の態様において、(i)を含む微生物は、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。一部の態様において、(ii)を含む非天然に生じる微生物は、アコニターゼ、イソシトレート、デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。
一部の態様において、上記のような(i)を含む微生物は、ATP−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする4つの外因性核酸を含み;前記(ii)を含む微生物は、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼ、およびH2ヒドロゲナーゼをコードする5つの外因性核酸を含み;または前記(iii)を含む微生物は、COデヒドロゲナーゼおよびH2ヒドロゲナーゼをコードする2つの外因性核酸を含む。
一部の態様において、前記少なくとも1つの外因性核酸が異種核酸である、本明細書に開示されるような非天然に生じる微生物を含む。一部の態様において、非天然に生じる微生物は実質的に嫌気性培地に存在する。
一部の実施形態において、本発明は、2,4−ペンタジエノエートを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、上記のような非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、2,4−ペンタジエノエートを生産する方法を提供する。
一部の実施形態において、本発明は、3−ブテン−1−オールを生産するのに十分な量で発現される3−ブテン−1−オール経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む3−ブテン−1−オール経路を有する微生物を含む、非天然に生じる微生物を提供し、前記3−ブテン−1−オール経路は、以下:(A)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(アルデヒド還元);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;(B)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(アルデヒド還元);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;および3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;(C)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(CoA還元およびアルコール形成);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;(D)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(CoA還元およびアルコール形成);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;および3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;(E)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;(F)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;および3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;(G)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;(H)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;および3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;(I)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成);3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;ならびに(J)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成);および3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼから選択される。
一部の態様において、上記のような非天然に生じる微生物は、3−ブテン−1−オール経路の酵素を各々コードする2、3、4または5つの外因性核酸を含む。例えば、一部の態様において、微生物は、以下:(A)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(アルデヒド還元);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;(B)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(アルデヒド還元);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;および3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;(C)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(CoA還元およびアルコール形成);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;(D)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(CoA還元およびアルコール形成);5−ヒドロキシ−3−オキソペンタノエートレダクターゼ;および3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;(E)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;(F)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3,5−ジオキソペンタノエートレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;および3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;(G)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;(H)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);3−ヒドロキシ−5−オキソペンタノエートレダクターゼ;および3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼ;(I)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成);3,5−ジヒドロキシペンタノエートデヒドラターゼ;および5−ヒドロキシペント−2−エノエートデカルボキシラーゼ;ならびに(J)マロニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ;3−オキソグルタリル−CoAレダクターゼ(ケトン還元);3−ヒドロキシグルタリル−CoAレダクターゼ(アルコール形成);および3,5−ジヒドロキシペンタノエートデカルボキシラーゼから選択される酵素の各々をコードする外因性核酸を含む。
一部の実施形態において、本発明は、上記のような非天然に生じる微生物を提供し、前記微生物はさらに、(i)還元的TCA経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む還元的TCA経路であって、前記少なくとも1つの外因性核酸は、ATP−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的TCA経路;(ii)還元的TCA経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む還元的TCA経路であって、前記少なくとも1つの外因性核酸は、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼ、およびH2ヒドロゲナーゼから選択される、還元的TCA経路;または(iii)COデヒドロゲナーゼ、H2ヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸、を含む。一部の態様において、(i)を含む非天然に生じる微生物は、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシン、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。一部の実施形態において、(ii)を含む非天然に生じる微生物は、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸をさらに含む。一部の態様において、(i)を含む非天然に生じる微生物は、ATP−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレタクターゼをコードする4つの外因性核酸を含み、(ii)を含む前記微生物は、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、COデヒドロゲナーゼ、およびH2デヒドロゲナーゼをコードする5つの外因性核酸を含み;または(iii)を含む前記微生物は、COデヒドロゲナーゼおよびH2ヒドロゲナーゼをコードする2つの外因性核酸を含む。
一部の態様において、前記少なくとも1つの外因性核酸が異種核酸である、本明細書に開示されるような非天然に生じる微生物を含む。一部の態様において、非天然に生じる微生物は実質的に嫌気性培地に存在する。
一部の実施形態において、本発明は、3−ブテン−1−オールを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、上記のような非天然に生じる微生物を培養する工程を含む、3−ブテン−1−オールを生産する方法を提供する。
一部の実施形態において、本発明は、3−ブテン−1−オールを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、上記のような3−ブテン−1−オールを生産できる非天然に生じる微生物を培養し、前記3−ブテン−1−オールを1,3−ブタジエンに化学的に変換する、工程を含む、1,3−ブタジエンを生産する方法を提供する。3−ブテン−1−オールを1,3−ブタジエンに化学的に変換する方法は当該技術分野において周知であることは理解される。
本発明はまた、途中で主要な代謝中間体を介して、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエンまで炭素フラックスを改良するように遺伝子操作された生合成経路に部分的に関する。本発明は、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエンまでの種々の酵素変換反応を途中で触媒できる酵素をコードする1つ以上の外因性遺伝子を有する非天然に生じる微生物を提供する。一部の実施形態において、これらの酵素変換反応は、還元的トリカルボン酸(RTCA)サイクルの一部であり、限定されないが、炭水化物ベースの炭素原料から生産物収率を改良するために使用される。
多くの遺伝子操作された経路において、炭水化物原料に基づいた最大生産物収率の実現は、不十分な還元当量によって、あるいは還元当量および/または副産物に対する炭素の損失によって妨げられる。一部の実施形態によれば、本発明は、(i)還元的TCAサイクルにより炭素固定を高めること、ならびに/あるいは(ii)気体炭素源および/またはCO、CO2および/またはH2などの合成成分からさらなる還元当量を利用することによって、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエンの収率を増加させる。合成ガスに加えて、このようなガスの他の源には、限定されないが、天然に見出されるか、または生成される、空気が含まれる。
CO2固定還元的トリカルボン酸(RTCA)サイクルは、還元当量およびATPを使用するCO2同化のエネルギー吸収性の同化経路である(図22)。RTCAサイクルの1ターンは、2モルのCO2を1モルのアセチル−CoAに同化するか、または4モルのCO2を1モルのオキサロアセテートに同化する。アセチル−CoAのこのさらなる利用は、炭水化物ベースの炭素原料に由来する生産物分子の最大理論収率を改良する。例示的な炭水化物には、限定されないが、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノースおよびグリセロールが含まれる。
一部の実施形態において、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよび/またはヒドロゲナーゼ酵素に結合した還元的TCAサイクルが、合成ガス、CO2、CO、H2、および/または他の気体炭素源を微生物が利用できるように使用され得る。合成ガス(Synthesis gas)(合成ガス(syngas))は特に、主にH2およびCOの混合物であり、時々、石炭、石油、天然ガス、バイオマス、または有機廃棄物などの任意の有機原料の気化により得られ得る少量のCO2を含む。多くの気化プロセスが開発されており、ほとんどの設計は部分的酸化に基づき、0.5:1〜3:1 H2/CO混合物として合成ガスを提供するために、制限された酸素が高温(500〜1500℃)での有機材料の完全燃焼を回避する。石炭に加えて、多くの種類のバイオマスが、合成ガス産生のために使用され、再生可能な化学物質および燃料の生物学的生産のための安価かつ柔軟な原料を表す。二酸化炭素は、空気から提供され得るか、または例えば、固体CO2のタンクシリンダから、もしくは昇華により濃縮されて提供され得る。同様に、COおよび水素ガスは、試薬形態および/または任意の所望の比で混合されて提供され得る。他の気体炭素形態には、例えば、メタノールまたは同様の揮発性有機溶媒が含まれる。
合成ガスおよび/または他の炭素源の成分は、十分なCO2、還元当量、および作動するための還元的TCAサイクルのためのATPを提供できる。RTCAサイクルの1ターンは、2モルのCO2を1モルのアセチル−CoAに同化し、2ATPおよび4還元当量を必要とする。COおよび/またはH2は、それぞれ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびヒドロゲナーゼ酵素により還元当量を提供できる。還元当量は、NADH、NADPH、FADH、還元型キノン、還元型フェレドキシン、還元型フラボドキシンおよびチオレドキシンの形態でもたらされ得る。還元当量、特にNADH、NADPH、および還元型フェレドキシンは、RTCAサイクル酵素、例えば、マレートデヒドロゲナーゼ、フマレートレダクターゼ、アルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ(あるいは2−オキソグルタレート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アルファ−ケトグルタレートシンターゼ、または2−オキソグルタレートシンターゼとしても知られている)、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびイソシトレートデヒドロゲナーゼについての補因子として機能し得る。これらの還元当量からの電子は、代替として、それらが、酸素、窒素、酸化金属イオン、プロトン、または電極などの受容体に移動する電子伝達鎖を生成するイオン勾配を通過できる。次いで、イオン勾配は、ATPシンターゼまたは類似酵素によりATP生成のために使用され得る。
還元的TCAサイクルは、緑色硫黄光合成細菌クロロビウム・リミコーラ(Chlorobium limicola)において最初に報告されていた(Evansら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.55:928−934(1966)
)。同様の経路が、一部の原核生物(プロテオバクテリア、緑色硫黄細菌および好熱性水素酸化細菌)および硫黄依存性古細菌において特徴付けられている(Huglerら,J.Bacteriol.187:3020−3027(2005;Huglerら,Environ.Microbiol.9:81−92(2007))。一部の場合、還元および酸化(Krebs)TCAサイクルは同じ生物に存在する(Huglerら,前出(2007);Siebersら,J.Bacteriol.186:2179−2194(2004))。一部のメタン細菌および偏性嫌気性菌は、生合成中間体を合成する機能をし得る不完全酸化または還元的TCAサイクルを保有している(Ekielら,J.Bacteriol.162:905−908(1985):Woodら,FEMS Microbiol.Rev.28:335−352(2004))。
還元的TCAサイクルの重要な炭素固定酵素は、アルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびイソシトレートデヒドロゲナーゼである。さらなる炭素は、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼカルボキシキナーゼによるホスホエノールピルベートのオキサロアセテートへの変換、またはリンゴ酸酵素によるピルベートのリンゴ酸塩への変換の間、固定され得る。
TCAサイクルにおける酵素の多くは、可逆的であり、還元および酸化方向において反応を触媒できる。しかしながら、一部のTCAサイクル反応は、インビボにおいて不可逆的であるので、異なる酵素が、逆TCAサイクルに必要な方向においてこれらの反応を触媒するために使用される。これらの反応は、(1)クエン酸塩のオキサロアセテートおよびアセチル−CoAへの変換、(2)フマレートのスクシネートへの変換、および(3)スクシニル−CoAのアルファ−ケトグルタレートへの変換である。TCAサイクルにおいて、クエン酸塩は、オキサロアセテートおよびアセチル−CoAの濃縮から形成される。逆反応、クエン酸塩のオキサロアセテートおよびアセチル−CoAへの開裂は、ATP依存性であり、ATP−シトレートリアーゼ、またはシトリル−CoAシンテターゼおよびシトリル−CoAリアーゼにより触媒される。あるいは、シトレートリアーゼは、アセチル−CoAシンテターゼ、アセチル−CoAトランスフェラーゼ、またはホスホトランスアセチラーゼおよびアセテートキナーゼに結合されて、クエン酸からアセチル−CoAおよびオキサロアセテートを形成し得る。スクシネートのフマレートへの変換はスクシネートデヒドロゲナーゼにより触媒されるのに対して、逆反応はフマレートレダクターゼにより触媒される。TCAサイクルにおいて、スクシニル−CoAは、アルファ−ケトグルタレートデヒドロロゲナーゼ複合体によるアルファ−ケトグルタレートのNAD(P)+依存性脱カルボキシル化から形成される。逆反応は、アルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレダクターゼにより触媒される。
1)CO、2)CO2およびH2、3)COおよびCO2、4)COおよびH2を含む合成ガス、ならびに5)CO、CO2およびH2を含む合成ガスまたは他の気体炭素源でアセチル−CoA由来生産物を生産できる逆トリカルボン酸サイクルを利用できる生物は、以下の酵素活性:ATP−シトレートリアーゼ、リアーゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、アルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマレートレダクターゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、アセチル−CoAトランスフェラーゼ、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、およびフェレドキシンのいずれかを含み得る(図23を参照のこと)。これらの活性に必要な酵素および対応する遺伝子は本明細書上記に記載されている。
合成ガスまたは他の気体炭素源由来の炭素は、逆TCAサイクルおよびその成分により固定され得る。具体的には、特定の炭素ガス利用経路成分と、アセチル−CoAから2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエンを形成するための経路との組み合わせの結果、外から供給されるか、またはCOからアセチル−CoAへの内生的に生産される二酸化炭素に存在する炭素を固定するための効果的な機構を与えることによりこれらの生産物の高収率が得られる。
一部の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物における2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエン経路は、還元的TCAサイクルを駆動するための付加を含む、還元に関与する、生合成工程の収率を高めるために、(1)CO、(2)CO2、(3)H2、またはそれらの混合物のいずれかの組み合わせを利用できる。
一部の実施形態において、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、還元的TCA経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む。少なくとも1つの外因性核酸は、ATP−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択され;また、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼNAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびフェレドキシンから選択される少なくとも1つの外因性核酸は、(1)CO、(2)CO2、(3)H2、(4)CO2およびH2、(5)COおよびCO2、(6)COおよびH2、または(7)CO、CO2、およびH2を利用できるように十分な量で発現される。
一部の実施形態において、方法は、還元的TCA経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸も含む、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物を培養する工程を含む。少なくとも1つの外因性核酸は、ATP−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、アルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される。さらに、このような生物はまた、生産物を生産するために(1)CO、(2)CO2、(3)H2、(4)CO2およびH2、(5)COおよびCO2、(6)COおよびH2、または(7)CO、CO2、およびH2を利用できるように十分な量で発現される、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびフェレドキシンから選択される少なくとも1つの外因性酵素を含み得る。
一部の実施形態において、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物はさらに、アセチル−CoAを介する炭素フラックスを高めるのに十分な量で発現される還元的TCA経路の酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む。少なくとも1つの外因性核酸は、ATP−シトレートリアーゼ、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、アコニターゼおよびアルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される。
一部の実施形態において、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、一酸化炭素および/または水素の存在下で還元当量の能力を高めるのに十分な量で発現される酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含み、それにより、炭水化物ベースの炭素原料による酸化還元が制限された生産物の収率を増加させる。少なくとも1つの外因性核酸は、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびフェレドキシンから選択される。一部の実施形態において、本発明は、一酸化炭素または水素の存在下で還元当量の能力を高める方法を提供し、それにより、糖または気体炭素源などの炭水化物ベースの炭素原料による酸化還元が制限された生産物の収率を増加させ、この方法は、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエンを生産するための条件下で、かつ、十分な期間、この非天然に生じる微生物を培養する工程を含む。
一部の実施形態において、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、還元的TCA経路の酵素を各々コードする2つの外因性核酸を含む。一部の実施形態において、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、還元的TCA経路の酵素を各々コードする3つの外因性核酸を含む。一部の実施形態において、非天然に生じる微生物は、ATP−シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする3つの外因性核酸を含む。一部の実施形態において、非天然に生じる微生物は、シトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、およびアルファ−ケトグルタレート:フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする3つの外因性核酸を含む。
一部の実施形態において、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物はさらに、ピルベート:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸を含む。
一部の実施形態において、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物はさらに、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチル−CoAシンターゼ、フェレドキシン、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする外因性核酸を含む。
一部の実施形態において、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、(1)CO、(2)CO2、(3)CO2およびH2、(4)COおよびH2、または(5)CO、CO2、およびH2から選択される炭素原料を利用する。一部の実施形態において、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、還元当量のために水素を利用する。一部の実施形態において、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、還元当量のためにCOを利用する。一部の実施形態において、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物は、還元当量のためにCOおよび水素の組み合わせを利用する。
一部の実施形態において、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物はさらに、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ピルベートカルボキシラーゼ、およびリンゴ酸酵素から選択される酵素をコードする1つ以上の核酸を含む。
一部の実施形態において、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物はさらに、マレートデヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、フマレートレダクターゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、およびスクシニル−CoAトランスフェラーゼから選択される酵素をコードする1つ以上の核酸を含む。
一部の実施形態において、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、または1,3−ブタジエン経路を有する非天然に生じる微生物はさらに、シトレートリアーゼ、ATP−シトレートリアーゼ、シトリル−CoAシンテターゼ、シトリル−CoAリアーゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、フマラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチレート、アセチル−CoAシンテターゼ、およびフェレドキシンをコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む。
一部の実施形態において、炭素原料およびリン酸塩、アンモニア、硫黄、塩素および他のハロゲンなどの他の細胞摂取源は、1,3−ブタジエンまたはいずれかの1,3−ブタジエン経路の中間体に存在する原子の同位体分布を変更させるように選択され得る。上記に列挙した種々の炭素原料および他の摂取源は、本明細中でまとめて「摂取源」と称する。摂取源は、生産物のトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路またはその途中のいずれかの中間体に存在するいずれかの原子についての同位体濃縮を提供できる。種々の炭素原料および上記に列挙した他の摂取源は、本明細書中でまとめて「摂取源」と称する。摂取源は、いずれかの時点で経路から離れて分岐して生成されたトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン不純物のいずれかを含む、生産物のトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンまたはトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の中間体に存在するいずれかの原子についての同位体濃縮を提供できる。同位体濃縮は、例えば、炭素、水素、酸素、窒素、硫黄、リン、塩素または他のハロゲンを含む、任意の標的原子に対して達成され得る。
一部の実施形態において、摂取源は、炭素−12、炭素−13および炭素−14の割合を変更させるように選択され得る。一部の実施形態において、摂取源は、酸素−16、酸素−17、および酸素−18の割合を変更させるように選択され得る。一部の実施形態において、摂取源は、水素、重水素、および三重水素の割合を変更させるように選択され得る。一部の実施形態において、摂取源は、窒素−14および窒素−15の割合を変更させるように選択され得る。一部の実施形態において、摂取源は、硫黄−32、硫黄−33、硫黄−34、および硫黄−35の割合を変更させるように選択され得る。一部の実施形態において、摂取源は、リン−31、リン−32、およびリン−33の割合を変更させるように選択され得る。一部の実施形態において、摂取源は、塩素−35、塩素−36、および塩素−37の割合を変更させるように選択され得る。
一部の実施形態において、摂取源の標的同位体の割合は、摂取源の合成化学濃縮により得られ得る。そのような同位体が濃縮された摂取源は、商業的に購入され得るか、または実験室で調製され得る。一部の実施形態において、摂取源の標的同位体の割合は、天然の摂取源の源を選択することにより得られ得る。一部のこのような実施形態において、炭素原は、例えば、炭素−14が比較的少なくなり得る化石燃料、または石油由来の対応物より多量の炭素−14を有し得る環境の炭素源、例えばCO2由来の炭素源から選択され得る。
同位体濃縮は、安定同位体比質量分析(SIRMS)および核磁気共鳴による部位特異的天然同位体分別(SNIF−NMR)などの当該技術分野において公知の技術を用いて質量分析により容易に評価される。このような質量分析技術は、液体クロマトグラフィー(LC)および/または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などの分離技術と一体化されてもよい。
一部の実施形態において、本発明は、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンあるいは大気中炭素摂取源を反映する炭素−12、炭素−13、および炭素−14の割合を有するトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン中間体を提供する。一部のこのような実施形態において、摂取源はCO2である。一部の実施形態において、一部の実施形態において、本発明は、石油ベースの炭素摂取源を反映する炭素−12、炭素−13、および炭素−14の割合を有するトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの中間体を提供する。一部の実施形態において、本発明は、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンあるいは大気中炭素摂取源と石油ベースの摂取源との組み合わせにより得られる炭素−12、炭素−13、および炭素−14の割合を有するトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの中間体を提供する。摂取源のこのような組み合わせは、炭素−12、炭素−13、および炭素−14の割合を変更させ得る1つの手段である。
従って、本明細書に提供される教示および指針を考慮して、当業者は、炭水化物などの炭素源で増殖する場合、本発明の生合成した化合物を分泌する非天然に生じる微生物が生産され得ることを理解するだろう。そのような化合物には、例えば、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンおよびトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路における中間代謝物のいずれかが含まれる。必要なもの全ては、例えば、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生合成経路の内容物を含む、所望の化合物または中間体の生合成を達成するために、必要な酵素またはタンパク質活性の1つ以上において操作することである。従って、本発明は、炭水化物または他の炭素源で増殖する場合、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを生産および/または分泌し、また、炭水化物または他の炭素源で増殖する場合、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路において示される中間代謝物のいずれかを生産および/または分泌する非天然に生じる微生物を提供する。本発明のトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを生産する微生物は、中間体、例えば、フェニルアラニン、フェニルピルベート、フェニルアセトアルデヒド、フェニルアセテート、ベンゾイル−CoA、3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoA、[(3−オキソ−3−フェニルプロピオニル)オキシ]ホスホネート、ベンゾイルアセテート、アセトフェノン、1−フェニルエタノール、trans,trans−ムコネート、cis,trans−ムコネート、cis,cis−ムコネート、trans−2,4−ペンタジエノエート、およびcis−2,4−ペンタジエノエートから合成を開始できる。さらなる例として、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート経路の中間体は、1−デオキシ−D−キシルロース−5−ホスフェートまたはC−メチル−D−エリトリトール−4−ホスフェートであり得る(実施例IIIおよび図5を参照のこと)。p−トルエート経路の中間体は、例えば、2,4−ジヒドロキシ−5−メチル−6−[(ホスホノオキシ)メチル]オキサン−2−カルボキシレート、1,3−ジヒドロキシ−4−メチル−5−オキソシクロヘキサン−1−カルボキシレート、5−ヒドロキシ−4−メチル−3−オキソシクロヘキシ−1−エン−1−カルボキシレート、3,5−ジヒドロキシ−4−メチルシクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート、5−ヒドロキシ−4−メチル−3−(ホスホノオキシ)シクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート、5−[(1−カルボキシエト−1−エン−1−イル)オキシ]−4−メチル−3−(ホスホノオキシ)シクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート、または3−[(1−カルボキシエト−1−エン−1−イル)オキシ]−4−メチルシクロヘキサ−1,5−ジエン−1−カルボキシレートであり得る(実施例IVおよび図6を参照のこと)。テレフタレート中間体は、例えば、4−カルボキシベンジルアルコールまたは4−カルボキシベンズアルデヒドであり得る(実施例Vおよび図7を参照のこと)。
本明細書に開示されるように、p−トルエートおよびベンゾエートは、非天然に生じる微生物の対象であり得る例示的な中間体である。このようなカルボキシレートはイオン化形態または完全にプロトン化形態で生じ得る。従って、接尾語「−エート」、または酸形態は、特にイオン化形態が、化合物が見られるpHに依存することが知られているため、遊離酸形態および任意の脱プロトン化形態の両方を説明するために交換可能に使用され得る。本発明に従って利用可能なプロピオネート産物は、O−カルボキシレートおよびS−カルボキシレートエステルなどのエステル形態を含むことが理解される。O−およびS−カルボキシレートは、C1〜C6、分岐または直鎖カルボキシレートである低級アルキルを含み得る。一部のこのようなO−またはS−カルボキシレートには、限定されないが、メチル、エチル、n−プロピル、n−ブチル、i−プロピル、sec−ブチル、およびtert−ブチル、ペンチル、ヘキシルO−またはS−カルボキシレートが含まれ、それらのいずれかはさらに、例えば、プロぺニル、ブテニル、ペンチル、およびヘキセニルO−またはS−カルボキシレートを与える、不飽和を有し得る。O−カルボキシレートは生合成経路の生産物であり得る。生合成経路により利用可能な例示的なO−カルボキシレートには、限定されないが、メチルプロピオネート、エチルプロピオネート、およびn−プロピルプロピオネートが含まれ得る。他の生合成的に利用可能なO−プロピオネートには、長鎖基に対する媒体、すなわち、C7〜C22、脂肪アルコール由来のO−プロピオネートエステル、例えば、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ラウリル、トリデシル、ミリスチル、ペンタデシル、セチル、パルミトリル、ヘプタデシル、ステアリル、ノンアデシル、アラチジル、ヘネイコシルおよびベヘニルアルコールが含まれ得、それらのいずれか1つは、必要に応じて分岐され得、および/または不飽和を含み得る。O−プロピオネートエステルはまた、遊離カルボン酸生産物のエステル化またはO−もしくはS−プロピオネートのエステル交換などの生合成または化学プロセスにより利用可能であり得る。
本発明の非天然に生じる微生物は、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを生産するのに十分な量のトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の酵素またタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸を外因的に発現させる、本明細書に例示されるような当該技術分野において周知の方法を用いて構築される。本発明の微生物は、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを生産するのに十分な条件下で培養されることは理解される。本明細書に提供される教示および指針に従って、本発明の非天然に生じる微生物は、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの生合成を達成でき、約0.1〜200mM以上の細胞濃度を生じる。通常、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの細胞内濃度は、約3〜150mM、特に約5〜125mM、より特には約10mM、20mM、50mM、80mMまたはそれ以上を含む、約8〜100mMである。これらの例示的な範囲の各々の間、およびそれ以上の細胞内濃度もまた、本発明の非天然に生じる微生物から達成されてもよい。
一部の実施形態において、培養条件は、嫌気性または実質的に嫌気性増殖あるいは維持条件を含む。例示的な嫌気性条件は以前に記載されており、当該技術分野において周知である。発酵プロセスについての例示的な嫌気性条件は、本明細書に記載されており、例えば、2007年8月10日に出願された米国特許出願公開第2009/0047719号に記載されている。これらの条件のいずれかが、非天然に生じる微生物および当該技術分野において周知の他の嫌気性条件と共に利用され得る。このような嫌気性または実質的に嫌気性条件下で、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生産物は、5〜10mM以上および本明細書に例示される全ての他の濃度の細胞内濃度でトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを合成できる。上記の説明は細胞内濃度を指しているが、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを生産する微生物は、細胞内にトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを生産でき、および/または培地中に生産物を分泌できることが理解される。
本明細書に開示される培養および発酵条件に加えて、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの生合成を達成するための増殖条件は、培養条件に浸透圧保護剤の添加を含み得る。特定の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、浸透圧保護剤の存在下で本明細書に記載されるように、維持、培養または発酵され得る。手短に述べると、浸透圧保護剤は、浸透圧調節物質として作用し、本明細書に記載される微生物が浸透圧に対して生存するのを助ける化合物を指す。浸透圧保護剤には、限定されないが、ベタイン、アミノ酸および糖トレハロースが含まれる。このような非限定的な例は、グリシンベタイン、プラリネベタイン、ジメチルテチン、ジメチルスルホニオプロプリオネート、3−ジメチルスルホニオ−2−メチルプロプリオネート、ピペコリン酸、ジメチルスルホニオアセテート、コリン、L−カルニチンおよびエクトインがある。一態様において、浸透圧保護剤はグリシンベタインである。当業者は、浸透圧から本明細書に記載される微生物を保護するのに好適な浸透圧保護剤の量および種類は使用する微生物によることを理解する。培地条件において浸透圧保護剤の量は、例えば、約0.1mM以下、約0.5mM以下、約1.0mM以下、約1.5mM以下、約2.0mM以下、約2.5mM以下、約3.0mM以下、約5.0mM以下、約7.0mM以下、約10mM以下、約50mM以下、約100mM以下または約500mM以下であり得る。
培養条件は、例えば、液体培養処理および発酵ならびに他の大規模処理を含み得る。本明細書に記載されるように、本発明の生合成生産物の特に有用な収率は、嫌気性または実質的に嫌気性培養条件下で得られ得る。
本明細書に記載されるように、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの生合成を達成するための1つの例示的な増殖条件は、嫌気性培養または発酵条件を含む。特定の実施形態において、本発明の非天然に生じる微生物は、嫌気性または実質的に嫌気性条件下で維持、培養または発酵され得る。手短に述べると、嫌気性条件は環境中に酸素がないことを指す。実質的に嫌気性条件は、例えば、培地中の溶解酸素濃度が飽和の0〜10%で存在する、培養、バッチ発酵または連続発酵を含む。実質的に嫌気性条件はまた、1%未満の酸素の雰囲気に維持される密閉チャンバ内の液体培地中または固体寒天上の増殖または静止細胞を含む。酸素の割合は、例えば、培地にN2/CO2混合物または他の好適な非酸素ガス(複数も含む)を散布することによって維持され得る。
本明細書に記載される培養条件は、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを製造するためにスケールアップされ、連続して増殖され得る。例示的な増殖手順は、例えば、供給バッチ発酵およびバッチ分離:供給バッチ発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離を含む。これらのプロセスの全ては当該技術分野において周知である。発酵処理は特に、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの市販量の生合成生産に有用である。通常、および非連続培養処理と同様に、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの連続および/またはほぼ連続生産は、対数増殖期の増殖を維持および/またはほぼ持続させる十分な栄養素および培地中で、非天然に生じるトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンを生産する本発明の微生物を培養することを含む。このような条件下での連続培養は、例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日または7日以上の増殖を含み得る。さらに、連続培養は、1週間、2週間、3週間、4週間または5週間またはそれ以上から数ヶ月の長い期間を含み得る。あるいは、特定の用途に適切である場合、本発明の微生物は数時間培養されてもよい。連続および/またはほぼ連続培養条件はまた、これらの例示的な期間の間の全ての時間間隔を含み得ることは理解される。本発明の微生物を培養する時間は、所望の目的のための生産物の十分な量を生産するのに十分に長い期間であることはさらに理解される。
発酵処理は当該技術分野において周知である。手短に述べると、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの生合成生産のための発酵は、例えば、供給バッチ発酵およびバッチ分離;供給バッチ発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離に利用され得る。バッチおよび連続発酵処理の例は当該技術分野において周知である。
十分な量のトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの連続生産のための本発明のトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生産物を用いる上記の発酵処理に加えて、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン生産物はまた、例えば、生産物を他の化合物に変換するために化学合成手順に同時に供され得るか、または生産物は発酵培地から分離されて、所望の場合、生産物を他の化合物に変換するために化学変換に連続して供され得る。
より良い生産物を生成するために、代謝モデリングは増殖条件を最適化するために利用され得る。モデリングはまた、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計するために使用され得る(例えば、米国特許出願公開第2002/0012939号、同第2003/0224363号、同第2004/0029149号、同第2004/0072723号、同第2003/0059792号、同第2002/0168654号、および同第2004/0009466号、ならびに米国特許第7,127,379号を参照のこと)。モデリング分析は、代謝をより効果的なトルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの生産にシフトする細胞増殖に対する効果の信頼可能な予測を可能にする。
所望の生産物の生合成を支持する代謝変化を識別および設計するための1つのコンピューターによる方法は、OptKnockコンピューターフレームワークである(Burgardら,Biotechnol.Bioeng.84:647−657(2003))。OptKnockは、遺伝子欠失または標的生産物を過剰生産する遺伝子的に安定な微生物を生じる破壊ストラテジーを教示する代謝モデリングおよびシミュレーションプログラムである。具体的には、フレームワークは、所望の生化学物質を細胞増殖の副産物に強制的にする遺伝子操作を教示するために、微生物の完全な代謝および/または生化学ネットワークを調べる。戦略的に置かれた遺伝子欠失または他の機能的遺伝子破壊の間にわたって生化学的産物を細胞増殖と関連付けることによって、バイオリアクタにおける長期間後の遺伝子操作された株に負荷される選択圧は、強制された増殖と関連した生化学生産物の結果として性能の向上を導く。最後に、遺伝子欠失が構築される場合、それらの野生型状態に戻る設計された株のごくわずかな可能性が存在する。なぜなら、OptKnockにより選択された遺伝子は、ゲノムから完全に除去されるからである。従って、このコンピューターによる方法は、所望の生産物の生合成を導く代替経路を識別するために使用され得るか、または所望の生産物の生合成のさらなる最適化のために非天然に生じる微生物と共に使用され得る。
手短に述べると、本明細書で使用するOptKnockという用語は、細胞代謝をモデリングするためのコンピューターによる方法およびシステムを指す。OptKnockプログラムは、特定の制限をフラックスバランス分析(FBA)モデルに組み込むモデルおよび方法のフレームワークに関連する。これらの制限は、例えば、定性的動態情報、定性的規制情報、および/またはDNAマイクロアレイ実験データを含む。OptKnockはまた、例えば、フラックスバランスモデル由来のフラックス境界を狭くし、続いて、遺伝子付加または欠失の存在下で代謝ネットワークの性能限界を調べることによって、種々の代謝問題に対する解をコンピューターで計算する。OptKnockコンピューターフレームワークは、代謝ネットワークの性能限界の効果的なクエリーを可能にするモデル形成の構築を可能にし、得られる混合整数線形計画問題を解決するための方法を提供する。本明細書中でOptKnockと称される代謝モデリングおよびシミュレーション法は、例えば、2002年1月10日に出願された米国特許出願公開第2002/0168654号、2002年1月10日に出願された国際特許出願PCT/US02/00660号、および2007年8月10日に出願された米国特許出願第2009/0047719号に記載されている。
生産物の生合成生産物を支持する代謝変化を識別および設計するための別のコンピューターによる方法は、SimPheny(登録商標)と呼ばれる代謝モデリングおよびシミュレーションシステムである。このコンピューターによる方法およびシステムは、例えば、2002年6月14日に出願された米国特許出願第2003/0233218号および2003年6月13日に出願された国際公開PCT/US03/18838号に記載されている。SimPheny(登録商標)は、コンピューター内でネットワークモデルを生成し、システムにおける化学反応のいずれかおよび全ての可能な機能性を含む解空間を定義するために生物学的システムの化学反応による質量、エネルギーまたは電荷のフラックスをシミュレートし、それにより、生物学的システムのための許容された活性の範囲を決定するために使用され得るコンピューターによるシステムである。このアプローチは制約ベースのモデリングと称される。なぜなら、解空間は、含まれる反応および反応熱力学の既知の化学量論ならびに反応の間の最大フラックスと関連した容量制約などの制約により規定されるからである。これらの制約により定義される空間は、生物学的システムまたはその生化学成分の表現型能力および挙動を決定するために問い合わせされ得る。
生物学的システムは、フレキシブルであり、多くの異なる方法において同じ結果に到達し得るので、これらのコンピューターによるアプローチは生物学的事実と一致する。生物学的システムは、全ての生物系が直面しなければならない基本的制約によって制限されている進化機構を介して設計される。従って、制約に基づいたモデリングストラテジーはこれらの一般的事実を包含する。さらに、制約を狭くすることによってネットワークモデルに連続してさらなる制約を課す能力により、解空間のサイズの減少が生じるので、生理学的機能または表現型が予測され得る精度が向上する。
本明細書に提供される教示および指針を考慮して、当業者は、代謝モデリングおよびシミュレーションのための種々のコンピューターフレームワークを、宿主微生物における所望の化合物の生合成の設計および実施に適用することができるだろう。このような代謝モデリングおよびシミュレーション法は、例えば、SimPheny(登録商標)およびOptKnockなどの上記に例示されるようなコンピューターによるシステムを含む。本発明の例示のために、一部の方法は、モデリングおよびシミュレーションのためのOptKnock計算フレームワークに対する参照と共に本明細書に記載される。当業者は、OptKnockを用いる代謝変化の識別、設計および実施を、このような他の代謝モデリングおよびシミュレーション計算フレームワークならびに当該技術分野における周知の方法に適用する方法を知っているだろう。
上記の方法は、破壊するための代謝反応の1つのセットを与える。セットまたは代謝修飾内の各反応の除外により、生物の増殖期の間の必須生産物として所望の生産物が得られ得る。その反応は知られているため、二相OptKnock問題の解もまた、反応のセット内の各反応を触媒する1つ以上の酵素をコードする関連遺伝子(複数も含む)を提供する。反応のセットおよび各反応に関与する酵素をコードするそれらの対応する遺伝子の識別は、通常、自動化プロセスであり、酵素とコード遺伝子との間の関係を有する反応データベースと反応の相互関係によりなされる。
一旦識別されると、所望の生産物の生産を達成するために破壊され得る反応のセットは、セット内の各代謝反応をコードする少なくとも1つの遺伝子の機能的破壊により標的細胞または生物において実施される。反応セットの機能的破壊を達成するための1つの特に有用な手段は、各コード遺伝子の欠失による。しかしながら、一部の例において、例えば、調節因子のためのプロモーターまたはcis結合部位などの調節領域の突然変異、欠失を含む他の遺伝子異常により、あるいは多くの位置のいずれかにおけるコード配列の切断により反応を破壊することは有益であり得る。例えば、生産物の結合の迅速な評価が所望される場合、または遺伝的逆転が生じる可能が低い場合、これらの後の異常は、有用であり得る遺伝子セットの全ての欠失より少ない欠失を生じる。
所望の生産物の増殖に関連した生合成を含む、生合成を生じ得る破壊または代謝修飾するために反応のさらなるセットを導く上記の二相OptKnock問題に対するさらなる生産的解を識別するために、整数カットと呼ばれる、最適化方法が実施され得る。この方法は、各々の反復における整数カットと称されるさらなる制約の組み込みと共に上記に例示したOptKnock問題を反復して解くことにより進められる。整数カットの制約は、生産物生合成を増殖に強制的に関連させる任意の以前の反復において識別された正確な同じセットの反応を選択することから解決手順を効果的に防止する。例えば、以前に識別された増殖と関連した代謝修飾が、破壊するための反応1、2および3を特定する場合、以下の制約は、同じ反応が、後の解において同時に考慮されることを防止する。整数カット法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Burgardら,Biotechnol.Prog.17:791−797(2001)の記載に見出され得る。代謝モデリングおよびシミュレーションのためのOptKnock計算フレームと併せたそれらの使用に対する参照と共に本明細書に記載される全ての方法と同様に、反復計算分析において冗長性を減少させる整数カット法もまた、例えば、SimPheny(登録商標)を含む、当該技術分野において周知の他の計算フレームワークと共に適用され得る。
本明細書に例示される方法は、標的生化学生産物の生産を、識別される遺伝子変化を有するように遺伝子操作された細胞または生物の増殖に強制的に関連させることを含む、所望の生産物を生合成的に生産する細胞および生物の構築を可能にする。従って、本明細書に記載されるコンピューターによる方法は、OptKnockまたはSimPheny(登録商標)から選択されるコンピューター内での方法により識別される代謝修飾の識別および実施を可能にする。代謝修飾のセットは、例えば、1つ以上の生合成経路の酵素および/または例えば遺伝子欠失による破壊を含む、1つ以上の代謝反応の機能的破壊の付加を含み得る。
上で議論したように、OptKnock方法は、突然変異微生物ネットワークが、長期間の増殖選択に供される場合、それらのコンピューターにより予測された最大増殖表現型に対して進化され得るという前提で開発された。つまり、そのアプローチは、選択圧下で自己最適化する生物の能力を活用する。OptKnockフレームワークは、ネットワーク化学量論に基づいて生化学生産物と細胞増殖とを強制的に関連させる遺伝子欠失の組み合わせの包括的な列挙を可能にする。最適遺伝子/反応ノックアウトの識別は、得られるネットワークについての最適増殖解が対象の生化学物質を過剰生産するように活性反応のセットを選択する二相最適化問題の解を必要とする(Burgardら,Biotechnol.Bioeng.84:647−657(2003))。
大腸菌代謝のコンピューター内での化学量論は、以前に例示され、例えば、米国特許出願公開第2002/0012939号、同第2003/0224363号、同第2004/0029149号、同第2004/0072723号、同第2003/0059792号、同第2002/0168654号および同第2004/0009466号、ならびに米国特許第7,127,379号に記載されるような代謝経路のための必須遺伝子を識別するために利用され得る。本明細書に開示されるように、OptKnock数学的フレームワークは、所望の生産物の増殖と関連した生産を導くピンポイントの遺伝子欠失に適用され得る。さらに、二相OptKnock問題は、欠失の1つのセットのみを提供する。全ての有意義な解、すなわち、増殖と関連した生産物形成を導く全てのセットのノックアウトを列挙するために、整数カットと呼ばれる最適化技術が実施され得る。これは、上で議論したように各々の反復において整数カットと称されるさらなる制約の組み込みを有するOptKnock問題を反復して解決することを必要とする。
本明細書に開示されるように、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の所望の活性をコードする核酸が宿主生物内に導入され得る。一部の場合、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエンの生産を増加させるために、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の酵素またはタンパク質の活性を修飾することが好適であり得る。例えば、タンパク質または酵素の活性を増加させる既知の突然変異がコード核酸分子内に導入され得る。さらに、最適化方法が、酵素もしくはタンパク質の活性を増加させ、および/または阻害活性を減少させ、例えば負の調節因子の活性を減少させるために適用され得る。
1つのこのような最適化方法は指向進化である。指向進化は、酵素の特性を改良および/または変更させるために特異的遺伝子に標的とされる突然変異の導入を含む強力なアプローチである。改良および/または変更された酵素は、多くの酵素変異体(例えば>104)の自動化スクリーニングを可能にする感受性高スループットスクリーニングアッセイの開発および実施により識別され得る。突然変異生成およびスクリーニングの反復ラウンドは典型的に、最適化された特性を有する酵素に影響を与えるように実施される。突然変異生成のための遺伝子の領域を識別するのに役立ち得る計算アルゴリズムもまた開発されており、生成およびスクリーニングするのに必要とする酵素変異体の数を顕著に減少させ得る。多くの指向進化技術が、種々の変異体ライブラリーの作製に効果的であるように開発されており(レビューのために、Hibbertら,Biomol.Eng 22:11−19(2005);Huisman and Lalonde,In Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries pgs.717−742(2007),Patel(ed.),CRC Press;Otten and Quax.Biomol.Eng22:1−9(2005).;ならびにSenら,Appl Biochem.Biotechnol 143:212−223(2007)を参照のこと)、それらの方法は、多くの酵素クラスにわたる広範囲の特性の改良に首尾良く適用されている。指向進化技術により改良および/または変更される酵素特性は、例えば、非天然に物質を変換するための選択性/特異性;強力な高温処理のための温度安定性;低または高pH条件下での生物学的処理のためのpH安定性;高生産物力価が達成され得るように、基質または生産物耐性;非天然の物質を含むように広範囲の基質結合を含む、結合(Km);生産物、基質、または重要な中間体による阻害を除去するための阻害(Ki);所望のフラックスを達成させるために酵素反応速度を増加させるための活性(kcat);タンパク質収率および全経路のフラックスを増加させるための発現レベル;好気性条件下で空気感受性酵素を作用するための酸素安定性;ならびに酸素の非存在下で好気性酸素を作用するための嫌気性活性、を含む。
特定の酵素の望ましい特性を目的とする突然変異生成および遺伝子の多様化のための多くの例示的な方法が開発されている。そのような方法は当業者に周知である。それらの任意のものが、トルエン、ベンゼン、p−トルエート、テレフタレート、(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホネート、(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホネート、ベンゾエート、スチレン、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1オールまたは1,3−ブタジエン経路の酵素またはタンパク質の活性を変更および/または最適化するために使用され得る。そのような方法は、限定されないが、PCR反応においてDNAポリメラーゼの忠実度を減少させることによりランダム点突然変異を導入する、EpPCR;(Pritchardら,J.Theor.Biol.234:497−509(2005));環状プラスミドが、テンプレートとして使用され、最後の2つのヌクレオチド上にエキソヌクレアーゼ耐性チオホスフェート連結を有するランダム6−merが、プラスミドを増幅させるために使用され、続いて、プラスミドがタンデムリピートにおいて再環状にされる細胞内に形質転換されることを除いて、epPCRと同様のエラープローンローリングサークル増幅(epRCA)(Fujiiら,Nucleic Acids Res.32e145(2004);およびFujiiら,Nat.Protoc.1:2493−2497(2006));典型的に、DNAポリメラーゼの存在下でアニーリングおよび伸長の周期によって再構築されるランダム断片のプールを生じて、キメラ遺伝子のライブラリーを作製するために、DnaseIまたはEndoVなどのヌクレアーゼを用いた2以上の変異遺伝子の消化を包含する、DNAまたはファミリーシャッフリング(Stemmer,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:10747−10751(1994);およびStemmer,Nature370:389−391(1994));テンプレート刺激後に、変性および非常に短い時間のアニーリング/伸長(5秒程度短い。)を用いる反復した周期の2工程PCRを必要とする、付着伸長(StEP)(Zhaoら,Nat.Biotechnol.16:258−261(1998));ランダム配列プライマーを使用して、テンプレートの異なるセグメントと相補的な多くの短いDNA断片を作製する、ランダム刺激組換え(RPR)(Shaoら,Nucleic Acids Res 26:681−683(1998))を含む。
さらなる方法は、直鎖状プラスミドDNAを使用して、ミスマッチ修復によって修復されるヘテロ二本鎖を形成する、ヘテロ二本鎖組換え(Volkovら,Nucleic Acids Res.27:e18(1999);およびVolkovら,Methods Enzymol.328:456−463(2000));DnaseI断片化と一本鎖DNA(ssDNA)のサイズ分画とを採用する、一過性テンプレートにおけるランダムキメラ形成(RACHITT)(Cocoら.,Nat.Biotechnol.19:354−359(2001));テンプレートのプールとして使用される一方向性ssDNA断片の存在下でプライマーから一方向性に増殖する鎖のテンプレート切り替えを必要とする、切断型テンプレートに関する組換え伸長(RETT)(Leeら,J.Molec.Catalysis26:119−129(2003));縮重プライマーが、分子間の組換えを制御するために使用される、縮重オリゴヌクレオチド遺伝子シャッフリング(DOGS)(BergquistおよびGibbs,Methods Mol.Biol.352:191−204(2007);Bergquistら,Biomol.Eng.22:63−72(2005);Gibbsら,Gene271:13−20(2001));対象の遺伝子または遺伝子断片の1塩基対の欠失をともなうコンビナトリアルライブラリーを作製する、ハイブリッド酵素の作製のための増加性切断(ITCHY)(Ostermeierら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:3562−3567(1999);およびOstermeierら,Nat.Biotechnol.17:1205−1209(1999));ITCHYとほぼ同じであるが、例外は、ホスホチオアートdNTPを使用して切断を生じる、ハイブリッド酵素の作製のためのチオ−増加性切断(THIO−ITCHY)(Lutzら,Nucleic Acids Res.29:E16(2001));組換え遺伝子のための2つの方法、ITCHYおよびDNAシャッフリングを組み合わせた、SCRATCHY(Lutzら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:11248−11253(2001));突然変異は、epPCR後の、使用可能な活性を保持するものについてのスクリーニング/選択を介して実施される、ランダム浮動突然変異誘発(RNDM)(Bergquistら,Biomol.Eng.22:63−72(2005));ホスホチオアートヌクレオチドのランダム組み込みおよび切断を用いてランダム長断片のプールを生じるランダム突然変異誘発法であり、このプールをテンプレートとして使用して、イノシンなどの「普編的な」塩基の存在下で伸長し、イノシン含有相補物の複製は、ランダムな塩基組み込みおよび結果として突然変異誘発を与える、配列飽和突然変異誘発(SeSaM)(Wongら,Biotechnol.J.3:74−82(2008);Wongら,Nucleic Acids Res.32:e26(2004);およびWongら,Anal.Biochem.341:187−189(2005));重複するオリゴヌクレオチドを設計して、「標的におけるすべての遺伝的多様性」をコードし、シャッフリングされた後代について非常に高い多様性を可能にする、合成シャッフリング(Nessら,Nat.Biotechnol.20:1251−1255(2002));dUTPの組み込みに次ぐウラシルDNAグリコシラーゼおよびその後のピペリジンによる処理の組み合わせを活用して、エンドポイントDNA断片化を実施する、ヌクレオチド交換及び切除技術NexT(Mullerら,Nucleic Acids Res.33:e117(2005))を含む。
さらなる方法は、リンカーを使用して、2つの遠隔に関連したまたは関連していない遺伝子間の融合を促進させ、2つの遺伝子の間のある範囲のキメラを生じ、結果として、単一交差ハイブリッドのライブラリーを生じる、配列相同性非依存性タンパク質組換え(SHIPREC)(Sieberら,Nat.Biotechnol.19:456−460(2001));出発物質がインサートを有するスーパーコイル二本鎖DNA(dsDNA)プラスミドを含み、2つのプライマーは、突然変異に所望の部位で縮重する、遺伝子部位飽和突然変異誘発(商標)(GSSM(商標))(Kretzら,Methods Enzymol.388:3−11(2004));限定された領域を多数の起こり得るアミノ酸配列変更と置き換えるための短いオリゴヌクレオチドカセットの使用を包含する、コンビナトリアルカセット突然変異誘発(CCM)(Reidhaar−Olsonら,Methods Enzymol.208:564−586(1991);およびReidhaar−Olsonら,Science241:53−57(1988));CCMと本質的に同様であるが、高い突然変異率でのepPCRの使用により、ホットスポットおよびホット領域を同定した後、CMCMによる伸長で、タンパク質配列空間の規定された領域をカバーする、コンビナトリアル多重カセット突然変異誘発(CMCM)(Reetzら,Angew.Chem.Int.Ed Engl.40:3589−3591(2001));DNAポリメラーゼIIIの突然変異サブユニットをコードする、mutD5遺伝子を利用する、条件的tsミューテータープラスミドは、ランダムな20〜4000倍の増加と選択の間の天然の突然変異頻度とを可能にし、選択が必要とされない場合、有害な突然変異の蓄積を遮断させる、ミューテーター株技術(Selifonovaら,Appl.Environ.Microbiol.67:3645−3649(2001));Lowら,J.Mol.Biol.260:359−3680(1996))を含む。
さらなる例示的な方法は、選択されたアミノ酸の組み合わせ突然変異を評価および最適化する多次元突然変異誘発法である、探索型突然変異誘発(LTM)(Rajpalら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102:8466−8471(2005));複数の遺伝子に一度に、または単一の遺伝子のキメラ(複数の突然変異)の大きなライブラリーを作製することに適用することのできるDNAシャッフリング法であるである、遺伝子再構築(Verenium Corporationにより供給されるTunable GeneReassembly(商標)(TGR(商標))技術);特定の倍数を有する構造的に規定されたタンパク質骨格を固定し、かつ倍数および全体的なタンパク質エネルギー性を安定化させることのできるアミノ酸置換のための配列空間を検索する、最適化アルゴリズムであり、通常、既知の三次元構造を有するタンパク質に最も効果的に作用する、インシリコタンパク質設計自動化(PDA)(Hayesら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:15926−15931(2002));ならびに構造/機能の知識を使用して、酵素の改良にありがちな部位を選択すること、Stratagene QuikChange(Stratagene;San Diego CA)などの突然変異誘発法を使用して選択された部位における飽和突然変異誘発を実施すること、所望の特性についてのスクリーニング/選択、改良されたクローンを用いて、所望の活性が得られるまで、別の部位および持続した反復でやり直すことを包含する、反復性飽和突然変異誘発(ISM)(Reetzら,Nat.Protoc.2:891−903(2007);およびReetzら,Angew.Chem.Int.Ed Engl.45:7745−7751(2006))を含む。
変異誘発に関する上述の方法のいずれも、単独または任意の組み合わせで使用されてもよい。さらに、指向進化法のいずれか1つまたは組み合わせは、本明細書に記載されるような適応進化と併せて使用されてもよい。
実施例I
ベンゼン及びトルエンへの経路
この実施例は、フェニルアラニンからトルエン、フェニルアラニンからベンゼン、及びベンゾイル−CoAからスチレンへの経路を示す。
図1に、フェニルアラニンを酵素的に変換するための経路を示す。最初の工程は、アミノトランスフェラーゼ又は脱アミノ化オキシドレダクターゼによって行うことができる転換であるフェニルアラニンのフェニルピルビン酸への変換を含む。次いで、図1の工程Bにおいて、フェニルピルビン酸をフェニルアセトアルデヒドに脱炭酸する。脱カルボニル化によってフェニルアセトアルデヒドから直接(図1、工程E)、又はフェニル酢酸中間体を介して間接的に(図1、工程C及びD)トルエンを生成することができる。フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はフェニルアセトアルデヒドオキシダーゼのいずれかによって、フェニル酢酸をフェニル酢酸に酸化することができる(図1、工程C)。別の経路は、フェニルピルビン酸オキシダーゼによるフェニルピルビン酸のフェニル酢酸への直接酸化的脱炭酸(図1、工程F)である。
フェニルアラニンをベンゼンに酵素的に変換するための一段階経路を図2に示す。フェニルアラニン及び水から、ベンゼン、ピルビン酸塩及びアンモニアへの変換は、フェニルアラニンベンゼン−リアーゼ活性を有する酵素により触媒される。
ベンゾイル−CoAからのスチレンへの酵素的経路を図3に示す。ベンゾイル−CoAは、多数の生合成経路及び分解経路に共通の中間代謝産物である。ベンゾイル−CoAの生合成及び分解産物としてのベンゾイル−CoAの生成に関与する経路は、当技術分野において公知である。提唱されるスチレン経路では、まず、β−ケトチオラーゼによって、ベンゾイル−CoA及びアセチル−CoAを3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAに変換する(図3、工程A)。次いで、CoAヒドロラーゼ、トランスフェラーゼ又はシンテターゼによって、3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAのCoA部分が放出される(図3、工程B)。あるいは、ホスホトランス−3−オキソ−3−フェニルプロピオニラーゼ及びベンゾイル酢酸キナーゼによる2つの酵素的段階で3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAをベンゾイル酢酸に変換する(図3、工程F及びG)。形成されると、ベンゾイル酢酸は脱炭酸され、還元され、脱水されて、スチレンを形成する(図3、工程C、D及びE)。
図1〜3に示す転換を触媒するための酵素をEC番号(表1)により分類し、更に以下に記載する。
1.1.1.a オキシドレダクターゼ(オキソからアルコールへ):アセトフェノンの1−フェニルエタノールへの還元(図3の工程D)は、アセトフェノンレダクターゼ活性を有するケトンレダクターゼにより触媒される。この活性を有する酵素は、多数の生物において特性評価されており、生成物の形成は一般に立体選択性である。この活性を有する例示的な酵素は、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)のR特異的な短鎖デヒドロゲナーゼ/レダクターゼであり、これは、広範囲にわたって研究され、構造的に特性評価され、そして、補基質としてNADPHよりもNADHを好むように再改変されている(Schliebenら,J.Mol.Biol.349:801−813(2005年))。アセトフェノンレダクターゼ活性を有する更なる酵素は、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)のadhF1(Hildebrandtら,Appl.Microbiol Biotechnol.59:483−487(2002年))、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)(Pennacchioら,Appl.Environ.Microbiol 74:3949−3958(2008年))のadh及びレイフソニア属(Leifsonia)の種S749のLSADH(Inoueら,Biosci.Biotechnol.Biochem.70:418−426(2006年))によりコードされている。S特異的酵素は、脱窒素細菌であるアロマトレウム・アロマチカム(Aromatoleum aromaticum)EbN1のエチルベンゼン分解経路において特性評価された(Kniemeyerら,Arch.Microbiol.176:129−135(2001年))。pedによりコードされているこの酵素は、低pH(4)で還元方向を選好するが、中性pHでは酸化方向を選好する。
様々なアルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、ケトンのアルコール官能基への還元を触媒する。また、これら酵素はアセトフェノンの還元を触媒するのに適している。大腸菌(E.coli)におけるこのような2つの酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(mdh)及び乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhA)によりコードされている。ラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)に由来する乳酸デヒドロゲナーゼは、乳酸、2−オキソ酪酸、2−オキソペンタン酸及び2−オキソグルタル酸を含む様々な鎖長の2−ケト酸に対して高い活性を示すことが示されている(Steinbuchelら,Eur.J.Biochem.130:329−334(1983年))。2−ケトアジピン酸のα−ヒドロキシアジピン酸への変換は、ラット及びヒトの胎盤にみられることが報告されている酵素である2−ケトアジピン酸レダクターゼにより触媒され得る(Sudaら,Arch.Biochem.Biophys.176:610−620(1976年);Sudaら,Biochem.Biophys.Res.Commun.77:586−591(1977年))。更なるオキシドレダクターゼは、ヒトの心臓に由来するミトコンドリアの3−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ(bdh)であり、これは既にクローニングされ、特性評価されている(Marksら,J.Biol.Chem.267:15459−15463(1992年))。C.ベエイジェリンキー(C.beijerinckii)(Ismaielら,J.Bacteriol.175:5097−5105(1993年))及びT.ブロッキイ(T.brockii)(Lamedら,Biochem.J.195:183−190(1981年);Peretzら,Biochemistry 28:6549−6555(1989年))のアルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、アセトンをイソプロパノールに変換する。メチルエチルケトンレダクターゼ、あるいは2−ブタノールデヒドロゲナーゼは、MEKの還元を触媒して2−ブタノールを形成する。例示的なMEKレダクターゼ酵素は、ロドコッカス・ルーバー(Rhodococcus ruber)(Kosjekら,Biotechnol Bioeng.86:55−62(2004年))及びパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)(van derら,Eur.J.Biochem.268:3062−3068(2001年))において見出すことができる。
1.2.1.a オキシドレダクターゼ(アルデヒドから酸へ):フェニルアセトアルデヒドのフェニル酢酸への酸化は、ECクラス1.2.1における酵素であるフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼにより触媒される(図1の工程C)。NAD+依存性フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素(EC1.2.1.39)は、大腸菌、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)及びキンギョソウ(Antirrhinum majus)において特性評価されている(Longら,Plant J 59:256−265(2009年);Ariasら,Environ.Microbiol 10:413−432(2008年);Ferrandezら,FEBS Lett.406:23−27(1997年))。フェニルアセトアルデヒドに対して高い活性を有するNAD+依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素は、ウシ(Bos taurus)、ラット(Rattus norvegicus)及びヒト(Homo sapiens)等の哺乳類において特性評価されている(Klyosov,Biochemistry 35:4457−4467(1996年a);Lindahlら,J Biol.Chem.259:11991−11996(1984年))。ヒトの肝臓でみられる2つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ALDH−1及びALDH−2は、様々な脂肪族アルデヒド、芳香族アルデヒド及び多環式アルデヒド等の広い基質範囲を有し、フェニルアセトアルデヒドに対する活性が実証されている(Klyosov,Biochemistry 35:4457−4467(1996b))。badhによってコードされているシュードモナス・プチダのNADP+依存性ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼも、フェニルアセトアルデヒドに対する活性を示した(Yeungら,Biochim.Biophys.Acta 1784:1248−1255(2008年)))。フェニルアセトアルデヒドに対して高い活性を有するNAD+依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素は、ウシ、ラット及びヒト等の哺乳類においても特性評価されている(Klyosov,Biochemistry 35:4457−4467(1996年a);Lindahlら,J Biol.Chem.259:11991−11996(1984年))。ヒトの肝臓でみられる2つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ALDH−1及びALDH−2は、様々な脂肪族アルデヒド、芳香族アルデヒド及び多環式アルデヒド等の広い基質範囲を有し、フェニルアセトアルデヒドに対する活性が実証されている(Klyosov,Biochemistry 35:4457−4467(1996年b))。
1.2.3.a アルデヒドオキシダーゼ:O2依存性アルデヒドオキシダーゼ酵素を使用して、フェニルアセトアルデヒド又はフェニルピルビン酸をフェニル酢酸に変換することができる(図1の工程C及びF)。フェニルアセトアルデヒドオキシダーゼ酵素は、フェニルアセトアルデヒド、水及びO2をフェニル酢酸及び過酸化水素に変換する。例示的なフェニルアセトアルデヒドオキシダーゼ酵素は、メチロバチルス属(Methylobacillus)の種、シュードモナス属(Pseudomonas)の種、ストレプトミセス・モデラタス(Streptomyces moderatus)、モルモット(Cavia porcellus)、及びトウモロコシ(Zea mays)でみられる(Koshibaら,Plant Physiol 110:781−789(1996年))。トウモロコシの2つのフラビン−及びモリブデン−含有アルデヒドオキシダーゼは、zmAO−1及びzmAO−2によりコードされている(Sekimotoら,J Biol.Chem.272:15280−15285(1997年))。また、フェニルアセトアルデヒドオキシダーゼの活性は、マカラスムギ(Avena sativa)のインドール−3−アセトアルデヒドオキシダーゼ(EC1.2.3.7)においても実証されているが、この活性に関連する遺伝子は現在まで同定されておらず、トウモロコシのアルデヒドオキシダーゼ遺伝子に対して著しい相同性を有してもいない(Rajagopal,Physiol.Plant 24:272−281(1971年))。トウモロコシ遺伝子に対する配列相同性によって更なるフェニルアセトアルデヒドオキシダーゼを推測することができたので、それらを以下に示す。
フェニルピルビン酸オキシダーゼ酵素は、フェニルピルビン酸及びO2をフェニル酢酸、CO2及び水に変換する(図1の工程F)。アルスロバクター・グロビフォルミス(Arthrobacter globiformis)由来の4−ヒドロキシフェニルピルビン酸オキシダーゼ(EC1.2.3.13)は、チロシン異化作用中にフェニルピルビン酸のフェニル酢酸へのO2依存性酸化を触媒することが示された(Blakley,Can.J Microbiol 23:1128−1139(1977年))。この酵素活性は、細胞抽出液において実証されたが;この酵素をコードする遺伝子は、現在まで同定されていない。
1.4.1.a オキシドレダクターゼ(脱アミノ化):フェニルアラニンのフェニルピルビン酸へのNAD(P)+依存性酸化(図1の工程A)は、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼとも呼ばれるフェニルアラニンオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)によって触媒される。pdh遺伝子によってコードされているNAD+依存性フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ酵素は、バチルス・バジウス(Bacillus badius)、リシニバチルス・スパエリクス(Lysinibacillus sphaericus)及びサーモアクチノミセス・インターメディウス(Thermoactinomyces intermedius)において特性評価されている(Yamadaら,Biosci.Biotechnol.Biochem.59:1994−1995(1995年);Takadaら,J Biochem.109:371−376(1991年);Okazakiら,Gene 63:337−341(1988年))。
2.3.1.a アシルトランスフェラーゼ(ホスホトランスアシラーゼ):ホスホトランスベンゾイラーゼ活性を有する酵素は、3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAを[(3−オキソ−3−フェニルプロピオニル)オキシ]リン酸にリン酸化するために必要である(図3の工程F)。この活性を有する酵素は、現在まで特性評価されていない。例示的なリン酸転移アシルトランスフェラーゼとしては、ホスホトランスアセチラーゼ(EC2.3.1.8)及びホスホトランスブチリラーゼ(EC2.3.1.19)が挙げられる。大腸菌に由来するpta遺伝子は、アセチル−CoAをアセチルリン酸に可逆的に変換するホスホトランスアセチラーゼをコードしている(Suzuki,Biochim.Biophys.Acta 191:559−569(1969年))。また、幾つかの生物におけるホスホトランスアセチラーゼ酵素は、プロピオニル−CoAのプロピオニルリン酸への変換を触媒する。このような酵素は、大腸菌(Hesslingerら,Mol.Microbiol 27:477−492(1998年))、枯草菌(Bacillus subtilis)(Radoら,Biochim.Biophys.Acta 321:114−125(1973年))、クロストリジウム・クルイベリ(Clostridium kluyveri)(Stadtman,1:596−599(1955年))及びサーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)(Bockら,J Bacteriol.181:1861−1867(1999年))のpta遺伝子産物を含む。C.アセトブチリカム(C.acetobutylicum)由来のptb遺伝子は、ブチリル−CoAをブチリルリン酸に可逆的に変換する酵素であるホスホトランスブチリラーゼをコードしている(Wiesenbornら,Appl Environ.Microbiol 55:317−322(1989年);Walterら,Gene 134:107−111(1993年))。更なるptb遺伝子は、酪酸産生細菌L2−50(Louisら,J.Bacteriol.186:2099−2106(2004年))及び巨大菌(Bacillus megaterium)(Vazquezら,Curr.Microbiol 42:345−349(2001年))で見出されている。
2.3.1.b β−ケトチオラーゼ。β−ケトチオラーゼ酵素は、ベンゾイル−CoA及びアセチル−CoAを3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAに変換するために必要である(図3の工程A)。この転換が自然に生じることは知られていない。適切なβ−ケトチオラーゼ酵素としては、3−オキソアジピル−CoAチオラーゼ(EC2.3.1.174)、3−オキソピメロイル−CoA:グルタリル−CoAアシルトランスフェラーゼ(EC2.3.1.16)、3−オキソバレリル−CoAチオラーゼ及びアセトアセチル−CoAチオラーゼ(EC2.1.3.9)が挙げられる。
3−オキソアジピル−CoAチオラーゼ(EC2.3.1.174)は、β−ケトアジピル−CoAをスクシニル−CoA及びアセチル−CoAに変換し、また、芳香族化合物を分解するためのβ−ケトアジピン酸経路の鍵となる酵素である。前記酵素は、シュードモナス・プチダ(Harwoodら,J Bacteriol.176:6479−6488(1994年))及びアシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)(Dotenら,J Bacteriol.169:3168−3174(1987年))を含む土壌細菌及び真菌に広く存在する。シュードモナス属B13株におけるpcaF(Kaschabekら,J Bacteriol.184:207−215(2002年))、シュードモナス・プチダUにおけるphaD(Oliveraら,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 95:6419−6424(1998年))、シュードモナス・フルオレッセンスSTにおけるpaaE(Diら,Arch.Microbiol 188:117−125(2007年))及び大腸菌由来のpaaJ(Nogalesら,Microbiology 153:357−365(2007年))によってコードされている遺伝子産物もこの転換を触媒する。幾つかのβ−ケトチオラーゼは、シュードモナス・プチダ由来のbkt、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1由来のpcaF及びbkt、バークホルデリア・アンビファリア(Burkholderia ambifaria)AMMD由来のbkt、大腸菌由来のpaaJ、及びP.プチダ由来のphaDを含むオキソアジピル−CoA形成方向において著しく且つ選択的な活性を示す。
3−オキソピメロイル−CoAチオラーゼは、グルタリル−CoA及びアセチル−CoAの3−オキソピメロイル−CoAへの縮合を触媒する(EC2.3.1.16)。この転換を触媒する酵素は、ラルストニア・ユートロファ(以前はアルカリゲネス・ユートロファ(Alcaligenes eutrophusとして知られていた)における遺伝子bktB及びbktCによりコードされている(Slaterら,J.Bacteriol.180:1979−1987(1998年);Haywoodら,FEMS Microbiology Letters 52:91−96(1988年))。BktBタンパク質の配列は公知であるが、BktCタンパク質の配列は現在まで報告されていない。また、ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)のpimオペロンは、pimBによってコードされているβ−ケトチオラーゼをコードし、ベンゾイル−CoAの分解中にこの転換を分解方向に触媒すると予測される(Harrisonら,Microbiology 151:727−736(2005年))。S.アシジトロフィカス(S.aciditrophicus)におけるβ−ケトチオラーゼ酵素は、bktBに対する配列相同性(43%の同一性、e値=1e−93)により同定された。
アセチル−CoA及びプロピオニル−CoAからの3−オキソ吉草酸の形成を触媒するβ−ケトチオラーゼ酵素は、3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAの形成を触媒することもできる。ズーグレア・ラミゲラ(Zoogloea ramigera)は、プロピオニル−CoA及びアセチル−CoAからβ−ケトバレリル−CoAを形成することができる2つのケトチオラーゼを有し、R.ユートロファは、同じ転換を触媒することができるβ−酸化ケトチオラーゼを有する(Gruysら,(1999年))。これら遺伝子又はそれが翻訳されたタンパク質の配列は報告されていないが、R.ユートロファ由来のbktBに対する配列相同性に基いて、R.ユートロファ、Z.ラミゲラ、又は他の生物における幾つかの遺伝子を同定することができたので、それらを以下に列挙する。
更なる酵素としては、2分子のアセチル−CoAをアセトアセチル−CoAに変換することが知られているβ−ケトチオラーゼが挙げられる(EC2.1.3.9)。例示的なアセトアセチル−CoAチオラーゼ酵素としては、大腸菌由来のatoB(Martinら,Nat.Biotechnol 21:796−802(2003年))、C.アセトブチリカム(C.acetobutylicum)由来のthlA及びthlB(Hanaiら,Appl Environ Microbiol 73:7814−7818(2007年);Winzerら,J.Mol.Microbiol Biotechnol 2:531−541(2000年))、出芽酵母(S.cerevisiae)由来のERG10(Hiserら,J.Biol.Chem.269:31383−31389(1994年))の遺伝子産物が挙げられる。
2.6.1.a アミノトランスフェラーゼ:ECクラス2.6.1におけるフェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ又はトランスアミナーゼは、フェニルアラニンをフェニルピルビン酸に変換するために必要である(図1の工程A)。フェニル酢酸アミノトランスフェラーゼ、芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ及び他の酵素を含む様々な酵素がこの転換を触媒する。大腸菌におけるフェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、tyrB、ilvE及びaspCによりコードされている(Lee−Pengら,J Bacteriol.139:339−345(1979年);Powellら,Eur.J Biochem.87:391−400(1978年))。他の生物におけるフェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有する例示的な酵素としては、ARO9によりコードされている出芽酵母の芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ(Iraquiら,Mol.Gen.Genet.257:238−248(1998年))、及びTAA1によりコードされているシロイヌナズナのトリプトファンアミノトランスフェラーゼが挙げられる(Taoら,Cell 133:164−176(2008年))。
2.7.2.a ホスホトランスフェラーゼ:ECクラス2.7.2におけるホスホトランスフェラーゼ酵素は、1つのATPの加水分解と同時に、カルボン酸をホスホン酸に変換する。図3の工程Gでは、ホスホトランスフェラーゼは、[(3−オキソ−3−フェニルプロピオニル)オキシ]ホスホン酸及びADPをベンゾイル酢酸及びATPに変換するために必要である。この正確な活性を有する酵素は、現在まで特性評価されていない。例示的な酵素としては、酪酸キナーゼ(EC2.7.2.7)、イソ酪酸キナーゼ(EC2.7.2.14)、アスパルトキナーゼ(EC2.7.2.4)、酢酸キナーゼ(EC2.7.2.1)及びγ−グルタミルキナーゼ(EC2.7.2.11)が挙げられる。アスパルトキナーゼは、アスパラギン酸のATP依存性リン酸化を触媒し、幾つかのアミノ酸の合成に関与する。lysCによってコードされる大腸菌のアスパルトキナーゼIII酵素は、芳香族化合物アスパラギン酸1−ベンジルエステルを含む広い基質範囲を有し、基質特異性に関与する触媒残基が解明されている(Kengら,Arch.Biochem.Biophys.335:73−81(1996年))。大腸菌における2つの更なるキナーゼとしては、酢酸キナーゼ及びγ−グルタミルキナーゼが挙げられる。ackAによりコードされる大腸菌の酢酸キナーゼ(Skarstedtら,J.Biol.Chem.251:6775−6783(1976年))は、酢酸に加えてプロピオン酸をリン酸化する(Hesslingerら,Mol.Microbiol 27:477−492(1998年))。proBによりコードされる大腸菌のγ−グルタミルキナーゼ(Smithら,J.Bacteriol.157:545−551(1984年))は、グルタミン酸のガンマ炭酸基をリン酸化する。酪酸キナーゼは、C.アセトブチリカムにおける酸生成中、ブチリルリン酸を酪酸に可逆的に変換する(Caryら,Appl.Environ.Microbiol 56:1576−1583(1990年))。この酵素は、2つのbuk遺伝子産物のいずれによりコードされている(Huangら,J Mol.Microbiol Biotechnol 2:33−38(2000年))。他の酪酸キナーゼ酵素は、C.ブチリカム及び破傷風様菌(C.tetanomorphum)でみられる(TWAROGら,J Bacteriol.86:112−117(1963年))。関連酵素である、サーモトガ・マリティマ由来のイソ酪酸キナーゼは、大腸菌において発現し、結晶化された(Diaoら,J Bacteriol.191:2521−2529(2009年);Diaoら,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.59:1100−1102(2003年))。
2.8.3.a CoAトランスフェラーゼ:CoAトランスフェラーゼは、ある分子から別の分子へのCoA部分の可逆的な転移を触媒する。図3の工程Bは、3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAトランスフェラーゼ活性を有する酵素により触媒される。この転換では、ベンゾイル酢酸は、酢酸、コハク酸、又は他のもの等のCoAアクセプターへのCoAの転移により3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAから形成される。同様の基質と反応する例示的なCoAトランスフェラーゼ酵素としては、シンナモイル−CoAトランスフェラーゼ(EC2.8.3.17)及びベンジルスクシニル−CoAトランスフェラーゼが挙げられる。クロストリジウム・スポロゲネス(Clostridium sporogenes)におけるfldAによってコードされているシンナモイル−CoAトランスフェラーゼは、シンナモイル−CoAから、フェニル酢酸、3−フェニルプロピオン酸及び4−フェニル酪酸を含む様々な芳香族酸基質にCoA部分を転移する(Dickertら,Eur.J Biochem.267:3874−3884(2000年))。ベンジルスクシニル−CoAトランスフェラーゼは、CoAアクセプターとしてコハク酸又はマレイン酸を利用し、ベンジルスクシニル−CoAからコハク酸ベンジルを形成する。この酵素は、脱窒素細菌サウエラ・アロマチカ(Thauera aromatica)(この細菌では、bbsEFによりコードされる)において逆方向に特性評価された(Leutweinら,J Bacteriol.183:4288−4295(2001年))。
多様な基質範囲を有する更なるCoAトランスフェラーゼ酵素としては、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、4−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼ、ブチリル−CoAトランスフェラーゼ、グルタコニル−CoAトランスフェラーゼ及びアセトアセチル−CoAトランスフェラーゼが挙げられる。クロストリジウム・クルイベリのcat1、cat2及びcat3の遺伝子産物は、それぞれスクシニル−CoA、4−ヒドロキシブチリル−CoA及びブチリル−CoAトランスフェラーゼ活性を示すことが示されている(Seedorfら,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 105:2128−2133(2008年);Sohlingら,J Bacteriol.178:871−880(1996年))。また、同様のCoAトランスフェラーゼ活性は、膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis)(van Grinsvenら,J.Biol.Chem.283:1411−1418(2008年))及びトリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)(Riviereら,J.Biol.Chem.279:45337−45346(2004年))にも存在する。嫌気性細菌アシドアミノコックス・ファーメンタンス(Acidaminococcus fermentans)由来のグルタコニル−CoAトランスフェラーゼ(EC2.8.3.12)は、グルタコニル−CoA及び3−ブテノイル−CoAと反応する(Mackら,Eur.J.Biochem.226:41−51(1994年))。この酵素をコードする遺伝子は、gctA及びgctBである。この酵素は、グルタリル−CoA、2−ヒドロキシグルタリル−CoA、アジピル−CoA、クロトニル−CoA及びアクリリル−CoAを含む幾つかの代替基質に対して、低いが検出可能な活性を示す(Buckelら,Eur.J Biochem.118:315−321(1981年))。この酵素は、大腸菌でクローニングされ、発現している(Mackら,Eur.J.Biochem.226:41−51(1994年))。グルタコネートCoA−トランスフェラーゼ活性は、クロストリジウム・スポロスフェロイデス(Clostridium sporosphaeroides)及びクロストリジウム・シンビオサム(Clostridium symbiosum)でも検出されている。アセトアセチル−CoAトランスフェラーゼは、CoAドナーとしてアセチル−CoAを利用する。この酵素は、大腸菌のatoA(αサブユニット)及びatoD(βサブユニット)遺伝子によりコードされている(Korolevら,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.58:2116−2121(2002年);Vanderwinkelら,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902−908(1968年))。この酵素は広い基質範囲を有し(Sramekら,Arch.Biochem.Biophys.171:14−26(1975年))、アセチル−CoAからイソ酪酸(Matthiesら,Appl Environ.Microbiol 58:1435−1439(1992年))、吉草酸及びブタン酸(Vanderwinkelら,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902−908(1968年))を含む様々な基質にCoA部分を転移することが示されている。類似の酵素が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032(Duncanら,Appl.Environ.Microbiol 68:5186−5190(2002年))、クロストリジウム・アセトブチリカム(Caryら,Appl.Environ.Microbiol 56:1576−1583(1990年);Wiesenbornら,Appl.Environ.Microbiol 55:323−329(1989年))及びクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム(Clostridium saccharoperbutylacetonicum(Kosakaら,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58−68(2007年))に存在する。
3.1.2.a CoAヒドロラーゼ:3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAは、ECクラス3.1.2におけるCoAヒドロラーゼ又はチオエステラーゼによって、対応する酸に加水分解され得る(図3の工程B)。芳香族基質を加水分解する例示的なCoAチオエステルとしては、ベンゾイル−CoAヒドロラーゼ、4−ヒドロキシベンゾイル−CoAヒドロラーゼ(EC3.1.2.23)及びフェニルアセチル−CoAヒドロラーゼ(EC3.1.2.25)が挙げられる。アゾアルカス・エバンシイ(Azoarcus evansii)の遺伝子orf1は、安息香酸代謝に関与するベンゾイル−CoAヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする(Ismail,Arch.Microbiol 190:451−460(2008年))。この酵素は、大腸菌において異種発現させたとき、多くの代替基質に対して活性を示した。配列類似性により、更なるベンゾイル−CoAヒドロラーゼ酵素が、マグネトスピリラム・マグネトタクチカム(Magnetospirillum magnetotacticum)、ジャナスチア属(Jannaschia)の種CCS1、及びサジッツラ・ステラータ(Sagittula stellata)E−37の安息香酸分解遺伝子クラスターにおいて同定された。シュードモナス属の種CBS3の4−ヒドロキシベンゾイル−CoAヒドロラーゼは、代替基質ベンゾイル−CoA及びp−メチルベンゾイル−CoAに対して活性を示し、また、大腸菌で異種発現され、特性評価されている(Songら,Bioorg.Chem.35:1−10(2007年))。アリール−CoAヒドロラーゼ活性を有する更なる酵素としては、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)のパルミトイル−CoAヒドロラーゼ(Wangら,Chem.Biol.14:543−551(2007年))及びentHによりコードされている大腸菌のアシル−CoAヒドロラーゼ(Guoら,Biochemistry 48:1712−1722(2009年))が挙げられる。
広い基質範囲を有する幾つかの更なるCoAヒドロラーゼは、ベンゾイル−CoA及び/又はp−メチルベンゾイル−CoAを加水分解するのに適している。例えば、ラットの脳に由来するacot12によってコードされる酵素(Robinsonら,Biochem.Biophys.Res.Commun.71:959−965(1976年))は、ブチリル−CoA、ヘキサノイル−CoA及びマロニル−CoAと反応することができる。acot8によってコードされるヒトのジカルボン酸チオエステラーゼは、グルタリル−CoA、アジピル−CoA、スベリル−CoA、セバシル−CoA及びドデカンジオイル−CoAに対する活性を示す(Westinら,J.Biol.Chem.280:38125−38132(2005年))。また、この酵素に最も近い大腸菌ホモログtesBも、様々なCoAチオールエステルを加水分解することができる(Naggertら,J Biol Chem 266:11044−11050(1991年))。また、類似の酵素が、ラットの肝臓において特性評価されている(Deana R.,Biochem Int 26:767−773(1992年))。大腸菌においてヒドロラーゼ活性を有する更なる酵素としては、ybgC、paaI及びybdBが挙げられる(Kuznetsovaら,FEMS Microbiol Rev,2005,29(2):263−279;Songら,J Biol Chem,2006,281(16):11028−38)。
4.1.1a.カルボキシ−リアーゼ:ECクラス4.1.1におけるデカルボキシラーゼ酵素は、図1〜3における幾つかの転換を触媒するのに必要である。フェニルピルビン酸のフェニルアセトアルデヒドへの変換(図1の工程B)は、ケト酸デカルボキシラーゼにより触媒される。フェニル酢酸のトルエンへの脱炭酸(図1の工程D)は、フェニル酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素により触媒される。3−オキソ酸デカルボキシラーゼは、ベンゾイル酢酸のアセトフェノンへの脱炭酸(図7の工程C)に必要である。デカルボキシラーゼ(カルボキシリアーゼとしても知られている)は、カルボン酸基を有する有機化合物又は細胞内代謝物からの二酸化炭素の喪失を触媒する。デカルボキシラーゼは、本来優勢であり、補因子としてピリドキサールリン酸又はピリドキサールピルビン酸のいずれかを必要する場合もあるが、多くは、補因子の結合を必要としない。50を超えるデカルボキシラーゼ酵素が、報告され、生化学的方法及び/又は分析法により特性評価されている。
フェニル酢酸デカルボキシラーゼは、フェニル酢酸のトルエンへの脱炭酸(図1の工程D)を触媒するのに必要である。このような活性は、特性評価されているデカルボキシラーゼ酵素において現在まで検出されていない。類似の反応を触媒する酵素は、自然界で4−ヒドロキシフェニル酢酸をp−クレゾールに脱炭酸する4−ヒドロキシフェニル酢酸デカルボキシラーゼ(EC4.1.1.83)である。クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)及びクロストリジウム・スカトロゲネス(Clostridium scatologenes)に由来する、特性評価されている4−ヒドロキシフェニル酢酸デカルボキシラーゼ酵素は、2つのサブユニットで構成され、特定の活性化酵素による活性化を必要とする(Yuら,Biochemistry 45:9584−9592(2006年);Andreiら,Eur.J Biochem.271:2225−2230(2004年))。C.スカトロゲネスではcsdABCにより、そしてC.ディフィシレではhpdABCによりコードされているこれら酵素は、大腸菌で異種発現されている。別の適切な酵素は、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)のアリールマロン酸デカルボキシラーゼ(EC4.1.1.76)であり、これは、構造上関連する基質である2−フェニルプロピオン酸に対する活性を有する(Yatakeら,Appl.Microbiol Biotechnol.78:793−799(2008年))。この酵素の配列は、Yatakeらによる刊行物から入手可能であるが;この酵素は、現在までGenBankアクセッション番号が割り当てられていない。AMDA_BORBRによってコードされている気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)由来の関連酵素(98%のアミノ酸同一性)が、最近結晶化された(Kuettnerら,J Mol.Biol.377:386−394(2008年))。
フェニルピルビン酸のフェニルアセトアルデヒドへの変換(図1、工程B)は、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素により触媒される。幾つかのケト酸デカルボキシラーゼ酵素は、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ(EC4.1.1.43)、ピルビン酸デカルボキシラーゼ(EC4.1.1.1)、分枝鎖アルファケト酸デカルボキシラーゼ(EC4.1.1.72)及びギ酸ベンジルデカルボキシラーゼ(EC4.1.1.7)を含むフェニルピルビン酸に対する活性が実証されている。例示的なフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼは、アゾスピリルム・ブラシレンセ(Azospirillum brasilense)のipdC遺伝子によってコードされている(Spaepenら,J Bacteriol.189:7626−7633(2007年))。フェニルピルビン酸は、この酵素が好む基質である。また、遺伝子PDC1、PDC5、PDC6及びARO10によってコードされている出芽酵母の酵素も、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を示す(Dickinsonら,J Biol.Chem.278:8028−8034(2003年))。フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する他の酵素としては、ザイゴサッカロミセス・ビスポラス(Zygosaccharomyces bisporus)のピルビン酸デヒドロゲナーゼ酵素(Neuserら,Biol.Chem.381:349−353(2000年))、結核菌H37Rv及びラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)の分枝鎖2−オキソ酸デカルボキシラーゼ酵素(Gockeら,Adv.Synth.Catal.349:1425−1435(2007年);Wertherら,J Biol.Chem.283:5344−5354(2008年))、及びシュードモナス・プチダのギ酸ベンジルデカルボキシラーゼ酵素(Siegertら,Protein Eng Des Sel 18:345−357(2005年))が挙げられる。別の適切な酵素はザイモモナス・モビルス(Zymomonas mobilus)由来のピルビン酸デカルボキシラーゼであるが、その理由は、この酵素が広い基質範囲を有し、基質特異性を変化させるための指向改変研究の対象であったためである(Siegertら,Protein Eng Des Sel 18:345−357(2005年))。
ベンゾイル酢酸のアセトフェノンへの脱炭酸(図3の工程C)は、ベンゾイル酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素によって触媒される。この活性を有するATP依存性酵素であるアセトフェノンカルボキシラーゼは、アロマトレウム・アロマチカムEbN1においてエチルベンゼン分解中に逆(カルボキシル化)方向に作用する(Rabusら,Arch.Microbiol 178:506−516(2002年))。この酵素はapc1〜5によってコードされる5つのサブユニットで構成され、カルボキシル化の方向においてATP依存性である(AMPの形成)。配列相同性によって、アゾトバクター・ビネランジイ(Azotobacter vinelandii)及びルブロバクター・キシラノフィラス(Rubrobacter xylanophilus)において類似する酵素が見出されている。
あるいは、3−オキソ酸デカルボキシラーゼは、ベンゾイル酢酸をアセトフェノンに変換することができる。例示的な3−オキソ酸デカルボキシラーゼは、アセト酢酸デカルボキシラーゼ(EC4.1.1.4)であり、これは、自然界ではアセト酢酸をアセトン及びCO2に変換する。adcによってコードされているクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素は広い基質範囲を有し、ベンゾイル酢酸のアセトフェノンへの望ましい脱炭酸を触媒することが示されている(Rozzelら,J.Am.Chem.Soc.106:4937−4941(1984年);Bennerら,J.Am.Chem.Soc.103:993−994(1981年);Autorら,J Biol.Chem.245:5214−5222(1970年))。関連するアセト酢酸デカルボキシラーゼは、クロストリジウム・ベエイジェリンキーにおいて特性評価されている(Ravagnaniら,Mol.Microbiol 37:1172−1185(2000年))。また、無細胞抽出物において特性評価されているバチルス・ポリミキサ(Bacillus polymyxa)由来のアセト酢酸デカルボキシラーゼは、3−ケト酸について広い基質特異性を有し、3−オキソペンタン酸を脱炭酸することができる(Matiasekら,Curr.Microbiol 42:276−281(2001年))。この酵素をコードする遺伝子は、現在まで同定されておらず、B.ポリミキサのゲノム配列も未だ利用可能ではない。別のadcは、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカムでみられる(Kosakaら,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58−68(2007年))。配列相同性により、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)及びバチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)FZB42を含む他の生物における更なる遺伝子を推測することができる。
4.1.99.a デカルボニラーゼ:デカルボニラーゼ酵素は、フェニルアセトアルデヒドをトルエンに変換するのに必要である(図1の工程E)。デカルボニラーゼ酵素は、植物、哺乳類、昆虫及び細菌におけるアルカン生合成の最後の工程を触媒する(Dennisら,Arch.Biochem.Biophys.287:268−275(1991年))。非酸化的デカルボニラーゼは、同時にCOを放出しながらアルデヒドをアルカンに転換し、一方、酸化的デカルボキシラーゼは、補因子としてNADPH及びO2を利用し、CO2、水及びNADP+を放出するシトクロムP450酵素である。例示的なデカルボニラーゼ酵素としては、オクタデカナールデカルボニラーゼ(EC4.1.99.5)、ステロールデサチュラーゼ及び脂肪アルデヒドデカルボニラーゼが挙げられる。コバルト−ポルフィリン含有デカルボニラーゼは、藻類ボツリオコッカス・ブラウニイ(Botryococcus braunii)において精製され、特性評価されたが;この活性に関連する遺伝子は現在まで同定されていない(Dennisら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 89:5306−5310(1992年))。エンドウマメ(Pisum sativum)由来の銅含有デカルボニラーゼも精製され、特性評価されている(Schneider−Belhaddadら,Arch.Biochem.Biophys.377:341−349(2000年))。シロイヌナズナのCER1遺伝子は、エピクチクラのろう形成に関与する脂肪酸デカルボニラーゼをコードしている(米国特許第6,437,218号)。更なる脂肪酸デカルボニラーゼは、タルウマゴヤシ(Medicago truncatula)、ブドウ(Vitis vinifera)及びイネでみられる(米国特許出願公開第2009/0061493号)。
酸化的デカルボニラーゼ酵素は、イエバエ(Musca domestica)及びキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)のCYP4G2v1及びCYP4G1遺伝子産物によってコードされている(米国特許出願公開第2010/0136595号)。酸化的デカルボニラーゼ活性を有する更なる酵素は、配列相同性により、他の生物、例えば、ヨトウガ(Mamestra brassicae)、メリカタバコガ(Helicoverpa zea)、及びエンドウヒゲナガアブラムシ(Acyrthosiphon pisum)において同定することができる。
4.1.99.b リアーゼ:図2におけるフェニルアラニンのベンゼンへの変換は、フェニルアラニンベンゼン−リアーゼ活性を有する酵素により触媒される。必要な新規活性は、同時にピルビン酸及びアンモニアを放出しながら、可逆的にチロシン及びフェノールを相互変換するチロシンフェノールリアーゼ(EC4.1.99.2)の活性に類似している。tutAによってコードされているパンテア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)(旧エルウイニア・ハービコラ(Erwinia herbicola))由来の酵素は、ジヒドロキシフェニルアラニンを含む様々な置換誘導体と反応する(Foorら,Appl.Environ.Microbiol 59:3070−3075(1993年))。この酵素は、大腸菌において異種発現され、カテコール、ピルビン酸及びアンモニアからジヒドロキシフェニルアラニンを合成するために利用された。更なるチロシンフェノール−リアーゼ酵素は、シトロバクター・インターメディウス(Citrobacter intermedius)(Nagasawaら,Eur.J Biochem.117:33−40(1981年))、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)(Phillipsら,Biochim.Biophys.Acta 1647:167−172(2003年))及びシンビオバクテリウム・サーモフィラム(Symbiobacterium thermophilum)(Hiraharaら,Appl.Microbiol Biotechnol.39:341−346(1993年))でみられる。シトロバクター・フロインデイの酵素は、構造的に特性評価されており、基質結合に関与する残基が同定された(Milicら,J Biol.Chem.283:29206−29214(2008年))。フェニルアラニンは、任意の特性評価されているチロシンフェノールリアーゼ酵素の天然基質ではなく;むしろ、幾つかの酵素の阻害剤として作用することが示されている。この活性を獲得し、且つ性能を改善するために、当技術分野において周知である指向進化又は他のタンパク質工学的アプローチが必要になる可能性がある。
同様の反応を触媒する酵素は、トリプトファナーゼとも呼ばれるトリプトファンインドールリアーゼ(EC4.1.99.1)であり、この酵素は、トリプトファン及び水をインドール及びピルビン酸に変換する。例示的なトリプトファンインドールリアーゼ酵素としては、大腸菌のtnaA、シンビオバクテリウム・サーモフィラムのtna1、及びエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)のtnaAの遺伝子産物が挙げられる(Koganら,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.60:2073−2075(2004年);Kawasakiら,Biosci.Biotechnol.Biochem.59:1938−1943(1995年);Suzukiら,Agric.Biol.Chem.55:3059−3066(1991年))。
4.2.1.a デヒドラターゼ:図3の工程Eは、1−フェニルエタノールをスチレンに変換するためにデヒドラターゼ(EC4.1.2.−)を使用する。この反応を触媒するための例示的な酵素としては、フマラーゼ(EC4.2.1.2)、シトラマル酸ヒドラターゼ(EC4.2.1.34)及びジメチルマレイン酸ヒドラターゼ(EC4.2.1.85)が挙げられる。フマラーゼ酵素は、自然界において、リンゴ酸のフマル酸への可逆的な脱水を触媒する。フマラーゼ酵素の基質としての1−フェニルエタノールの適合性は、現在まで文献には記載されていないが、この酵素に関する豊富な構造情報が利用可能であり、また、研究者は、活性、阻害及び局在を変化させるための酵素の改変に成功している(Weaver,61:1395−1401(2005年))。大腸菌は、3つのフマラーゼ:増殖条件により調節されるFumA、FumB及びFumCを有する。FumBは、酸素感受性であり、嫌気条件下でのみ活性を有する。FumAは、微小嫌気条件下で活性を有し、FumCは、好気増殖中に活性を有する唯一の酵素である(Tsengら,183:461−467(2001年);Woodsら,954:14−26(1988年);Guestら,J Gen Microbiol 131:2971−2984(1985年))。更なる酵素は、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)(Smithら,Int.J Biochem.Cell Biol 31:961−975(1999年))、サーマス・サーモフィラス(Mizobataら,Arch.Biochem.Biophys.355:49−55(1998年))及びラット(Kobayashiら,89:1923−1931(1981年))でみられる。高い配列相同性を有する類似の酵素としては、シロイヌナズナ由来のfum1及びコリネバクテリウム・グルタミカム由来のfumCが挙げられる。ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム(Pelotomaculum thermopropionicum)由来のmmcBCフマラーゼは、2つのサブユニットを有する別のクラスのフマラーゼである(Shimoyamaら,270:207−213(2007年))。シトラマル酸ヒドロリアーゼは、自然界で2−メチルリンゴ酸をメサコン酸に脱水する。この酵素は、広い基質特異性を有することが示されている、メタノカルドコッカス・ジャナスキイ(Methanocaldococcus jannaschii)の2−オキソブタン酸へのピルビン酸経路において研究されている(Drevlandら,J Bacteriol. 189:4391−4400(2007年))。この酵素活性は、破傷風様菌、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、シトロバクター・アマロナティカス(Citrobacter amalonaticus)でも検出され、これら細菌においてグルタミン酸分解に関与していると考えられる(Kato及びAsano,Arch.Microbiol 168:457−463(1997年))。M.ジャナスキイのタンパク質配列は、これらの生物における遺伝子に対してそれほど高い相同性を有する訳ではない。ジメチルマレイン酸ヒドラターゼは、ジメチルマレイン酸(dimethylmaeate)を水和して(2R,3S)−2,3−ジメチルリンゴ酸を形成するアコニターゼファミリーにおける、可逆的なFe2+依存性且つ酸素感受性の酵素である。この酵素は、ユーバクテリウム・バーケリ(Eubacterium barkeri)におけるdmdABによってコードされている(Alhapelら,上記;Kollmann−Kochら,Hoppe Seylers.Z.Physiol Chem.365:847−857(1984年))。
6.2.1.a 酸−チオールリガーゼ:3−オキソ−3−フェニルプロピオニル−CoAのベンゾイル酢酸への変換(図3の工程B)は、ECクラス6.2.1におけるCoAシンテターゼ又は酸−チオールリガーゼによって触媒され得る。この正確な転換を触媒するATP形成CoAシンテターゼは、現在まで特性評価されていないが;広い基質特異性を有する幾つかの酵素は、文献に記載されている。AF1211によってコードされているアーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)由来のADP形成アセチル−CoAシンテターゼ(ACD、EC6.2.1.13)は、イソ酪酸、イソペンタン酸及びフマル酸を含む様々な直鎖及び分岐鎖の基質に対して作用することが示された(Musfeldtら,J Bacteriol.184:636−644(2002年))。AF1983によってコードされているアーケオグロブス・フルギダスにおける第2の可逆的なACDも、芳香族化合物フェニル酢酸及びインドール酢酸に対して活性が高く広い基質範囲を有することが示された(Musfeldtら,上記)。スクシニル−CoAシンテターゼであるとアノテーションされたハロアーキュラ・マリスモルツイ(Haloarcula marismortui)由来の酵素は、基質としてプロピオン酸、酪酸及び分枝鎖酸(イソ吉草酸及びイソ酪酸)を受容し、順方向及び逆方向に作用することが示された(Brasenら,Arch.Microbiol 182:277−287(2004年))。超好熱性古細菌であるピロバキュラム・アエロフィラム(Pyrobaculum aerophilum)由来のPAE3250によってコードされているACDは、全ての特性評価されているACDのうち最も広い基質範囲を示し、アセチル−CoA、イソブチリル−CoA(好ましい基質)、及びフェニルアセチル−CoAと反応する(Brasen及びSchonheit,Arch.Microbiol 182:277−287(2004年))。指向進化又は工学的技術を用いて、ホスト生物の生理的温度で作用するようにこの酵素を改変することができる。A.フルギダス、H.マリスモルツイ及びP.アエロフィラム由来の酵素は全て大腸菌でクローニングされ、機能的に発現し、特性評価されている(Brasen及びSchonheit,Arch.Microbiol 182:277−287(2004年);Musfeldt及びSchonheit,J Bacteriol.184:636−644(2002年))。更なる酵素は、大腸菌におけるsucCDによってコードされており、これは、自然界では、1つのATPを消費すると同時にコハク酸からスクシニル−CoAへの形成を触媒する(この反応は、インビボにおいて可逆的である)(Buckら,Biochemistry 24:6245−6252(1985年))。シュードモナス・プチダ由来のアシル−CoAリガーゼは、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、及びオクタン酸を含む幾つかの脂肪族基質、並びにフェニル酢酸及びフェノキシ酢酸等の芳香族化合物に対して作用することが実証されている(Fernandez−Valverdeら,Appl.Environ.Microbiol.59:1149−1154(1993年))。関連する酵素であるリゾビウム・レグミノサルム(Rhizobium leguminosarum)由来のマロニル−CoAシンテターゼ(6.3.4.9)は、幾つかの二酸、すなわち、エチル−、プロピル−、アリル−、イソプロピル−、ジメチル−、シクロプロピル−、シクロプロピルメチレン−、シクロブチル―、及びベンジル−マロネートをこれらの対応するモノチオエステルに変換することができた(Pohlら,J.Am.Chem.Soc.123:5822−5823(2001年))。
実施例II 1,3−ブタジエンからムコン酸異性体への経路
この実施例は、ムコン酸異性体から1,3−ブタジエンへの経路を示す。
図4は、デカルボキシラーゼ酵素によるムコン酸異性体の1,3−ブタジエンへの変換を示す。シス,シス−ムコン酸、シス,トランス−ムコン酸、又はトランス,トランス−ムコン酸は、まず、シス−2,4−ペンタジエノエート又はトランス−2,4−ペンタジエノエートのいずれかに脱炭酸される(図4の工程A、B、C、及びD)。2,4−ペンタジエノエートは、次いで、脱炭酸されて1,3−ブタジエンを形成する(図4の工程E、F)。
任意のムコン酸異性体の脱炭酸が、1,3−ブタジエンへの経路の一部として機能し得ることが理解される。シス,シス−ムコン酸の生物学的生成は、当技術分野において周知である(Draths及びFrost.J Am Chem Soc.116:399−400(1994年);Niuら.Biotechnol Prog.18:201−211(2002年);Bang及びChoi.J Ferm Bioeng.79(4):381−383(1995年))。ムコン酸の異性体は、ECクラス5.2.1におけるムコン酸イソメラーゼ酵素により相互に変換され得る。
更に、2,4−ペンタジエノエートのいずれかの異性体の脱炭酸により1,3−ブタジエンが形成されることが理解される。あるいは、2,4−ペンタジエノエートは、ムコン酸以外の出発物質から形成することもできる(例えば、ペンタ−2−エノエート又はペンタ−4−エノエートの脱水素を介する第2の二重結合の導入;ヒドロラーゼ、シンテターゼ、又はトランスフェラーゼを介する2,4−ペンタジエノイル−CoAからのCoAの除去、それぞれアルデヒド又はアルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼを介する4−ペンタジエナール又は2,4−ペンタジエノールの脱水素)。2,4−ペンタジエノエートの異性体は、ECクラス5.2.1におけるイソメラーゼ酵素により相互に変換され得る。
多数のデカルボキシラーゼ酵素が特性評価されており、構造的に類似する基質をムコン酸又は2,4−ペンタジエノエート異性体に脱炭酸することが示されている。例示的な酵素としては、ソルビン酸デカルボキシラーゼ、アコニット酸デカルボキシラーゼ(EC4.1.1.16)、4−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼ(EC4.1.1.77)、ケイ皮酸デカルボキシラーゼ及びフェルラ酸デカルボキシラーゼが挙げられる。これら酵素は、図4に示す通り、ムコン酸及び/又は2,4−ペンタジエノエートを脱炭酸するために本発明において用いるために適用可能である。
密接に関連する機能を有する1つのデカルボキシラーゼ酵素は、ソルビン酸を1,3−ペンタジエンに変換するソルビン酸デカルボキシラーゼである。アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)によるソルビン酸の脱炭酸は、3つの遺伝子:padA1、ohbA1、及びsdrAを必要とする(Plumridgeら.Fung.Genet.Bio,47:683−692(2010年)。PadA1は、フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼとしてアノテーションされており、ohbA1は、推定4−ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼであり、sdrAは、ソルビン酸デカルボキシラーゼの調節因子である。また、幾つかの菌類及び酵母の種を含む更なる種もソルビン酸を脱炭酸することが示されている(Kinderlerler及びHatton,Food Addit Contam.,7(5):657−69(1990年);Casasら,Int J Food Micro.,94(1):93−96(2004年);Pinches及びApps,Int.J.Food Microbiol.116:182−185(2007年))。例えば、コウジカビ(Aspergillus oryzae)及びネオサルトリア・フィシェリ(Neosartorya fischeri)は、ソルビン酸を脱炭酸し、padA1、ohbA1、及びsdrAに近いホモログを有することが示されている。
アコニット酸デカルボキシラーゼは、本発明における別の有用な酵素である。この酵素は、カンジダ属の株、また糸状菌アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)においてもイタコネート生合成の最後の工程を触媒する(Bonnarmeら.J Bacteriol.177:3573−3578(1995年);Willke及びVorlop,Appl Microbiol.Biotechnol 56:289−295(2001年))。アコニット酸デカルボキシラーゼは、アスペルギルス・テレウスから精製され、特性評価されている(Dwiartiら,J.Biosci.Bioeng.94(1):29−33(2002年))。シス−アコニット酸デカルボキシラーゼ(CAD)酵素の遺伝子及びタンパク質の配列は、以下の表に列挙する幾つかの近いホモログとともに、既に報告されている(欧州特許出願公開第2017344 A1号;国際公開第2009/014437 A1号)。
4−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼは、4−オキサロクロトン酸の2−オキソペンタン酸への脱炭酸を触媒する。この酵素は、多数の生物から単離され、特性評価されている。この酵素をコードする遺伝子としては、シュードモナス属の種(株600)におけるdmpH及びdmpE(Shinglerら,174:711−724(1992年))、シュードモナス・プチダ由来のxylII及びxylIII(Katoら,Arch.Microbiol 168:457−463(1997年);Stanleyら,Biochemistry 39:3514(2000年);Lianら,J.Am.Chem.Soc.116:10403−10411(1994年))、並びにラルストニア・ユートロファJMP134由来のReut_B5691及びReut_B5692(Hughesら,158:79−83(1984年))が挙げられる。シュードモナス属の種(株600)由来の酵素をコードする遺伝子は、大腸菌でクローニングされ、発現している(Shinglerら,174:711−724(1992年))。
最後に、ケイ皮酸(フェニルアクリレート)及び置換ケイ皮酸誘導体の対応するスチレン誘導体への変換を触媒するデカルボキシラーゼの分類が特性評価されている。これら酵素は、様々な生物に共通であり、また、大腸菌でクローニングされ、発現しているこれら酵素をコードする具体的な遺伝子としては、出芽酵母由来のpad1(Clausenら,Gene 142:107−112(1994年))、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)由来のpdc(Barthelmebsら,67:1063−1069(2001年);Qiら,Metab Eng 9:268−276(2007年);Rodriguezら,J.Agric.Food Chem.56:3068−3072(2008年))、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)由来のpofK(pad)(Uchiyamaら,Biosci.Biotechnol.Biochem.72:116−123(2008年);Hashidokoら,Biosci.Biotech.Biochem.58:217−218(1994年))、ペジコッカス・ペントサセウス(Pedicoccus pentosaceus)(Barthelmebsら,67:1063−1069(2001年))、並びに枯草菌(Bacillus subtilis)及びバチルス・プミルス(Bacillus pumilus)由来のpadC(Shinglerら,174:711−724(1992年))が挙げられる。シュードモナス・フルオレッセンス由来のフェルラ酸デカルボキシラーゼも、精製され、特性評価されている(Huangら,J.Bacteriol.176:5912−5918(1994年))。この分類における酵素は安定であり、外因性の又は内部的に結合する補因子を必要としないので、これら酵素は生体内転換に理想的に適している(Sariaslani,Annu.Rev.Microbiol.61:51−69(2007年))。
上記列挙したデカルボキシラーゼはそれぞれ、図4に示す望ましい転換に対して可能な適する酵素を表す。望ましい変換(例えば、ムコン酸から2,4−ペンタジエノエート、2,4−ペンタジエノエートからブタジエン)において酵素の望ましい活性又は生産能がみられない場合、デカルボキシラーゼ酵素は必要な性能を実現するために公知のタンパク質工学的方法を使用して進化させることができる。重要なことに、デカルボキシラーゼのC末端領域が基質特異性に関与していると考えられることが、キメラ酵素の使用を通じて示された(Barthelmebs,L.;Divies,C.;Cavin,J.−F.2001.Expression in Escherichia coli of Native and Chimeric Phenolic Acid Decarboxylases with Modified Enzymatic Activities and Method for Screening Recombinant E.coli Strains Expressing These Enzymes,Appl.Environ.Microbiol.67,1063−1069.)。したがって、ムコン酸又は2,4−ペンタジエノエートに対する活性を得るためにデカルボキシラーゼの特異性を広げるための指向進化実験は、これら酵素のC末端領域に集中してもよい。
図4における転換を触媒するのに必要なデカルボキシラーゼのうちの幾つかは、ムコン酸又は2,4−ペンタジエノエートの特定の異性体に対してより高い活性を示し得る。イソメラーゼ酵素は、脱炭酸にとってそれほど望ましくないムコン酸又は2,4−ペンタジエノエートの異性体をより望ましい異性体に変換するために適用することができる。類似する変換を触媒し、ひいては本発明に適する酵素を表す例示的なイソメラーゼとしては、マレイン酸シス−トランスイソメラーゼ(EC5.2.1.1)、マレイルアセトンシス−トランスイソメラーゼ(EC5.2.1.2)及び脂肪酸シス−トランスイソメラーゼが挙げられる。マレイン酸シス−トランスイソメラーゼは、フマル酸をマレイン酸に変換する。この酵素は、アルガリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)(Hatakeyamaら,1997年,Gene Cloning and Characterization of Maleate cis−trans Isomerase from Alcaligenes faecalis,Biochem.Biophys.Research Comm.239,74−79)又はセラチア・マルセスセンス(Serratia marcescens)(Hatakeyamaら,Biosci.Biotechnol.Biochem.64:1477−1485(2000年))由来のmaiA遺伝子によってコードされている。配列相同性によって同定することができる類似の遺伝子としては、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)、ラルストニア・ピッケティ(Ralstonia pickettii)12D、及びラルストニア・ユートロファH16由来のものが挙げられる。更なるマレイン酸シス−トランスイソメラーゼ酵素は、そのアミノ酸配列が参照文献(Mukouyamaら、米国特許第6,133,014号)に配列番号1〜4として提供されている酵素によってコードされている。マレイルアセトンシス,トランス−イソメラーゼは、4−マレイル−アセト酢酸の4−フマリル−アセチル酢酸への変換(シスからトランスへの変換)を触媒する。この酵素は、緑膿菌(Fernandez−Canonら,J Biol.Chem.273:329−337(1998年)))及びコレラ菌(Vibrio cholera)(Seltzer,J Biol.Chem.248:215−222(1973年))におけるmaiAによってコードされている。配列相同性によって、大腸菌O157において類似する酵素が同定された。cti遺伝子産物は、シス−不飽和脂肪酸(UFA)のトランス−UFAへの変換を触媒する。酵素は、P.ブチダにおいて特性評価されている(Junkerら,J Bacteriol.181:5693−5700(1999年))。類似する酵素が、シュワネラ属(Shewanella)の種MR−4及びコレラ菌でみられる。
実施例III
(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホン酸を生成するための例示的な経路
この実施例は、テレフタル酸(PTA)前駆体(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホン酸(2H3M4OP)を生成するための例示的な経路について記載する。
p−トルイル酸及びPTA経路の前駆体は、2H3M4OPである。この化学物質は、図5に示す3つの酵素的段階で、中央代謝産物グリセルアルデヒド−3−リン酸(G3P)及びピルビン酸から誘導することができる。最初の2つの段階は、大腸菌、及びイソプレノイドを生合成するためにメチルエリスリトールリン酸(非メバロン酸)経路を利用する他の生物において自然界で行われる。ピルビン酸及びG3Pは、まず、DXPシンテターゼによって縮合されて、1−デオキシ−D−キシルロース5−リン酸(DXP)を形成する。続く炭素骨格の還元及び再配置は、DXPレダクトイソメラーゼによって触媒される。最後に、新規ジオールデヒドラターゼが、2−C−メチル−D−エリトリトール−4−リン酸をp−トルイル酸前駆体2H3M4OPに転換する。
A.1−デオキシキシルロース−5−リン酸(DXP)シンテターゼ。ピルビン酸及びG3Pは、DXPシンテターゼ(EC2.2.1.7)によって縮合されて、DXPを形成する。この酵素は、イソプレノイドを生合成する非メバロン酸経路の最初の段階を触媒する。前記酵素は、補因子としてチアミン二リン酸を必要とし、また、還元FADを必要とするが、正味の酸化還元変化は存在しない。大腸菌の酵素の結晶構造は利用可能である(Xiangら,J.Biol.Chem.282:2676−2682(2007年))。他の酵素は、結核菌(Baileyら,Glycobiology 12:813−820(2002年)及びアグロバクテリウム・チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)(Leeら,J.Biotechnol.128:555−566(2007年))においてクローニングされ、特性評価されている。枯草菌及びシネコシスティス属(Synechocystis)種PCC6803由来のDXPシンテターゼ酵素は、大腸菌でクローニングされた(Harker及びBramley,FEBS Lett.448:115−119(1999年))。
B.1−デオキシ−D−キシルロース5−リン酸レダクトイソメラーゼ(EC1.1.1.267)。1−デオキシ−D−キシルロース5−リン酸(DXP)の2−C−メチル−D−エリトリトール−4−リン酸へのNAD(P)H依存性還元及び再配置は、イソプレノイドを生合成するための非メバロン酸経路の第2の段階においてDXPレダクトイソメラーゼ(DXR、EC1.1.1.267)によって触媒される。NADPH依存性の大腸菌の酵素は、dxrによりコードされている(Takahashiら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:9879−9884(1998年))。シロイヌナズナ由来の組み換え酵素は、大腸菌において機能的に発現した(Carretero−Pauletら,Plant Physiol.129:1581−1591(2002年))。ザイモモナス・モビルス及び結核菌由来のDXR酵素は、特性評価されており、結晶構造も利用可能である(Grolleら,FEMS Microbiol.Lett.191:131−137(2000年));Henrikssonら,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.62:807−813(2006年))。特性評価されているDXR酵素の大部分は、厳密にNADPH依存性であるが、シロイヌナズナ及び結核菌由来の酵素は、低い割合でNADHと反応する(Argyrou及びBlanchard,Biochemistry 43:4375−4384(2004年));Rohdichら,FEBS J.273:4446−4458(2006年))。
C.2−C−メチル−D−エリトリトール−4−リン酸デヒドラターゼ。ジオールデヒドラターゼは、2−C−メチル−D−エリトリトール−4−リン酸をp−トルイル酸前駆体に変換するのに必要である(Altmiller及びWagner,Arch.Biochem.Biophys.138:160−170(1970年))。この転換は実験的に実証されていないが、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(EC4.2.1.9)、プロパンジオールデヒドラターゼ(EC4.2.1.28)、グリセロールデヒドラターゼ(EC4.2.1.30)及びミオイノシトールデヒドラターゼ(EC4.2.1.44)を含む幾つかの酵素は、類似の転換を触媒する。
二級ジオールである2,3−ブタンジオールを2−ブタノンに変換することができるジオールデヒドラターゼ又はプロパンジオールデヒドラターゼ酵素(EC4.2.1.28)は、この転換についての優れた候補である。アデノシルコバラミン依存性ジオールデヒドラターゼは、アルファ、ベータ及びガンマサブユニットを含有し、これらは全て酵素の機能に必要である。例示的な遺伝子候補は、肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)(Tobimatsuら,Biosci.Biotechnol.Biochem.62:1774−1777(1998年);Torayaら,Biochem.Biophys.Res.Commun.69:475−480(1976年))、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)(Bobikら,J.Bacteriol.179:6633−6639(1997年))、クレブシエラ・オキシトカ(Tobimatsuら,J.Biol.Chem.270:7142−7148(1995年))及びラクトバチルス・コリノイデス(Lactobacillus collinoides)(Sauvageotら,FEMS Microbiol.Lett.209:69−74(2002年))でみられる。他の生物におけるジオールデヒドラターゼ遺伝子候補を単離する方法は、当技術分野において周知である(例えば、米国特許第5,686,276号を参照されたい)。
グリセロールデヒドラターゼファミリー(EC4.2.1.30)の酵素も、2−C−メチル−D−エリトリトール−4−リン酸を脱水するために使用することができる。例示的な遺伝子候補は、肺炎杆菌におけるgldABC及びdhaB123(国際公開第2008/137403号及びTorayaら,Biochem.Biophys.Res.Commun.69:475−480(1976年))、クロストリジウム・パストゥリアヌム(Clostridium pasteuranum)におけるdhaBCE(Macisら,FEMS Microbiol Lett.164:21−28(1998年))、及びシトロバクター・フロインデイにおけるdhaBCE(Seyfriedら,J.Bacteriol.178:5793−5796(1996年))によってコードされている。ベータサブユニットの2つの残基に突然変異を導入することにより、80〜336倍増強された活性を有する肺炎杆菌由来のB12依存性ジオールデヒドラターゼの変異体が最近作製された(Qiら,J.Biotechnol.144:43−50(2009年))。低い不活化速度を有するジオールデヒドラターゼ酵素は、エラープローンPCRを用いてDuPontにより開発された(国際公開第2004/056963号)。
B12依存性ジオールデヒドラターゼを利用する場合、対応する再活性化因子の異種発現が推奨される。B12依存性ジオールデヒドラターゼは、基質及び幾つかの下流産物による作用機序に基づく自殺活性化を起こす。不活性コバラミンとの緊密な結合により引き起こされる不活化は、ATP依存性プロセスにおけるジオールデヒドラターゼ再活性化因子により部分的に克服することができる。B12補因子の再生は、更なるATPを必要とする。ジオールデヒドラターゼ再生因子は、2つのサブユニットのタンパク質である。例示的な候補は、クレブシエラ・オキシトカ(Moriら,J.Biol.Chem.272:32034−32041(1997年))、ネズミチフス菌(Bobikら,J.Bacteriol.179:6633−6639(1997年);Chenら,J.Bacteriol.176:5474−5482(1994年))、ラクトバチルス・コリノイデス(Sauvageotら,FEMS Microbiol.Lett.209:69−74(2002年))及び肺炎杆菌(Klebsiella pneumonia)(国際公開第2008/137403号)でみられる。
B12非依存性ジオールデヒドラターゼ酵素は、補因子としてS−アデノシルメチオニン(SAM)を利用し、厳密な嫌気条件下で機能し、特定の活性化酵素による活性化を必要とする(Freyら,Chem.Rev.103:2129−2148(2003年))。dhaB1及びdhaB2によってコードされている酪酸菌(Clostridium butyricum)のグリセロールデヒドロゲナーゼ及び対応する活性化因子は、よく特性評価されている(O’Brienら,Biochemistry 43:4635−4645(2004年);Raynaudら,Proc.Natl.Acad.Sci USA 100:5010−5015(2003年))。この酵素は、大腸菌の1,3−プロパンジオール過剰産生株において最近使用され、非常に高力価の産物を得ることができた(Tangら,Appl.Environ.Microbiol.75:1628−1634(2009年))。ロゼブリア・イヌリニボランス(Roseburia inulinivorans)由来の更なるB12非依存性ジオールデヒドラターゼ酵素及び活性化因子は、2,3−ブタンジオールの2−ブタノンへの変換を触媒することが示された(米国特許出願公開第2009/09155870号)。
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(DHAD、EC4.2.1.9)は、分岐鎖アミノ酸の生合成に関与するB12非依存性酵素である。そのネイティブな役割においては、2,3−ジヒドロキシ−3−メチル吉草酸をイソロイシンの前駆体である2−ケト−3−メチル−吉草酸に変換する。バリンの生合成においては、前記酵素は、2,3−ジヒドロキシ−イソ吉草酸の2−オキソイソ吉草酸への脱水を触媒する。スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)由来のDHADは広い基質範囲を有し、そして、大腸菌において発現した組み換え酵素の活性が様々なアルドン酸に対して実証された(Kim及びLee,J.Biochem.139:591−596(2006年))。S.ソルファタリカス酵素は、多くのジオールデヒドラターゼ酵素とは異なり酸素耐性である。ilvDによってコードされている大腸菌の酵素は、その鉄−硫黄クラスターを不活化する酸素に対して感受性である(Flintら,J.Biol.Chem.268:14732−14742(1993年))。類似する酵素がアカパンカビ(Neurospora crassa)(Altmiller及びWagner,Arch.Biochem.Biophys.138:160−170(1970年))及びネズミチフス菌(Armstrongら,Biochim.Biophys.Acta 498:282−293(1977年))で特性評価されている。
ジオールデヒドラターゼミオ−イノソーゼ−2−デヒドラターゼ(EC4.2.1.44)は、別の例示的な候補である。ミオ−イノソーゼは、隣接するアルコール基を含有する六員環である。ミオ−イノソーゼ−2−デヒドラターゼ機能をコードする精製酵素は、ミオイノシトール分解についてクレブシエラ・アエロゲネスにおいて研究されているが(Berman及びMagasanik,J.Biol.Chem.241:800−806(1966年))、現在まで関連する遺伝子は同定されていない。シノリゾビウム・フレディ(Sinorhizobium fredii)のミオ−イノソーゼ−2−デヒドラターゼは、大腸菌でクローニングされ、機能的に発現した(Yoshidaら,Biosci .Biotechnol.Biochem.70:2957−2964(2006年))。iolEによってコードされている枯草菌由来の類似する酵素についても研究されている(Yoshidaら,Microbiology 150:571−580(2004年))。
実施例IV
シキミ酸経路酵素により(2−ヒドロキシ−3−メチル−4−オキソブトキシ)ホスホン酸からp−トルイル酸を合成するための例示的な経路
この実施例は、シキミ酸経路酵素を用いてp−トルイル酸を合成するための例示的な経路について記載する。
p−トルイル酸の化学構造は、電子伝達体ユビキノンの前駆体であるp−オキシ安息香酸と非常に類似している。4−ヒドロキシ安息香酸は、細菌、植物及び真菌でみられるシキミ酸経路における酵素によって中央代謝前駆体から合成される。シキミ酸経路は、D−エリトロース−4−リン酸(E4P)及びホスホエノールピルビン酸(PEP)をコリスミ酸に転換する7つの酵素的段階で構成される。経路酵素としては、2−デヒドロ−3−デオキシホスホヘプトン酸(DAHP)シンテターゼ、デヒドロキナ酸(DHQ)シンテターゼ、DHQデヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸(EPSP)シンテターゼ及びコリスミ酸シンテターゼが挙げられる。経路の最初の段階では、エリトロース−4−リン酸及びホスホエノールピルビン酸がDAHPシンテターゼによって連結されて、3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソナート−7−リン酸を形成する。次いで、この化合物は脱リン酸化され、脱水され、還元されて、シキミ酸を形成する。シキミ酸は、3つの酵素:シキミ酸キナーゼ、3−ホスホシキミ酸−2−カルボキシビニルトランスフェラーゼ及びコリスミ酸シンテターゼの作用によってコリスミ酸に変換される。その後の、コリスミ酸の4−ヒドロキシ安息香酸への変換は、コリスミ酸リアーゼによって触媒される。
p−トルイル酸の合成は、図6に示す方法と同様の方法で進行する。前記経路は、PEP及び2H3M4OP(E4Pの3−ヒドロキシル基の代りのメチル基を有するE4Pと類似する化合物)で出発する。E4Pのヒドロキシル基は、シキミ酸経路の反応の化学作用に直接関与しないので、メチル置換2H3M4OP前駆体が代替基質として反応すると予測される。指向又は適応進化を用いて、基質としての2H3M4OP及び下流の誘導体に対する選好性を改善することができる。このような方法は、当技術分野において周知である。
また、シキミ酸経路酵素を通る流れの効率を改善するための株改変ストラテジーも適用可能である。グルコース輸送系を変化させることにより、経路前駆体PEPの利用可能性を上昇させることができる(Yiら,Biotechnol.Prog.19:1450−1459(2003年))。4−ヒドロキシ安息香酸過剰産生株を、3−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−7−リン酸シンテターゼのフィードバック非感受性アイソザイムの過剰発現を用いてシキミ酸経路を通る流れが改善されるように改変した(Barker及びFrost,Biotechnol.Bioeng.76:376−390(2001年))。更に、シキミ酸経路酵素及びコリスミ酸リアーゼの発現レベルが高まった。p−トルイル酸を過剰産生する株において同様のストラテジーを使用することができる。
A.2−デヒドロ−3−デオキシホスホヘプトン酸シンテターゼ(EC2.5.1.54)。エリトロース−4−リン酸及びホスホエノールピルビン酸の縮合は、2−デヒドロ−3−デオキシホスホヘプトン酸(DAHP)シンテターゼ(EC2.5.1.54)によって触媒される。この酵素の3つのアイソザイムは、aroG、aroF及びaroHによって大腸菌ゲノムにコードされており、それぞれ、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンによるフィードバック阻害の対象である。最小培地で増殖させた野生型の細胞では、aroG、aroF及びaroHの遺伝子産物は、それぞれ、DAHPシンテターゼ活性の80%、20%及び1%に寄与した(Hudson及びDavidson,J.Mol.Biol.180:1023−1051(1984年))。AroGの2つの残基が、フェニルアラニンによる阻害を軽減することが見出された(Kikuchiら,Appl.Environ.Microbiol.63:761−762(1997年))。チロシンによるAroFのフィードバック阻害は、単一塩基対の変化により取り除かれた(Weaver及びHerrmann,J.Bacteriol.172:6581−6584(1990年))。チロシン非感受性DAHPシンテターゼは、大腸菌の4−ヒドロキシ安息香酸過剰産生株において過剰発現した(Barker及びFrost,Biotechnol.Bioeng.76:376−390(2001年))。aroG遺伝子産物は、様々な別の4又は5炭素長の基質を受容することが示された(Sheflyanら,J.Am.Chem.Soc.120(43):11027−11032(1998年);Williamsonら,Bioorg.Med.Chem.Lett.15:2339−2342(2005年))。酵素は、(3S)−2−デオキシエリトロース−4−リン酸(エリトロース−4−リン酸と類似しているが、2位のアルコールが存在しない基質)と効率的に反応する(Williamsonら,上記,2005)。ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)及びパイロコッカス・フリオサス由来の酵素も、この代替基質を受容し(Schofieldら,Biochemistry 44:11950−11962(2005年));Webbyら,Biochem.J.390:223−230 2005))、大腸菌で発現している。野性型の大腸菌AroG酵素とは7つのアミノ酸が異なるDAHPシンテターゼの進化した変異体は、Kcat/KMにおいて60倍の改良を示すことが示された(Ran及びFrost,J.Am.Chem.Soc.129:6130−6139(2007年))。
B.3−デヒドロキナ酸シンテターゼ(EC4.2.3.4)。図2に示す通り、基質(2)(2,4−ジヒドロキシ−5−メチル−6−[(ホスホノオキシ)メチル]オキサン−2−カルボン酸)の基質(3)(1,3−ジヒドロキシ−4−メチルシクロヘキサ−1−エン−1−カルボン酸)への脱リン酸化は、3−デヒドロキナ酸シンテターゼによる3−デオキシ−アラビノ−ヘプツロナート−7−リン酸の脱リン酸化と類似している。酵素は、大腸菌(Mehdiら,Methods Enzymol.142:306−314(1987年)、枯草菌(Hasan及びNester,J.Biol.Chem.253:4999−5004(1978年))、及び結核菌H37Rv(de Mendoncaら,J.Bacteriol.189:6246−6252(2007年))において特性評価されている。大腸菌の酵素は、L−チロシンにより阻害される(Barker及びFrost,Biotechnol.Bioeng.76:376−390(2001年))。
C.3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ(EC4.2.1.10)。3−デヒドロキネース(DHQase)と名付けられた3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼは、自然界において、図2のp−トルイル酸経路における工程Cと同様に、3−デヒドロキナ酸の3−デヒドロシキミ酸への脱水を触媒する。DHQase酵素は、機序、立体化学及び配列相同性に基づいて2つのクラスに分類することができる(Gourleyら,Nat.Struct.Biol.6:521−525.(1999年))。一般に、1型酵素は生合成に関与し、一方、2型酵素は、逆(分解)方向に作用する。大腸菌(Kinghornら,Gene 14:73−80.1981年))、腸チフス菌(Salmonella typhi)(Kinghornら,上記,1981年;Servosら,J.Gen.Microbiol.137:147−152(1991年))及び枯草菌(Warburgら,Gene 32:57−66 1984年))由来の1型酵素がクローニングされ、特性評価されている。例示的なII型の3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ酵素は、結核菌、ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)(Evansら,FEBS Lett.530:24−30(2002年))、及びヘリコバクター・ピロリ(Leeら,Proteins 51:616−7(2003年))でみられる。
D.シキミ酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.25)。シキミ酸デヒドロゲナーゼは、図2の工程Dと同様に、3−デヒドロシキミ酸のシキミ酸へのNAD(P)H依存性還元を触媒する。大腸菌ゲノムは、異なる補因子特異性を有する2つのシキミ酸デヒドロゲナーゼパラログをコードする。aroEによってコードされている酵素は、NADPH特異的であり、一方、ydiB遺伝子産物は、補因子としてNADH(好ましい)又はNADPHを利用することができるキナ酸/シキミ酸デヒドロゲナーゼである(Michelら,J.Biol.Chem.278:19463−19472(2003年))。結核菌(Zhangら,J.Biochem.Mol.Biol.38:624−631(2005年))、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)(Yeら,J.Bacteriol.185:4144−4151(2003年))及びヘリコバクター・ピロリ(Hanら,FEBS J.273:4682−4692(2006年))由来のNADPH依存性酵素は、大腸菌において機能的に発現した。
E.シキミ酸キナーゼ(EC2.7.1.71)。シキミ酸キナーゼは、図2の工程Eと同様に、シキミ酸類似体の3−ヒドロキシル基のATP依存性リン酸化を触媒する。2つのシキミ酸キナーゼ酵素が、大腸菌におけるaroK(SK1)及びaroL(SK2)によってコードされている(DeFeyter及びPittard,J.Bacteriol.165:331−333(1986年);Lobner−Olesen及びMarinus,J.Bacteriol.174:525−529(1992年))。aroLによってコードされているSK2のKmは、SK1のKmよりも100倍低く、これは、この酵素が芳香族生合成に関与することを示す(DeFeyterら,上記,1986)。結核菌(Guら,J.Mol.Biol.319:779−789(2002年));Oliveiraら,Protein Expr.Purif.22:430−435(2001年)(doi:10.1006/prep.2001.1457,doi;S1046−5928(01)91457−3,pii)、ヘリコバクター・ピロリ(Chengら,J.Bacteriol.187:8156−8163(2005年))及び黒脚病菌(Erwinia chrysanthemi)(Krellら,Protein Sci.10:1137−1149(2001年))由来の更なるシキミ酸キナーゼ酵素が、大腸菌でクローニングされている。
F.3−ホスホシキミ酸−2−カルボキシビニルトランスフェラーゼ(EC2.5.1.19)。5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンテターゼ(EPSPS)としても知られている3−ホスホシキミ酸−2−カルボキシビニルトランスフェラーゼは、ホスホエノールピルビン酸のエノールピルビル部分のシキミ酸−3−リン酸の5−ヒドロキシルへの転移を触媒する。この酵素は、大腸菌におけるaroAによってコードされている(Andersonら,Biochemistry 27:1604−1610(1988年))。結核菌(Oliveiraら,Protein Expr.Purif.22:430−435(2001年))、ドナリエラ・サリナ(Dunaliella salina)(Yiら,J.Microbiol.45:153−157(2007年))及び黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(Priestmanら,FEBS Lett.579:728−732(2005年))由来のEPSPS酵素は、大腸菌でクローニングされ、機能的に発現している。
G.コリスミ酸シンテターゼ(EC4.2.3.5)。コリスミ酸シンテターゼは、5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸のコリスミ酸への転換を触媒する、シキミ酸経路の7番目の酵素である。この酵素は補因子として還元型フラビンモノヌクレオチド(FMN)を必要とするが、酵素の正味の反応は酸化還元変化を含まない。植物及び細菌でみられる酵素とは対照的に、真菌におけるコリスミ酸シンテターゼは、NADPHと引き換えにFMNを減少させることもできる(Macherouxら,Planta 207:325−334(1999年))。代表的な単機能酵素は、大腸菌のaroC(Whiteら,Biochem.J.251:313−322(1988年))及び肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)(Maclean及びAli,Structure 11:1499−1511(2003年)(doi:S0969212603002648,pii)によってコードされている。真菌の二機能酵素は、アカパンカビ(Kitzingら,J.Biol.Chem.276:42658−42666(2001年))及び出芽酵母(Jonesら,Mol.Microbiol.5:2143−2152(1991年))でみられる。
H.コリスミ酸リアーゼ(EC4.1.3.40)。コリスミ酸リアーゼは、ユビキノン生合成における最初の関与段階:コリスミ酸からピルビン酸を除去して4−ヒドロキシ安息香酸を形成する段階を触媒する。この酵素反応は、4−ヒドロキシ安息香酸生成物の緩徐な放出により速度が制限され(Gallagherら,Proteins 44:304−311(2001年))、これは、下流の膜結合酵素への4−ヒドロキシ安息香酸の送達において役割を果たすと考えられる。大腸菌のコリスミ酸リアーゼは、クローニングされ、特性評価されており、またこの酵素は、結晶化されている(Gallagherら,上記,2001;Siebertら,FEBS Lett.307:347−350(1992年))。構造学的研究により、G90残基が生成物阻害の一因とされている(Smithら,Arch.Biochem.Biophys.445:72−80(2006年))。2つの表面活性システイン残基の改変により、タンパク質の凝集が減少した(Holdenら,Biochim.Biophys.Acta 1594:160−167(2002年))。組み換え型の結核菌コリスミ酸リアーゼは、大腸菌においてクローニングされ、特性評価されている(Stadthagenら,J.Biol.Chem.280:40699−40706(2005年))。
B−F.多機能AROMタンパク質。ほとんどの細菌では、シキミ酸経路酵素は別々のポリペプチドによってコードされている。微生物の真核生物では、5つの酵素機能が、五機能超遺伝子によりコードされている多機能タンパク質により触媒される(Campbellら,Int.J.Parasitol.34:5−13(2004年))。多機能AROMタンパク質複合体は、図2の反応B〜Fと同様の反応を触媒する。AROMタンパク質複合体は、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アカパンカビ、出芽酵母及びニューモシスティス・カリニ(Pneumocystis carinii)を含む真菌において特性評価されている(Banerjiら,J.Gen.Microbiol.139:2901−2914(1993年);Charlesら,Nucleic Acids Res.14:2201−2213(1986年);Cogginsら,Methods Enzymol.142:325−341(1987年);Duncan,K.,Biochem.J.246:375−386(1987年))。AROMの幾つかの構成要素は、個々のポリペプチドとして独立に機能することが示されている。例えば、デヒドロキナ酸シンテターゼ(DHQS)は、AROMのアミノ末端ドメインを形成し、大腸菌にクローニングしたとき独立に機能し得る(Mooreら,Biochem.J.301(Pt1):297−304(1994年))。アスペルギルス・ニデュランス由来のAROMの構成要素の幾つかの結晶構造は、触媒機序を理解する手がかりとなる(Carpenterら,Nature 394:299−302(1998年))。
実施例V
p−トルイル酸をテレフタル酸に酵素転換するための例示的な経路
この実施例は、p−トルイル酸をテレフタル酸(PTA)に変換するための例示的な経路について記載する。
p−トルイル酸は、更に、図3に示す通り3つの酵素的段階でメチル基を酸に酸化させることによりPTAに転換され得る。この経路は、p−トルイル酸メチル−モノオキシゲナーゼレダクターゼ、4−カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ、及び4−カルボキシベンジルアルデヒドデヒドロゲナーゼで構成される。最初の段階では、p−トルイル酸メチル−モノオキシゲナーゼは、O2の存在下でp−トルイル酸を4−カルボキシベンジルアルコールに酸化する。基質としての4−トルエンスルホネートと反応する、コマモナス・テストステローニ酵素(Comamonas testosteroni)(tsaBM)は、精製され、特性評価されている(Locherら,J.Bacteriol.173:3741−3748(1991年))。4−カルボキシベンジルアルコールは、次いで、4−カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ(tsaC)によりアルデヒドに変換される。アルデヒドの酸への転換は、4−カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ(tsaD)によって触媒される。これら反応を触媒する酵素は、炭素及びエネルギーの唯一の供給源としてp−トルイル酸を利用することができる生物であるコマモナス・テストステローニT−2においてみられる(Junkerら,J.Bacteriol.179:919−927(1997年))。特に、バークホルデリア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、スフィンゴモナス属(Sphingomonas)及びコマモナス属のプロテオバクテリアに対する配列相同性により、p−トルイル酸をPTAに転換する更なる遺伝子を見出すことができる(米国特許第6,187,569号及び米国特許出願公開第2003/0170836号)。コマモナス・テストステローニ酵素に関連するGenbank識別子を以下に列挙する。
実施例VI 2H4OPからの安息香酸の合成
この実施例は、シキミ酸経路酵素による2H4OPからの安息香酸の合成(図9)、及び安息香酸経路前駆体2H4OPを生成するための例示的な経路(図8)を示す。
p−トルイル酸のように、安息香酸の化学構造は、実施例IVに上記したシキミ酸経路の生成物であるp−ヒドロキシ安息香酸に類似している。この実施例では、シキミ酸経路酵素を利用して、図9に示される経路によって経路前駆体(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホン酸(2H4OP)から安息香酸を合成する。2H4OPに対するシキミ酸経路酵素の反応性、及び安息香酸形成において使用される代替基質は、任意で、基質としての2H4OP及び下流の誘導体に対する選好性を改善するために指向又は適応進化により最適化されてもよい。このような方法は、当技術分野において周知であり、本明細書に記載される。
安息香酸経路前駆体である(2−ヒドロキシ−4−オキソブトキシ)ホスホン酸(2H4OP)を合成するための例示的且つ新規な経路を図8に示す。この経路では、2H4OPは、2つの酵素的段階で中央代謝産物エリトロース−4−リン酸から誘導される。最初の段階では、ジオールデヒドラターゼは、エリトロース−4−リン酸を(2,4−ジオキソブトキシ)ホスホン酸(24DBP)に転換する。24DBPの2−ケト基は、次いで、24DBPレダクターゼ活性を有するオキシドレダクターゼによって2H4OPのアルコールに還元される。図8の工程A及びBのための例示的な酵素を以下に示す。
A.エリトロース−4−リン酸デヒドラターゼ:ECクラス4.2.1におけるジオールデヒドラターゼ酵素は、エリトロース−4−リン酸を24DBPに変換するために使用される(図4、工程A)。この転換を触媒する酵素は示されていないが、ジヒドロキシ−酸デヒドラターゼ(EC4.2.1.9)、プロパンジオールデヒドラターゼ(EC4.2.1.28)、グリセロールデヒドラターゼ(EC4.2.1.30)及びミオ−イノシトールデヒドラターゼ(EC4.2.1.44)を含む幾つかの酵素は、類似の転換を触媒する。例示的なジオールデヒドラターゼ酵素は、実施例IIIに上記されている。
二級ジオールである2,3−ブタンジオールを2−ブタノンに変換することができるジオールデヒドラターゼ又はプロパンジオールデヒドラターゼ酵素(EC4.2.1.28)を、この転換に用いることができる。アデノシルコバラミン−又はB12−依存性ジオールデヒドラターゼは、アルファ、ベータ及びガンマサブユニットを含有し、これらは全て酵素の機能に用いられる。例示的な遺伝子は、肺炎杆菌(Tobimatsuら,Biosci.Biotechnol.Biochem.62:1774−1777(1998年);Torayaら,Biochem.Biophys.Res.Commun.69:475−480(1976年))、ネズミチフス菌(Bobikら,J.Bacteriol.179:6633−6639(1997年))、クレブシエラ・オキシトカ(Tobimatsuら,J.Biol.Chem.270:7142−7148(1995年))及びラクトバチルス・コリノイデス(Sauvageotら,FEMS Microbiol.Lett.209:69−74(2002年))でみられる。他の生物におけるジオールデヒドラターゼ遺伝子を単離する方法は、全文が参照により本明細書に援用される米国特許第5,686,276号に例証されている通り、当技術分野において周知である。
グリセロールデヒドラターゼファミリー(EC4.2.1.30)の酵素も、エリトリトール−4−リン酸を脱水するために使用することができる。例示的な遺伝子としては、肺炎杆菌におけるgldABC及びdhaB123(国際公開第2008/137403号及びTorayaら,Biochem.Biophys.Res.Commun.69:475−480(1976年))、クロストリジウム・パストゥリアヌム(Clostridium pasteurianum)におけるdhaBCE(Macisら,FEMS Microbiol Lett.164:21−28(1998年))、及びシトロバクター・フロインデイにおけるdhaBCE(Seyfriedら,J.Bacteriol.178:5793−5796(1996年))が挙げられる。ベータサブユニットの2つの残基に突然変異を導入することにより、80〜336倍増強された活性を有する肺炎杆菌由来のB12依存性ジオールデヒドラターゼの変異体が最近作製された(Qiら,J.Biotechnol.144:43−50(2009年))。低い不活化速度を有するジオールデヒドラターゼ酵素は、エラープローンPCRを用いてDuPontにより開発された(国際公開第2004/056963号)。
B12依存性ジオールデヒドラターゼを利用する場合、対応する再活性化因子の異種発現が有用である。B12依存性ジオールデヒドラターゼは、基質及び幾つかの下流産物による作用機序に基づく自殺活性化を起こす。不活性コバラミンとの緊密な結合により引き起こされる不活化は、ATP依存性プロセスにおけるジオールデヒドラターゼ再活性化因子により部分的に克服することができる。B12補因子の再生は、ATP依存性である。ジオールデヒドラターゼ再生因子は、2つのサブユニットのタンパク質である。例示的な遺伝子は、クレブシエラ・オキシトカ(Moriら,J.Biol.Chem.272:32034−32041(1997年))、ネズミチフス菌(Bobikら,J.Bacteriol.179:6633−6639(1997年);Chenら,J.Bacteriol.176:5474−5482(1994年))、ラクトバチルス・コリノイデス(Sauvageotら,FEMS Microbiol.Lett.209:69−74(2002年))及び肺炎杆菌(国際公開第2008/137403号)でみられる。
B12非依存性ジオールデヒドラターゼ酵素は、補因子としてとしてS−アデノシルメチオニン(SAM)を利用し、厳密な嫌気条件下で機能し、特定の活性化酵素による活性化を必要とする(Freyら,Chem.Rev.103:2129−2148(2003年))。dhaB1及びdhaB2によってコードされている酪酸菌のグリセロールデヒドロゲナーゼ及び対応する活性化因子は、よく特性評価されている(O’Brienら,Biochemistry 43:4635−4645(2004年);Raynaudら,Proc.Natl.Acad.Sci USA 100:5010−5015(2003年))。この酵素は、大腸菌の1,3−プロパンジオール過剰産生株において最近使用され、非常に高力価の産物を得ることができた(Tangら,Appl.Environ.Microbiol.75:1628−1634(2009年))。ロゼブリア・イヌリニボランス由来の更なるB12非依存性ジオールデヒドラターゼ酵素及び活性化因子は、2,3−ブタンジオールの2−ブタノンへの変換を触媒することが示された(米国特許出願公開第2009/09155870号)。
ジヒドロキシ−酸デヒドラターゼ(DHAD、EC4.2.1.9)は、分岐鎖アミノ酸の生合成に関与するB12非依存性酵素である。そのネイティブな役割においては、2,3−ジヒドロキシ−3−メチル吉草酸をイソロイシンの前駆体である2−ケト−3−メチル−吉草酸に変換する。バリンの生合成においては、前記酵素は、2,3−ジヒドロキシ−イソ吉草酸の2−オキソイソ吉草酸への脱水を触媒する。スルホロブス・ソルファタリカス由来のDHADは広い基質範囲を有し、そして、大腸菌において発現した組み換え酵素の活性が様々なアルドン酸に対して実証された(Kim及びLee,J.Biochem.139:591−596(2006年))。S.ソルファタリカス酵素は、多くのジオールデヒドラターゼ酵素とは異なり酸素に対して耐性である。ilvDによってコードされている大腸菌の酵素は、その鉄−硫黄クラスターを不活化する酸素に対して感受性である(Flintら,J.Biol.Chem.268:14732−14742(1993年))。類似する酵素がアカパンカビ(Altmiller及びWagner,Arch.Biochem.Biophys.138:160−170(1970年))及びネズミチフス菌(Armstrongら,Biochim.Biophys.Acta 498:282−293(1977年))で特性評価されている。
ジオールデヒドラターゼミオ−イノソーゼ−2−デヒドラターゼ(EC4.2.1.44)は、別の例示的な酵素である。ミオ−イノソーゼは、隣接するアルコール基を含有する六員環である。ミオ−イノソーゼ−2−デヒドラターゼ機能をコードする精製酵素は、ミオイノシトール分解についてクレブシエラ・アエロゲネスにおいて研究されているが(Berman及びMagasanik,J.Biol.Chem.241:800−806(1966年))、現在まで関連する遺伝子は同定されていない。シノリゾビウム・フレディのミオ−イノソーゼ−2−デヒドラターゼは、大腸菌でクローニングされ、機能的に発現した(Yoshidaら,Biosci .Biotechnol.Biochem.70:2957−2964(2006年))。iolEによってコードされている枯草菌由来の類似する酵素についても研究されている(Yoshidaら,Microbiology 150:571−580(2004年))。
B.(2,4−ジオキソブトキシ)ホスホン酸レダクターゼ:(2,4−ジオキソブトキシ)ホスホン酸レダクターゼ活性を有する酵素は、24DBPを2H4OPに変換するために使用される。この化合物は、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素の公知の基質ではないが、ECクラス1.1.1における幾つかの酵素は、類似する反応を触媒する。リン酸化型基質のケトンを還元する例示的な酵素としては、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.8)、3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.95)及びエリトロネート−4−リン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.290)が挙げられる。グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼは、ジヒドロキシアセトリン酸のグリセロール−3−リン酸へのNAD(P)H依存性還元を触媒する。この酵素は、大腸菌のgpsAによってコードされている(Kitoら,J Biol.Chem.244:3316−3323(1969年))。3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、大腸菌(遺伝子serAによってコードされている)を含む幾つかの生物においてセリン生合成の最初の段階を触媒する(Tobeyら,J Biol.Chem.261:12179−12183(1986年))。エリトロネート−4−リン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.290)は、2−オキソ−3−ヒドロキシ−4−ホスホブタン酸のエリトロネート−4−リン酸への可逆的な還元を触媒する。大腸菌のpdxBによってコードされているこの酵素は、通常、ピリドキサル−5’−リン酸生合成について逆方向に作用する(Schoenleinら,J Bacteriol.171:6084−6092(1989年))。緑膿菌におけるpdxBによってコードされている類似の酵素が、大腸菌で特性評価されており、異種発現されている(Haら,Acta Crystallogr.Sect.F.Struct.Biol.Cryst.Commun.62:139−141(2006年))。
広範なアルコールデヒドロゲナーゼ酵素が、ケトンのアルコール官能基への還元を触媒する。大腸菌由来のこのような2つの酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(mdh)及び乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhA)によりコードされている。ラルストニア・ユートロファに由来する乳酸デヒドロゲナーゼは、乳酸、2−オキソ酪酸、2−オキソペンタン酸及び2−オキソグルタル酸を含む様々な鎖長の2−ケト酸に対して高い活性を示すことが実証されている(Steinbuchelら,Eur.J.Biochem.130:329−334(1983年))。α−ケトアジピン酸のα−ヒドロキシアジピン酸への変換は、ラット及びヒトの胎盤にみられることが報告されている酵素である2−ケトアジピン酸レダクターゼにより触媒され得る(Sudaら,Arch.Biochem.Biophys.176:610−620(1976年);Sudaら,Biochem.Biophys.Res.Commun.77:586−591(1977年))。更なるオキシドレダクターゼは、既にクローニングされ、特性評価されているヒトの心臓に由来するミトコンドリアの3−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ(bdh)である(Marksら,J.Biol.Chem.267:15459−15463(1992年))。C.ベエイジェリンキー(Ismaielら,J.Bacteriol.175:5097−5105(1993年))及びT.ブロッキイ(Lamedら,Biochem.J.195:183−190(1981年);Peretzら,Biochemistry 28:6549−6555(1989年))のアルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、アセトンをイソプロパノールに変換する。メチルエチルケトンレダクターゼ、あるいは2−ブタノールデヒドロゲナーゼは、MEKの還元を触媒して2−ブタノールを形成する。例示的な酵素は、ロドコッカス・ルーバー(Kosjekら,Biotechnol Bioeng.86:55−62(2004年))及びパイロコッカス・フリオサス(van derら,Eur.J.Biochem.268:3062−3068(2001年))において見出すことができる。
Matsuyamaら((1995年))によって記載されている通り、特にバチルス属、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium)、カンジダ属(Candida)及びクレブシエラ属に属するものを含む多くの生物は、4−ヒドロキシ−2−ブタノンの1,3−ブタンジオールへの還元を触媒することができる。突然変異型のロドコッカス属のフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ(Sar268)及びレイフソニア属のアルコールデヒドロゲナーゼも、高収率でこの転換を触媒することが示されている(Itohら,Appl.Microbiol Biotechnol.75:1249−1256(2007年))。
ホモセリンデヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.13)は、アスパラギン酸セミアルデヒドのホモセリンへのNAD(P)H依存性還元を触媒する。大腸菌を含む多くの生物では、ホモセリンデヒドロゲナーゼは、アスパラギン酸のアスパルチル−4−リン酸へのATP依存性変換も触媒する二機能酵素である(Starnesら,Biochemistry 11:677−687(1972年))。機能ドメインは、触媒的に独立であり、リンカー領域によって連結され(Sibilliら,J Biol.Chem.256:10228−10230(1981年))、また、両方のドメインはトレオニンによるアロステリック阻害に供される。thrAによってコードされている大腸菌酵素のホモセリンデヒドロゲナーゼドメインは、アスパラギン酸キナーゼドメインから分離され、特性評価され、高い触媒活性及びトレオニンによる阻害の減少を示すことが見出されている(Jamesら,Biochemistry 41:3720−3725(2002年))。これは、例えば、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)(Cahyantoら,Microbiology 152:105−112(2006年))及びシロイヌナズナのhom1を含む他の二機能トレオニンキナーゼに適用することができる。出芽酵母におけるhom6(Jacquesら,Biochim.Biophys.Acta 1544:28−41(2001年))及びラクトバチルス・プランタルムにおけるhom2(Cahyantoら,Microbiology 152:105−112(2006年))によってコードされている単機能ホモセリンデヒドロゲナーゼは、大腸菌において機能的に発現しており、特性評価されている。
実施例VII
ベンゼン及びトルエンへの経路
この実施例は、安息香酸及びベンゾイル−CoAからベンゼンへ、並びにp−トルイル酸及びp−メチルベンゾイル−CoAからトルエンへの経路を示す。
安息香酸又はベンゾイル−CoAからベンゼンを酵素的に生成するための経路を、図10に示す。安息香酸及びベンゾイル−CoAは、多様な芳香族分解経路に共通の天然に存在する中間代謝産物である。また、安息香酸は、本明細書に記載する別のシキミ酸経路によって生成することもできる。安息香酸及び/又はベンゾイル−CoAからベンゼンへの幾つかの経路を図10に示す。まず、脱炭酸を介して安息香酸から直接ベンゼンを生成することができる(図10、経路E)。あるいは、安息香酸レダクターゼにより直接(図10、経路B)、又はベンゾイル−CoA及び/若しくは(ベンゾイルオキシ)ホスホン酸中間体を介して間接的に(図10、経路A及びD、経路B、経路H及びG、又は経路A、F、及びG)、酸部分をアルデヒドに還元してもよい。次いで、ベンズアルデヒドを脱カルボニル化してベンゼンを形成することができる(図10、経路C)。
p−トルイル酸及び/又はp−メチルベンゾイル−CoAからトルエンを酵素的に生成するための類似する経路を図11に示す。p−トルイル酸は、本明細書に記載する別のシキミ酸経路によって生成することができる。p−トルイル酸(p−安息香酸メチルとしても知られている)及び/又はp−メチルベンゾイル−CoAをトルエンに変換するための経路は、上記安息香酸又はベンゾイル−CoAのベンゼンへの転換と類似している。図10及び11に示す転換を触媒するための酵素をEC番号により分類し、更に以下に記載する。
1.2.1.b オキシドレダクターゼ(アシル−CoAからアルデヒドへ):ベンゾイル−CoAレダクターゼ活性を有する酵素を用いて、ベンゾイル−CoAをベンズアルデヒドに変換する(図10の経路D)。同様に、p−メチルベンゾイル−CoAのp−メチルベンズアルデヒド(p−トルアルデヒドとも呼ばれる)への還元は、p−メチルベンゾイル−CoAレダクターゼ活性を有する酵素によって触媒される(図11の経路D)。これらの活性を有する酵素は特性評価されていないが、類似の反応を触媒する酵素は、シンナモイル−CoAレダクターゼ(EC1.2.1.44)である。この酵素は、シンナモイル−CoA、並びにクマロイル−CoA及びフェルロイル−CoA等の置換芳香族誘導体のNAD(P)H依存性還元を触媒する。この酵素は、シロイヌナズナ(Lauvergeatら,Phytochemistry 57:1187−1195(2001年))、コムギ(Triticum aestivum)及びスイッチグラス(Panicum virgatum)(Escamilla−Trevinoら,New Phytol.185:143−155(2010年))を含む生物において特性評価されている。シロイヌナズナ及びスイッチグラス由来の酵素は、大腸菌で特性評価され、異種発現した。
他の幾つかの十分に特性評価されているアシル−CoAレダクターゼは、アシル−CoAを対応するアルデヒドに還元する。例示的な酵素としては、脂肪酸アシル−CoAレダクターゼ(EC1.2.1.50)、スクシニル−CoAレダクターゼ(EC1.2.1.76)、アセチル−CoAレダクターゼ(EC1.2.1.10)及びブチリル−CoAレダクターゼが挙げられる。例示的な脂肪酸アシル−CoAレダクターゼ酵素は、アシネトバクター・カルコアセティカス(Reiserら,179:2969−2975(1997年))及びアシネトバクター属の種M−1(Ishigeら,Appl.Environ.Microbiol.68:1192−1195(2002年))のacr1によってコードされている。スクシニル−CoAレダクターゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム・クルイベリのsucD(Sohlingら,J Bacteriol.178:871−880(1996年a);Sohlingら,178:871−80(1996年))及びP.ジンジバリス(P.gingivalis)のsucD(Takahashiら,J.Bacteriol.182:4704−4710(2000年))によってコードされている。更なるスクシニル−CoAレダクターゼ酵素は、メタッロスパエラ・セデュラ(Metallosphaera sedula)(Bergら,Science.318:1782−1786(2007年))及びサーモプロテウス・ニュートロフィラス(Thermoproteus neutrophilus)(Ramos−Veraら,J Bacteriol.191:4286−4297(2009年))等の好熱性古細菌の3−ヒドロキシプロピオン酸/4−ヒドロキシ酪酸回路に関与している。Msed_0709によってコードされているM.セデュラのCoAレダクターゼは、NADPH依存性であり、またマロニル−CoAレダクターゼ活性を有する。T.ニュートロフィラス酵素は、NADPH及びNADHの両方に対して活性を有する。bphGによってコードされているシュードモナス属の種のアシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド及びホルムアルデヒドを対応するCoAエステルに酸化及びアシル化することが実証されている(Powlowskiら,175:377−385(1993年))。エタノールへのアセチル−CoAの還元に加えて、リゥコノストック・メゼンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)においてadhEによってコードされる酵素は、分枝鎖化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリル−CoAに酸化させることが示されている(Kooら,Biotechnol Lett.27:505−510(2005年))。ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム等の溶媒生成生物において、類似の反応、ブチリル−CoAのブチルアルデヒドへの変換を触媒する(Kosakaら,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58−68(2007年))。クロストリジウム・ベエイジェリンキーにおいてaldによってコードされているアシル−CoAレダクターゼは、アセチル−CoA及びブチリル−CoAを対応するアルデヒドに還元することが示されている(Tothら,Appl Environ.Microbiol 65:4973−4980(1999年))。この酵素は、eutEによってコードされているネズミチフス菌及び大腸菌のCoA依存性アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素と高い配列相同性を示す。
更なるCoAレダクターゼ酵素は、マロニル−CoAをマロン酸セミアルデヒドに転換するマロニル−CoAレダクターゼである。マロニル−CoAレダクターゼは、好熱好酸性古細菌における3−ヒドロキシプロピオン酸回路を介する自己栄養性炭素固定において鍵となる酵素である(Bergら,318:1782−1786(2007年);Thauer,318:1732−1733(2007年))。この酵素は、補因子としてNADPHを利用し、メタッロスパエラ属及びスルホロブス属の種において特性評価されている(Alberら,188:8551−8559(2006年);Huglerら,184:2404−2410(2002年))。酵素は、メタッロスパエラ・セデュラにおけるMsed_0709によってコードされている(Alberら,188:8551−8559(2006年);Bergら,318:1782−1786(2007年))。スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)由来のマロニル−CoAレダクターゼをコードする遺伝子は、大腸菌でクローニングされ、異種発現した(Alberら,188:8551−8559(2006年))。この酵素も、メチルマロニル−CoAの対応するアルデヒドへの変換を触媒することが示されている(国際公開第2007/141208号)。両方のマロニル−CoAレダクターゼ酵素の候補は、アスパルチル−4−リン酸のアスパラギン酸セミアルデヒドへの還元及び同時に生じる脱リン酸化を触媒する酵素であるアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼと高い配列相同性を有する。タンパク質への配列相同性により、スルホロブス・ソルファタリカス及びスルホロブス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)を含む他の生物で更なる遺伝子を見出すことができる。
1.2.1.d オキシドレダクターゼ(リン酸化/脱リン酸化)(10/11G):(ベンゾイルオキシ)ホスホン酸のベンズアルデヒドへの還元(図10の経路G)、及び(p−メチルベンゾイルオキシ)ホスホン酸のp−メチルベンズアルデヒドへの還元(図11の経路G)は、ホスホン酸レダクターゼ活性を有する酵素によって触媒される。これら変換を触媒する酵素は現在まで同定されていないが、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.2.1.12)、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC1.2.1.11)アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ(EC1.2.1.38)及びグルタミン酸−5−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC1.2.1)によって触媒される類似の転換は、十分報告されている。アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ASD、EC1.2.1.11)は、4−アスパルチルリン酸のアスパラギン酸−4−セミアルデヒドへのNADPH依存性還元を触媒する。ASDは、アミノ酸生合成に関与し、抗菌の標的として最近研究されている(Hadfieldら,Biochemistry 40:14475−14483(2001年))。大腸菌のASD構造は解明されており(Hadfieldら,J Mol.Biol.289:991−1002(1999年))、酵素は、代替基質ベータ−3−メチルアスパルチルリン酸を受容することが示されている(Shamesら,J Biol.Chem.259:15331−15339(1984年))。インフルエンザ菌酵素は、活性部位における基質結合親和性を変化させる酵素工学的研究の対象である(Blancoら,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.60:1388−1395(2004年))。他のASD遺伝子/酵素は、結核菌(Shafianiら,J Appl Microbiol 98:832−838(2005年))、メタノコッカス・ジャナスキイ(Methanococcus jannaschii)(Faehnleら,J Mol.Biol.353:1055−1068(2005年))、並びに感染性細菌であるコレラ菌及びヘリコバクター・ピロリ(Mooreら,Protein Expr.Purif.25:189−194(2002年))でみられる。関連する酵素は、出芽酵母(Pauwelsら,Eur.J Biochem.270:1014−1024(2003年))、枯草菌(O’Reillyら,Microbiology 140(Pt5):1023−1025(1994年))、大腸菌(Parsotら,Gene.68:275−283(1988年))、及び他の生物でみられる、自然界ではアセチルグルタミルリン酸をアセチルグルタミン酸−5−セミアルデヒドに還元する酵素であるアセチルグルタミルリン酸レダクターゼ(EC1.2.1.38)である。大腸菌の更なるリン酸レダクターゼとしては、gapAによりコードされているグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(Branlantら,Eur.J.Biochem.150:61−66(1985年))及びproAによりコードされているグルタミン酸−5−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(Smithら,J.Bacteriol.157:545−551(1984年b))が挙げられる。ネズミチフス菌(Mahanら,J Bacteriol.156:1249−1262(1983年))及びカンピロバクター・ジェジュニ(Louieら,Mol.Gen.Genet.240:29−35(1993年))由来のグルタミン酸−5−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子は、大腸菌においてクローニングされ、発現された。
1.2.1.e オキシドレダクターゼ(酸からアルデヒドへ):安息香酸のベンズアルデヒドへの又はp−トルイル酸のp−メチルベンズアルデヒドへの直接変換(図10及び11の経路B)は、カルボン酸レダクターゼによって触媒される。例示的な酵素としては、カルボン酸レダクターゼ、α−アミノアジピン酸レダクターゼ及びレチン酸レダクターゼが挙げられる。カルボン酸レダクターゼ(CAR)は、カルボン酸の対応するアルデヒドへのマグネシウム、ATP及びNADPH依存性の還元を触媒する(Venkitasubramanianら,J Biol.Chem.282:478−485(2007年))。この酵素の天然基質は安息香酸であり、前記酵素は、p−トルイル酸を含む芳香族基質を広く受容する(Venkitasubramanianら,Biocatalysis in Pharmaceutical and Biotechnology Industries.CRC press(2006年))。carによってコードされているノカルジア・イオウェンシス(Nocardia iowensis)由来の酵素は、大腸菌でクローニングされ、機能的に発現した(Venkitasubramanianら,J Biol.Chem.282:478−485(2007年))。CARは、不活性なアポ酵素を活性を有するハロ酵素に変換するホスホパンテテイントランスフェラーゼ(PPTase)による翻訳後活性化を必要とする(Hansenら,Appl.Environ.Microbiol 75:2765−2774(2009年))。特定のPPTaseをコードするnpt遺伝子の発現は、酵素の活性を改善した。ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)でみられる類似の酵素は、griC及びgriDの遺伝子によってコードされている。この酵素は、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸を3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドに変換することが示されているが、その理由は、griC又はgriDのいずれかの欠失が、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸代謝の短絡産物である細胞外3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸の蓄積を導くためである(Suzukiら,J.Antibiot.60(6):380−387(2007年))。S.グリセウスのPPTaseは、ノカルジア・イオウェンシスのnpt遺伝子に対する配列相同性により予測される通り、SGR_665によりコードされている可能性がある。
類似の特性を有する酵素である、α−アミノアジピン酸レダクターゼ(AAR、EC1.2.1.31)は、幾つかの真菌種におけるリシン生合成経路に関与する。この酵素は、自然界ではα−アミノアジピン酸をα−アミノアジピン酸セミアルデヒドに還元する。カルボキシル基は、まず、ATP依存性のアデニル酸形成によって活性化され、次いで、NAD(P)Hによって還元されて、アルデヒド及びAMPが生じる。CARと同様に、この酵素はマグネシウムを利用し、PPTaseによって活性化される。AAR及び対応するPPTaseのための酵素は、出芽酵母(Morrisら,Gene 98:141−145(1991年))、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)(Guoら,Mol.Genet.Genomics 269:271−279(2003年))及び***酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Fordら,Curr.Genet.28:131−137(1995年))でみられる。***酵母由来のAARは、大腸菌で発現したとき著しい活性を示した(Guoら,Yeast 21:1279−1288(2004年))。ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)由来のAARは、代替基質としてS−カルボキシメチル−L−システインを受容するが、アジピン酸、L−グルタミン酸又はジアミノピメリン酸とは反応しなかった(Hijarrubiaら,J Biol.Chem.278:8250−8256(2003年))。P.クリソゲナムのPPTaseをコードする遺伝子は、現在まで同定されておらず、配列比較相同性探索によって信頼度の高いヒットは同定されなかった。
2.3.1.a アシルトランスフェラーゼ(ホスホトランスフェラーゼ):ホスホトランスベンゾイラーゼ活性を有する酵素は、ベンゾイル−CoA及び(ベンゾイルオキシ)ホスホン酸を相互変換するために使用される(図10の経路F)。ホスホトランス−p−メチルベンゾイラーゼ活性を有する類似の酵素は、p−メチルベンゾイル−CoA及び(p−メチルベンゾイルオキシ)ホスホン酸を相互変換する(図11の経路F)。例示的なリン酸転移アシルトランスフェラーゼとしては、ホスホトランスアセチラーゼ(EC2.3.1.8)及びホスホトランスブチリラーゼ(EC2.3.1.19)が挙げられる。大腸菌に由来するpta遺伝子は、アセチル−CoAをアセチルリン酸に可逆的に変換するホスホトランスアセチラーゼをコードしている(Suzuki,Biochim.Biophys.Acta 191:559−569(1969年))。また、この酵素は、プロピオニル−CoAプロピオニルリン酸を変換することもできる(Hesslingerら,Mol.Microbiol 27:477−492(1998年))。プロピオニル−CoAに対して活性を示す他のリン酸アセチルトランスフェラーゼは、枯草菌(Radoら,Biochim.Biophys.Acta 321:114−125(1973年))、クロストリジウム・クルイベリ(Stadtman,1:596−599(1955年))及びサーモトガ・マリティマ(Bockら,J Bacteriol.181:1861−1867(1999年))でみられる。同様に、C.アセトブチリカム由来のptb遺伝子は、ブチリル−CoAをブチリルリン酸に可逆的に変換する酵素であるホスホトランスブチリラーゼをコードしている(Wiesenbornら,Appl Environ.Microbiol 55:317−322(1989年);Walterら,Gene 134:107−111(1993年))。更なるptb遺伝子は、酪酸産生細菌L2−50(Louisら,J.Bacteriol.186:2099−2106(2004年))及び巨大菌(Vazquezら,Curr.Microbiol 42:345−349(2001年))でみられる。
2.7.2.a ホスホトランスフェラーゼ(カルボキシル基アクセプター(キナーゼ)):キナーゼ又はホスホトランスフェラーゼの酵素は、1つのATPを加水分解すると同時にカルボン酸をホスホン酸に転換する。このような酵素は、安息香酸を(ベンゾイルオキシ)ホスホン酸に(図10、経路H)、及びp−トルイル酸を(p−メチルベンゾイルオキシ)ホスホン酸に(図11、経路H)変換するために使用される。これらの正確な転換は、現在まで実証されていない。例示的な酵素としては、酪酸キナーゼ(EC2.7.2.7)、イソ酪酸キナーゼ(EC2.7.2.14)、アスパルトキナーゼ(EC2.7.2.4)、酢酸キナーゼ(EC2.7.2.1)及びγ−グルタミルキナーゼ(EC2.7.2.11)が挙げられる。酪酸キナーゼは、クロストリジウム属において、酸生成中にブチリルリン酸を酪酸に可逆的に変換する(Caryら,Appl.Environ.Microbiol 56:1576−1583(1990年))。クロストリジウム・アセトブチリカム酵素は、2つのbuk遺伝子産物のいずれかによりコードされている(Huangら,J Mol.Microbiol Biotechnol 2:33−38(2000年))。他の酪酸キナーゼ酵素は、C.ブチリカム及び破傷風様菌でみられる(TWAROGら,J Bacteriol.86:112−117(1963年))。関連酵素である、サーモトガ・マリティマ由来のイソ酪酸キナーゼは、大腸菌において発現し、結晶化された(Diaoら,J Bacteriol.191:2521−2529(2009年);Diaoら,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.59:1100−1102(2003年))。アスパルトキナーゼは、アスパラギン酸のATP依存性リン酸化を触媒し、幾つかのアミノ酸の合成に関与する。lysCによってコードされている大腸菌におけるアスパルトキナーゼIII酵素は、広い基質範囲を有し、基質特異性に関与する触媒残基が解明されている(Kengら,Arch.Biochem.Biophys.335:73−81(1996年))。大腸菌における2つの更なるキナーゼは、酢酸キナーゼ及びγ−グルタミルキナーゼである。ackAによりコードされている大腸菌の酢酸キナーゼ(Skarstedtら,J.Biol.Chem.251:6775−6783(1976年))は、酢酸に加えてプロピオン酸をリン酸化する(Hesslingerら,Mol.Microbiol 27:477−492(1998年))。proBによりコードされている大腸菌のγ−グルタミルキナーゼ(Smithら,J.Bacteriol.157:545−551(1984年a))は、グルタミン酸のガンマ炭酸基をリン酸化する。
2.8.3.a CoAトランスフェラーゼ(10/11A):CoAトランスフェラーゼは、ある分子から別の分子へのCoA部分の可逆的な転位を触媒する。図10の経路Aは、ベンゾイル−CoAトランスフェラーゼ活性を有する酵素によって触媒される。この転換では、ベンゾイル−CoAは、アセチル−CoA、スクシニル−CoA又は他のもの等のCoAドナー由来のCoA基の転移によって安息香酸から形成される。p−メチルベンゾイル−CoAトランスフェラーゼは、図11の経路Aにおいてp−トルイル酸からの類似する反応を触媒する。類似する基質と反応する例示的なCoAトランスフェラーゼ酵素としては、シンナモイル−CoAトランスフェラーゼ(EC2.8.3.17)及びベンジルスクシニル−CoAトランスフェラーゼが挙げられる。クロストリジウム・スポロゲネスにおけるfldAによってコードされているシンナモイル−CoAトランスフェラーゼは、シンナモイル−CoAから、フェニル酢酸、3−フェニルプロピオン酸及び4−フェニル酪酸を含む様々な芳香族酸基質にCoA部分を転移する(Dickertら,Eur.J Biochem.267:3874−3884(2000年))。ベンジルスクシニル−CoAトランスフェラーゼは、CoAドナーとしてスクシニル−CoA又はマレイル−CoAを利用し、コハク酸ベンジルからベンジルスクシニル−CoAを形成する。この酵素は、脱窒素細菌サウエラ・アロマチカ(この細菌では、bbsEFによりコードされる)において特性評価された(Leutweinら,J Bacteriol.183:4288−4295(2001年))。
多様な基質範囲を有する更なるCoAトランスフェラーゼ酵素としては、スクシニル−CoAトランスフェラーゼ、4−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼ、ブチリル−CoAトランスフェラーゼ、グルタコニル−CoAトランスフェラーゼ及びアセトアセチル−CoAトランスフェラーゼが挙げられる。クロストリジウム・クルイベリのcat1、cat2及びcat3の遺伝子産物は、それぞれスクシニル−CoA、4−ヒドロキシブチリル−CoA及びブチリル−CoAトランスフェラーゼ活性を示すことが示されている(Seedorfら,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 105:2128−2133(2008年);Sohlingら,J Bacteriol.178:871−880(1996年b))。また、同様のCoAトランスフェラーゼ活性は、膣トリコモナス(van Grinsvenら,J.Biol.Chem.283:1411−1418(2008年))及びトリパノソーマ・ブルセイ(Riviereら,J.Biol.Chem.279:45337−45346(2004年))にも存在する。嫌気性細菌アシドアミノコックス・ファーメンタンス由来のグルタコニル−CoAトランスフェラーゼ(EC2.8.3.12)酵素は、グルタコニル−CoA及び3−ブテノイル−CoAと反応する(Mackら,Eur.J.Biochem.226:41−51(1994年))。この酵素をコードする遺伝子は、gctA及びgctBである。この酵素は、グルタリル−CoA、2−ヒドロキシグルタリル−CoA、アジピル−CoA、クロトニル−CoA及びアクリリル−CoAを含む他のCoA誘導体に対して、低いが検出可能な活性を示す(Buckelら,Eur.J Biochem.118:315−321(1981年))。この酵素は、大腸菌でクローニングされ、発現している(Mackら,Eur.J.Biochem.226:41−51(1994年))。グルタコネートCoA−トランスフェラーゼ活性は、クロストリジウム・スポロスフェロイデス及びクロストリジウム・シンビオサムでも検出されている。アセトアセチル−CoAトランスフェラーゼは、CoAドナーとしてアセチル−CoAを利用する。この酵素は、大腸菌のatoA(アルファサブユニット)及びatoD(ベータサブユニット)遺伝子によりコードされている(Korolevら,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.58:2116−2121(2002年);Vanderwinkelら,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902−908(1968年))。この酵素は広い基質範囲を有し(Sramekら,Arch.Biochem.Biophys.171:14−26(1975年))、アセチル−CoAからイソ酪酸(Matthiesら,Appl Environ.Microbiol 58:1435−1439(1992年))、吉草酸(Vanderwinkelら,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902−908(1968年))及びブタン酸(Vanderwinkelら,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902−908(1968年))を含む様々な基質にCoA部分を転移することが示されている。類似の酵素が、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032(Duncanら,Appl.Environ.Microbiol 68:5186−5190(2002年))、クロストリジウム・アセトブチリカム(Caryら,Appl.Environ.Microbiol 56:1576−1583(1990年);Wiesenbornら,Appl.Environ.Microbiol 55:323−329(1989年))及びクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム(Kosakaら,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58−68(2007年))に存在する。
3.1.2.a CoAヒドロラーゼ(10/11A):ベンゾイル−CoA及びp−メチルベンゾイル−CoAは、ECクラス3.1.2におけるCoAヒドロラーゼ又はチオエステラーゼによって対応する酸に加水分解され得る(図10及び11の経路A)。ベンゾイル−CoA及び/又は類似する基質を加水分解する例示的なCoAチオエステルとしては、4−ヒドロキシベンゾイル−CoAヒドロラーゼ(EC3.1.2.23)及びフェニルグリオキサール−CoAヒドロラーゼ(EC3.1.2.25)が挙げられる。アゾアルカス・エバンシイの遺伝子orf1は、安息香酸代謝に関与するベンゾイル−CoAヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードしている(Ismail,Arch.Microbiol 190:451−460(2008年))。この酵素は、大腸菌において異種発現させたとき、多くの代替基質に対して活性を示した。配列類似性により、更なるベンゾイル−CoAヒドロラーゼ酵素が、マグネトスピリラム・マグネトタクチカム、ジャナスチア属の種CCS1、及びサジッツラ・ステラータE−37の安息香酸分解遺伝子クラスターにおいて同定された(Ismail,Arch.Microbiol 190:451−460(2008年))。シュードモナス属の種CBS3の4−ヒドロキシベンゾイル−CoAヒドロラーゼは、ベンゾイル−CoA及びp−メチルベンゾイル−CoAを基質として受容し、また、大腸菌で異種発現され、特性評価されている(Songら,Bioorg.Chem.35:1−10(2007年))。ベンゾイル−CoAヒドロラーゼ活性を示す更なる酵素としては、結核菌のパルミトイル−CoAヒドロラーゼ(Wangら,Chem.Biol.14:543−551(2007年))及びentHによりコードされている大腸菌のアシル−CoAヒドロラーゼ(Guoら,Biochemistry 48:1712−1722(2009年))が挙げられる。
広い基質範囲を有する幾つかの更なるCoAヒドロラーゼは、ベンゾイル−CoA及び/又はp−メチルベンゾイル−CoAを加水分解するのに適した酵素である。例えば、ラットの脳に由来するacot12によってコードされる酵素(Robinsonら,Biochem.Biophys.Res.Commun.71:959−965(1976年))は、ブチリル−CoA、ヘキサノイル−CoA及びマロニル−CoAと反応することができる。acot8によってコードされているヒトのジカルボン酸チオエステラーゼは、グルタリル−CoA、アジピル−CoA、スベリル−CoA、セバシル−CoA及びドデカンジオイル−CoAに対する活性を示す(Westinら,J.Biol.Chem.280:38125−38132(2005年))。また、この酵素に最も近い大腸菌ホモログであるtesBは、様々なCoAチオールエステルを加水分解することができる(Naggertら,J Biol Chem 266:11044−11050(1991年))。また、類似の酵素が、ラットの肝臓において特性評価されている(Deana R.,Biochem Int 26:767−773(1992年))。
4.1.1a.カルボキシ−リアーゼ(6/7E):ECクラス4.1.1におけるデカルボキシラーゼ酵素は、安息香酸をベンゼンに(図10の経路E)、及びp−トルイル酸をトルエンに(図11の経路E)変換するために使用される。これら又は類似する基質と反応する例示的な酵素としては、ベンゼンカルボキシラーゼ、バニリン酸デカルボキシラーゼ、ケイ皮酸デカルボキシラーゼ、アミノ安息香酸デカルボキシラーゼ及び様々なヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼが挙げられる。利用される補因子に依存して、デカルボキシラーゼ酵素は酸化的であってもよく又は非酸化的であってもよい(Lupaら,Genomics 86:342−351(2005年a))。安息香酸カルボキシラーゼ活性を有すると予測される酵素は、クロストリジウム属細菌濃縮培地クローンBFにおいて同定された(Abuら,Environ.Microbiol(2010年))。
4−ヒドロキシ安息香酸、2,3−ジヒドロキシ安息香酸、3,4−ジヒドロキシ安息香酸、2,6−ジヒドロキシ安息香酸及び4,5−ジヒドロキシフタレート等のヒドロキシル化芳香族に対する活性が実証されている多数の特性評価されているデカルボキシラーゼは、p−トルイル酸又は安息香酸等の代替基質に対しても活性を示す場合がある。例示的なヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ酵素としては、コマモナス・テストステローニの4,5−ジヒドロキシフタレートデカルボキシラーゼ(Nakazawaら,Appl.Environ.Microbiol 36:264−269(1978年))、アスペルギルス・ニガーの2,3−ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ(Kamathら,Biochem.Biophys.Res.Commun.145:586−595(1987年))、及び大腸菌の3−オクタプレニル−4−ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ(Zhangら,J Bacteriol.182:6243−6246(2000年))が挙げられる。例示的な4−ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼは、セディメンチバクター・ヒドロキシベンゾイカス(Sedimentibacter hydroxybenzoicus)(旧クロストリジウム・ヒドロキシベンゾイカム(Clostridium hydroxybenzoicum)のshdBD及びubiD、並びにエンテロバクター・クロアカエP240のubiDによってコードによりコードされている(Matsuiら,Arch.Microbiol 186:21−29(2006年a);Heら,Eur.J Biochem.229:77−82(1995年))。ubiDによってコードされている通性嫌気性生物エンテロバクター・クロアカエ由来の4−ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼは、複数の基質に対する活性について試験されており、4−ヒドロキシ安息香酸及び4−アミノ安息香酸の両方によって誘導されることが示された(Matsuiら,Arch.Microbiol 186:21−29(2006年b))。枯草菌のbsdBCD遺伝子は、可逆的な非酸化的4−ヒドロキシ安息香酸/バニリン酸デカルボキシラーゼをコードする(Lupaら,Can.J Microbiol 54:75−81(2008年))。この酵素は、大腸菌において異種発現した。類似するデカルボキシラーゼは、他の幾つかの生物において示されており(Lupaら,Genomics 86:342−351(2005年b))、これらのうちの幾つかの遺伝子を以下に列挙する。
ケイ皮酸(フェニルアクリレート)及び置換ケイ皮酸誘導体の脱炭酸を触媒する更なる分類のデカルボキシラーゼが特性評価されている。これら酵素は、様々な生物において共通であり、そして、大腸菌でクローニングされ、発現しているこれら酵素をコードする具体的な遺伝子としては、出芽酵母由来のpad1(Clausenら,Gene 142:107−112(1994年))、ラクトバチルス・プランタルム由来のpdc(Barthelmebsら,67:1063−1069(2001年);Qiら,Metab Eng 9:268−276(2007年);Rodriguezら,J.Agric.Food Chem.56:3068−3072(2008年))、クレブシエラ・オキシトカ由来のpofK(pad)(Uchiyamaら,Biosci.Biotechnol.Biochem.72:116−123(2008年);Hashidokoら,Biosci.Biotech.Biochem.58:217−218(1994年))、ペジコッカス・ペントサセウス(Barthelmebsら,67:1063−1069(2001年))、並びに枯草菌及びバチルス・プミルス由来のpadC(Shinglerら,174:711−724(1992年))が挙げられる。シュードモナス・フルオレッセンス由来のフェルラ酸デカルボキシラーゼも、精製され、特性評価されている(Huangら,J.Bacteriol.176:5912−5918(1994年))。この分類における酵素は安定であることが示されており、外因性の又は内部的に結合する補因子を必要としないので、これら酵素は生体内転換に理想的に適している(Sariaslani,Annu.Rev.Microbiol.61:51−69(2007年))。
4.1.99.a デカルボニラーゼ:デカルボニラーゼ酵素は、ベンズアルデヒドをベンゼンに(図10の経路C)、及びp−メチルベンズアルデヒドをトルエンに(図11の経路C)変換するために使用される。デカルボニラーゼ酵素は、植物、哺乳類、昆虫及び細菌におけるアルカン生合成の最後の工程を触媒する(Dennisら,Arch.Biochem.Biophys.287:268−275(1991年))。非酸化的デカルボニラーゼは、COを放出すると同時にアルデヒドをアルカンに転換する。例示的なデカルボニラーゼ酵素としては、オクタデカナールデカルボニラーゼ(EC4.1.99.5)、ステロールデサチュラーゼ及び脂肪アルデヒドデカルボニラーゼが挙げられる。シロイヌナズナのCER1遺伝子は、エピクチクラのろう形成に関与する脂肪酸デカルボニラーゼをコードしている(米国特許第6,437,218号)。更なる脂肪酸デカルボニラーゼは、タルウマゴヤシ、ブドウ及びイネでみられる(米国特許出願公開第2009/0061493号)。コバルト−ポルフィリン含有デカルボニラーゼは、藻類ボツリオコッカス・ブラウニイにおいて精製され、特性評価されたが;この活性に関連する遺伝子は現在まで同定されていない(Dennisら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 89:5306−5310(1992年))。エンドウマメ由来の銅含有デカルボニラーゼも精製され、特性評価されているが、関連する遺伝子は未だ同定されていない(Schneider−Belhaddadら,Arch.Biochem.Biophys.377:341−349(2000年))。
あるいは、酸化的デカルボニラーゼは、アルデヒドをアルカンに変換することができる。酸化的デカルボニラーゼは、補因子としてNADPH及びO2を利用し、CO2、水、及びNADP+を放出するシトクロムP450酵素である。この活性は、イエバエ及びキイロショウジョウバエのCYP4G2v1及びCYP4G1遺伝子産物において示されている(米国特許出願公開第2010/0136595号)。配列相同性により、他の生物、例えば、ヨトウガ、メリカタバコガ、及びエンドウヒゲナガアブラムシにおいて酸化的デカルボニラーゼ活性を有する更なる酵素を同定することができる。
6.2.1.a 酸−チオールリガーゼ(8A、11B):安息香酸のベンゾイル−CoAへの、又はp−トルイル酸のp−メチルベンゾイル−CoAへのATP依存性活性化(図10及び11の経路A)は、CoAシンテターゼ又は酸−チオールリガーゼによって触媒される。AMP形成CoAリガーゼは、芳香族酸を対応するCoA誘導体に活性化させ、一方、ADP形成CoAリガーゼは、一般に可逆的である。サウエラ・アロマチカ及びアゾアルカス属の種の株CIB由来の例示的なAMP形成ベンゾイル−CoAリガーゼが特性評価されている(Lopez Barraganら,J Bacteriol.186:5762−5774(2004年);Schuhleら,J.Bacteriol.185:4920−4929(2003年))。あるいは、構造上類似する基質と反応するAMP形成CoAリガーゼは、安息香酸又はp−トルイル酸に対する活性を有し得る。aliAによってコードされているロドシュードモナス・パルストリス由来のAMP形成シクロヘキサンカルボキシレートCoAリガーゼは、十分に特性評価されており、活性部位の変化が酵素の基質特異性に影響を与えることが示されている(Samantaら,Mol.Microbiol 55:1151−1159(2005年))。また、この酵素は、嫌気性ベンゼン環分解中にシクロヘキサ−1−エン−1−カルボン酸CoAリガーゼとしても機能する(Eglandら,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 94:6484−6489(1997年))。更なる例示的なCoAリガーゼとしては、P.クリソゲナム由来の2つの特性評価されているフェニル酢酸−CoA(Lamas−Maceirasら,Biochem.J 395:147−155(2006年);Wangら,Biochem.Biophys.Res.Commun.360:453−458(2007年));Wangら,Biochem.Biophys.Res.Commun.360:453−458(2007年))、シュードモナス・プチダ由来のフェニル酢酸−CoAリガーゼ(Martinez−Blancoら,J Biol.Chem.265:7084−7090(1990年))、及び枯草菌由来の6−カルボキシヘキサノエート−CoA(Bowerら,J Bacteriol.178:4122−4130(1996年))が挙げられる。
これら正確な転換を触媒するADP形成CoAリガーゼは、現在まで特性評価されていないが;広い基質特異性を有する幾つかの酵素が文献に記載されている。AF1211によってコードされているアーケオグロブス・フルギダス由来のADP形成アセチル−CoAシンテターゼ(ACD、EC6.2.1.13)は、イソ酪酸、イソペンタン酸及びフマル酸を含む様々な直鎖及び分岐鎖の基質に対して作用することが示された(Musfeldtら,J Bacteriol.184:636−644(2002年))。AF1983によってコードされているアーケオグロブス・フルギダスにおける第2の可逆的なACDも、芳香族化合物フェニル酢酸及びインドール酢酸に対する活性が高く、広い基質範囲を有することが示された(Musfeldtら,上記)。スクシニル−CoAシンテターゼであるとアノテーションされたハロアーキュラ・マリスモルツイ由来の酵素は、基質としてプロピオン酸、酪酸及び分枝鎖酸(イソ吉草酸及びイソ酪酸)を受容し、順方向及び逆方向に作用することが示された(Brasenら,Arch.Microbiol 182:277−287(2004年))。超好熱性古細菌ピロバキュラム・アエロフィラム由来のPAE3250によってコードされているACDは、全ての特性評価されているACDのうち最も広い基質範囲を示し、アセチル−CoA、イソブチリル−CoA(好ましい基質)、及びフェニルアセチル−CoAと反応する(Brasen及びSchonheit,Arch.Microbiol 182:277−287(2004年))。指向進化又は工学的技術を用いて、ホスト生物の生理的温度で作用するようにこの酵素を改変することができる。A.フルギダス、H.マリスモルツイ及びP.アエロフィラム由来の酵素は全て、大腸菌でクローニングされ、機能的に発現し、特性評価されている(Brasen及びSchonheit,Arch.Microbiol 182:277−287(2004年);Musfeldt及びSchonheit,J Bacteriol.184:636−644(2002年))。更なる酵素は、自然界では1つのATPを消費すると同時にコハク酸からのスクシニル−CoAの形成を触媒する(この反応は、インビボにおいて可逆的である)大腸菌におけるsucCDによってコードされている(Buckら,Biochemistry 24:6245−6252(1985年))。シュードモナス・プチダ由来のアシル−CoAリガーゼは、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、及びオクタン酸を含む幾つかの脂肪族基質、並びにフェニル酢酸及びフェノキシ酢酸等の芳香族化合物に対して作用することが示されている(Fernandez−Valverdeら,Appl.Environ.Microbiol.59:1149−1154(1993年))。関連する酵素であるリゾビウム・レグミノサルム由来のマロニル−CoAシンテターゼ(6.3.4.9)は、幾つかの二酸、すなわち、エチル−、プロピル−、アリル−、イソプロピル−、ジメチル−、シクロプロピル−、シクロプロピルメチレン−、シクロブチル―、及びベンジル−マロネートをこれらの対応するモノチオエステルに変換することができる(Pohlら,J.Am.Chem.Soc.123:5822−5823(2001年))。
実施例VIII ピルビン酸、オルニチン及びアラニンから2,4−ペンタジエノエートへの経路
この実施例は、ピルビン酸、オルニチン及びアラニンから2,4−ペンタジエノエートへの経路を示す。
図12は、ピルビン酸の2,4−ペンタジエノエートへの変換を示す。この変換は、4つの酵素的段階で行うことができる。まず、ピルビン酸及びアセトアルデヒドは、4−ヒドロキシ−2−ケト吉草酸アルドラーゼによって4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸に縮合される(図12の工程A)。次に、4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸生成物が2−オキソペンテン酸に脱水される(図12の工程B)。続く2−オキソペンテン酸の還元及び脱水により、2,4−ペンタジエノエートが生じる(図12の工程C/D)。
図13は、アラニン又はオルニチンから2,4−ペンタジエノエートへの経路を示す。図13の工程Aでは、アラニン及びアセチル−CoAがAKPチオラーゼによって結合して、AKPを形成する。1つの経路では、AKPはアセチルアクリレートに脱アミノ化される(工程B)。次いで、アセチルアクリレートの4−オキソ基が2,4−ペンタジエノエートに還元及び脱水される(工程C/D)。別の経路では、AKPは、アミノトランスフェラーゼ又はデヒドロゲナーゼにより2,4−ジオキソペンタン酸に変換される(工程E)。2,4−ジオキソペンタン酸の2−又は4−オキソ基の還元により、それぞれ、2−ヒドロキシ−4−オキソペンタン酸(工程H)又は4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸(工程K)が生じる。あるいは、4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸は、AKPを2−アミノ−4−ヒドロキシペンタン酸に還元し(工程J)、次いで、アミノ基転移又は酸化的脱アミノ化(工程L)することにより形成することもできる。形成されると、4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸は、図12に示す通り3つの酵素的段階で2,4−ペンタジエノエートに変換することができる(図12の工程B/C/D)。2−ヒドロキシ−4−オキソペンタン酸中間体は、アセチルアクリレートに脱水され(工程F)、次いで、還元及び脱水され得る(工程C/D)。
図13に示すAKPからの経路への別の入口は、オルニチンである。オルニチンアミノムターゼは、まず、オルニチンを2,4−ジアミノペンタン酸に変換することを必要とする(工程M)。次いで、2,4−ジアミノペンタン酸中間体を、アミノ基転移又は酸化的脱アミノ化よってAKPに変換する(工程N)。
アラニン又はオルニチンのD−又はL−立体異性体のいずれも、図13に示す2,4−ペンタジエノエート経路に対する前駆体又は中間体として機能することができると理解される。アラニン又はオルニチンのD−及びL−立体異性体は、アラニンラセマーゼ又はオルニチンラセマーゼ酵素によって容易に相互変換される。
図5及び6に示す転換を触媒するための酵素をEC番号により分類し(表2)、更に以下に記載する。
1.1.1.a オキシドレダクターゼ(オキソからアルコールへ):図5及び6における多くの転換は、ケトンのアルコールへの還元を含む。図12の工程Cにおいて、2−オキソペンテン酸は2−ヒドロキシペンテン酸に還元される。類似する転換は、ケト酸2,4−ジオキソペンタン酸の対応するヒドロキシ酸、2−ヒドロキシ−4−オキソペンタン酸への還元(図13の工程H)である。図13の工程C、J及びKは、AKP、2,4−ジオキソペンタン酸及びアセチルアクリレートの4−オキソ基の対応するアルコールへの還元を伴う。これら転換は、ECクラス1.1.1におけるオキシドレダクターゼ酵素によって触媒される。
幾つかの例示的なアルコールデヒドロゲナーゼは、ケトンをアルコール官能基に変換する。大腸菌由来のこのような2つの酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(mdh)及び乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhA)によりコードされている。更に、ラルストニア・ユートロファに由来する乳酸デヒドロゲナーゼは、乳酸、2−オキソ酪酸、2−オキソペンタン酸及び2−オキソグルタル酸を含む様々な鎖長の2−ケト酸に対して高い活性を示すことが示されている(Steinbuchelら,Eur.J.Biochem.130:329−334(1983年))。α−ケトアジピン酸のα−ヒドロキシアジピン酸への変換は、ラット及びヒトの胎盤にみられることが報告されている酵素である2−ケトアジピン酸レダクターゼにより触媒される(Sudaら,Arch.Biochem.Biophys.176:610−620(1976年);Sudaら,Biochem.Biophys.Res.Commun.77:586−591(1977年))。更なる候補オキシドレダクターゼは、ヒトの心臓に由来するミトコンドリアの3−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ(bdh)であり、これは、既にクローニングされ、特性評価されている(Marksら,J.Biol.Chem.267:15459−15463(1992年))。C.ベエイジェリンキー(Ismaielら,J.Bacteriol.175:5097−5105(1993年))及びT.ブロッキイ(Lamedら,Biochem.J.195:183−190(1981年);Peretzら,Biochemistry 28:6549−6555(1989年))のアルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、アセトンをイソプロパノールに変換する。メチルエチルケトンレダクターゼは、MEKの2−ブタノールへの還元を触媒する。例示的なMEKレダクターゼ酵素は、ロドコッカス・ルーバー(Kosjekら,Biotechnol Bioeng.86:55−62(2004年))及びパイロコッカス・フリオサス(van derら,Eur.J.Biochem.268:3062−3068(2001年))において見出すことができる。
1.4.1.a オキシドレダクターゼ(脱アミノ化):ECクラス1.4.1における酵素は、アクセプターとしてNAD+、NADP+又はFADを有するアミノ基の酸化的脱アミノ化を触媒する。このような酵素は、AKPの2,4−ジオキソペンタン酸への(図13、工程E)、2−アミノ−4−ヒドロキシペンタン酸の4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸への(図13、工程L)、及び2,4−ジアミノペンタン酸のAKPへの(図13、工程N)酸化的脱アミノ化を触媒するために必要である。2,4−ジアミノペンタン酸のAKPへの変換(図13の工程N)は、2,4−ジアミノペンタン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.4.1.12)により触媒される。2,4−ジアミノペンタン酸デヒドロゲナーゼ酵素は、クロストリジウム・スティックランディ(Clostridium sticklandii)のord遺伝子産物等、オルニチンの嫌気発酵を受ける生物において特性評価されている(Fonknechten,J.Bacteriol.In Press:(2009年))。ord遺伝子産物に対する配列相同性により、他の生物において更なる2,4−ジアミノペンタン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子候補を推測することができる。関連する酵素である3,5−ジアミノヘキサン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.4.1.11)は、3,5−ジアミノヘキサン酸の5−アミノ−3−オキソヘキサン酸への酸化的脱アミノ化を触媒する。この酵素をコードする遺伝子kddは、フソバクテリウム・ヌクレアトゥム(Fusobacterium nucleatum)において最近同定された(Kreimeyerら,J Biol.Chem.282:7191−7197(2007年))。この酵素は、リシンを発酵させる他の生物において既に精製され、特性評価されているが、これら酵素に関連した遺伝子は、現在まで同定されていない(Bakerら,J Biol.Chem.247:7724−7734(1972年);Bakerら,Biochemistry 13:292−299(1974年))。配列相同性によって、ミキソコッカス・ザンサス(Myxococcus xanthus)、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)W83及び他の配列決定されている生物における候補を推測することができる。
基質AKP及び2−アミノ−4−ヒドロキシペンタン酸(図13の工程E及びL)は、αアミノ酸に類似しており、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.4.1.2)、ロイシンデヒドロゲナーゼ(EC1.4.1.9)及びアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.4.1.21)等のアミノ酸デヒドロゲナーゼ酵素のための代替基質として機能することもできる。グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、グルタミン酸の2−オキソグルタル酸への可逆的なNAD(P)+依存性変換を触媒する。例示的な酵素は、大腸菌におけるgdhA(McPhersonら,Nucleic.Acids Res.11:5257−5266(1983年);Korberら,J.Mol.Biol.234:1270−1273(1993年))、サーモトガ・マリティマにおけるgdh(Kortら,Extremophiles 1:52−60(1997年);Lebbinkら,J.Mol.Biol.280:287−296(1998年);Lebbinkら,J.Mol.Biol.289:357−369(1999年))及びハロバクテリウム・サリナルム(Halobacterium salinarum)におけるgdhA1(Ingoldsbyら,Gene.349:237−244(2005年))によってコードされている。更なるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素は、枯草菌(Khanら,Biosci.Biotechnol Biochem.69:1861−1870(2005年))、タバコ(Nicotiana tabacum)(Purnellら,Planta 222:167−180(2005年))、イネ(Abikoら,Plant Cell Physiol 46:1724−1734(2005年))、ハロフェラックス・メディテラネイ(Haloferax mediterranei)(Diazら,Extremophiles.10:105−115(2006年))及びハロバクテリウム・サリナルム(Haydenら,FEMS Microbiol Lett.211:37−41(2002年))において特性評価されている。タバコ酵素は、gdh1及びgdh2によってコードされるアルファサブユニット及びベータサブユニットで構成される(Purnellら,Planta 222:167−180(2005年))。例示的なロイシンデヒドロゲナーゼは、セレウス菌(Bacillus cereus)のldhによってコードされる。この酵素は、ロイシン、イソロイシン、バリン及び2−アミノブタン酸を含む一連の基質と反応する(Stoyanら,J.Biotechnol 54:77−80(1997年);Ansorgeら,Biotechnol Bioeng.68:557−562(2000年))。nadXによってコードされるサーモトガ・マリティマ由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは、NADの生合成に関与する(Yangら,J.Biol.Chem.278:8804−8808(2003年))。
2.6.1.a アミノトランスフェラーゼ:AKPの2,4−ジオキソペンタン酸への(工程E)、2−アミノ−4−ヒドロキシペンタン酸の4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸への(工程L)、及び2,4−ジアミノペンタン酸のAKPへの(工程N)変換を含む図13における幾つかの転換は、アミノトランスフェラーゼ又はトランスアミナーゼ酵素によって触媒される。幾つかのアミノトランスフェラーゼは、アミノ酸及び誘導体を対応する2−オキソ酸に変換する。このような酵素は、図13の工程E及びLに図示される転換を触媒するのに非常に適している(すなわち、AKPアミノトランスフェラーゼ及び2−アミノ−4−ヒドロキシペンタン酸アミノトランスフェラーゼ)。これらの転換に適切なアミノ酸アミノトランスフェラーゼの選択は、基質の立体化学に依存する場合がある。基質がD−立体配置である場合、D−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ(EC2.6.1.21)を利用することができ、一方、L−立体異性体は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(EC2.6.1.1)等のL−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの好ましい基質である。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、自然界で、オキサロ酢酸からグルタミン酸にオキソ基を転移して、α−ケトグルタル酸及びアスパラギン酸を形成する。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性は、例えば大腸菌由来のaspC(Yagiら,100:81−84(1979年);Yagiら,113:83−89(1985年))、出芽酵母由来のAAT2(Yagiら,92:35−43(1982年))、及びシロイヌナズナ由来のASP5(Kwokら,55:595−604(2004年);de laら,46:414−425(2006年);Wilkieら,Protein Expr.Purif.12:381−389(1998年))の遺伝子産物によって触媒される。ラット由来の酵素は、2−アミノヘキサン二酸及び2,4−ジアミノ酪酸等の代替基質をアミノ基転移することが示されている(Recasensら,Biochemistry 19:4583−4589(1980年))。他のL−アミノ酸基質に作用するアミノトランスフェラーゼも、これら転換を触媒することができる。バリンアミノトランスフェラーゼは、バリン及びピルビン酸の2−ケトイソ吉草酸及びアラニンへの変換を触媒する。大腸菌遺伝子avtAは類似の酵素をコードし(Whalenら,J.Bacteriol.150:739−746(1982年))、これも、α−ケト酪酸のアミノ基転移を触媒してα−アミノ酪酸を生成するが、この反応におけるアミノドナーは同定されていない(Whalenら,J.Bacteriol.158:571−574(1984年))。別の酵素候補は、α−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ(EC2.6.1.39)であり、これは、幾つかの生物におけるリシンの生合成及び分解に関与する酵素である。この酵素は、アミノアクセプターとしてα−ケトグルタル酸を使用して、2−アミノアジピン酸及び2−オキソアジピン酸を相互変換する。遺伝子の候補は、ヒト(Okunoら,Enzyme Protein 47:136−148(1993年))及びサーマス・サーモフィラス(Miyazakiら,Microbiology 150:2327−2334(2004年))でみられる。lysNによってコードされるサーマス・サーモフィラス酵素は、オキサロ酢酸、2−オキソイソカプロン酸、2−オキソイソ吉草酸及び2−オキソ−3−メチル吉草酸を含む幾つかの代替基質に対して活性を有する。
基質がD−立体異性体で存在する場合、アミノ基転移は、D−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ及びD−アラニンアミノトランスフェラーゼ(DAAT)としても知られているD−アミノトランスフェラーゼ(EC2.6.1.21)によって触媒され得る。この分類の酵素は、基質特異性が広いことで知られており、基質特異性は種特異的である。datによってコードされるバチルス属種YM−1由来のDアミノトランスフェラーゼは、クローニングされ、配列決定され(Tanizawaら,J Biol.Chem.264:2450−2454(1989年))、結晶構造が解明されている(Peisachら,Biochemistry 37:4958−4967(1998年))。この酵素も、基質特異性を変化させるために改変されている(Gutierrezら,Eur.J Biochem.267:7218−7223(2000年);Gutierrezら,Protein Eng 11:53−58(1998年))。更なる遺伝子候補は、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)ATCC10716(Taylorら,Biochim.Biophys.Acta 1350:38−40(1997年))、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)(Pucciら,J Bacteriol.177:336−342(1995年))及び枯草菌(Martinez−Carrionら,J Biol.Chem.240:3538−3546(1965年))でみられる。
2,4−ジアミノペンタン酸のAKPへの変換(図13の工程N)は、2,4−ジアミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素により触媒される。この活性は現在まで酵素において特性評価されていないが、幾つかの酵素は、類似する転換、2,4−ジアミノブタン酸のアスパラギン酸−4−セミアルデヒドへの変換を触媒する。例示的な酵素候補としては、β−アラニンアミノトランスフェラーゼ(EC2.6.1.18)、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ(EC2.6.1.46及びEC2.6.1.76)及びγ−アミノ酪酸(GABA)アミノトランスフェラーゼ(EC2.6.1.19)が挙げられる。例示的なジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素は、アシネトバクター・バウマニイ(Acinetobacter baumanii)及びインフルエンザ菌(Ikaiら,J Bacteriol.179:5118−5125(1997年);Ikaiら,Biol Pharm.Bull.21:170−173(1998年))におけるdat遺伝子産物によってコードされる。その天然基質に加えて、2,4−ジアミノ酪酸、A.バウマニイのDATは、リシン、4−アミノ酪酸及びオルニチンの末端アミンをアミノ基転移する。更なるジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子候補としては、マリノコッカス・ハロフィルス(Marinococcus halophilus)及びハロバチルス・デバネンシス(Halobacillus dabanensis)のectB遺伝子産物(Zhaoら,Curr Microbiol 53:183−188(2006年);Louisら,Microbiology 143(Pt4):1141−1149(1997年))、並びに緑膿菌のpvdH遺伝子産物(Vandenendeら,J Bacteriol.186:5596−5602(2004年))が挙げられる。アミノアクセプターとしてα−ケトグルタル酸を利用するジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素は、EC2.6.1.76に含まれる。このような酵素は、アシネトバクター・バウマニイでみられる。
また、シュードモナス・フルオレッセンスのβ−アラニンアミノトランスフェラーゼは、基質として2,4−ジアミノ酪酸を受容するが(Hayaishiら,J Biol Chem 236:781−790(1961年));この活性に関連する遺伝子は現在まで同定されていない。γアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼは、自然界ではコハク酸セミアルデヒド及びグルタミン酸を4−アミノ酪酸及びα−ケトグルタル酸に相互変換する。一般に、GABAアミノトランスフェラーゼは、広範囲の代替基質と反応する(Schulzら,56:1−6(1990年);Liuら,43:10896−10905(2004年))。大腸菌における2つのGABAトランスアミナーゼは、gabT(Bartschら,J Bacteriol.172:7035−7042(1990年))及びpuuE(Kuriharaら,J.Biol.Chem.280:4602−4608(2005年))によってコードされる。gabT遺伝子産物は、広い基質特異性を有することが示されている(Schulzら,56:1−6(1990年);Liuら,43:10896−10905(2004年))。マウス(Mus musculus)及びイノシシ(Sus scrofa)におけるGABAアミノトランスフェラーゼは、様々な代替基質と反応することが示されている(Cooper,Methods Enzymol.113:80−82(1985年))。
4.1.3.a リアーゼ:ピルビン酸及びアセトアルデヒドの4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸への縮合(図12の工程A)は、4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸アルドラーゼ(EC4.1.3.39)によって触媒される。この酵素は、フェノール、クレゾール及びカテコールを分解するための経路に関与する。mhpEによってコードされる大腸菌酵素は、アクセプターとしてのアセトアルデヒドに対して非常に特異的であるが、代替基質2−ケト酪酸又はフェニルピルビン酸をドナーとして受容する(Pollardら,Appl Environ Microbiol 64:4093−4094(1998年))。類似する酵素が、シュードモナス・プチダのcmtG及びtodHの遺伝子によってコードされている(Lauら,Gene 146:7−13(1994年);Eaton,J Bacteriol.178:1351−1362(1996年))。シュードモナス属のCF600では、この酵素は、dmpFGによってコードされる二機能アルドラーゼデヒドロゲナーゼヘテロダイマーの一部である(Manjasettyら,Acta Crystallogr.D.Biol Crystallogr.57:582−585(2001年))。デヒドロゲナーゼの機能は、アセトアルデヒド及びアセチル−CoAを相互変換して、一部の細胞に対して毒性のあるアセトアルデヒドの細胞内濃度を低下させるという利点を提供することである。
4.2.1.a デヒドラターゼ:4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸の2−オキソペンテン酸への脱水(図12の工程B)は、4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸ヒドラターゼ(EC4.2.1.80)によって触媒される。類似する酵素は、4−ヒドロキシペンタ−2−エノエートの2,4−ペンタジエノエートへの脱水(図13の工程D)を触媒するために必要とされる。4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸ヒドラターゼは、芳香族分解経路に関与し、典型的に、4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子と共転写される。例示的な遺伝子産物は、大腸菌のmhpD(Ferrandezら,J Bacteriol.179:2573−2581(1997年);Pollardら,Eur J Biochem.251:98−106(1998年))、シュードモナス・プチダのtodG及びcmtF(Lauら,Gene 146:7−13(1994年);Eaton,J Bacteriol.178:1351−1362(1996年))、コマモナス属の種CNB−1のcnbE(Maら,Appl Environ Microbiol 73:4477−4483(2007年))、及びバークホルデリア・キセノボランス(Burkholderia xenovorans)のmhpD(Wangら,FEBS J 272:966−974(2005年))によってコードされる。緊密に関連する酵素である2−オキソヘプタ−4−エン−1,7−ジオエートヒドラターゼは、4−ヒドロキシフェニル酢酸の分解に関与し、そこで補因子としてマグネシウムを使用して、2−オキソ−ヘプタ−4−エン−1,7−ジオエート(OHED)を2−オキソ−4−ヒドロキシ−ヘプタ−1,7−ジオエートに変換する(Burksら,J.Am.Chem.Soc.120:(1998年))。OHEDヒドラターゼ酵素の候補は、大腸菌C(Roperら,Gene 156:47−51(1995年);Izumiら,J Mol.Biol.370:899−911(2007年))及び大腸菌W(Prietoら,J Bacteriol.178:111−120(1996年))で同定され、特性評価されている。配列比較により、広範囲の細菌、植物、及び動物におけるホモログが明らかになる。中でも、非常に類似する配列を有する酵素は、肺炎杆菌(91%の同一性、e値=2e−138)及びサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)(91%の同一性、e値=4e−138)に含有されている。
2−ヒドロキシペンテン酸(図12、工程D)又は2−ヒドロキシ−4−オキソペンタン酸(図13、工程F)の脱水を触媒するための酵素候補としては、フマラーゼ(EC4.2.1.2)、シトラマル酸ヒドラターゼ(EC4.2.1.34)及びジメチルマレイン酸ヒドラターゼ(EC4.2.1.85)が挙げられる。フマラーゼ酵素は、自然界において、リンゴ酸のフマル酸への可逆的な脱水を触媒する。基質としての2−ヒドロキシペンテン酸又は2−ヒドロキシ−4−オキソペンテン酸と反応するフマラーゼの能力は、文献には記載されていないが、この酵素に関する豊富な構造情報が利用可能であり、また、他の研究者が、活性、阻害及び局在を変化させるための酵素の改変に成功している(Weaver,61:1395−1401(2005年))。大腸菌は、3つのフマラーゼ:増殖条件により調節されるFumA、FumB及びFumCを有する。FumBは、酸素感受性であり、嫌気条件下でのみ活性を有する。FumAは、微小嫌気条件下で活性を有し、FumCは、好気増殖中に活性を有する唯一の酵素である(Tsengら,183:461−467(2001年);Woodsら,954:14−26(1988年);Guestら,J Gen Microbiol 131:2971−2984(1985年))。更なる酵素候補は、カンピロバクター・ジェジュニ(Smithら,Int.J Biochem.Cell Biol 31:961−975(1999年))、サーマス・サーモフィラス(Mizobataら,Arch.Biochem.Biophys.355:49−55(1998年))及びラット(Kobayashiら,89:1923−1931(1981年))でみられる。高い配列相同性を有する類似の酵素としては、シロイヌナズナ由来のfum1及びコリネバクテリウム・グルタミカム由来のfumCが挙げられる。ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム由来のmmcBCフマラーゼは、2つのサブユニットを有する別の分類のフマラーゼである(Shimoyamaら,270:207−213(2007年))。シトラマル酸ヒドロリアーゼは、自然界では、2−メチルリンゴ酸をメサコン酸に脱水する。この酵素は、広い基質特異性を有することが示されている、メタノカルドコッカス・ジャナスキイの2−オキソブタン酸へのピルビン酸経路において研究されている(Drevlandら,J Bacteriol. 189:4391−4400(2007年))。この酵素活性は、破傷風様菌、モルガネラ・モルガニー、シトロバクター・アマロナティカスでも検出され、これら細菌においてグルタミン酸分解に関与していると考えられる(Katoら,Arch.Microbiol 168:457−463(1997年))。M.ジャナスキイのタンパク質配列は、これら生物における遺伝子に対してそれほど高い相同性を有する訳ではない。ジメチルマレイン酸ヒドラターゼは、ジメチルマレイン酸を水和して(2R,3S)−2,3−ジメチルリンゴ酸を形成するアコニターゼファミリーにおける、可逆的なFe2+依存性且つ酸素感受性の酵素である。この酵素は、ユーバクテリウム・バーケリにおけるdmdABによってコードされている(Alhapelら,上記;Kollmann−Kochら,Hoppe Seylers.Z.Physiol Chem.365:847−857(1984年))。
4.3.1.a アンモニア−リアーゼ:アンモニアリアーゼ酵素は、図13の工程Bにおける2−アミノ−4−オキソペンタン酸(AKP)のアセチルアクリレートへの脱アミノ化を触媒するために必要である。この正確な転換を触媒する酵素は同定されていない。しかし、AKPは、アスパルターゼ(EC4.3.1.1)の天然基質であるアスパラギン酸に構造上類似している。アスパルターゼは、微生物に広く存在する酵素であり、広範囲にわたって特性評価されている(Viola,74:295−341(2000年))。大腸菌酵素は、アスパラギン酸フェニルメチルエステル、アスパラギン、ベンジルアスパラギン酸及びリンゴ酸を含む様々な代替基質と反応することが示されている(Maら,672:60−65(1992年))。更に、基質特異性を変化させるためにこの酵素に対して指向進化が使用されている(Asanoら,22:95−101(2005年))。aspAによってコードされている大腸菌アスパルターゼの結晶構造は解明されている(Shiら,36:9136−9144(1997年))。アスパルターゼ機能を有する酵素は、インフルエンザ菌(Sjostromら,Biochim.Biophys.Acta 1324:182−190(1997年))、シュードモナス・フルオレッセンス(Takagiら,J.Biochem.96:545−552(1984年))、枯草菌(Sjostromら,1324:182−190(1997年))、及びセラチア・マルセスセンス(Takagiら,161:1−6(1985年))においても特性評価されている。
AKPの脱アミノ化を触媒するための別の酵素候補は、3−メチルアスパルターゼ(EC4.3.1.2)である。β−メチルアスパルターゼ及び3−メチルアスパラギン酸アンモニアリアーゼとしても知られているこの酵素は、自然界では、トレオ−3−メチルアスパラギン酸のメサコン酸への脱アミノ化を触媒する。破傷風様菌由来の3−メチルアスパルターゼは、大腸菌でクローニングされ、機能的に発現し、結晶化されている(Asuncionら,57:731−733(2001年);Asuncionら,J Biol Chem.277:8306−8311(2002年);Bottingら,27:2953−2955(1988年);Godaら,31:10747−10756(1992年))。シトロバクター・アマロナティカスでは、この酵素はBAA28709によってコードされている(Kato及びAsano,Arch.Microbiol 168:457−463(1997年))。3−メチルアスパラギン酸も、大腸菌YG1002から結晶化されているが(Asanoら,FEMS Microbiol Lett.118:255−258(1994年))、タンパク質配列は、GenBank等の公的データベースに掲載されていない。配列相同性を用いて、破傷風菌(C.tetani)におけるCTC_02563、及び大腸菌O157:H7におけるECs0761を含む更なる候補遺伝子を同定することができる。
5.1.1.a ラセマーゼ:ECクラス5.1.1におけるラセマーゼ酵素は、D−及びL−アミノ酸を異性化する。このような酵素は、D−アラニン及び/又はD−オルニチンの生物学的利用能を高め、それによって、アラニンのAKPへの(図13の工程A)又はオルニチンの2,4−ジアミノペンタン酸への(図13の工程M)変換を増加させるために必要とされる場合がある。アラニンラセマーゼ(EC5.1.1.1)及びオルニチンラセマーゼ(EC5.1.1.12)活性を有する酵素が特性評価されている。アラニンラセマーゼは、アラニンのL−及びD−立体異性体を相互変換する。大腸菌は、alr及びdadXによりコードされている2つのアラニンアミノムターゼ酵素を有する(Lilleyら,Gene 129:9−16(1993年);Wildら,Mol Gen Genet.198:315−322(1985年))。大腸菌で発現させたとき、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)のvanT遺伝子もアラニンラセマーゼ活性を示した(Ariasら,Microbiology 146(Pt7):1727−1734(2000年))。更なるアラニンラセマーゼ酵素候補は、枯草菌及び結核菌において特性評価されている(Pierceら,FEMS Microbiol Lett.283:69−74(2008年);Strychら,FEMS Microbiol Lett.196:93−98(2001年))。D−オルニチン及びL−オルニチンの相互転換はオルニチンラセマーゼによって触媒される。C.スティックランディのorr遺伝子産物によってコードされている酵素は、精製され、特性評価されている(Fonknechten,J.Bacteriol.In Press:(2009年))。配列類似性により、クロストリジウム・ディフィシレ及びフゾバクテリウム・ペリオドンチカム(Fusobacterium periodonticum)等の生物において更なるオルニチンラセマーゼ遺伝子候補を同定することができる。
5.4.3.a アミノムターゼ:オルニチンアミノムターゼ(EC5.4.3.5)は、オルニチンの2,4−ジアミノペンタン酸への変換(図13の工程M)を触媒する。クロストリジウム・スティックランディのoraSEによってコードされている、この活性を有するB12依存性の酵素は、大腸菌でクローニングされ、配列決定され、発現している(Chenら,J.Biol.Chem.276:44744−44750(2001年))。この酵素は、オルニチンのD−立体異性体と優先的に反応する(Fonknechten,J.Bacteriol.In Press:(2009年))。オルニチンアミノムターゼ酵素は、他の生物では現在まで特性評価されていない。配列相同性によって、アルカリフィラス・オレムランディイ(Alkaliphilus oremlandii)及びクロストリジウム・ディフィシレ等の生物における類似する酵素を同定することができる。リシンアミノムターゼは2つの類似する転換:2,5−ジアミノヘキサン酸(EC5.4.3.4)とリシンとの相互変換、及び3,5−ジアミノヘキサン酸(EC5.4.3.3)と3,6−ジアミノヘキサン酸との相互変換を触媒する。この酵素は、リシンの酢酸及び酪酸への発酵に関与し、クロストリジウム・スティックランディ(Berkovitchら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 101:15870−15875(2004年))及びポルフィロモナス・ジンジバリス(Tangら,Biochemistry 41:8767−8776(2002年))で特性評価されている。
その他:2−アミノ−4−オキソペンタン酸(AKP)は、AKPチオロアーゼによってアラニン及びアセチル−CoAから形成される(図13の工程A)。AKPチオラーゼ(AKPT、EC番号なし)は、クロストリジウム・スティックランディにおけるオルニチン分解に関与するピリドキサールリン酸依存性酵素である(Jengら,Biochemistry 13:2898−2903(1974年);Kenkliesら,Microbiology 145(Pt4):819−826(1999年))。AKPT(or−2(ortA)及びor−3(ortB))のアルファサブユニット及びベータサブユニットをコードする遺伝子クラスターが最近報告され、酵素の生化学的性質が特性評価された(Fonknechten,J.Bacteriol.In Press:(2009年))。酵素は、両方向に作用することができ、D−アラニンの異性体と反応する。酵素工学又は指向進化により、基質としてL−アラニンに作用する酵素を可能にして、一次基質に関して汎用性を有する更なる経路を提供することができる。あるいは、アラニンラセマーゼ酵素の共発現により、基質の利用可能性を高めることができる。高い配列相同性を有する酵素は、クロストリジウム・ディフィシレ、アルカリフィルス・メタリレジゲンス(Alkaliphilus metalliredigenes)QYF、サーモアナエロバクター属(Thermoanaerobacter)の種X514、及びサーモアナエロバクター・テングコンゲンシス(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4でみられる(Fonknechten,J.Bacteriol.In Press:(2009年))。
実施例IX
合成ガスから還元当量を抽出するための例示的なヒドロゲナーゼ及びCOデヒドロゲナーゼ酵素、並びに例示的な還元TCA回路酵素
本発明の天然には存在しない微生物において有用な還元TCA回路の酵素としては、ATPクエン酸リアーゼ及び3つのCO2固定酵素:イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼのうちの1以上が挙げられる。ATPクエン酸リアーゼ又はクエン酸リアーゼ及びα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼの存在は、生物において活発な還元TCA回路が存在することを示す。還元TCA回路の各段階の酵素を以下に示す。
ATPクエン酸シンテターゼとも呼ばれるATPクエン酸リアーゼ(ACL、EC2.3.3.8)は、クエン酸のオキサロ酢酸及びアセチル−CoAへのATP依存性切断を触媒する。ACLは、緑色硫黄細菌クロロビウム・リミコーラ(Chlorobium limicola)及びクロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)において研究されているRTCA回路の酵素である。クロロビウム・リミコーラ由来のアルファ(4)ベータ(4)ヘテロメリック酵素は、大腸菌でクローニングされ、特性評価された(Kanaoら,Eur.J.Biochem.269:3409−3416(2002年)。aclABによってコードされるC.リミコーラ酵素は、不可逆的であり、また、酵素の活性はADP/ATPの比率によって調節される。クロロビウム・テピダム由来の組み換えACLも大腸菌において発現し、触媒機構におけるアルファサブユニット及びベータサブユニットの役割を解明する研究において、ホロ酵素がインビトロで再構成された(Kim及びTabita,J.Bacteriol.188:6544−6552(2006年)。ACL酵素は、バルネアリウム・リトトロフィカム(Balnearium lithotrophicum)、スルフリハイドロゲニビウム・サブテラネウム(Sulfurihydrogenibium subterraneum)及びアクウィフェクス門(Aquificae)の細菌の他のメンバーにおいても同定されている(Huglerら,Environ.Microbiol.9:81−92(2007年))。この活性は、幾つかの真菌においても同様に報告されている。例示的な生物としては、ソルダリア・マクロスポラ(Sordaria macrospora)(Nowrousianら,Curr.Genet.37:189−93(2000年)、アスペルギルス・ニデュランス、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)(Hynes及びMurray,Eukaryotic Cell,July:1039−1048,(2010年)、及びアスペルギルス・ニガー(Meijerら.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.36:1275−1280(2009年)が挙げられる。他の候補は、配列相同性に基いて見出すことができる。これら酵素に関する情報を以下に記載する。
幾つかの生物では、クエン酸のオキサロ酢酸及びアセチル−CoAへの変換は、シトリル−CoA中間体を通じて進行し、2つの別々の酵素シトリル−CoAシンテターゼ(EC6.2.1.18)及びシトリル−CoAリアーゼ(EC4.1.3.34)によって触媒される(Aoshima,M.,Appl.Microbiol.Biotechnol.75:249−255(2007年)。シトリル−CoAシンテターゼは、クエン酸のシトリル−CoAへの活性化を触媒する。ヒドロジェノバクター・サーモフィラス(Hydrogenobacter thermophilus)酵素は、それぞれccsA及びccsBによってコードされる大サブユニット及び小サブユニットで構成される(Aoshimaら,Mol.Micrbiol.52:751−761(2004年))。アキフェクス・エオリクス(Aquifex aeolicus)のシトリル−CoAシンテターゼは、sucC1及びsucD1によってコードされるアルファサブユニット及びベータサブユニットで構成される(Huglerら,Environ.Microbiol.9:81−92(2007年))。シトリル−CoAリアーゼは、シトリル−CoAをオキサロ酢酸及びアセチル−CoAに分割する。この酵素は、ヒドロジェノバクター・サーモフィラスにおけるccl(Aoshimaら,Mol.Microbiol.52:763−770(2004年))及びアキフェクス・エオリクスにおけるaq_150(Huglerら,上記(2007年))によりコードされているホモトリマーである。クエン酸をオキサロ酢酸及びシトリル−CoAに変換するこの機序のための遺伝子は、クロロビウム・テピダムにおいても最近報告された(Eisenら,PNAS 99(14):9509−14(2002年)。
オキサロ酢酸は、順方向及び逆方向の両方に作用する酵素であるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.37)によってリンゴ酸に変換される。出芽酵母は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの3つのコピー、MDH1(McAlister−Henn及びThompson,J.Bacteriol.169:5157−5166(1987年)、MDH2(Minard及びMcAlister−Henn,Mol.Cell.Biol.11:370−380(1991年);Gibson及びMcAlister−Henn,J.Biol.Chem.278:25628−25636(2003年))及びMDH3(Steffan及びMcAlister−Henn,J.Biol.Chem.267:24708−24715(1992年))を有し、これらはそれぞれミトコンドリア、サイトゾル及びペルオキシソームに局在する。大腸菌は、mdhによってコードされる、活性を有するリンゴ酸デヒドロゲナーゼを有することが知られている。
フマル酸ヒドラターゼ(EC4.2.1.2)は、フマル酸のリンゴ酸への可逆的な水和を触媒する。fumA、fumB及びfumCによってコードされる大腸菌の3つのフマラーゼは、酸素利用可能性の異なる条件下で調節される。FumBは、酸素感受性であり、嫌気条件下で活性を有する。FumAは、微小嫌気条件下で活性を有し、FumCは、好気増殖中に活性を有する(Tsengら,J.Bacteriol.183:461−467(2001年);Woodsら,Biochim.Biophys.Acta 954:14−26(1988年);Guestら,J Gen Microbiol 131:2971−2984(1985年))。出芽酵母は、フマラーゼをコードする遺伝子FUM1を1コピー含有し、その産物は、サイトゾル及びミトコンドリアの両方に局在する(Sassら,J.Biol.Chem.278:45109−45116(2003年))。更なるフマラーゼ酵素は、カンピロバクター・ジェジュニ(Smithら,Int.J Biochem.Cell Biol 31:961−975(1999年))、サーマス・サーモフィラス(Mizobataら,Arch.Biochem.Biophys.355:49−55(1998年))及びラット(Kobayashiら,J.Biochem.89:1923−1931(1981年))でみられる。高い配列相同性を有する類似の酵素としては、シロイヌナズナ由来のfum1及びコリネバクテリウム・グルタミカム由来のfumCが挙げられる。ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム由来のMmcBCフマラーゼは、2つのサブユニットを有する別の分類のフマラーゼである(Shimoyamaら,FEMS Microbiol.Lett.270:207−213(2007年))。
フマル酸レダクターゼは、フマル酸のコハク酸への還元を触媒する。frdABCDによってコードされる4つのサブユニットで構成される大腸菌のフマル酸レダクターゼは、膜結合型であり、嫌気条件下で活性を有する。この反応の電子供与体はメナキノンであり、この反応で生成される2つのプロトンはプロトン勾配には寄与しない(Iversonら,Science 284:1961−1966(1999年))。酵母ゲノムは、FRDS1(Enomotoら,DNA Res.3:263−267(1996年))及びFRDS2(Muratsubakiら,Arch.Biochem.Biophys.352:175−181(1998年))によってコードされる2つの可溶性フマル酸レダクターゼアイソザイムをコードし、これらは、それぞれサイトゾル及びプロミトコンドリアに局在し、グルコース上における嫌気増殖中に使用される(Arikawaら,FEMS Microbiol.Lett.165:111−116(1998年))。
コハク酸のスクシニル−CoAへのATP依存性アシル化は、スクシニル−CoAシンテターゼ(EC6.2.1.5)によって触媒される。出芽酵母のLSC1及びLSC2遺伝子、並びに大腸菌のsucC及びsucD遺伝子の産物は、自然界では、1つのATPを消費すると同時にコハク酸からのスクシニル−CoAの形成を触媒するスクシニル−CoAシンテターゼ複合体を形成する(これはインビボでは可逆的な反応である)(Buckら,Biochemistry 24:6245−6252(1985年))。これらタンパク質は、以下の通り同定される:
2−オキソグルタル酸シンテターゼ又は2−オキソグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ(OFOR)としても知られているα−ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ(EC1.2.7.3)は、2つの還元型フェレドキシン当量を消費すると同時にCO2及びスクシニル−CoAからα−ケトグルタル酸を形成する。OFOR及びピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ(PFOR)は、補因子としてチアミンピロリン酸、CoA及び鉄−硫黄クラスターを、そして電子伝達体としてフェレドキシン、フラボドキシン及びFADを利用する2−オキソ酸:フェレドキシン(フラボドキシン)オキシドレダクターゼの多様なファミリーのメンバーである(Adamsら,Archaea.Adv.Protein Chem.48:101−180(1996年))。この分類における酵素は可逆的であり、ヒドロジェノバクター・サーモフィラス、デスルホバクター・ヒドロジェノフィラス(Desulfobacter hydrogenophilus)及びクロストリジウム属の種等のRTCA回路によって炭素を固定する生物においてカルボキシル化方向に機能する(Shibaら.1985年;Evansら,Proc.Natl.Acad.ScI.U.S.A.55:92934(1966年);Buchanan,1971年)。korABによってコードされるH.サーモフィラス由来の2つのサブユニットの酵素は、大腸菌においてクローニングされ、発現している(Yunら,Biochem.Biophys.Res.Commun.282:589−594(2001年))。forDABGEによってコードされる、スクシニル−CoAについて厳密な基質特異性を有する同じ生物由来の5つのサブユニットOFORが、最近同定され、大腸菌で発現した(Yunら.2002年)。両方のH.サーモフィラスOFOR酵素のCO2固定速度は特性評価されている(Yamamotoら,Extremophiles 14:79−85(2010年))。クロロビウム・チオスルファトフィラム(Chlorobium thiosulfatophilum)由来のCO2固定OFORは、精製され、特性評価されているが、この酵素をコードする遺伝子は現在まで同定されていない。H.サーモフィラス遺伝子に対する配列相同性によって、クロロビウム属の種における酵素候補を推測することができる。例えば、クロロビウム・リミコーラゲノムは2つの類似するタンパク質をコードしている。ムーレラ・サーモアセチカ(Moorella thermoacetica)等の酢酸生成菌は、2つのOFOR酵素をコードすると予測される。Moth_0034によってコードされる酵素は、CO2を同化する方向に機能すると予測される。この酵素に関係する遺伝子であるMoth_0034は、現在まで実験的には検証されていないが、公知のOFOR酵素に対する配列相同性によって推測することができる。
生理学的条件下で脱炭酸方向に機能するOFOR酵素は、逆反応を触媒することもできる。ST2300によりコードされている好熱好酸性古細菌スルホロブス属の種の株7由来のOFORについては、広範囲に研究が行われている(Zhangら.1996年)。大腸菌においてこのタンパク質を効率的に発現させるために、プラスミドに基づく発現系が開発されており(Fukudaら,Eur.J.Biochem.268:5639−5646(2001年))、基質特異性に関与する残基が決定された(Fukuda及びWakagi,Biochim.Biophys.Acta 1597:74−80(2002年))。アエロパイラム・ペルニクス(Aeropyrum pernix)株K1由来のApe1472/Ape1473によってコードされているOFORが、最近、大腸菌にクローニングされ、特性評価され、2−オキソグルタル酸及び広範囲の2−オキソ酸と反応することが見出されてた(Nishizawaら,FEBS Lett.579:2319−2322(2005年))。別の例示的なOFORは、ヘリコバクター・ピロリにおけるoorDABCによってコードされている(Hughesら.1998年)。α−ケトグルタル酸に特異的な酵素は、サウエラ・アロマチカにおいて報告されている(Dorner及びBoll,J,Bacteriol.184(14),3975−83(2002年)。配列相同性により、ロドスピリラム・ラブラム(Rhodospirillum rubrum)において類似する酵素を見出すことができる。また、2つのサブユニットの酵素は、クロロビウム・テピダムでも同定されている(Eisenら,PNAS 99(14):9509−14(2002年))。
イソクエン酸デヒドロゲナーゼは、NAD(P)+の還元を伴い、イソクエン酸の2−オキソグルタル酸への可逆的な脱炭酸を触媒する。出芽酵母及び大腸菌におけるIDH酵素は、それぞれ、IDP1及びicdによりコードされている(Haselbeck及びMcAlister−Henn,J.Biol.Chem.266:2339−2345(1991年);Nimmo,H.G.,Biochem.J.234:317−2332(1986年))。還元TCA回路における逆反応である、2−オキソグルタル酸のイソクエン酸への還元的カルボキシル化は、クロロビウム・リミコーラ由来のNADPH依存性CO2固定IDHに好まれ、大腸菌で機能的に発現した(Kanaoら,Eur.J.Biochem.269:1926−1931(2002年))。95%の配列同一性を有する類似の酵素が、以下に列挙する他の幾つかの候補に加えて、C.テピダムゲノムで見出されている。
H.サーモフィラスでは、2−オキソグルタル酸のイソクエン酸への還元的カルボキシル化は、2つの酵素:2−オキソグルタル酸カルボキシラーゼ及びオキサロコハク酸レダクターゼによって触媒される。2−オキソグルタル酸カルボキシラーゼ(EC6.4.1.7)は、α−ケトグルタル酸のオキサロコハク酸へのATP依存性カルボキシル化を触媒する(Aoshima及びIgarashi,Mol.Microbiol.62:748−759(2006年))。この酵素は、2つのサブユニットで構成される大きな複合体である。大(A)サブユニットのビオチン化は、酵素機能に必要である(Aoshimaら,Mol.Microbiol.51:791−798(2004年))。オキサロコハク酸レダクターゼ(EC1.1.1.−)は、オキサロコハク酸のD−トレオ−イソクエン酸へのNAD依存性変換を触媒する。この酵素は、H.サーモフィラスにおけるicdによってコードされるホモダイマーである。この酵素の速度パラメータは、他の生物におけるイソクエン酸デヒドロゲナーゼ酵素とは対照的に、インビボにおいて還元的カルボキシル化方向にのみ酵素が作用することを示す(Aoshima及びIgarashi,J.Bacteriol.190:2050−2055(2008年))。配列相同性に基いて、チオバチルス・デニトリフィカンス(Thiobacillus denitrificans)及びサーモクリニス・アルブス(Thermocrinis albus)でも遺伝子候補が見出されている。
アコニターゼ(EC4.2.1.3)は、中間体シス−アコニット酸を介してクエン酸及びイソ−クエン酸の可逆的な異性化を触媒する鉄−硫黄含有タンパク質である。2つのアコニターゼ酵素が、acnA及びacnBによって大腸菌ゲノムにおいてコードされている。AcnBが主な異化酵素であるが、AcnAがより安定であり、且つ酸化又は酸ストレス条件下で活性を有すると考えられる(Cunninghamら,Microbiology 143(Pt12):3795−3805(1997年))。ネズミチフス菌におけるアコニターゼの2つのアイソザイムは、acnA及びacnBによってコードされている(Horswill及びEscalante−Semerena,Biochemistry 40:4703−4713(2001年))。ACO1によってコードされる出芽酵母のアコニターゼは、ミトコンドリアに局在してTCA回路に関与する(Gangloffら,Mol.Cell.Biol.10:3551−3561(1990年))、及びサイトゾルに局在してグリオキシル酸短絡回路に関与する(Regev−Rudzkiら,Mol.Biol.Cell.16:4163−4171(2005年))。
ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ(PFOR)は、ピルビン酸の可逆的な酸化を触媒してアセチル−CoAを形成する。デスルホビブリオ・アフリカヌス(Desulfovibrio africanus)由来のPFORは、大腸菌でクローニングされ、発現して、酸素の存在下で数日間安定である活性を有する組換え酵素が生成された(Pieulleら,J.Bacteriol.179:5684−5692(1997年))。酸素安定性は、PFORにおいて比較的珍しく、D.アフリカヌス酵素のポリペプチド鎖における60残基の伸長によって付与されると考えられる。この酵素における2つのシステイン残基が、酸素の形態における不活化から酵素を保護するジスルフィド結合を形成する。このジスルフィド結合及び酸素の存在下における安定性は、他のデスルホビブリオ属の種でも見出されている(Vitaら,Biochemistry,47:957−64(2008年))。M.サーモアセチカのPFORも十分に特性評価されており(Menon及びRagsdale,Biochemistry 36:8484−8494(1997年))、独立栄養生長中にピルビン酸合成の方向に高活性を有することが示された(Furdui及びRagsdale,J.Biol.Chem.275:28494−28499(2000年))。更に、大腸菌は、M.サーモアセチカのPFORに対して51%同一であるタンパク質をコードする、特性評価されていないオープンリーディングフレームydbKを有する。大腸菌におけるピルビン酸オキシドレダクターゼ活性を立証する証拠が報告されている(Blaschkowskiら,Eur.J.Biochem.123:563−569(1982年))。また、PFORは、ロドバクター・カプスラータ(Rhodobacter capsulatas)(Yakunin及びHallenbeck,Biochimica et Biophysica Acta 1409(1998年)39−49(1998年))及びクロロビウム・テピダム(Choloboum tepidum)(Eisenら,PNAS 99(14):9509−14(2002年))を含む他の生物においても記載されている。porEDABGによってコードされるH.サーモフィラス由来の5つのサブユニットのPFORは、大腸菌にクローニングされ、脱炭酸方向及びCO2同化方向の両方において機能することが示された(Ikedaら.2006年;Yamamotoら,Extremophiles 14:79−85(2010年))。また、C.カルボキシジボランズ(C.carboxidivorans)P7にもホモログが存在する。幾つかの更なるPFOR酵素は、以下の総説に記載されている(Ragsdale,S.W.,Chem.Rev.103:2333−2346(2003年))。最後に、フラボドキシンレダクターゼ(例えば、ヘリコバクター・ピロリ又はカンピロバクター・ジェジュニ由来のfqrB)(St Mauriceら,J.Bacteriol.189:4764−4773(2007年)又はRnf型タンパク質(Seedorfら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:2128−2133(2008年);及びHerrmann,J.Bacteriol 190:784−791(2008年))は、PFORによって生成される還元型フェレドキシンからNADH又はNADPHを生成する手段を提供する。これらタンパク質は、以下の通り同定される:
ピルビン酸のアセチル−CoAへの変換は、他の幾つかの酵素又はその組合せによって触媒され得る。例えば、ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、NADの分子をNADHに還元すると同時に、ピルビン酸をアセチル−CoAに転換することができる。ピルビン酸の酸化的脱炭酸をアシル化させる一連の部分的な反応を触媒するのは複数の酵素の複合体である。前記酵素は3つのサブユニット:ピルビン酸デカルボキシラーゼ(E1)、ジヒドロリポアミドアシルトランスフェラーゼ(E2)及びジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ(E3)で構成される。この酵素は、大腸菌及び出芽酵母を含む幾つかの生物において天然に存在する。大腸菌酵素では、E1構成要素における特定の残基が基質特異性に関与している(Bisswanger,H.,J.Biol.Chem.256:815−82(1981年);Bremer,J.,Eur.J.Biochem.8:535−540(1969年);Gongら,J.Biol.Chem.275:13645−13653(2000年))。酵素工学的取り組みにより、嫌気条件下における大腸菌のPDH酵素活性が改善された(Kimら,J.Bacteriol.190:3851−3858(2008年);Kimら,Appl.Environ.Microbiol.73:1766−1771(2007年);Zhouら,Biotechnol.Lett.30:335−342(2008年))。大腸菌のPDHとは対照的に、枯草菌の複合体は活性を有し、嫌気条件下で増殖するために必要である(Nakanoら,J.Bacteriol.179:6749−6755(1997年))。また、グリセロール上における増殖中に特性評価された肺炎杆菌のPDHも、嫌気条件下で活性を有する(5)。ウシの腎臓(18)由来の酵素複合体及びアゾトバクター・ビネランジイ由来のE2触媒ドメインの結晶構造は、利用可能である(4)。この変換を触媒することができる更に別の酵素は、ピルビン酸ギ酸リアーゼである。この酵素は、ピルビン酸及びCoAのアセチル−CoA及びギ酸への変換を触媒する。ピルビン酸ギ酸リアーゼは、嫌気性酸化還元バランスの調節を補助するために使用される原核生物に共通の酵素である。例示的な酵素は、pflBによりコードされている大腸菌(Knappe及びSawers,FEMS.Microbiol Rev.6:383−398(1990年))、ラクトコッカス・ラクチス(Melchiorsenら,Appl Microbiol Biotechnol 58:338−344(2002年))、及びストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)(Takahashi−Abbeら,Oral.Microbiol Immunol.18:293−297(2003年))において見出すことができる。大腸菌は、tdcEによってコードされている更なるピルビン酸ギ酸リアーゼを有し、これはピルビン酸又は2−オキソブタン酸のアセチル−CoA又はプロピオニル−CoAへの変換を触媒する(Hesslingerら,Mol.Microbiol 27:477−492(1998年))。大腸菌由来のpflB及びtdcEは両方とも、pflAによってコードされているピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素の存在を必要とする。更に、大腸菌においてyfiDによってコードされる短いタンパク質は、酸素切断されたピルビン酸ギ酸リアーゼに結合し、その活性を回復させることができる(Veyら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:16137−16141(2008年)。大腸菌由来のpflA及びpflBは、国際公開第2008/080124号に記載の通りブタノールを生成するためにサイトゾルのアセチル−CoAを増加させる手段として出芽酵母で発現したことに留意されたい。それぞれpfl及びactによってコードされる更なるピルビン酸ギ酸リアーゼ及び活性化酵素の候補は、クロストリジウム・パストゥリアヌムでみられる(Weidnerら,J Bacteriol.178:2440−2444(1996年))。
更に、異なる酵素を併用して、ピルビン酸をアセチル−CoAに変換することもできる。例えば、出芽酵母では、アセチル−CoAは、まずピルビン酸を脱炭酸してアセトアルデヒドを形成することによりサイトゾルにおいて得られる。アセトアルデヒドは、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼによって酢酸に酸化され、続いて、活性化されて、アセチル−CoAシンテターゼによってアセチル−CoAを形成する。アセチル−CoAシンテターゼは、大腸菌(Kumariら,J.Bacteriol.177:2878−2886(1995年))、サルモネラ・エンテリカ(Staraiら,Microbiology 151:3793−3801(2005年);Staraiら,J.Biol.Chem.280:26200−26205(2005年))及びムーレラ・サーモアセチカ(既に記載した)を含む他の幾つかの生物におけるネイティブな酵素である。あるいは、酢酸は、酢酸キナーゼ及びホスホトランスアセチラーゼによって活性化されてアセチル−CoAを形成し得る。まず、酢酸キナーゼは、ATP分子の使用を伴って、酢酸をアセチルリン酸に変換する。アセチルリン酸及びCoAは、次に、ホスホトランスアセチラーゼによって1つのリン酸を放出するとともにアセチル−CoAに変換される。酢酸キナーゼ及びホスホトランスアセチリアーゼは両方とも、幾つかのクロストリジウム属及びメタノサルチナ・サーモフィラ(Methanosarcina thermophila)においてよく研究されている酵素である。
ピルビン酸をアセチル−CoAに変換する更に別の方法は、ピルビン酸オキシダーゼを介する。ピルビン酸オキシダーゼは、電子受容体としてユビキノンを使用して、ピルビン酸を酢酸に変換する。大腸菌では、この活性はpoxBによってコードされる。poxBは、出芽酵母及びザイモモナス・モビリスのピルビン酸デカルボキシラーゼと類似性を有する。この酵素は、チアミンピロリン酸補因子(Koland及びGennis,Biochemistry 21:4438−4442(1982年));O’Brienら,Biochemistry 16:3105−3109(1977年);O’Brien及びGennis,J.Biol.Chem.255:3302−3307(1980年))、及びフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)補因子を有する。次いで、既に記載した通り、アセチル−CoAシンテターゼ、又は酢酸キナーゼ及びホスホトランスアセチラーゼのいずれかによって、酢酸はアセチル−CoAに変換され得る。また、これらの酵素のうちの一部は、アセチル−CoAからピルビン酸への逆反応を触媒することもできる。
NADH又はNADPHの形態で還元当量を使用する酵素については、還元型フェレドキシンから電子を転移することによりこれら還元型キャリアを生成することができる。2つの酵素、フェレドキシン:NAD+オキシドレダクターゼ(EC1.18.1.3)及びフェレドキシン:NADP+オキシドレダクターゼ(FNR、EC1.18.1.2))が、還元型フェレドキシンからNAD(P)+への電子の可逆的転移を触媒する。フェレドキシン:NADP+オキシドレダクターゼ(FNR、EC1.18.1.2)は、NADPHからフェレドキシン又はフラボドキシン等の低電位アクセプターへの電子の可逆的転移を促進する非共有結合したFAD補因子を有する(Blaschkowskiら,Eur.J.Biochem.123:563−569(1982年);Fujiiら,1977年)。HP1164(fqrB)によってコードされるヘリコバクター・ピロリFNRは、NADPHをピルビン酸依存的に産生させるピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ(PFOR)の活性に関連する(Stら.2007年)。類似する酵素が、カンピロバクター・ジェジュニでみられる(Stら.2007年)。フェレドキシン:NADP+オキシドレダクターゼ酵素は、fprによって大腸菌ゲノムにおいてコードされている(Bianchiら.1993年)。フェレドキシン:NAD+オキシドレダクターゼは、NAD+からNADHを生成するために還元型フェレドキシンを利用する。大腸菌を含む幾つかの生物では、この酵素は多機能ジオキシゲナーゼ酵素複合体の構成要素である。hcaDによってコードされる大腸菌のフェレドキシン:NAD+オキシドレダクターゼは、芳香族酸の利用に関与する3−フェニルプロピオン酸ジオキシゲナーゼ系の構成要素である(Diazら.1998年)。NADH:フェレドキシンレダクターゼ活性は、ヒドロジェノバクター・サーモフィラス株TK−6の細胞抽出物において検出されたが、この活性に関連する遺伝子は未だ同定されていない(Yoonら.2006年)。最後に、エネルギー節約型の膜結合Rnf型タンパク質(Seedorfら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:2128−2133(2008年);Herrmannら,J.Bacteriol.190:784−791(2008年))は、還元型フェレドキシンからNADH又はNADPHを生成する手段を提供する。更なるフェレドキシン:NAD(P)+オキシドレダクターゼは、クロストリジウム・カルボキシジボランズP7においてアノテーションされている。
フェレドキシンは、低い還元電位を有する細胞内の電子伝達体として機能する、1以上の鉄−硫黄クラスターを含有する小さな酸性タンパク質である。還元型フェレドキシンは、フェレドキシン−NADP+オキシドレダクターゼ、ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ(PFOR)、及び2−オキソグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ(OFOR)等のFe依存性酵素に電子を供与する。H.サーモフィラス遺伝子fdx1は、それぞれOFOR及びPFORによる2−オキソグルタル酸及びピルビン酸の可逆的カルボキシル化に必要な[4Fe−4S]型フェレドキシンをコードする(Yamamotoら,Extremophiles 14:79−85(2010年))。スルホロブス・ソルファタリカスの2−オキソ酸:フェレドキシンレダクターゼに結合するフェレドキシンは、モノマー性ジクラスター[3Fe−4S][4Fe−4S]型フェレドキシンである(Parkら.2006年)。このタンパク質に関連する遺伝子は完全には配列決定されていないが、N−末端ドメインはS.アシドカルダリウス由来のzfxフェレドキシンと93%の相同性を共有する。大腸菌ゲノムは、未知の生理機能を有する可溶性フェレドキシン、fdxをコードする。幾つかの証拠が、鉄−硫黄クラスターアセンブリにおいてこのタンパク質が機能できることを示している(Takahashi及びNakamura,1999年)。更なるフェレドキシンタンパク質は、ヘリコバクター・ピロリ(Mukhopadhyayら.2003年)及びカンピロバクター・ジェジュニ(van Vlietら.2001年)において特性評価されている。クロストリジウム・パストゥリアヌム由来の2Fe−2Sフェレドキシンは、大腸菌でクローニングされ、発現している(Fujinaga及びMeyer,Biochemical and Biophysical Research Communications,192(3):(1993年))。ムーレラ・サーモアセチカ、クロストリジウム・カルボキシジボランズP7及びロドスピリラム・ラブラム等の酢酸生成菌は、以下の表に列挙される幾つかのフェレドキシンをコードするためと予測される。
スクシニル−CoAトランスフェラーゼは、CoAアクセプター分子にCoA部分を転移すると同時にスクシニル−CoAのコハク酸への変換を触媒する。多くのトランスフェラーゼが広い特異性を有し、特に、酢酸、コハク酸、プロピオン酸、酪酸、2−アセト酢酸メチル、3−ケトヘキサン酸、3−ケトペンタン酸、吉草酸、クロトン酸、3−メルカプトプロピオン酸、プロピオン酸、酢酸ビニル及び酪酸もの多様なCoAアクセプターを利用することができる。
コハク酸のスクシニル−CoAへの変換は、ATP又はGTPの直接の消費を必要としないトランスフェラーゼによって行うことができる。この種の反応は、多くの生物において一般的である。コハク酸のスクシニル−CoAへの変換は、スクシニル−CoA:アセチル−CoAトランスフェラーゼによっても触媒され得る。クロストリジウム・クルイベリのcat1の遺伝子産物は、スクシニル−CoA:アセチル−CoAトランスフェラーゼ活性を示すことが示されている(Sohling及びGottschalk,J.Bacteriol.178:871−880(1996年))。更に、活性は膣トリコモナス(van Grinsvenら.2008年)及びトリパノソーマ・ブルセイ(Riviereら.2004年)に存在する。aarCによってコードされるアセトバクター・アセチ(Acetobacter aceti)由来のスクシニル−CoA:酢酸CoAトランスフェラーゼは、変異体TCA回路におけるスクシニル−CoAシンテターゼを置換する(Mullinsら.2008年)。また、類似のスクシニル−CoAトランスフェラーゼ活性は、膣トリコモナス(van Grinsvenら.2008年)、トリパノソーマ・ブルセイ(Riviereら.2004年)及びクロストリジウム・クルイベリ(Sohling及びGottschalk,1996年c)にも存在する。シュードモナス・プチダにおけるpcaI及びpcaJによってコードされるβ−ケトアジピン酸:スクシニル−CoAトランスフェラーゼは、更に別の候補である(Kaschabekら.2002年)。前述のタンパク質は以下の通り同定される。
3−ケトアセチル−CoAを3−ケト酸に変換すると同時にコハク酸をスクシニル−CoAに変換する更なる例示的なトランスフェラーゼは、スクシニル−CoA:3:ケト酸−CoAトランスフェラーゼ(EC2.8.3.5)である。例示的なスクシニル−CoA:3:ケト酸−CoAトランスフェラーゼは、ヘリコバクター・ピロリ(Corthesy−Theulazら.1997年)、枯草菌、及びヒト(Fukaoら.2000年;Tanakaら.2002年)に存在する。前述のタンパク質は、以下の通り同定される。
スクシニル−CoA:3:ケト酸−CoAトランスフェラーゼによるコハク酸のスクシニル−CoAへの変換は、アセトアセチル−CoA等の3−ケトアシル−CoAのアセト酢酸等の3−ケト酸への同時変換を必要とする。3−ケト酸を3−ケトアシル−CoAに戻す変換は、アセトアセチル−CoA:酢酸:CoAトランスフェラーゼによって触媒され得る。アセトアセチル−CoA:酢酸:CoAトランスフェラーゼは、アセトアセチル−CoA及び酢酸をアセト酢酸及びアセチル−CoAに変換し、逆もまた同様である。例示的な酵素としては、以下に示す大腸菌由来のatoAD(Hanaiら,Appl Environ Microbiol 73:7814−7818(2007年)、C.アセトブチリカム由来のctfAB(Jojimaら,Appl Microbiol Biotechnol 77:1219−1224(2008年)及びクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム由来のctfAB(Kosakaら,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58−68(2007年))の遺伝子産物が挙げられる。
更に別の可能なCoAアクセプターは、コハク酸ベンジルである。スクシニル−CoA:(R)−ベンジルコハク酸CoA−トランスフェラーゼは、サウエラ・アロマチカ等の生物におけるトルエンのための嫌気性分解経路の一部として機能する(Leutwein及びHeider,J.Bact.183(14)4288−4295(2001年))。ホモログは、アゾアルカス属の種T、アロマトレウム・アロマチカムEbN1及びジオバクター・メタリレデュセンス(Geobacter metallireducens)GS−15で見出すことができる。前述のタンパク質は以下の通り同定される。
更に、ygfHは、大腸菌においてプロピオニルCoA:コハク酸CoAトランスフェラーゼをコードする(Hallerら,Biochemistry,39(16)4622−4629)。近いホモログは、例えば、シトロバクター・ヤンガエ(Citrobacter youngae)ATCC29220、サルモネラ・エンテリカ亜種アリゾナエ血清型、及びエルシニア・インターメディア(Yersinia intermedia)ATCC29909で見出すことができる。前述のタンパク質は以下の通り同定される。
クエン酸リアーゼ(EC4.1.3.6)は、クエン酸を酢酸及びオキサロ酢酸に切断する一連の反応を触媒する。この酵素は、嫌気条件下で活性を有し、3つのサブユニット:アシルキャリアタンパク質(ACP、ガンマ)、ACPトランスフェラーゼ(アルファ)及びアシルリアーゼ(ベータ)で構成される。酵素の活性化には、アセチル−CoAに構造が類似する珍しい補欠分子族2’−(5’’−ホスホリボシル)−3−’−デホスホ−CoAの共有結合及びアセチル化が使用される。アシル化は、CitC、クエン酸リアーゼシンテターゼによって触媒される。2つの更なるタンパク質CitG及びCitXは、アポ酵素を活性型ホロ酵素に変換するために使用される(Schneiderら,Biochemistry 39:9438−9450(2000年))。野性型大腸菌は、クエン酸リアーゼ活性を有しないが;モリブデン補因子合成が欠損している突然変異体は、活性型クエン酸リアーゼを有する(Clark,FEMS Microbiol.Lett.55:245−249(1990年))。大腸菌酵素はcitEFDによってコードされ、クエン酸リアーゼシンテターゼはcitCによってコードされる(Nilekani及びSivaRaman,Biochemistry 22:4657−4663(1983年))。リゥコノストック・メゼンテロイデスのクエン酸リアーゼは、大腸菌でクローニングされ、特性評価され、発現している(Bekalら,J.Bacteriol.180:647−654(1998年))。クエン酸リアーゼ酵素は、ネズミチフス菌及び肺炎杆菌を含む炭素及びエネルギー源としてクエン酸を利用する腸内細菌においても同定されている(Bott,Arch.Microbiol.167:78−88(1997年);Bott及びDimroth,Mol.Microbiol.14:347−356(1994年))。前述のタンパク質を以下に作表する。
酢酸キナーゼ(EC2.7.2.1)は、酢酸のアセチルリン酸への可逆的なATP依存性リン酸化を触媒する。例示的な酢酸キナーゼ酵素は、大腸菌、クロストリジウム・アセトブチリカム及びメタノサルチナ・サーモフィラを含む多くの生物において特性評価されている(Ingram−Smithら,J.Bacteriol.187:2386−2394(2005年);Fox及びRoseman,J.Biol.Chem.261:13487−13497(1986年);Winzerら,Microbioloy 143(Pt10):3279−3286(1997年))。酢酸キナーゼ活性は、大腸菌purTの遺伝子産物においても実証されている(Marolewskiら,Biochemistry 33:2531−2537(1994年)。幾つかの酪酸キナーゼ酵素(EC2.7.2.7)、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム由来のbuk1及びbuk2は、基質として酢酸も受容する(Hartmanis,M.G.,J.Biol.Chem.262:617−621(1987年))。
アセチルリン酸からのアセチル−CoAの形成は、リン酸トランスアセチラーゼ(EC2.3.1.8)によって触媒される。大腸菌に由来するpta遺伝子は、アセチル−CoAをアセチルリン酸に可逆的に変換する酵素をコードしている(Suzuki,T.,Biochim.Biophys.Acta 191:559−569(969))。更なるアセチルトランスフェラーゼ酵素は、枯草菌(Rado及びHoch,Biochim.Biophys.Acta 321:114−125(1973年)、クロストリジウム・クルイベリ(Stadtman,E.,Methods Enzymol.1:5896−599(1955年)、及びサーモトガ・マリティマ(Bockら,J.Bacteriol.181:1861−1867(1999年))において特性評価されている。この反応は、クロストリジウム・アセトブチリカム由来のptb遺伝子産物を含む幾つかのホスホトランスブチリラーゼ酵素(EC2.3.1.19)によっても触媒される(Wiesenbornら,App.Environ.Microbiol.55:317−322(1989年);Walterら,Gene 134:107−111(1993年))。更なるptb遺伝子は、酪酸産生細菌L2−50(Louisら,J.Bacteriol.186:2099−2106(2004年)、及び巨大菌(Vazquezら,Curr.Microbiol.42:345−349(2001年)でみられる。
酢酸のアセチル−CoAへのアシル化は、アセチル−CoAシンテターゼ活性を有する酵素によって触媒される。この反応を触媒する2つの酵素は、AMP形成アセチル−CoAシンテターゼ(EC6.2.1.1)及びADP形成アセチル−CoAシンテターゼ(EC6.2.1.13)である。AMP形成アセチル−CoAシンテターゼ(ACS)は、酢酸をアセチル−CoAに活性化するための主な酵素である。例示的なACS酵素は、大腸菌(Brownら,J.Gen.Microbiol.102:327−336(1977年)、ラルストニア・ユートロファ(Priefert及びSteinbuchel,J.Bacteriol.174:6590−6599(1992年))、メタノサーモバクター・サームオートトロフィカス(Methanothermobacter thermautotrophicus)(Ingram−Smith及びSmith,Archaea 2:95−107(2007年))、サルモネラ・エンテリカ(Gulickら,Biochemistry 42:2866−2873(2003年))、及び出芽酵母(Jogl及びTong,Biochemistry 43:1425−1431(2004年))でみられる。ADP形成アセチル−CoAシンテターゼは、一般に広い基質範囲を有する可逆的な酵素である(Musfeldt及びSchonheit,J.Bacteriol.184:636−644(2002年))。ADP形成アセチル−CoAシンテターゼの2つのアイソザイムは、アーケオグロブス・フルギダスのゲノムにおいて、AF1211及びAF1983によってコードされる(Musfeldt及びSchonheit,上記(2002年))。ハロアーキュラ・マリスモルツイ由来の酵素(スクシニル−CoAシンテターゼとしてアノテーションされた)も、基質として酢酸を受容し、酵素の可逆性が示された(Brasen及びSchonheit,Arch.Microbiol.182:277−287(2004年))。超好熱性古細菌(crenarchaeon)であるピロバキュラム・アエロフィラム由来のPAE3250によってコードされているACDは、全ての特性評価されているACDのうち最も広い基質範囲を示し、酢酸、イソブチリル−CoA(好ましい基質)、及びフェニルアセチル−CoAと反応する(Brasen及びSchonheit,上記(2004年))。指向進化又は工学的技術を用いて、ホスト生物の生理的温度で作用するようにこの酵素を改変することができる。A.フルギダス、H.マリスモルツイ及びP.アエロフィラム由来の酵素は全て、大腸菌でクローニングされ、機能的に発現し、特性評価されている(Brasen及びSchonheit,上記(2004年);Musfeldt及びSchonheit,上記(2002年))。更なる候補としては、大腸菌においてsucCDによってコードされるスクシニル−CoAシンテターゼ(Buckら,Biochemistry 24:6245−6252(1985年))、及びシュードモナス・プチダ由来のアシル−CoAリガーゼ(Fernandez−Valverdeら,Appl.Environ.Microbiol.59:1149−1154(1993年))が挙げられる。前述のタンパク質を以下に作表する。
アセチル−CoAのマロニル−CoAへの変換は、アセチル−CoAカルボキシラーゼ酵素によって行うことができる。これら酵素は、複数のサブユニットを含有する。このような酵素のうちの3つを以下に提供する。
2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、又は1,3−ブタンジエン等の還元型発酵産物を合成する微生物細胞の基質のC−mol当たりの生成物の収量は、炭水化物原料における不十分な還元当量によって限定される。還元当量、すなわち電子は、それぞれ一酸化炭素デヒドロゲナーゼ(CODH)及びヒドロゲナーゼ酵素を使用するCO及びH2等の合成ガス成分から抽出することができる。次いで、還元当量は、酸化型フェレドキシン、酸化型キノン、酸化型チトクロム、NAD(P)+、水又は過酸化水素等のアクセプターに渡されて、それぞれ還元型フェレドキシン、還元型キノン、還元型チトクロム、NAD(P)H、H2又は水を形成する。様々なWood−Ljungdahl経路及び還元的TCA回路酵素のための酸化還元キャリアとして機能し得るので、還元型フェレドキシン及びNAD(P)Hが特に有用である。
以下に、合成ガス成分からレドックスを抽出するために使用される酵素及び対応する遺伝子を記載する。CODHは、電子の消費又は獲得においてCO及びCO2を相互変換する可逆的な酵素である。ACS/CODH複合体におけるCODHの自然界における生理学的な役割は、アセチル−CoAシンテターゼによってアセチル−CoAに取込むためにCO2をCOに変換することである。それにもかかわらず、このようなCODH酵素は、このような酵素の可逆的な性質のために、COからの還元当量の抽出に適している。ACSの非存在下においてこのようなCODH酵素が発現することにより、前記酵素がこれらの自然界における生理学的な役割(すなわち、CO酸化)とは反対の方向に作用することが可能になる。
M.サーモアセチカ、C.ヒドロジェノフォルマンス、C.カルボキシジボランズP7及び他の幾つかの生物では、CODHをコードする更なる遺伝子は、ACS/CODHオペロンの外側に位置する。これら酵素は、一酸化炭素の二酸化炭素への変換から電子(すなわち、還元当量)を抽出するための手段を提供する。M.サーモアセチカ遺伝子(Genbankアクセッション番号:YP_430813)は、オペロンにおいて単独で発現し、「ピンポン」反応においてCOからフェレドキシンのような外部伝達物質へ電子を伝達すると考えられる。次いで、還元型伝達物質は、他の還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NAD(P)H)キャリア又はフェレドキシン依存性細胞過程に連結される(Ragsdale,Annals of the New York Academy of Sciences 1125:129−136(2008年))。近接するタンパク質であるC.ヒドロジェノフォルマンスのCODH−II及びCooFをコードする遺伝子は、クローニングされ、配列決定された(Gonzalez及びRobb,FEMS Microbiol Lett.191:243−247(2000年))。得られた複合体は膜結合型であったが、CODH−IIの細胞質画分は同化の役割を示唆するNADPHの形成を触媒することが示された(Svetlitchnyiら,J Bacteriol.183:5134−5144(2001年))。また、CODH−IIの結晶構造も利用可能である(Dobbekら,Science 293:1281−1285(2001年))。類似するACS不含CODH酵素は、ジオバクター・メタリレデュセンスGS−15、クロロビウム・ファエオバクテロイデス(Chlorobium phaeobacteroides)DSM266、クロストリジウム・セルロリティカム(Chlostridium cellulolyticum)H10、デスルホビブリオ・デスルフリカンス(Desulfovibrio desulfuricans)亜種デスルフリカンス株ATCC 27774、ペロバクター・カルビノリカス(Pelobacter carbinolicus)DSM2380及びカンピロバクター・カルバス(Campylobacter curvus)525.92を含む生物の多様なアレイにおいて見出すことができる。
場合によっては、ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、CODHに隣接して位置する。ロドスピリラム・ラブラムでは、コードされたCODH/ヒドロゲナーゼタンパク質は、CO及びH2OのCO2及びH2への変換からプロトン勾配の形態でエネルギーが生じる部位であることが示されている膜結合酵素複合体を形成する(Foxら,J Bacteriol.178:6200−6208(1996年))。C.ヒドロジェノフォルマンスのCODH−I及びその隣接する遺伝子は、R.ラブラムCODH/ヒドロゲナーゼ遺伝子クラスターに対する類似性に基づいて、類似する機能的役割を触媒することが示唆されている(Wuら,PLoS Genet.1:e65(2005年))。C.ヒドロジェノフォルマンスCODH−Iも、電極につながれたきに強力なCO酸化及びCO2還元活性を示すことが示された(Parkinら,J Am.Chem.Soc.129:10328−10329(2007年))。例示的なCODH及びヒドロゲナーゼ遺伝子のタンパク質配列は、以下のGenBankアクセッション番号によって同定することができる。
大腸菌及び他の腸内細菌においてネイティブなのは、4つ以下のヒドロゲナーゼをコードする複数の遺伝子である(Sawers,G.,Antonie Van Leeuwenhoek 66:57−88(1994年);Sawersら,J Bacteriol.164:1324−1331(1985年);Sawers及びBoxer,Eur.J Biochem.156:265−275(1986年);Sawersら,J Bacteriol.168:398−404(1986年))。酵素活性の多重性を考慮して、大腸菌又は別のホスト生物は、入って来る分子状の水素を分離し、対応するアクセプターを還元するのに十分なヒドロゲナーゼ活性を提供することができる。大腸菌は、それぞれhyaABCDEF及びhybOABCDEFGの遺伝子クラスターによってコードされている、2つの取込みヒドロゲナーゼHyd−1及びHyd−2を有する(Lukeyら,How E.coli is equipped to oxidize hydrogen under different redox conditions,J Biol Chem published online,2009年11月16日)。Hyd−1は酸素耐性であり、不可逆的であり、hyaCチトクロムを介してキノン還元に関連する。Hyd−2はO2感受性であり、可逆的であり、電子を周辺質のフェレドキシンhybAに伝達し、これは次いで、hybBの内在性膜タンパク質を介してキノンを還元する。還元型キノンは、TCA回路の還元的分岐におけるフマル酸レダクターゼのための電子供給源として機能し得る。還元型フェレドキシンは、NADPH又はNADHを生成するためにNAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ等の酵素によって使用され得る。あるいは、還元型フェレドキシンは、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、AKGフェレドキシンオキシドレダクターゼ及び5,10−メチレン−H4葉酸レダクターゼ等の反応に電子供与体として使用される場合もある。
大腸菌の水素−リアーゼ系は、ヒドロゲナーゼ3、アクセプターとしてフェレドキシンを使用する膜結合酵素複合体、及びフェレドキシンアクセプターを使用するヒドロゲナーゼ4を含む。ヒドロゲナーゼ3及び4は、それぞれhyc及びhyfの遺伝子クラスターによってコードされる。ヒドロゲナーゼ3は、可逆的な酵素であることが示されている(Maedaら,Appl Microbiol Biotechnol 76(5):1035−42(2007年))。また、大腸菌におけるヒドロゲナーゼ活性は、その対応するタンパク質がヒドロゲナーゼ複合体のアセンブリに含まれるhyp遺伝子の発現にも依存する(Jacobiら,Arch.Microbiol 158:444−451(1992年);Rangarajanら,J.Bacteriol.190:1447−1458(2008年))。
M.サーモアセチカのヒドロゲナーゼは、十分な内因性のヒドロゲナーゼ活性を有しないホストに適している。M.サーモアセチカは、排他的な炭素源としてCO2を用いて増殖することができ、これは、還元当量がH2から抽出されて、Wood−Ljungdahl経路を介してアセチル−CoAを合成することが可能になることを示す(Drake,H.L.,J.Bacteriol.150:702−709(1982年);Drake及びDaniel,Res.Microbiol.155:869−883(2004年);Kellum及びDrake,J.Bacteriol.160:466−469(1984年))(図22を参照されたい)。M.サーモアセチカは、大腸菌由来の幾つかのhyp、hyc及びhyf遺伝子に対するホモログを有する。これら遺伝子によってコードされるタンパク質配列は、以下のGenBankアクセッション番号によって同定される。
その遺伝子が大腸菌hyp遺伝子に相同であるM.サーモアセチカにおけるタンパク質を以下に示す。
大腸菌ヒドロゲナーゼ3及び/又は4タンパク質に相同なM.サーモアセチカにおけるタンパク質を以下の表に列挙する。
更に、ヒドロゲナーゼ機能をコードする幾つかの遺伝子クラスターがM.サーモアセチカに存在し、それらの対応するタンパク質配列を以下に提供する。
ラルストニア・ユートロファH16は、末端電子受容体としての酸素とともに、エネルギー源として水素を使用する。その膜結合型取込み[NiFe]ヒドロゲナーゼは、周辺質に配向され、b型チトクロムを介して呼吸鎖に結合する(Schink及びSchlegel,Biochim.Biophys.Acta,567,315−324(1979年);Bernhardら,Eur.J.Biochem.248,179−186(1997年))、「O2耐性」ヒドロゲナーゼである(Cracknellら.Proc Nat Acad Sci,106(49)20681−20686(2009年))。また、R.ユートロファは、細胞質に存在し、水素を消費して直接NAD+を還元するHoxオペロンによってコードされるO2耐性の可溶性ヒドロゲナーゼを含有する(Schneider及びSchlegel,Biochim.Biophys.Acta 452,66−80(1976年);Burgdorf,J.Bact.187(9)3122−3132(2005年))。可溶性ヒドロゲナーゼ酵素は、ジオバクター・スルフレドゥセンス(Coppi,Microbiology 151,1239−1254(2005年))、シネコシスティス属の株PCC6803(Germer,J.Biol.Chem.,284(52),36462−36472(2009年))、及びチオカプサ・ロゼオペルシシナ(Thiocapsa roseopersicina)(Rakhely,Appl.Environ.Microbiol.70(2)722−728(2004年))を含む幾つかの生物に更に存在する。シネコシスティス属の酵素は、水素からNADPHを生成することができる。シネコシスティス属の株PCC6803由来のHoxオペロン、及びノストック属(Nostoc)の種PCC7120由来のHypオペロンによってコードされるアクセサリー遺伝子の両方の過剰発現は、Hox遺伝子単独の発現と比較して、ヒドロゲナーゼ活性を上昇させた(Germer,J.Biol.Chem.284(52),36462−36472(2009年))。
二酸化炭素をピルビン酸又はホスホエノールピルビン酸のいずれかに固定し、TCA回路中間体であるオキサロ酢酸又はリンゴ酸を形成するために使用される幾つかの酵素及び対応する遺伝子を以下に記載する。
ホスホエノールピルビン酸のオキサロ酢酸へのカルボキシル化は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼによって触媒される。例示的なPEPカルボキシラーゼ酵素は、大腸菌におけるppc(Kaiら,Arch.Biochem.Biophys.414:170−179(2003年)、メチロバクテリウム・エキストロクエンス(Methylobacterium extorquens)AM1におけるppcA(Arpsら,J.Bacteriol.175:3776−3783(1993年)及びコリネバクテリウム・グルタミカムにおけるppc(Eikmannsら,Mol.Gen.Genet.218:330−339(1989年)によってコードされる。
ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換するための別の酵素は、PEPカルボキシキナーゼであり、これは、PEPをカルボキシル化すると同時にATPを形成する。ほとんどの生物では、PEPカルボキシキナーゼは、糖新生機能を果たし、1つのATPを消費してオキサロ酢酸をPEPに変換する。出芽酵母は、ネイティブなPEPカルボキシキナーゼPCK1が糖新生の役割を果たすこのような生物の一例である(Valdes−Heviaら,FEBS Lett.258:313−316(1989年)。大腸菌は、別のこのような生物であり、オキサロ酢酸の生成におけるPEPカルボキシキナーゼの役割がPEPカルボキシラーゼに比べて小さいと考えられるので、恐らくPEPカルボキシキナーゼの重炭酸に対するより高いKmのために、これはATPを形成しない(Kimら,Appl.Environ.Microbiol.70:1238−1241(2004年))。それにもかかわらず、ネイティブな大腸菌PEPカルボキシキナーゼのPEPからオキサロ酢酸への活性が、大腸菌K−12のppc突然変異体において最近実証された(Kwonら,J.Microbiol.Biotechnol.16:1448−1452(2006年))。これらの株は増殖欠陥を示さず、高NaHCO3濃度においてコハク酸生成が増加した。大腸菌の突然変異株は、適応進化に従って優勢なCO2固定酵素としてPckを採用することができる(Zhangら.2009年)。幾つかの生物、特にルーメン細菌では、PEPカルボキシキナーゼは、PEPからのオキサロ酢酸の産生及びATPの生成においてかなり効率的である。大腸菌にクローニングされているPEPカルボキシキナーゼ遺伝子の例としては、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス(Mannheimia succiniciproducens)(Leeら,Biotechnol.Bioprocess Eng.7:95−99(2002年))、アネロビオスピリウム・サクシニシプロデュセンス(Anaerobiospirillum succiniciproducens)(Laivenieksら,Appl.Environ.Microbiol.63:2273−2280(1997年)、及びアクチナバチルス・サクシノゲネス(Actinobacillus succinogenes)(Kimら.上記)に由来するものが挙げられる。インフルエンザ菌によってコードされるPEPカルボキシキナーゼ酵素は、PEPからのオキサロ酢酸の形成において有効である。
ピルビン酸カルボキシラーゼ(EC6.4.1.1)は、1つのATPを消費して、ピルビン酸をオキサロ酢酸に直接変換する。ピルビン酸カルボキシラーゼ酵素は、出芽酵母においてはPYC1(Walkerら,Biochem.Biophys.Res.Commun.176:1210−1217(1991年)及びPYC2(Walkerら,上記)、恥垢菌(Mycobacterium smegmatis)においてはpyc(Mukhopadhyay及びPurwantini,Biochim.Biophys.Acta 1475:191−206(2000年))によってコードされる。
リンゴ酸酵素は、1還元当量を消費してCO2及びピルビン酸をリンゴ酸に変換するために適用することができる。この目的のためのリンゴ酸酵素としては、制限するものではないが、リンゴ酸酵素(NAD依存性)及びリンゴ酸酵素(NADP依存性)を挙げることができる。例えば、大腸菌リンゴ酸酵素(Takeo,J.Biochem.66:379−387(1969年))又はより高い活性を有する類似酵素のうちの1つは、ピルビン酸及びCO2のリンゴ酸への変換を可能にすると表すことができる。PEPとは対照的に炭素をピルビン酸に固定することによって、リンゴ酸酵素は、PEP由来の高エネルギーリン酸結合をピルビン酸キナーゼによって変換して、ピルビン酸の形成においてATPを作成するか、又はグルコースを輸送するためのホスホトランスフェラーゼ系により変換することを可能にする。リンゴ酸酵素は、典型的に、リンゴ酸からのピルビン酸形成の方向に作用すると仮定されるが、maeAによってコードされるNAD依存性酵素の過剰発現は、炭素を固定する方向に作用することにより、嫌気条件下で致死性のΔpfl−ΔldhA表現型を回復すると同時に大腸菌におけるコハク酸生成を増加させることが実証されている(Stols及びDonnelly,Appl.Environ.Microbiol.63(7)2695−2701(1997年))。類似する所見は、大腸菌において豚回虫(Ascaris suum)由来のリンゴ酸酵素を過剰発現する際にもみられた(Stolsら,Appl.Biochem.Biotechnol.63−65(1),153−158(1997年))。maeBによってコードされる第2の大腸菌リンゴ酸酵素は、NADP依存性であり、また、オキサロ酢酸及び他のアルファケト酸を脱カルボキシルする(Iwakuraら,J.Biochem.85(5):1355−65(1979年))。
TCA回路の還元的分岐を介してオキサロ酢酸(例えば、PEPカルボキシラーゼ、PEPカルボキシキナーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼから形成される)又はリンゴ酸(例えば、リンゴ酸酵素又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼから形成される)をスクシニル−CoAに変換するために使用される酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマル酸デヒドラターゼ(フマラーゼ)、フマル酸レダクターゼ及びスクシニル−CoAトランスフェラーゼである。酵素の各々に対する遺伝子は、上記の通りである。
微生物においてスクシニル−CoAから様々な生成物への経路を改変するための酵素、遺伝子及び方法は、現在当技術分野において公知である。本明細書に開示する通りCO及び/又はH2から得られる更なる還元当量は、炭水化物系原料を利用するとき、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、又は1,3−ブタジエンの収量を向上させる。例えば、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、又は1,3−ブタジエンは、図20に例証される経路を介してスクシニル−CoAから生成され得る。スクシニル−CoAを2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、又は1,3−ブタジエンに変換するための例示的な酵素としては、スクシニル−CoA:アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ、3−オキソアジピル−CoAトランスフェラーゼ、シンテターゼ、又はヒドロラーゼ、3−オキソアジピン酸デヒドロゲナーゼ、2−フマリル酢酸デカルボキシラーゼ、3−オキソペンタ−4−エノエートレダクターゼ、3−ヒドロキシペンタ−4−エノエートデヒドラターゼ、3−オキソアジピル−CoAレダクターゼ、3−ヒドロキシアジピル−CoAトランスフェラーゼ、シンテターゼ、又はヒドロラーゼ、3−ヒドロキシアジピン酸デヒドロゲナーゼ、3−ヒドロキシヘキサ−4−エンジオエートデカルボキシラーゼ、3−オキソアジピン酸レダクターゼ、2−フマリル酢酸レダクターゼ、3−ヒドロキシペンタ−4−エノエートデカルボキシラーゼ、2,4−ペンタジエノエートデカルボキシラーゼが挙げられる。
微生物において解糖中間体から様々な生成物への経路を改変するための酵素、遺伝子及び方法は、現在当技術分野において公知である。CO及びH2から得られる更なる還元当量は、本明細書に記載の通り、炭水化物におけるこれら全ての生成物の収量を向上させる。
実施例X
COの取り扱い及び嫌気培養の方法
この実施例は、COの取り扱い及び嫌気培養に使用される方法について記載する。
A.アッセイ及び少規模培養のための少量のCOの取り扱い。COは、毒性を有する無臭、無色、及び無味の気体である。したがって、COを利用する培養及びアッセイには特殊な取り扱いが必要とされた。CO酸化、アセチル−CoA合成、ミオグロビンを使用するCO濃縮、及び小規模バッチ式培養におけるCO耐性/利用を含む幾つかのアッセイには、ドラフト内で分注され、取り扱われた少量のCOガスが必要とされた。生化学アッセイでは、非常に少量(<2mL)の生化学アッセイ培地又はバッファをCOで飽和させ、次いで、アッセイを実施することが必要とされた。COの取り扱い工程は全て、適切な高さに設定されたサッシを備え且つ送風機の稼働しているドラフト内において実施した;COは、シュレンクラインに接続された圧縮ガスシリンダー及びレギュレータから分注した。後者を用いれば、幾つかの可能性のあるキュベット又はバイアルの各々に等濃度のCOを確実に分注することができる。シュレンクラインは、入力側に酸素スクラッバー、反対側に油圧放出バブラー及び通気孔を有するように設定した。アッセイキュベットは、嫌気的であり且つCOを含有していた。したがって、アッセイキュベットはゴム栓でしっかりと密閉し、試薬は、気密針及びシリンジを使用して添加又は除去した。次に、少量(約50mL)の培養物を、しっかりと密閉された血清ボトル内においてCO飽和状態で増殖させた。生化学アッセイと同様に、CO飽和微生物培養物は、シュレンクライン設備を用いてドラフトにおいて平衡化した。生化学アッセイ及び微生物培養はともに、ドラフトの外側における取り扱いを安全にするために持ち運び可能な密閉容器内で且つ小体積で行った。圧縮COタンクは、ドラフトに隣接していた。
典型的には、シュレンクラインを用いて、それぞれ通気孔を有するキュベットにCOを分注した。キュベット上のゴム栓に19又は20ゲージの使い捨て注射針を刺し、同様に通気孔を設ける。油圧バブラーをCOタンク及び酸素スクラッバーと共に使用した。ガラス製又は石英製の分光光度計用キュベットは頂上部に円形の穴を有し、その中にKontesストッパースリーブ、Sz7774250−0007を設置した。CO検出器ユニットをドラフトの近くに配置した。
B.大規模培養物に供給する多量のCOの取り扱い。発酵生産における原料としての合成ガスをシミュレートするために、発酵培養物にCO又はCOとH2との混合物のいずれかを供給する。したがって、1リットル〜数リットルの範囲の量の細胞は、培地中のCOの溶解濃度を上昇させるためのCO気体の添加を含み得る。これら状況では、かなり多量の連続投与されるCO気体を培養物に添加する。様々な時点において、培養物を回収するか、又はサンプルを採取する。あるいは、発酵槽の一部である一体型連続流遠心分離機を用いて細胞を回収する。
発酵プロセスは、嫌気条件下において実施される。場合によっては、酸素又は空気を発酵槽にポンプで注入して、呼吸環境を与えるのに適した酸素飽和状態を確保することは不経済である。更に、嫌気発酵中に生じる還元力が、呼吸よりも生成物の形成において必要とされる場合がある。更に、様々な経路における酵素の多くは、様々な程度酸素に対して感受性である。M.サーモアセチカ等の古典的な酢酸生成菌は偏性嫌気性菌であり、Wood−Ljungdahl経路における酵素は、分子状酸素による不可逆的な不活化に対する感受性が高い。酸素耐性酢酸生成菌が存在する一方で、Wood−Ljungdahl経路における酵素のレパートリーは、酸素の存在下において不適合である場合がある。その理由は、大部分が金属酵素であり、重要な構成要素がフェレドキシンであり、且つエネルギー獲得を最大化するために、Wood−Ljungdahl経路から離れた代謝を迂回させるよう調節される場合があるためである。同時に、培養中の細胞は、大規模な細胞増殖の存在下での非常手段の必要性を抑える酸素スカベンジャーとして作用する。
C.嫌気性チャンバー及び条件。例示的な嫌気性チャンバーは、市販されている(例えば、Vacuum Atmospheres Company、Hawthorne CA;MBraun,Newburyport MAを参照されたい)。条件は、1ppm以下のO2濃度及び1atmの純N2を含んでいた。一例では、3つの酸素スクラッバー/触媒再生器が使用され、チャンバーはO2電極を含んでいた(Teledyne;City of Industry CA等)。ほぼ全ての物品及び試薬を、内側チャンバーのドアを開く前にチャンバーのエアロックにおいて4回循環させた。>5mLの体積を有する試薬は、チャンバーに導入する前に純N2でスパージした。グローブは1年間に2回取り替え、酸素レベルの変化に対するチャンバーの反応が次第に鈍くなってきたら、触媒容器を定期的に再生させる。チャンバーの圧力は、ソレノイドにより起動される一方向バルブによって制御した。これによって周囲よりも高いレベルにチャンバー圧を設定することができ、パージバルブを通じて非常に小さなチューブを移動させることが可能になった。
嫌気性チャンバーにより、常に非常に低く、且つ高度に酸素感受性である嫌気条件に必要とされるO2濃度が実現された。しかし、細胞の増殖及び取扱いは通常このような予防措置を必要としない。別の嫌気性チャンバーの構成では、混合物中にいくらかの水素ガスを必要とする触媒として白金又はパラジウムを使用することができる。ソレノイドバルブを使用する代わりに、バブラーによって圧力放出を制御してもよい。機器を使用するO2モニタリングを用いる代わりに、試験用ストリップを使用してもよい。
D.嫌気性微生物学。COの取扱いに関して上記した通り、少量の培養物を取り扱った。具体的には、血清ボトル又は培地ボトルに厚いゴム栓を取り付け、アルミニウム製クリンプを使用してボトルを密閉する。Terrificブロス等の培地を従来の方法で作製し、適切にサイズ分けした血清ボトルに分注する。ボトルには適度なバブリングで約30分間窒素をスパージする。これにより培地から酸素の大部分が除去される。この工程の後、各ボトルにゴム栓で蓋をし(Bellco 20mmセプタムストッパー;Bellco、Vineland、NJ等)、クリンプで密閉する(Bellco 20mm)。次いで、培地のボトルを、緩徐な(液体)排出サイクルを使用してオートクレーブにかける。少なくとも時折、ストッパーを介して針を突き刺し、オートクレーブ中に排気してもよい;オートクレーブから取り出す際に針は直ちに除去する必要がある。滅菌培地は、シリンジ及び針を介して添加される残りの培地成分、例えばバッファー又は抗生物質を有する。還元剤を添加する前に、窒素(又は用途に応じてCO)を用いて30〜60分間ボトルを平衡化する。100×150mMの硫化ナトリウム、200mMのシステイン−HCl等の還元剤を添加する。これは、硫化ナトリウムを乾燥ビーカーに、そしてシステインを血清ボトルに量り入れ、両方を嫌気性チャンバーに入れ、硫化ナトリウムを嫌気水に溶解させ、次いでこれを血清ボトル中のシステインに添加することによって作製される。硫化ナトリウム溶液は、システインと接触すると硫化水素ガスを発生するので、ボトルは直ちに密閉する。培養物に注入するとき、シリンジフィルターを使用して溶液を滅菌する。B12(10μMのシアノコバラミン)、塩化ニッケル(NiCl2、チャンバー内の嫌気水中で作製した40mM原液から最終濃度20マイクロモルにした、オートクレーブ処理によって又は培養物への注入時にシリンジフィルターを使用することによって滅菌した)、及び硫酸第一鉄アンモニウム(必要とされる最終濃度は100μMである−チャンバー内の嫌気水中で100〜1000倍原液として作製した、オートクレーブ処理によって又は培養物への注入時にシリンジフィルターを使用することによって滅菌した)等の他の成分は、注射針を介して添加する。嫌気的条件下でのより迅速な増殖を容易にするために、1リットルのボトルに、嫌気的に増殖させた前培養物50mLを接種した。ベクター中のpA1−lacO1プロモーターの誘導は、イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度0.2mMになるまで添加することによって実施し、約3時間実施した。
バブリングしながら連続的に気体を添加することにより、より大きなボトル中で多量の培養物を増殖させることができる。金属製バブラーを備えるゴム栓を培地添加後にボトルに配置し、ボトルの残り部分をセットアップする前に30分間以上窒素をスパージする。滅菌フィルターがボトルに吹き込まれる気体を滅菌し、ボトル上のホースを小型Cクランプで圧縮可能であるように、各ボトルを一緒に置く。培地及び細胞は、磁気攪拌子を用いて攪拌する。全ての培地成分及び細胞を添加したら、ボトルを、大気中であるが、連続的にボトルに窒素をスパージしながら、インキュベータ内でインキュベートする。
実施例XI
CO酸化(CODH)アッセイ
この実施例では、CO酸化(COデヒドロゲナーゼ;CODH)を測定するためのアッセイ法について記載する。
ムーレラ・サーモアセチカの7つの遺伝子のCODH/ACSオペロンを大腸菌発現ベクターにクローニングした。インタクトな約10kbpのDNA断片をクローニングしたが、この領域中の遺伝子の一部は自身の内因性プロモーターにより発現され、全てが内因性リボソーム結合部位を含有する可能性がある。これらクローンを、CODH活性を定量的に測定するアッセイを用いてCO酸化についてアッセイした。M.サーモアセチカの遺伝子産物に対する抗血清をウエスタンブロットに用いて、比活性を推定した。M.サーモアセチカはグラム陽性菌であり、リボソーム結合部位のエレメントは大腸菌において良好に機能すると予測される。以下でより詳細に記載するこの活性は、M.サーモアセチカの比活性の約50分の1であると推定された。M.サーモアセチカの酵素の至適温度が55℃付近であるという事実によって、組換え大腸菌細胞のCODH活性が制限される可能性がある。したがって、中温性であり且つ明らかにインタクトなCODH/ACSオペロン及びWood−Ljungdahl経路を有するムーレラ属に近縁なデスルフィトバクテリウム・ハフニエンス(Desulfitobacterium hafniense)等の中温性CODH/ACS経路が有利である可能性がある。考えられるホスト生物としての酢酸生成菌としては、ロドスピリラム・ラブラム、ムーレラ・サーモアセチカ及びデスルフィトバクテリウム・ハフニエンスが挙げられるが、これらに限定されない。
CO酸化は、最も感度が高く且つ最も確実なCODH/ACSアッセイである。大腸菌に基づく合成ガス使用系は、最終的に、特に最大活性に関して、クロストリジウム属(すなわち、ムーレラ属)の系とほぼ同程度に嫌気的であることを必要とする。CODHの改善は可能であるはずであるが、最終的には水に対するCOガスの溶解度によって制限される。
ます、各遺伝子を発現ベクターに個別にクローニングした。複数のサブユニット/1複合体の組合せ発現ユニットを作製した。タンパク質レベルでの大腸菌における発現を決定した。組合せたM.サーモアセチカCODH/ACSオペロンと個別の発現クローンとを両方作製した。
CO酸化アッセイ。このアッセイはWood−Ljungdahl経路内の酵素活性のアッセイのうち最も簡潔で、信頼性が高く、且つ汎用性の高いアッセイの1つであり、CODHについて試験する(Seravalliら,Biochemistry 43:3944−3955(2004年))。M.サーモアセチカのCODHの比活性の典型的な活性は、55℃において500U又は25℃において約60Uである。このアッセイは、COの存在下におけるメチルビオローゲンの還元を利用する。これは密閉された嫌気的ガラス製キュベット内において578nmで測定される。
より詳細には、最初に脱イオン水で4回及びアセトンで1回キュベットを洗浄した後、ガラス製のゴム栓付きキュベットを準備した。少量の真空グリースをゴムガスケットの上に広げた。キュベットにCOガスを供給し、22Gaの針及び排気用針で10分間乾燥させた。体積0.98mLの反応バッファ(50mMのHepes、pH8.5、2mMのジチオスレイトール(DTT))を、排気用針とともに22Gaの針を使用して添加し、そして100%COを添加した。メチルビオローゲン(CH3ビオローゲン)原液は水中1Mであった。20mMの最終濃度で20マイクロリットルを各アッセイに使用した。メチルビオローゲンを加えたとき、ハミルトンシリンジの使用を容易にするためにジャケットとして18Gaの針(一部)を使用し、CH3ビオローゲンを引き出した。4〜5のアリコートを調製し、廃棄して洗浄し、ガスでシリンジを平衡化した。CH3ビオローゲン原液を作製するとき少量の亜ジチオン酸ナトリウム(0.1M原液)を添加して、CH3ビオローゲンをわずかに還元させた。温度は、加熱したOlis分光光度計(Bogart GA)内で55℃に平衡化した。ブランク反応(CH3ビオローゲン+バッファ)を最初に実施して、CH3ビオローゲン還元のベース速度を測定した。ACS90及びACS91(それぞれ最初のcooCを有する及び有しないM.サーモアセチカのCODH−ACSオペロン)の大腸菌細胞粗抽出物。10マイクロリットルの抽出物を一度に添加し、混合し、アッセイした。還元型CH3ビオローゲンは紫色になる。アッセイの結果を表Iに示す。
Mta98/Mta99は、M.サーモアセチカ由来のメタノールメチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現する大腸菌のMG1655株であり、したがって、M.サーモアセチカのCODHオペロンを含有するACS90 ACS91大腸菌株のネガティブコントロールである。
細胞タンパク質の約1%がCODHである場合、これらの数字は、純粋なM.サーモアセチカのCODHの500U/mg活性よりも約100倍低いことになる。ウエスタンブロットに基づく実際の推定値では細胞タンパク質の0.5%であり、したがって活性は、M.サーモアセチカのCODHの活性よりも約50倍低い。それにもかかわらず、この実験は、ネガティブコントロールにおいて、組換え大腸菌よりもはるかに少ないCO酸化活性を示す。ネガティブコントロールにおいてみられる少量のCO酸化(CH3ビオローゲンの還元)は、大腸菌のCH3ビオローゲンを還元する能力が限られている可能性があることを示す。
CODH及びMtrタンパク質の最終濃度を推定するために、CO酸化、ACS、メチルトランスフェラーゼ、及びコリノイドFe−Sアッセイにおいて使用したのと同じ細胞抽出物に対してSDS−PAGE、次にウエスタンブロット分析を実施した。使用した抗血清は、精製されたM.サーモアセチカのCODH−ACS及びMtrタンパク質に対するポリクローナル抗血清であり、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体を使用して可視化した。ウエスタンブロット分析を実施し、結果を図24に示す。ACS90及びACS91中のCODHの量は、対照レーンとの比較によって50ngであると推定された。2つのCODHサブユニット及びメチルトランスフェラーゼを含むCODH−ACSオペロン遺伝子の発現を、ウエスタンブロット分析によって確認した。したがって、組換え大腸菌細胞は、7つの遺伝子のオペロンの複数の構成要素を発現する。更に、メチルトランスフェラーゼ及びコリノイド鉄硫黄タンパク質の両方が同じ組換え大腸菌細胞中で活性を有していた。これらタンパク質は、同じ細胞にクローニングされた同じオペロンの一部である。
ポジティブコントロールとしてムーレラ・サーモアセチカ細胞の抽出物を使用して、CO酸化アッセイを繰り返した。大腸菌ACS90及びACS91中のCODH活性は測定可能であったが、M.サーモアセチカ対照よりも約130〜150倍低かった。アッセイの結果を図25に示す。簡潔に述べると、細胞(CODH/ACSオペロンを有するM.サーモアセチカ又は大腸菌、ACS90又はACS91又は空ベクター:pZA33S)を増殖させ、抽出物を上記の通り調製した。抽出物を調製した日の様々な時点で55℃において上記の通りアッセイを実施した。メチルビオローゲンの還元を120秒間にわたるタイムコースで578nmにおいて追跡した。
これらの結果は、CO酸化(CODH)アッセイ及び結果について記載する。メチルビオローゲン還元アッセイにより測定したとき、組換え大腸菌細胞はCO酸化活性を発現した。
実施例XII
大腸菌のCO耐性実験及びCO濃縮アッセイ(ミオグロビンアッセイ)
この実施例では、高濃度のCOに対する大腸菌の耐性について記載する。
飽和量のCOの存在下で大腸菌が嫌気的に増殖することができるかどうか試験するために、少体積の嫌気性微生物学において上記した通り、50mLのTerrificブロス培地(還元溶液、NiCl2、Fe(II)NH4SO4、シアノコバラミン、IPTG、及びクロラムフェニコールを加えた)を含む120mLの血清ボトル中に培養物を配置した。これらボトルのうちの半分は窒素ガスで30分間平衡化し、半分はCOガスで30分間平衡化した。空ベクター(pZA33)を対照として使用し、pZA33空ベクターを含有する培養物及びACS90とACS91との両方を含有する培養物をN2及びCOの両方で試験した。全てを接種し、37℃で振盪(250rpm)しながら36時間増殖させた。36時間の期間の最後に、フラスコの検査によって全てにおいて多量の増殖が示された。観察した増殖の大部分は一晩で長いラグを伴って生じた。
全ての培養物がCOの存在下で十分増殖したと考えられると仮定して、最終CO濃度を確認した。これは、COに曝露したときのミオグロビンのスペクトルシフトのアッセイを使用して実施された。亜ジチオン酸ナトリウムで還元されたミオグロビンの吸収ピークは435nmであり、COで還元されるとこのピークは423nmにシフトする。低波長のため及び300nm以降の全スペクトルを記録することが必要になるため、石英製キュベットを使用しなければならない。CO濃度は標準曲線に対して測定し、COの最大水溶解度に関するヘンリーの法則の定数=20℃及び1atmで970マイクロモルに依存する。
CO濃度のミオグロビン試験用に、キュベットを水で10回、アセトンで1回洗浄し、次いで、CODHアッセイと同様にストッパーで密閉した。N2をキュベットに約10分間吹き込んだ。体積1mLの嫌気性バッファ(HEPES、pH8.0、2mMのDTT)を、ハミルトンシリンジを用いてブランク(COで平衡化せず)に添加した。10マイクロリットルの体積のミオグロビン(約1mM、変動があり得、非常に多くの量がまさに必要となる)及び1マイクロリットルの亜ジチオン酸塩(20mM原液)を添加した。COの標準曲線は、1マイクロリットルずつ増加させながら添加したCO飽和バッファを使用して作製した。それぞれの増分に関してピーク高さ及びシフトを記録した。試験した培養物はpZA33/CO、ACS90/CO、及びACS91/COであった。これらのそれぞれを同じキュベットに1マイクロリットルずつ増加させながら添加した。実験の途中で、第2のキュベットをセットアップし使用した。結果を表IIに示す。
表IIに示す結果は、COの存在又は不在下のいずれにおいて株を培養したかとは無関係に培養物が増殖したことを示す。これら結果は、大腸菌が嫌気条件下でCOへの曝露に対して耐性であり得ること、及びCODH−ACSオペロンを発現する大腸菌細胞がいくらかのCOを代謝し得ることを示す。
これら結果は、大腸菌細胞が、CODH/ACSを発現しようとしまいと、飽和量のCOの存在下で増殖することができたことを実証する。更に、これらはCOの代わりに窒素中でも、対照と同程度に十分増殖した。この実験は、大腸菌の研究室株が、標準大気圧で実施した合成ガスプロジェクトにおいて到達可能な濃度のCOに対して非感受性であることを実証した。更に、予備実験は、CODH/ACSを発現する組換え大腸菌細胞が、おそらく二酸化炭素への酸化によって、いくらかのCOを実際に消費したことを示した。
実施例XIII
1,3−ブタジエン及び3−ブテン−1−オールを形成するための3−ヒドロキシ酸デカルボキシラーゼ酵素
3−ヒドロキシ酸デカルボキシラーゼ酵素は、3−ヒドロキシ酸のアルケン誘導体へのATP駆動脱炭酸を触媒する。イソブチレン、プロピレン及びエチレンの形成を触媒する3−ヒドロキシ酸デカルボキシラーゼ酵素が最近報告された(国際公開第2010/001078号、並びにGogerty及びBobik,Appl.Environ.Microbiol.,p.8004−8010,Vol.76,No.24(2010年))。本発明者らは、本明細書において、図16に示す3−ヒドロキシペンタ−4−エノエート(3HP4)の1,3−ブタジエンへの変換、及び図17に示す3,5−ジヒドロキシペンタン酸の3−ブテン−1−オールへの変換を触媒する類似の酵素の適用を提案する。3−ブテン−1−オール生成物は、次いで、化学的脱水を介して、又は3−ブテン−1−オールデヒドラターゼ酵素による生物学的脱水を介してブタジエンに変換することができる。
3−ヒドロキシペンタ−4−エノエートのブタジエンへの変換は、3−ヒドロキシペンタ−4−エノエートデカルボキシラーゼによって行われる。同様に、3,5−ジヒドロキシペンタン酸の3−ブテン−1−オールへの変換は、3,5−ジヒドロキシペンタン酸デカルボキシラーゼによって行われる。このような酵素は、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ又はジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ酵素に対する類似性を共有し得る。1つの可能な3−ヒドロキシペンタ−4−エノエートデカルボキシラーゼは、3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸(3−HMB)をイソブテンに変換することが示された出芽酵母のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ(ScMDD又はERG19)である(Gogerty及びBobik,2010,Appl.Environ.Microbiol.,p.8004−8010,Vol.76,No.24)。この酵素の2つの改善された変異体ScMDD1(I145F)及びScMDD2(R74H)は、野性型のHisタグ付酵素と比較して、19倍及び38倍の増加を実現することが実証された。ERG19及び更なる酵素候補を以下に提供する。
実施例XIV
3−ブテン−1−オールのブタジエンへの化学的脱水
アルコールは、適切な条件下で適切な脱水触媒を用いる反応によってオレフィンに変換することができる。ブタノール及びペンタノール等のアルコールをオレフィンに変換する典型的な脱水触媒としては、様々な酸で処理されたアルミナ及び未処理のアルミナ(例えば、γ−アルミナ)、並びにシリカ触媒、並びにゼオライト(例えば、β型ゼオライト触媒、ZSM−5又はY型ゼオライト、フッ素処理β−ゼオライト触媒、フッ素処理クレー触媒)を含むクレー、スルホン酸樹脂(例えば、Amberlyst(登録商標)15等のスルホン化スチレン樹脂)、リン酸及び硫酸等の強酸、三フッ化ホウ素及び三塩化アルミニウム等のルイス酸、並びに金属酸化物(例えば、酸化ジルコニウム又は二酸化チタン)及び金属塩化物を含む様々な種類の金属塩が挙げられる(例えば、Latshaw B E,Dehydration of Isobutanol to Isobutylene in a Slurry Reactor,Department of Energy Topical Report,1994年2月)。
脱水反応は、様々な反応器構成において不均質及び均質な触媒系の両方を用いて、気体及び液相の両方において行うことができる。典型的には、使用される触媒は、反応によって生成される水に対して安定である。水は、生成物とともに反応域から通常除去される。生じるアルケンは、(例えば、反応器の条件に依存して)気体中又は液相中のいずれかで反応器を出て、下流の精製プロセスにより捕捉されるか又は本明細書に記載する通り反応器内で他の化合物(ブタジエン又はイソプレン等)に更に変換される。脱水反応によって生成される水は、未反応のアルコール及びアルケン生成物とともに反応器を出て、蒸留又は相分離によって分離される。脱水工程で水が多量に生成されるので、使用される脱水触媒は一般に水に対して耐性であり、基質及び生成物から水を除去するプロセスは、脱水工程を含有する任意のプロセスの一部であってもよい。この理由のために、脱水反応の基質として湿潤アルコール(すなわち、約95重量%又は98重量%以下が水)を使用し、脱水反応によって生成された水とともにこの水を除去することが可能である(例えば、米国特許第4,698,452号及び同第4,873,392号に記載の通りゼオライト触媒を用いて)。更に、中性のアルミナ及びゼオライトは、アルコールをアルケンに脱水するが、一般的にこれら触媒の酸性型よりも高い温度及び圧力で行われる。
3−ブテン−1−オールのブタジエンへの脱水は、当技術分野において周知である(Gustav.Egloff及びGeorge.Hulla,Chem.Rev.,1945,36(1),pp 63−141)。例えば、3−ブテン−1−オールは、1,4−ブタンジオールの1,3−ブタジエンへの脱水における中間体として形成される(Satoら,Catalysis Communications,5(8),2004,p.397−400)。
実施例XV
2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、及び1,3−ブタジエンへの経路
この実施例は、2,4−ペンタジエノエート、3−ブテン−1−オール、及び1,3−ブタジエンへの経路について記載する。中間体3HP4、3,5−ジヒドロキシペンタン酸及び3−ブテン−1−オールへの新規経路を図18〜21に示す。3HP4への経路を、図18、19及び20(新規)に示す。3,5−ジヒドロキシペンタン酸及び3−ブテン−1−オールへの経路を、図19及び21(新規)に示す。ブタジエン前駆体2,4−ペンタジエノエートへの更なる経路を図19、20及び21(新規)に示す。
2,4−ペンタジエノエートへの幾つかの経路は、上記実施例に開示されている(例えば、図4、12、13、14及び15を参照されたい)。図18(新規)に示す通り、2,4−ペンタジエノエートの水和により3−ヒドロキシペンタ−4−エノエートが得られる。3−ヒドロキシペンタ−4−エノエートは、次いで、下記の通り3−ヒドロキシ酸デカルボキシラーゼによりブタジエンに脱炭酸され得る。
アクリリル−CoA及び3−HP−CoAから2,4−ペンタジエノエートへの更なる経路を図19に示す。また、3HP4、3−ブテン−1−オール及びブタジエンへの経路も示す。
アクリリル−CoAから3HP4への経路は:工程M/O/P、工程M/N/Tを含む。
3−HP−CoAから3HP4への経路は:工程A/L/O/P、工程A/L/N/Tを含む。
スクシニル−CoAから3HP4及び24PDへの経路を図20に示す。スクシニル−CoA及びアセチル−CoAは、まず、3−オキソアジピル−CoAチオラーゼによって結合されて、3−オキソアジピル−CoAを形成する(工程A)。1つの経路では、3−オキソアジピル−CoAの3−オキソ基が還元されて、3−ヒドロキシアジピル−CoAを形成する(工程G)。次いで、CoAヒドロラーゼ、シンテターゼ又はトランスフェラーゼによって、CoA部分が酸基に変換される。次いで、3−ヒドロキシアジピン酸が酸化されて、3−ヒドロキシヘキサ−4−エンジオエートを形成する(工程I)。次いで、この生成物が脱カルボキシルされて3HP4を形成する。別の経路では、工程Bにおいて、CoAトランスフェラーゼ、シンテターゼ又はヒドロラーゼによって、3−オキソアジピル−CoAが3−オキソアジピン酸に変換される。次いで、3−オキソアジピン酸が3−ヒドロキシアジピン酸に還元され(工程K)、これが、上記の通り3HP4に変換される。あるいは、3−オキソアジピン酸は、工程Cにおいて2−フマリル酢酸に変換される。次いで、2−フマリル酢酸の3−オキソ基が3−ヒドロキシヘキサ−4−エンジオエートに還元され、これが3HP4に脱カルボキシルされる。更に別の実施形態では、2−フマリル酢酸が脱炭酸されて3−オキソペンタ−4−エノエートを形成し(工程D)、これが、次いで、3HP4に還元される(工程E)。次いで、3HP4は、3HP4デカルボキシラーゼによって1段階でブタジエンに変換されるか(工程M)、又は2段階で2,4−ペンタジエンに脱水され、次いで、脱炭酸される(工程F、及びN)。
マロニル−CoA及びアセチル−CoAから3−ブテン−1−オール、ブタジエン及び2,4−ペンタジエノエートへの経路を図21に示す。これら経路では、マロニル−CoA及びアセチル−CoAがチオラーゼによって結合されて、3−オキソグルタリル−CoAを形成する。次いで、この中間体は、幾つかの異なる経路(工程B/C/D、工程B/G、工程H/I/J、工程H/L/D、K/J)によって3,5−ジヒドロキシペンタン酸に変換することができる。形成されると、3,5−ジヒドロキシペンタン酸は、3−ヒドロキシ酸デカルボキシラーゼによって脱炭酸されて、3−ブテン−1−オールを形成し得る(工程M)。次いで、3−ブテン−1−オールデヒドロゲナーゼ又は化学触媒による脱水により、ブタジエンが生じる(工程O)。あるいは、3,5−ジヒドロキシペンタン酸は、工程Eに示す通り、5−ヒドロキシペンタ−2−エノエートに脱水されてもよい。次いで、この中間体は、3−ブテン−1−オールに脱炭酸されてもよく(工程N)、又は更に2,4−ペンタジエノエートに脱水されてもよい(工程F)。
図18〜21に示す転換を触媒するための酵素をEC番号により分類し(表1)、更に以下に記載する。
図19〜21に示す幾つかの反応は、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素によって触媒される。これら反応としては、図19の工程B、I、N及びP、図20の工程E、G、K及びL、並びに図21の工程B、D、I、J及びLが挙げられる。
アルデヒドのアルコールへの還元を触媒する酵素(すなわち、アルコールデヒドロゲナーゼ、換言すればアルデヒドリダクターゼ)をコードする例示的な遺伝子としては、C2〜C14の中鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードするalrA(Taniら,Appl.Environ.Microbiol.66:5231−5235(2000年))、大腸菌由来のyqhD及びfucO(Sulzenbacherら,342:489−502(2004年))、ブチリルアルデヒドをブタノールに変換するC.アセトブチリカム由来のbdhI及びbdhII(Walterら,174:7149−7158(1992年))が挙げられる。YqhDは、補因子としてNADPHを使用して広範なアルデヒドの還元を触媒し、C(3)よりも長い鎖長を好む(Sulzenbacherら,342:489−502(2004年);Perezら,J Biol.Chem.283:7346−7353(2008年))。ザイモモナス・モビリスE由来のadhA遺伝子産物は、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド及びアクロレインを含む多くのアルデヒドに対する活性を有することが実証されている(Kinoshitaら,Appl Microbiol Biotechnol 22:249−254(1985年))。更なるアルデヒドリダクターゼ候補は、C.サッカロパーブチルアセトニカムにおけるbdh、並びにC.ベイジェリンキにおけるCbei_1722、Cbei_2181及びCbei_2421によってコードされる。出芽酵母における更なるアルデヒドリダクターゼ遺伝子候補としては、アルデヒドリダクターゼGRE3、ALD2−6及びHFD1、グリオキシル酸レダクターゼGOR1及びYPL113C、並びにグリセロールデヒドロゲナーゼGCY1が挙げられる(国際公開第2011/022651A1号;Atsumiら,Nature 451:86−89(2008年))。メチルグリオキサールのアセトール又はラクトアルデヒドへの還元を触媒するための既に記載されている酵素候補は、適切なラクトアルデヒドレダクターゼ酵素候補でもある。
4−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を示す酵素(EC1.1.1.61)もこのカテゴリに分類される。このような酵素は、ラルストニア・ユートロファ(Bravoら,J Forens Sci,49:379−387(2004年))、クロストリジウム・クルイベリ(Wolffら,Protein Expr.Purif.6:206−212(1995年))及びシロイヌナズナ(Breitkreuzら,J Biol Chem,278:41552−41556(2003年))において特性評価されている。シロイヌナズナ酵素は、酵母においてクローニングされ、特性評価された(Breitkreuzら,J.Biol.Chem.278:41552−41556(2003年))。更に別の遺伝子は、ゲオバチルス・サーモグルコシダシウス(Geobacillus thermoglucosidasius)由来のアルコールデヒドロゲナーゼadhIである(Jeonら,J Biotechnol 135:127−133(2008年))。
別の例示的なアルデヒドリダクターゼは、3−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.31)としても知られているメチルマロン酸セミアルデヒドレダクターゼである。この酵素は、バリン、ロイシン及びイソロイシン分解に関与し、細菌、真核生物及び哺乳類において同定されている。サーマス・サーモフィラスHB8由来のP84067によってコードされる酵素は、構造的に特性評価されている(Lokanathら,J Mol Biol,352:905−17(2005年))。ヒトの3−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼの可逆性は、アイソトープで標識された基質を使用して実証された(Manningら,Biochem J,231:481−4(1985年))。この酵素をコードする更なる遺伝子としては、ヒト(Hawesら,Methods Enzymol,324:218−228(2000年))及びウサギ(Oryctolagus cuniculus)(Hawesら,上記;Chowdhuryら,Biosci.Biotechnol Biochem.60:2043−2047(1996年))における3hindh、緑膿菌及びシュードモナス・プチダにおけるmmsB、並びにシュードモナス・プチダにおけるdhat(Aberhartら,J Chem.Soc.[Perkin1] 6:1404−1406(1979年);Chowdhuryら,Biosci.Biotechnol Biochem.60:2043−2047(1996年);Chowdhuryら,Biosci.Biotechnol Biochem.67:438−441(2003年))が挙げられる。緑膿菌由来のmmsB(Gokarnら,US Patent 739676,(2008年))及びシュードモナス・プチダ由来のmmsBを含む幾つかの3−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ酵素は、還元方向において特性評価されている。
ケトンをヒドロキシル官能基に還元する幾つかの例示的なアルコールデヒドロゲナーゼが存在する。大腸菌由来のこのような2つの酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(mdh)及び乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhA)によりコードされている。更に、ラルストニア・ユートロファに由来する乳酸デヒドロゲナーゼは、乳酸、2−オキソ酪酸、2−オキソペンタン酸及び2−オキソグルタル酸を含む様々な鎖長の2−ケト酸に対して高い活性を示すことが実証されている(Steinbuchelら,Eur.J.Biochem.130:329−334(1983年))。α−ケトアジピン酸のα−ヒドロキシアジピン酸への変換は、ラット及びヒトの胎盤にみられることが報告されている酵素である2−ケトアジピン酸レダクターゼにより触媒され得る(Sudaら,Arch.Biochem.Biophys.176:610−620(1976年);Sudaら,Biochem.Biophys.Res.Commun.77:586−591(1977年))。更なるオキシドレダクターゼは、既にクローニングされ、特性評価されている、ヒトの心臓由来のミトコンドリアの3−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ(bdh)である(Marksら,J.Biol.Chem.267:15459−15463(1992年))。C.ベエイジェリンキー(Ismaielら,J.Bacteriol.175:5097−5105(1993年))及びT.ブロッキイ(Lamedら,Biochem.J.195:183−190(1981年);Peretzら,Biochemistry 28:6549−6555(1989年))のアルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、アセトンをイソプロパノールに変換する。メチルエチルケトンレダクターゼは、MEKの2−ブタノールへの還元を触媒する。例示的なMEKレダクターゼ酵素は、ロドコッカス・ルーバー(Kosjekら,Biotechnol Bioeng.86:55−62(2004年))及びパイロコッカス・フリオサス(van derら,Eur.J.Biochem.268:3062−3068(2001年))において見出すことができる。
Matsuyamaら((1995年))によって記載されている通り、特にバチルス属、ブレビバクテリウム属、カンジダ属及びクレブシエラ属に属するものを含む多くの生物は、4−ヒドロキシ−2−ブタノンの1,3−ブタンジオールへの還元を触媒することができる。突然変異型のロドコッカス属のフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ(Sar268)及びレイフソニア属のアルコールデヒドロゲナーゼも、高収率でこの転換を触媒することが示されている(Itohら,Appl.Microbiol Biotechnol.75:1249−1256(2007年))。
また、3−オキソアシル−CoA基質を対応する3−ヒドロキシアシル−CoA生成物に還元するアルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、図19〜21に図示される経路に関連する。3−オキソアシル−CoAデヒドロゲナーゼ酵素(EC1.1.1.35)は、3−オキソアシル−CoA分子を3−ヒドロキシアシル−CoA分子に変換し、多くの場合、脂肪酸ベータ酸化又はフェニル酢酸異化作用に関与する。例えば、fadB及びfadJによりコードされている大腸菌における2つの脂肪酸酸化複合体のサブユニットは、3−ヒドロキシアシル−CoAデヒドロゲナーゼとして機能する(Binstockら,Methods Enzymol.71 Pt C:403−411(1981年))。フェニル酢酸分解オペロンにおける他の遺伝子に対する大腸菌のpaaHの近縁性(Nogalesら,153:357−365(2007年))及びpaaH突然変異体がフェニル酢酸上では増殖できないという事実(Ismailら,Eur.J Biochem.270:3047−3054(2003年))を考慮して、大腸菌のpaaH遺伝子も3−ヒドロキシアシル−CoAデヒドロゲナーゼをコードすると予測される。アセトアセチル−CoAレダクターゼは、クロストリジウム属の幾つかの種における酪酸へのアセチル−CoA発酵経路に関与し、詳細に研究されている(Jonesら,Microbiol Rev.50:484−524(1986年))。hbdによってコードされているクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素は、大腸菌でクローニングされ、機能的に発現している(Younglesonら,J Bacteriol.171:6800−6807(1989年))。アセトアセチル−CoAを3−ヒドロキシブチリル−CoAに還元することが実証されている更に他の遺伝子は、ズーグレア・ラミゲラ由来のphbB(Plouxら,Eur.J Biochem.174:177−182(1988年))及びロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)由来のphaB(Alberら,Mol.Microbiol 61:297−309(2006年))である。前者の遺伝子はNADPH依存性であり、そのヌクレオチド配列は決定されており(Peoplesら,Mol.Microbiol 3:349−357(1989年))、遺伝子は、大腸菌において発現している。前記遺伝子に対する基質特異性研究から、アセトアセチル−CoAに加えて基質として3−オキソプロピオニル−CoAも受容できるという結論が導かれた(Plouxら,Eur.J Biochem.174:177−182(1988年))。更なる遺伝子としては、パラコッカス・デニトリフィカンスにおけるphaB、クロストリジウム・クルイベリにおけるHbd1(C末端ドメイン)及びHbd2(N−末端ドメイン)(Hillmer及びGottschalk,Biochim.Biophys.Acta 3334:12−23(1974年))、並びにウシにおけるHSD17B10(Wakilら,J Biol.Chem.207:631−638(1954年))が挙げられる。パラコッカス・デニトリフィカンス由来の酵素は機能的に発現しており、大腸菌において特性評価されている(Yabutaniら,FEMS Microbiol Lett.133:85−90(1995年))。多くの類似する酵素が、クロストリジウム属の他の種及びメタッロスパエラ・セデュラで見出されている(Bergら,Science.318:1782−1786(2007年))。カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)由来の酵素は、ペルオキシゾームの脂肪酸ベータ酸化多機能酵素2型(MFE−2)の構成要素である。このタンパク質のデヒドロゲナーゼBドメインは、アセトアセチル−CoAに対して触媒的に活性を有する。前記ドメインは、大腸菌において機能的に発現しており、結晶構造が利用可能であり、触媒機構は十分に理解されている(Ylianttilaら,Biochem Biophys Res Commun 324:25−30(2004年);Ylianttilaら,J Mol Biol 358:1286−1295(2006年))。
二機能オキシドレダクターゼは、アシル−CoAを対応するアルコールに変換する。この活性を有する酵素は、3−ヒドロキシグルタリル−CoAの3,5−ジヒドロキシオキシペンタン酸(図21、工程G)への変換、及び3−オキソグルタリル−CoAの5−ヒドロキシ−3−オキソペンタン酸(図21、工程K)への変換に必要とされる。
アシル−CoAをアルコールに変換する例示的な二機能オキシドレダクターゼとしては、アセチル−CoA等の基質をエタノールに(例えば、大腸菌由来のadhE(Kesslerら,FEBS.Lett.281:59−63(1991年)))、及びブチリル−CoAをブタノールに(例えば、C.アセトブチリカム由来のadhE2(Fontaineら,J.Bacteriol.184:821−830(2002年)))に転換するものが挙げられる。bdhI及びbdhIIによってコードされるC.アセトブチリカム酵素(Walterら,J.Bacteriol.174:7149−7158(1992年))は、アセチル−CoA及びブチリル−CoAをエタノール及びブタノールにそれぞれ還元する。アセチル−CoAのエタノールへの還元に加えて、リゥコノストック・メゼンテロイデスにおけるadhEによってコードされる酵素は、分枝鎖化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリル−CoAに酸化することが示されている(Kazahayaら,J.Gen.Appl.Microbiol.18:43−55(1972年);Kooら,Biotechnol Lett,27:505−510(2005年))。別の例示的な酵素は、マロニル−CoAを3−HPに変換することができる。この活性を有するNADPH依存性酵素は、クロロフレクサス・アウランティアカス(Chloroflexus aurantiacus)において特性評価されており、そこでは3−ヒドロキシプロピオン酸回路に関与している(Huglerら,J Bacteriol,184:2404−2410(2002年);Straussら,Eur J Biochem,215:633−643(1993年))。300kDaの質量を有するこの酵素は、高度に基質特異的であり、他の公知オキシドレダクターゼに対して配列相同性をほとんど示さない(Huglerら,上記)。他の生物において、この特異的な反応を触媒することが示されている酵素は存在しないが;他の生物が類似する経路を有する可能性があるという生物情報学的証拠は存在する(Klattら,Env Microbiol,9:2067−2078(2007年))。配列相同性によって、ロセイフレキサス・カステンホルジイ(Roseiflexus castenholzii)、エリスロバクター属(Erythrobacter)の種NAP1及び海洋性ガンマプロテオバクテリアのHTCC2080を含む他の生物における酵素候補を推測することができる。
長鎖アシル−CoA分子は、アルコール形成脂肪酸アシル−CoAレダクターゼをコードするホホバ(Simmondsia chinensis)FAR等の酵素により、対応するアルコールに還元され得る。それが大腸菌において過剰発現することにより、FAR活性及び脂肪族アルコールの蓄積が生じた(Metzら,Plant Physiol,122:635−644(2000年))。
これら工程を触媒するための別の候補は、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−CoAレダクターゼ(すなわち、HMG−CoAレダクターゼ)である。この酵素は、自然界では、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−CoAにおけるCoA基をアルコール形成メバロン酸に還元する。3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−CoAレダクターゼをコードするスルホロブス・ソルファタリカスのhmgA遺伝子は、大腸菌においてクローニングされ、配列決定され、発現している(Bocharら,J Bacteriol.179:3632−3638(1997年))。また、出芽酵母は、その中に2つのHMG−CoAレダクターゼを有する(Bassonら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 83:5563−5567(1986年))。また、シロイヌナズナから遺伝子が単離され、出芽酵母におけるHMG−COAレダクターゼ活性を補足することが示されている(Learnedら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 86:2779−2783(1989年))。
1.2.1ファミリーにおけるアシル−CoAレダクターゼは、アシル−CoAを対応するアルデヒドに還元する。このような変換は、図21の工程C及びHにおいて必要とされる。幾つかのアシル−CoAデヒドロゲナーゼ酵素は、公開されている文献に記載されており、これら工程に対する適切な候補を表す。これらを以下に記載する。
例示的なアシル−CoAレダクターゼ酵素としては、脂肪酸アシル−CoAレダクターゼ、スクシニル−CoAレダクターゼ(EC1.2.1.76)、アセチル−CoAレダクターゼ及びブチリル−CoAレダクターゼが挙げられる。例示的な脂肪酸アシル−CoAレダクターゼ酵素は、アシネトバクター・カルコアセティカス(Reiser,Journal of Bacteriology 179:2969−2975(1997年))及びアシネトバクター属の種M−1(Ishigeら,Appl.Environ.Microbiol.68:1192−1195(2002年))のacr1によってコードされる。スクシニル−CoAレダクターゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム・クルイベリのsucD(Sohling,J.Bacteriol.178:871−880(1996年))及びP.ジンジバリスのsucD(Takahashi,J.Bacteriol 182:4704−4710(2000年))によってコードされる。更なるスクシニル−CoAレダクターゼ酵素は、メタッロスパエラ・セデュラ(Bergら,Science.318:1782−1786(2007年))及びサーモプロテウス・ニュートロフィラス(Ramos−Veraら,J Bacteriol.191:4286−4297(2009年))を含む好熱性古細菌の3−ヒドロキシプロピオン酸/4−ヒドロキシ酪酸回路に関与している。Msed_0709によってコードされているM.セデュラ酵素は、厳密にNADPH依存性であり、またマロニル−CoAレダクターゼ活性を有する。T.ニュートロフィラス酵素は、NADPH及びNADHの両方に対して活性を有する。bphGによってコードされるシュードモナス属の種におけるアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをアシル化する酵素は、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド及びホルムアルデヒドを酸化及びアシル化することが示されているので、また別のものである(Powlowski,J.Bacteriol.175:377−385(1993年))。アセチル−CoAのエタノールへの還元に加えて、リゥコノストック・メゼンテロイデスにおいてadhEによってコードされている酵素は、分枝鎖化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリル−CoAに酸化することが示されている(Kazahayaら,J.Gen.Appl.Microbiol.18:43−55(1972年);及びKooら,Biotechnol Lett,27:505−510(2005年))。ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム等の溶媒生成生物において、類似の反応、ブチリル−CoAのブチルアルデヒドへの変換を触媒する(Kosakaら,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58−68(2007年))。
アシル−CoAを対応するアルデヒドに変換する更なる酵素の種類は、マロニル−CoAをマロン酸セミアルデヒドに転換するマロニル−CoAレダクターゼである。マロニル−CoAレダクターゼは、好熱好酸性古細菌における3−ヒドロキシプロピオン酸回路を介する自己栄養性炭素固定において鍵となる酵素である(Berg,Science 318:1782−1786(2007年);及びThauer,Science 318:1732−1733(2007年))。この酵素は、補因子としてNADPHを利用し、メタッロスパエラ属及びスルホロブス属の種において特性評価されている(Alberら,J.Bacteriol.188:8551−8559(2006年);及びHugler,J.Bacteriol.184:2404−2410(2002年))。この酵素は、メタッロスパエラ・セデュラにおいてMsed_0709によってコードされている(Alberら,J.Bacteriol.188:8551−8559(2006年);及びBerg,Science 318:1782−1786(2007年))。スルホロブス・トコダイイ由来のマロニル−CoAレダクターゼをコードする遺伝子は、大腸菌でクローニングされ、異種発現した(Alberら,J.Bacteriol 188:8551−8559(2006年)。この酵素も、メチルマロニル−CoAの対応するアルデヒドへの変換を触媒することが示されている(国際公開第2007141208号(2007年))。これら酵素のアルデヒドデヒドロゲナーゼ機能は、クロロフレクサス・アウランティアカス由来の二機能デヒドロゲナーゼに類似しているが、配列相同性はほとんど存在しない。両方のマロニル−CoAレダクターゼ酵素の候補は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルチル−4−リン酸のアスパラギン酸セミアルデヒドへの還元と同時に脱リン酸化を触媒する酵素と高い配列相同性を有する。タンパク質に対する配列相同性により、スルホロブス・ソルファタリカス及びスルホロブス・アシドカルダリウスを含む他の生物で更なる遺伝子酵素を見出すことができ、それを以下に列挙する。CoAアシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼに関する更に別の候補は、クロストリジウム・ベエイジェリンキー由来のald遺伝子である(Toth,Appl.Environ.Microbiol.65:4973−4980(1999年)。この酵素は、アセチル−CoA及びブチリル−CoAを対応するアルデヒドに還元することが報告されている。この遺伝子は、ネズミチフス菌及び大腸菌のアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするeutEに非常に類似している(Toth,Appl.Environ.Microbiol.65:4973−4980(1999年)。
一部が可逆性である2−エノエートレダクターゼ酵素は、広範なα,β−不飽和カルボン酸及びアルデヒドのNAD(P)H依存性還元を触媒することが知られている(Rohdichら,276:5779−5787(2001年))。これら酵素は、図20の工程I及びCに図示される転換を実施するのに適切な候補を表す。幾つかの例を以下に提供する。
C.クルイベリの最近公開されたゲノム配列では、エノエートレダクターゼについて9つのコード配列が報告され、そのうちの1つが特性評価されている(Seedorfら,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 105:2128−2133(2008年))。C.チロブチリカム(C.tyrobutyricum)及びM.サーモアセチカム(M.thermoaceticum)の両方に由来するenr遺伝子は、クローニングされ、配列決定されており、互いに59%の同一性を示す。また、前者の遺伝子は、C.クライベリにおいて特性評価されている遺伝子に対して約75%の類似性を有することが見出されている(Gieselら,135:51−57(1983年))。これらの配列結果に基いて、enrが大腸菌におけるジエノイルCoAレダクターゼ(fadH)に非常に類似していることが報告されている(Rohdichら,J Biol.Chem.276:5779−5787(2001年))。また、C.サーモアセチカムのenr遺伝子は、大腸菌において触媒的活性型で発現している(Rohdichら,J Biol.Chem.276:5779−5787(2001年))。この酵素は、広範囲のα,β−不飽和カルボニル化合物に対する活性を示す。
別の候補である2−エノエートレダクターゼは、2−マレイル酢酸(4−オキソヘキサ−2−エンジオエート)の3−オキソアジピン酸への還元を触媒する酵素であるマレイル酢酸レダクターゼ(MAR、EC1.3.1.32)である。MAR酵素は、自然界では、芳香族分解経路に関与する(Kaschabekら,J Bacteriol.175:6075−6081(1993年);Kaschabekら,J Bacteriol.177:320−325(1995年);Camaraら,J Bacteriol.(2009年);Huangら,Appl Environ.Microbiol 72:7238−7245(2006年))。酵素活性は、シュードモナス属の種の株B13において同定され、特性評価されており(Kaschabekら,175:6075−6081(1993年);Kaschabekら,177:320−325(1995年))、それをコードしている遺伝子は、クローニングされ、配列決定された(Kasbergら,J Bacteriol.179:3801−3803(1997年))。更なるMAR遺伝子候補としては、シュードモナス属の種の株B13由来のclcE遺伝子(Kasbergら,J Bacteriol.179:3801−3803(1997年))、ロドコッカス・オーパカス(Rhodococcus opacus)由来のmacA遺伝子(Seibertら,180:3503−3508(1998年))、ラルストニア・ユートロファ(カプリアビダス・ネカトール(Cupriavidus necator)としても知られている)由来のmacA遺伝子(Seibertら,Microbiology 150:463−472(2004年))、ラルストニア・ユートロファ由来のtfdFII(Seibertら,J Bacteriol.175:6745−6754(1993年))、及びコリネバクテリウム・グルタミカムにおけるNCgl1112(Huangら,Appl Environ.Microbiol 72:7238−7245(2006年))が挙げられる。ccaDによってコードされるシュードモナス・レイネケイ(Pseudomonas reinekei)MT1におけるMARが最近同定された(Camaraら,J Bacteriol.(2009年))。
図19〜21の工程A及び図19の工程Mは、3−ヒドロキシプロピオニル−CoA、アクリリル−CoA、スクシニル−CoA又はマロニル−CoAのいずれかとアセチル−CoAとの縮合を必要とする。幾つかの −ケトチオラーゼ酵素は、公開されている文献に記載されており、これら工程に対する適切な候補を表す。これらを以下に記載する。
例えば、3−オキソアジピル−CoAチオラーゼは、前述の工程に適するβ−ケトチオラーゼ酵素の1種を表す。3−オキソアジピル−CoAチオラーゼ(EC2.3.1.174)は、自然界では、β−ケトアジピル−CoAをスクシニル−CoA及びアセチル−CoAに変換し、芳香族化合物を分解するためのβ−ケトアジピン酸経路の鍵となる酵素である。この酵素は、シュードモナス・プチダ(Harwoodら,J Bacteriol.176:6479−6488(1994年))及びアシネトバクター・カルコアセティカス(Dotenら,J Bacteriol.169:3168−3174(1987年))を含む土壌細菌及び真菌に広く存在する。シュードモナス属の株B13におけるpcaF(Kaschabekら,J Bacteriol.184:207−215(2002年))、シュードモナス・プチダUにおけるphaD(Oliveraら,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 95:6419−6424(1998年))、シュードモナス・フルオレッセンスSTにおけるpaaE(Diら,Arch.Microbiol 188:117−125(2007年))及び大腸菌由来のpaaJ(Nogalesら,Microbiology 153:357−365(2007年))によってコードされている遺伝子産物もこの転換を触媒する。幾つかのβ−ケトチオラーゼは、シュードモナス・プチダ由来のbkt、緑膿菌PAO1由来のpcaF及びbkt、バークホルデリア・アンビファリアAMMD由来のbkt、大腸菌由来のpaaJ、及びP.プチダ由来のphaDを含むオキソアジピル−CoA形成方向に著しく且つ選択的な活性を示す。
グルタリル−CoA及びアセチル−CoAは、縮合されて、オキソピメロイル−CoA:グルタリル−CoAアシルトランスフェラーゼ、β−ケトチオラーゼ(EC2.3.1.16)によって3−オキソピメロイル−CoAを形成する。この転換を触媒する酵素は、遺伝子bktB及びbktCによりコードされるラルストニア・ユートロファ(以前はアルカリゲネス・ユートロファとして知られていた)にみられる(Slaterら,J.Bacteriol.180:1979−1987(1998年);Haywoodら,52:91−96(1988年))。BktBタンパク質の配列は、公知であるが;BktCタンパク質の配列は報告されていない。また、ロドシュードモナス・パルストリスのpimオペロンは、pimBによってコードされているβ−ケトチオラーゼもコードし、ベンゾイル−CoA分解中に分解方向にこの転換を触媒すると予測される(Harrisonら,151:727−736(2005年))。S.アシジトロフィカスにおけるβ−ケトチオラーゼ酵素候補は、bktBに対する配列相同性により同定された(43%の同一性、e値=1e−93)。
また、アセチル−CoA及びプロピオニル−CoA由来のベータケト吉草酸の形成を触媒するβ−ケトチオラーゼ酵素は、3−ヒドロキシプロピオニル−CoA、アクリリル−CoA、スクシニル−CoA又はマロニル−CoAとアセチル−CoAとの縮合を触媒することができる。ズーグレア・ラミゲラは、プロピオニル−CoA及びアセチル−CoAから −ケトバレリル−CoAを形成することができる2つのケトチオラーゼを有し、R.ユートロファは、同じ転換を触媒することができる −酸化ケトチオラーゼを有する(Gruysら,米国特許第5,958,745号(1999年))。これら遺伝子又はそrれが翻訳されたタンパク質の配列は報告されていないが、R.ユートロファ由来のbktBに対する配列相同性に基いて、R.ユートロファ、Z.ラミゲラ、又は他の生物における幾つかの候補を同定することができる。これらは、以下を含む:
更なる候補としては、2分子のアセチル−CoAをアセトアセチル−CoAに変換することが知られているβ−ケトチオラーゼ(EC2.1.3.9)が挙げられる。例示的なアセトアセチル−CoAチオラーゼ酵素としては、大腸菌由来のatoB(Martinら,Nat.Biotechnol 21:796−802(2003年))、C.アセトブチリカム由来のthlA及びthlB(Hanaiら,Appl Environ Microbiol 73:7814−7818(2007年);Winzerら,J.Mol.Microbiol Biotechnol 2:531−541(2000年))、出芽酵母由来のERG10(Hiserら,J.Biol.Chem.269:31383−31389(1994年))の遺伝子産物が挙げられる。
2.8.3ファミリーにおける酵素は、ある分子から別の分子へのCoA部分の可逆的転移を触媒する。このような転換は、図19の工程F、O、G、T、H及びE、並びに図20の工程B及びHによって必要とされる。幾つかのCoAトランスフェラーゼ酵素は、公開されている文献に記載されており、これら工程に対する適切な候補を表す。これらを以下に記載する。
多くのトランスフェラーゼが広い特異性を有し、したがって、特に、酢酸、コハク酸、プロピオン酸、酪酸、2−アセト酢酸メチル、3−ケトヘキサン酸、3−ケトペンタン酸、吉草酸、クロトン酸、3−メルカプトプロピオン酸、プロピオン酸、酢酸ビニル及び酪酸もの多様なCoAアクセプターを利用することができる。例えば、ロゼブリア属の種A2−183由来の酵素は、ブチリル−CoA:酢酸:CoAトランスフェラーゼ及びプロピオニル−CoA:酢酸:CoAトランスフェラーゼ活性を有することが示された(Charrierら,Microbiology 152,179−185(2006年))。近縁なホモログは、例えばロゼブリア・インテスティナリス(Roseburia intestinalis)L1−82、ロゼブリア・イヌリニボランスDSM16841、ユーバクテリウム・レクタレ(Eubacterium rectale)ATCC 33656において見出すことができる。プロピオニル−CoAトランスフェラーゼ活性を有する別の酵素は、クロストリジウム・プロピオニクム(Clostridium propionicum)において見出すことができる(Selmerら,Eur J Biochem 269,372−380(2002年))。この酵素は、CoAアクセプターとして酢酸、(R)−乳酸、(S)−乳酸、アクリレート、及び酪酸を用いることができる(Selmerら,Eur J Biochem 269,372−380(2002年);Schweiger及びBuckel,FEBS Letters,171(1)79−84(1984年))。近いホモログは、例えば、ノーヴィ菌(Clostridium novyi)NT、クロストリジウム・ベエイジェリンキーNCIMB8052及びクロストリジウム・ボツリナムC株エークルンド(Eklund)において見出すことができる。YgfHは、大腸菌においてプロピオニルCoAコハク酸CoAトランスフェラーゼをコードする(Hallerら,Biochemistry,39(16)4622−4629)。近いホモログは、例えば、シトロバクター・ヤンガエATCC29220、サルモネラ・エンテリカ亜種アリゾナエ血清型、及びエルシニア・インターメディアATCC29909で見出すことができる。これらのタンパク質は、以下の通り同定される:
更なる候補酵素は、シュードモナス属におけるpcaI及びpcaJによってコードされている2ユニットの酵素であり、これは、3−オキソアジピル−CoA/コハク酸トランスフェラーゼ活性を有することが示されている(Kaschabekら,上記)。相同性に基いて類似する酵素は、アシネトバクター属の種ADP1(Kowalchukら,Gene 146:23−30(1994年))及びストレプトミセス・セリカラーに存在する。更なる例示的なスクシニル−CoA:3:オキソ酸−CoAトランスフェラーゼは、ヘリコバクター・ピロリ(Corthesy−Theulazら,J.Biol.Chem.272:25659−25667(1997年))及び枯草菌(Stolsら,Protein.Expr.Purif.53:396−403(2007年))に存在する。これらのタンパク質は、以下の通り同定される:
CoAアクセプターとして酢酸を利用することができるCoAトランスフェラーゼは、大腸菌atoA(アルファサブユニット)及びatoD(ベータサブユニット)遺伝子によってコードされるアセトアセチル−CoAトランスフェラーゼである(Vanderwinkelら,Biochem.Biophys.Res Commun.33:902−908(1968年);Korolevら,Acta Crystallogr.D Biol Crystallogr.58:2116−2121(2002年))。この酵素もイソ酪酸(Matthiesら,Appl Environ Microbiol 58:1435−1439(1992年))、吉草酸(Vanderwinkelら,上記)及びブタン酸(Vanderwinkelら,上記)を含む様々な分岐鎖及び直鎖のアシル−CoA基質から酢酸にCoA部分を転移することが示されている。類似する酵素は、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032(Duncanら,Appl Environ Microbiol 68:5186−5190(2002年))、クロストリジウム・アセトブチリカム(Caryら,Appl Environ Microbiol 56:1576−1583(1990年))及びクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム(Kosakaら,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58−68(2007年))に存在する。これらのタンパク質は、以下の通り同定される:
更なる例示的なトランスフェラーゼ候補は、それぞれスクシニル−CoA、4−ヒドロキシブチリル−CoA及びブチリル−CoAトランスフェラーゼ活性を示すことが示されているクロストリジウム・クルイベリのcat1、cat2及びcat3の遺伝子産物により触媒される(Seedorfら,上記;Sohlingら,Eur.J Biochem.212:121−127(1993年);Sohlingら,J Bacteriol.178:871−880(1996年))。また、同様のCoAトランスフェラーゼ活性は、膣トリコモナス(van Grinsvenら,J.Biol.Chem.283:1411−1418(2008年))及びトリパノソーマ・ブルセイ(Riviereら,J.Biol.Chem.279:45337−45346(2004年))にも存在する。これらタンパク質は、以下の通り同定される:
嫌気性細菌アシドアミノコックス・ファーメンタンス由来のグルタコネート−CoAトランスフェラーゼ(EC2.8.3.12)酵素は、二酸グルタコニル−CoA及び3−ブテノイル−CoAと反応する(Mackら,FEBS Lett.405:209−212(1997年))。この酵素をコードする遺伝子は、gctA及びgctBである。この酵素は、グルタリル−CoA、2−ヒドロキシグルタリル−CoA、アジピル−CoA及びアクリリル−CoAを含む他のCoA誘導体に対して、低いが検出可能な活性を示す(Buckelら,Eur.J Biochem.118:315−321(1981年))。この酵素は、大腸菌でクローニングされ、発現している(Mackら,Eur.J.Biochem.226:41−51(1994年))。これらタンパク質は、以下の通り同定される:
3.1.2ファミリーにおける酵素は、アシル−CoA分子を対応する酸に加水分解する。このような転換は、図19の工程F、O、G、T、H及びE、並びに図20の工程B及びHによって必要とされる。幾つかのこのような酵素は、公開されている文献に記載されており、これら工程に対する適切な候補を表す。
例えば、ラットの脳に由来するacot12によってコードされる酵素(Robinsonら,Biochem.Biophys.Res.Commun.71:959−965(1976年))は、ブチリル−CoA、ヘキサノイル−CoA及びマロニル−CoAと反応することができる。acot8によってコードされているヒトのジカルボン酸チオエステラーゼは、グルタリル−CoA、アジピル−CoA、スベリル−CoA、セバシル−CoA及びドデカンジオイル−CoAに対する活性を示す(Westinら,J.Biol.Chem.280:38125−38132(2005年))。また、この酵素に最も近い大腸菌ホモログtesBも、様々なCoAチオールエステルを加水分解することができる(Naggertら,J Biol Chem 266:11044−11050(1991年))。類似の酵素が、ラットの肝臓において特性評価されている(Deana R.,Biochem Int 26:767−773(1992年))。大腸菌においてヒドロラーゼ活性を有する更なる酵素としては、ybgC、paaI及びybdBが挙げられる(Kuznetsovaら,FEMS Microbiol Rev,2005年,29(2):263−279;Songら,J Biol Chem,2006年,281(16):11028−38)。その配列は報告されていないが、エンドウの葉のミトコンドリア由来の酵素は、広い基質特異性を有し、アセチル−CoA、プロピオニル−CoA、ブチリル−CoA、パルミトイル−CoA、オレオイル−CoA、スクシニル−CoA及びクロトニル−CoAに対する活性が実証されている(Zeiherら,Plant.Physiol.94:20−27(1990年))。出芽酵母由来のアセチル−CoAヒドロラーゼであるACH1は、別の候補ヒドロラーゼを表す(Buuら,J.Biol.Chem.278:17203−17209(2003年))。
更に別の候補ヒドロラーゼは、アシドアミノコックス・ファーメンタンス由来のグルタコネートCoAトランスフェラーゼである。この酵素は、部位特異的変異誘発によって、グルタリル−CoA、アセチル−CoA及び3−ブテノイル−CoAに対する活性を有するアシル−CoAヒドロラーゼに転換された(Mackら,FEBS.Lett.405:209−212(1997年))。これは、スクシニル−CoA:3−ケト酸−CoAトランスフェラーゼ及びアセトアセチル−CoA:アセチル−CoAトランスフェラーゼをコードする酵素もこの反応工程に対する候補として機能する可能性があるが、その機能を変化させる特定の突然変異を必要とすることを示唆する。
更なるヒドロラーゼ酵素としては、バリン分解中の3−ヒドロキシイソブチリル−CoAの3−ヒドロキシイソ酪酸への変換を効率的に触媒すると記載されている3−ヒドロキシイソブチリル−CoAヒドロラーゼが挙げられる(Shimomuraら,J Biol Chem.269:14248−14253(1994年))。この酵素をコードする遺伝子としては、ラット(Shimomuraら,Methods Enzymol.324:229−240(2000年))及びヒト(Shimomuraら,上記)のhibchが挙げられる。また、配列相同性によって、出芽酵母のhibch及びセレウス菌のBC_2292を含む類似の遺伝子候補を同定することができる。
ECクラス4.1.1におけるデカルボキシラーゼ酵素は、図19の工程U、Y、V及びX、図20の工程D、J、M及びN、並びに図21の工程M、N及びPを触媒するために必要とされる。候補デカルボキシラーゼ酵素は、本願に既に記載されている。
二重結合の水和は、4.2.1酵素ファミリーにおけるヒドラターゼ酵素によって触媒することができる。二重結合を形成するための水の除去は、4.2.1酵素ファミリーにおけるデヒドラターゼ酵素によって触媒される。ヒドラターゼ酵素は、時に可逆的であり、また脱水も触媒する。デヒドラターゼ酵素は、時に可逆的であり、また水和も触媒する。水の付加又は所与の基質からの除去は、図19における工程S、K、L、R、D、C、J、Q及びW、図20における工程F、並びに図21における工程E、F及びOによって必要とされる。幾つかのヒドラターゼ及びデヒドラターゼ酵素は、公開されている文献に記載されており、これら工程に対する適切な候補を表す。
例えば、多くのデヒドラターゼ酵素が、電子求引性のカルボニル、カルボン酸又はCoAチオールエステル基によるアルファ水素の活性化、並びにベータ位からのヒドロキシル基の除去を含む水のα,β−脱離を触媒する(Buckelら,J Bacteriol,117:1248−60(1974);Martinsら,PNAS 101:15645−9(2004))。例示的な酵素としては、2−(ヒドロキシメチル)グルタル酸デヒドラターゼ(EC4.2.1.−)、フマラーゼ(EC4.2.1.2)、3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ(EC4.2.1.10)、シクロヘキサノンヒドラターゼ(EC4.2.1.−)及び2−ケト−4−ペンテン酸デヒドラターゼ(EC4.2.1.80)、シトラマル酸ヒドロリアーゼ及びジメチルマレイン酸ヒドラターゼが挙げられる。
2−(ヒドロキシメチル)グルタル酸デヒドロゲナーゼは、2−(ヒドロキシメチル)グルタル酸を2−メチレン−グルタル酸に脱水する[4Fe−4S]含有酵素であり、ユーバクテリウム・バーケリ(旧クロストリジウム・バルケリ(Clostridium barkeri))におけるニコチン酸異化作用における役割について研究されている(Alhapelら,Proc Natl Acad Sci 103:12341−6(2006年))。高い配列相同性を有する類似の酵素は、バクテロイデス・カピローサス(Bacteroides capillosus)、アナエロツルンカス・コリホミニス(Anaerotruncus colihominis)及びナトラネロビウス・サーモフィラス(Natranaerobius thermophilius)でみられる。これら酵素は、[4Fe−4S]含有細菌のセリンデヒドラターゼ(例えばtdcG、sdhB及びsdaAによってコードされる大腸菌酵素)のアルファサブユニット及びベータサブユニットに対して相同である。E.バーケリにおいて類似の機能を有する酵素は、ジメチルマレイン酸を水和して(2R,3S)−2,3−ジメチルリンゴ酸を形成するアコニターゼファミリーにおける可逆的なFe2+依存性且つ酸素感受性酵素であるジメチルマレイン酸ヒドラターゼである。この酵素は、dmdABによってコードされる(Alhapelら,Proc Natl Acad Sci U S A 103:12341−6(2006年);Kollmann−Kochら,Hoppe Seylers.Z.Physiol Chem.365:847−857(1984年))。
フマル酸ヒドラターゼ(EC4.2.1.2)酵素は、自然界では、フマル酸のリンゴ酸への可逆的な水和を触媒する。基質としての3−オキソブタノールと反応するフマル酸ヒドラターゼの能力は、文献には記載されていないが、この酵素に関する豊富な構造情報が利用可能であり、また、他の研究者が、活性、阻害及び局在を変化させるための酵素の改変に成功している(Weaver,61:1395−1401(2005年))。大腸菌は、3つのフマラーゼ:増殖条件により調節されるFumA、FumB及びFumCを有する。FumBは、酸素感受性であり、嫌気条件下でのみ活性を有する。FumAは、微小嫌気条件下で活性を有し、FumCは、好気増殖において活性を有する唯一の酵素である(Tsengら,J Bacteriol,183:461−467(2001年);Woodsら,954:14−26(1988年);Guestら,J Gen Microbiol 131:2971−2984(1985年))。更なる酵素候補は、カンピロバクター・ジェジュニ(Smithら,Int.J Biochem.Cell Biol 31:961−975(1999年))、サーマス・サーモフィラス(Mizobataら,Arch.Biochem.Biophys.355:49−55(1998年))及びラット(Kobayashiら,J.Biochem,89:1923−1931(1981年))でみられる。高い配列相同性を有する類似の酵素としては、シロイヌナズナ由来のfum1及びコリネバクテリウム・グルタミカム由来のfumCが挙げられる。ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム由来のMmcBCフマラーゼは、2つのサブユニットを有する別のクラスのフマラーゼである(Shimoyamaら,270:207−21 3(2007年))。
4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸の2−オキソペンテン酸への脱水は、4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸ヒドラターゼ(EC4.2.1.80)によって触媒される。この酵素は芳香族分解経路に関与し、典型的に、4−ヒドロキシ−2−オキソ吉草酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子と共転写される。例示的な遺伝子産物は、大腸菌のmhpD(Ferrandezら,J Bacteriol.179:2573−2581(1997年);Pollardら,Eur J Biochem.251:98−106(1998年))、シュードモナス・プチダのtodG及びcmtF(Lauら,Gene 146:7−13(1994年);Eaton,J Bacteriol.178:1351−1362(1996年))、コマモナス属の種CNB−1のcnbE(Maら,Appl Environ Microbiol 73:4477−4483(2007年))、及びバークホルデリア・キセノボランスのmhpD(Wangら,FEBS J 272:966−974(2005年))によってコードされる。緊密に関連する酵素である2−オキソヘプタ−4−エン−1,7−ジオエートヒドラターゼは、4−ヒドロキシフェニル酢酸分解に関与し、そこで補因子としてマグネシウムを使用して、2−オキソ−ヘプタ−4−エン−1,7−ジオエート(OHED)を2−オキソ−4−ヒドロキシ−ヘプタ−1,7−ジオエートに変換する(Burksら,J.Am.Chem.Soc.120:(1998年))。OHEDヒドラターゼ酵素の候補は、大腸菌C(Roperら,Gene 156:47−51(1995年);Izumiら,J Mol.Biol.370:899−911(2007年))及び大腸菌W(Prietoら,J Bacteriol.178:111−120(1996年))で同定され、特性評価されている。配列比較により、広範囲の細菌、植物、及び動物におけるホモログが明らかになっている。中でも、非常に類似する配列を有する酵素は、肺炎杆菌(91%の同一性、e値=2e−138)及びサルモネラ・エンテリカ(91%の同一性、e値=4e−138)に含有されている。
別の酵素候補は、自然界では2−メチルリンゴ酸をメサコン酸に脱水する酵素であるシトラマル酸ヒドロリアーゼ(EC4.2.1.34)である。この酵素は、広い基質特異性を有することが示されているメタノカルドコッカス・ジャナスキイの2−オキソブタン酸へのピルビン酸経路において研究されている(Drevlandら,J Bacteriol.189:4391−4400(2007年))。この酵素活性は、破傷風様菌、モルガネラ・モルガニー、シトロバクター・アマロナティカスでも検出され、これらではグルタミン酸分解に関与していると考えられる(Katoら,Arch.Microbiol 168:457−463(1997年))。メタノカルドコッカス・ジャナスキイのタンパク質配列は、これらの生物における遺伝子に対してそれほど高い相同性を有する訳ではない。
ジメチルマレイン酸ヒドラターゼ(EC4.2.1.85)は、ジメチルマレイン酸を水和して(2R,3S)−2,3−ジメチルリンゴ酸を形成するアコニターゼファミリーにおける可逆的なFe2+依存性且つ酸素感受性酵素である。この酵素は、ユーバクテリウム・バーケリにおけるdmdABによってコードされている(Alhapelら,上記;Kollmann−Kochら,Hoppe Seylers.Z.Physiol Chem.365:847−857(1984年))。
オレイン酸ヒドラターゼは、国際公開第2011076691号に提案されているような更なる適切な候補を表す。これらは、図19の工程W及び図21の工程Oに特に有用である。例としては、以下のタンパク質が挙げられる。
エノイル−CoAヒドラターゼ(EC4.2.1.17)は、様々な3−ヒドロキシアセチル−CoA基質の脱水を触媒する(Robertsら,Arch.Microbiol 117:99−108(1978年);Agnihotriら,Bioorg.Med.Chem.11:9−20(2003年);Conradら,J Bacteriol.118:103−111(1974年))。echによってコードされるシュードモナス・プチダのエノイル−CoAヒドラターゼは、3−ヒドロキシブチリル−CoAのクロトニル−CoAへの変換を触媒する(Robertsら,Arch.Microbiol 117:99−108(1978年))。この転換は、クロストリジウム・アセトブチリカムのcrt遺伝子産物、C.クライベリのcrt1遺伝子産物、及び他のクロストリジウム属の生物によっても触媒される(Atsumiら,Metab Eng 10:305−311(2008年);Boyntonら,J Bacteriol.178:3015−3024(1996年);Hillmerら,FEBS Lett.21:351−354(1972年))。更なるエノイル−CoAヒドラターゼ候補は、P.プチダのphaA及びphaB、並びにP.フルオレッセンス由来のpaaA及びpaaBである(Oliveraら,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 95:6419−6424(1998年))。ロドシュードモナス・パルストリスにおけるpimFの遺伝子産物は、ピメロイル−CoA分解に関与するエノイル−CoAヒドラターゼをコードすると予測される(Harrisonら,Microbiology 151:727−736(2005年))。最後に、maoC(Parkら,J Bacteriol.185:5391−5397(2003年))、paaF(Ismailら,Eur.J Biochem.270:3047−3054(2003年);Parkら,Appl.Biochem.Biotechnol 113−116:335−346(2004年);Parkら,Biotechnol Bioeng 86:681−686(2004年))及びpaaG(Ismailら,Eur.J Biochem.270:3047−3054(2003年);Park及びLee,Appl.Biochem.Biotechnol 113−116:335−346(2004年);Park及びYup,Biotechnol Bioeng 86:681−686(2004年))を含む多くの大腸菌遺伝子は、エノイル−CoAヒドラターゼ機能を示すことが示されている。
あるいは、fadA及びfadBの大腸菌遺伝子産物は、エノイル−CoAヒドラターゼ活性を示す脂肪酸酸化に関与する多酵素複合体をコードする(Yangら,Biochemistry 30:6788−6795(1991年);Yang,J Bacteriol.173:7405−7406(1991年);Nakahigashiら,Nucleic Acids Res.18:4937(1990年))。fadRによってコードされるネガティブレギュレーターのノックアウトを利用して、fadB遺伝子産物を活性化することができる(Satoら,J Biosci.Bioeng 103:38−44(2007年))。fadI及びfadJの遺伝子は類似する機能をコードし、自然界では嫌気条件下で発現する(Campbellら,Mol.Microbiol 47:793−805(2003年))。
アシル−CoA基質のその酸生成物への変換は、一部が可逆性である6.2.1酵素ファミリーにおけるCoA酸−チオールリガーゼ又はCoAシンテターゼによって触媒され得る。図19〜20に示す幾つかの反応は、酸−チオールリガーゼ酵素によって触媒される。これら反応としては、図19の工程F、O、G、T、H及びE、並びに図20の工程B及びHが挙げられる。CoA酸−チオールリガーゼ又はCoAシンテターゼ活性を触媒する幾つかの酵素は、文献に記載されており、これらの工程に対する適切な候補を表す。
例えば、ADP形成アセチル−CoAシンテターゼ(ACD、EC6.2.1.13)は、ATPを合成すると同時に、アシル−CoAエステルを対応する酸に変換する酵素である。AF1211によってコードされているアーケオグロブス・フルギダス由来のADC Iは、イソ酪酸、イソペンタン酸及びフマル酸を含む様々な直鎖及び分岐鎖の基質に対して作用することが示された(Musfeldtら,J Bacteriol.184:636−644(2002年))。AF1983によってコードされているアーケオグロブス・フルギダスにおける第2の可逆的なACDも、環状化合物フェニル酢酸及びインドール酢酸に対する活性が高く、広い基質範囲を有することが示された(Musfeldt及びSchonheit,J Bacteriol.184:636−644(2002年))。(スクシニル−CoAシンテターゼであるとアノテーションされた)ハロアーキュラ・マリスモルツイ由来の酵素は、基質としてプロピオン酸、酪酸及び分枝鎖酸(イソ吉草酸及びイソ酪酸)を受容し、順方向及び逆方向に作用することが示された(Brasenら,Arch.Microbiol 182:277−287(2004年))。超好熱性古細菌であるピロバキュラム・アエロフィラム由来のPAE3250によってコードされているACDは、全ての特性評価されているACDのうち最も広い基質範囲を示し、アセチル−CoA、イソブチリル−CoA(好ましい基質)、及びフェニルアセチル−CoAと反応する(Brasenら,上記)。指向進化又は工学的技術を用いて、ホスト生物の生理学的温度で作用するようにこの酵素を改変することができる。A.フルギダス、H.マリスモルツイ及びP.アエロフィラム由来の酵素は全て、大腸菌でクローニングされ、機能的に発現し、特性評価されている(Brasen及びSchonheit,上記;Musfeldt及びSchonheit,J Bacteriol.184:636−644(2002年))。更なる候補は、大腸菌のsucCD、並びに出芽酵母のLSC1及びLSC2遺伝子によってコードされるスクシニル−CoAシンテターゼである。これら酵素は、自然界では、インビボにおいて可逆的である反応において、1つのATPを消費すると同時にコハク酸からスクシニル−CoAへの形成を触媒する(Buckら,Biochemistry 24:6245−6252(1985年))。シュードモナス・プチダ由来のアシル−CoAリガーゼは、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、及びオクタン酸を含む幾つかの脂肪族基質、並びにフェニル酢酸及びフェノキシ酢酸等の芳香族化合物に対して作用することが実証されている(Fernandez−Valverdeら,Appl.Environ.Microbiol.59:1149−1154(1993年))。関連する酵素であるリゾビウム・レグミノサルム由来のマロニル−CoAシンテターゼ(6.3.4.9)は、幾つかの二酸、すなわち、エチル−、プロピル−、アリル−、イソプロピル−、ジメチル−、シクロプロピル−、シクロプロピルメチレン−、シクロブチル―、及びベンジル−マロネートをこれらの対応するモノチオエステルに変換することができる(Pohlら,J.Am.Chem.Soc.123:5822−5823(2001年))。
これら工程の別の候補酵素は、ピメロイル−CoAリガーゼ(EC6.2.1.14)としても知られている6−カルボキシヘキサン酸−CoAリガーゼであり、これは、自然界では、グラム陽性菌におけるビオチン生合成中にピメリン酸をピメロイル−CoAに活性化する。大腸菌にクローニングされているクローンシュードモナス・メンドシナ(Pseudomonas mendocina)由来の酵素は、代替基質ヘキサンジオエート及びノナンジオエートを受容することが示された(Biniedaら,Biochem.J 340(Pt3):793−801(1999年))。他の候補は、枯草菌(Bowerら,J Bacteriol.178:4122−4130(1996年))及びリシニバチルス・スパエリクス(旧バチルス・スパエリクス(Bacillus sphaericus))(Plouxら,Biochem.J 287(Pt3):685−690(1992年))でみられる。
更なるCoAリガーゼとしては、配列が未だ特性評価されていないラットのジカルボン酸−CoA(Vamecqら,Biochem.J 230:683−693(1985年))、P.クリソゲナム由来の2つの特性評価されているフェニル酢酸−CoAリガーゼのいずれか(Lamas−Maceirasら,Biochem.J 395:147−155(2006年);Wangら,360:453−458(2007年))、シュードモナス・プチダ由来のフェニル酢酸−CoAリガーゼ(Martinez−Blancoら,J Biol Chem 265:7084−7090(1990年))、及び枯草菌由来の6−カルボキシヘキサン酸−CoAリガーゼ(Bowerら.J Bacteriol 178(14):4122−4130(1996年))が挙げられる。マウス(Hasegawaら,Biochim Biophys Acta 1779:414−419(2008年))及びヒト(Ohgamiら,Biochem.Pharmacol.65:989−994(2003年))由来のアセトアセチル−CoAシンテターゼは、自然界では、アセト酢酸のアセトアセチル−CoAへのATP依存性変換を触媒する。
他のクラスにおける酵素のように、ECクラス6.2.1における特定の酵素は広い基質特異性を有することが見出されている。シュードモナス・プチダ由来のアシル−CoAリガーゼは、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、及びオクタン酸を含む幾つかの脂肪族基質、並びにフェニル酢酸及びフェノキシ酢酸等の芳香族化合物に対して作用することが実証されている(Fernandez−Valverdeら,Applied and Environmental Microbiology 59:1149−1154(1993年))。関連する酵素であるリゾビウム・トリフォリイ(Rhizobium trifolii)由来のマロニル−CoAシンテターゼ(6.3.4.9)は、幾つかの二酸、すなわち、エチル−、プロピル−、アリル−、イソプロピル−、ジメチル−、シクロプロピル−、シクロプロピルメチレン−、シクロブチル―、及びベンジル−マロネートをこれらの対応するモノチオエステルに変換することができる(Pohlら,J.Am.Chem.Soc.123:5822−5823(2001年))。
本願全体にわたって、様々な刊行物を参照してきた。GenBank及びGI番号の公開を含むこれら刊行物の開示は、本発明が関係する当技術分野の現況をより完全に記載するために、参照することにより全文が本願に組み込まれる。上に提供した実施例を参照して本発明について説明してきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく様々な変更を行うことができることを理解すべきである。