JP2013535191A - 抗ｉｌ−２３ヘテロ二量体特異的抗体 - Google Patents

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Abstract

本開示は、抗体の抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインは、ＩＬ−２３には特異的に結合するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合しない、単離されたまたは組み換えＩＬ−２３結合タンパク質を提供する。本開示はまたＩＬ−２３結合タンパク質の使用も提供する。

Description

本開示は、インターロイキン（ＩＬ）−２３に特異的に結合するタンパク質およびそれらの使用に関する。
インターロイキン（ＩＬ）−２３は、インターロイキン−６ヘリカルサイトカインファミリーのメンバーの計算的に導出されたプロファイルで、配列データベースを検索することによって発見された。この検索は、ＩＬ−１２ｐ３５サブユニットと相同であるＩＬ−２３ｐ１９（ｐ１９）と命名された、新しいサイトカインサブユニットの発見につながった。このＩＬ−１２ｐ３５サブユニットは、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットと二量体化して、ＩＬ−１２を形成する。ＩＬ−１２ｐ４０を伴うｐ１９の発現は、ＩＬ−２３と呼ばれるヘテロ二量体タンパク質の分泌につながった。
ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットは、Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３と標識された３つのドメインを有する。各ドメインは、βシート構造であり、Ｄ２ドメインはＣ１７７鎖間ジスルフィド結合を含む。Ｄ２上にはＮ連結型グリコシル化部位もある。
ｐ１９サブユニットは、４つのヘリックスバンドルを含むという点で、ＩＬ−１２ｐ３５に似ている。しかしながら、ＩＬ−１２ｐ３５と比較してＩＬ−２３ｐ１９における短縮したヘリカル長さ、ならびに「チルト」および「ロール」は、変化した足跡をもたらす。ＩＬ−２３ｐ１９は、ＩＬ−１２ｐ３５と比較すると、ＩＬ−１２ｐ４０と相互作用する様式も異なる。
その標的細胞型に対するＩＬ−２３の特異的効果は、ＩＬ−１２Ｒβ１およびＩＬ−２３Ｒを含むＩＬ−２３Ｒ複合体によって媒介される。ＩＬ−２３へのＩＬ−１２Ｒβ１の結合は、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットを介して媒介される。
ＩＬ−２３のＩＬ−２３ｐ１９は、ＩＬ−２３Ｒへの結合の原因となり、それによって、ＩＬ−２３Ｒ複合体に対するＩＬ−２３の選択性を与えている。
ＩＬ−２３は、活性化ヒトマクロファージならびに樹状細胞によって分泌される。ＩＬ−２３は、大部分が記憶Ｔ細胞に作用し、ネズミ脾細胞がＩＬ−２３に応答してＩＬ−１７を分泌する能力において実証されるように、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆの調節を通して自己免疫疾患を促進するとされている。ヒトにおいてはＩＬ−２３／ＩＬ−１７経路が存在し、ＩＬ−２３は、ＩＬ−１７とともに、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αの良好な誘導物であることが示されており、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αの全ては炎症誘発性サイトカインである。インビトロで、ＩＬ−６およびＴＧＦ−β１は、ナイーブＴ細胞のＴＨ１７Ｔ細胞経路への発達を促進する。これらの細胞は、ＩＬ−２１の分泌を介したオートクリン様式で、さらに駆動される。ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１βは、細胞をこのＴＨ１７応答において維持すると考えられる。
ＩＬ−１２およびＩＬ−２３は、どちらも共通のサブユニットを含有するので、疾病状態を、いずれか１つのインターロイキンの過剰産生だけに帰することは困難であった。しかしながら、研究は、ＩＬ−２３の調節不全が、いくつかある自己免疫疾患の中で、乾癬、クローン病、および多発性硬化症に関連付けられていることを示している。
ＩＬ−２３が種々の病態に関与していることを考慮すると、このサイトカインに特異的な拮抗薬が望ましい。しかしながら、ＩＬ−２３のどちらのサブユニットも他の二量体サイトカインと共有されているので、このサイトカインを特異的に標的にすることが困難であることが分かっている。例えば、米国特許第ＵＳ７１９６１７２号で説明されているように、でＩＬ−１２ｐ４０サブユニットは、ＩＬ−１２の構成要素でもあり、ＩＬ−２３ｐ１９は、ｚｃｙｔｏ３３ｆ２等のヘテロ二量体サイトカインの構成要素でもある。
本発明者らは、ＩＬ−２３には特異的に結合するが、ＩＬ−２３の一部ではない（例えば、単離したＩＬ−１２ｐ４０もしくはＩＬ−２３ｐ１９）とき、または別のサイトカインの一部（例えば、どちらもＩＬ１２ｐ４０を含むＩＬ−１２、またはＩＬ−２３ｐ１９を含むｚｃｙｔｏ３３ｆ２）であるときに、その構成部分の（ＩＬ−１２ｐ４０もしくはＩＬ−２３ｐ１９）いずれにも特異的に結合しない、タンパク質を産生した。そのようなタンパク質は、ＩＬ−１２ｐ４０またはＩＬ−２３ｐ１９サブユニットを共有するサイトカインの活性を阻害する望ましくない効果を引き起こす可能性が低く、したがって、治療の際に「オフターゲット」効果を有する可能性が低い。さらに、そのようなタンパク質は、例えば診断／予後において、ＩＬ−２３を検出するための特定の試験の基準を提供する。
本開示は、抗体の抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインは、ＩＬ−２３には特異的に結合するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合しない、単離されたまたは組み換えＩＬ−２３結合タンパク質を提供する。
当業者は、上述のことから、抗原結合ドメインのＩＬ−２３結合タンパク質への包含が、タンパク質も、ＩＬ−２３には特異的に結合するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合しないことを意味することを理解するであろう。
一実施例において、抗原結合ドメインは、ＩＬ−２３のヘテロ二量体界面に特異的に結合する。
本開示は、加えて、または代替として、抗体の抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインは、ＩＬ−２３のヘテロ二量体界面には特異的に結合するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合しない、単離されたまたは組み換えＩＬ−２３結合タンパク質を提供する。
本開示は、加えて、または代替として、抗体の抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインは、
（ｉ）ＩＬ−２３には特異的に結合するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合せず、
（ｉｉ）中の水素が重水素と交換されたＩＬ−２３に結合し、
（ｉｉｉ）中の水素が重水素と交換されたＩＬ−２３への結合時に、配列番号２の残基１１２〜１４４を含む領域における重水素の水素への交換を低減する、
単離されたまたは組み換えＩＬ−２３結合タンパク質を提供する。
一実施例において、交換の減少は、統計的に有意である。
一実施例において、交換の減少は、交換前および交換後のＩＬ−２３の領域の重水素含量のパーセント変化を判定し、最小のパーセント変化を有する領域（例えば、試験した領域の５０％が最小のパーセント変化を伴う）の平均変化よりも標準偏差が２倍、２．５倍、または３倍大きい変化を有する領域を決定することによって計算される。
一実施例において、抗原結合ドメインは、配列番号２の残基９１〜１４４を含む領域、または配列番号２の残基９１〜１０９および１１２〜１４４を含む領域における交換を低減する。
一実施例において、抗原結合ドメインは、配列番号１の残基１３５〜１５３を含む領域における交換をさらに低減する。この実施例に従って、本開示は、加えて、または代替として、抗体の抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインは、
（ｉ）ＩＬ−２３には特異的に結合するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合せず、
（ｉｉ）中の水素が重水素と交換されたＩＬ−２３に結合し、
（ｉｉｉ）中の水素が重水素と交換されたＩＬ−２３への結合時に、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットの領域、およびＩＬ−２３ｐ１９の領域における重水素の水素への交換を低減する、
単離されたまたは組み換えＩＬ−２３結合タンパク質を提供する。
一実施例において、ＩＬ−２３結合タンパク質は、ＩＬ−２３に特異的に結合するが、単離されたＩＬ−１２ｐ４０サブユニットには有意に結合せず、また単離されたＩＬ−２３ｐ１９サブユニットには有意に結合しない。
一実施例において、単離されたＩＬ−１２ｐ４０サブユニットは、付加的な配列、例えばＦＬＡＧタグまたは抗体のＦｃ領域を含む。例えば、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットは、配列番号１７に記載の配列を含むＦＬＡＧタグに融合した、または抗体のＦｃ領域に融合した、配列番号１に記載の配列を含み、該Ｆｃ領域は、配列番号１６に記載の配列を含む。
一実施例において、単離されたＩＬ−２３ｐ１９サブユニットは、付加的な配列、例えばＦＬＡＧタグまたは抗体のＦｃ領域を含む。例えば、ＩＬ−２３ｐ１９サブユニットは、配列番号１７に記載の配列を含むＦＬＡＧタグに融合した、または抗体のＦｃ領域に融合した、配列番号２に記載の配列を含み、該Ｆｃ領域は、配列番号１６に記載の配列を含む。
一実施例において、ＩＬ−２３結合タンパク質は、ＩＬ−２３に特異的に結合し、ＩＬ−２３のＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットは、付加的な配列、例えば上記で説明したように、ＦＬＡＧタグまたは抗体のＦｃ領域を含む。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、１ｎＭ以下（７５０ｐＭ以下等、例えば５００ｐＭ以下）のＩＣ５０で、ＩＬ−２３のＩＬ−２３受容体（ＩＬ−２３Ｒ）への結合を低減する。一実施例において、ＩＬ−２３結合タンパク質のＩＣ５０は、４００ｐＭ以下である。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、１００ｎＭ〜１ｎＭ（１５０ｐＭ〜７５０ｐＭ等、例えば、１５０ｐＭ〜５００ｐＭ）のＩＣ５０で、ＩＬ−２３のＩＬ−２３Ｒへの結合を低減する。一実施例において、ＩＬ−２３結合タンパク質のＩＣ５０は、１６０ｐＭ〜４００ｐＭである。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、１ｎＭ以下（例えば、７５０ｐＭ以下、例えば、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下等）のＥＣ５０で、ＩＬ−２３のＩＬ−２３Ｒへの結合を低減する。一実施例において、ＥＣ５０は、約３００ｐＭ以下である。例えば、ＥＣ５０は、約２６０ｐＭである。
ＩＬ−２３のＩＬ−２３Ｒへの結合を判定するための方法は、当業者には明らかにであろう。例えば、１つの方法では、単離されたまたは組み換えＩＬ−２３Ｒ、もしくは細胞発現ＩＬ−２３Ｒが固定化される。標識したＩＬ−２３が、次いで、ＩＬ−２３のＩＬ−２３Ｒへの結合を減少すると思われる試験タンパク質の存在下または非存在下で、固定化した受容体または細胞と接触され、および結合標識の量が検出される。ＩＬ−２３結合タンパク質の非存在下と比較したときの、ＩＬ−２３結合タンパク質の存在下で結合した標識の量の減少は、タンパク質がＩＬ−２３のＩＬ−２３Ｒへの結合を低減または防止することを示す。複数の濃度のＩＬ−２３結合タンパク質を試験することによって、ＩＣ５０および／またはＥＣ５０が決定される。
別の実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、脾細胞によるＩＬ−２３誘発性のＩＬ−１７分泌を低減する。１つの方法では、培養した脾細胞（例えば、マウス脾細胞）を、ＩＬ−２３結合タンパク質の存在下または非存在下でＩＬ−２３と接触させる。ＩＬ−１７の分泌が起こる十分な時間の後、例えば酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＩＬ−１７のレベルを検出する。タンパク質の非存在下と比較して、タンパク質の存在下でのサイトカインのレベルがより低いことは、タンパク質がＩＬ−２３の活性を中和することを示す。複数の濃度のタンパク質を試験することによって、ＩＣ５０またはＥＣ５０が決定される。
一実施例において、ＩＣ５０は、１μＭ以下（例えば、８００μＭ以下、例えば、７５０μＭ以下、５００μＭ以下等）である。
一実施例において、ＩＣ５０は、約１ｎＭ以下（例えば、８００ｐＭ以下）である。例えば、ＩＣ５０は、７００ｐＭ以下である。一実施例において、ＩＣ５０は、約１ｐＭ〜８００ｐＭ（例えば、約１００ｐＭ〜７００ｐＭ、例えば、約１２０ｐＭ〜６８０ｐＭ）である。
一実施例において、ＥＣ５０は、１μＭ以下（例えば、８００μＭ以下、例えば、７５０μＭ以下、５００μＭ以下等）である。
一実施例において、ＥＣ５０は、１ｎＭ以下（例えば、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下等）である。一実施例において、ＥＣ５０は、約３００ｐＭ以下である。例えば、ＥＣ５０は、約２９０ｐＭである。
一実施例において、ＩＬ−２３結合タンパク質は、ＩＬ−２３に特異的に結合し、抗体のＩＬ−２３への結合を競合的に阻害することができ、該抗体は、
（ｉ）配列番号７に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号１２に記載の配列を含むＶＬ、または
（ｉｉ）配列番号４９に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号５０に記載の配列を含むＶＬ、
のうちのいずれか１つを含む。
抗体のＩＬ−２３への結合の競合的な阻害を判定するための方法は、本明細書で説明されており、本開示のこの実施例に準用されるものと解釈されたい。
例えば、ＩＬ−２３結合タンパク質は、
（ｉ）配列番号７に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号１２に記載の配列を含むＶＬ、または
（ｉｉ）配列番号４９に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号５０に記載の配列を含むＶＬ、
のうちのいずれか１つを含む抗体によって結合されるエピトープと同じ、またはそれと重複するエピトープに結合する。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質の抗原結合ドメインは、ＩＬ−２３の構成要素であるときに、ＩＬ−２３のＩＬ−２３ｐ１９サブユニットに特異的に結合する。例えば、抗原結合ドメインは、ＩＬ−２３の構成要素が配列番号２のアミノ酸１１２〜１４４を含む領域にあるときに、ＩＬ−２３のＩＬ−２３ｐ１９に特異的に結合する。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質の抗原結合ドメインは、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがどちらもＩＬ−２３の構成要素であるときには、それらに特異的に結合する。例えば、抗原結合ドメインは、約５０オングストロームの原子間距離（４０オングストローム以内の原子間距離等、例えば、３０オングストローム以内の原子間距離）以内の原子を含む、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットの領域と結合する。一実施例において、領域内の原子は、約２５オングストロームの原子間距離以内である。例えば、抗原結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸１１２〜１４４を含む領域においてＩＬ−２３ｐ１９サブユニットに結合し、配列番号１のアミノ酸１３５〜１５３を含む領域においてＩＬ−１２ｐ４０サブユニットに結合する。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、少なくとも約１×１０−２（少なくとも約９×１０−３、例えば、少なくとも約８×１０−３、例えば、少なくとも約７×１０−３）の解離定数（ｋｄ）でＩＬ−２３に結合する。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、少なくとも約１×１０４（少なくとも約５×１０４等、例えば、少なくとも約１×１０５）の会合定数（ｋａ）でＩＬ−２３に結合する。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、少なくとも約１×１０−７（例えば、少なくとも５×１０−８、少なくとも約１×１０−８等）の平衡定数（ＫＤ）でＩＬ−２３に結合する。一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、約１×１０−７〜約１×１０−９（例えば、約１×１０−７〜約１×１０−９）の平衡定数（ＫＤ）を伴うＩＬ−２３に結合する。
本開示は、加えて、または代替として、配列番号２１〜５０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列もしくはそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列、または配列番号５７〜７７のいずれか１つに記載の配列もしくはそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含む核酸によって、もしくは中程度から高度の緊縮状態の下でそれにハイブリッド形成される核酸によってコードしたアミノ酸配列を含む、抗体の抗原結合ドメインを含み、単離されたまたは組み換えＩＬ−２３結合タンパク質を提供する。
本開示は、配列番号２６〜２９、４９、５０のいずれか１つ、配列番号２０もしくは３０〜３３のいずれか１つのアミノ酸１〜１２０、配列番号４５もしくは４６のアミノ酸１〜１１３に記載のアミノ酸配列、もしくはそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列、または配列番号６、１１、５７〜６０、７２、７３、７６、もしくは７７のいずれか１つに記載の配列もしくはそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含む核酸によって、または中程度から高度の緊縮状態の下でハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、抗体の抗原結合ドメインを含み、単離されたまたは組み換えＩＬ−２３結合タンパク質を提供する。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質の抗原結合ドメインは、配列番号７、１２、２６、２７、２８、２９、４９、または５０のいずれか１つに記載の配列を含む、可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む。ＣＤＲを判定するための例示的な番号付けスキームは、当技術分野で知られており、それらのシステムのいずれをも使用して、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質のＣＤＲを決定することができる。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、Ｋａｂａｔ付番方式に従って定義され、配列番号１０、配列番号１５、配列番号５３、または配列番号５６に記載の配列を含む、ＣＤＲ３を含む。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式に従って定義され、「ＣＤＲ３」と標識された配列を含み、また、図７Ａ〜７Ｆのいずれか１つにおいて太文字で示される、ＣＤＲ３を含む。
本開示のいくつかの実施例において、抗原結合ドメインは、配列番号２６、２７、２８、２９、４９、または５０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む可変領域の３つのＣＤＲを含む、抗体可変領域である。
例えば、抗原結合ドメインは、配列番号２６、２７、２８、２９、または４９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含む、ＶＨである。一実施例において、ＶＨは、配列番号７に記載の配列を含む可変領域の３つのＣＤＲを含む。一実施例において、ＶＨは、配列番号３３に記載の配列を含む可変領域の３つのＣＤＲを含む。一実施例において、ＶＨは、配列番号４９に記載の配列を含む可変領域の３つのＣＤＲを含む。一実施例において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番方式に従って定義される。例えば、ＩＬ−２３結合タンパク質は、以下のＣＤＲを含む、ＶＨを含む：
（ｉ）配列番号８もしくは５１に記載のアミノ酸配列（または図７Ａ、７Ｂ、もしくは７ＥでＣＤＲ１と標識され、下線を引いた配列）を含む、ＣＤＲ１、
（ｉｉ）随意に、配列番号９、２２、２４、もしくは５２に記載のアミノ酸配列（または図７Ａ、７Ｂ、もしくは７ＥでＣＤＲ２と標識され、下線を引いた配列）を含み、任意で、ＣＤＲ２アミノ酸配列の５つのＣ末端アミノ酸のいずれか１つ以上が、任意の他の天然に存在するアミノ酸と置換される、ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号１０または５３に記載のアミノ酸配列（または図７Ａ、７Ｂ、もしく７ＥでＣＤＲ３と標識され、下線を引いた配列）を含む、ＣＤＲ３。
さらなる実施例では、ＣＤＲは、拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式に従って定義される。例えば、ＶＨは、以下のＣＤＲを含む：
（ｉ）図７Ａ、７Ｂ、もしくは７ＥでＣＤＲ１と標識され、太文字で示されるアミノ酸配列を含む、または配列番号２３もしくは２５に記載のアミノ酸を含む、ＣＤＲ１、
（ｉｉ）図７Ａ、７Ｂ、もしくは７ＥでＣＤＲ２と標識され、太文字で示されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）図７Ａ、７Ｂ、もしくは７ＥでＣＤＲ３と標識され、太文字で示されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ３。
別の実施例において、抗原結合ドメインは、配列番号２７、２９、または５０うちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含む、ＶＬである。一実施例において、ＶＬは、配列番号１２に記載の配列を含む可変領域の３つのＣＤＲを含む。一実施例において、ＶＬは、配列番号５０に記載の配列を含む可変領域の３つのＣＤＲを含む。
一実施例において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番方式に従って定義される。例えば、ＩＬ−２３結合タンパク質は、以下のＣＤＲを含む、ＶＬを含む：
（ｉ）配列番号１３もしくは５４に記載のアミノ酸配列（または図７Ｃ、７Ｄ、もしくは７ＦでＣＤＲ１と標識され、下線を引いた配列）を含む、ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１４もしくは５５に記載のアミノ酸配列（または図７Ｃ、７Ｄ、もしくは７ＦでＣＤＲ２と標識され、下線を引いた配列）を含む、ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号１５もしくは５６に記載のアミノ酸配列（または図７Ｃ、７Ｄ、もしくは７ＦでＣＤＲ３と標識され、下線を引いた配列）を含む、ＣＤＲ３。
さらなる実施例では、ＣＤＲは、拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式に従って定義される。例えば、ＶＬは、以下のＣＤＲを含む：
（ｉ）図７Ｃ、７Ｄ、もしくは７ＦでＣＤＲ１と標識され、太文字で示される、ＣＤＲ１、
（ｉｉ）図７ＢでＣＤＲ２と標識され、太文字で示される、ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）図７ＢでＣＤＲ３と標識され、太文字で示される、ＣＤＲ３。
一実施例において、抗原結合ドメインは、例えば、上記で説明したような、それぞれが３つのＣＤＲを含む、ＶＨおよびＶＬを含む。
一実施例において、抗原結合ドメインは、以下の可変領域対のうちの１つの、６つのＣＤＲを含む
（ｉ）配列番号２６に記載の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号２７に記載の配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｉ）配列番号２８に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号２９に記載の配列を含むＶＬ、または
（ｉｉｉ）配列番号４９に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号５０に記載の配列を含むＶＬ。
例えば、抗原結合ドメインは、以下を含む：
（ｉ）配列番号８もしくは５１に記載の配列（または図７Ａ、７Ｂ、もしくは７ＥでＣＤＲ１と標識され、下線を引いた配列）を含む、重鎖ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）配列番号９、２２、もしくは５２に記載の配列（または図７Ａ、７Ｂ、もしくは７ＥでＣＤＲ２と標識され、下線を引いた配列）を含み、任意でＣＤＲ２アミノ酸配列の５つのＣ末端アミノ酸のいずれかの１つ以上が、任意の他の天然に存在するアミノ酸で置換される、重鎖ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１０もしくは５３に記載の配列（または図７Ａ、７Ｂ、もしくは７ＥでＣＤＲ３と標識され、下線を引いた配列）を含む、重鎖ＣＤＲ３と、
（ｉｖ）配列番号１３もしくは５４に記載の配列（または図７Ｃ、７Ｄ、もしくは７ＦでＣＤＲ１と標識され、下線を引いた配列）を含む、軽鎖ＣＤＲ１と、
（ｖ）配列番号１４もしくは５５に記載の配列（または図７Ｃ、７Ｄ、もしくは７ＦでＣＤＲ２と標識され、下線を引いた配列）を含む、軽鎖ＣＤＲ２と、
（ｖｉ）配列番号１５もしくは５６に記載の配列（または図７Ｃ、７Ｄ、もしくは７ＦでＣＤＲ３と標識され、下線を引いた配列）を含む、軽鎖ＣＤＲ３。
本開示の例示的なＩＬ−２３結合タンパク質は、配列番号２６、２８、または４９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、抗原結合ドメインを含む。例えば、ＶＨは、配列番号７、配列番号４９、配列番号３０〜４４のいずれか１つのアミノ酸１〜１２０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または前述の配列のいずれか１つに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含む。一実施例において、ＶＨは、配列番号７、配列番号４９、または配列番号３０〜３３のアミノ酸１〜１２０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。
別の実施例において、ＶＨは、配列番号６、１９、５７〜７１、もしくは７６のいずれか１つに記載の配列を含む核酸によって、それに対して少なくとも約８０％の同一性である配列を含む核酸によって、または中程度から高度のハイブリッド形成条件下でそれらにハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む。別の実施例において、ＶＨは、配列番号６、１９、５７〜６０、もしくは７６のいずれか１つに記載の配列を含む核酸によって、それに対して少なくとも約８０％の同一性である配列を含む核酸によって、または中程度から高度のハイブリッド形成条件下でそれらにハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む。
一実施例において、ＶＨは、配列番号２８に記載の配列を含む。一実施例において、ＶＨは、配列番号３０のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含む。一実施例において、ＶＨは、配列番号３１のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含む。一実施例において、ＶＨは、配列番号３２のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含む。一実施例において、ＶＨは、配列番号３３のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含む。
一実施例において、ＶＨは、配列番号４９に記載の配列を含む。
一実施例において、ＶＨは、配列番号７に記載の配列、またはそのヒト化、脱免疫化、または合成ヒト化形態を含む。
本開示の例示的なＩＬ−２３結合タンパク質は、配列番号２７、２９、または５０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、抗原結合ドメインを含む。例えば、ＶＬは、配列番号１２、配列番号５０、もしくは配列番号４５〜４８のいずれか１つのアミノ酸１〜１１３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または前述の配列のいずれか１つに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含む。例えば、ＶＬは、配列番号１２、配列番号５０、配列番号４５もしくは４６のアミノ酸１〜１１３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または前述の配列のいずれか１つに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含む。
別の実施例において、ＶＬは、配列番号１１、１８、７２〜７５、もしくは７７のいずれか１つに記載の配列を含む核酸によって、それに対して少なくとも約８０％同一である配列を含む核酸によって、または中程度から高度のハイブリッド形成条件下でそれらにハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む。例えば、ＶＬは、配列番号１１、１８、７２、７３、もしくは７７のいずれか１つに記載の配列を含む核酸によって、それに対して少なくとも約８０％同一である配列を含む核酸によって、または中程度から高度のハイブリッド形成条件下でそれらにハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む。
一実施例において、ＶＬは、配列番号２９に記載の配列を含む。例えば、ＶＬは、配列番号４５に記載の配列を含む。例えば、ＶＬは、配列番号４６に記載の配列を含む。
一実施例において、ＶＬは、配列番号５０に記載の配列を含む。
一実施例において、ＶＬは、配列番号１１に記載の配列、またはそのヒト化、脱免疫化、合成ヒト化形態を含む。
例示的なＩＬ−２３結合タンパク質は、ＶＨおよびＶＬを含み、ＶＨおよびＶＬは、結合して、抗原結合ドメインを含むＦｖを形成する。
例示的なＩＬ−２３結合タンパク質は、
（ｉ）配列番号２６に記載の配列を含む可変領域のＣＤＲ１、２、および３を含むＶＨ、ならびに配列番号２７に記載の配列を含む可変領域のＣＤＲ１、２、および３を含むＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２８に記載の配列を含む可変領域のＣＤＲ１、２、および３を含むＶＨ、ならびに配列番号２９に記載の配列を含む可変領域のＣＤＲ１、２、および３を含むＶＬ、または
（ｉｉｉ）配列番号４９に記載の配列を含む可変領域のＣＤＲ１、２、および３を含むＶＨ、ならびに配列番号５０に記載の配列を含む可変領域のＣＤＲ１、２、および３を含むＶＬ、
を含む。
Ｋａｂａｔ付番方式または拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式に従って定義されるこれらの配列におけるＣＤＲは、本明細書で説明されており、本開示の本実施例に準用されるものと解釈されたい。
本開示の１つの例示的な形態において、ＩＬ−２３結合タンパク質は、
（ｉ）配列番号８に記載の配列を有するＣＤＲ１、配列番号９または２２に記載の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１０に記載の配列を有するＣＤＲ３を含む、ＶＨと、
（ｉｉ）配列番号１３に記載の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１４に記載の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１５に記載の配列を有するＣＤＲ３を含む、ＶＬと、
を含む。
本開示の別の例示的な形態において、ＩＬ−２３結合タンパク質は、
（ｉ）配列番号５１に記載の配列を有するＣＤＲ１、配列番号５２に記載の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号５３に記載の配列を有するＣＤＲ３を含む、ＶＨと、
（ｉｉ）配列番号５４に記載の配列を有するＣＤＲ１、配列番号５５に記載の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号５６に記載の配列を有するＣＤＲ３を含む、ＶＬと、
を含む。
いくつかのＩＬ−２３結合タンパク質において、ＶＨおよびＶＬは、単一のポリペプチド鎖中にある。そのようなＩＬ−２３結合タンパク質の例示的な形態は、
（ｉ）単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ジｓｃＦｖ）、または
（ｉｉｉ）定常領域、Ｆｃ、または重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２および／もしくはＣＨ３に連結された（ｉ）および／または（ｉｉ）のうちの少なくとも１つ、
を含む。
他の例示的なＩＬ−２３結合タンパク質は、別々のポリペプチド鎖中にあるＶＬおよびＶＨを含む。そのようなＩＬ−２３結合タンパク質の例示的な形態は、
（ｉ）ダイアボディ、
（ｉｉ）トリアボディ、
（ｉｉｉ）テトラボディ、
（ｉｖ）Ｆａｂ、
（ｖ）Ｆ（ａｂ’）２、
（ｖｉ）Ｆｖ、または
（ｉｖ）定常領域、Ｆｃ、または重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２および／もしくはＣＨ３に連結された（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちの１つ、
を含む。
本開示のＩＬ−２３結合タンパク質の実施例は、抗体である。
本開示のいくつかの例示的なＩＬ−２３結合タンパク質は、キメラ、脱免疫化、ＣＤＲグラフト、ヒト化、霊長類化、合成ヒト化、またはヒトタンパク質である。
一実施例において、本開示は、抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインは、ＩＬ−２３には特異的に結合するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合せず、配列番号２６、２８、もしくは４９に記載の配列を含むＶＨ、および／または配列番号２７、２９、もしくは５０のいずれか１つに記載の配列を含むＶＬを含む、抗体を提供する。例えば、抗体は、
（ｉ）配列番号７、配列番号４９、配列番号３０〜４４のいずれか１つのアミノ酸１〜１２０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または前述の配列のいずれか１つに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含む、ＶＨ、または
（ｉｉ） 配列番号１２、配列番号５０、配列番号４５〜４８のいずれか１つのアミノ酸１〜１１３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または前述の配列のいずれか１つに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含む、ＶＬ、
を含む。
一実施例において、本開示は、抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインは、ＩＬ−２３には特異的に結合するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合せず、
（ｉ）配列番号２６に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号２７に記載の配列を含むＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２８に記載の配列含むＶＨ、および配列番号２９に記載の配列を含むＶＬ、または
（ｉｉｉ）配列番号４９に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号５０に記載の配列を含むＶＬ、
を含む、抗体を提供する。
一実施例において、本開示は、抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインは、ＩＬ−２３には特異的に結合するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合せず、配列番号２８に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号２９に記載の配列を構成含むＶＬを含む、ヒト化抗体を提供する。
一実施例において、ヒト化抗体の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号３０のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４５のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４５のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号３２のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４６のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３３のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４６のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｖ）配列番号３４のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４６のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３５のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４７のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｖｉｉ）配列番号３３のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４８のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｖｉｉｉ） 配列番号３４のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４８のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｉｘ）配列番号３２のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４８のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｘ）配列番号３６のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４５のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｘｉ）配列番号３７のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４７のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｘｉｉ）配列番号３８のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４６のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｘｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４６のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｘｉｖ）配列番号４０のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４５のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｘｖ）配列番号４１のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４６のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｘｖｉ）配列番号４２のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４６のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｘｖｉｉ）配列番号４３のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４７のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４８のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｘｉｘ）配列番号３９のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４８のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｘｘ）配列番号４４のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４７のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｘｘｉ）配列番号４１のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４８のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、または
（ｘｘｉｉ）配列番号４２のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４８のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
を含む。
一実施例において、本開示は、抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインは、ＩＬ−２３には特異的に結合するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合せず、
（ｉ）配列番号３０のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４５のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４５のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号３２のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４６のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、または
（ｉｖ）配列番号３３のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４６のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
を含む、ヒト化抗体を提供する。
本開示は、抗体の抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインは、ＩＬ−２３には特異的に結合するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合せず、配列番号４９に記載の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号５０に記載の配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ヒト抗体も提供する。
本開示のＩＬ−２３結合タンパク質の例示的な形態は、配列番号３または１６に記載の配列を含む定常領域に連結される配列番号７に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４に記載の配列を含む定常領域に連結される配列番号１２に記載の配列を含むＶＬを含む、キメラ抗体である。一実施例において、キメラ抗体は、配列番号２０に記載の配列を含む重鎖、および配列番号２１に記載の配列を含む軽鎖を含む。
本開示は、抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインは、ＩＬ−２３には特異的に結合するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合せず、配列番号７に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号１２に記載の配列を含むＶＬ、またはモノクローナル抗体のキメラ、脱免疫化、合成ヒト化、もしくはヒト化形態を含む、モノクローナル抗体をさらに提供する。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから成る群から選択される、ヒトまたは非ヒト霊長類の重鎖免疫グロブリン定常領域を含む。例示的な重鎖免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ定常領域、例えば、ＩｇＧ１定常領域である。一実施例において、定常領域は、配列番号３または１６に記載の配列を含む。
別の実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、カッパまたはラムダから成る群から選択される。ヒトまたは非ヒト霊長類の軽鎖免疫グロブリン定常領域を含む。一実施例において、カッパ軽鎖定常領域は、配列番号４に記載の配列を含む。一実施例において、ラムダ軽鎖定常領域は、配列番号８３に記載の配列を含む。
一実施例において、ＩＬ−２３結合タンパク質は、ＩＬ−２３活性を中和する。
ある実施例において、ＩＬ−２３結合タンパク質は、放射性同位体、検出可能な標識、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象内のタンパク質の半減期を延長させる化合物、およびこれらの混合物から成る群から選択される化合物に抱合される。
本開示は、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質をコードする核酸も提供する。この点に関して、本開示は、本明細書で説明される具体的に例示された核酸に限定されず、遺伝子コードの縮重の結果として本開示のＩＬ−２３結合タンパク質をコードする、いかなる核酸も包含する。例えば、核酸は、特定の細胞型での発現に対してコドン最適化され得る。
一実施例において、核酸は、配列番号６、１１、１８、１９、もしくは５７〜７７のいずれか１つに記載の配列、それに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列、または中程度から高度の緊縮状態の下でハイブリッド形成する配列を含む。一実施例において、核酸は、配列番号６、１１、１８、１９、５７〜６０、７２、７３、７６、もしくは７７のいずれか１つに記載の配列、それに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列、または中程度から高度の緊縮状態の下でハイブリッド形成する配列を含む。
一実施例において、そのような核酸は、核酸がプロモーターに操作可能に連結された発現構築体中に含まれる。そのような発現構築体は、ベクター、例えばプラスミド中にあり得る。
単一ポリペプチドのＩＬ−２３結合タンパク質に関する本開示の実施例において、発現構築体は、そのポリペプチド鎖をコードする核酸に連結されたプロモーターを含んでもよい。
ＩＬ−２３結合タンパク質を形成する複数のポリペプチドに関する実施例において、本開示の発現構築体は、プロモーターに操作可能に連結された（例えば、ＶＨを含む）ポリペプチドの１つをコードする核酸、およびプロモーターに操作可能に連結された別の（例えば、ＶＬを含む）ポリペプチドをコードする核酸を含む。
別の実施例において、発現構築体は、二シストロン性発現構築体であり、例えば、５'から３'の順に以下の操作可能に連結された構成要素を含む。
（ｉ）プロモーター、
（ｉｉ）第１のポリペプチドをコードする核酸、
（ｉｉｉ）内部リボソーム進入部位、および
（ｉｖ）第２のポリペプチドをコードする核酸。
例えば、第１のポリペプチドがＶＨを含み、第２のポリペプチドがＶＬを含むか、または第１のポリペプチドがＶＬを含み、第２のポリペプチドがＶＨを含む。
本開示は、その１つが（例えば、ＶＨを含む）第１のポリペプチドをコードし、別の１つが（例えば、ＶＬを含む）第２のポリペプチドをコードする、別々の発現構築体も企図している。例えば、本開示は、
（ｉ）ポリペプチドをコードする核酸を含む、第１の発現構築体（例えば、プロモーターに操作可能に連結されたＶＨを含む）と、
（ｉｉ）ポリペプチドをコードする核酸を含む、第２の発現構築体（例えば、プロモーターに操作可能に連結されたＶＬを含む）と、を含み、
第１および第２のポリペプチドが会合して、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質を形成する、
組成物も提供する。
本開示は、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質を発現する単離された細胞、または本開示のＩＬ−２３結合タンパク質を発現するように遺伝子的に修正された組み換え細胞も提供する。
一実施例において、細胞は、本開示の発現構築体、すなわち、
（ｉ）操作可能にプロモーターに連結されたポリペプチドをコードする核酸を含む、第１の発現構築体（例えば、ＶＨを含む）と、
（ｉｉ）操作可能にプロモーターに連結されたポリペプチドをコードする核酸を含む、第２の発現構築体（例えば、ＶＬを含む）と、を含み、
第１および第２のポリペプチドが会合して、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質を形成する、
発現構築体を含む。
本開示の細胞の例としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞が挙げられる。
本開示は、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質を産生するための方法をさらに提供する。例えば、そのような方法は、ＩＬ−２３結合タンパク質が十分に産生される条件の下で、本開示の発現構築体を維持することを伴う。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質を産生するための方法は、ＩＬ−２３結合タンパク質が産生される、および随意に分泌されるのに十分な条件の下で、本開示の細胞を培養することを含む。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質を産生するための方法は、ＩＬ−２３結合タンパク質を単離することをさらに含む。
本開示は、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質と、好適な担体または希釈剤とを含む、組成物も提供する。一実施例において、この担体または希釈剤は、薬学的に許容されるものである。
本開示は、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質、それをコードする核酸、それを発現する細胞、または本開示の組成物を、細胞、組織、臓器、または対象に投与することを含む、該細胞、組織、臓器、または対象におけるＩＬ−２３媒介疾患の症状を治療または防止するための方法をさらに提供する。
本開示は、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質または本開示の組成物の、医療薬における使用も提供する。
本開示は、加えて、または代替として、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質の、ＩＬ−２３媒介疾患の治療のための薬剤の製造における使用も提供する。
一実施例において、状態は、ＴＨ１７細胞媒介疾患である。
一実施例において、状態は、炎症性疾患または自己免疫疾患である。
例えば、疾患は、乾癬、クローン病、または多発性硬化症である。１つの例示的な形態において、疾患は、乾癬である。
本開示は、乾癬、クローン病、多発性硬化症の治療で使用するための、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質、抗体、組成物も提供する。
本開示は、試料を、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質と接触させ、よって、抗原−タンパク質複合体を形成することと、該複合体を検出することとを含み、該複合体を検出することが試料中のＩＬ−２３を示す、試料中のＩＬ−２３を検出するための方法をさらに提供する。
一実施例において、本方法は、試料を、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質と接触させ、それを固体または半固体の基質上に固定化し、よって、抗原−タンパク質複合体を形成することと、該複合体を検出することとを含む。いくつかの実施例において、複合体を検出することは、複合体を、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質とは異なる部位でＩＬ−２３、ＩＬ−２３ｐ１９、および／またはＩＬ−１２ｐ４０に結合する抗体の抗原結合ドメインを含む、第２のタンパク質と接触させることと、該第２のタンパク質を検出することとを含む。
例えば、第２のタンパク質は、検出可能な標識によって標識される。代替として、第２のタンパク質に結合する、さらに標識されたタンパク質が使用される。
別の実施例において、本方法は、
（ｉ）試料を、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質とは異なる部位でＩＬ−２３、および／またはＩＬ−２３ｐ１９、および／またはＩＬ−１２ｐ４０に結合する抗体の抗原結合ドメインを含む、タンパク質と接触させて、それを固体または半固体の基質上に固定化し、よって、抗原−タンパク質複合体を形成することと、
（ｉｉ）この複合体を本開示のＩＬ−２３結合タンパク質と接触させて、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質を検出することによって、複合体を検出することと、
を含む。
例えば、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、検出可能な標識で標識される。代替として、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質に結合する、さらに標識されたタンパク質が使用される。
本開示はまた、対象由来の試料中のＩＬ−２３を検出するために本開示の方法を行うことを含み、該試料中のＩＬ−２３の検出が該対象の疾患を示す、該対象の疾患を診断または予後診断するための方法も提供する。
一実施例において、本方法は、試料中のＩＬ−２３のレベルを判定することを含み、対照試料と比較した試料中のＩＬ−２３のレベルの増加または減少が疾患を示す。
例示的な疾患は、本明細書で説明されており、本開示の本実施例に準用されるものと解釈されたい。
ＩＬ−２３に特異的に結合する能力は、例えば疾患を診断または予後診断するために、撮像応用も可能にする。したがって、本開示は、存在する場合は、ＩＬ−２３に結合した本開示のＩＬ−２３結合タンパク質または抗体をインビボで検出することを含み、該ＩＬ−２３結合タンパク質または抗体が検出可能な標識に抱合されている、対象のＩＬ−２３の位置を特定する、および／または検出するための方法をさらに提供する。一実施例において、本方法は、ＩＬ−２３結合タンパク質または抗体を対象に投与することをさらに含む。
ＩＬ−２３に対するキメラ抗体Ｅ１１Ｅ７キメラの特異性を示す、一連のグラフ図である。パネルＡは、ヒトＩＬ−２３に対するＥ１１Ｅ７キメラの反応性を示す。パネルＢは、ヒトＩＬ−２３ｐ１９−Ｆｃ融合タンパク質に対するＥ１１Ｅ７キメラの反応性を示す。パネルＣは、ヒトＩＬ−１２ｐ４０−Ｆｃ融合タンパク質に対するＥ１１Ｅ７キメラの反応性を示す。パネルＤは、マウスＩＬ−２３に対するＥ１１Ｅ７キメラの反応性を示す。 水素／重水素交換実験中に、Ｅ１１Ｅ７の結合によって保護されるＩＬ−２３の領域の位置を示す、図形的に表現した図である。黒色の原子は、重複ペプチド全体にわたって重水素の高いパーセント差を示した、ＩＬ−２３ｐ１９上のアミノ酸を表す。灰色の原子は、重複ペプチド全体にわたって重水素の高いパーセント差を示した、ＩＬ−１２ｐ４０上のアミノ酸を表す。値（２５．８６７）は、ＩＬ−２３ｐ１９およびＩＬ−１２ｐ４０の領域のいくつかの原子間の距離（オングストローム）である。 示されるように、Ｅ１１Ｅ７キメラまたは抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体によるＩＬ−２３のＩＬ−２３受容体（ＩＬ−２３Ｒ）への結合の阻害を示すグラフ図である。 マウス脾細胞によるＩＬ−２３誘発性のＩＬ−１７分泌のＥ１１Ｅ７またはＥ１１Ｅ７キメラ媒介性中和を示すグラフ図である。値は、抗体の非存在下でのマウス脾細胞によるＩＬ−２３誘発性のＩＬ−１７分泌と比較した阻害パーセントとして表される。 （示されるように）Ｅ１１Ｅ７キメラ、抗ＩＬ−２３ｐ１９抗体、またはアイソタイプ対照抗体で処置した動物の乾癬のＩＬ−２３媒介性マウスモデルにおける経時的な臨床スコアを示すグラフ図である。 （示されるように）Ｅ１１Ｅ７キメラ、抗ＩＬ−２３ｐ１９抗体、またはアイソタイプ対照抗体で処置した動物の乾癬のＩＬ−２３媒介性マウスモデルにおける表皮厚さを示すグラフ図である。 ＥＬＩＳＡを使用して判定した、Ｅ１１Ｅ７のＩＬ−２３へのＥ１１Ｅ７キメラおよびのヒト化形態の結合を示すグラフ図である。 抗体の可変領域の配列および／または配列のアラインメントを示す、図形的に表現した図である。図７Ａは、Ｅ１１Ｅ７のＶＨ領域およびそのヒト化形態のアラインメントを示す図である。配置の下にある記号は以下のとおりである。「＊」は、アラインメント中の残基が同一であることを意味し、「：」は、アラインメント中の残基が強く保存されていることを意味し（強く保存された群：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ）、「．」は、残基が弱く保存されていることを意味する（弱く保存された群：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＦＶＬＩＭ、ＨＦＹ）。コンセンサス配列も示され、「Ｘ」は、変動の部位を示す。「Ｘ」の下には、分析した配列のその部位で生じる全てのアミノ酸が示される。四角で囲んだ領域は、（示されるように）Ｋａｂａｔ付番方式および拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式によって定義したＣＤＲを含む。Ｋａｂａｔ付番方式によって定義したＣＤＲには下線を引いている。拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式によって定義したＣＤＲは、太字で示す。 抗体の可変領域の配列および／または配列のアラインメントを示す、図形的に表現した図である。図７Ｂは、Ｅ１１Ｅ７の選択されたヒト化形態のＶＨ領域のアラインメントを示す図である。配置の下にある記号は以下のとおりである。「＊」は、アラインメント中の残基が同一であることを意味し、「：」は、アラインメント中の残基が強く保存されていることを意味し（強く保存された群：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ）、「．」は、残基が弱く保存されていることを意味する（弱く保存された群：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＦＶＬＩＭ、ＨＦＹ）。コンセンサス配列も示され、「Ｘ」は、変動の部位を示す。「Ｘ」の下には、分析した配列のその部位で生じる全てのアミノ酸が示される。四角で囲んだ領域は、（示されるように）Ｋａｂａｔ付番方式および拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式によって定義したＣＤＲを含む。Ｋａｂａｔ付番方式によって定義したＣＤＲには下線を引いている。拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式によって定義したＣＤＲは、太字で示す。 抗体の可変領域の配列および／または配列のアラインメントを示す、図形的に表現した図である。図７Ｃは、Ｅ１１Ｅ７のＶＬ領域およびそのヒト化形態のアラインメントを示す図である。配置の下にある記号は以下のとおりである。「＊」は、アラインメント中の残基が同一であることを意味し、「：」は、アラインメント中の残基が強く保存されていることを意味し（強く保存された群：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ）、「．」は、残基が弱く保存されていることを意味する（弱く保存された群：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＦＶＬＩＭ、ＨＦＹ）。コンセンサス配列も示され、「Ｘ」は、変動の部位を示す。「Ｘ」の下には、分析した配列のその部位で生じる全てのアミノ酸が示される。四角で囲んだ領域は、（示されるように）Ｋａｂａｔ付番方式および拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式によって定義したＣＤＲを含む。Ｋａｂａｔ付番方式によって定義したＣＤＲには下線を引いている。拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式によって定義したＣＤＲは、太字で示す。 抗体の可変領域の配列および／または配列のアラインメントを示す、図形的に表現した図である。図７Ｄは、Ｅ１１Ｅ７の選択されたヒト化形態のＶＬ領域のアラインメントを示す図である。配置の下にある記号は以下のとおりである。「＊」は、アラインメント中の残基が同一であることを意味し、「：」は、アラインメント中の残基が強く保存されていることを意味し（強く保存された群：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ）、「．」は、残基が弱く保存されていることを意味する（弱く保存された群：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＦＶＬＩＭ、ＨＦＹ）。コンセンサス配列も示され、「Ｘ」は、変動の部位を示す。「Ｘ」の下には、分析した配列のその部位で生じる全てのアミノ酸が示される。四角で囲んだ領域は、（示されるように）Ｋａｂａｔ付番方式および拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式によって定義したＣＤＲを含む。Ｋａｂａｔ付番方式によって定義したＣＤＲには下線を引いている。拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式によって定義したＣＤＲは、太字で示す。 抗体の可変領域の配列および／または配列のアラインメントを示す、図形的に表現した図である。図７Ｅは、ヒト抗体ＳＴ８８３／８８５のＶＨのアミノ酸配列を示す図である。配置の下にある記号は以下のとおりである。「＊」は、アラインメント中の残基が同一であることを意味し、「：」は、アラインメント中の残基が強く保存されていることを意味し（強く保存された群：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ）、「．」は、残基が弱く保存されていることを意味する（弱く保存された群：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＦＶＬＩＭ、ＨＦＹ）。コンセンサス配列も示され、「Ｘ」は、変動の部位を示す。「Ｘ」の下には、分析した配列のその部位で生じる全てのアミノ酸が示される。四角で囲んだ領域は、（示されるように）Ｋａｂａｔ付番方式および拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式によって定義したＣＤＲを含む。Ｋａｂａｔ付番方式によって定義したＣＤＲには下線を引いている。拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式によって定義したＣＤＲは、太字で示す。 抗体の可変領域の配列および／または配列のアラインメントを示す、図形的に表現した図である。図７Ｆは、ヒト抗体ＳＴ８８３／８８５のＶＬのアミノ酸配列を示す図である。配置の下にある記号は以下のとおりである。「＊」は、アラインメント中の残基が同一であることを意味し、「：」は、アラインメント中の残基が強く保存されていることを意味し（強く保存された群：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ）、「．」は、残基が弱く保存されていることを意味する（弱く保存された群：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＦＶＬＩＭ、ＨＦＹ）。コンセンサス配列も示され、「Ｘ」は、変動の部位を示す。「Ｘ」の下には、分析した配列のその部位で生じる全てのアミノ酸が示される。四角で囲んだ領域は、（示されるように）Ｋａｂａｔ付番方式および拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式によって定義したＣＤＲを含む。Ｋａｂａｔ付番方式によって定義したＣＤＲには下線を引いている。拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式によって定義したＣＤＲは、太字で示す。 Ｅ１１Ｅ７のＩＬ−２３へのヒト化形態の結合を示すが、ＩＬ−１２ｐ４０またはＩＬ−２３ｐ１９には有意に結合していないことを示す、一連のグラフ図である。ブランクは、被覆抗原を省略した分析条件を指す。 完全ヒト抗体ＳＴ８８３／８８５ＩｇＧのＩＬ−２３への結合を示すが、ＩＬ−１２ｐ４０またはＩＬ−２３ｐ１９には有意に結合していないことを示す、グラフ図である。ブランクは、被覆抗原を省略した分析条件を指す。 ＥＬＩＳＡ（Ａ）を介して行った、捕捉抗体としてＥ１１Ｅ７を使用した組み換えＩＬ−２３の検出を示すグラフ図である。 ＥＬＩＳＡ（Ｂ）によって測定した、ポークウィードマイトジェン（ＰＭＷ）およびリポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激したときの、細胞系ＴＨＰ−１によって産生された、Ｅ１１Ｅ７による天然ＩＬ−２３の検出を示すグラフ図である。 動物を免疫化することによって抗ＩＬ−２３抗体を産生するための方法を示す、図形的に表現した図である。 ファージディスプレイによって抗ＩＬ−２３抗体を産生するための方法を示す、図形的に表現した図である。
概要
この明細書の全体を通して、別途具体的に提示されない限り、または別途文脈上必要でない限り、単一のステップ、組成物、一群のステップ、または一群の組成物への言及は、１つおよび複数（すなわち、１つ以上）のそれらのステップ、組成物、一群のステップ、または一群の組成物を包含すると解釈されるべきである。したがって、別途文脈が明確に指示しない限り、本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を含む。例えば、「ａ」の参照は、１つならびに２つ以上を含み、「ａｎ」の参照は、１つならびに２つ以上を含み、「ｔｈｅ」の参照は、１つならびに２つ以上を含む、等である。
本開示の各実施例は、別途具体的に提示されない限り、あらゆる実施形態に準用されるものとする。
本開示の各実施例は、抗体の抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインが、配列番号４９に記載の配列を含むＶＨおよび配列番号５０に記載の配列を含むＶＬを含む、タンパク質に準用されるものとする。
本開示の各実施例は、抗体の抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインが、配列番号７に記載の配列を含むＶＨおよび配列番号１２に記載の配列を含むＶＬ、またはそれらのヒト化形態を含む、例えば、表１の２〜２３行のいずれか１行で説明される抗体のＶＨおよびＶＬを含む、タンパク質に準用されるものとする。
本開示の各実施例は、抗体の抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインが、表１の２、３、６、または７行のいずれか１行で説明される抗体のＶＨおよびＶＬを含む、タンパク質に準用されるものとする。
当業者は、本明細書の開示に対して、具体的に説明されたもの以外の変形形態および修正形態が可能であることを理解するであろう。本開示は、そのような全ての変形形態および修正形態を包含することを理解されたい。本発明は、本明細書において参照または示される全てのステップ、特徴、組成物、および化合物を個別または集合的に含み、かつ該ステップまたは特徴の全ての組み合わせ、または任意の２つ以上の組み合わせを含む。
本開示の範囲は、本明細書で説明される特定の実施形態に限定されるものではなく、それらは例証することを意図したものに過ぎない。機能的に同等の産物、組成物、および方法は、明らかに本開示の範囲内である。
本明細書で説明される組成物および方法は、別途指示されていない限り、分子生物学、細菌学、ウイルス学、組み換えＤＮＡ技術、溶液中のペプチド合成、固相ペプチド合成、および免疫学といった従来の手法を使用して、過度の実験を伴わずに産生されるか、または行われる。そのような手順は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｖｏｌｓ Ｉ， ＩＩ，およびＩＩＩ全て、Ｂｅｎｎｙ Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，（２００４）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｖｏｌ．２４８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｓ．ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．，１９８５），ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，全文、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ，１９８４）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，全文および特に、Ｇａｉｔ，ｐｐｌ−２２、Ａｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，ｐｐ３５−８１、Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ，ｐｐ８３−１１５、およびＷｕ ｅｔ ａｌ，ｐｐ１３５−１５１による論文、４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，全文、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８６）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，全文、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），全シリーズ、Ｊ．Ｆ．Ｒａｍａｌｈｏ Ｏｒｔｉｇａｏ，Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ａｃｃｅｓｓ ｔｏ Ｖｉｒｔｕａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｗｅｂｓｉｔｅ（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の「Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，Ｄ．，Ｔｅｉｃｈｍａｎ，Ｊ．，Ｌｉｅｎ，Ｅ．Ｌａｎｄ Ｆｅｎｉｃｈｅｌ，Ｒ．Ｌ．（１９７６）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７３ ３３６−３４２、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９６３）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９−２１５４、Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９７９）ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．ｅｄｓ．），ｖｏｌ．２，ｐｐ．１−２８４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１２．Ｗｕｎｓｃｈ，Ｅ．，ｅｄ．（１９７４）Ｓｙｎｔｈｅｓｅ ｖｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｎ ｉｎ Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌｓ Ｍｅｔｏｄｅｎ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ （Ｍｕｌｅｒ，Ｅ．，ｅｄ．），ｖｏｌ．１５，４ｔｈ ｅｄｎ．，Ｐａｒｔｓ １ ａｎｄ ２，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．＆Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．（１９８４）Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２５，４４９−４７４、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、およびＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ Ｒ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓ，ｅｄ．，２０００），ＩＳＢＮ ０１９９６３７９７０，全文、で説明されている。
「および／または」という用語、例えば「Ｘおよび／またはＹ」という用語は、「ＸおよびＹ」もしくは「ＸまたはＹ」のいずれかを意味するものと理解されるものとし、どちらも意味すること、またはいずれかを意味することに対する明確な支持を提供するものと解釈されるものとする。
本明細書で使用される「〜、間（ｂｅｔｗｅｅｎ）」という用語は、２つの値の間の範囲、または２つの残基間のタンパク質またはポリペプチド中の１つの残基という状況において、包含的な様式で読み取られる、すなわち２つの列挙された値／残基の間に位置する任意の値／残基、および２つの列記された値／残基を含むものとして読み取られるべきである。例えば、「１〜１０」という用語は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０を含むものと理解されるものとする。
本明細書の状況において、「配列番号ＸＸ〜ＹＹのいずれか１つ（またはいずれか１つ以上）」は、（本明細書で定義されるように）列挙された配列番号の間にある配列のいずれか１つ（または１つ以上）を定義する明細書または特許請求の範囲に対する原文通りの支持を提供するものと理解されるであろう。
この明細書の全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、明示された要素、完全体、もしくはステップ、または一群の要素、整数、もしくはステップを含むことを意味するが、任意の他の要素、完全体、もしくはステップ、または一群の要素、整数、もしくはステップを除外しないことを意味するものと理解されるであろう。
配列リストの見出し
配列番号１は、ヒトＩＬ−１２ｐ４０サブユニットのアミノ酸配列である。
配列番号２は、ヒトＩＬ−２３ｐ１９サブユニットのアミノ酸配列である。
配列番号３は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
配列番号４は、ヒト軽鎖カッパ定常領域のアミノ酸配列である。
配列番号５は、可撓性リンカーによって分離されたＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットを含む融合タンパク質をコードする、ヌクレオチド配列である。
配列番号６は、抗体Ｅ１１Ｅ７のＶＨをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号７は、抗体Ｅ１１Ｅ７のＶＨのアミノ酸配列である。
配列番号８は、抗体Ｅ１１Ｅ７のＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列である（Ｋａｂａｔ付番方式に従う）。
配列番号９は、抗体Ｅ１１Ｅ７のＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列である（Ｋａｂａｔ付番方式に従う）。
配列番号１０は、抗体Ｅ１１Ｅ７のＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列である（Ｋａｂａｔ付番方式に従う）。
配列番号１１は、抗体Ｅ１１Ｅ７のＶＬをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１２は、抗体Ｅ１１Ｅ７のＶＬのアミノ酸配列である。
配列番号１３は、抗体Ｅ１１Ｅ７のＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列である（Ｋａｂａｔ付番方式に従う）。
配列番号１４は、抗体Ｅ１１Ｅ７のＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列である（Ｋａｂａｔ付番方式に従う）。
配列番号１５は、抗体Ｅ１１Ｅ７のＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列である（Ｋａｂａｔ付番方式に従う）。
配列番号１６は、ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
配列番号１７は、ＦＬＡＧタグのアミノ酸配列である。
配列番号１８は、Ｅ１１Ｅ７キメラ抗体のＶＬをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１９は、Ｅ１１Ｅ７キメラ抗体のＶＨをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２０は、Ｅ１１Ｅ７のＶＨおよびヒト定常領域を含むキメラ抗体（Ｅ１１Ｅ７キメラと命名）の重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号２１は、Ｅ１１Ｅ７のＶＬおよびヒト定常領域を含むキメラ抗体（Ｅ１１Ｅ７キメラと命名）の軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号２２は、本明細書で説明されるＩＬ−２３と結合する抗体のＶＨの代替のＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号２３は、抗ＩＬ−２３抗体のＶＨのＣＤＲ１のコンセンサス配列のアミノ酸配列である（拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式に従う）。
配列番号２４は、抗ＩＬ−２３抗体のＶＨのＣＤＲ２のコンセンサス配列のアミノ酸配列である（Ｋａｂａｔ付番方式に従う）。
配列番号２５は、ヒト化抗ＩＬ−２３抗体のＶＨのＣＤＲ１のコンセンサス配列のアミノ酸配列である（拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式に従う）。
配列番号２６は、抗ＩＬ−２３抗体のＶＨのコンセンサス配列のアミノ酸配列である。
配列番号２７は、抗ＩＬ−２３抗体のＶＬのコンセンサス配列のアミノ酸配列である。
配列番号２８は、ヒト化抗ＩＬ−２３抗体のＶＨのコンセンサス配列のアミノ酸配列である。
配列番号２９は、ヒト化抗ＩＬ−２３抗体のＶＬのコンセンサス配列のアミノ酸配列である。
配列番号３０は、ヒト化抗体重鎖番号２０のアミノ酸配列である。
配列番号３１は、ヒト化抗体重鎖番号２１のアミノ酸配列である。
配列番号３２は、ヒト化抗体重鎖番号６のアミノ酸配列である。
配列番号３３は、ヒト化抗体重鎖番号８のアミノ酸配列である。
配列番号３４は、ヒト化抗体重鎖番号９のアミノ酸配列である。
配列番号３５は、ヒト化抗体重鎖番号１６のアミノ酸配列である。
配列番号３６は、ヒト化抗体重鎖番号１のアミノ酸配列である。
配列番号３７は、ヒト化抗体重鎖番号１３のアミノ酸配列である。
配列番号３８は、ヒト化抗体重鎖番号７のアミノ酸配列である。
配列番号３９は、ヒト化抗体重鎖番号１１のアミノ酸配列である。
配列番号４０は、ヒト化抗体重鎖番号１８のアミノ酸配列である。
配列番号４１は、ヒト化抗体重鎖番号５のアミノ酸配列である。
配列番号４２は、ヒト化抗体重鎖番号１０のアミノ酸配列である。
配列番号４３は、ヒト化抗体重鎖番号１４のアミノ酸配列である。
配列番号４４は、ヒト化抗体重鎖番号１５のアミノ酸配列である。
配列番号４５は、ヒト化抗体軽鎖番号４のアミノ酸配列である。
配列番号４６は、ヒト化抗体軽鎖番号２２のアミノ酸配列である。
配列番号４７は、ヒト化抗体軽鎖番号１２のアミノ酸配列である。
配列番号４８は、ヒト化抗体軽鎖番号２３のアミノ酸配列である。
配列番号４９は、ヒト抗体番号ＳＴ８８３／８８５のＶＨのアミノ酸配列である。
配列番号５０は、ヒト抗体番号ＳＴ８８３／８８５のＶＬのアミノ酸配列である。
配列番号５１は、ヒト抗体番号ＳＴ８８３／８８５のＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号５２は、ヒト抗体番号ＳＴ８８３／８８５のＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号５３は、ヒト抗体番号ＳＴ８８３／８８５のＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号５４は、ヒト抗体番号ＳＴ８８３／８８５のＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号５５は、ヒト抗体番号ＳＴ８８３／８８５のＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号５６は、ヒト抗体番号ＳＴ８８３／８８５のＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号５７は、ヒト化抗体重鎖番号２０のＶＨをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号５８は、ヒト化抗体重鎖番号２１のＶＨをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号５９は、ヒト化抗体重鎖番号６のＶＨをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６０は、ヒト化抗体重鎖番号８のＶＨをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６１は、ヒト化抗体重鎖番号９のＶＨをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６２は、ヒト化抗体重鎖番号１６のＶＨをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６３は、ヒト化抗体重鎖番号１のＶＨをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６４は、ヒト化抗体重鎖番号１３のＶＨをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６５は、ヒト化抗体重鎖番号７のＶＨをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６６は、ヒト化抗体重鎖番号１１のＶＨをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６７は、ヒト化抗体重鎖番号１８のＶＨをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６８は、ヒト化抗体重鎖番号５のＶＨをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６９は、ヒト化抗体重鎖番号１０のＶＨをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号７０は、ヒト化抗体重鎖番号１４のＶＨをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号７１は、ヒト化抗体重鎖番号１５のＶＨをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号７２は、ヒト化抗体軽鎖番号４のＶＬをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号７３は、ヒト化抗体軽鎖番号２２のＶＬをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号７４は、ヒト化抗体軽鎖番号１２のＶＬをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号７５は、ヒト化抗体軽鎖番号２３のＶＬをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号７６は、ヒト抗体番号ＳＴ８８３／８８５のヌクレオチド配列をコードするＶＨである。
配列番号７７は、ヒト抗体番号ＳＴ８８３／８８５のヌクレオチド配列をコードするＶＬである。
配列番号７８は、連結した構成要素（ＩＬ−１２ｐ４０−リンカー−ＩＬ−２３ｐ１９）を含む融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号７９は、ＨＩＳタグのアミノ酸配列である。
配列番号８０は、ＡｖｉＨＩＳタグのアミノ酸配列である。
配列番号８１は、抗体の重鎖のリーダー配列のアミノ酸配列である。
配列番号８２は、抗体の軽鎖のリーダー配列のアミノ酸配列である。
配列番号８３は、ヒト軽鎖ラムダ定常領域のアミノ酸配列である。
選択された定義
「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」という用語は、その由来起源または由来源のために、その固有の状態において該タンパク質またはポリペプチドを伴う天然に随伴される成分を伴わない、または同じ種に由来する他のタンパク質を実質的に含まない、タンパク質またはポリペプチドである。タンパク質は、当技術分野で知られているタンパク質精製手法を使用して、単離によって、天然に随伴される成分を実質的に含まないようにすることができる。本明細書で使用される「回収する」という用語は、例えば、当技術分野で知られているタンパク質精製手法を使用して、単離によって、ポリペプチド等の化学種が、天然に随伴される成分を実質的に含まないようにするプロセスを指す。一実施例において、単離されたタンパク質は、実質的に精製される。「実質的に精製される」という用語は、汚染物質を実質的に含まない、例えば、汚染物質を少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％含まないことを意味する。
「組み換え」という用語は、人工遺伝子組み換えの産物を意味することを理解されたい。故に、抗体の抗原結合ドメインを含む組み換えタンパク質という状況において、この用語は、Ｂ細胞の成熟中に起こる天然組み換えの産物である、対象の体内で自然に発生する抗体を包含しない。しかしながら、そのような抗体が単離された場合、それは抗体可変領域を含む単離されたタンパク質とみなされるとする。同様に、組み換え手段を使用して、タンパク質をコードする核酸を単離させて発現させた場合、結果として生じるタンパク質は、抗体の抗原結合ドメインを含む組み換えタンパク質である。組み換えタンパク質は、それが細胞、組織、または対象内にあるとき、例えばそこで発現したときに、人工組み換え手段によって発現させたタンパク質も包含する。
「ＩＬ−２３結合タンパク質」という用語は、単一のポリペプチド鎖（すなわち、ペプチド結合によって連結される一連の隣接するアミノ酸）、または本明細書で説明および／もしくは特許請求される様式でＩＬ−２３に結合することが可能な、互いに共有的または非共有的に連結される一連のポリペプチド（すなわち、ポリペプチド複合体）を含むものと解釈されるものとする。例えば、一連のポリペプチド鎖は、好適な化学結合またはジスルフィド結合を使用して、共有的に連結することができる。非共有結合の例としては、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、および疎水相互作用が挙げられる。
前述のパラグラフからの「ポリペプチド鎖」という用語は、ペプチド結合によって連結される一連の隣接するアミノ酸を意味することが理解されるであろう。
本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原に特異的に結合することが可能である、抗体の領域、すなわち、ＶＨ、ＶＬ、またはＦｖを意味するものと解釈されるものとする。抗原結合ドメインは、抗体全体という状況である必要はなく、例えば、単離した形態（例えば、ドメイン抗体）または例えば本明細書で説明されるｓｃＦｖ等の別の形態とすることができる。
本開示の目的で、「抗体」という用語は、Ｆｖ内に含まれる抗原結合部位によって、１つまたは複数の密に関連する抗原（例えば、ＩＬ−２３）に特異的に結合することが可能な、タンパク質を含む。この用語は、４つの鎖抗体（例えば、２つの軽鎖および２つの重鎖）、組み換え抗体、または修飾抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ＣＤＲ移植抗体、霊長類化抗体、非免疫化抗体、合成ヒト化抗体、半抗体、二重特異性抗体）を含む。抗体は、一般に、定常ドメインを含み、これは、定常領域、定常断片、または結晶化可能断片（Ｆｃ）に配列することができる。抗体の例示的な形態は、それらの基本単位として４鎖構造を含む。完全長抗体は、共有的に連結される２つの重鎖（約５０〜７０ｋＤ）、および２つの軽鎖（それぞれ、約２３ｋＤａ）を含む。軽鎖は、一般に、可変領域（存在する場合）と、定常ドメインとを含み、哺乳動物では、κ軽鎖、またはλ軽鎖のいずれかである。重鎖は、一般に、可変領域と、ヒンジ領域によって付加的な定常ドメインに連結される１つまたは２つの定常ドメインとを含む。哺乳動物の重鎖は、α、δ、ε、γ、またはμの型の１つである。各軽鎖も、重鎖の１つに共有的に連結される。例えば、２つの重鎖、ならびに重鎖および軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって、および非共有相互作用によって互いに保持される。鎖間ジスルフィド結合の数は、抗体の種類によって変動し得る。各鎖は、Ｎ末端可変領域（それぞれ、アミノ酸長さが約１１０である、ＶＨまたはＶＬ）と、Ｃ末端の１つ以上の定常ドメインとを有する。軽鎖（アミノ酸長さが約１１０である、ＣＬ）の定常ドメインは、重鎖（アミノ酸長さが３３０〜４４０である、ＣＨ１）の第１の定常ドメインと整列され、それにジスルフィド結合する。軽鎖可変領域は、重鎖の可変領域と整列される。抗体重鎖は、２つ以上の付加的なＣＨドメイン（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３等）を含むことができ、かつＣＨ１定常ドメインとＣＨ２定常ドメインとの間にヒンジ領域を含むことができる。抗体は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものとすることができる。一実施例において、抗体は、ネズミ（マウスまたはラット）抗体、または霊長類（例えば、ヒト）抗体である。一実施例において、抗体は、キメラであるか、ヒト化、合成ヒト化、ＣＤＲ移植、または脱免疫化される。
本明細書で使用される「可変領域」は、抗原に特異的に結合することができる、本明細書で定義される抗体の軽鎖および／または重鎖の部分を指し、相補性決定領域（ＣＤＲ）、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、フレームワーク領域（ＦＲ）とのアミノ酸配列を含む。例えば、可変領域は、３つのＣＤＲとともに、３または４つのＦＲ（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および随意にＦＲ４）を含む。ＩｇＮＡＲ由来のタンパク質の場合、タンパク質は、ＣＤＲ２が欠如し得る。ＶＨは、重鎖の可変領域を指す。ＶＬは、軽鎖の可変領域を指す。
本明細書で使用される「相補性決定領域」（同意語：ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）という用語は、その存在が特異的抗体結合の主な要因である、抗体可変領域のアミノ酸残基を指す。各可変領域は、典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として識別される、３つのＣＤＲ領域を有する。一実施例において、ＣＤＲおよびＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７および１９９１のＫａｂａｔ配列に従って定義される（本明細書では、「Ｋａｂａｔ付番方式」とも称される）。別の実施例において、ＣＤＲおよびＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、拡張Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｍｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に従って定義される。Ｋａｂａｔの付番方式によれば、ＶＨのＦＲおよびＣＤＲは、残基１〜３０（ＦＲ１）、３１〜３５（ＣＤＲ１）、３６〜４９（ＦＲ２）、５０〜６５（ＣＤＲ２）、６６〜９４（ＦＲ３）、９５〜１０２（ＣＤＲ３）、および１０３〜１１３（ＦＲ４）に位置付けられる。Ｋａｂａｔの付番方式によれば、ＶＬのＦＲおよびＣＤＲは、残基１〜２３（ＦＲ１）、２４〜３４（ＣＤＲ１）、３５〜４９（ＦＲ２）、５０〜５６（ＣＤＲ２）、５７〜８８（ＦＲ３）、８９〜９７（ＣＤＲ３）、および９８〜１０７（ＦＲ４）に位置付けられる。本開示は、Ｋａｂａｔ付番方式によって定義されるＦＲおよびＣＤＲに限定されず、カノニカル付番方式、もしくはＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８７７−８８３，１９８９、および／もしくはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３，９２７−９４８，１９９７の付番方式、Ｈｏｎｎｅｇｈｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｋｔｈｕｎ Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０９：６５７−６７０，２００１、もしくはｔｈｅ ＩＭＧＴ ｓｙｓｔｅｍ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｉｎ Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：２０６−２１１，１９９７の付番方式を含む、全ての付番方式を含む。一実施例において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番方式に従って定義される。随意に、Ｋａｂａｔ付番方式に従う重鎖ＣＤＲ２は、本明細書で列記される５つのＣ末端を含まず、またはそれらのアミノ酸のいずれか１つ以上が、別の天然に存在するアミノ酸と置換される。付加的または代替的な随意選択肢において、軽鎖ＣＤＲ１は、本明細書で列記される４つのＮ末端アミノ酸を含まず、またはそれらのアミノ酸のいずれか１つ以上が、別の天然に存在するアミノ酸と置換される。この点に関して、Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９：１３３−１３９，１９９５は、重鎖ＣＤＲ２の５つのＣ末端アミノ酸および／または軽鎖ＣＤＲ１の４つのＮ末端アミノ酸が、一般に、抗原結合に関与しないことを立証した。
「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変領域残基である。
本明細書で使用される「Ｆｖ」という用語は、複数のポリペプチドを含むか、単一のポリペプチドを含むかに関わらず、ＶＬおよびＶＨが会合して、抗原結合部位を有する、すなわち抗原に特異的に結合することが可能な複合体を形成する、任意のタンパク質を意味するものと解釈されるものとする。抗原結合部位を形成するＶＨおよびＶＬは、単一のポリペプチド鎖または異なるポリペプチド鎖中にあり得る。さらに、本開示のＦｖ（ならびに本開示の任意のタンパク質）は、同じ抗原に結合してもよく、結合しなくてもよい、複数の抗原結合部位を有し得る。この用語は、抗体に直接由来する断片、ならびにそのようなタンパク質の組み換え形態を包含するものと理解されるとする。いくつかの実施例では、ＶＨが重鎖定常ドメインＣＨ１に連結されず、および／またはＶＬが軽鎖定常ドメインＣＬに連結されない。例示的なＦｖ含有ポリペプチドまたはタンパク質は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、もしくはより高次の複合体、または定常領域に連結する前述の配列のいずれかもしくはそのドメイン、例えばＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメイン、例えば、ミニボディを含む。「Ｆａｂ断片」は、免疫グロブリンの一価の抗原結合断片から成り、、酵素パパインによる全抗体の消化で、無傷の軽鎖および重鎖の一部分から成る断片を得ることよって産生することができ、または組み換え手段を使用して産生することができる。抗体の「Ｆａｂ’断片」は、ペプシンで全酵素を処理し、続いて還元して、無傷の軽鎖、ならびにＶＨおよび単一定常ドメインを含む重鎖の一部分から成る分子を得ることによって得ることができる。このようにして処理された抗体毎に、２つのＦａｂ’断片が得られる。Ｆａｂ’断片は、組み換え手段によって産生することもできる。抗体の「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つのジスルフィド結合によって互い保持される２つのＦａｂ’断片の二量体から成り、以降の還元を伴わずに、酵素ペプシンで全抗体分子を処理することによって得られる。「Ｆａｂ２」断片は、例えばロイシンジッパーまたはＣＨ３ドメインを使用して連結される２つのＦａｂ断片を含む、組み換え断片である。「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域が好適な可撓性ポリペプチドリンカーによって共有的に連結される抗体の可変領域断片（Ｆｖ）を含む、組み換え分子である。この用語の範囲に含まれる例示的なＦｖ含有タンパク質の詳細な考察は、本明細書の以下で提供される。
本明細書で使用される「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓまたはｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」という用語は、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質が、特定の単数もしくは複数の抗原またはそれを発現する細胞と、代替の抗体または細胞よりも、長い継続期間および／または高い親和性で、より頻繁に、より迅速に反応または会合することを意味するものと解釈されるものとする。例えば、抗原に「特異的に結合する」タンパク質は、それが他の抗原に結合するよりも、その抗原に、高い親和性、結合活性で、より容易に、および／またはより長い継続期間で結合する。また、この定義を読み取ることによって、例えば、第１の抗原に特異的に結合するタンパク質は、第２の抗原に特異的に結合してもよく、結合しなくてもよい。このように、「特異的結合」は、必ずしも排他的結合または別の抗原の検出不能の結合を必要とするわけではなく、これは、「選択的結合」という用語で表される。１つの実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質の抗原への「特異的結合」は、タンパク質が、１００ｎＭ以下（５０ｎＭ以下など、例えば、２０ｎｍ以下、１ｎＭ以下等）の一定の親和性で抗原に結合することを意味する。
本明細書で使用される「有意に結合しない」という用語は、同じ条件下で試験したときに、ＩＬ−２３ｐ１９サブユニットおよびＩＬ−１２ｐ４０サブユニットがＩＬ−２３の構成要素ではないときに、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質のそれらへの結合が、ＩＬ−２３への結合よりも、１０倍、２０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍少ないことを示すことを意味するものと解釈されるものとする。いくつかの実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、ＩＬ−２３ｐ１９サブユニットおよびＩＬ−１２ｐ４０サブユニットがＩＬ−２３の構成要素ではないときに、それらに対して１×１０−６以下の平衡定数（ＫＤ）を有し、例えば、タンパク質は、少なくとも約１×１０−８、５×１０−９等のＩＬ−２３に対するＫＤを有する。この結合のレベルの減少は、ＥＬＩＳＡまたはバイオセンサー分析（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）で測定し得る。一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、ウエスタンブロット、またはＦＡＣＳによって測定したときに、ＩＬ−２３ｐ１９およびＩＬ−１２ｐ４０がＩＬ−２３の構成要素ではないときに、それらに検出可能な程度に結合しない。この点に関して、「検出可能な程度に結合しない」とは、例えば、アイソタイプ対照抗体を使用して判定したときに、結合のレベルがバックグラウンドよりも有意に大きくないことを意味することを理解されたい。
「ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには」は、単離したＩＬ−２３ｐ１９サブユニットまたはＩＬ−１２ｐ４０サブユニット、またはそれらが別のポリペプチドと複合体形成されるとき（すなわち、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットが、ＩＬ−１２ｐ３５等のＩＬ−２３ｐ１９以外のポリペプチドと複合化形成され得る）を包含する。
本明細書で使用される「ＩＬ−２３」という用語は、ＩＬ−１２およびＩＬ−２７を含む５つのそのようなヘテロ二量体サイトカインのファミリーに属する、ヘテロ二量体ヒトサイトカインを含む（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，Ｐｆｌａｎｚ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９ ６４１−４）。この用語は、例えばジスルフィド架橋で、互いに連結されたＩＬ−２３ｐ１９サブユニットおよびＩＬ−１２ｐ４０サブユニットを含む、ヘテロ二量体タンパク質を含む。ＩＬ−２３という用語は、標準的な組み換え発現方法によって調製することができる、組み換えＩＬ−２３（ｒＩＬ−２３）を含むことを意図している。いくつかの実施例において、本開示は、その組み換え形態（すなわち、ｒｈＩＬ−２３）を含む、ヒトＩＬ−２３（本明細書では、ｈＩＬ−２３またはＩＬ−２３と略記される）を包含する。
本明細書で使用される「ＩＬ−１２／２３」という用語は、集合的にＩＬ−１２およびＩＬ−２３を指す。
本明細書で使用される「ＩＬ−１２ｐ４０」という用語は、「ＩＬ−２３ｐ４０」と同一であり、単純に「ｐ４０」および「ｐ４０サブユニット」または「ＩＬ−１２ｐ４０サブユニット」とも称され、サイトカインＩＬ−１２の４０ｋＤａサブユニット、およびサイトカインＩＬ−２３（例えば、ヒトＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３）の４０ｋＤａサブユニットを含む。命名を目的とし、限定を目的としないが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットのアミノ酸配列は、配列番号１に記載される。一実施例において、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットは、本明細書で論じられるように、配列番号１に記載の配列を含む。
「単離されたＩＬ−１２ｐ４０サブユニット」という用語は、例えば別のインターロイキンタンパク質とヘテロ二量体の構成要素を形成しない形態の、上記に定義したようなＩＬ−１２ｐ４０サブユニットを意味するものと解釈されるものとする。この用語は、「単離されたＩＬ−１２ｐ４０サブユニット」が、いかなる他のタンパク質またはポリペプチド配列も含まないことを意味していない。例えば、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットは、別のポリペプチド（例えば、ＦＬＡＧタグまたは抗体のＦｃ領域）に融合させることができる。この用語はまた、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットが抗体のＦｃ領域に融合した場合に、ホモ二量体を形成し得るので、単量体形態のＩＬ−１２ｐ４０サブユニットに限定されない（しかしながら、これは、定義によって包含される「単離されたＩＬ−１２ｐ４０サブユニット」の１つの例である）。
本明細書で使用される「ＩＬ−２３ｐ１９」という用語は、単純に「ｐ１９」または「ｐ１９サブユニット」とも称され、サイトカインＩＬ−２３（例えば、ヒトのＩＬ−２３の）１９ｋＤａサブユニットを含む。命名を目的とし、限定を目的としないが、ＩＬ−２３ｐ１９サブユニットのアミノ酸配列は、配列番号２に記載される。一実施例において、ＩＬ−２３ｐ１９サブユニットは、本明細書で論じられるように、配列番号２に記載の配列を含む。
「単離されたＩＬ−２３ｐ１９サブユニット」という用語は、例えば別のインターロイキンタンパク質とヘテロ二量体の構成要素を形成しない形態の、上記に定義したようなＩＬ−２３ｐ１９サブユニットを意味するものと解釈されるものとする。この用語は、「単離されたＩＬ−２３ｐ１９サブユニット」が、いかなる他のタンパク質またはポリペプチド配列も含まないことを意味していない。例えば、ＩＬ−２３ｐ１９サブユニットは、別のポリペプチド（例えば、ＦＬＡＧタグまたは抗体のＦｃ領域）に融合させることができる。この用語はまた、ＩＬ−２３ｐ１９サブユニットが抗体のＦｃ領域に融合した場合に、ホモ二量体を形成し得るので、単量体形態のＩＬ−２３ｐ１９サブユニットに限定されない（しかしながら、これは、定義によって包含される「単離されたＩＬ−２３ｐ１９サブユニット」の１つの例である）。
本明細書で使用される、「ヘテロ二量体」という用語は、２つの異なるサイトカインサブユニットを含むタンパク質複合体を意味することを理解されたい。例えば、ＩＬ−２３ｐ１９およびＩＬ−１２ｐ４０は、ＩＬ−２３ヘテロ二量体を形成し、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ３５は、ＩＬ−１２ヘテロ二量体を形成する。
本明細書で使用される「単量体」という用語は、ＩＬ−１２のサブユニットが別のサイトカインサブユニットと直接接触していないことを意味するものと解釈されるものとする。
本明細書で使用される「生物活性」とは、ＩＬ−２３の１つ以上の生物学的特性を指す。ＩＬ−２３の生物学的性質としては、細胞上のＩＬ−１２Ｒβ１および／または細胞上のＩＬ−２３Ｒへの結合、細胞への結合に続くＩＦＮ−γ産生の誘発、細胞への結合に続くＩＬ−１７産生の誘発、細胞への結合に続くＩＬ−２１産生の誘発、細胞への結合に続くＩＬ−２２産生の誘発、ＴＨ１７細胞分化の誘発および樹枝細胞の抗原提示能の活性化、ならびに、記憶Ｔ細胞の増殖の選択的誘発、が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ヘテロ二量体界面」という用語は、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−２３ｐ１９が、互いに接触し、互いに連結され、および／またはタンパク質の結合を可能にするのに十分に近く、よって、ＩＬ−２３に結合するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよび／またはＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合しない部位を取り囲む、ＩＬ−２３の領域を意味するものと解釈されるものとする。この点に関して、この用語は、実際に互いに接触するＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−２３ｐ１９中のそれらの残基だけに限定しない。むしろ、残基は、ヘテロ二量体化に関与するタンパク質の領域内にあり（図２で示される）、かつタンパク質の結合を可能にし、ＩＬ−２３ヘテロ二量体への特異的結合を可能にするように露出させることだけしか必要としない。一実施例において、「ヘテロ二量体界面」とは、例えばＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−２３ｐ１９のアミノ酸を含む、タンパク質の二量体化によって産生される、エピトープである。
本明細書で使用される「エピトープ」という用語（同意語：「抗原決定基」）は、抗体の抗原結合ドメインを構成するタンパク質が結合する、ＩＬ−２３の領域を意味するものと理解されたい。この用語は、必ずしも、タンパク質が接触する、特異的残基または構造に限定されない。例えば、この用語は、タンパク質が接触するアミノ酸および／またはこの領域の外側の１０以上、５つ〜１０、２つ〜５つ、または１つ〜３つのアミノ酸を含む、領域を包含することを意図している。いくつかの実施例において、エピトープは、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−２３ｐ１９の二量体化に応じて産生される、一連の線状アミノ酸である。しかしながら、エピトープは、ＩＬ−２３が折り畳まれたとき、すなわち、「立体配置エピトープ」であるときに、互いに近接して位置付けられる（例えば、互いに約５０オングストローム以内、互いに４０オングストローム以内等、例えば、３０オングストローム以内、互いに約２５オングストローム以内等）、一連の非連続アミノ酸を含むこともできる。当業者は、「エピトープ」という用語が、ペプチドまたはポリペプチドに限定されないことに気付くであろう。例えば、「エピトープ」という用語は、糖側鎖、ホスホリル側鎖、またはスルホニル側鎖等の分子の化学活性表面群を含み、ある実施形態では、特異的３次元構造的特性および／または特異的電荷特性を有し得る。エピトープもしくはペプチド、またはそれを含むポリペプチドは、動物に投与して、エピトープに対する抗体を生成することができる。
「競合的に阻害する」という用語は、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質が、配列番号７に記載の配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２に記載の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体の、ＩＬ−２３への結合を低減または防止することを意味するものと理解されるものとする。上述のことから、タンパク質は、抗体の結合を完全に阻害する必要はなく、むしろ、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％といった、統計的に有意な量の結合を低減することだけしか必要としないことが明白であろう。結合の競合的阻害を決定するための方法は、当技術分野で知られており、および／または本明細書で説明される。例えば、抗体が、ＩＬ−２３に、タンパク質の存在下または非存在下のいずれかで曝露される。タンパク質の非存在下よりも、タンパク質の存在下での抗体の結合が少ない場合、このタンパク質は、抗体の結合を競合的に阻害しているとみなされる。例えば、タンパク質および抗体は、実質的に同時にＩＬ−２３に曝露される。一実施例において、結合の競合的阻害は、抗体の抗原結合ドメインと重複するＩＬ−２３上のタンパク質の抗原結合ドメインによって引き起こされる。
２つのエピトープという文脈での「重複する」とは、２つのエピトープが、タンパク質が一方のエピトープに結合して、他方のエピトープに結合するタンパク質の結合を競合的に阻害するのに十分な数のアミノ酸残基を共有することを意味するものと解釈されるものとする。例えば、本開示は、配列番号７に記載の配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２に記載の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体の、そのエピトープへの結合を防止するのに十分な数の残基を共有するエピトープに結合するタンパク質を包含する。
本明細書で「中程度の緊縮性」とは、４５℃〜６５℃の範囲の温度で２×ＳＳＣ緩衝剤、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、もしくは同じ条件で行われる、ハイブリッド化および／または洗浄として定義される。本明細書で「高度の緊縮性」とは、少なくとも６５℃の温度で０．１×ＳＳＣ緩衝剤、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、もしくはより低い塩濃度で行われる、ハイブリッド化および／または洗浄として定義される。本明細書で特定のレベルの緊縮性に対する参照は、当業者に知られているＳＳＣ以外の洗浄／ハイブリッド化溶液を使用する、同等の条件を包含する。例えば、２本鎖核酸のストランドが解離する温度（融解温度またはＴｍとしても知られる）を算出するための方法は、当技術分野で知られている。核酸のＴｍに類似する温度（例えば、５℃以内、または１０℃以内）、または等しい温度は、高度の緊縮性とみなされる。中程度の緊縮性は、核酸の計算したＴｍの１０℃〜２０℃以内、または１０℃〜１５℃以内とみなされる。
本明細書で使用される「疾患」は、正常な機能の撹乱またはそれに対する妨害であり、任意の特異的状態に限定されず、疾病または障害を含む。
本明細書で使用される「予防すること」、「予防する」、または「予防」という用語は、特定の疾患または状態の少なくとも１つの症状の進行を止めるか、または遅らせるのに十分な治療上有効量の本開示ＩＬ−２３結合タンパク質を投与することを含む。
本明細書で使用される「治療している」、「治療する」、または「治療」という用語は、特定の疾患または状態の少なくとも１つの症状を低減または排除するのに十分な治療上有効量の本明細書で説明されるタンパク質を投与することを含む。
本明細書で使用される「対象」という用語は、哺乳動物等の任意の動物を意味するものと解釈されるものとする。一実施例において、哺乳動物は、ヒトまたは非ヒト霊長類である。例えば、哺乳動物は、ヒトである。
本明細書で「試料」に対する参照は、体液（例えば、血液、滑液、または脳脊髄液）、細胞物質（例えば、組織吸引物）、組織生検標本、または外科標本が挙げられるが、これらに限定されない、対象由来の任意の試料に対する参照として理解されるべきである。「試料」は、該試料の抽出物、誘導体、および／または画分、例えば、血清、血漿、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、または軟膜画分を含む。
本明細書で使用される、「診断」という用語、および「診断する」、「診断される」、または「診断すること」等が挙げられるが、これらに限定されないその変形は、臨床状態の任意の一次診断、または再発性疾患の診断を含む。
本明細書で使用される「予後」、「予後診断すること」、およびその変形は、回復、再発の可能性、または治療の結果を含む、疾患の可能性の高い結果または経過を指す。
抗体可変領域を含むタンパク質
抗体
免疫化に基づく方法
抗体を生成するために、ＩＬ−２３、その修飾形態（例えば、ＩＬ−２３ｐ１９サブユニットに融合させたＩＬ−１２ｐ４０サブユニットを含む、融合タンパク質）、またはそれらをコードする核酸であって、随意に、任意の好適な、もしくは所望の担体、アジュバント、もしくは薬学的に許容される担体とともに調合されたものが、注射可能な組成物の形態で、対象（例えば、マウス、ラット、ニワトリ等の非ヒト対象）に簡便に投与される。注射は、鼻腔内、筋肉内、皮下、静脈内、皮内、腹膜内、または他の既知の経路であってもよい。随意に、ＩＬ−２３またはそれをコードするＤＮＡが、多数回投与される。抗体を調製して特徴付けるための手段は、当技術分野で知られている（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい。）。
ポリクローナル抗体の産生は、免疫化に続いて、免疫化した動物の血液を種々の時点で採取することによって監視することができる。所望の抗体力価を達成することが必要である場合は、第２の追加免疫注射を行ってもよい。追加免疫および力価測定のプロセスを、適当な力価が得られるまで繰り返す。所望のレベルの免疫原性が得られたときに、免疫化した動物から採血し、血清を分離して、貯蔵し、かつ／またはその動物を使用してモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を生成する。
モノクローナル抗体は、本開示によって企図される例示的な抗体である。一般に、そのような方法は、抗体産生細胞を刺激するのに十分な条件下で、ＩＬ−２３またはそれをコードする核酸で対象（例えば、マウスまたはラット）を免疫化することを伴う。いくつかの実施例では、（例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００８２３１号および／またはＬｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８（１９９４）：８５６−８５９で説明されているように）ヒト免疫グロブリンタンパク質を発現し、かつネズミ免疫グロブリンタンパク質を発現しないように遺伝子操作したマウスを免疫化して、抗体を産生する。免疫化に続いて、抗体産生体細胞（例えば、Ｂリンパ球）を、不死細胞、例えば不死骨髄腫細胞と融合させる。そのような融合させた細胞（ハイブリドーマ）を産生するための種々の方法が知られており、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７，１９７５で説明されている。次いで、抗体産生に十分な条件下で、ハイブリドーマ細胞を培養することができる。
本方法は、抗体を産生するための他の方法、例えば（例えば、Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６６，９１−９６，１９９０）で説明されているような）ＡＢＬ−ＭＹＣ技術を企図している。
ライブラリに基づく方法
本開示は、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質を特定するための、その可変領域を含む抗体またはタンパク質のライブラリのスクリーニングも包含する。
この開示の実施例は、ナイーブライブラリ（未処置の対象由来）、免疫化したライブラリ（抗原で免疫化した対象由来）、または合成ライブラリを含む。抗体をコードする核酸またはその領域（例えば、可変領域）が、（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ，ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１で開示されているように）従来の手法によってクローン化され、当技術分野で知られている方法を使用してタンパク質をコードしてディスプレイするために使用される。タンパク質のライブラリを作成するための他の手法は、例えば、米国特許第ＵＳ６３０００６４号（例えば、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＡＧのＨｕＣＡＬライブラリ）、米国特許第ＵＳ５８８５７９３号、米国特許第ＵＳ６２０４０２３号、米国特許第ＵＳ６２９１１５８号、または米国特許第ＵＳ６２４８５１６号で説明されている。
本開示によるＩＬ−２３結合タンパク質は、可溶性分泌タンパク質でもよく、または細胞の表面上の融合タンパク質、または粒子（例えば、ファージまたは他のウイルス、リボソームまたは胞子）として提示されてもよい。種々のディスプレイライブラリ形式が当技術分野で知られている。例えば、ライブラリは、インビトロのディスプレイライブラリ（例えば、米国特許第ＵＳ７２７０９６９号で説明されているような、例えば、リボソームディスプレイライブラリ、共有結合ディスプレイライブラリ、またはｍＲＮＡディスプレイライブラリ）である。さらに別の実施例において、ディスプレイライブラリは、例えば、米国特許第ＵＳ６３０００６４号、米国特許第ＵＳ５８８５７９３号、米国特許第ＵＳ６２０４０２３号、米国特許第ＵＳ６２９１１５８号、または米国特許第ＵＳ６２４８５１６号で説明されているような、ファージディスプレイライブラリであり、抗体の抗原結合ドメインを含むタンパク質が、ファージ上に発現する。他のファージディスプレイ法は、当技術分野で知られており、本開示によって企図される。同様に、細胞ディスプレイ法は、本開示によって企図されており、例えば、米国特許第ＵＳ５５１６６３７号で説明されているような、例えば、細菌性ディスプレイライブラリ、例えば、米国特許第ＵＳ６４２３５３８号または哺乳類ディスプレイライブラリで説明されているような、酵母ディスプレイライブラリである。
ディスプレイライブラリをスクリーニングするための方法は、当技術分野で知られている。一実施例において、本開示のディスプレイライブラリは、例えば、Ｓｃｏｐｅｓが（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４で）説明しているように、親和性精製を使用してスクリーニングされる。親和性精製の方法は、典型的に、ライブラリによってディスプレイされる抗原結合ドメインを含むタンパク質を、標的抗原（例えば、ＩＬ−２３）と接触させることと、洗浄に続いて、抗原に結合したままであるそれらのドメインを溶出することとを伴う。
所望であれば、スクリーニングによって特定されたいかなる可変領域またはｓｃＦｖｓも、完全な抗体に容易に修飾される。可変領域またはｓｃＦｖｓを完全な抗体に修飾または再構成するための例示的な方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．３５４：８５−９０，２０１０、またはＪｏｓｔｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８９：６５−８０，２００４で説明されている。代替的に、または加えて、Ａｕｓｕｂｅｌ他が（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＩＳＢＮ ０４７ １５０３３８，１９８７で）、および／またはＳａｍｂｒｏｏｋ他が（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２００１で）説明しているように、標準的なクローン化方法が使用される。
ＩＬ−２３に特異的に結合するタンパク質の選択
当業者は、ＩＬ−２３に特異的に結合する抗体結合ドメインを含むタンパク質を選択するための好適な方法を利用できる。
例えば、本開示のＩＬ−２３に結合することができるタンパク質を特定するために、スクリーニングを行ってもよい。ＩＬ−２３に結合する任意のタンパク質は、次いで、ＩＬ−２３の構成要素ではない（例えば、単離したもの、または別のサイトカイン、例えばＩＬ−１２の一部である）ときに、ＩＬ−２３ｐ１９またはＩＬ−１２ｐ４０に結合することができないものを特定するために、スクリーニングされる。当然、これらのスクリーニングの順序は、逆にすることもできる。
この種のスクリーニングの実施例は、図１１で表され、および／または本明細書で例示される。組み換えＩＬ−２３またはＩＬ−２３を発現するベクターの遺伝的免疫化のマウスへの繰り返し投与に続いて、骨髄腫細胞とのネズミ脾細胞の融合を行い、結果としてハイブリドーマ細胞が得られる。これらのハイブリドーマ細胞によって分泌される抗体は、次いで、天然のＩＬ−２３に対して１回目のスクリーニングが行われる。陽性ハイブリドーマは、次いで、ＦＬＡＧタグ付けした、ＩＬ−２３、ＩＬ−２３ｐ１９、およびＩＬ−１２ｐ４０に対して２回目の試験が行われる。ＩＬ−２３結合に対しては陽性であるが、ＩＬ−２３ｐ１９およびＩＬ−１２ｐ４０に対しては陽性でない抗体が、ヘテロ二量体特異的抗体である。
ディスプレイしたタンパク質では、ＩＬ−２３に特異的に結合しないタンパク質を取り去るために、パニングを使用することができる。例えば、ＩＬ−２３に結合するタンパク質をディスプレイするファージは、次いで、ＩＬ−２３の構成要素ではない（例えば、単離したもの、別のサイトカインの一部である）ときに、ＩＬ−１２ｐ４０またはＩＬ−２３ｐ１９に曝露され、それによって、ＩＬ−１２ｐ４０またはＩＬ−２３ｐ１９に別々に結合する結合タンパク質、すなわち、交差反応タンパク質を除去する。
この種の方法の実施例は、図１２で表され、および／または本明細書で例示される。この実施例において、ファージは、最初に、ＩＬ−２３への結合についてスクリーニング（またはパニング）されて、未結合のファージが除去され、結合したファージが保持される。結合したファージは、次いで、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットへの結合について試験されて、結合したファージが除去され、結合しなかったファージが保持される。数回パニングした後に、ＩＬ−２３に対する必要な特異性を有する抗体断片が得られる。
別の方法は、それらのポリペプチドが二量体化されなかったときに提示または曝露されなかった、ＩＬ−２３ｐ１９およびＩＬ−１２ｐ４０の二量体化に応じて形成または曝露されたエピトープを特定することと、抗原として該エピトープ含むペプチドまたはポリペプチドを使用して、本開示のタンパク質を産生することとを伴う。
脱免疫化、キメラ、ヒト化、合成ヒト化、霊長類化、およびヒトタンパク質
本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、ヒト化タンパク質であってもよい。
「ヒト化タンパク質」という用語は、ヒト抗体由来のＦＲ上または中にグラフト化された非ヒト種（例えば、マウス、ラット、または非ヒト霊長類）由来の抗体由来のＣＤＲ（この種の抗体は、「ＣＤＲグラフト化抗体」とも称される）を含む、ヒト様可変領域を含むタンパク質を指すものと理解されるものとする。本明細書で例示されるように、ヒト化タンパク質は、ヒトタンパク質の１つ以上の残基が１つ以上のアミノ酸置換によって修飾される、および／またはヒトタンパク質の１つ以上のＦＲ残基が対応する非ヒト残基によって置換される、タンパク質も含む。ヒト化タンパク質は、ヒト抗体および非ヒト抗体のいずれにも見られない残基を含んでもよい。タンパク質の任意の付加的な領域（例えば、Ｆｃ領域）は、一般に、ヒトである。ヒト化は、当技術分野で知られている方法、例えば、米国特許第ＵＳ５２２５５３９号、米国特許第ＵＳ６０５４２９７号、米国特許第ＵＳ７５６６７７１号、または米国特許第ＵＳ５５８５０８９号を使用して行うことができる。「ヒト化タンパク質」という用語は、例えば、米国特許第ＵＳ７７３２５７８号で説明されるような、超ヒト化タンパク質も包含する。
一実施例において、本開示は、
（ｉ）配列番号３０に記載の配列を含む重鎖および配列番号４５に記載の配列を含む軽鎖、
（ｉｉ）配列番号３１に記載の配列を含む重鎖および配列番号４５に記載の配列を含む軽鎖、
（ｉｉｉ）配列番号３２に記載の配列を含む重鎖および配列番号４６に記載の配列を含む軽鎖、
（ｉｖ）配列番号３３に記載の配列を含む重鎖および配列番号４６に記載の配列を含む軽鎖、
（ｖ）配列番号３４に記載の配列を含む重鎖および配列番号４６に記載の配列を含む軽鎖、
（ｉｖ）配列番号３５に記載の配列を含む重鎖および配列番号４７に記載の配列を含む軽鎖、
（ｖｉｉ）配列番号３３に記載の配列を含む重鎖および配列番号４８に記載の配列を含む軽鎖、
（ｖｉｉｉ）配列番号３４に記載の配列を含む重鎖および配列番号４８に記載の配列を含む軽鎖、
（ｉｘ）配列番号３２に記載の配列を含む重鎖および配列番号４８に記載の配列を含む軽鎖、
（ｘ）配列番号３６に記載の配列を含む重鎖および配列番号４５に記載の配列を含む軽鎖、
（ｘｉ）配列番号３７に記載の配列を含む重鎖および配列番号４７に記載の配列を含む軽鎖、
（ｘｉｉ）配列番号３８に記載の配列を含む重鎖および配列番号４６に記載の配列を含む軽鎖、
（ｘｉｉｉ）配列番号３９に記載の配列を含む重鎖および配列番号４６に記載の配列を含む軽鎖、
（ｘｉｖ）配列番号４０に記載の配列を含む重鎖および配列番号４５に記載の配列を含む軽鎖、
（ｘｖ）配列番号４１に記載の配列を含む重鎖および配列番号４６に記載の配列を含む軽鎖、
（ｘｖｉ）配列番号４２に記載の配列を含む重鎖および配列番号４６に記載の配列を含む軽鎖、
（ｘｖｉｉ）配列番号４３に記載の配列を含む重鎖および配列番号４７に記載の配列を含む軽鎖、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号３８に記載の配列を含む重鎖および配列番号４８に記載の配列を含む軽鎖、
（ｘｉｘ）配列番号３９に記載の配列を含む重鎖および配列番号４８に記載の配列を含む軽鎖、
（ｘｘ）配列番号４４に記載の配列を含む重鎖および配列番号４７に記載の配列を含む軽鎖、
（ｘｘｉ）配列番号４１に記載の配列を含む重鎖および配列番号４８に記載の配列を含む軽鎖、または
（ｘｘｉｉ）配列番号４２に記載の配列を含む重鎖および配列番号４８に記載の配列を含む軽鎖、
（ｉ）配列番号３０に記載の配列を含む重鎖および配列番号４５に記載の配列を含む軽鎖、
（ｉｉ）配列番号３１に記載の配列を含む重鎖および配列番号４５に記載の配列を含む軽鎖、
（ｉｉｉ）配列番号４６に記載の配列を含む配列番号３２および軽鎖に記載の配列を含む重鎖、または
（ｉｖ）配列番号３３に記載の配列を含む重鎖および配列番号４６に記載の配列を含む軽鎖、を含む、ヒト化抗体を提供する。
一実施例において、ヒト化タンパク質は、本明細書で開示される軽鎖配列の２７ｄ〜３４、５０〜５５、および８９〜９６、ならびに本明細書で開示される重鎖配列の３１〜３５ｂ、５０〜５８、および９５〜１０１の領域を含む（Ｋａｂａｔ付番方式に応じた番号付け）。この点に関して、Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９：１３３−１３９，１９９５は、これらの領域が、抗原に最も結合または接触する可能性が高いものである証拠を提示している。
本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、ヒトのタンパク質であってもよい。本明細書で使用される「ヒトタンパク質」という用語は、ヒト、例えばヒト生殖細胞系もしくは体細胞に見られる配列に由来または対応する、可変抗体領域および随意に定常抗体領域を有する、タンパク質を指す。「ヒト」抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸、例えば、インビトロでランダムまたは部位指定変異によって導入される変異、（特に、保存的置換を伴う変異、またはタンパク質の少数の残基、例えば、タンパク質の残基の１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つにおける変異）を含む可能性がある。これらの「ヒト抗体」は、必ずしもヒトの免疫応答の結果として生成される必要はなく、むしろ、組み換え手段（例えば、ファージディスプレイライブラリのスクリーニング）を使用して、ヒト抗体定常領域および／もしくは可変領域を含む遺伝子導入動物（例えば、マウス）によって、ならびに／または（米国特許第ＵＳ５５６５３３２号で説明されているような）誘導選択法を使用して、生成することができる。この用語は、そのような抗体の親和性成熟形態も包含する。ヒトタンパク質はまた、ヒト抗体由来のＦＲ、またはヒトＦＲのコンセンサス配列由来の配列を含み、例えば、米国特許第ＵＳ６３０００６４号および／もしくは米国特許第ＵＳ６２４８５１６号で説明されているような、ＣＤＲの１つ以上が無作為もしくは半無作為であるＦＲを含むタンパク質を含むものとみなされる。
本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、合成ヒト化タンパク質であってもよい。「合成ヒト化タンパク質」という用語は、国際特許出願第ＷＯ２００７／０１９６２０号で説明される方法によって調製されるタンパク質を指す。合成ヒト化ＩＬ−２３結合タンパク質は、抗体の可変領域を含み、この可変領域は、新世界霊長類の抗体可変領域由来のＦＲ、および非新世界霊長類の抗体可変領域由来のＣＤＲを含む。例えば、合成ヒト化ＩＬ−２３結合タンパク質は、抗体の可変領域を含み、この可変領域は、新世界霊長類の抗体可変領域由来のＦＲ、およびマウスまたはラット抗体由来のＣＤＲ、例えば、本明細書で説明されるＥ１１Ｅ７を含む。一実施例において、合成ヒト化ＩＬ−２３結合タンパク質は、可変領域の一方または双方が合成ヒト化された、ＩＬ−２３結合抗体である。
本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、霊長類化タンパク質であってもよい。「霊長類化タンパク質」は、非ヒト霊長類、例えば、カニクイザルマカクの免疫化に続いて生成される抗体由来の可変領域を含む。随意に、非ヒト霊長類抗体の可変領域は、霊長類化抗体を産生するために、ヒト定常領域に連結される。霊長類化抗体を産生するための例示的な方法は、米国特許第ＵＳ６１１３８９８号で説明されている。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、キメラタンパク質である。「キメラタンパク質」という用語は、抗原結合ドメインが特定の種（例えば、マウスまたはラット等のネズミ類）に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する一方で、タンパク質の残りが、別の種（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）由来のタンパク質に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する、タンパク質を指す。一実施例において、キメラタンパク質は、非ヒト抗体（例えば、ネズミ抗体）由来のＶＨおよびＶＬを含み、抗体の残りの領域は、ヒト抗体に由来する。そのようなキメラタンパク質の産生は、当技術分野で知られており、（例えば、米国特許第ＵＳ６３３１４１５号、米国特許第ＵＳ５８０７７１５号、米国特許第ＵＳ４８１６５６７号、および米国特許第ＵＳ４８１６３９７号で説明されているような）標準的な手段によって達成され得る。
本開示は、例えば、国際特許出願第ＷＯ２０００／３４３１７号および国際特許出願第ＷＯ２００４／１０８１５８号で説明されるような、脱免疫化タンパク質も企図する。非免疫化抗体およびタンパク質は、１つ以上のエピトープ、例えばＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを除去（すなわち、変異）し、それによって、対象の抗体またはタンパク質に対する免疫応答が高まる可能性を低減する。例えば、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、１つ以上のＢ細胞またはＴ細胞エピトープを特定するために分析し、エピトープ内の１つ以上のアミノ酸残基を変異させ、それによって、ＩＬ−２３結合タンパク質の免疫原性を低減する。
抗原結合ドメインを含む他のＩＬ−２３結合タンパク質
本開示は、いかのもの等の、他の抗原結合ドメイン含有タンパク質も企図する：
（ｉ）抗体のＶＨまたはＶＬの全てもしくは一部分を含む、単一ポリペプチド鎖である、単一ドメイン抗体（例えば、米国特許第ＵＳ６２４８５１６号を参照されたい）、
（ｉｉ）ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ（例えば、米国特許第ＵＳ５８４４０９４号および／または米国特許出願第２００８０１５２５８６号で説明されているもの）、
（ｉｉｉ）ｓｃＦｖｓ（例えば、米国特許第ＵＳ５２６０２０３号で説明されているもの）、
（ｉｖ）ミニボディ（例えば、米国特許第ＵＳ５８３７８２１号で説明されているもの）、
（ｖ）「鍵および鍵穴孔」二重特異性タンパク質（米国特許第ＵＳ５７３１１６８号で説明されているもの）、
（ｖｉ）ヘテロ抱合タンパク質（例えば、米国特許第ＵＳ４６７６９８０号で説明されているもの）、
（ｖｉｉ）化学架橋剤を使用して産生されるヘテロ抱合タンパク質（例えば、米国特許第４６７６９８０号で説明されているもの）、
（ｖｉｉｉ）Ｆａｂ’−ＳＨ断片（例えば、Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５，１９９２で説明されているもの）、または
（ｉｘ）Ｆａｂ３（例えば、欧州特許出願第ＥＰ１９９３０３０２８９４号で説明されているもの）。
定常ドメインの融合
本開示は、抗体の抗原結合ドメインおよび定常領域（例えば、Ｆｃ）もしくはそのドメイン、例えばＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含む、タンパク質を包含する。好適な定常領域またはドメインは、当業者に明らかであり、および／またはそのようなポリペプチドの配列は、全米バイオテクノロジー情報センター等の、一般に公開されているデータベースから容易に入手することが可能である。Ｋａｂａｔらは、いくつかの好適な定常領域／ドメインの説明も提供している。いくつかの実施例において、ＩＬ−２３結合タンパク質の定常領域またはその一部分は、ヒト抗体に由来する。定常領域またはその一部分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含む任意の抗体クラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む、任意の抗体アイソタイプに由来してもよい。定常領域の例示的な配列は、米国特許出願第２００７０１４８１６７号に含まれる。
定常領域および／またはそのドメインは、二量体化、延長された血清半減期（例えば、ＦｃＲｎへの結合による）、抗原依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、および／もしくは抗原依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）等の、生物活性を提供、修飾、または増強するために有用である。
本開示は、例えば米国特許第ＵＳ７２１７７９７号、米国特許第ＵＳ７２１７７９８号、または米国特許出願第２００９００４１７７０号（延長された半減期を有する）もしくは米国特許出願第２００５０３７０００号（増加したＡＤＣＣ）で説明されているような、変異定常領域またはドメインを含むタンパク質も企図する。
例えば、ＩＬ−２３結合タンパク質は、タンパク質の半減期を延長させる、１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、ＩＬ−２３結合タンパク質は、新生児Ｆｃ領域（ＦｃＲｎ）に対する定常領域の親和性を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、定常領域を含む。例えば、定常領域は、エンドソームにおけるＦｃ／ＦｃＲｎの結合を促進するように、より低いｐＨ、例えば約ｐＨ６．０で、ＦｃＲｎに対する増加した親和性を有する。一実施例において、定常領域は、約ｐＨ７．４でのその親和性と比較して、約ｐＨ６で、ＦｃＲｎに対する増加した親和性を有し、これは、細胞の再利用に続くＦｃの血液中への再放出を促進する。これらのアミノ酸置換は、血液からのクリアランスを低減することによって、タンパク質の半減期を延長させるために有用である。
例示的なアミノ酸置換としては、ＥＵ付番方式に従って、Ｔ２５０Ｑおよび／またはＭ４２８Ｌ；Ｔ２５２Ａ、Ｔ２５４Ｓ、およびＴ２６６Ｆ；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ；、またはＨ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆを含む。付加的であるか選択的アミノ酸置換は、例えば、米国特許出願第２００７０１３５６２０号または米国特許第７０８３７８４号で説明されている。
本開示の中和タンパク質は、ＩｇＧ４定常領域または安定化ＩｇＧ４定常領域を含むことができる。「安定化ＩｇＧ４定常領域」という用語は、Ｆａｂアーム交換、半抗体のＦａｂアーム交換もしくは形成を受ける傾向、または半抗体を形成する傾向を低減するように修飾された、ＩｇＧ４定常領域を意味するものと理解されるであろう。「Ｆａｂアーム交換」とは、ヒトＩｇＧ４のための一種のタンパク質修飾を指し、そこではＩｇＧ４重鎖および取り付けられた軽鎖（半分子）が、別のＩｇＧ４分子からの重鎖−軽鎖の対と交換される。このようにして、ＩｇＧ４分子は、２つの異なる抗原を認識する２つの異なるＦａｂアームを獲得し得る（二重特異性分子をもたらす）。Ｆａｂアーム交換は、インビボで自然に起こり、精製された血液細胞または還元グルタチオン等の還元剤によってインビトロで誘発することができる。「半抗体」は、ＩｇＧ４抗体が解離して、それぞれが単一の重鎖および単一の軽鎖を含む２つの分子を形成したときに形成される。
一実施例において、安定化ＩｇＧ４定常領域は、Ｋａｂａｔのシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８７および／または１９９１）に従って、ヒンジ領域の２４１位にプロリンを含む。この位置は、ＥＵ付番方式（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，２００１、およびＥｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３，７８−８５，１９６９）に従って、ヒンジ領域の２２８位に対応する。ヒトＩｇＧ４において、この残基は、一般にセリンである。プロリンに対するセリン置換に続いて、ＩｇＧ４ヒンジ領域は、配列ＣＰＰＣを含む。この点に関して、当業者は、「ヒンジ領域」が、抗体の２つのＦａｂアームに運動性を与える、ＦｃおよびＦａｂ領域を連結する、抗体重鎖定常領域のプロリンに富む部分であることに気付くであろう。ヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド結合を伴う、システイン残基を含む。これは、一般に、Ｋａｂａｔの付番方式に従って、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２２６からＰｒｏ２４３まで伸びるものとして定義される。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成する、最初および最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによって、ＩｇＧ１配列と整列させてもよい（例えば、国際特許出願第ＷＯ２０１０／０８０５３８号を参照されたい）。
変異タンパク質
本明細書で論じられるように、本開示は、本開示の配列に少なくとも８０％の同一性を有するタンパク質または核酸を提供する。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、配列番号７、配列番号３０〜４４のいずれか１つのアミノ酸１〜１２０、または配列番号４９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む、ＶＨを含み、タンパク質は、ＩＬ−２３には特異的に結合することが可能であるが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合することができない。代替的に、または加えて、タンパク質は、任意の実施例に従って本明細書で説明されているように、ＶＨのＣＤＲと、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である、ＣＤＲ（例えば、３つのＣＤＲ）を含み、ＩＬ−２３には特異的に結合することが可能であるが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合することができない。タンパク質のＩＬ−２３、ＩＬ−２３ｐ１９、およびＩＬ−１２ｐ４０への結合を決定するための方法は、本明細書で説明される。
例えば、本発明者らは、残基の約３０％の変異を有する、一連のＶＨ領域を産生した。したがって、タンパク質は、本明細書で開示されるＶＨの配列と少なくとも約７０％同一である配列を含む、ＶＨを含むことができる。一実施例において、配列は、少なくとも８５％または９５％同一である。
本発明者らは、残基の約１１％の変異を有する、一連のヒト化ＶＨ領域も産生した。したがって、タンパク質は、本明細書で開示されるＶＨの配列と少なくとも約８９％同一である配列を含む、ＶＨを含むことができる。一実施例において、配列は、少なくとも９０％または９５％同一である。
本発明者らは、Ｋａｂａｔ付番方式に従って、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合せずに、ＩＬ−２３への特異的結合を維持しながら変異させることができる、重鎖ＣＤＲ２中の残基も特定した。例えば、１６の残基のうちの２つ（残基の１２．５％）を変異させることができる。したがって、タンパク質は、本明細書で開示される重鎖ＣＤＲ２の配列に対して少なくとも約８７．５％の同一性を有する、ＣＤＲ２を含むことができる。
本明細書で論じられるように、重鎖ＣＤＲ２の５つのＣ末端残基（残基の３１％）が保存的または非保存的アミノ酸置換に変異させることができることも当技術分野で知られている（Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９：１３３−１３９，１９９５）。したがって、タンパク質は、本明細書で開示される重鎖ＣＤＲ２の配列に対して少なくとも約６９％の同一性を有するＣＤＲ２を含むことができる。
本発明者らは、拡張Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式に従って、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合せずに、ＩＬ−２３への特異的結合を維持しながら変異させることができる、重鎖ＣＤＲ１中の残基も特定した。例えば、７つの残基のうちの２つ（残基の２８％または４３％）を変異させことができ、または７つの残基のうちの３つ（残基の４３％）を変異させることができる。したがって、タンパク質は、本明細書で開示される重鎖ＣＤＲ１配列に対して少なくとも約７２％の同一性を有する、ＣＤＲ２を含むことができる。
別の実施例において、本開示の核酸は、配列番号６、１９、５７〜７１、もしくは７６のいずれか１つに記載の配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。本開示は、配列番号配列番号７、２６、２８、配列番号３０〜４４のいずれか１つのアミノ酸１〜１２０、または配列番号４９のいずれか１つに記載の配列を含むタンパク質をコードする核酸も包含するが、遺伝子コードの縮重の結果として本明細書で例示される配列と異なる。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、配列番号１２、配列番号４５〜４８のいずれか１つのアミノ酸１〜１１３、または配列番号５０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む、ＶＬを含み、タンパク質は、ＩＬ−２３には特異的に結合することが可能であるが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合することができない。代替的に、または加えて、タンパク質は、任意の実施例に従って本明細書で説明されているように、ＶＬのＣＤＲと、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である、ＣＤＲ（例えば、３つのＣＤＲ）を含み、ＩＬ−２３には特異的に結合することが可能であるが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合することができない。
例えば、本発明者らは、残基の約３２％の変異を有する、一連のＶＬ領域を産生した。したがって、タンパク質は、本明細書で開示されるＶＬの配列と少なくとも約６８％同一である配列を含む、ＶＬを含むことができる。一実施例において、配列は、少なくとも８５％または９５％同一である。
本発明者らは、残基の約１４％の変異を有する、一連のヒト化ＶＬ領域も産生した。したがって、タンパク質は、本明細書で開示されるＶＨの配列と少なくとも約８６％同一である配列を含む、ＶＨを含むことができる。一実施例において、配列は、少なくとも９０％または９５％同一である。
別の実施例において、本開示の核酸は、配列番号１１、１８、７２〜７５、もしくは７７のいずれか１つに記載の配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。本開示は、配列番号１２、２７、２９、配列番号４５〜４８のいずれか１つのアミノ酸１〜１１３、または配列番号５０のいずれか１つに記載の配列を含むタンパク質をコードする核酸も包含するが、遺伝子コードの縮重の結果として本明細書で例示される配列と異なる。
核酸またはポリペプチドの同一性パーセントは、ギャップ作成ペナルティ＝５およびギャップ伸長ペナルティ＝０．３でのＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３，１９７０）分析（ＧＣＧプログラム）によって判定される。問い合わせ配列は、少なくとも５０残基の長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも５０残基の領域にわたって２つの配列を整列させる。例えば、問い合わせ配列は、少なくとも１００残基の長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１００残基の領域にわたって２つの配列を整列させる。一実施例において、２つの配列は、それらの全体の長さにわたって整列されられる。
本開示は、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質の変異形態を企図する。例えば、そのような変異タンパク質は、本明細書で記載される配列と比較して、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施例において、ＩＬ−２３結合タンパク質は、１０以下、例えば、９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つの保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換体」とは、アミノ酸残基が、類似した側鎖、疎水性、および／または親水性を有するアミノ酸残基と置換されたものである。
類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。疎水性指標は、例えば、Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３２，１９８２で説明されており、親水性指標は、例えば、米国特許第ＵＳ４５５４１０１号で説明されている。
本開示は、非保存的アミノ酸変化も企図する。例えば、特に対象となるのは、荷電アミノ酸の、別の荷電アミノ酸との置換、および中性のまたは正に荷電したアミノ酸との置換である。いくつかの実施例において、タンパク質は、１０以下、例えば、９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つの非保存的アミノ酸置換を含む。
任意の実施例に従って本明細書で説明されるタンパク質の変異形態は、ＩＬ−２３に特異的に結合する能力を保持するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよび／またはＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合しない。ＩＬ−２３への特異的結合を決定するための方法は、本明細書で説明される。例えば、標識したタンパク質を、固定化したＩＬ−２３、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニット、またはＩＬ−２３ｐ１９サブユニットと接触させる。洗浄に続いて、結合した標識を検出する。標識したタンパク質を、固定化したＩＬ−２３ｐ１９および／またはＩＬ−１２ｐ４０と接触させ、洗浄に続いて、結合したラベルを検出する。ＩＬ−２３には結合したが、ＩＬ−２３ｐ１９またはＩＬ−１２ｐ４０には結合しなかった標識の検出は、変異タンパク質が、ＩＬ−２３に特異的に結合する能力を保持していることを示す。前述の方法の随意の付加的なステップは、ＩＬ−２３ｐ１９サブユニットおよび／またはＩＬ−１２ｐ４０サブユニットに結合した標識を検出することを含む。ＩＬ−２３には結合したが、ＩＬ−２３ｐ１９および／またはＩＬ−１２ｐ４０には有意に結合しなかった標識が検出された場合、そのタンパク質は、ＩＬ−２３には特異的に結合するが、ＩＬ−２３ｐ１９サブユニットおよび／またはＩＬ−１２ｐ４０サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合しないものとみなされる。
一実施例において、変異は、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質のＦＲ内で起こる。別の実施例において、変異は、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質のＣＤＲ内で起こる。
タンパク質の変異形態を産生するための例示的な方法は、以下を含む：
・ ＤＮＡの変異誘発（Ｔｈｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．５２５：３０９−２２，２００９）またはＲＮＡの変異誘発（Ｋｏｐｓｉｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０７（２）：１６３−８，２００６；国際特許出願第ＷＯ１９９９／０５８６６１号）、
・ ポリペプチドをコードする核酸を、変異誘発細胞、例えばＸＬ−１Ｒｅｄ、ＸＬ−ｍｕｔＳ、ＸＬ−ｍｕｔＳ−Ｋａｎｒ細菌細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に導入すること、
・ 例えばＳｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−９１，１９９４で開示されているような、ＤＮＡシャフリング、および
・ ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒが（ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮＹ，１９９５で）説明しているような、部位指定変異誘発。
本開示の変異タンパク質の生物活性を決定するための例示的な方法は、当業者に明らかになり、および／または本明細書で説明される。例えば、抗原結合、結合の競合的阻害、親和性、会合、解離、および治療効果を決定するための方法は、本明細書で説明される。
一実施例において、変異タンパク質は、親和性成熟によって、またはその後に産生される。
例示的なタンパク質
本発明者らによって産生されたタンパク質を含む例示的な可変領域、およびそれらをコードする核酸を、表１で説明する。
Figure 2013535191
タンパク質を産生するための方法
組み換え発現
本明細書で論じられるように、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質（および／またはそのようなタンパク質に含まれるポリペプチド）をコードする核酸は、発現構築体中に導入され、よって、プロモーターに操作可能に連結され、それによって、その発現を促進する。発現構築体を産生する、例えば発現構築体／ベクターにクローン化するための方法は、当技術分野で知られており、ならびに／またはＡｕｓｕｂｅｌ他が（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＩＳＢＮ ０４７ １５０３３８，１９８７で）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ他が（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２００１で）説明しており、また米国特許第ＵＳ７２７０９６９号で説明されている。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、細菌細胞中で発現させる。例えばスタフィロコッカス種、コリネバクテリウム属種、サルモネラ種、バチルス種、およびシュードモナス種等の最新細胞における発現に好適な、典型的なプロモーターとしては、ｌａｃｚ、Ｉｐｐ、温度感受性（Ｌまたは（Ｒプロモーター、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、またはＩＰＴＧ誘発性ｔａｃプロモーターもしくはｌａｃＵＶ５プロモーター等の半人工プロモーター、等のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施例において、ＩＬ−２３結合タンパク質は、酵母細胞中で発現させる。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、およびＳ．ｐｏｍｂｅ等の酵母細胞における発現に好適な、典型的なプロモーターとしては、遺伝子ＡＤＨ１、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、ＣＵＰ１、ＰＨＯ５、ｎｍｔ、ＲＰＲ１、またはＴＥＦ１に由来するプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
さらなる実施例において、ＩＬ−２３結合タンパク質は、昆虫細胞中で発現させる。昆虫細胞または昆虫における発現に好適な、典型的なプロモーターとしては、ＯＰＥＩ２プロモーター、ムリ種カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｕｒｉ）から単離した昆虫アクチンプロモーター、ショウジョウバエ種のｄｓｈプロモーター（Ｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９，１３−２５，２０００）が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、植物細胞中で発現させることもできる。植物細胞中でペプチドを発現させるためのプロモーターは、当技術分野で知られており、オオムギアミラーゼ遺伝子プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子プロモーター、ならびにオーキシン誘導性植物プロモーターＰ１およびＰ２が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、哺乳動物細胞中で、または哺乳動物中で発現させる。哺乳類細胞における発現に好適な、典型的なプロモーターとしては、例えば、レトロウイルスＬＴＲエレメント、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＣＭＶ ＩＥ（サイトメガロウイルス前初期）プロモーター、ＥＦ１プロモーター（ヒト伸長因子１由来）、ＥＭ７プロモーター、ＵｂＣプロモーター（ヒトユビキチンＣ由来）から成る群から選択される、プロモーターが挙げられる。有用な哺乳類宿主細胞系の例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）によって形質転換したサル腎臓ＣＶｌ系、ヒト胚腎臓系（ＨＥＫ−２９３細胞）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、または骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ／０細胞）が挙げられる。一実施例において、細胞は、ＣＨＯ細胞である。
発現構築体／ベクターの他の要素は、当技術分野で知られており、例えば、エンハンサ、転写ターミネーター、ポリアデニル化配列、選択可能または検出可能なマーカーをコードする核酸、および複製の起源が挙げられる。
一実施例において、発現構築体は、二シストロン性発現構築体である。「二シストロン性」とは、核酸の異なる領域に由来する２つの異なるポリペプチドをコードすることが可能である、単一の核酸を意味し、例えば、ポリペプチドを含むＶＨおよび異なるポリペプチドとしてポリペプチドを含むＶＬをコードすることが可能である、単一の核酸を意味する。一般に、各異なるポリペプチドをコードする領域は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離され、ＩＲＥＳの５'領域は、転写末端配列を含まない。例示的なＩＲＥＳは、例えば、米国特許出願第２００９０２４７４５５号で説明されている。
好適な発現構築体は、産生に続いて、当技術分野で知られている任意の方法を使用して、好適な細胞に導入される。例示的な方法としては、特に、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥデキストランによって媒介される形質移入、リポフェクトアミン（Ｇｉｂｃｏ、ＭＤ、ＵＳＡ）および／またはセルフェクチン（Ｇｉｂｃｏ、ＭＤ、ＵＳＡ）等を使用した、リポソームによって媒介される形質移入、ＰＥＧ媒介性ＤＮＡ取り込み、電気穿孔法、およびＤＮＡ被覆タングステンまたは金粒子（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ社、ＷＩ、ＵＳＡ）等を使用した、微粒子衝撃法が挙げられる。
本開示のＩＬ−２３結合タンパク質を産生するために使用される細胞は、次いで、当技術分野で知られている条件下で培養されて、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質を産生する。
無細胞発現系、例えば、ＴＮＴ Ｔ７およびＴＮＴ Ｔ３系（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＥＸＰ１−ＤＥＳＴおよびｐＥＸＰ２−ＤＥＳＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）も本開示によって企図される。
タンパク質精製
産生／発現に続いて、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、当技術分野で知られている方法を使用して精製される。そのような精製は、一般に、実質的に非特異性のタンパク質、酸、脂質、炭水化物等を含まない、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質を提供する。例えば、ＩＬ−２３結合タンパク質が調整物中に存在することになり、約９０％を超える（例えば、９５％、９８％、または９９％の）調整物中のタンパク質が、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質である。
本開示の単離されたタンパク質を得るために用いられる、ペプチド精製の標準的な方法としては、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、位相分離方法、電気泳動分離、沈殿法、塩溶／塩析法、免疫クロマトグラフィ、および／または他の方法等の、高圧（または高性能）液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）および非ＨＰＬＣポリペプチド単離プロトコルが挙げられるが、これらに限定されない。
代替として、親和性精製は、標識を含む融合タンパク質を単離するために有用である。親和性クロマトグラフィを使用してタンパク質を単離するための方法は、当技術分野で知られており、例えば、Ｓｃｏｐｅｓが（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４で）説明している。例えば、標識（ポリヒスチジンタグの場合、これは、例えば、ニッケル−ＮＴＡであり得る）に結合する抗体または化合物は、固体支持体上に固定化されてもよい。タンパク質を含む試料は、次いで、しばらくの間、結合が起こるのに十分な条件下で、固定化した抗体または化合物と接触させられる。洗浄し、あらゆる結合しなかったまたは特異的に結合しなかったタンパク質を除去した後に、タンパク質を溶出する。
抗体のＦｃ領域を含むタンパク質の場合、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、またはその修飾形態は、親和性精製に使用することができる。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖Ｆｃ領域を含む、精製されたタンパク質を単離するために有用である。タンパク質Ｇは、全てのマウスＦｃアイソタイプおよびヒトγ３に推奨される。
抱合体
本開示は、別の化合物に抱合される本開示のＩＬ−２３結合タンパク質、例えば抱合体（または免疫抱合体）も提供する。他の化合物は、ＩＬ−２３結合タンパク質に直接的または間接的に結合することができる（例えば、間接結合の場合、リンカーを含むことができる）。化合物は、ＩＬ−２３結合タンパク質に、共有的または非共有的に連結することができる。化合物の例としては、放射性同位体（例えば、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０、またはインジウム−１１１）、検出可能な標識（例えば、フルオロフォアまたは蛍光ナノ結晶）、治療化合物（例えば、化学療法剤または抗炎症剤）、コロイド（例えば、金）、毒素（例えば、リシンまたは破傷風類毒素）、核酸、ペプチド（例えば、血清アルブミン結合ペプチド）、タンパク質（例えば、抗体または血清アルブミンの抗原結合ドメインを含むタンパク質）、対象のタンパク質の半減期を延長させる化合物（例えば、この活性を有するポリエチレングリコールまたは他の水溶性ポリマー）、およびこれらの混合物が挙げられる。本開示のＩＬ−２３結合タンパク質に抱合させることができる例示的な化合物、およびそのような抱合のための方法は、当技術分野で知られており、例えば、国際特許出願第ＷＯ２０１０／０５９８２１号で説明されている。
抗イディオタイプ抗体
ＩＬ−２３に特異的に結合する本開示のＩＬ−２３結合タンパク質に加えて、本開示は、本開示のタンパク質に特異的な抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体も提供する。抗Ｉｄ抗体は、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質の抗原結合ドメインと一般に関連する一意の決定基を認識する、抗体である。抗Ｉｄは、本開示のタンパク質またはその抗原結合ドメインで動物を免疫化することによって調製することができる。免疫化された動物は、免疫化するタンパク質のイディオタイプ決定基を認識し、応答して、抗Ｉｄ抗体を産生する。抗Ｉｄ抗体は、さらに別の動物において免疫応答を誘発するために、「免疫原」として使用してもよく、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を産生する。
スクリーニングアッセイ
本開示の抗体可変領域を含むタンパク質は、例えば以下で説明するように、生物活性について容易にスクリーニングされる。
結合アッセイ
そのようなアッセイの１つの形態は、例えば、Ｓｃｏｐｅｓが（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４で）説明しているような、抗原結合アッセイである。そのような方法は、一般に、ＩＬ−２３結合タンパク質を標識付けすることと、それを固定化された抗原と接触させることとを伴う。洗浄し、特異的に結合しなかったタンパク質を除去した後に、標識の量を検出し、その結果として、結合したタンパク質を検出する。当然、ＩＬ−２３結合タンパク質は、固定化することができ、抗原を標識することができる。例えば本明細書で説明または例示される、パニングタイプのアッセイも使用することができる。
中和アッセイ
本開示のＩＬ−２３結合タンパク質の効果（または中和活性）を決定するための例示的なインビトロの方法は、ＩＬ−２３を、免疫細胞を含む細胞の集団に接触させることであり、そのときに、ＩＬ−２３は、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質の存在下、または非存在下で作用する。次いで、標準的な方法、例えば、１３Ｈチミジン取り込みまたは５，６−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）の標識またはサイトカイン分泌を使用して、細胞の増殖を測定する。タンパク質の非存在下で培養した試料と比較した、細胞増殖および／またはサイトカイン分泌の増加または減少は、ＩＬ−２３結合タンパク質が、ＩＬ−２３の活性を調節することを示す。そのような方法は、本明細書で例示される。
本開示のＩＬ−２３結合タンパク質がＩＬ−２３の中和を調節する能力を決定するための別の方法は、受容体結合アッセイである。そのような方法において、ＩＬ−２３受容体またはそれを発現する細胞が、固定化される。標識したＩＬ−２３（例えば、５０ｎｇ／ｍＬ〜１５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ等）は、次いで、試験タンパク質の存在下、または非存在下で固定化した受容体または細胞に接触させて、結合した標識の量を検出する。ＩＬ−２３タンパク質およびＩＬ−２３は、受容体に接触させる前に互いに接触させることができ、または受容体に実質的に同時に接触させることができる。ＩＬ−２３結合タンパク質の非存在下と比較したときの、ＩＬ−２３結合タンパク質の存在下で結合した標識の量の減少が、タンパク質がＩＬ−２３のＩＬ−２３Ｒへの結合を低減または防止することを示す。
複数の濃度のＩＬ−２３結合タンパク質を試験することによって、ＩＣ５０、すなわち、ＩＬ−２３Ｒに結合するＩＬ−２３の量を低減するタンパク質の濃度が決定される。一実施例において、ＩＣ５０は、約１ｎＭ以下（７５０ｐＭ以下等、例えば、５００ｐＭ以下）である。例えば、ＩＣ５０は、４００ｐＭ以下である。一実施例において、ＩＣ５０は、約１ｐＭ〜５００ｐＭ、例えば、約５０ｐＭ〜４５０ｐＭである。例えば、ＩＣ５０は、約１００ｐＭ〜４００ｐＭ、例えば、約１５０ｐＭ〜４００ｐＭである。
同様に、ＥＣ５０、すなわち、タンパク質によって達成されるＩＬ−２３のＩＬ−２３Ｒへの結合の最大阻害の５０％を達成するタンパク質の濃度を判定することができる。一実施例において、ＥＣ５０は、１ｎＭ以下（例えば、７５０ｐＭ以下、例えば、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下等）である。一実施例において、ＥＣ５０は、約３００ｐＭ以下である。例えば、ＥＣ５０は、約２６０ｐＭである。
ＩＬ−２３の活性を中和する、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質の能力を決定するための別の方法は、脾細胞を、ＩＬ−２３結合タンパク質の存在下または非存在下でＩＬ−２３と接触させて、ＩＬ−１７等のサイトカインの分泌を検出することである。タンパク質の非存在下と比較して、タンパク質の存在下でのサイトカインのレベルがより低いことが、タンパク質がＩＬ−２３の活性を中和することを示す。複数の濃度のタンパク質を試験することによって、ＩＣ５０、すなわち、サイトカイン分泌の最大阻害の５０％が起こる濃度が決定される。
複数の濃度のＩＬ−２３結合タンパク質を試験することによって、ＩＣ５０、すなわち、分泌されたサイトカイン（例えば、ＩＬ−１７）の量を低減するタンパク質の濃度が判定される。一実施例において、ＩＣ５０は、約１ｎＭ以下 （９００ｐＭ以下等、例えば、８００ｐＭ以下）である。例えば、ＩＣ５０は、７００ｐＭ以下である。一実施例において、ＩＣ５０は、約１ｐＭ〜８００ｐＭ、例えば、約５０ｐＭ〜７００ｐＭである。例えば、ＩＣ５０は、約１００ｐＭ〜７００ｐＭ、例えば、約１２０ｐＭ〜６８０ｐＭである。
同様に、ＥＣ５０、すなわち、タンパク質によって達成されるサイトカイン（例えば、ＩＬ−１７）の最大阻害の５０％を達成するタンパク質の濃度を決定することができる。一実施例において、ＥＣ５０は、１ｎＭ以下（例えば、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下等）である。一実施例において、ＥＣ５０は、約３００ｐＭ以下である。例えば、ＥＣ５０は、約２９０ｐＭである。
細胞死滅アッセイ
別の実施例において、本開示の（例えば、毒性化合物または定常領域に連結している）ＩＬ−２３結合タンパク質の能力は、細胞の死亡を誘発するそれらの能力を判定することによって評価される。Ｆｃに連結したタンパク質の場合、（例えば、ＡＤＣＣ／ＣＤＣを促進するために）免疫エフェクター細胞および／または補体の存在下でそのようなアッセイを行うことが望ましい。
インビボの治療効果アッセイ
別の実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質の活性は、ＩＬ−２３結合タンパク質を動物モデルに投与することによって決定される。例えば、ＩＬ−２３結合タンパク質を、（例えば、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９：１４５５−１４６５，２００４で説明されているように）糖尿病を抑制、予防、治療、もしくは遅延させる能力を試験するために、ＮＯＤマウスに投与し、ＧＶＨＤのマウスモデルに（例えば、Ｔｒｅｎａｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１２：１６８８−１６９６，２００２で説明されているように）投与し、乾癬のマウスモデルに（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１８（７）：２６２９−２６３９，２００８）で説明されているように）投与し、関節リウマチ、例えば、マウスのＳＫＧ株のモデル（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４２６：４５４−４６０，１９９５）、ラットＩＩ型コラーゲン関節炎モデル、マウスＩＩ型コラーゲン関節炎モデル、もしくはいくつかの種において抗原誘発性の関節炎モデル（Ｂｅｎｄｅｌｅ Ｊ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌ Ｎｅｕｒｏｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔ；１（４）：３７７−３８５，２００１）に投与し、多発性硬化症（例えば、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ））に投与し、および／または炎症気道疾患（例えば、ＯＶＡチャレンジまたはゴキブリ抗原チャレンジ）のモデルに投与する。
一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質の活性は、例えば本明細書で例示されるように、乾癬のＩＬ−２３誘発動物モデルにおいて決定される。例えば、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）に、局所化された炎症応答が誘発されるように、ＩＬ−２３を皮下投与する。タンパク質を、ＩＬ−２３の投与前または投与後に投与することによって、炎症応答を防止または治療するそれらの能力について試験する。次いで、動物を、紅斑および／もしくは硬結について評価し、および／または皮膚試料を各マウスから採集して組織学的評価のために固定する。
競合的結合アッセイ
本開示の抗体の結合を競合的に阻害するタンパク質を判定するためのアッセイが、当業者に明らかになるであろう。例えば、本開示の抗体を、検出可能な標識、例えば蛍光標識または放射性標識に抱合させる。次いで、標識した抗体および試験タンパク質を、ＩＬ−２３またはそのエピトープと混合して、接触させる。次いで、標識した抗体のレベルを決定し、タンパク質の非存在下で標識した抗体をＩＬ−２３またはエピトープと接触させたときに判定したレベルと比較する。タンパク質の非存在下と比較したときに、タンパク質の存在下で標識した抗体のレベルが減少していた場合、タンパク質は、抗体の結合を競合的に阻害している。
随意に、試験タンパク質は、抗体とは異なる標識に抱合される。これは、タンパク質またはエピトープに対する試験タンパク質の結合レベルの検出を可能にする。
別の実施例では、ＩＬ−２３を本明細書で説明される抗体と接触させる前に、試験タンパク質を、ＩＬ−２３またはその領域に結合させる。タンパク質の非存在下と比較したときの、タンパク質の存在下で結合した抗体の量の減少は、タンパク質が抗体のＩＬ−２３への結合を競合的に阻害することを示す。相互アッセイを、標識したタンパク質を使用し、最初に抗体をＩＬ−２３に結合させることで、行うこともできる。この場合、抗体の非存在下と比較したときの、抗体の存在下でＩＬ−２３に結合した標識したタンパク質の量の減少は、タンパク質が抗体のＩＬ−２３への結合を競合的に阻害することを示す。
エピトープマッピングアッセイ
別の実施例では、本明細書で説明されるタンパク質によって結合されるエピトープをマップする。エピトープマッピング法は、当業者に明らかになるであろう。例えば、関心のエピトープ、例えば１０〜１５のアミノ酸を含むペプチドを含む、ＩＬ−２３配列またはその領域に架かる一連の重複ペプチドが産生される。次いで、ＩＬ−２３結合タンパク質を、各ペプチドまたはそれらの組み合わせに接触させて、それに結合したペプチドを決定する。これは、ＩＬ−２３結合タンパク質が結合したエピトープを含むペプチドの決定を可能にする。複数の不連続なペプチドがタンパク質によって結合された場合、このタンパク質は、立体配置エピトープを結合している場合がある。
代替として、または加えて、ＩＬ−２３内のアミノ酸残基を、例えばアラニン走査変異誘発によって変異させて、タンパク質の結合を低減または防止する変異を判定する。ＩＬ−２３結合タンパク質の結合を低減または防止する任意の変異は、タンパク質によって結合されたエピトープ内にある可能性が高い。
さらなる方法は、ＩＬ−２３またはその領域を、固定化した本開示のタンパク質に結合させることと、結果として生じた複合体をプロテアーゼで消化することとを伴う。次いで、固定化したタンパク質に結合した状態のペプチドを単離し、例えば質量分析法を使用して分析して、それらの配列を決定する。
さらなる方法は、ＩＬ−２３またはその領域中の水素を重水素原子に変換することと、結果として生じたタンパク質を、固定化した本開示のタンパク質に結合させることとを伴う。次いで、重水素原子を水素に変換し、ＩＬ−２３またはその領域を単離し、酵素で消化し、例えば質量分析法を使用して分析して、重水素を含む領域を決定するが、この領域は、本明細書で説明されるタンパク質の結合によって、水素への変換から保護されている。この方法の一形態を、本明細書で例示する。
親和性アッセイ
随意に、ＩＬ−２３またはそのエピトープについて、タンパク質の解離定数（Ｋｄ）、会合定数（Ｋａ）、または親和定数（ＫＤ）を判定する。一実施例において、ＩＬ−２３結合タンパク質のこれらの定数は、放射性標識または蛍光標識したＩＬ−２３結合アッセイによって測定する。このアッセイは、標識されていないＩＬ−２３の一連の滴定の存在下で、タンパク質を、最小濃度の標識したＩＬ−２３と平衡させる。洗浄し、結合していないＩＬ−２３を除去した後に、標識の量を判定する。
親和性の測定値は、抗体の反応に対する標準的な方法、例えば、免疫アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｍｙｓｚｋａ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１：５４，２０００；Ｅｎｇｌｅｂｉｅｎｎｅ Ａｎａｌｙｓｔ．１２３：１５９９，１９９８）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、または当技術分野で知られている他の動態額的相互作用アッセイによって決定することができる。
一実施例において、定数は、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって、例えば、固定化したＩＬ−２３またはその領域でのＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用することによって測定される。例示的なＳＰＲ法は、米国特許第ＵＳ７２２９６１９号で説明されている。
半減期アッセイ
本開示によって包含されるいくつかのタンパク質は、改善された半減期を有し、例えば、修飾されていないタンパク質と比較して、それらの半減期を延長するように修飾される。改善された半減期を伴うタンパク質を判定するための方法は、当業者に明らかになるであろう。例えば、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合するタンパク質の能力が評価される。この点に関して、ＦｃＲｎの増加した結合親和性は、分子の血清半減期を増加させた（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２４２９，１９９４を参照されたい）。
本開示のＩＬ−２３結合タンパク質の半減期は、例えばＫｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４：５４２，１９９４で説明されている方法に従う、薬物動態学的研究によって測定することもできる。この方法によれば、放射性標識したタンパク質を、マウスに静脈内注射し、その血漿濃度を、例えば注射後の３分〜７２時間といった、時間の関数として定期的に測定する。このようにして得られたクリアランス曲線は、二相、すなわち、アルファ相およびベータ相となるはずである。インビボでタンパク質の半減期を決定するために、ベータ相のクリアランス速度を計算して、野生型のまたは修飾されていないタンパク質のクリアランス速度と比較する。
安定性アッセイ
本開示のＩＬ−２３結合タンパク質の安定性は、種々のアッセイのいずれかによって評価することができる。例えば、タンパク質は、例えば、熱、酸、または室温でしばらくの間（例えば、１ヵ月）貯蔵するといった条件に晒される。次いで、濁度の決定（不安定性を示す条件に晒した後の濁度の増加）、サイズ排除クロマトグラフィ、非還元ゲル電気泳動、または本明細書で説明される結合もしくは中和の試験によって、タンパク質の凝集を評価することができる。
薬学的組成物
本開示のＩＬ−２３結合タンパク質、それをコードする核酸、またはそれを発現する細胞（同意語：活性成分）は、予防的または治療的処置のための、非経口、局所、経口、もしくは局部投与、エアロゾル投与、または経皮投与に有用である。一実施例において、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質、それをコードする核酸、またはそれを発現する細胞は、静脈内または皮下投与等の非経口投与のためのものである。
投与されるタンパク質、それをコードする核酸、またはそれを発現する細胞の配合物は、選択した投与経路および配合（例えば、溶液、乳剤、カプセル）に応じて異なる。投与されるタンパク質、それをコードする核酸、またはそれを発現する細胞を含む適切な薬学的組成物は、生理学的に許容される担体において調製することができる。タンパク質の混合物も使用することができる。溶液または乳剤の場合、好適な担体としては、例えば、水溶液もしくはアルコール／水溶液、乳剤、または、食塩水および緩衝培地を含む、懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル油、または不揮発性油が挙げられる。種々の適切な水性担体が当業者に知られており、水、緩衝水、緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、デキストロース溶液、およびグリシンが挙げられる。静脈内ビヒクルは、種々の添加剤、保存剤、液体の栄養素、または電解質補充液（一般的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ，Ｅｄ．１９８０を参照のこと）を含むことができる。組成物は、随意に、生理学的条件に近づけるために、必要に応じて、ｐＨ調整剤および緩衝剤、ならびに毒性調整剤（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および乳酸ナトリウム）等の、薬学的に許容される補助物質を含有することができる。本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、当技術分野で知られている凍結乾燥および還元手法に従って、貯蔵のために凍結乾燥して、使用前に、好適な担体中で再構成することができる。
選択した媒質中の活性成分の最適な濃度は、当業者によく知られている手順に従って、経験的に決定することができ、所望の最終的な薬学的配合物に依存することになるであろう。
本開示のＩＬ−２３結合タンパク質の投与に対する投薬量の範囲は、所望の効果を産生するのに十分に大きいものである。例えば、組成物は、治療的または予防的有効量のＩＬ−２３結合タンパク質、それをコードする核酸、またはそれを発現する細胞を含む。
本明細書で使用される「有効量」という用語は、対象におけるＩＬ−２３のシグナル伝達を誘発／増加させる、または阻害／低減／防止するための、ＩＬ−２３結合タンパク質、核酸、または細胞の十分な量を意味するものと解釈されるものとする。当業者は、そのような量が、例えば、タンパク質、核酸、もしくは細胞、特定の対象、および／または治療する状態の種類もしくは重篤性に応じて変動することに気付くであろう。故に、この用語は、本開示を特定の量、例えば、タンパク質、核酸、または細胞の重量または数に限定するものと解釈されるべきではない。
本明細書で使用される「治療上有効量」という用語は、疾患の１つ以上の症状を低減または阻害するための、タンパク質、核酸、または細胞の十分な量を意味するものと解釈されるものとする。
本明細書で使用される「予防的有効量」という用語は、疾患の１つ以上の検出可能な症状の発生を防止または阻害するための、タンパク質、核酸、または細胞の十分な量を意味するものと解釈されるものとする。
投薬量は、過粘稠度症候群、肺水腫、鬱血性心不全等の副作用を引き起こすほど多くすべきではない。一般に、投薬量は、患者の年齢、状態、性別、および疾病の程度によって変動し、当業者によって判定することができる。投薬量は、任意の合併症の場合に、各医師によって調整することができる。投薬量は、１日または複数日にわたって、１回以上の用量投与において、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ等に変動させることができる。
本開示の１つ以上のタンパク質を、単独で、または別の薬物もしくは薬剤と組み合わせて（投与前、同時、または投与後）、適切な経路によって個人に投与することができる。例えば、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、タンパク質、例えば、ＴＮＦ拮抗薬、抗ＩＬ−１２／２３抗体、抗炎症剤、または鎮痛剤と組み合わせて使用することもできる。本開示のＩＬ−２３結合タンパク質は、抗生物質および／または抗微生物剤と併せて与えられる、別々に投与される組成物として使用することができる。
当業者は、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質が、本開示の発現構築体または本開示のＩＬ−２３結合タンパク質を発現する細胞を投与することによって、対象に導入されてもよいことを理解するであろう。インビボで抗体をコードする核酸を標的細胞に導入するための種々の方法を使用することができる。例えば、裸の核酸を標的部位に注射してもよく、リポソーム中にカプセル化してもよく、またはウイルスベクターによって導入してもよい。
診断アッセイ
以下のアッセイを、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質で行うことができる。
免疫アッセイは、対象の状態を診断するための、または試料中のＩＬ−２３を検出するための、例示的なアッセイ形式である。本開示は、ウエスタンブロット法、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光結合免疫吸着アッセイ（ＦＬＩＳＡ）、競合アッセイ、放射免疫アッセイ、ラテラルフロー免疫アッセイ、フロースルー免疫アッセイ、電気化学発光アッセイ、比濁分析に基づくアッセイ、濁度に基づくアッセイ、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づくアッセイを含む、あらゆる形態の免疫アッセイを企図する。
好適な免疫アッセイの１つの形態は、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＬＩＳＡである。
１つの形態において、そのようなアッセイは、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質を、例えばポリスチレンもしくはポリカーボネート製のマイクロウエルもしくはディップスティック、膜、またはガラス支持体（例えば、ガラススライド）等の、固体マトリクス上に固定化することを伴う。次いで、試験試料を、ＩＬ−２３結合タンパク質と直接接触させて、試料中の任意の抗原を結合させるか、または捕捉する。洗浄し、試料中のあらゆる非結合タンパク質をも除去した後に、別個のエピトープにおいてＩＬ−２３に結合する（例えば、ＩＬ−２３ｐ１９またはＩＬ−１２ｐ４０と結合する）タンパク質を、捕捉した抗原と直接接触させる。この検出タンパク質は、一般に、例えば酵素（西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、またはβ−ガラクトシダーゼ等の、検出可能なレポーター分子で標識される。代替として、検出タンパク質に結合する、第２の標識したタンパク質を使用することができる。洗浄し、あらゆる結合していないタンパク質をも除去した後に、過酸化水素、ＴＭＢもしくはトルイジン、または５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｘ−ｇａｌ）等の基質の添加によって、検出可能なマーカーを検出する。当然、逆の様式で、固定化した（捕捉）タンパク質および検出タンパク質を使用しもよい。
次いで、既知の数のマーカーを使用して、または対照試料との比較によって生成した標準曲線を使用して、試料中の抗原のレベルを決定する。
ＦＬＩＳＡの場合、試料中の標識したタンパク質のレベルを決定するために、酵素ではなく蛍光標識が使用される。
上記で説明したアッセイは、検出の基準として化学発光または電気化学発光を使用するように、容易に改良される。
当業者に明らかになるように、免疫吸着アッセイに基づく他の検出法が、本開示の機能において有用である。例えば、免疫吸着法は、検出のための放射性標識、検出のための金標識（例えば、コロイド状金）、検出のための例えばＮＡＤ＋をカプセル化したリポソーム、またはアクリジニウム連結免疫吸着アッセイを使用する、前掲の説明に基づく。
本開示のいくつかの実施例において、ＩＬ−２３のレベルは、表面プラズモン共鳴検出器（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標），ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、フロースルーデバイス（例えば、米国特許第ＵＳ７２０５１５９号で説明されているもの）、マイクロまたはナノ免疫アッセイデバイス（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００３０１２４６１９号で説明されているもの）、ラテラルフローデバイス（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００４０２２８７６１号または米国特許出願公開第ＵＳ２００４０２６５９２６号で説明されているもの）、蛍光偏光免疫アッセイ（ＦＰＩＡ：例えば、米国特許第ＵＳ４５９３０８９号または米国特許第ＵＳ４７５１１９０号で説明されているもの）、または免疫比濁アッセイ（例えば、米国特許第ＵＳ５５７１７２８号または米国特許第ＵＳ６２４８５９７号で説明されているもの）を使用して決定される。
撮像法
上述のことから当業者に明らかになるように、本開示は、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質を使用した、撮像法も企図する。撮像のために、タンパク質は、一般に、検出可能な標識に抱合され、この標識は、撮像によって検出可能である、信号を発することができるあらゆる分子または薬剤とすることができる。しかしながら、本開示のＩＬ−２３結合タンパク質に特異的に結合する、標識した二次的化合物が使用されてもよい。例示的な検出可能な標識としては、タンパク質、放射性同位体、フルオロフォア、可視光発光フルオロフォア、赤外発光フルオロフォア、金属、強磁性体、電磁放射物質、特異的磁気共鳴（ＭＲ）分光学的シグネチャを伴う物質、Ｘ線吸収もしくは反射物質、または音響変更物質が挙げられる。
本開示のＩＬ−２３結合タンパク質（および、使用する場合、標識した二次的化合物）は、撮像手順の前に、撮像する臓器または組織（もしくは、癌の場合は腫瘍）に、全身的または局所的に投与することができる。一般に、ＩＬ−２３結合タンパク質は、腫瘍、組織、または臓器の所望の光学画像を達成するのに十分な用量で投与される。そのような用量は、用いられる特定のタンパク質、撮像される状態、撮像手順を受ける組織もしくは臓器、使用されている撮像装置等に依存して、大きく変動し得る。
本開示のいくつかの実施例において、ＩＬ−２３結合タンパク質は、腫瘍の撮像、臓器の断層撮像、臓器機能の観察、冠状血管造影、蛍光内視鏡検査、レーザ誘導手術、光音響法、および音響蛍光法等が挙げられるが、これらに限定されない、種々の生医学的応用において、組織および臓器のインビボでの光学的造影剤として使用される。
撮像法の例としては、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）、ＭＲ分光法、放射線写真撮影、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波、平面ガンマカメラ撮像、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、他の核医学に基づく撮像、可視光を使用した光学的撮像、ルシフェラーゼを使用した光学的撮像、フルオロフォアを使用した光学的撮像、他の光学的撮像、近赤外光を使用した撮像、または赤外光を使用した撮像が挙げられる。
いくつかの実施例において、造影剤は、ヒトで使用する前に、インビトロまたはインビボのアッセイを使用して、例えば本明細書で説明されるモデルを使用して試験される。
試料および対照試料
当業者に明らかであるように、本明細書で説明される実施例のいくつかは、ＩＬ−２３のレベルを決定するために、ある程度の定量化を必要とする。そのような定量化は、好適な対照試料を本開示のアッセイに含めることによって決定され得る。
一実施例において、好適な対照試料は、健康な対象または正常な対象から得られる試料である。
この文脈において、「健康な対象」という用語は、ＩＬ−２３と関連する疾患、例えば炎症性疾患に罹患していないことが分かっている、個人を意味するものと解釈されるものとする。
「正常な対象」という用語は、個人の集団と比較して、試料中のＩＬ−２３のレベルが正常である個人を意味するものと解釈されるものとする。
本開示は、正常および／もしくは健康な対象、または正常および／もしくは健康な対象の集団から得られるデータセットとしての、対照試料も企図する。
一実施例において、本開示の方法は、例えば本明細書で説明される方法を使用して、対照試料のＩＬ−２３のレベルを決定することをさらに含む。
一実施例において、対象からの試料および対照試料は、ほぼまたは実質的に同時に検定される。
一実施例において、対象からの試料および対照試料は、結果の比較を可能にするために、任意の１つ以上の実施形態において本明細書で説明されるような、同じ本開示の方法を使用して検定される。
疾患
本開示の方法を行うことによって治療／予防／診断／予後診断され得る例示的な疾患としては、炎症性疾患、ＧＶＨＤ、感染、および癌が挙げられる。
例示的な炎症性疾患としては、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（硬皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、類肉腫症、自己免疫溶血性貧血（免疫汎血球減少症、発作性夜行性血色素尿症）、自己免疫血小板減少症（特発性血小板減少紫斑病、免疫介在性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫介在性腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、多発性硬化症等の中枢および末梢神経系の脱髄性疾患、特発性多発性神経障害、感染性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎および他の非肝親和性（ｎｏｎｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｃ）ウイルス）自己免疫慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、硬化性胆管炎等の肝胆汁性疾患、炎症性および線維性肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）、グルテン過敏性腸症、ウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形紅斑、および接触皮膚炎を含む自己免疫または免疫介在性皮膚疾患、乾癬、好酸球性肺炎等の肺のアレルギー性疾患、特発性肺線維症、ならびに過敏性肺炎が挙げられる。
例えば、炎症性疾患は、炎症性関節炎（例えば、ＲＡまたは若年性慢性関節炎）である。
別の実施例において、炎症性疾患は、炎症性神経性状態、例えばミエリン会合状態、例えば多発性硬化症である。
別の実施例において、炎症性疾患は、炎症性皮膚疾患（例えば、自己免疫または免疫介在性皮膚疾患）、例えば、水疱性皮膚疾患、多形紅斑、接触皮膚炎である。あるいは、皮膚疾患は、乾癬である。
別の実施例において、炎症性疾患は、炎症性粘膜疾患、例えば、腸の炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患、クローン病、または潰瘍性大腸炎）または肺の炎症性疾患（例えば、気道過敏症または喘息）である。
一実施例において、疾患は、ＴＨ１７細胞媒介疾患である。本明細書で使用される「ＴＨ１７細胞媒介疾患」という用語は、ＴＨ１７細胞の過剰な数または活性を特徴とする、またはそれによって引き起こされるあらゆる状態を意味するものと解釈されるものとする。当業者は、ＴＨ１７細胞が、ＩＬ−１７を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞であることに気付くであろう。例示的なＴＨ１７細胞媒介疾患としては、自己免疫／炎症性疾患（例えば、乾癬、炎症性腸疾患、関節炎（例えば、関節リウマチ）、多発性硬化症、および炎症性腸疾患（例えば、クローン病））、および移植片対宿主疾患が挙げられる。
一実施例において、疾患は、乾癬である。
別の実施例において、疾患は、クローン病である。
さらなる実施例において、疾患は、多発性硬化症である。
一実施例において、多発性硬化症は、再発寛解型多発性硬化症であり、ＩＬ−２３結合タンパク質または抗体は、再発の防止によって寛解期にある状態の間に投与される。
キット
本開示は、
（ｉ）本開示のＩＬ−２３結合タンパク質またはそれをコードする発現構築体、
（ｉｉ）本開示の細胞、または
（ｉｉｉ）本開示の薬学的組成物、
のうちの１つ以上を含む、キットをさらに含む。
ＩＬ−２３を検出するためのキットの場合、キットは、例えば本開示のＩＬ−２３結合タンパク質に連結される、検出手段をさらに含むことができる。
治療／予防的使用のためのキットの場合、キットは、薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含むことができる。
随意に、本開示のキットは、任意の実施形態に従って本明細書で説明される方法で使用するための説明書とともに包装される。
本開示は、以下の限定的でない実施例でさらに説明される。
一般的な方法
ＨＥＫ２９３／ｐＴＴ５発現系
ＨＥＫ２９３Ｅ／ｐＴＴ５発現系を伴う全ての形質移入について、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞は、完全な細胞成長培地（１ＬのＦ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））、９ｍＬのＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））、５０μＬ／１００ｍＬの培養液にジェネティシン（５０ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））とともに２０％（ｗ／ｖ）のトリプトンＮＩ（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ（商標））を含有する２ｍＭのグルタミン）中で培養した。簡潔に述べると、形質移入の前日に、遠心分離によって細胞を採取して、ジェネティシンを伴わない新鮮な培地中に再懸濁した。次の日、製造業者の指示に従って、ＤＮＡおよびＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ）を含む形質移入混合物の滴下によって細胞に形質移入した。形質移入した培養物を、穏やかに振盪（１２０ｒｐｍ）しながら、３７℃、５％のＣＯ２で、一晩インキュベートした後、トリプトンおよびジェネティシン（５００ｍＬの培養液容積あたり、それぞれ、１２．５ｍＬおよび２５０μＬ）を添加した。次の日、５００ｍＬの培養液あたり１２．５ｍＬのトリプトンおよび２５０μＬのジェネティシンを添加した。培養物を、７日間にわたって３７℃、５％のＣＯ２、および１２０ｒｐｍでインキュベートし、次いで、上澄みを採取して精製した。
ＩＬ−２３タンパク質
ヒトＩＬ−２３（ＩＬ−２３ｐ１９（配列番号２）に共有的に連結されたＩＬ−１２ｐ４０（配列番号１）を含む）を購入した（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｒ ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。代替として、ＩＬ−２３、ＩＬ−１２ｐ４０、およびＩＬ−２３ｐ１９は、上記で説明したように、ＤＮＡ発現構築体の形質移入を通して、哺乳類のＨＥＫ２９３Ｅ／ｐＴＴ５発現系中で産生した。以下のタンパク質を産生した。
Figure 2013535191
分泌タンパク質を含む培養上清を、２０００ｘｇで１０分間の遠心分離で、細胞を除去することによって採取した。ＨＩＳタグを含むタンパク質を、ＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｈｉｓ８親和性タグを介して、上清から精製した。Ｆｃ領域を含むタンパク質を、抗体の生成のために、下記で説明されるようなタンパク質Ａクロマトグラフィを使用して精製した。溶出したタンパク質は、濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して、脱塩を介して、またはサイズ排除クロマトグラフィを介して、ＰＢＳに緩衝剤交換した。
ファージディスプレイについて、組み換えヒトＩＬ−２３ＡｖｉＨＩＳのＡｖｉｔａｇ（商標）配列を、酵素ＢｉｒＡを使用してビオチン化した。これは、ＡｖｉＴａｇ配列中のアミノ酸を含む単一のアミンにおいて特異的ビオチン化をもたらした。遊離ビオチンを、３．５ｋＤａの分子量カットオフで、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用したＰＢＳに対する透析によって、または脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、タンパク質調製物から除去した。
抗体を発現するベクターの構築
重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列を、コンピュータで、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ１定常領域（例えば、ＮＣＢＩ登録番号Ｐ０１８５７．１を参照されたい）上に構成した。同様に、軽鎖可変領域配列を、コンピュータで、親可変領域のアイソタイプに従って、ヒトカッパまたはラムダ定常領域（例えば、ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＩ１０３９５（カッパ）およびＡＡＩ０７８５３（ラムダ）を参照されたい）上に構成した。その後、アミノ酸配列を、ＤＮＡ配列（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に逆翻訳した。結果として生じた遺伝子を、合成オリゴヌクレオチド（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のアセンブリによって新たに合成した。その後、重鎖および軽鎖遺伝子は、それぞれ、重鎖または軽鎖のリーダー配列（それぞれ、配列番号８１および８２）を含む、発現ベクターｐＴＴ５の変異体（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０，Ｅ９，２００２）にクローン化した。
抗体の発現および精製
上記で説明したように、抗体を、形質移入試薬ＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ｐＴＴ５プラスミドを含む重鎖および軽鎖の共形質移入を通して、細胞系ＨＥＫ２９３Ｅ中に産生した。７日後、上清を遠心分離によって採取して、ｐＨ７．４に調整した後、ＨｉＴｒａｐ（商標）タンパク質Ａカラム（５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に装填した。カラムを、５０ｍＬの１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。ｐＨ２．５、０．１Ｍのクエン酸を使用して溶出を行った。溶出した抗体を、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に脱塩した。抗体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析した。抗体の濃度を、製造業者の指示に従って、ＢＣＡアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定した。
ＥＬＩＳＡによる抗体のＩＬ−２３への結合の検出
ＮｕｎｃＭａｘｉｓｏｒｐ９６−ウエルプレートを、炭素塩被覆緩衝剤中で１μｇ／ｍＬに希釈したヒトＩＬ−２３で被覆して、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄（１ｘＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）中で３回）し、次いで、室温で、ＰＢＳ中１％のＢＳＡで１時間遮断した。ビオチン化された抗体を１０μｇ／ｍＬから始めて調製し、連続半対数希釈を行い、次いで１００μＬをプレートに添加して、１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１：２０００希釈のストレプトアビジン−ＨＲＰを全てのウエルに添加して、さらに１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）を使用して、その後現像した。等量の１Ｍ ＨＣｌを添加することによって、発色現像反応を停止させた。プレートに基づく分光光度計を使用して、結果として生じた反応物の吸光度を測定した。
ＩＬ−２３結合抗体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００を使用して、タンパク質Ａ（Ｐｉｅｒｃｅ）を、３０００応答単位（ＲＵ）が得られるように、アミン連結化学を使用してＣＭ５チップ上に固定化した。抗体を、フローセル２または４の表面に捕捉し、フローセル１または３を対照表面とした。ヒトＩＬ−２３を、双方のフローセルに通過させて、応答単位を測定した。次いで、表面を、ｐＨ２．５で１０ｍＭのグリシンで再生した。動態学的実行について、このプロセスを５つのＩＬ−２３希釈物で繰り返した。ｋａ、ｋｄ、およびＫＤを判定するために、１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ式を使用して適合させる前に、データを、ランニング緩衝剤の注射を使用して二重参照した。
ネズミ脾細胞におけるＩＬ−２３誘発性のＩＬ−１７産生の抗体阻害
脾臓を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得て、最初に、脾臓を均質化し、続いて、ＮＨ４Ｃｌを使用して赤血球を溶解させることによって準備した。次いで、脾細胞を、培地（ＲＰＭＩ、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬグルタミン、１００ＵのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中で、再懸濁および遠心分離によって洗浄した。抗体を十分な培養培地で希釈して、９６−ウエルプレート全体の滴定曲線を作成した。１００ｎｇ／ｍＬをヒトＩＬ−２３（ＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を各ウエルに添加し、５％のＣＯ２湿度で、３７℃で１時間インキュベートした。細胞をウエルに添加し、ウエルあたり２００μＬの総容積で、１ｍＬあたり５×１０６個の細胞濃度を得た。培養物を、５％のＣＯ２湿度で、３７℃で４日間インキュベートした。インキュベーションの終了後、上清を採取し、ネズミＩＬ−１７用のＤｕｏｓｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、産生したネズミＩＬ−１７を検出した。
ＩＬ−２３に特異的に結合するモノクローナル抗体の産生
ハイブリドーマの生成
ヘテロ二量体ＩＬ−２３に対するモノクローナル抗体を、対応する従来のラットのタンパク質免疫化による遺伝子免疫化によって産生した。遺伝子免疫化について、ヒトＩＬ−２３のＤＮＡ配列（１つのプロモーターからの分子の発現を促進するように、ＧＳリンカーを含む；配列番号５）を、制限酵素技術を使用して、遺伝子免疫化のためにプラスミドにクローン化した。結果として生じたプラスミドは、Ｎ末端またはＣ末端でｃ−ｍｙｃエピトープによってタグ付けされた、可溶性ＩＬ−２３の分泌を可能にする。可溶性ＩＬ−２３の発現を確認するために、ｃ−ｍｙｃエピトープを利用した。
次いで、ラットを、公開されている手順（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １７：５６９−５７６，１９９８）に従って、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子銃（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、プラスミドで６回免疫化した。免疫化プラスミドの最後の適用の１週間後に、各ラットを、組み換えヒトＩＬ−２３タンパク質（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の皮内注射によって追加免疫した。
４日後に、ラットを死亡させ、それらのリンパ球を、ポリエチレングリコール（ＨｙｂｒｉＭａｘ（商標）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して骨髄腫細胞と融合させ、１ウエルあたり１００，０００個の細胞を９６−ウエルマイクロタイタープレートに播種し、ハイブリドーマ選択のために１０％のウシ胎児血清およびＨＡＴ添加剤（前掲のＫｉｌｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を補充したＤＭＥＭ中で成長させた。
抗体特異性に対するハイブリドーマのスクリーニング
完全長の天然ＩＬ−２３（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、９６−ウエルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）上に被覆した。各ハイブリドーマ由来のハイブリドーマ上清を、ＩＬ−２３を被覆したウエルに添加し、結合した抗体を、呈色反応を促進するＨＲＰ抱合体を伴うネズミ（ラット）抗体に特異的な二次抗体を使用して検出した。ＩＬ−２３に対して陽性結合を示したハイブリドーマを、限界希釈法を介してサブクローン化し、この細胞を、培養倍地で希釈し、１ウエルあたり細胞１個未満の比率で、新鮮な９６−ウエルプレート中に入れた。クローンを回収した後に、ハイブリドーマ上清に対してさらなるＥＬＩＳＡを行った。
抗ＦＬＡＧＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、一晩ＥＬＩＳＡプレート上に被覆した。次いで、これらのプレートを、ＦＬＡＧタグ付けしたＩＬ−２３ｐ１９、ＦＬＡＧタグ付けしたＩＬ−１２ｐ４０、およびＦＬＡＧタグ付けしたＩＬ−２３を個々に捕捉するために使用した。クローンからのハイブリドーマ上清を添加し、ＩＬ−２３への結合については陽性であるが、ＩＬ−１２ｐ４０またはＩＬ−２３ｐ１９については陽性でないハイブリドーマを拡大させた。
ＩＬ−２３ヘテロ二量体特異性を伴うラット抗体Ｅ１１Ｅ７の特定および分子の特徴付け
前述の免疫化およびスクリーニング方法を使用したところ、スクリーニングした約８３のハイブリドーマの中の１つのラットハイブリドーマが、ＩＬ−２３には強く結合したが、ＩＬ−１２ｐ４０またはＩＬ−２３ｐ１９には有意に結合しなかった抗体を分泌した。Ｅ１１Ｅ７と称されるこの抗体を、Ｅ１１Ｅ７発現ハイブリドーマ細胞から単離したＲＮＡを使用して、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって配列決定した。簡潔に述べると、製造業者のプロトコルに従って、ＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ）を使用して、ＲＮＡを調製した。その後、ＡｃｃｕＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、１００〜２００ｎｇのＲＮＡから合成したｃＤＮＡを、ＰＣＲのテンプレートとして使用した。Ｎｏｖａｇｅｎ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔからのプライマーを使用して、基本的に製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の指示に従って、ポリメラーゼＵｌｔｒａＰｆｕＩＩ−ＨＳを使用して、推定のＥ１１Ｅ７重鎖および軽鎖配列をｃＤＮＡから増幅した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒおよび以下の循環パラメータを使用して、サーモサイクリングを行った。

（９４℃で２分）１サイクル、続いて、
（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で４５秒）３０サイクル、続いて
（７２℃で５分）１サイクル
アガロースゲル（０．７〜１．０％）上での電気泳動に続いて、ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して切除し、浄化した。７２℃で１５分間の、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））およびｄＡＴＰのインキュベーションを通して、Ａテーリングを行った。次いで、Ａテーリングを行ったＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に結合させ、製造業者の指示に従って、ＴＯＰ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））に形質転換した。ベクター特異的プライマーを使用した形質転換体のＰＣＲスクリーニングで、約５００ｂｐの挿入物を含有するプラスミドを保有するクローンを特定した。その後、プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（ＱＩＡｇｅｎ）を使用して挿入物含有クローンから単離して、配列決定した（ＡＧＲＦ，Ｂｒｉｓｂａｎｅ）。次いで、可変重鎖（配列番号６）および可変軽鎖（配列番号１１）のヌクレオチド配列を、一次アミノ酸配列に翻訳した（ＶＨについて配列番号７、およびＶＬについて配列番号１２）。
ラットＥ１１Ｅ７重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列をヒトの定常領域上に構成することを通して、ラット−ヒトキメラ抗体を生成した。逆翻訳に続いて遺伝子を合成し、その後、一般的な方法で説明したように、発現ベクターｐＴＴ５にクローン化した。ＶＨのヌクレオチド配列は、配列番号１９に記載の配列を含む。ＶＬのヌクレオチド配列は、配列番号１８に記載の配列を含む。これらの完全長重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２０および２１で与えられる。
Ｅ１１Ｅ７キメラをビオチン化し（Ｐｉｅｒｃｅ ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）、一般的な方法で説明したＥＬＩＳＡ手法を使用して、ＩＬ−２３Ｆｃ、ＩＬ−２３ｐ１９Ｆｃ、ＩＬ−１２ｐ４０Ｆｃ、およびネズミＩＬ−２３（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）への結合についてスクリーニングした。ビオチン化したＥ１１Ｅ７キメラは、ＩＬ−２３には強く結合したが、それぞれのサブユニットまたはネズミＩＬ−２３にはほとんどまたは全く結合を示さなかった（図１）。これは、Ｅ１１Ｅ７キメラが、ヒトＩＬ−２３複合体に特異的であるが、それぞれのサブユニットに対しては特異的ではないことを実証した。
Ｅ１１Ｅ７のエピトープのマッピング
抗体が結合するＩＬ−２３上の場所を決定するために、Ｅ１１Ｅ７キメラに対してエピトープマッピングを行った。水素／重水素交換実験（本質的に、米国特許第ＵＳ６７９７４８２Ｂ２号で説明されているように）を使用して、Ｅ１１Ｅ７への結合に関与するＩＬ−２３の臨界領域を特定した。溶液中で、ＩＬ−２３において水素を重水素に交換した。次いで、この重水素化したＩＬ−２３に、溶液中でＥ１１Ｅ７キメラのＦＡｂ断片を結合させた。抗体と接触し、したがって、交換から保護されたＩＬ−２３の領域を除いて、複合体を交換して水素に戻した。次いで、ＩＬ−２３抗体複合体を消化させ、質量分光法を介して分析して、重水素を含む領域を特定した。以下の結果が得られた。
Figure 2013535191
この分析に使用した配列は、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットについては配列番号１に対応し、ＩＬ−２３ｐ１９サブユニットについては配列番号２に対応する。
各個々のサブユニットについて、平均±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）の重水素のパーセント差を、最小の重水素含量を伴うペプチドの５０％にわたって計算した。平均＋３Ｓ．Ｄ．よりも大きい値を有意であるとした。ｐ４０サブユニット全体の平均（５０％）＋３Ｓ．Ｄ．の重水素のパーセント差は、１０．２％であった。ｐ１９サブユニット全体の平均（５０％）＋３Ｓ．Ｄ．の重水素のパーセント差は、１８．１％であった。重水素の差のパーセントが平均（５０％）±３Ｓ．Ｄ．よりも大きかった重複ペプチド配列を、表３において太字で強調する。これらのデータは、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−２３ｐ１９の残基が、Ｅ１１Ｅ７キメラの結合時に重水素交換から保護されたことを示す。
最大の重水素含量を伴うペプチド（ｐ４０：１３５〜１５３、ｐ１９：１１２〜１４４）を、ＩＬ−２３の結晶構造にマップした（図２）。直径が約５０オングストローム（結晶構造３ＨＭＸ全体で測定）である抗体のＦＡｂアームは、ｐ４０およびｐ１９の強調した領域内で、原子間の２５オングストロームの間隔全体で十分に結合することができた。
Ｅ１１Ｅ７キメラは、ＩＬ−２３のＩＬ−２３Ｒへの結合を阻害する
ｈＩＬ−２３Ｒ−ＨＩＳを、炭酸塩被覆緩衝剤で１μｇ／ｍＬに希釈し、９６−ウエルプレートの各ウエルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを３回洗浄した。次いで、２００μＬの遮断緩衝剤を添加し、プレートを２５℃で１時間インキュベートすることによってウエルを遮断した。Ｅ１１Ｅ７キメラまたは抗ｐ４０抗体を、１０μｇ／ｍＬから始まる滴定曲線を作成するのに十分な抗体希釈剤で希釈した。ビオチン化したｈＩＬ−２３（Ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、抗体希釈剤で１００ｎｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。ｈＩＬ−２３を、深ウエル容器中で２時間、抗体とともに前保温した。上で説明したようにプレートを洗浄し、その後、ウエルを２５℃で２時間、抗体／ｈＩＬ−２３溶液でインキュベートした。次いで、上で説明したようにプレートを洗浄し、抗体希釈剤中１：５０００の１００μＬのストレプトアビジンＨＲＰ（ＢＤ Ｐｈａｍｉｎｇｅｎ）を使用して、結合したビオチン化したサイトカインを検出した。２５℃で１時間インキュベートした後に、上で説明したようにプレートを再度洗浄した。１００μＬのＴＭＢ基質溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、各ウエルに添加し、１５分間発色現像させた。１００μＬの１Ｍ ＨＣｌを添加して発色現像反応を停止させ、４５０ｎｍ（参照波長６２０ｎｍ）で吸光度を判定した。
Ｅ１１Ｅ７は、試験した最高濃度においてＩＬ−２３がＩＬ−２３Ｒに結合するのを阻害することができなかった抗ｐ４０と比較したときに、ＩＬ−２３がＩＬ−２３Ｒに結合するのを阻害することができた（図２）。
Ｅ１１Ｅ７は、インビトロで強力な阻害剤でありかつＩＬ−２３生物活性である
ＳＰＲアッセイにおいて、Ｅ１１Ｅ７キメラの親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００の感度を超え、１００ｐＭ未満のＫＤを有する。Ｅ１１Ｅ７およびそのキメラであるＥ１１Ｅ７キメラを、ネズミ脾細胞アッセイを使用して、それらのＩＬ−２３中和能力についてスクリーニングした。どちらの抗体も、ヒトＩＬ−２３誘発性のネズミＩＬ−１７分泌の強力な中和を示した（図４）。これらの結果は、ヘテロ二量体複合体には結合するが、ＩＬ−２３の個々のサブユニットには結合しない抗体が、ＩＬ−２３生物活性の強力な中和剤であることを実証する。
Ｅ１１Ｅ７キメラは、乾癬のＩＬ−２３駆動ネズミモデルにおいて有効である
Ｃ５７Ｂl／６ＪマウスをＩＬ−２３の背中への皮内投与で６日間処置したところ、紅斑および硬結を特徴とする限局性の炎症性応答を誘発し、表皮過形成、不全角化症、および限局性の炎症性浸潤を伴った。サイトカイン処置を開始する前日に、単回投薬で炎症性応答を減少させる抗体の能力について抗体を試験した。サイトカイン注射を開始する前日に、Ｅ１１Ｅ７キメラ、ヒトｐ１９特異的抗体（米国特許第ＵＳ７８０７１６０号による抗体７Ｇ１０）、またはアイソタイプ対照抗体を、１０ｍｇ／ｋｇの用量の単回腹腔内注射で与えた。マウスを、試験領域の紅斑および硬結について毎日評点した。全ての処置および観察は、盲検で行った。研究の終了時に、各マウスから皮膚試料を採集し、標準的なプロトコルによって、組織学的処理ならびにマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のために固定した。
表皮厚さの値は、各マウスからの皮膚の各部の低電力画像の紙コピーを印刷することによって決定した。各画像上の皮膚区画を、３つの垂直線を使用して４つの四半部に分割した。次いで、表皮厚さを、四半部を描画するために使用した３つの線の交差点で測定し、すなわち、写真１枚あたり３つの測定値を測定した。次いで、各画像に対してスケールを使用して、ｍｍである実際の距離をマイクロメートルに変換した。毛嚢または汗腺等の表皮厚さを表していないとみなされる領域と測定地点が交差した場合は、その測定地点を皮膚の隣接する区画に調整した。測定は、２つの独立した観察者によって盲検で行った。
Ｅ１１Ｅ７キメラおよび抗ｐ１９を受け取ったどちらの群も、アイソタイプ対照と比較して、５日目から臨床スコアが減少し、この研究における抗体の有効性を実証した（図５Ａ）。また、Ｅ１１Ｅ７キメラが、６日目から抗ｐ１９抗体を超える改善された有効性を示すことも観察された。
Ｅ１１Ｅ７キメラおよび抗ｐ１９抗体は、アイソタイプ対照と比較して、統計的に有意な表皮厚さの減少を示した（図５Ｂ）。Ｅ１１Ｅ７キメラによる処置は、抗ｐ１９抗体による処置よりも大幅に減少した表皮厚さをもたらした。これは、臨床的スコアと十分に相関し、このネズミの乾癬モデルにおいて試験したときに、Ｅ１１Ｅ７キメラが抗ｐ１９抗体よりも強力なＩＬ−２３の阻害剤であることを実証する。
ラット抗体Ｅ１１Ｅ７のヒト化
Ｓｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ（商標）（米国特許公開第ＵＳ２００３／００３９６４９号）および３次元モデリング（Ｌｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：１３５−１５９，２００４）並行方策を用いて、ラットＥ１１Ｅ７抗体のＣＤＲを支持することが可能な好適なヒトフレームワークを選択した。
３次元モデリングを使用したヒトフレームワーク受容体の選択
ラットのＶＨおよびＶＬの独立した３次元モデルを、結晶構造のデータベース（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｐｄｂ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｗｐｄｂ．ｏｒｇ）およびソフトウェアパッケージのＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏｖ３．０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ（商標）、米国）を使用して構成した。簡潔に述べると、結晶構造情報を伴う、類似する（相同性が７０％を超える）ポリペプチド配列の抗体を特定するために、ラットの重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれかを使用して、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）の検索によって、タンパク質データバンクデータベースを確認した。その後、これらの構造を使用して、ラットの可変領域によって共有されるアミノ酸の相同性および特定した結晶構造の相同性に基づいて、相同性モデルを構築した。
ラットのＶＨおよびＶＬモデルを使用して、どのフレームワーク領域のアミノ酸が、ＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用する可能性が高く、したがって、ヒト化抗体の最適な活性のために、選択したヒト受容体に保存する必要性が高いかを予測した。また、これらのモデルを使用して、それらのフレームワークと齧歯動物の抗体のフレームワークとの構造的相同性に基づいて、タンパク質データバンクから、好適なヒトのＶＨおよびＶＬ受容体のフレームワークを特定した。正しい重鎖および軽鎖の対形成を確実にするために、同じ抗体結晶構造のＶＨおよびＶＬヒト受容体フレームワークを、ヒト化プロセスによって進展させた。、齧歯動物−ヒトの重鎖フレームワーク領域との構造的相同性を有するヒト受容体抗体を、より良好な齧歯動物−ヒトの軽鎖フレームワークの相同性を有するヒト受容体抗体よりも好ましいものとした。ラットの抗体Ｅ１１Ｅ７について、選択したヒト受容体フレームワークは、ｐｄｂ登録コード３Ｂ２Ｕ、３Ｌ５Ｙ、１Ｕ６Ａ、および１ＱＬＲであった。選択したフレームワークのうち、３Ｌ５Ｙおよび１Ｕ６Ａは、ヒト生殖細胞系配列に対して複数のアミノ酸残基の変化を含むので、進展させなかった。
ラットＥ１１Ｅ７のＳｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ（商標）
簡潔に述べると、カノニカル構造を、それらのそれぞれのアミノ酸配列の検査を通して、ラットＥ１１Ｅ７重鎖および軽鎖に割り当てた。Ｅ１１Ｅ７は、カノニカル構造３−１−１／１−１（ＶＬ／ＶＨ）を割り当てた。同じカノニカル構造を共有するヒト生殖細胞系配列を、ドナーＣＤＲを移植するための受容体フレームワークとして使用した。
ヒト化データの要約
ヒト化プロセスの結果として、２２のヒト化抗体を産生して、ヒトＩＬ−２３と結合するそれらの能力について試験した（表４）。簡潔に述べると、２２のヒト化抗体の２ｍＬの形質移入を、ＳＰＲを介して抗体発現レベルおよび結合活性についてスクリーニングした。タンパク質Ａを、アミン結合を使用して、ＣＭ５ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＧｒａｄｅセンサチップのＦＣ１およびＦＣ２（または代替として、ＦＣ３およびＦＣ４）に固定化して、約３０００ＲＵを得た。ＦＣ１を、実験の全体を通してブランクとして使用した。実験は、ＨＢＳ−Ｐ緩衝剤（ＳＰＲ）中で実行した。抗体含有細胞培養上清を、１０ｘＨＢＳ−Ｐ緩衝剤で、９：１の比率で希釈した。希釈した抗体を、２０μＬ／分の流量でＦＣ２に注入した。ＦＣ１およびＦＣ２の双方全体で５分の解離時間、動態学的注射として５ｇ／ｍＬの濃度で、ＩＬ−２３（ＨＥＫ２９３Ｅ由来）に両ＦＣの表面を通過させた。表面の再生を、１０ｍＭ、ｐＨ１．５のグリシンを使用して行った。ＦＣ２からのセンサグラムデータは、ＦＣ１および緩衝剤だけの対照から減じた。５０ＲＵよりも大きいレベルで捕捉し、かつ０．１を超えるＩＬ−２３捕捉／抗体捕捉比率を有する抗体をスケールアップし、さらなる試験のために精製した。
各抗体の可変重鎖および軽鎖の配列番号を、選択した試験抗体のｋｄ（オフレート）とともに表４に示す。
Figure 2013535191
全ての試験したヒト化抗体は、表面プラズモン共鳴を介して、ＩＬ−２３への結合を示した（表４）。抗体１−４、６−２２、８−２２、２０−４、９−２２、および２１−４を、ＩＬ−２３への結合について、ＥＬＩＳＡで試験した（図６）。試験した全ての抗体が、Ｅ１１Ｅ７キメラへの結合に類似したＩＬ−２３への結合を示した。これらのデータで、ヒト化Ｅ１１Ｅ７抗体における結合活性の良好な保持が確認される。
ヒト化抗体およびＥ１１Ｅ７のＶＨおよびＶＬの配列を図７に示す。また、この図は、保存／同一性およびコンセンサス配列の領域を示す。
いくつかの抗体を、Ｂｉａｃｏｒｅを介して、それらがＩＬ−２３に結合する能力についてさらに試験した（表５）。試験したヒト化抗体の５つのうち４つが、ピコモル単位の親和性（ＫＤ）で、ＩＬ−２３と結合した。抗体は、Ｅ１１Ｅ７キメラと比較したときに、より速いオフレートを有した。
Figure 2013535191
ＩＬ−２３に対するヒト化抗体の特異性
表５に提示される結果に基づいて、選択的にＩＬ−２３に結合するそれらの能力についてさらにスクリーニングするために４つの抗体を選択した。ＥＬＩＳＡによって示されるように、抗体２１−４、８−２２、６−２２、および２０−４は、全て、ＩＬ−２３に特異的に結合したが、ＩＬ−１２ｐ４０またはＩＬ−２３ｐ１９のどちらにも有意に結合しなかったことを示した（図８）。
ＩＬ−２３に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体の産生
ファージディスプレイ
複数の個々のヒトＦＡｂ断片を含むナイーブバクテリオファージ（ファージ）ライブラリ（ＸＯＭＡ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）を、ＩＬ−２３には結合するが、ＩＬ−２３、ｐ１９、およびｐ４０の個々のサブユニットには有意に結合しない抗体を単離する試みでスクリーニングした。
Ｄｙｎａｌ製Ｍ４５０磁気エポキシビーズへの抗原の架橋
１ｍＬのＤｙｎａｌ製Ｍ４５０エポキシビーズを、ｐＨ８．０で１ｍＬの１００ｍＭリン酸ナトリウムで１回洗浄した。洗浄したビーズを、ｐＨ８．０で０．５ｍＬの１００ｍＭのリン酸ナトリウムにさらに再懸濁し、結合させるべき１．４μｍｏｌのリガンドを加え、最終的な結合容積を、ｐＨ８．０で１００ｍＭのリン酸ナトリウムで、１ｍＬにした。結合反応を、ゆっくり回転させながら、室温で一晩（約１６時間）継続させた。その後、ビーズを、ｐＨ７．４で２０μＬの１Ｍのトリスを添加し、室温で３０分間ゆっくり回転させながら遮断した。ビーズを、ＰＢＳで３回洗浄し、１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁した。
ファージライブラリのバイオパニング
異なる試薬および／またはパニング条件を使用したいくつかの不成功のファージディスプレイキャンペーンに続いて、前述の特異性を有する抗ＩＬ−２３抗体を、ファージディスプレイライブラリから単離した。一般プロトコルは、Ｍａｒｋｓ他（Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：１６１−１７６，２００４）によって概説される方法に従った。簡潔に述べると、各ファージディスプレイキャンペーンは、カッパ鎖およびラムダ鎖の双方を含むライブラリを独立してスクリーニングする３回のバイオパニングを伴った。各回のバイオパニングについて、各ライブラリから採取したファージ粒子を、遮断バッファ（ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水中の５％の脱脂乳）と１：１で混合し、室温で１時間インキュベートすることによって遮断した。次いで、遮断したファージライブラリを、該当する場合には、ライブラリについて説明されるように遮断した抗原を使用して、室温で１時間、予め枯渇させた。
ライブラリパニングは、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離管中で、遮断および予め枯渇させたライブラリと、選択複合体（予め遮断したもの）とを混合し、室温で１時間回転させながら行った。特異的に結合しなかったファージは、一連の洗浄を使用して除去した。各洗浄は、磁気ラックを使用してビーズ複合体を溶液から管壁に引き寄せることと、上清を吸引することと、次いで、ビーズを新鮮な洗浄緩衝液で再懸濁することとが含まれた。これを、ＰＢＳ洗浄緩衝液（０．５％の脱脂乳を伴うＰＢＳ）またはＰＢＳ−Ｔ洗浄緩衝液（０．０５％のＴＷＥＥＮ−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．５％の脱脂乳を伴うＰＢＳ）で複数回繰り返した。洗浄プロセス後、結合したままのファージを溶出した。
１回目および２回目のパニングの終了後に、出力ファージを、指数的に成長するＴＧ１大腸菌（酵母−トリプトン（ＹＴ）成長媒体）の１０ｍＬの培養液に添加して、振盪せずに３７℃で３０分間インキュベートし、次いで２５０ｒｐｍで３０分間振盪することによって、細胞を感染させた。次いで、ファージディスプレイ出力をコードするファージミドを、標準プロトコル（前掲のＭａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，２００４）に従って、ファージ粒子として救出した。３回目のパニング終了後、ＴＧ１細胞を、出力ファージで感染させたが、細胞は、別個の大腸菌のコロニーを産生するのに十分な希釈度で、細胞は固体ＹＴ成長媒体（２％のグルコースおよび１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補充）上で平板培養した。
スクリーニングのためのＦａｂの発現
３回目のファージライブラリのバイオパニングによる別個の大腸菌のコロニーを使用して、１ｍＬの２ＹＴ成長媒体（２％のグルコースおよび１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補充）のアリコートを、９６ウエル深ウエルプレートに接種した。プレートを、３８０ｒｐｍで振盪しながら（Ｉｎｎｏｖａ ４４Ｒシェーカー、軌道１インチ（約２５．４ｍｍ））３０℃で一晩成長させて、マスタープレートを作成した。Ｆａｂについて、誘導細菌を、新鮮な２ＹＴ媒体（１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充）を含む、さらなる９６ウエルの深ウエルプレートで１：１００に希釈し、ＯＤ６００が０．５に到達するまで、３７℃、３８０ｒｐｍで成長させた。最終濃度１．２５ｍＭのＩＰＴＧを添加し、プレートを、前述のように振盪しながら、２５℃で一晩（約１６時間）成長させた。
可溶性Ｆａｂの調製
誘導プレートからの細菌ペレットを、２０００ｇで１０分間（室温）の遠心分離によって採取した。使用済み培地を廃棄し、ペレットを、１６０μｇ／ｍＬのリゾチーム、１０μｇ／ｍＬのＲＮＡｓｅ、５μｇ／ｍＬのデオキシリボヌクレアーゼ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｒｏｃｈｅ）から成る、１ウエルあたり２００μＬのリゾチーム緩衝剤中に再懸濁した。プレートを、１ウエルあたりさらに１００μＬのリゾチーム緩衝剤を添加する前に、２１℃、４００ｒｐｍで３０分間でインキュベートし、さらに、２１℃、４００ｒｐｍで３０分間インキュベートした。その後、プレートを、アッセイにおいてＦａｂ抽出物を使用する前に、３０００ｇで１５分間（室温）遠心分離した。
Ｆａｂ発現、ならびに抗原ＩＬ−２３、ＩＬ−２３ｐ１９−Ｆｃ、およびＩＬ−１２ｐ４０−Ｆｃへの結合に関するＥＬＩＳＡスクリーニング
ＮｕｎｃＭａｘｉｓｏｒｐ９６−ウエルプレートを、炭素塩被覆緩衝剤中１μｇ／ｍＬのタグ付けしていないヒトＩＬ−２３で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。さらに、プレートを、抗原ヒトｐ１９−Ｆｃ、ヒトｐ４０−Ｆｃ、および抗カッパまたは抗ラムダいずれかの抗体を使用して、ＩＬ−２３について説明したるように被覆した。プレートを洗浄し、次いで、室温で１時間、ＰＢＳ中１％のＢＳＡで遮断した。プレートを再度洗浄し、その後に、１ウエルあたり５０μＬのＦａｂ抽出物を添加し、室温でさらに１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、その後に、１ウエルあたり５０μＬの、１：２０００に希釈した抗ｖ５−ＨＲＰ抗体抱合体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を添加し、室温でさらに１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、現像して、上記で説明したように読み取った。
ＩＬ−２３結合特異性を示すリードＦａｂのファージディスプレイの結果
多数のスクリーニングのアプローチに続いて、キャンペーン４および５からスクリーニングした７６８のＦａｂのうちの１つのＦａｂ（ＳＴ８８３／８８５と称する）が、ＩＬ−２３には結合したが、ＩＬ−２３ｐ１９−ＦｃまたはＩＬ−２３ｐ４０−Ｆｃへの結合がほとんどまたは全く観察されなかった。この特異性を伴うＳＴ８８３／８８５Ｆａｂをコードするファージミドを含むバクテリアを、５ｍＬのＬＢブロス（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充）中で一晩再成長させ、これを使用して、配列決定のためにプラスミドＤＮＡを単離した。ＳＴ８８３／８８５の可変重鎖は、配列番号４９として与えられ、可変軽鎖は、配列番号５０として与えられる。
ＳＴ８８３／８８５のＶＨおよびＶＬを、増幅させて、それらのそれぞれのｐＴＴ５重鎖および軽鎖発現ベクターにサブクローン化した。次いで、ＳＴ８８３／８８５ＩｇＧと称される完全長抗体を、上記で説明したように、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞のヒトＩｇＧ１ラムダのアイソタイプ抗体として発現させた。抗体を、遠心分離による懸濁液からの細胞の除去に続いて、（上記で説明したように）タンパク質Ａクロマトグラフィによって精製した。図９で示されるように、抗体は、ＩＬ−２３に対しては特異的であるが、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−２３ｐ１９には有意に結合しないことが分かった。
ＩＬ−２３特異的抗体による内因性ＩＬ−２３の検出
Ｅ１１Ｅ７等のＩＬ−２３特異的抗体は、生物学的試料中のＩＬ−２３の検出において有用である。
ＩＬ−２３を検出するＥ１１Ｅ７の効果を実証するために、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡが開発された。ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬのＥ１１Ｅ７を、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）上に被覆し、４℃でインキュベートした。次の日、プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）を伴うＰＢＳを使用して洗浄し、ＰＢＳ中１０％のウシ胎仔血清で１時間遮断した。ｒｈＩＬ−２３を、３ｎｇ／ｍＬの最高濃度で添加し、プレート全体に連続希釈を行った。プレートを、１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ビオチン化したＩＬ−２３による検出抗体、その後ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、次いでストレプトアビジンＨＲＰによる検出を使用して、複合体を検出した。組み換えＩＬ−２３を、捕捉抗体としてＥ１１Ｅ７を使用して、用量−滴定で検出した（図１０Ａ）。
天然のＩＬ−２３を検出するためにＥ１１Ｅ７を使用できるかどうかを判定するために、ＴＨＰ−１細胞を、培養液中１μｇ／ｍＬのアメリカヤマゴボウ***促進因子（ＰＷＭ）および異なる濃度のリポ多糖類（ＬＰＳ）で２４時間刺激した。次いで、上清を採集して、上で説明したＥＬＩＳＡ形式で検定した。Ｅ１１Ｅ７は、試験したいくつかの濃度のＬＰＳで天然のＩＬ−２３を検出することが可能であった（図１０Ｂ）。
さらなる抗体および抗体断片の産生
４．１ ハイブリドーマ細胞系の生成
ヘテロ二量体ＩＬ−２３に対するモノクローナル抗体を、従来のタンパク質免疫化によって、または基本的に実施例１で説明されるような、遺伝的免疫化を使用して産生した。この方法は、ラットではなくマウスを免疫化するようにいくつかの形態に改変される。
ハイブリドーマのスクリーニングおよびＤＮＡの配列決定は、基本的に実施例１で説明されるように、および／または図１１で表されるように行われる。
４．２ ディスプレイライブラリからのさらなるＩＬ−２３ヘテロ二量体抗体の単離
一次選択について、抗体断片をディスプレイするファージのライブラリを、保持されているＦＬＡＧタグ付けしたＩＬ−２３タンパク質および陽性結合ファージに対してパニングする。次いで、抗ＦＬＡＧ Ｍ２被覆ビーズ（Ｓｉｇｍａ）およびＦＬＡＧタグ付けしたｐ１９を使用して、ＩＬ−２３ｐ１９サブユニットへの結合に対して陽性のファージの枯渇を行い、併せて、抗ＦＬＡＧ Ｍ２被覆ビーズ（Ｓｉｇｍａ）およびＦＬＡＧタグ付けしたＩＬ−１２ｐ４０を使用して、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットへの結合に対して陽性のファージの枯渇を行う。これによって、ＩＬ−２３のヘテロ二量体界面に対して特異的である抗体断片を提示するファージが残る（図１１）（Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｅｄ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ａｎｄ Ａｔｋｉｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００２））。抗ＦＬＡＧ Ｍ２被覆ビーズ（Ｓｉｇｍａ）およびＦＬＡＧタグ付けしたＩＬ−２３に対してスクリーニングすることによって、これらの抗体断片のさらなる親和性成熟を行う。次いで、プラスミドプレップ（Ｑｉａｇｅｎ）および制限消化によって放出される抗体断片の挿入物によって、選択対象出力からのファージベクターを単離する。これらの挿入物を、ファージ発現ベクターに結合させ、抗体断片の可溶性発現およびスクリーニングのために、大腸菌株ＨＢ２１５１を形質転換するために使用する。代替として、抗体断片挿入物を、配列決定して、短縮したヒト定常領域とともに発現させる。
抗体を発現するベクターの構築、発現、および抗体の精製
抗体を発現するベクターを、基本的に上で説明したように産生する。次いで、抗体を発現させて、本質的に上で説明したように精製する。
精製された抗体の特徴付け
実施例５で説明したように、発現させて、精製した抗体を、基本的に上で説明したように、マウス脾細胞を使用したＥＬＩＳＡアッセイ、ＩＬ−２３／ＩＬ−２３Ｒ阻害アッセイ、およびＩＬ−１７放出アッセイを使用して特徴付けする。
ヘテロ二量体特異的抗体のエピトープの特徴付け
点変異技術を使用して、３次元Ｘ線結晶構造（３Ｄ８５）に基づいて、側鎖が溶液と接触することが予測される各位置において、アラニンをＩＬ−２３のタンパク質配列に導入する。次いで、ＩＬ−２３の発現および精製について上記で説明した方法を使用して、単一のアラニン点変異を含む各ＩＬ−２３タンパク質を発現させて、精製する。ＳＰＲ技術を使用して、候補抗体をタンパク質Ａチップの表面に固定化し、各ＩＬ−２３変異体タンパク質を該表面に通過させ、結合動態を測定する。固定化した抗体に結合しなかった、または結合が弱いタンパク質変異体は、ＩＬ−２３上の抗体のエピトープに点変異を含み得る。
さらなる実験では、各ＩＬ−２３変異体を、ＥＬＩＳＡプレート上に被覆する。次いで、遮断後に、ＩＬ−２３に特異的なポリクローナル抗体と共に、候補抗体を添加する。次いで、それらの対応する二次抗体を使用して、両方の抗体を検出する。候補抗体がＩＬ−２３変異体に結合できない状況であるが、ポリクローナル抗体がＩＬ−２３変異体に結合したときには、ＩＬ−２３変異体上のアラニン変異のアミノ酸位置が、候補抗体と相互作用するアミノ酸位置としての役割を果たすことを示し得る。

Claims (49)

  1. 抗体の抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインは、ＩＬ−２３には特異的に結合するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合しない、単離されたまたは組み換えＩＬ−２３結合タンパク質。
  2. 前記抗原結合ドメインは、ＩＬ−２３のヘテロ二量体界面に特異的に結合する、請求項１に記載のＩＬ−２３結合タンパク質。
  3. 抗体の抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインは、
    （ｉ）ＩＬ−２３には特異的に結合するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合せず、
    （ｉｉ）中の水素が重水素と交換されたＩＬ−２３に結合し、
    （ｉｉｉ）中の水素が重水素と交換されたＩＬ−２３への結合時に、配列番号２の残基１１２〜１４４を含む領域における前記重水素の水素への交換を低減する、
    単離されたまたは組み換えＩＬ−２３結合タンパク質。
  4. １ｎＭ以下のＩＣ５０および／または１ｎＭ以下のＥＣ５０で、ＩＬ−２３のＩＬ−２３受容体（ＩＬ−２３Ｒ）への結合を低減する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＩＬ−２３結合タンパク質。
  5. 約１ｎＭ以下のＩＣ５０および／または１ｎＭ以下のＥＣ５０で、脾細胞によるＩＬ−２３誘発性のＩＬ−１７分泌を低減する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＩＬ−２３結合タンパク質。
  6. ＩＬ−２３に特異的に結合し、抗体のＩＬ−２３への結合を競合的に阻害することができる請求項１または２に記載のＩＬ−２３結合タンパク質であって、前記抗体は、
    （ｉ）配列番号７に記載の配列を含むＶＨおよび配列番号１２に記載の配列を含むＶＬ、または
    （ｉｉ）配列番号４９に記載の配列を含むＶＨおよび配列番号５０に記載の配列を含むＶＬ、
    のうちのいずれか１つを含む、前記タンパク質。
  7. 前記タンパク質は、
    （ｉ）配列番号７に記載の配列を含むＶＨおよび配列番号１２に記載の配列を含むＶＬ、または
    （ｉｉ）配列番号４９に記載の配列を含むＶＨおよび配列番号５０に記載の配列を含むＶＬ、
    のうちのいずれか１つを含む抗体によって結合されるエピトープと同じ、またはそれと重複するエピトープに結合する、請求項６に記載のＩＬ−２３結合タンパク質。
  8. 前記抗原結合ドメインは、ＩＬ−２３の構成要素であるときに、ＩＬ−２３のＩＬ−２３ｐ１９サブユニットに特異的に結合する、請求項１、２、４、または５のいずれか１項に記載のＩＬ−２３結合タンパク質。
  9. 前記抗原結合ドメインは、ＩＬ−２３の構成要素が配列番号２のアミノ酸１１２〜１４４を含む領域にあるときに、ＩＬ−２３のＩＬ−２３ｐ１９サブユニットに特異的に結合する、請求項８に記載のＩＬ−２３結合タンパク質。
  10. 配列番号７、１２、２６〜２９、４９、５０のいずれか１つ、配列番号２０もしくは３０〜３３のいずれか１つのアミノ酸１〜１２０、配列番号４５もしくは４６のアミノ酸１〜１１３に記載のアミノ酸配列、または配列番号６、１１、１８、１９、５７〜６０、７６、７２、７３、もしくは７７のいずれか１つに記載の配列を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、抗体の抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインは、ＩＬ−２３には特異的に結合するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合しない、単離されたまたは組み換えＩＬ−２３結合タンパク質。
  11. 前記抗原結合ドメインは、
    （ｉ）配列番号２６に記載の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号２７に記載の配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
    （ｉｉ）配列番号２８に記載の配列を含むＶＨおよび配列番号２９に記載の配列を含むＶＬ、または
    （ｉｉｉ）配列番号４９に記載の配列を含むＶＨおよび配列番号５０に記載の配列を含むＶＬ、
    の可変領域対のうちの１つの、６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１または２に記載のＩＬ−２３結合タンパク質。
  12. 前記タンパク質は、
    （ｉ）配列番号８もしくは５１に記載の配列、または図７Ａ、７Ｂ、もしくは７ＥでＣＤＲ１と標識されかつ下線を引いた配列を含む、重鎖ＣＤＲ１と、
    （ｉｉ）配列番号９、２２、もしくは５２に記載の配列、または図７Ａ、７Ｂ、もしくは７ＥでＣＤＲ２と標識されかつ下線を引いた配列を含む重鎖ＣＤＲ２であって、随意に、ＣＤＲ２アミノ酸配列の５つのＣ末端アミノ酸のいずれか１つ以上が、任意の他の天然に存在するアミノ酸と置換される、重鎖ＣＤＲ２と、
    （ｉｉｉ）配列番号１０もしくは５３に記載の配列、または図７Ａ、７Ｂ、もしくは７ＥでＣＤＲ３と標識されかつ下線を引いた配列を含む、重鎖ＣＤＲ３と、
    （ｉｖ）配列番号１３もしくは５４に記載の配列、または図７Ｃ、７Ｄ、もしくは７ＦでＣＤＲ１と標識されかつ下線を引いた配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１と、
    （ｖ）配列番号１４もしくは５５に記載の配列、または図７Ｃ、７Ｄ、もしくは７ＦでＣＤＲ２と標識されかつ下線を引いた配列を含む、軽鎖ＣＤＲ２と、
    （ｖｉ）配列番号１５もしくは５６に記載の配列、または図７Ｃ、７Ｄ、もしくは７ＦでＣＤＲ３と標識されかつ下線を引いた配列を含む、軽鎖ＣＤＲ３と、
    を含む、請求項１１に記載のＩＬ−２３結合タンパク質。
  13. 前記抗体の前記抗原結合ドメインは、配列番号２６、２８、または４９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項１または２に記載のＩＬ−２３結合タンパク質。
  14. 前記ＶＨは、配列番号７、配列番号４９、または配列番号３０〜３３のいずれか１つに記載のアミノ酸１〜１２０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のタンパク質。
  15. 前記抗体の前記抗原結合ドメインは、配列番号２７、２９、または５０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１または２に記載のＩＬ−２３結合タンパク質。
  16. 前記ＶＬは、配列番号１２、配列番号５０、または配列番号４５もしくは４６のアミノ酸１〜１１３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のＩＬ−２３結合タンパク質。
  17. 重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨおよびＶＬは結合して前記抗原結合ドメインを含むＦｖを形成する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＩＬ−２３結合タンパク質。
  18. 前記ＶＨおよびＶＬが単一のポリペプチド鎖中にある、請求項１７に記載のＩＬ−２３結合タンパク質。
  19. （ｉ）単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、
    （ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ジｓｃＦｖ）、または
    （ｉｉｉ）Ｆｃまたは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２および／もしくはＣＨ３に連結された（ｉ）および／または（ｉｉ）のうちの少なくとも１つ
    である、請求項１８に記載のＩＬ−２３結合タンパク質。
  20. 前記ＶＬおよびＶＨが別々のポリペプチド鎖中にある、請求項１７に記載のＩＬ−２３結合タンパク質。
  21. （ｉ）ダイアボディ、
    （ｉｉ）トリアボディ、
    （ｉｉｉ）テトラボディ、
    （ｉｖ）Ｆａｂ、
    （ｖ）Ｆ（ａｂ’）２、
    （ｖｉ）Ｆｖ、または
    （ｉｖ）Ｆｃまたは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２および／もしくはＣＨ３に連結された（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちの１つ
    である、請求項２０に記載のＩＬ−２３結合タンパク質。
  22. 抗体である、請求項２０に記載のＩＬ−２３結合タンパク質。
  23. 抗原結合ドメインを含む抗体であって、前記抗原結合ドメインは、ＩＬ−２３には特異的に結合するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合せず、
    （ｉ）配列番号２６に記載の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号２７に記載の配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
    （ｉｉ）配列番号２８に記載の配列を含むＶＨおよび配列番号２９に記載の配列を含むＶＬ、または
    （ｉｉｉ）配列番号４９に記載の配列を含むＶＨおよび配列番号５０に記載の配列を含むＶＬ、
    を含む、抗体。
  24. （ｉ）配列番号３０のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４５のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
    （ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４５のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
    （ｉｉｉ）配列番号３２のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４６のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、または
    （ｉｖ）配列番号３３のアミノ酸１〜１２０に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号４６のアミノ酸１〜１１３に記載の配列を含むＶＬ、
    のうちのいずれか１つを含むヒト化抗体である、請求項２３に記載の抗体。
  25. ヒト重鎖定常領域に連結される配列番号７に記載の配列を含むＶＨおよびヒト軽鎖定常領域に連結される配列番号１２に記載の配列を含むＶＬを含むキメラ抗体である、請求項２３に記載の抗体。
  26. 前記キメラ抗体は、配列番号２０に記載の配列を含む重鎖、および配列番号２１に記載の配列を含む軽鎖を含む、請求項２５に記載の抗体。
  27. 配列番号７に記載の配列を含むＶＨ、および配列番号１２に記載の配列を含むＶＬ、またはそれらのキメラ、脱免疫化、ＣＤＲグラフト、ヒト化、もしくは合成ヒト化形態を含む、モノクローナル抗体である、請求項２３に記載の抗体。
  28. 抗原結合ドメインを含むヒト抗体であって、抗原結合ドメインがＩＬ−２３には特異的に結合するが、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３ｐ１９サブユニットがＩＬ−２３の構成要素でないときには、それらに有意に結合せず、配列番号４９に記載の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号５０に記載の配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、前記抗体。
  29. キメラであるか、脱免疫化、ＣＤＲグラフト、ヒト化、霊長類化、または合成ヒト化される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＩＬ−２３結合タンパク質。
  30. 化合物に抱合した、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＩＬ−２３結合タンパク質、または請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の抗体。
  31. 前記化合物は、放射性同位体、検出可能な標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象内で前記タンパク質の半減期を延長させる化合物、およびこれらの混合物から成る群から選択される、請求項３０に記載のＩＬ−２３結合タンパク質または抗体。
  32. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＩＬ−２３結合タンパク質、もしくは請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の抗体をコードする、またはそのポリペプチドをコードする、単離されたまたは組み換え核酸。
  33. 配列番号６、１１、５７〜６０、７２、７３、７６、または７７のいずれか１つに記載の配列を含む、単離されたまたは組み換え核酸。
  34. プロモーターに操作可能に連結された、請求項３２または３３に記載の核酸を含む、発現構築体。
  35. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＩＬ−２３結合タンパク質、または請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の抗体を発現する、単離されたまたは組み換え細胞。
  36. 請求項３２もしくは３３に記載の核酸、または請求項３４に記載の発現構築体を含む、請求項３５に記載の細胞。
  37. 請求項１〜２２もしくは２９〜３１のいずれか１項に記載のＩＬ−２３結合タンパク質、請求項２３〜２８、３０、もしくは３１のいずれか１項に記載の抗体、請求項３２もしくは３３に記載の核酸、請求項３４に記載の発現構築体、または請求項３５もしくは３６に記載の細胞、および好適な担体もしくは希釈剤を含む、組成物。
  38. 前記担体または希釈剤は、薬学的に許容される、請求項３７に記載の組成物。
  39. 請求項１〜２２もしくは２９〜３１のいずれか１項に記載のＩＬ−２３結合タンパク質、請求項２３〜２８、３０、もしくは３１のいずれか１項に記載の抗体、請求項３２もしくは３３に記載の核酸、請求項３４に記載の発現構築体、請求項３５もしくは３６に記載の細胞、または請求項３７もしくは３８に記載の組成物を、細胞、組織、臓器、または対象に投与することを含む、前記細胞、組織、臓器、または対象における少なくとも１つのＩＬ−２３媒介疾患（condition）の症状を治療または予防するための方法。
  40. 前記疾患は、炎症性疾患である、請求項３９に記載の方法。
  41. 請求項１〜２２もしくは２９〜３１のいずれか１項に記載のＩＬ−２３結合タンパク質、請求項２３〜２８、３０、もしくは３１のいずれか１項に記載の抗体、請求項３２もしくは３３に記載の核酸、請求項３４に記載の発現構築体、請求項３５もしくは３６に記載の細胞、または請求項３７もしくは３８に記載の組成物の、医療薬における使用。
  42. 請求項１〜２２もしくは２９〜３１のいずれか１項に記載のＩＬ−２３結合タンパク質、請求項２３〜２８、３０、もしくは３１のいずれか１項に記載の抗体、請求項３２もしくは３３に記載の核酸、請求項３４に記載の発現構築体、または請求項３５もしくは３６に記載の細胞の、疾患の治療のための薬剤の製造における使用。
  43. 前記疾患は、乾癬、クローン病、または多発性硬化症である、請求項４０もしくは４１に記載の方法、または請求項４２に記載の使用。
  44. 乾癬、クローン病、または多発性硬化症の治療で使用するための、請求項１〜２２もしくは２９〜３１のいずれか１項に記載のＩＬ−２３結合タンパク質、請求項２３〜２８、３０、もしくは３１のいずれか１項に記載の抗体、請求項３２もしくは３３に記載の核酸、請求項３４に記載の発現構築体、請求項３５もしくは３６に記載の細胞、または請求項３７もしくは３８に記載の組成物。
  45. 試料中のＩＬ−２３を検出するための方法であって、試料を、請求項１〜２２もしくは２９〜３１のいずれか１項に記載のＩＬ−２３結合タンパク質、または請求項２３〜２８、３０、もしくは３１のいずれか１項に記載の抗体と接触させて、抗原−タンパク質複合体を形成することと、前記複合体を検出することと、を含み、前記複合体を検出することが前記試料中のＩＬ−２３を示す、前記方法。
  46. 対象の疾患を診断するための方法であって、前記対象由来の試料で請求項４５に記載の方法を行うことを含み、前記試料中のＩＬ−２３の検出が前記疾患を示す、方法。
  47. 前記試料中のＩＬ−２３のレベルを判定することを含み、対照試料と比較した前記試料中のＩＬ−２３のレベルの増加または減少が前記疾患を示す、請求項４６に記載の方法。
  48. 対象のＩＬ−２３の位置を特定する（localize）、および／または検出するための方法であって、存在する場合は、ＩＬ−２３に結合した請求項３０もしくは３１に記載のＩＬ−２３結合タンパク質または抗体をインビボで検出することを含み、前記タンパク質または抗体が検出可能な標識に抱合されている、前記方法。
  49. 前記タンパク質または抗体を前記対象に投与することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
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