JP2013519757A - キレート剤の存在下で高安定性を有するアミラーゼ変異体を含む洗浄組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書は、コンピュータ可読形態での配列リストを含む。本コンピュータ可読形態は、参照により本明細書に組み込まれる。
(a)(1つ又は複数の)変更は独立して、
(i)その位置のすぐ下流で隣接したアミノ酸の挿入、
(ii)その位置を占有するアミノ酸の欠失、及び/又は
(iii)その位置を占有するアミノ酸の置換であり、
(b)変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、
(c)それぞれの位置が、配列番号6のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する。
(a)(1つ又は複数の)変更は独立して、
(i)その位置のすぐ下流で隣接したアミノ酸の挿入、
(ii)その位置を占有するアミノ酸の欠失、及び/又は
(iii)その位置を占有するアミノ酸の置換であり、
(b)変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、
(c)それぞれの位置が、配列番号6のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する。
アルファ−アミラーゼ(アルファ−1,4−グルカン−4−グルカノヒドロラーゼ、E.C.3.2.1.1)は、デンプン並びに他の線状及び分枝状1,4−グルコシドオリゴ及び多糖類の加水分解を触媒する酵素の一群を構成する。バチルス属種、例えば、バチルス・リケニフォルミス等由来、アスペルギルス・オリザエ(TAKA−アミラーゼ)又は黒色アスペルギルス等の菌類の種由来、大麦等の植物由来、及び哺乳動物由来等の細菌を含む広範囲の選択の生物に由来するアルファ−アミラーゼが既知である。
EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、NTA(2,2’,2”−ニトリロトリアセテート)、クエン酸塩、2−ヒドロキシプロパン−1,2,3−トリカルボキシレート、DTPA(ジエチレントリアミン五酢酸)、MGDA(メチルグリシンアセト酢酸又はN,N’−ビス(カルボキシメチル)アラニン)、EGTA(エチレングリコール四酢酸)、EDDS(エチレンジアミン−N,N’−ジコハク酸)、GLDA(L−グルタミン酸、N,N−アセト酢酸)、PAA[ポリ(アクリル酸)]等のポリカルボン酸塩、PAA/PMA[コポリ(アクリル酸/マレイン酸)]、又はこれらの混合物様のカルボキシレート基であるキレート剤であるか、あるいはそれに基づくキレート剤であり得る。
親アルファ−アミラーゼは、ハイブリッドアルファ−アミラーゼ、すなわち、少なくとも2つのアルファ−アミラーゼに由来する部分アミノ酸配列の組み合わせを含むアルファ−アミラーゼであり得る。
(A)バチルス・リケニフォルミス、バチルス種、又はKSM AP1378の株に由来するか、
(B)配列番号6、8、10、12、18又は22に示されるアミノ酸配列を有する群から選択されるか、
(C)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24又は26のうちの1つに対して、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも95%、更により好ましくは少なくとも97%、及び更により好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するか、
(D)低い、好ましくは中程度、好ましくは高いストリンジェンシー条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23又は25のうちの1つの核酸配列とハイブリダイズする核酸配列によってコードされる。
相同性は、第2の配列からの第1の配列の誘導を示す2つの配列間の同一性の程度として決定され得る。本発明のために、2つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、EMBOSSパッケージ(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276〜277)のNeedleプログラムにおいて実施されるようなNeedleman−Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443〜453)、好ましくはバージョン3.0.0又はそれ以降を用いて決定される。必要に応じて用いられるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが10、ギャップ伸長ペナルティが0.5、及びEBLOSUM62(BLOSUM62のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。「最長同一性(longest identity)」と表示されたNeedleの出力(−nobriefオプションを用いて得られる)を同一率として用い、これは以下のように計算される。
(同一残基×100)/(アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数)
(同一デオキシリボヌクレオチド×100)/(アライメントの長さ−アライメント中のギャップの総数)
一態様では、デンプン分解活性を有する親ポリペプチドは、非常に低いストリンジェンシー条件、好ましくは低ストリンジェンシー条件、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件、より好ましくは中程度〜高いストリンジェンシー条件、更により好ましくは高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、(i)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23又は25の成熟ポリペプチドコード配列、(ii)配列番号1の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムDNA配列、(iii)(i)若しくは(ii)の部分配列、又は(iv)(i),(ii)、若しくは(iii)の全長相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる(J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d edition,Cold Spring Harbor,New York)。部分配列は、デンプン分解活性を有するポリペプチド断片をコードする。一態様では、相補鎖は、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23又は25の成熟ポリペプチドコード配列の全長相補鎖である。
変異を遺伝子に導入するためのいくつかの方法が、当該技術分野において既知である。アルファ−アミラーゼをコードするDNA配列のクローニングを手短に議論した後、アルファ−アミラーゼをコードする配列内の特定の位置での変異を発生させるための方法を議論する。
親アルファ−アミラーゼをコードするDNA配列は、当該技術分野において周知の種々の方法を用いて、問題のアルファ−アミラーゼを産生する任意の細胞又は微生物から単離され得る。最初に、ゲノムDNA及び/又はcDNAライブラリは、研究されるアルファ−アミラーゼを産生する生物由来の染色体DNA又はメッセンジャーRNAを用いて構築されるべきである。次に、アルファ−アミラーゼのアミノ酸配列が既知の場合、相同性の標識オリゴヌクレオチドプローブを合成及び使用して、問題の生物から調製されるゲノムライブラリ由来のアルファ−アミラーゼをコードするクローンを同定し得る。あるいは、既知のアルファ−アミラーゼ遺伝子と相同の配列を含有する標識オリゴヌクレオチドプローブをプローブとして使用し、ハイブリダイゼーション及び比較的低いストリンジェンシーの洗浄条件を用いて、アルファ−アミラーゼをコードするクローンを同定することができる。
アルファ−アミラーゼをコードするDNA配列が単離され、変異の望ましい部位が同定された時点で、変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含有し、変異体ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成中に挿入される。特定の方法では、アルファ−アミラーゼをコードする配列を架橋するDNAの一本鎖ギャップは、アルファ−アミラーゼ遺伝子を担持するベクター中に作成される。次に、所望の変異を担持する合成ヌクレオチドは、一本鎖DNAの相同部分にアニールされる。残りのギャップは、その後、DNAポリメラーゼI(クレノウ断片)で充填され、構築は、T4リガーゼを用いて連結される。この方法の具体例は、Morinaga et al.1984 Biotechnology 2,pp 636〜639に記載されている。米国特許第4,760,025号は、カセットの比較的重要でない変更を行なうことによる、複数の変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかしながら、種々の長さの多数のオリゴヌクレオチドが導入され得るため、更に多種多様の変異がMorinaga法によっていずれか1回で導入され得る。
ランダム変異誘発は、示される問題のアミノ酸配列に翻訳する遺伝子の少なくとも3つの部分において、あるいは全体の遺伝子内で、局所的ランダム変異誘発又は領域特異的ランダム変異誘発のいずれかとして好適に行なわれる。
(a)親アルファ−アミラーゼをコードするDNA配列をランダム変異誘発に供する工程と、
(b)工程(a)で得られた変異DNA配列を宿主細胞で発現させる工程と、
(c)親アルファ−アミラーゼと比較して変化したデンプン親和性を有するアルファ−アミラーゼ変異体を発現する宿主細胞をスクリーニングする工程と、を含む。
ランダム変異誘発は、問題の親アルファ−アミラーゼの一部分に有利に局所化され得る。これは、例えば、酵素のある特定の領域が酵素の所与の性質にとって特に重要であると同定されたとき、及び改善された性質を有する変異体をもたらすよう修飾されることが予想されるときに有利であり得る。そのような領域は、通常、親酵素の三級構造が解明され、酵素の機能に関連したときに同定され得る。
本発明の変異体をもたらす代替方法には、例えば、国際特許第95/22625号(Affymax Technologies N.V.)及び国際特許第96/00343号(Novo Nordisk A/S)に記載の方法を含む、当該技術分野において既知の遺伝子シャフリング法が含まれる。
本発明に従って、上述の方法、又は当該技術分野において既知の任意の代替方法によって産生される変異体をコードするDNA配列は、典型的には、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意で、制御因子遺伝子又は種々の活性化因子遺伝子をコードする制御配列を含む発現ベクターを用いて、酵素形態で発現され得る。
いくつかの他のアルファ−アミラーゼのアミノ酸配列と整列した配列番号6に開示のアルファ−アミラーゼのアミノ酸配列に由来する番号付けシステムを用いて、構造相同性の領域中のアルファ−アミラーゼにおけるアミノ酸残基の位置を示すことが可能である。
(1つ又は複数の)最初のアミノ酸:(1つ又は複数の)位置:(1つ又は複数の)置換アミノ酸
この命名法に従って、例えば、30位におけるアラニンのアスパラギンへの置換は、以下のように示され:
Ala30Asn又はA30N
同一の位置におけるアラニンの欠失は、以下のように示され:
Ala30*又はA30*
リジン等の30位以降の更なるアミノ酸残基の挿入は、以下のように示される:
Ala30AlaLys又はA30AK
アミノ酸残基30〜33等の連続した一続きのアミノ酸残基の欠失は、(30〜33)*又はΔ(A30〜N33)と示される。単一のアミノ酸残基の欠失は、簡潔に、30*と開示され得る。
*36Asp又は*36D
これは、36位におけるアスパラギン酸の挿入についてである。
Ala30Asn+Glu34Ser又はA30N+E34S
Ala30Asn Glu34Ser又はA3ON E34S
それぞれ、アラニン及びグルタミン酸をアスパラギン及びセリンに置換する30位及び34位における変異を表している。
Ala30Asn,Glu34Ser又はA30N,E34S
更により簡潔化された複数の変異は、スペースによって分けられ得、例えば、以下の通りである:
Ala30Asn Glu34Ser又はA30N E34S
あるいは、複数の変異は、コンマ又はセミコロンで分けられ得る。
A30N、E又は
A30N若しくはA30E
あるいは、1つ以上の代替のアミノ酸残基が所与の位置に挿入され得、それは、以下のように示される:
A30[N,E]又はA30[N E]、あるいは、A30{N,E}又はA30{N E}
簡潔化のため、ある特定の位置で置換され得る代替のアミノ酸は、以下のように示され得る:
A30 N、E、H、L又はV
更に、修飾に好適な位置が、任意の特定の修飾が示唆されることなく、本明細書において同定されるとき、任意のアミノ酸残基が、その位置に存在するアミノ酸残基に置換され得ることを理解されたい。したがって、例えば、30位におけるアラニンの修飾が言及されるが、特定されないとき、アラニンが、任意の他のアミノ酸すなわち、以下のうちのいずれかに欠失又は置換され得ることを理解されたい:
R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V
更に、「A30X」とは、以下の置換のうちの任意の1つを意味する:
A30R、A30N、A30D、A30C、A30Q、A30E、A30G、A30H、A30I、A30L、A30K、A30M、A30F、A30P、A30S、A30T、A30W、A30Y、若しくはA30V、又は短縮して、A30R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V
あるいは例えば、A30[R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V]
当業者は、例えば、配列番号6による番号付けを用いることは、計数のために配列番号6を用いて、親が必ず配列番号6であることを意味するのではなく、単に変更される位置が配列番号6に従って定義されることを意味すると理解するであろう。したがって、特定の置換を説明する別の方法は、変更されるアミノ酸をXで示すことである。したがって、X30Nは、異なるアルファ−アミラーゼが親アルファ−アミラーゼとして使用され得ることを反映して、30位に存在する任意のアミノ酸がNで置換され得ることを意味する。
荷電アミノ酸:
Asp、Glu、Arg、Lys、His
陰性荷電アミノ酸(最も陰性の残基の順に):
Asp、Glu
陽性荷電アミノ酸(最も陽性の残基の順に):
Arg、Lys、His
中性アミノ酸:
Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Asn、Gln、Ser、Thr、Pro
疎水性アミノ酸残基(最も疎水性の残基を最後に記載):
Gly、Ala、Val、Pro、Met、Leu、Ile、Tyr、Phe、Trp、
親水性アミノ酸(最も親水性の残基を最後に記載):
Thr、Ser、Cys、Gln、Asn
この命名法は、特定の共通の性質を有するアミノ酸残基の置換、挿入、又は欠失を伴う修飾に特に関連している。そのような修飾は、(1つ又は複数の)保守的なアミノ酸修飾と称される。保守的な修飾の例は、塩基性アミノ酸(アルギニン、リジン及びヒスチジン)、酸性アミノ酸(グルタミン酸及びアスパラギン酸)、極性アミノ酸(グルタミン及びアスパラギン)、疎水性アミノ酸(ロイシン、イソロイシン及びバリン)、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン)、並びに小アミノ酸(グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン)の群の範囲内にある。概して比活性を変更しないアミノ酸修飾は、当該技術分野において既知であり、例えば、H.Neurath and R.L.Hill,1979,In,The Proteins,Academic Press,New Yorkに記載されている。最も一般に発生する交換は、Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、及びAsp/Gly、並びにこれらの逆である(Taylor,1986,Journal of Theoretical Biology 119:205〜218)。
好ましい変異体は、親アルファ−アミラーゼの領域193〜213中の1つ以上、又は1つ若しくはいくつかのアミノ酸残基における(1つ又は複数の)変更を含む。特に好ましい実施形態では、変異体は、181、182、183、若しくは184のアミノ酸領域における少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失、及び更に領域193〜213中の1つ以上又は1つ若しくはいくつかのアミノ酸残基における変更を含み、番号付けは、すなわち、配列番号6による番号付けを用いて、配列番号6の成熟ポリペプチドに相当する。本発明者は、そのような変更が、具体的には、以下の「材料及び方法」に記載されるように、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、10mM未満、好ましくは9.5mM未満、好ましくは9.0mM未満、好ましくは8.5mM未満、好ましくは8.0mM未満、好ましくは7.5mM未満、好ましくは7.0mM未満、好ましくは6.5mM未満、好ましくは6.0mM未満、好ましくは5.5mM未満、好ましくは、好ましくは5.0mM未満、好ましくは4.5mM未満、4.0mM未満、好ましくは3.5mM未満、好ましくは3.0mM未満、好ましくは2.5mM未満、好ましくは2.0mM未満、好ましくは1.5mM未満、又は好ましくは1.0mM未満の濃度のキレート剤が遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができるとき、キレート剤を含む組成物において増加した安定性を有する変異体をもたらすことを見出した。
SP690+R181* G182* N195F;SP690+G182* T183* N195F;SP690+T183* G184* N195F;SP690+H183* G184* V206Y;SP690+H183* G184* N195F V206Y;SP690+H183* G184* N195F Y243F;SP690+ H183* G184* V206Y Y243F;SP690+H183* G184* N195F V206L Y243F;SP690+H183* G184* N195F V206Y Y243F;SP690+R181* G182* N195F M202L;SP690+G182* T183* N195F M202L;SP690+T183* G184* N195F M202L;SP690+R181* G182* R118K N195F R320K R458K;SP690+G182* T183* R118K N195F R320K R458K;SP690+T183* G184* R118K N195F R320K R458K。
(a)(1つ又は複数の)変更は、独立して、
(i)その位置のすぐ下流でのアミノ酸の挿入、
(ii)その位置を占有するアミノ酸の欠失、及び/又は
(iii)その位置を占有するアミノ酸の置換であり、
(b)変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、
(c)それぞれの位置が、配列番号6のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する。
(a)(1つ又は複数の)変更は独立して、
(i)その位置のすぐ下流で隣接したアミノ酸の挿入、
(ii)その位置を占有するアミノ酸の欠失、及び/又は
(iii)その位置を占有するアミノ酸の置換であり、
(b)変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、
(c)それぞれの位置が、配列番号6のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する。
(a)アミラーゼ活性を有する親ポリペプチドのアミノ酸配列を提供する工程、
(b)配列番号6の成熟ポリペプチドの195、197、198、200、203、206、210、212、213、243位に相当する1つ以上の位置を占有する1つ以上のアミノ酸を選択し、116、118、129、133、134、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418,431、434、447、458位に相当する1つ以上の位置を更に選択する工程、
(c)選択されたアミノ酸残基を置換若しくは欠失することによって、又は選択されたアミノ酸残基に下流で隣接した1つ以上のアミノ酸残基を挿入することによって、配列を修飾する工程、
(d)修飾された配列を有する変異体ポリペプチドを産生する工程、
(e)変異体ポリペプチドを、アミラーゼ活性及び安定性について試験する工程、及び
(f)親ポリペプチドと比較して、キレート剤の存在下で、アミラーゼ活性及び増加した安定性を有する変異体ポリペプチドを選択する工程を含むポリペプチドを調製するための方法に関し、10mM未満の濃度の前記キレート剤は、21℃及びpH 8.0で、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる。
(a)(1つ又は複数の)変更は独立して、
(i)その位置のすぐ下流で隣接したアミノ酸の挿入、
(ii)その位置を占有するアミノ酸の欠失、及び/又は
(iii)その位置を占有するアミノ酸の置換であり、
(b)変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、
(c)それぞれの位置が、配列番号6のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する。
SP722+R181*G182*、SP722+G182*+D183*、SP722+D183*及びG184*;SP722+R181*G182* N195F;SP722+G182* D183* N195F;SP722+D183* G184* N195F;SP722+R181*G182* M202L;SP722+G182* D183* M202L;SP722+D183* G184* M202L;SP722+R181* G182* N195F M202L;SP722+G182 D183* N195F M202L SP722+D183* G184* N195F M202L;SP722+D183* G184* N195F V206L Y243F;SP722+D183* G184* N195F V206Y Y243F;SP722+D183* G184* N195F V206F Y243F;
SP722+R181* G182* R181Q;SP722+G182* D183* R181Q;SP722+D183* G184* R181Q;SP722+R181* G182* L118K N195F H458K;SP722+G182* D183* L118K N195F H458K;SP722+D183* G184* L118K N195F H458K;SP722+D183* G184 G133E G149R N195Y Y203F V206L;
AA560+R181* G182*;AA560+G182* D183*;AA560+D183* G184*;AA560+R181* G182* N195F;AA560+G182* D183* N195F;AA560+D183* G184* N195F;AA560+ D183* G184* I206Y;AA560+ D183* G184* Y243F;AA560+ D183* G184* I206L Y243F;AA560+ D183* G184* N195F I206L;AA560+D183* G184* N195F Y243F;AA560+D183* G184* N195F I206L、Y243F;AA560+D183* G184* N195F I206Y Y243F;AA560+D183* G184* N195F I206F;AA560+R181* G182* M202L;AA560+G182* D183* M202L;AA560+D183* G184* M202L;
AA560+R181* G182* N195F M202L;AA560+G182* D183* N195F M202L;AA560+D183* G184* N195F M202L;
AA560+R181* G182* R118K N195F R320K T458K;AA560+G182* D183* R118K N195F R320K T458K;AA560+D183* G184* R118K N195F R320K T458K;AA560+D183* G184* R118K N195F I206L R320K R458K;AA560+D183* G184* R118K N195F I206Y R320K R458K;AA560+D183* G184* R118K N195F Y243F R320K R458K;AA560+D183* G184* R118K N195F I206L Y243F R320K R458K
SP707+R181* G182*、SP707+G182* H183*、SP707+H183* G184*;SP707+ R181* G182* N195F;SP707+ G182* H183* N195F;SP707+H183* G184* N195F I206L、Y243F;SP707+H183* G184* N195F I206Y Y243F;SP707+H183* G184* N195F I206F Y243F;SP707+H183* G184* N195F;SP707+ R181* G182* M202L;SP707+ G182* H183* M202L;SP707+D183* G184* M202L;SP707+ R181* G182* N195F M202L;SP707+ G182* H183* N195F M202L;SP707+H183* G184* N195F M202L;SP707+R181* G182* R181Q;SP707+G182* H183* R181Q;SP707+H183* G184* R181Q;
SP707+R181* G182* R118K N195F R320K R458K;SP707+G182* H183* R118K N195F R320K R458K;SP707+H183* G184* R118K N195F R320K R458K;
SP690+R181* G182*、SP690+G182* T183*、SP690+T183* G184*;SP690+R181* G182* N195F;SP690+G182* T183* N195F;SP690+T183* G184* N195F;SP690+T183* G184* N195F V206L、Y243F;SP690+T183* G184* N195F V206Y Y243F;SP690+T183* G184* N195F V206F Y243F;SP690+R181* G182* M202L;SP690+G182* T183* M202L;SP690+T183* G184* M202L;
SP690+R181* G182* N195F M202L;SP690+G182* T183* N195F M202L;SP690+T183* G184* N195F M202L;
SP690 +R181* G182* R118K N195F R320K R458K;SP690 +G182* T183* R118K N195F R320K R458K;SP690 +T183* G184* R118K N195F R320K R458K。
X193A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、X、Y、好ましくはS193T、
X195A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、X、Y、好ましくはN195[F又はY]、
X197A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、X、Y、好ましくはN197[F又はL]、
X198A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、X、Y、好ましくはY198N、
X200A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、X、Y、好ましくはY200F、
X203A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、X、Y、好ましくはY203F、
X206A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、X、Y、好ましくはV206[F、Y、L、H又はN]、
X210A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、X、Y、好ましくはH210Y、
X212A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、X、Y、好ましくはE212[V又はG]、及び
X213A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、X、Y、好ましくはV213A、
X243A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはY243F。
X116A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはN116T
X118A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはR118K
X129A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、好ましくはQ129L
X133A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはG133E
X134A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはD134Y
X142A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはK142R
X146A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはP146S
X147A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、Y、好ましくはG147E
X149A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはG149R
X151A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはT151R
X152A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはY152H
X169A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはQ169E
X174C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはQ174R
X186A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、Y、好ましくはA186R
X235A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはI235N
X243A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはY243F
X244A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはS244Q
X303A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはG303V
X320A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはK320N
X339A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはS339P
X359C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはR359I
X418A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはN418D
X431A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはS431T
X434A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはP434T
X447A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはA447V
X458A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y、好ましくはR458K。
、L、I又はV]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、198位及び206位での、[Q又はN]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、及び129位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、129位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、129位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、129位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、129位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、及び203位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、129位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、142位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、203位及び206位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;133位での、[E又はD]での置換、及び149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、及び203位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、152位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、203位及び206位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、及び133位での、[E又はD]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、133位での、[E又はD]での置換、及び149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、及び203位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;116位での、[G、A、S、T又はM]での置換、133位での、[E又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、203位及び206位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び198位での、[Q又はN]での置換;195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、及び203位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換;195位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、198位での、[Q又はN]での置換、203位での、[F、W、Y、L、I又はV]での置換、及び206位での、[F、W、Y、L、I、V、N、Q又はH]での置換;133位での、[E、又はD]での置換、149位での、[R、K、H、Q又はN]での置換、195位での、[F、W、Y、L、I、又はV]での置換、203位での、[F、W、Y、L、I、又はV]での置換、及び206位での、[F、W、Y、L、I、V、N、Q、又はH]での置換。
D183* G184* N195L;D183* G184* N197F;D183* G184* N197L;D183* G184* Y243F;D183* G184* N195F、D183* G184* N277F;D183* G184* S431T;D183* G184* P434T;D183* G184* I235N S339P;D183* G184* L351F;D183* G184* A186R、N195F;D183* G184* H210Y;D183* G184* V206Y;D183* G184* V206L;D183* G184* V206F;D183* G184* V213A Q174R;D183* G184* E212V;D183* G184* V206F E212G G304V A447V;N116T G133E K142R D183* G184* Y198N V206Y;G133E D183* G184* N195Y Y198N Y200F;D183* G184* A186D N195F E212V V213A;N116T D183* G184* N195Y Y198N;K142R P146S G149K D183* G184* N195Y Y198N V206I;D134Y D183* G184*;T151R D183* G184* H210Y K320N R359I N418D Q490H;G147E G149R Q169E D183* G184* Y198N Y203F V206Y;G133E G149R D183* G184* N195Y Y198N Y203F V206Y;G147E Y152H Q169E D183* G184* Y198N V206Y;D183* G184* N195F V206Y;D183* G184* N195F V206L;D183* G184* N195F V206F;D183* G184* V206L Y243F;D183* G184* V206F Y243F;D183* G184* N195F Y243F;D183* G184* N195F H210Y;D183* G184* V206Y H210Y;D183* G184* V213A;D183* G184* S193T;D183* G184* A186T N195F;D183* G184* N195F V206Y Y243F;D183* G184* N195F V206L Y243F;D183* G184* N195F V206Y Y243F;D183* G184* N195F V206F Y243F;D183* G184* V206Y Y243F;D183* G184* N195Y;G133D G149R D183* G184* Y198N V206Y;N116T G133E G147E Y152H D183* G184* Y198N Y203F V206Y;G147E G149R D183* G184* N195F Y198N V206Y;G133E K142R D183* G184* N195F Y198N;G133E G149R Y152H D183* G184* N195Y Y198N V206Y;N116T Q129L K142R D183* G184* N195Y Y198N Y203F V206Y;G133E G149R Y152H D183* G184* N195Y Y198N Y203F V206Y;N116T G133E G149R G182* D183* Y198N Y203F V206Y;D183* G184* S193T V206L、D183* G184* G133E G149R N195Y Y203F V206L。
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本発明は、好ましくは、消費者用又は業務用のエアケア、カーケア、食器洗浄、布地柔軟剤(軟化剤を含む)、洗濯洗浄力、洗濯及びリンス剤及び/又はケア、塗装面洗浄及び/又はトリートメント、並びに他の洗浄のための特許請求される組成物に関する方法及び/又はその使用のための製品に関する。本発明による、上述のアルファ−アミラーゼ変異体は、典型的には、洗剤組成物、例えば、洗濯洗剤組成物又は食器洗浄洗剤組成物等の洗浄組成物中の構成要素であり得る。液体洗濯洗剤組成物が特に好ましい。
染料又は顔料物質が本発明の意図する布地色相剤であるかどうかを定義するための手順プロトコルを以下に記載する。
以下はそれぞれ、トップローディング全自動洗濯機(1及び2)並びにフロントローディング洗濯機(3)に特に好適な液体洗濯洗剤組成物である。
2 1つの−NHにつき20個のエトキシル基を有するポリエチレンイミン(MW=600)。
3 両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーは、1つの−NHにつき24個のエトキシレート基と、1つの−NHにつき16個のプロポキシレート基とを有するポリエチレンイミン(MW=600)である。
以下の例、食器洗浄洗剤4〜8はゲル形態である。
2 Novozymes A/S(Denmark)により販売。
3 本発明のカプセル化プロテアーゼ。
4 Genencor International(California,USA)により販売。好適なプロテアーゼ錠剤は、商品名FN3(登録商標)及びProperase(登録商標)で販売。
6 Alco Chemical(Tennessee,USA)により販売。
7 そのような好適なポリマーの1つは、Nippon Shokubai(Japan)により商品名Aqualic TLで販売。
8 Arch Chemicals Incorporated(Smyrna,Georgia,USA)により販売。
9 Rohm and Haas(Philadelphia,Pennsylvania,USA)により販売。
酵素:
SP722:配列番号:6、Novozymesから入手可能であり、国際特許第95/26397号に開示される。
AA560:配列番号10
一般的な分子生物学方法:
別途言及されない限り、DNA操作及び形質転換を、分子生物学の標準の方法を用いて行なった(Sambrook et al.(1989)、Ausubel et al.(1995)、Harwood and Cutting(1990)。
発酵を、当該技術分野において周知の方法によって、又は以下のように行なうことができる。関連した発現プラスミドを持つバチルス・サブティリス株を、関連した抗生物質を有するLB−寒天プレート上でストリーキングし、37℃で一晩成長させる。コロニーを、500mLの振盪フラスコ中の関連した抗生物質(例えば、10mg/Lのクロラムフェニコール)で補充された100mLのBPX培地に移す。
種々の量のキレート化物を、2.0mMのCa2+の溶液に添加し、遊離Ca2+の濃度を、一定のpH及び温度でカルシウムイオン選択性電極を用いることによって決定する。遊離カルシウムの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させるのに必要なキレート化物の濃度を、キレート化物の濃度に対して測定される遊離カルシウム濃度のプロットから決定することができる。本アッセイにおいて、遊離カルシウムの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させるのに必要なキレート化物の濃度を、pH 8及び21℃で、塩化カリウム及び49mMのEPPS中で測定する。
電解液:超純水(ミリQ水)中の4Mの塩化カリウム。
塩化カルシウム標準溶液に対して較正される、Thermo Scientific(カタログ番号9720BNWP)のカルシウムイオン選択性電極。本電極を、本電極に付随するガイドラインで説明されるように較正する。
全容積を50mLに調整するためにpH 8の緩衝液を用いて、それぞれ、4mLのカルシウム原液(最終濃度2.0mM)、1mLの電解液(最終濃度80mMの塩化カリウム)、種々の量(0〜45mL)のキレート原液を含有する一連のバイアルを調製する。本アッセイにおけるEPPSの最終濃度は、49mMである。
キレート剤はまた、キレート剤(キレート化剤)及びカルシウムイオンの結合定数によって特徴付けられ得る。この定数を、AD Nielsen,CC Fuglsang and P Westh,Analytical Biochemistry Vol.314(2003)page 227〜234、及びT Wiseman,S Williston,JF Brandts and L−N Lin,Analytical Biochemistry Vol.179(1989)page 131〜137によって説明されるITC(等温滴定熱量計)によって決定することができる。
20mMのHEPES(2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]−エタンスルホン酸)、pH 8、超純水(ミルQ水)で調整。
−20mMのHEPES中の125μMのキレート化物、pH 8、又は20mMのグリシン中の125μMのキレート化物、pH 10。
カルシウムイオンを除去するために、すべての緩衝液を、Chelex 100カラム(Sigma Aldrich C−7901、メチル基を介する芳香環へのマトリックス1%架橋ポリスチレンマトリックス活性基イミノ二酢酸(ナトリウム形態)マトリックス付着)に通過させる。実験前に、すべての溶液を真空下で撹拌して脱気する。
MCS−ITC(MicroCal Inc.,Northampton,MA,USA)
手順
参照細胞を超純水(ミルQ水)で充填する。試料細胞を、選択されたpHのキレート化物液で充填し、注射器を、選択されたpHのカルシウム溶液で充填する。溶液を、所望の温度、例えば、19℃に平衡化する。
洗剤組成物中のアルファ−アミラーゼ変異体の洗浄性能を評価するために、洗浄実験を行うことができる。酵素を、自動機械的ストレスアッセイ(AMSA)を用いて試験するか、又はビーカーを用いて洗浄実施試験をする。AMSA試験で、大量の少容量酵素−洗剤溶液の洗浄性能を試験することが可能である。AMSAプレートは、試験溶液のための多くのスロット及び洗浄される繊維製品の材料見本をスロットの全開口部にしっかりと締め付けるリッドを有している。洗浄期間中、プレート、試験溶液、織物及びリッドを、試験溶液を織物と接触させ、規則的及び周期的な振動様式で機械的ストレスを印加するために、精力的に振盪する。更なる説明に関して、国際特許第02/42740号、特に23〜24ページの段落「Special method embodiments」を参照されたい。
水(15度dH)、0.8g/Lの洗剤、例えば、上述のモデル洗剤A若しくはB、又は50mMのHCO3−、並びに例えば、1リットル当たり0、0.2、0.4、0.8及び/若しくは1.2mgの酵素タンパク質濃度の本発明の酵素を含む試験溶液を調製する。デンプン(例えば、Center For Testmaterials BV,P.O.Box 120,3133 KT,Vlaardingen,The NetherlandsのCS−28)で染色した布地を添加し、20℃で30分間洗浄する。水道水を流して完全にすすぎ、暗所で乾燥させた後、続いて、染色した布地の光強度又は反射率の値を、洗浄性能の尺度として測定する。デルタレミッション値を得るために、0mgの酵素タンパク質/Lを有する試験物を、ブランクとして使用する。好ましくは、機械的な動きを、例えば、布地を有する洗浄液の振盪、回転又は撹拌の形態で、洗浄工程中に適用する。
循環水浴(5℃)、ガラスビーカー(250mL)、100mL容量の洗浄液を有する1つのビーカーにつき1つの回転アーム、試験見本:Center for Testmaterials BV,Vlaardingen,The NetherlandsのCS−28(綿上の米デンプン)及びEMPA Testmaterials AG,St.Gallen,SwitzerlandのEMPA162(綿上の米デンプン/ポリエステル)、見本を5×5cmに切断する。
洗浄性能を、デルタレミッション値(ΔRem)として表す。非常に小さい、すなわち、0.7cm2(約0.7×1.0cm)の楕円形口径を有するMacbethカラーアイ7000反射分光光度計を用いて、見本の光反射率評価を行った。入射光中の紫外線なしで測定を行い、460nmでのレミッションを抽出した。測定開口部に対して見本を押し上げるピストンからの反射を減少させるために、見本を測定する前に、測定する見本を同一の種類の別の見本の上部に設置した。アミラーゼで洗浄した見本のレミッション値から、添加アミラーゼ(対照)なしで洗浄した見本のレミッション値を引くことによって、個々の見本のデルタレミッション値を計算した。
EnzChekアッセイ
アミラーゼ活性又は残存アミラーゼ活性を、以下のEnzCheckアッセイによって決定することができる。基質は、トウモロコシデンプン誘導体、DQ(商標)デンプン(トウモロコシデンプンBODIPY FL共役体)であり、蛍光を消す程度にBODIPY(登録商標)FL(4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−プロピオン酸)染料で標識されるトウモロコシデンプンである。約1mgの凍結乾燥基質を含有する1つのバイアルを、pH 4.0、100μLの50mM酢酸ナトリウム中に溶解する。バイアルを20秒間ボルテックスし、溶解するまで時折混合しながら室温で暗所に留置した。次に、950μLの10mM酢酸ナトリウム、0.01%(w/V)Triton X100((ポリエチレングリコールp−(1,1,3,3−テトラメチルブチル)−フェニルエーテル(C14H22O(C2H4O)n(n=9〜10))、pH 5.0を添加し、完全にボルテックスし、使用する準備が整うまで室温で暗所に保存する。基質作用液を、5mLの50mM HEPES、0.01%(w/V)Triton X100、1mM CaCl2、pH 7.0と混合して、1mLのこの溶液から調製する。
アルファ−アミラーゼ活性を、PNP−G7基質を採用する方法によって決定することができる。PNP−G7は、4,6−エチリデン(G7)−p−ニトロフェニル(G1)−α、D−マルトヘプタオシドの省略形であり、アルファ−アミラーゼ等のエンドアミラーゼで切断することができるブロックオリゴ糖である。切断後、キット中に含まれるアルファ−グルコシダーゼは、加水分解基質を更に消化して、黄色を有する遊離PNP分子を自由にし、ひいては、λ=405nm(400〜420nm)で、可視分光測光で測定することができる。PNP−G7基質及びアルファ−グルコシダーゼを含有するキットは、Roche/Hitachi(カタログ番号11876473)によって製造される。
このキットのG7−PNP基質は、22mMの4,6−エチリデン−G7−PNP及び52.4mMのHEPES(2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]−エタンスルホン酸)(pH 7.0)を含有する。
分析するアミラーゼ試料を、希釈試料のpHが7になるように、希釈緩衝液中で希釈した。20μLの希釈酵素試料を96ウェルマイクロタイタープレートに移し、80μLの基質作用液を添加することによって、アッセイを行なった。溶液を混合し、室温で1分間事前インキュベートし、吸収を20秒毎に5分間、OD 405nmで測定する。
親と比較した変異体の残存活性(安定性)における百分率点(pp)改善を、変異体の残存活性と親の残存活性との間の差異、すなわち、変異体残存活性−親の残存活性として計算する。
配列番号6 SP722のアミラーゼ変異体を、標準の手順、手短に言うと、ランダム及び/又は部位特異的変異を遺伝子に導入する工程、バチルス・ズブチルス宿主細胞を変異遺伝子で形質転換する工程、(例えば、国際特許第2004/111220号の実施例1に記載されるように)形質転換した宿主細胞を発酵させる工程、並びに発酵ブロスからアミラーゼを精製する工程によって調製した。類似した様式で、参照アミラーゼ(配列番号6)をバチルス・ズブチルスにおいて組み換え的に産生した。
実施例2a
遊離カルシウムイオンの測定
キレート剤(キレート化物)を、遊離カルシウムイオンの濃度(Ca2+)をpH 8で2.0mMから0.10mMに減少させるそれらの能力でランク付けすることができ、M.K.Nagarajan et al.,JAOCS,Vol.61,no.9(September 1984),pp.1475〜1478によって説明される方法から開発された。遊離カルシウムイオンの測定のための「材料及び方法」における上述のアッセイを用いた。
log Kの決定
あるいは、キレート剤は、キレート剤(キレート化剤)及びカルシウムイオンの結合定数によって特徴付けることができる。この定数を、AD Nielsen,CC Fuglsang and P Westh,Analytical Biochemistry Vol.314(2003)page 227〜234、及びT Wiseman,S Williston,JF Brandts and L−N Lin,Analytical Biochemistry Vol.179(1989)page 131〜137によって説明されるITC(等温滴定熱量計)によって決定することができる。log Kを決定するための手順を説明する。
EnzChekアッセイ
アミラーゼ活性又は残存アミラーゼ活性は、本発明において、上述のようにEnzCheckアッセイによって決定される。概して、モデル洗剤Bにおける残存アミラーゼ活性を、31℃で18時間のインキュベーション後に決定し、その後、活性を、上述のように4℃で18時間インキュベートした参照の活性と比較した。
洗剤中のアミラーゼの安定性を決定するために、20mMのHEPES、0.1%(w/V)のTriton X100中(pH 8.0)での希釈によって、試験した酵素を0.6mg/mLの酵素タンパク質の濃度に調整した。開始のアミラーゼ濃度が低すぎる場合、それを、10kDaのカットオフを有するUF膜を用いて、限外濾過(UF)によって濃縮することができる。
本実施例では、上述のPNP−G7アッセイを用いて、キレート剤DTPAの存在下でのインキュベーション後の残存アミラーゼ活性を決定するが、EnzCheckアッセイを用いて活性を決定する原理は、上述と同一である。概して、残存アミラーゼ活性を、キレート剤を含有する緩衝液中で、pH 8及び49℃又はpH 10及び42℃のいずれかで1時間インキュベーションした後に決定し、その後、その活性を、上述の「材料及び方法」に記載されるように、4℃で1時間インキュベートした参照の活性と比較する。
原理:
酵素試料を、pH 8.0の緩衝液中で、1.5%の最終濃度のDTPAと49℃で1時間インキュベートし、参照試料を、4℃で1時間インキュベートした。加えて、酵素試料を、pH 10.0の緩衝液中で、1.5%の最終濃度のDTPAと42℃で1時間インキュベートし、それらの参照試料を、4℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、PNP−G7アミラーゼ活性アッセイを用いて残存活性を決定した。
DTPAを有するpH 8緩衝液:50mMのEPPS、0.01%のTriton X100、1.875%のDTPA(ジエチレントリアミンペンタ酢酸、CAS番号67−43−6)、pH 8.0
DTPAを有するpH 10緩衝液:50mMのEPPS、0.01%のTriton X100、1.875%のDTPA(ジエチレントリアミンペンタ酢酸、CAS番号67−43−6)、pH 10.0
アミラーゼ溶液:5mMのEPPS中の0.25及び0.5mgの活性アミラーゼタンパク質/mL、0.01% Triton X−100、pH 8.0
手順:
160μL緩衝液(DTPAを有するpH 8緩衝液又はDTPAを有するpH 10緩衝液)及び40μLのアミラーゼ溶液を、96ウェルPCRマイクロタイタープレートに2回に分けて移し、内容物を1分間混合した(PCR:ポリメラーゼ連鎖反応)。最終濃度のDTPAは、それぞれのウェルにおいて1.5%であった。それぞれのウェルの20μLを、4℃で設置した新しいPCRマイクロタイタープレート(PCR MTP)に移した(参照試料)。PCR MTPを、緩衝液がpH 8.0を有した場合、49℃で1時間(pH 8、49℃試料)、緩衝液がpH 10.0を有した場合、42℃で1時間(pH 10、42℃試料)、PCR機器内でインキュベートした。
本実施例では、上述のPNP−G7アッセイを用いて、キレート剤DTPAの存在下でのインキュベーション後のSP722変異体の残存アミラーゼ活性を決定する。概して、残存アミラーゼ活性を、pH 8又はpH 10のいずれかのキレート剤を含有する緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベーションした後に決定し、その後、活性を、材料及び方法に記載されるように、4℃でインキュベートした参照の活性と比較する。
原理:
酵素試料を、1.5%(w/v)の最終濃度のDTPAを有するpH 8.0の緩衝液中で、指示された温度及びインキュベーション時間でインキュベートし、参照試料を、4℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。加えて、酵素試料を、1.5%(w/v)の最終濃度のDTPAを有するpH 10.0の緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベートし、それらの参照試料を、4℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。インキュベーション後、PNP−G7アミラーゼ活性アッセイを用いて残存活性を決定した。
DTPAを有するpH 8緩衝液:50mMのEPPS、0.01%(w/v)のTriton X100、1.875%(w/v)のDTPA(ジエチレントリアミンペンタ酢酸、CAS番号67−43−6)、pH 8.0
DTPAを有するpH 10緩衝液:50mMのグリシン、0.01%(w/v)のTriton X100、1.875%(w/v)のDTPA(ジエチレントリアミンペンタ酢酸、CAS番号67−43−6)、pH 10.0
アミラーゼ溶液:5mMのEPPS中の0.25及び0.5mgの活性アミラーゼタンパク質/mL、0.01%のTriton X−100、pH 8.0
手順:
160μL緩衝液(DTPAを有するpH 8緩衝液又はDTPAを有するpH 10緩衝液)及び40μLのアミラーゼ溶液を、96ウェルPCRマイクロタイタープレートに2回に分けて移し、内容物を1分間混合した(PCR:ポリメラーゼ連鎖反応)。最終濃度のDTPAは、それぞれのウェルにおいて1.5%(w/v)であった。それぞれのウェルの20μLを、4℃で設置したマイクロタイタープレート(MTP)に移した(参照試料)。PCR MTP(ストレス試料)を、以下の表に示されるように、PCR機器内でインキュベートした。
本実施例では、上述のPNP−G7アッセイを用いて、キレート剤HEDPの存在下でのインキュベーション後の残存アミラーゼ活性を決定する。概して、残存アミラーゼ活性を、pH 10のキレート剤を含有する緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベーションした後に決定し、その後、活性を、材料及び方法に記載されるように、4℃でインキュベートした参照の活性と比較する。
原理:
酵素試料を、1.5%(w/v)の最終濃度のHEDPを有するpH 10.0の緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベートし、参照試料を4℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。インキュベーション後、PNP−G7アミラーゼ活性アッセイを用いて残存活性を決定した。
HEDPを有するpH 10緩衝液:50mMのグリシン、0.01%(w/v)のTriton X100、1.875%(w/v)のHEDP(1−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、CAS番号2809−21−4)、pH 10.0
アミラーゼ溶液:5mMのEPPS中の0.25及び0.5mgの活性アミラーゼタンパク質/mL、0.01%(w/v)のTriton X−100、pH 8.0
手順:
160μLの緩衝液(HEDPを有するpH 10緩衝液)及び40μLのアミラーゼ溶液を、96ウェルPCRマイクロタイタープレートに2回に分けて移し、内容物を1分間混合した(PCR:ポリメラーゼ連鎖反応)。最終濃度のHEDPは、それぞれのウェルにおいて1.5%(w/v)であった。それぞれのウェルの20μLを、4℃で設置したマイクロタイタープレート(MTP)に移した(参照試料)。PCR MTP(ストレス試料)を、以下の表6.1に示されるように、PCR機器内でインキュベートした。残存活性を、100×V最大(ストレス試料)/V最大(参照試料)として計算した。親と比較した変異体の安定性における百分率点(pp)改善を、変異体の残存活性−親の残存活性として計算する。
本実施例では、上述のPNP−G7アッセイを用いて、キレート剤HEDPの存在下でのインキュベーション後の残存アミラーゼ活性を決定する。概して、残存アミラーゼ活性を、pH 8又はpH 10のいずれかのキレート剤を含有する緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベーションした後に決定し、その後、活性を、材料及び方法に記載されるように、4℃でインキュベートした参照の活性と比較する。
原理:
酵素試料を、1.5%(w/v)の最終濃度のHEDPを有するpH 8.0の緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベートし、参照試料を、4℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。加えて、酵素試料を、1.5%(w/v)の最終濃度のHEDPを有するpH 10.0の緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベートし、それらの参照試料を、4℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。インキュベーション後、PNP−G7アミラーゼ活性アッセイを用いて残存活性を決定した。
HEDPを有するpH 8緩衝液:50mMのEPPS、0.01%(w/v)のTriton X100、1.875%(w/v)のHEDP(1−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、CAS番号2809−21−4)、pH 8.0
HEDPを有するpH 10緩衝液:50mMのグリシン、0.01%(w/v)のTriton X100、1.875%(w/v)のHEDP(1−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、CAS番号2809−21−4)、pH 10.0
アミラーゼ溶液:5mMのEPPS中の0.25及び0.5mgの活性アミラーゼタンパク質/mL、0.01%(w/v)のTriton X−100、pH 8.0
手順:
160μLの緩衝液(HEDPを有するpH 8緩衝液又はHEDPを有するpH 10緩衝液)及び40μLのアミラーゼ溶液を、96ウェルPCRマイクロタイタープレートに2回に分けて移し、内容物を1分間混合した(PCR:ポリメラーゼ連鎖反応)。最終濃度のHEDPは、それぞれのウェルにおいて1.5%(w/v)であった。それぞれのウェルの20μLを、4℃で設置したマイクロタイタープレート(MTP)に移した(参照試料)。PCR MTP(ストレス試料)を、以下の表7.1に示されるように、PCR機器内でインキュベートした。残存活性を、100×V最大(ストレス試料)/V最大(参照試料)として計算した。親と比較した変異体の安定性における百分率点(pp)改善を、変異体の残存活性−親の残存活性として計算する。
本実施例では、上述のPNP−G7アッセイを用いて、キレート剤DTPA又はHEDPの存在下でのインキュベーション後の残存アミラーゼ活性を決定する。概して、残存アミラーゼ活性を、pH 8又はpH 10のいずれかのキレート剤を含有する緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベーションした後に決定し、その後、活性を、材料及び方法に記載されるように、4℃でインキュベートした参照の活性と比較する。
原理:
酵素試料を、1.5%(w/v)の最終濃度のDTPA又はHEDPを有するpH 8.0の緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベートし、参照試料を、4℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。加えて、酵素試料を、1.5%(w/v)最終濃度のDTPA又はHEDPを有するpH 10.0の緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベートし、それらの参照試料を、4℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。インキュベーション後、PNP−G7アミラーゼ活性アッセイを用いて残存活性を決定した。
DTPAを有するpH 8緩衝液:50mMのEPPS、0.01%(w/v)のTriton X100、1.875%(w/v)のDTPA(ジエチレントリアミンペンタ酢酸、CAS番号67−43−6)、pH 8.0
DTPAを有するpH 10緩衝液:50mMのグリシン、0.01%(w/v)のTriton X100、1.875%(w/v)のDTPA(ジエチレントリアミンペンタ酢酸、CAS番号67−43−6)、pH 10.0
HEDPを有するpH 8緩衝液:50mMのEPPS、0.01%(w/v)のTriton X100、1.875%(w/v)のHEDP(1−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、CAS番号2809−21−4)、pH 8.0
HEDPを有するpH 10緩衝液:50mMのグリシン、0.01%(w/v)のTriton X100、1.875%(w/v)のHEDP(1−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、CAS番号2809−21−4)、pH 10.0
アミラーゼ溶液:5mMのEPPS中の0.25及び0.5mgの活性アミラーゼタンパク質/mL、0.01%(w/v)Triton X−100、pH 8.0
手順:
160μLの緩衝液(DTPA若しくはHEDPを有するpH 8緩衝液又はDTPA若しくはHEDPを有するpH 10緩衝液)及び40μLのアミラーゼ溶液を、96ウェルPCRマイクロタイタープレートに2回に分けて移し、内容物を1分間混合した(PCR:ポリメラーゼ連鎖反応)。最終濃度のDTPA又はHEDPは、それぞれのウェルにおいて1.5%(w/v)であった。それぞれのウェルの20μLを、4℃で設置したマイクロタイタープレート(MTP)に移した(参照試料)。PCR MTP(ストレス試料)を、以下の表8.1及び表8.2に示されるように、PCR機器内でインキュベートした。残存活性を、100×V最大(ストレス試料)/V最大(参照試料)として計算した。親と比較した変異体の安定性における百分率点(pp)改善を、変異体の残存活性−親の残存活性として計算する。
本実施例では、PNP−G7アッセイを用いて、実施例5に記載されるように、キレート化の存在下で洗剤中でインキュベーションした後、残存アミラーゼ活性を決定する。
方法:それぞれが、本発明のアミラーゼ変異体又はSP722+D183*及びG184*とも称される以下の2つの欠失:D183*及びG184*を有する配列番号6(SP722)を含有するpH 8.2の洗剤C試料を、調製した。それぞれの洗剤試料を、インキュベーション前に最初の残存酵素活性について決定した(参照試料)。
手順:
アミラーゼを含有するpH 8.2の5gの洗剤Cを、エアタイトリッドを有する7mLのガラスバイアルに二重に設置した。最初の二重の試料の残存酵素活性を、インキュベーション前に決定した。
Claims (15)
- 洗浄組成物であって、
(a)親アルファ−アミラーゼの変異体であって、配列番号6による番号付けを用いて、195、193、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群から選択される1つ以上の位置での置換を含む、変異体と、
(b)好ましくは、0.01〜99.9重量%の量の洗浄補助剤と、任意で、
(c)少なくとも1つのキレート剤であって、10mM未満の濃度の前記キレート剤が、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる、キレート剤と、を含む、洗浄組成物。 - キレート剤を含み、
(a)10mM未満の濃度の前記キレート剤が、80mMの塩化カリウム及び49mMのEPPS中で、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができ、及び/又は
(b)10mM未満の濃度の前記キレート剤が、実施例2aに記載のアッセイで測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができ、及び/又は
(c)前記キレート剤が、8mM未満、好ましくは7mM未満、好ましくは6mM未満、好ましくは5mM未満、好ましくは4mM未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができ、及び/又は
(d)前記キレート剤が、21℃及びpH 8で測定されるとき、遊離カルシウムイオン濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができるクエン酸塩の濃度の0.9倍未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができ、及び/又は
(e)前記キレート剤が、遊離カルシウムイオン濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができるクエン酸塩の濃度の0.7倍未満、例えば0.5倍未満、例えば0.3倍未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる、請求項1に記載の組成物。 - 洗浄組成物であって、
(a)親アルファ−アミラーゼの変異体であって、配列番号6による番号付けを用いて、195、193、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群から選択される1つ以上の位置での置換を含む、変異体と、
(b)好ましくは、0.01〜99.9重量%の量の洗浄補助剤と、任意で、
(c)少なくとも1つのキレート剤であって、21℃及びpH 8.0で測定されるとき、遊離カルシウムイオンを2.0mMから0.10mMに減少させることができるクエン酸塩の濃度の0.9倍未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができる、キレート剤と、を含む、洗浄組成物。 - (a)前記変異体が、配列番号6による番号付けを用いて、195、193、197、198、200、203、206、210、212、213又は243位に相当する1つ以上の位置での少なくとも2つの置換を含み、及び/又は
(b)前記親アルファ−アミラーゼ配列が、193が、[G、A、S、T又はM]であるか、195位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、197位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、198位が、[Q又はN]であるか、200位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、203位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、206位が、[F、W、Y、N、L、I、V、H、Q、D又はE]であるか、210位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、212位が、[F、W、Y、L、I又はV]であるか、又は213位が、[G、A、S、T又はM]であるか、あるいは243が、[F、W、Y、L、I又はV]である置換のうちの少なくとも1つによって修飾され、及び/又は
(c)前記親アルファ−アミラーゼ配列が、193がTであるか、195位がF又はYであるか、197位がF又はLであるか、198位がNであるか、200位がFであるか、203位がFであるか、206位がYであるか、210位がYであるか、212位がVであるか、又は213位がAであるか、あるいは243位がFである置換のうちの少なくとも1つによって修飾され、かつ/あるいは前記変異体が、(配列番号6の番号付けを用いて)181、182、183、又は184のアミノ酸領域における少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を更に含み、及び/又は
(d)前記変異体が、配列番号6の成熟ポリペプチドの193、195、197、198、200、203、206、210、212、213位に相当する1つ以上の位置での置換と、116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458位に相当する1つ以上の位置での置換と、を含み、及び/又は
(e)前記変異体が、キレート剤の存在下で、pH 8及び31℃で18時間後、少なくとも60%の残存活性を有し、10mM未満の濃度の前記キレート剤が、21℃及びpH 8.0で、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができ、及び/又は
(f)前記変異体が、キレート剤の存在下で、pH 8及び31℃で18時間後、少なくとも70%の残存活性を有し、10mM未満の濃度の前記キレート剤が、21℃及びpH 8.0で、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができ、前記残存活性が、「材料及び方法」に記載されるように測定され、及び/又は
(g)前記変異体が、「材料及び方法」に記載のAMSAで測定されるとき、前記親アルファ−アミラーゼと比較して、改善された洗浄性能を有する、請求項1又は2に記載の組成物。 - 前記キレート剤が、EDTA、MGDA、EGTA、DTPA、DTPMP、HEDP及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記親アルファ−アミラーゼの変異体が、配列番号6の成熟ポリペプチドの195、197、198、200、203、206、210、212、213、243からなる群から選択される位置に相当する1つ以上の位置での変更を含み、116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458からなる群から選択される位置に相当する1つ以上の位置での変更を更に含み、
(a)前記(1つ又は複数の)変更が独立して、
(i)前記位置のすぐ下流で隣接したアミノ酸の挿入、
(ii)前記位置を占有する前記アミノ酸の欠失、及び/又は
(iii)前記位置を占有する前記アミノ酸の置換であり、
(b)前記変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、及び
(c)それぞれの位置が、配列番号6のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記親アルファ−アミラーゼの変異体が、181、182、183、又は184のアミノ酸領域において少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つの欠失を含み、195、197、198、200、203、206、210、212、213、243からなる群から選択される1つ以上の位置での変更を更に含み、116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458からなる群から選択される1つ以上の位置での変更を更に含み、
(a)前記(1つ又は複数の)変更が独立して、
(i)前記位置のすぐ下流で隣接したアミノ酸の挿入、
(ii)前記位置を占有する前記アミノ酸の欠失、及び/又は
(iii)前記位置を占有する前記アミノ酸の置換であり、
(b)前記変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、及び
(c)それぞれの位置が、配列番号6のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記変異体が、キレート剤を含む組成物において、前記親アルファ−アミラーゼと比較して、又は配列番号6と比較して、改善された安定性を有し、10mM未満の濃度の前記キレート剤が、21℃及びpH 8.0で、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができ、好ましくは、前記変異体が、キレート剤の存在下で、pH 8で18時間後、少なくとも60%の残存活性を有し、10mM未満の濃度の前記キレート剤が、21℃及びpH 8.0で、遊離カルシウムイオンの濃度を2.0mMから0.10mMに減少させることができ、前記残存活性が、「材料及び方法」に記載されるように測定される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
- デンプン分解活性を有する前記変異体が、配列番号6、8、10、12、18又は20の成熟ポリペプチドと少なくとも60%、より好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、及び最も好ましくは少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
- デンプン分解活性を有する前記親ポリペプチドが、好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中程度のストリンジェンシー条件、更により好ましくは少なくとも中程度〜高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件下で、(i)配列番号5、7、9又は11、17、19の成熟ポリペプチドコード配列、(ii)配列番号5、7、9、11、17、19の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムDNA配列、又は(iii)(i)若しくは(ii)の全長相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記アミラーゼが、親アルファ−アミラーゼの変異体であり、前記親アルファ−アミラーゼが、配列番号6のものであり、前記変異体が、前記欠失D183*及びG184*と、
(a)N195F+H210Y、
(b)N195F+V206L、H、Y、
(c)N195F+V206L+H210Y、
(d)N195F+V206Y+Y243F、
(e)NS18056(我々が変異を得る場合)
(f)S193T+V206L、
(g)G133E+G149R+N195Y+Y203F+V206L、
(h)I206L、Y、
(i)Y243F、
(j)N195F+V206L+Y243F、
(k)N195F、又は
(l)V206F+Y243Fの組の変異のうちの1つを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記キレート剤が、DTPA、HEDP、MGDA、DTPMP及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記洗浄補助剤が、香料マイクロカプセル、布地色相剤、プロテアーゼ、ポリエチレンイミンポリマー、リパーゼ、及びこれらの任意の混合物のうちの1つ以上を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、液体洗濯洗剤組成物である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
- 洗濯方法であって、好ましくは30℃以下の温度で、又はより好ましくは20℃以下の温度で、請求項1〜14のいずれか一項に記載の組成物で衣類を洗濯する工程を含む、方法。
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